DE69125371T4 - Zu zellulose- oder hemizelluloseabbau fähiges enzym - Google Patents

Description

ERFINDUNGSGEBIET
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym, ein DNA-Konstrukt, das für das Enzym kodiert, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und ein Mittel zum Abbau von Cellulose oder Hemicellulose, das das Enzym umfaßt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Enzyme, die in der Lage sind, Cellulose abzubauen, sind bereits für die Umwandlung von Biomasse in Flüssigbrennstoff, Gas und Futtermittelprotein vorgeschlagen worden. Die Herstellung von fermentierbaren Zuckern aus Biomasse mit Hilfe von cellulolytischen Enzymen kann jedoch aufgrund der Ineffizienz der gegenwärtig verwendeten cellulolytischen Enzyme noch nicht mit zum Beispiel der Herstellung von Glucose aus Stärke mittels α-Amylase wirtschaftlich konkurrieren. Cellulolytische Enzyme können außerdem in der Brauereiindustrie für den Abbau von β-Glucanen, in der Bäckereiindustrie zur Verbesserung der Eigenschaften von Mehl, in der Papierzellstoffverarbeitung zur Entfernung der nicht-kristallinen Teile von Cellulose, wodurch der Anteil an kristalliner Cellulose im Zellstoff erhöht wird, und in Tierfuttermitteln zur Verbesserung der Verdaubarkeit von Glucanen eingesetzt werden. Eine weitere wichtige Verwendung von cellulolytischen Enzymen ist für die Textilbehandlung, z.B. zur Verringerung der Härte von baumwollhaltigen Geweben (vgl. zum Beispiel GB 1 368 599 oder US 4,435,307), zur Schmutzentfernung und Farbklärung von Geweben (vgl. zum Beispiel EP 220 016) oder zur Bereitstellung einer lokalisierten Variation in der Farbe, um den Geweben ein "stone-washed"- Aussehen zu verleihen (vgl. zum Beispiel EP 307 564).
• Die praktische Verwertung von cellulolytischen Enzymen ist in gewissem Maße zurückgeworfen worden durch die Natur der bekannten cellulasezubereitungen, die oft komplexe Mischungen einer Vielzahl von einzelnen Cellulasekomponenten sind und die eine ziemlich niedrige spezifische Aktivität haben können. Es ist schwierig, die Produktion einzelner Komponenten in multiplen Enzymsystemen zu optimieren und so industrielle, kosteneffektive Produktion von cellulolytischen Enzymen zu implementieren, und ihr tatsächlicher Einsatz ist durch Schwierigkeiten behindert worden, die aus der Notwendigkeit entstanden sind, ziemlich große Mengen an Enzymen einzusetzen, um die gewünschte Wirkung zu erreichen.
• Die Nachteile von bereits vorgeschlagenen cellulolytischen Enzymen können durch Verwendung von Ein-Komponenten-Enzymen, die im Hinblick auf eine hohe spezifische Aktivität ausgewählt sind, behoben werden.
• Cellulolytische Ein-Komponenten-Enzyme sind isoliert worden aus z.B. Trichoderma reesei (vgl. Teeri et al., Gene 51, 1987, S. 43-52; P.M. Abuja, Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 1988, S. 180-185; und P.J. Kraulis, Biochemistry 28, 1989, S. 7241- 7257). Es ist festgestellt worden, daß die T. reesei-Cellulasen zusammengesetzt sind aus einer terminalen A-Region, die verantwortlich ist für die Bindung an Cellulose, einer B-Region, welche die A-Region mit dem Kern des Enzyms verknüpft, und einem Kern, der die katalytisch aktive Domäne enthält. Es ist festgestellt worden, daß die A-Region verschiedener T. reesei-Cellulasen hoch konserviert ist, und eine starke Homologie ist auch mit einer Cellulase beobachtet worden, die von Phanerochaete chrysosporium (Sims et al., Gene 74, 1988, S. 411-422) produziert wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß andere Pilze, die weder mit Trichoderma reesei oder Phanerochaete chrysosporium eng verwandt sind, in der Lage sind, Enzyme zu produzieren, die eine Region enthalten, die zur A-Region von T. reesei-Cellulasen homolog ist.
• Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym, das aus einem anderen Pilz als Trichoderma oder Phanerochaete gewonnen werden kann und das eine Kohlehydrat-Bindungsdomäne umfaßt, die homolog ist zu einer terminalen A-Region von Trichoderma reesei-Cellulasen, wobei diese Kohlehydrat-Bindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt
• oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein unlösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken. "Xaa" soll Variationen in der Aminosäuresequenz der Kohlehydrat-Bindungsdomäne von verschiedenen Enzymen anzeigen. Ein Bindestrich soll eine "Lücke" in der Aminosäuresequenz anzeigen (verglichen mit anderen, ähnlichen Enzymen).
• Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Cellulose" lösliche und unlösliche, amorphe und kristalline Formen von Cellulose einschließen. Der Ausdruck "Hemicellulose" soll Glucane (abgesehen von Stärke), Mannane, Xylane, Arabinane oder Polyglucuron- oder Polygalacturonsäure bedeuten. Der Ausdruck "Kohlehydrat-Bindungsdomäne" ("CBD") soll eine Aminosäuresequenz bezeichnen, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein Kohlehydratsubstrat, insbesondere Cellulose oder Hemicellulose, wie oben definiert, zu bewirken. Der Ausdruck "homolog" soll einen hohen Grad an Identität angeben in der Sequenz von Aminosäuren, die die Kohlehydrat-Bindungsdomäne des vorliegenden Enzyms bilden, und den Aminosäuren, die die A- Region bilden, die in T. reesei-Cellulasen zu finden ist ("A- Region" ist der Ausdruck, der verwendet wird, um die Cellulose(d.h. Kohlehydrat)-Bindungsdomäne von T. reesei-Cellulasen zu bezeichnen).
• Man glaubt gegenwärtig, daß Cellulose oder Hemicellulose abbauende Enzyme, die eine Sequenz von Aminosäuren enthalten, die identifizierbar ist als eine Kohlehydrat-Bindungsdomäne (oder "A-Region", wegen ihrer Homologie zur A-Region von T. reesei-Cellulasen), bestimmte wünschenswerte Eigenschaften als ein Ergebnis der Funktion der Kohlehydrat-Bindungsdomäne im Enzymmolekül besitzen, die die Bindung an feste Substrate (einschließlich Cellulose) vermitteln und folglich die Aktivität solcher Enzyme gegenüber solchen Substraten erhöhen soll. Identifizierung und Herstellung von Kohlehydrat-Bindungsdomäne enthaltenden Enzymen aus einer Vielzahl von Mikroorganismen ist daher von beträchtlichem Interesse.
• Cellulose oder Hemicellulose abbauende Enzyme der Erfindung können geeigneterweise durch Screening von Genom- oder cDNA- Bibliotheken von verschiedenen Pilzen mit einer Sonde identifiziert werden, die wenigstens einen Teil der DNA umfaßt, die die A-Region von T. reesei-Cellulasen kodiert. Wegen der Intraspezies(d.h. verschiedene T. reesei-Cellulasen)- und Interspezies-Homologie, die für die Kohlehydrat-Bindungsdomänen von verschiedenen Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzymen beobachtet wird, gibt es Grund zur Annahme, daß dieses Screeningverfahren einen geeigneten weg zur Isolierung von Enzymen von gegenwärtigem Interesse darstellt.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
• Kohlehydrat-Bindungsdomänen (CBD) enthaltende Enzyme, der Erfindung können insbesondere aus Stämmen von Humicola, z.B. Humicola insolens, Fusarium, z.B. Fusarium oxysporum, oder Myceliophthora, z.B. Myceliophthora thermophile, gewonnen werden.
• Einige der Variationen der Aminosäuresequenz, die oben dargestellt sind, scheinen "konservativ" zu sein, d.h. bestimmte Aminosäuren sind in diesen Positionen unter den verschiedenen CBD-haltigen Enzymen der Erfindung bevorzugt. So ist in Position 1 der oben dargestellten Sequenz die Aminosäure bevorzugt Trp oder Tyr. In Position 2 ist die Aminosäure bevorzugt Gly oder Ala. In Position 7 ist die Aminosäure bevorzugt Gln, Ile oder Asn. In Position 8 ist die Aminosäure bevorzugt Gly oder Asn. In Position 9 ist die Aminosäure bevorzugt Trp, Phe oder Tyr. In Position 10 ist die Aminosäure bevorzugt Ser, Asn, Thr oder Gln. In Position 12 ist die Aminosäure bevorzugt Pro, Ala oder Cys. In Position 13 ist die Aminosäure bevorzugt Thr, Arg oder Lys. In Position 14 ist die Aminosäure bevorzugt Thr, Cys oder Asn. In Position 18 ist die Aminosäure bevorzugt Gly oder Pro. In Position 19 ist die Aminosäure (wenn vorhanden) vorzugsweise Ser, Thr, Phe, Leu oder Ala. In Position 20 ist die Aminosäure bevorzugt Thr oder Lys. In Position 22 ist die Aminosäure Thr, Arg, Glu oder Lys. In Position 23 ist die Aminosäure Lys, Gln oder Ala; oder in den Positionen 22 und 23 sind die Aminosäuren Thr Lys, Arg Gln, Val Lys, Lys Lys, Arg Ala oder Glu Lys. In Position 24 ist die Aminosäure bevorzugt Gln oder Ile. In Position 26 ist die Aminosäure bevorzugt Gln, Asp oder Ala. In Position 27 ist die Aminosäure bevorzugt Trp oder Phe. In Position 29 ist die Aminosäure bevorzugt Ser, His, Tyr oder Ala; und in Position 32 ist die Aminosäure bevorzugt Leu, Ile, Gln, Val oder Thr.
• Beispiele für spezifische CBD-haltige Enzyme der Erfindung sind diejenigen, die eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfassen
• Das Cellulose oder Hemicellulose abbauende Enzym der Erfindung kann außerdem eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine verknüpfende B-Region definiert (um die Nomenklatur zu verwenden, die für T. reesei-Cellulasen etabliert ist), die an die Kohlehydrat-Bindungsdomäne anschließt und diese mit der katalytisch aktiven Domäne des Enzyms verbindet. Die B-Region-Sequenzen, die bisher für Enzyme der Erfindung etabliert sind, zeigen, daß solche Sequenzen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie vorwiegend hydrophil und ungeladen sind und daß sie in bestimmten Aminosäuren angereichert sind, insbesondere Glycin und/oder Asparagin und/oder Prolin und/oder Serin und/oder Threonin und/oder Glutamin. Diese charakteristische Struktur der B-Region verleiht der Sequenz Flexibilität, insbesondere in Sequenzen, die kurze, repetitive Einheiten aus primär Glycin und Asparagin enthalten. Solche Wiederholungen findet man nicht in den B-Region-Sequenzen von T. reesei oder P. chrysosporium, die B-Regionen vom Serin/Threonin-Typ enthalten. Man glaubt, daß die flexible Struktur die Wirkung der katalytisch aktiven Domäne des Enzyms, die über die A-Region an das unlösliche Substrat gebunden ist, erleichtert, und sie verleiht daher dem Enzym der Erfindung vorteilhafte Eigenschaften.
• Spezifische Beispiele für B-Regionen, die in Enzymen der Erfindung enthalten sind, haben die folgenden Aminosäuresequenzen
• In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Kohlehydrat-Bindungsdomäne, die homolog ist zu einer terminalen A-Region von Trichoderma reesei-Cellulasen, wobei diese Kohlehydrat-Bindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt
• oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung eines Proteins an ein unlösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken.
• Beispiele für spezifische Kohlehydrat-Bindungsdomänen sind diejenigen mit der oben angegebenen Aminosäuresequenz.
• In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine verknüpfende B-Region, die abgeleitet ist von einem Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, wobei besagte Region eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in den Aminosäuren Glycin und/oder Asparagin und/oder Prolin und/oder Serin und/oder Threolin und/oder Glutamin angereichert ist. Wie oben angegeben, können diese Aminosäuren oft in kurzen, repetitiven Einheiten auftreten. Beispiele für spezifische B-Region-Sequenzen sind die oben dargestellten.
• Die vorliegende Erfindung stellt eine einzigartige Möglichkeit zur Verfügung, die unterschiedlichen Regionen von verschiedenen Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzymen "hin- und herzuschieben", wodurch neuartige Kombinationen der CBD, B- Region und katalytisch aktiven Domäne geschaffen werden, die zu neuartigen Aktivitätsprofilen dieser Art von Enzymen führen. So kann das Enzym der Erfindung eines sein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die eine CBD definiert, wobei diese Aminosäuresequenz abgeleitet ist von einem natürlich auftretenden Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, eine Aminosäuresequenz, die eine verknüpfende B-Region definiert, wobei diese Aminosäuresequenz abgeleitet ist von einem anderen natürlich auftretenden Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, sowie eine katalytische aktive Domäne, die abgeleitet ist von dem Enzym, das entweder die CBD oder die B-Region liefert, oder von einem dritten Enzym. In einer besonderen Ausführungsform ist die katalytische aktive Domäne abgeleitet von einem Enzym, das in der Natur keine CBD oder B-Region umfaßt. Auf diese Weise ist es möglich, Enzyme mit verbesserten Bindungseigenschaften aus Enzymen zu konstruieren, denen die CBD und B-Regionen fehlen.
• Das Enzym der Erfindung ist vorzugsweise eine Cellulase, wie etwa eine Endoglucanase (die zur Hydrolyse amorpher Regionen mit niedriger Kristallinität in Cellulosefasern fähig ist), eine Cellobiohydrolase (auch bekannt als eine Exoglucanase, die zur Initiierung des Abbaus von Cellulose von den nicht- reduzierenden Kettenenden durch Entfernung von Cellobiose-Einheiten fähig ist) oder eine β-Glucosidase.
• In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA- Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym kodiert, wie oben beschrieben.
• Eine DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert, kann zum Beispiel durch den Aufbau einer cDNA- oder Genom-Bibliothek von einen Mikroorganismus, von dem bekannt ist, das er Cellulose oder Hemicellulose abbauende Enzyme produziert, wie etwa einem Stamm von Humicola, Fusarium oder Mycelopthora, und Screening auf positive Klone durch herkömmliche Verfahren, wie etwa durch Hybridisierung an Oligonukleotidsonden, die auf der Grundlage der vollständigen oder partiellen Aminosäuresequenz des Enzyms synthetisiert sind, oder Sonden, die auf der partiellen oder vollständigen DNA-Sequenz der A-Region aus T. reesei-Cellulasen beruhen, wie oben angegeben, oder durch Selektionieren auf Klone, die geeignete Enzymaktivität exprimieren, oder durch Selektionieren auf Klone, die ein Protein produzieren, das mit einem Antikörper reaktiv ist, der gegen ein natives Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym gezüchtet ist, isoliert werden.
• Alternativ kann die DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, synthetisch durch Standardverfahren hergestellt werden, z.B. das Phosphoamiditverfahren, das von S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859-1869, beschrieben ist, oder das Verfahren, das von Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, S. 801-805 beschrieben ist. Gemäß dem Phosphoamidit- Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesizer, gereinigt, anneliert, ligiert und in geeigneten Vektoren kloniert.
• Schließlich kann die DNA-Sequenz gemischt genomischen und synthetischen, gemischt synthetischen und cDNA- oder gemischt genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen, gemäß Standardtechniken. So kann daran gedacht werden, daß eine DNA-Sequenz, die die CBD des Enzyms kodiert, genomischen Ursprungs sein kann, während die DNA-Sequenz, die die B-Region des Enzyms kodiert, synthetischen Ursprungs sein kann oder umgekehrt; die DNA-Sequenz, die die katalytisch aktive Domäne des Enzyms kodiert, kann geeigneterweise genomischen oder cDNA-Ursprungs sein. Das DNA-Konstrukt kann auch durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt werden, zum Beispiel wie beschrieben in US 4,683,202 oder R.K. Saiki et al., Science 239, 1988, S. 487-491.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der ein inseriertes DNA-Konstrukt, wie oben beschrieben, trägt. Der Expressionsvektor kann geeigneterweise geeignete Promotor-, Operator- und Terminator-Sequenzen umfassen, die es ermöglichen, daß das Enzym in einem bestimmten Wirtsorganismus exprimiert wird, sowie einen Replikationsursprung, der es ermöglicht, daß der Vektor in dem fraglichen Wirtsorganismus repliziert wird.
• Der resultierende Expressionsvektor kann dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, wie etwa eine Pilzzelle, von der ein bevorzugtes Beispiel eine Spezies von Aspergillus ist, am bevorzugtesten Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können mit einem Verfahren transformiert werden, das Protoplastenbildung und Transformation der Protoplasten umfaßt, gefolgt von Regeneration der Zellwand in einer per se bekannten Art und Weise. Die Verwendung von Aspergillus als einem Wirtsmikroorganismus ist beschrieben in EP 238 023 (von Novo Industri A/S), deren Inhalt hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen wird.
• Alternativ können die Wirtsorganismen ein Bakterium sein, insbesondere Stämme von Streptomyces und Bacillus, und E. coli. Die Transformation von Bakterienzellen kann gemäß herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel wie beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989.
• Das Screening geeigneter DNA-Sequenzen und die Konstruktion von Vektoren kann ebenfalls mit Standardverfahren durchgeführt werden, vgl. Sambrook et al., aaO.
• Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzyms, wie oben beschrieben, wobei eine Zelle, die mit dem Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist, unter Bedingungen kultiviert wird, die der Produktion des Enzyms förderlich sind, und das Enzym anschließend aus der Kultur gewonnen wird. Das Medium, das verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu kultivieren, kann jedes herkömmliche Medium sein, das zum Züchten der fraglichen Wirtszellen geeignet ist. Das exprimierte Enzym kann geeigneterweise in das Kulturmedium sekretiert werden und kann daraus mit gut bekannten Verfahren gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen vom Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen proteinhaltiger Komponenten des Mediums mit Hilfe eines Salzes, wie etwa Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
• Durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, wie oben angegeben, Fermentations- und Mutationstechniken oder anderen Techniken, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind, ist es möglich, Cellulose oder Hemicellulose abbauende Enzyme einer hohen Reinheit und in einer hohen Ausbeute bereitzustellen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Mittel zum Abbau von Cellulose oder Hemicellulose, wobei das Mittel ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym, wie oben beschrieben, umfaßt. Es wird in Betracht gezogen, daß, abhängig von der Spezifität des Enzyms, dieses für eine (oder möglicherweise mehrere) der oben erwähnten Anwendungen eingesetzt werden kann. In einer besonderen Ausführungsform kann das Mittel eine Kombination von zwei oder mehr Enzymen der Erfindung oder eine Kombination von einem oder mehreren Enzymen der Erfindung mit einem oder mehreren anderen Enzymen mit Cellulose oder Hemicellulose abbauender Aktivität umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Fig. 1 zeigt die Konstruktion von Plasmid pSX224;
• Fig. 2 zeigt die Konstruktion von Plasmid pHW485;
• Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Plasmid pHW697 und pHW704;
• Fig. 4 zeigt die Konstruktion von Plasmid pHW768;
• Fig. 5 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pSX320;
• Fig. 6 zeigt die Konstruktion von Plasmid pSX777;
• Fig. 7 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCAHj170;
• Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid IM4;
• Fig. 9 zeigt die SOE-Fusion des ~43kD langen Endoglucanase-Signalpeptids und des N-Terminus von Endo1;
• Fig. 10 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCaHj180;
• Fig. 11 zeigt die DNA-sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von F. oxysporum-C-Familie-Cellobiohydrolase;
• Fig. 12 zeigt die DNA-sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von F. oxysporum-F-Familie-Cellulase;
• Fig. 13 zeigt die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von F. oxysporum-C-Familie-Endoglucanase;
• Fig. 14.A-E zeigt die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von H. insolens-Endoglucanase 1(EG1); und
• Fig. 15A-D zeigt die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz einer Fusion der B. lautus(NCIMB 40250)-Endo1-Katalysedomäne und die CBD und B-Region der ~43kD langen H. insolens- Endoglucanase.
• Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen veranschaulicht, die in keiner Weise dazu gedacht sind, den Schutzumfang der Erfindung, wie beansprucht, einzuschränken.
Beispiel 1 Isolation von A-Region-haltigen Klonen aus H. insolens
• Aus dem H. insolens-Stamm DSM 1800 (beschrieben in z.B. WO 89/09259), gezüchtet auf Cellulose, wurde mRNA gemäß dem Verfahren hergestellt, das von Kaplan et al., Biochem. J. 183 (1979) 181-184, beschrieben ist. Eine cDNA-Bibliothek, die 20.000 Klone enthielt, wurde im wesentlichen mit dem Verfahren von Okayama und Berg, Methods in Enzymology 154, 1987, S. 3- 28, erhalten.
• Die cDNA-Bibliothek wurde gescreent, wie beschrieben von Gergen et al., Nucl. Acids Res. 7(8), 1979, S. 2115-2136, mit Oligonukleotid-Sonden in der Antisense-Konfiguration, konstruiert gemäß der veröffentlichten Sequenzen des N-terminalen Teils der A-Region der vier T. reesei-Cellulase-Gene (Penttilä et al., Gene 45 (1986), 253-63; Saloheimo et al., Gene 63, (1988), 11-21; Shoemaker et al., Biotechnology, Oktober 1983, 691-696; Teeri et al., Gene 51 (1987) 43-52). Die Sondensequenzen waren wie folgt:
• Screening lieferte eine große Anzahl von Kandidaten, die gut an die A-Region-Sonden hybridisierten. Restriktionskartierung verringerte die Anzahl interessierender Klone auf 17, von denen 8 bisher sequenziert worden sind (wie beschrieben von Haltiner et al., Nucl. Acids Res. 13, 1985, S. 1015-1025), um das Vorhandensein einer terminalen CBD sowie einer B-Region zu bestätigen.
• Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die für die CBDs erhalten wurden, waren wie folgt
• Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die für die B-Region erhalten wurden, waren wie folgt
Beispiel 2 Expression in A. oryzae einer CBH-2-Typ-Cellulase aus H. insolens
• Die vollständige Sequenz eines der CBD-Klone zeigt eine frappierende Ähnlichkeit mit einer Cellobiohydrolase (CBH 2) aus T. reesei.
• Die Konstruktion des Expressionsvektors pSX224, der das H. insolens-CBH-2-Gen zur Expression in und Sekretion aus A. oryzae trägt, ist in Fig. 1 umrissen. Der Vektor p777, der das pUC19-Replicon und die Regulatorregionen des TAKA-Amylase-Promotors aus A. oryzae und Glucoamylase-Terminators aus A. niger enthält, ist beschrieben in EP 238 023. pSX 217 besteht aus dem Klonierungsvektor pcDV1-pL1 (vgl. Okayama und Berg, aaO.), der das H. insolens-CBH-2-Gen auf einem 1,8 kb langen Fragment trägt. Das CBH-2-Gen enthält drei Restriktionsstellen, die bei der Konstruktion verwendet werden: Eine BalI-Stelle am einleitenden Methionin-Codon in der Signalsequenz, eine BstBI-Stelle 620 bp flußabwärts von der BalI-Stelle und eine AvaII-Stelle 860 bp flußabwärts von der BstBI-Stelle. Die AvaII-Stelle ist im nicht-translierten C-terminalen Teil des Gens flußaufwärts der Poly A-Region lokalisiert, die in der endgültigen Konstruktion nicht erwünscht ist. Ebensowenig wie die Poly G-Region flußaufwärts des Gens im Klonierungsvektor. Diese Region wird herausgeschnitten und durch einen Oligonukleotid-Linker ersetzt, der das Translations-Startcodon nahe zur BamHI-Stelle am Ende des TAKA-Promotors plaziert.
• Der Expressionsvektor pSX 224 wurde in A. oryzae IFO 4177 unter Verwendung des amdS-Gens aus A. nidulans als dem selektionierbaren Marker transformiert, wie beschrieben in EP 238 023. Transformanten wurden in YPD-Medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) für 3- 4 Tage gezüchtet und auf neue Proteinspezies im Überstand mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Das CBH 2 aus H. insolens bildete eine Bande mit einem scheinbaren MG von 65 kD, was eine wesentliche Glykolisierung der Proteinkette anzeigt, von der auf der Grundlage der Aminosäurezusammensetzung berechnet ist, daß sie ein MG von 51 kD besitzt. Das intakte Enzym bindet sich gut an Cellulose, während sich enzymatische Abbauprodukte mit 55 kD und 40 kD nicht binden, was auf die Entfernung der A-Region und möglicherweise der B-Region hindeutet. Das Enzym besitzt eine gewisse Aktivität gegenüber Filterpapier, was zur Freisetzung von Glucose führt. Wie erwartet, besitzt es sehr eingeschränkte Endoglucanase-Aktivität, wie gemessen auf löslicher Cellulose in der Form von Carboxymethylcellulose.
Beispiel 3 Isolation von Fusarium oxysporum-Genom-DNA
• Eine gefriergetrocknete Kultur von Fusarium oxysporum wurde mit Phosphatpuffer rekonstituiert, jeweils 5mal auf 5 FOX-Mediumplatten (6% Hefeextrakt, 1,5% K&sub2;HPO&sub4;, 0,75% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 22,5% Glucose, 1,5% Agar, pH 5,6) getüpfelt und bei 37ºC inkubiert. Nach 6 Tagen Inkubation wurden die Kolonien von den Platten in 15 ml 0,001% Tween-80 hineingeschabt, was zu einer dicken und wolkigen Suspension führte.
• Vier 1-Liter-Kolben, von denen jeder 300 ml flüssiges FOX-Medium enthielt, wurden mit 2 ml der Sporensuspension beimpft und wurden bei 30ºC und 240 UPM inkubiert. Am vierten Tag der Inkubation wurden die Kulturen durch 4 Lagen steriler Gaze filtriert und mit sterilem Wasser gewaschen. Die Mycele wurden auf Whatman-Filterpapier getrocknet, in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu einem feinen Pulver in einem kalten Mörser zermahlen und zu 75 ml frischem Lyse-Puffer (10 mM Tris-Cl 7,4, 1% SDS, 50 mM EDTA, 100 µl DEPC) zugegeben. Die gründlich vermischte Suspension wurde in einem Wasserbad mit 65ºC für 1 Stunde inkubiert und dann für 10 Minuten bei 4.000 UPM und 5ºC in einer Bench-Top-Zentrifuge geschleudert. Der Überstand wurde dekantiert und EtOH-gefällt. Nach 1 Stunde auf Eis wurde die Lösung bei 19.000 UPM für 20 Minuten geschleudert. Der Überstand wurde dekantiert und isopropanolgefällt. Im Anschluß an eine Zentrifugation bei 10.000 UPM für 10 Minuten wurde der Überstand dekantiert und man ließ die Pellets trocknen.
• Ein Milliliter TER-Lösung (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 100 µg RNAse A) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden bei 4ºC für zwei Tage gelagert. Die Röhrchen wurden gepoolt und für 30 Minuten in ein Wasserbad mit 65ºC gegeben, um nicht-gelöste DNA zu suspendieren. Die Lösung wurde zweimal mit Phenol/CHCl&sub3;/Isoamylalkohol, zweimal mit CHCl&sub3;/Isoamylalkohol extrahiert und dann ethanolgefällt. Den Pellet ließ man absetzen und der EtOH wurde entfernt. 70%iger EtOH wurde zugegeben und die DNA über Nacht bei -20ºC gelagert. Nach Dekantieren und Trocknen wurde 1 ml TER zugegeben und die DNA wurde gelöst, indem die Röhrchen bei 65ºC für 1 Stunde inkubiert wurden. Die Herstellung lieferte 1,5 mg Genom-DNA.
Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von DNA, amplifiziert mit degenerierten Primern
• Um DNA aus der C-Familie(gemäß Nomenklatur von Henrissat et al., Gene 81 (1), 1989, S. 83-96)-Cellulasen unter Verwendung von PCR (vgl. US 4,683,195 und US 4,683,202) zu amplifizieren, wurde jedes "sense"-Oligonukleotid in Kombination mit jedem "antisense"-Oligonukleotid verwendet. So wurde das folgende Primer-Paar verwendet: Primer
• In der PCR-Reaktion wurde 1 µg Fusarium oxysporum-Genom-DNA als die Matrize verwendet. Zehnmal PCR-Puffer ist 100 mM Tris- HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl, 0,1% Gelatine (Perkin-Elmer Cetus). Die Reaktionen enthielten die folgenden Inhaltsstoffe:
• dH20 35,75 µl
• 10X PCR-Puffer 5 µl
• Matrizen-DNA 5 µl
• Primer 1 2 µl (40 pmol)
• Primer 2 2 µl (40 pmol)
• Taq-Polymerase 0,25 µl (1,25 U)
• insgesamt 50 µl
• Die PCR-Reaktionen wurden über 40 Zyklen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
• 94ºC 1,5 min
• 45º 2,0 min
• 72º 2,0 min
• Fünf Mikroliter von jeder Reaktion wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Größen der DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von DNA-Molekulargewichtsmarkern geschätzt. Die mit ZC3220 und ZC3221 geprimete Reaktion produzierte zwei DNA- Fragmente geeigneter Größe als Kandidaten für Fragmente von C- Familie-Cellulasen. Die Agaroseabschnitte, die diese zwei Fragmente enthielten, wurden herausgeschnitten und die DNA wurde elektroeluiert und mit den Restriktionsenzymen Kpn1 und Zba1 verdaut. Die Fragmente wurden in den Vektor pUC18 ligiert, der mit denselben zwei Restriktionsenzymen geschnitten worden war. Die Ligationen wurden in E. coli transformiert und Mini-Prep-DNA aus resultierenden Kolonien hergestellt. Die DNA-Sequenzen dieser Inserts wurden bestimmt und zeigten, daß zwei neue C-Familie-Cellulasen identifiziert worden waren, die eine eine neue Cellobiohydrolase und die andere eine neue Endoglucanase.
• Die PCR-Klonierungsstrategie, die oben für die C-Familie-Cellulasen beschrieben ist, wurde unter Verwendung anderer Primer, die konservierte aellulase-Sequenzen innerhalb der bekannten F-Familie-Cellulasen (vgl. Henrissat et al., aaO.) kodierten, angewendet. Das folgende Primer-Paar wurde zur Amplifikation von Fusarium-Genom-DNA verwendet. Primer
• Die PCR-Reaktionen wurden über 40 Zyklen durchgeführt wie folgt:
• 94ºC 1,5 min
• 50ºC 2,0 min
• 72ºC 2,0 min
• Die 180 bp-Bande wurde aus einem Agarose-Gelfragment eluiert, mit den Restriktionsenzymen Hind III und Cla I verdaut und in pUC19 ligiert, der mit Hind III und AccI verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde in E. coli transformiert und Mini-Prep- DNA wurde aus Kolonie-Isolaten hergestellt. Die DNA-Sequenz der klonierten DNA wurde bestimmt. Dieses Fragment kodierte Sequenzen, die einem neuen Mitglied der F-Familie-Cellulasen entsprachen.
Konstruktion einer Fusarium oxysporum-cDNA-Bibliothek
• Fusarium oxysporum wurde durch Fermentation gezüchtet und Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für RNA-Extraktion und Cellulase-Aktivitäts analyse entnommen. Die Aktivitätsanalyse schloß einen Test auf Gesamtcellulaseaktivität sowie einen auf Farbklärung ein. Fusarium oxysporum-Proben, die maximale Farbklärung zeigten, wurden auf Gesamt-RNA extrahiert, aus der poly(A)+RNA isoliert wurde.
• Um eine Fusarium oxysporum-cDNA-Bibliothek zu konstruieren, wurde Erststrang-cDNA in zwei Reaktionen synthetisiert, die eine mit und die andere ohne radioaktiv markiertes dATP. Eine 2,5X Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur hergestellt, indem die folgenden Reagenzien in der folgenden Reihenfolge vermischt wurden: 10 µl 5X Reverse-Transkriptase-Puffer (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland), 2,5 µl 200 mM Dithiothreit (frisch hergestellt oder aus einer Vorratslösung, die bei - 70ºC gelagert wurde) und 2,5 µl einer Mischung, die 10 mM von jedem Desoxynukleotidtriphosphat enthielt (dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP, erhalten von Pharmacia LKB Biotechnology, Alameda, CA). Die Reaktionsmischung wurde in jedes von zwei Röhrchen mit 7,5 µl aufgeteilt. 1,3 µl von 10 µCi/µl ³²P-α-dATP (Amersham, Arlington Heights, IL) wurden zu einem Röhrchen zugegeben und 1,3 µl Wasser zum anderen. Sieben Mikroliter jeder Mischung wurden in die endgültigen Reagenzgläser überführt. In einem getrennten Röhrchen wurde 5 µg Fusarium oxysporum-poly(A)&spplus;-RNA in 14 µl 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 µM EDTA mit 2 µl von 1 µg/µl Erststrang-Primer (ZC2938GACAGAGCACAGAATT CACTAGTGAGCTCT&sub1;&sub5;) vermischt. Die RNA/Primer-Mischung wurde bei 65ºC für 4 Minuten erhitzt, in Eiswasser abgeschreckt und kurz in einer Mikrofuge zentrifugiert. Acht Mikroliter der RNA/Primer-Mischung wurden zu den endgültigen Reagenzgläsern zugegeben. Fünf Mikroliter 200 U/µl Superscript Reverse Transkriptase (Gibco-BRL) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Nach vorsichtiger Bewegung wurden die Röhrchen bei 45ºC für 30 Minuten inkubiert. Achtzig Mikroliter 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA wurden zu jedem Röhrchen zugegeben, die Proben wurden verwirbelt und kurz zentrifugiert. Drei Mikroliter wurden aus jedem Röhrchen entnommen, um die Anzahl zu bestimmen, die durch TCA- Ausfällung eingebaut ist, und die Gesamtanzahl in der Reaktion. Eine 2 µl-Probe aus jedem Röhrchen wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Der Rest jeder Probe wurde in der Gegenwart von Auster-Glykogen ethanolgefällt. Die Nukleinsäuren wurden durch Zentrifugation pelletiert und die Pellets wurden mit 80%igem Ethanol gewaschen. Im Anschluß an die Ethanolwaschung wurden die Proben für 10 Minuten luftgetrocknet. Die Erststrang-Synthese lieferte 1,6 µg Fusarium oxysporum-cDNA, eine 33%ige Umsetzung von poly(A)+RNA zu DNA.
• Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde auf dem RNA-DNA-Hybrid aus den Erststrang-Reaktionen unter Bedingungen durchgeführt, die Erststrang-Priming der Zweitstrang-Synthese begünstigte, was zu Haarnadel-DNA führte. Die Erststrang-Produkte jeder der zwei Erststrang-Reaktionen wurden in 71 µl Wasser erneut suspendiert. Die folgenden Reagenzien wurden bei Raumtemperatur zu den Reagenzgläsern zugegeben: 20 µl 5X Zweitstrang-Puffer (100 mM Tris pH 7,4, 450 mM KCl, 23 mM MgCl&sub2; und 50 mM (NH&sub4;)&sub2;(SO&sub4;)), 3 µl 5 mM β-NAD und µl einer Desoxynukleotidtriphosphatmischung, jedes mit 10 mM. Ein Mikroliter α-³²P-dATP wurde zur Reaktionsmischung zugegeben, die nicht-markiertes dATP für die Erststrang-Synthese erhielt, während das Röhrchen, das markiertes dATP für die Erststrang-Synthese erhielt, 1 µl Wasser erhielt. Jedes Röhrchen erhielt dann 0,6 µl 7 U/µl E. coli-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 3,1 µl 8 U/µl E. coli-DNA-Polymerase I (Amersham) und 1 µl 2 U/µl RNase H (Gibco-BRL). Die Reaktionen wurden bei 16ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurden 2 µl von jeder Reaktion verwendet, um die TCA-ausfällbare Anzahl und die Gesamtanzahl in der Reaktion zu bestimmen, und 2 µl von jeder Reaktion wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Zum Rest jeder Probe wurden 2 µl 2,5 µg/µl Auster-Glykogen, 5 µl 0,5 EDTA und 200 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA zugegeben. Die Proben wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert und isopropanolgefällt. Nach Zentrifugation wurden die Pellets mit 100 µl 80%igen Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute an doppelsträngiger cDNA in jeder der Reaktionen betrug ungefähr 2,5 µg.
• Mungobohnen-Nuklease-Behandlung wurde verwendet, um die einzelsträngige DNA der Haarnadel zu klippen. Jedes cDNA-Pellet wurde erneut in 15 µl Wasser suspendiert und 2,5 µl 10X Mungobohnen-Puffer (0,3 M NaAc pH 4,6, 3 M NaCl und 10 mM ZnSO&sub4;), 2,5 µl 10 mM DTT, 2,5 µl 50%iges Glycerin und 2,5 µl 10 U/µl Mungobohnen-Nuklease (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert und 75 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,4 und 1 mM EDTA wurden zu jedem Röhrchen zugegeben. Zwei-Mikroliter- Aliquote wurden durch Gelanalyse mit alkalischer Agarose analysiert. Einhundert Mikroliter 1 M Tris-HCl pH 7,4 wurden zu jedem Röhrchen zugegeben und die Proben wurden zweimal mit Phenol-Chloroform extrahiert. Die DNA wurde isopropanolgefällt und durch Zentrifugation pelletiert. Nach Zentrifugation wurde der DNA-Pellet in 80%igem Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug ungefähr 2 µg DNA aus jeder der zwei Reaktionen.
• Die cDNA-Enden wurden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. DNA aus den zwei Proben wurde nach erneuter Suspension in einem Gesamtvolumen von 24 µl Wasser kombiniert. Vier Mikroliter 10X T4-Puffer (330 mM Tris-acetat pH 7,9, 670 mM KAc, 100 mM MgAc und 1 mg/ml Gelatine), 4 µl 1 mM dNTP, 4 µl 50 mM DTT und 4 µl 1 U/µl T4-DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim) wurden zur DNA zugegeben. Die Proben wurden bei 15ºC für 1 Stunde inkubiert. Nach Inkubation wurden 160 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA zugegeben und die Probe wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert. Die DNA wurde isopropanolgefällt und durch Zentrifugation pelletiert. Nach Zentrifugation wurde die DNA in 80%igem Ethanol gewaschen und luftgetrocknet.
• Nach erneuter Suspension der DNA in 6,5 µl Wasser wurden Eco RI-Adaptoren zur stumpfendigen DNA zugegeben. Ein Mikroliter 1 µg/µl Eco RI-Adaptor (Invitrogen, San Diego, CA Cat. # N409- 20), 1 µl 10X Ligase-Puffer (0,5 M Tris pH 7,8 und 50 mM MgCl&sub2;), 0,5 µl 10 mM ATP, 0,5 µl 100 mM DTT und 1 µl 1 U/µl T4- DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) wurden zur DNA zugegeben. Nachdem die Probe über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert wurde, wurde die Ligase bei 65ºC für 15 Minuten hitzedenaturiert.
• Die Sst I-Klonierungsstelle, kodiert durch den Erststrang-Primer, wurde einer Verdauung mit Sst 1-Endonuklease ausgesetzt. Dreiunddreizig Mikroliter Wasser, 5 µl 10x Sst 1-Puffer (0,5 M Tris pH 8,0, 0,1 M MgCl&sub2; und 0,5 M NaCl) und 2 µl 5 U/µl Sst 1 wurden zur DNA zugegeben und die Proben wurden bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Einhundertfünfzig Mikroliter 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA wurden zugegeben, die Probe wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert und die DNA wurde isopropanolgefällt. Die cDNA wurde auf einer Sepharose-CL-2B(Pharmacia LKB Biotechnology)-Säule chromatographiert, um die cDNA nach Größe zu selektionieren und freie Adaptoren zu entfernen. Eine 1,1 ml-Säule aus Sepharose CL 28 wurde in eine 1 ml-Kunststoff- Wegwerfpipette gegossen und die Säule wurde mit 50 Säulenvolumenteilen Puffer (10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) gewaschen. Die Probe wurde aufgebracht, Ein-Tropfen-Fraktionen wurden gesammelt und die DNA im Ruhevolumen wurde gepoolt. Die fraktionierte DNA wurde isopropanolgefällt. Nach Zentrifugation wurde die DNA mit 80%igem Ethanol gewaschen und luftgetrocknet.
• Eine Fusarium oxysporum-cDNA-Bibliothek wurde aufgebaut, indem die cDNA an den Vektor pYcDE8' (vgl. WO 90/10698) ligiert wurde, der mit Eco RI und Sst I verdaut worden war. Dreihundertneunzig Nanogramm Vektor wurden an 400 ng cDNA in einer 80 µl- Ligationsreaktion, die 8 µl 10x Ligase-Puffer, 4 µl 10 mM ATP, 4 µl 200 mM DTT und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) enthielt, ligiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden 5 µg Auster-Glykogen und 120 µl 10 mM Tris- HCl und 1 mM EDTA zugegeben und die Probe wurde mit Phenol- Chloroform extrahiert. Die DNA wurde ethanolgefällt, zentrifugiert und der DNA-Pellet mit 80%igem Ethanol gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde die DNA erneut in 3 µl Wasser suspendiert. Siebenunddreißig Mikroliter Elektroporations-kompetente DH10B- Zellen (Gibco-BRL) wurden zur DNA zugegeben und die Elektroporation wurde mit einer Bio-Rad Gene Pulser (Model # 1652076)- und Bio-Rad Pulse Controller (Model # 1652098)-Elektroporationseinheit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) durchgeführt. Vier Milliliter SOC (Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580) wurden zu den elektroporatisierten Zellen zugegeben und 400 µl der Zellsuspension wurden auf jeder von zehn 150 mm-LB-Amipicillin-Platten verteilt. Nach einer Inkubation über Nacht wurden 10 ml LB-amp-Medien zu jeder Platte zugegeben und die Zellen wurden in die Medien abgeschabt. Glycerin-Vorratslösungen und Plasmid-Zubereitungen wurden von jeder Platte hergestellt. Der Bibliothekshintergrund (Vektor ohne Insert) wurde zu ungefähr 1% bestimmt, indem der Vektor ohne Insert ligiert und die Anzahl von Klonen nach Elektroporation titriert wurde.
Screening der cDNA-Bibliothek
• Vollängen-Cellulase-cDNA-Klone wurden aus der Fusarium oxysporum-cDNA-Bibliothek durch Hybridisierung an PCR-erzeugte genomische Oligonukleotidsonden isoliert.
• Die PCR-erzeugten Oligonukleotide: ZC3309, ein 40mer, das für einen Teil der C-Familie-Cellobiohydrolase kodiert, ATT ACC AAC ACC AGC GTT GAC ATC ACT GTC AGA GGG CTT C; ZC3310, ein 28- mer, das für die C-Familie-Endoglucanase kodiert, AAC TCC GTT GAT GAA AGG AGT GAC GTA G; und ZC3311, ein 40mer, das für die F-Familie-Cellulase kodiert, CGG AGA GCA GCA GGA ACA CCA GAG GCA GGG TTC CAG CCA C, wurden mit T4-Polynukleotid-Kinase und ³²P-Gamma-ATP entmarkiert. Für die Kinasereaktion wurden 17 Pikomol jedes Oligonukleotids mit entionisiertem Wasser auf 12,5 µl Volumen aufgefüllt. Zu diesen wurden 2 µl 10 X Kinase- Puffer (1 X: 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7,8), 0,5 µl 200 mM Dithiothreit, 1 µl P-Gamma-ATP 150 mCi/ml, Amersham), 2 µl T&sub4;-Polynukleotid-Kinase (10 U/µl BRL) zugegeben. Die Proben wurden dann vermischt und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Oligonukleotide wurden von nicht-eingebauten Nukleotiden durch Ausfällung mit 180 µl TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 100 µl 7,5 M Ammoniumacetat, 2 µl Muschel- Glykogen (20 mg/ml, Gibco-BRL) und 750 µl 100%igem Ethanol getrennt. Pellets wurden in 200 µl destilliertem Wasser gelöst. Um die Radioaktivitätsmenge zu bestimmen, die in den Oligonukleotiden eingebaut ist, wurden 10 µl von 1: 1.000-Verdünnungen von Oligonukleotiden ohne Szintillationsflüssigkeit in einem Beckman LS 1800 Liquid Scintillation System abgelesen. Die Aktivitäten waren: 115 Millionen cpm für ZC3309, 86 Millionen cpm für ZC3310 und 79 Millionen cpm für ZC3311.
• Anfänglich wurde eine Bibliothek von 20.000 cDNA-Klonen mit einer Mischung aus jedem der drei Oligonukleotide, die den C- Familie-Cellobiohydrolase-, C-Familie-Endoglucanase- und F- Familie-Cellulase-Klonen entsprechen, sondiert. Die cDNA-Bibliothek wurde von titrierten Glycerin-Vorratslösungen, die bei -70ºC aufbewahrt wurden, ausplattiert. Viertausend Klone wurden auf jede von fünf 150 mm-LB-Ampicillin(1.000 µg/ml)- Platten ausplattiert. Unter Befolgung der Standardmethodik (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989) wurden unter Verwendung von Filtern Biotrans 0,2 µm 137 mm Lifts doppelt abgenommen. Die Filter wurden bei 80ºC im Vakuum für 2 Stunden gebacken, dann über Nacht in einer Kristallisierschale (Pharmacia LKB Biotechnology, Alameda, CA) bei 37ºC in 80 ml Vorhybridisierungslösung verwirbelt (5 X Denhardt's (1X: 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin Pentax Fraction 5 (Sigma, St. Louis, MO)), 5 X SSC (1 X: 0,15 M Natriumchlorid, 0,15 M Natriumcitrat pH 7,3)), 100 µg/ml denaturierte beschallte Lachssperma-DNA, 50 mM Natriumphosphat pH 6,8, 1 mM Natriumpyrophosphat, 100 uM ATP, 20% Formamid, 1% Natriumdodecylsulfat) (Ulrich et al., EMBO J. 3 (1984), 361- 364).
• Vorhybridisierte Filter wurden sondiert, indem sie einer zur Zeit in eine kristallisierte Schale mit 80 ml Vorhybridisierungslösung mit 80 Millionen cpm ZC3309, 86 Millionen cpm ZC3310 und 79 Millionen cpm ZC3311 gegeben wurden, und dann über Nacht bei 37ºC verwirbelt. Filter wurden dann bis zu hoher Stringenz gewaschen. Die sondierten Filter wurden mit drei 400 ml-Volumina Niederstringenz-Waschlösung (2 X SSC, 0,1% SDS) bei Raumtemperatur in der Kristallisierschale gewaschen, dann mit vier 1 Liter-Volumina in einer Kunststoffbox. Eine weitere Waschung für 20 Minuten bei 68ºC mit Tetramethylammoniumchlorid-Waschlösung (TMACL: 3 M Tetramethylammoniumchlorid, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1 g/l SDS) (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1585-1588, (1985)) lieferte eine Hochstringenz-Waschung für das 2Bmer ZC3310 unabhängig von seiner Basenzusammensetzung. Die Filter wurden dann trokkengetupft, auf Whatman-3MM-Papier aufgebracht und mit Kunststoffhülle für Autoradiographie überzogen. Sie wurden über Nacht bei -70ºC mit Verstärkungsschirmen und Kodak XAR-5-Film belichtet.
• Zwei mutmaßliche Positive erschienen auf Duplikatfiltern. Die entsprechenden Bereiche auf den Platten mit Kolonien wurden in 1 ml 1X Polymerasekettenreaktions(PCR)-Puffer (100 mm Tris HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl, 0,1% Gelatine; Perkin Elmer Cetus) aussortiert und mit fünf zehnfachen Verdünnungen auf 100 mm-LB-Platten mit 70 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Diese Platten wurden bei 37ºC über Nacht gezüchtet. Zwei Verdünnungen von jedem mutmaßlichen Klon wurden zum erneuten Screening, wie oben umrissen, ausgewählt. Ein isolierter Klon, pZFH196, wurde gefunden. Dieser wurde über Nacht in 10 ml 2X YT-Brühe (pro Liter: 16 g Bacto-Trypton, 10 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g Naal) hochgezüchtet. Dreiundzwanzig Mikrogramm DNA wurden mit dem Schnellkochverfahren (Holmes und Quigley, Anal. Biochem. 114 (1981), 193-197) gereinigt. Aus der Restriktionsanalyse wurde festgestellt, daß der Klon ungefähr 2.000 Basenpaare lang war. Sequenzanalyse zeigte, daß er ein homologes Fragment zu dem C-Familie-Cellobiohydrolase-Fragment, kloniert mit PCR, enthielt.
• In einem Versuch, zusätzliche Cellulase-cDNA-Klone zu isolieren, wurde eine cDNA-Bibliothek von 2 Millionen Klonen auf 20 150 mm-LB-Platten (100 µg/ml Ampicillin), die ungefähr 100.000 cDNA-Klone enthielten, ausplattiert. Wie im ersten Screeningversuch wurden Lifts doppelt abgenommen. Diese Bibliothek wurde mit Oligonukleotiden gesareent, die den drei Cellulasearten entsprachen, wie sie oben beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung mit Formamid im Vorhybridisierungspuffer und bei einer Temperatur von 30ºC durchgeführt wurde. Waschen mit TMACL wurde zweimal für 20 Minuten bei 67ºC durchgeführt. Zwischen 8 und 20 Signale wurden auf Duplikat-Filtern von jeder der 20 Platten gefunden. Fünfzehn Plugs wurden von der ersten Platte mit dem großen Ende einer Pasteurpipette in 1 ml 1 x PCR-Puffer (Perkin-Elmer Cetus) abgenommen. PCR wurde auf den Bakterienplugs mit drei separaten Oligonukleotidmischungen durchgeführt. Jede Mischung enthielt das vektorspezifische Oligonukleotid ZC2847 und zusätzlich ein unterschiedliches, cellulasespezifisches Oligonukleotid (ZC3309, ZC3310 oder ZC3311) in jeder Mischung. Amplitaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) wurde mit Pharmacia Ultrapure dNTP und unter Befolgung der Perkin-Elmer-Cetus-Verfahren verwendet. Sechzehn Pikomol von jedem Primer wurden in 40 µl-Reaktionsvolumina verwendet. Zwanzig Mikroliter Zellen in 1 X PCR-Puffer wurden zu 20 µl Mastermix zugegeben, das alles enthielt, was für PCR benötigt wird, mit Ausnahme von DNA. Nach einer anfänglichen Denaturierung für 1 Minute 45 Sekunden bei 94ºC wurden 28 Zyklen von: 45 Sekunden bei 94ºC, 1 Minute bei 45ºC und 2 Minuten bei 72ºC in einem Perkin-Elmer-Thermocycler verwendet. Zehn der 15 Plugs lieferten eine Bande, wenn sie mit dem C-Familie-spezifischen Oligonukleotid ZC3309 und ZC2847 geprimet wurden. Die anderen Mischungen ergaben keine spezifischen Produkte. Fünf Plugs, die die größten Banden durch PCR erzeugten und daher möglicherweise Vollänge-C-Familie-Cellobiohydrolasen waren, wurden, zusammen mit den 5 Plugs, die keine PCR-Banden erzeugten, bei fünflofachen Verdünnungen auf 100 mm-LB-Platten mit 70 µg/ml Ampicillin ausplattiert und über Nacht gezüchtet. Duplikat-Lifts wurden von je zwei zehnfachen Verdünnungen genommen. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurde durchgeführt, wie oben beschrieben, mit einer Mischung der drei Oligonukleotide. Isolierte Klone wurden auf allen 10 der Platings gefunden. Diese wurden von den Verdünnungsplatten mit einem Zahnstocher für Einzelkolonieisolierung auf 100 mm-LB-Platten mit 70 µg/ml Ampicillin aussortiert. PCR wurde auf isolierten Bakterienkolonien mit 2 Oligonukleotiden durchgeführt, die spezifisch für die C-Familie-Cellobiohydrolase (ZC3409 (CCG TTC TGG ACG TAC AGA) und ZC3411 (TGA TGT CAA GTT CAT CAA)) waren. Die Bedingungen waren identisch mit denjenigen, die oben beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß 10 Pikomol von jedem Primer in 25 µl-Reaktionsvolumina verwendet wurden. Kolonien wurden mit Zahnstocher in PCR-Röhrchen mit 25 µl Mastermix vor der Zyklisierung zugegeben. Fünf der 10 ergaben starke Banden der für eine C-Familie-Cellobiohydrolase erwarteten Größe. Isolierte Kolonien wurden dann in 20 ml Terrific Broth (Sambrook et al., aaO., A2) gezüchtet und DNA wurde mit dem Schnellkochverfahren isoliert. Die Klone wurden mit Sanger-Didesoxysequenzierung partiell sequenziert. Aus der Sequenzanalyse ergab sich, daß die fünf Klone, die mit PCR keine Banden ergaben, die spezifisch für eine C-Familie-Cellobiohydrolase waren, F-Familie-Cellulase-Klone waren.
• Um die C-Familie-Endoglucanase zu klonieren, wurde die cDNA- Bibliothek von 2 Millionen Klonen erneut nur mit ZC3310 gescreent. Die Bedingungen der Vorhybridisierung und Hybridisierung waren ähnlich zu den oben verwendeten. Filter wurden für 10 Stunden bei 30ºC mit einer Million CPM endmarkiertem ZC3310 pro ml Vorhybridisierungslösung ohne Formamid hybridisiert. Waschen mit TMACL wurde zweimal für 20 Minuten bei 60ºC durchgeführt. Sieben schwache Signale wurden auf Duplikat-Filtern gefunden. Plugs wurden mit dem großen Ende einer Pipette in 1 ml LB-Brühe aussortiert. Diese wurden in 5-10fachen Verdünnungen auf 100 mm-LB-Platten mit 70 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Duplikat-Lifts wurden von je zwei Verdünnungen genommen und verarbeitet, wie oben beschrieben. Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen wurde durchgeführt, wie für das erste Screeningniveau. Drei isolierte Klone wurden identifiziert und für Einzelkolonie-Hybridisierung ausgestrichen. Isolate wurden über Nacht in 50 ml Terrific Broth gezüchtet (pro Liter: 12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerin, autoklaviert und 100 ml 0,17 M KH&sub2;PO&sub4;, 0,72 M K&sub2;HPO&sub4; (Sambrook et al., aaO., A2)) und DNA wurde durch alkalische Lyse und PEG-Ausfällung mit Standardverfahren (Maniatis 1989, 1.38- 1.41) isoliert. Aus der Restriktionsanalyse ergab sich ein Klon (pZFH223) der länger war als die anderen, und dieser wurde für die vollständige Sequenzierung ausgewählt. Sequenzanalyse zeigte, daß er das anfänglich klonierte PCR-Fragment enthielt.
DNA-Sequenzanalyse
• Die cDNAs wurden im Hefe-Expressionsvektor pYCDE8' sequenziert. Die Didesoxykettenterminationsmethode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117, 1977, S. 5463-5467) wurde unter Verwendung von 35-S dATP von New England Nuclear (vgl. M.D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, S. 3963-3965) für alle Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die Reaktionen wurden durch modifizierte t7-DNA-Polymerase von Pharmacia (vgl. S. Tabor und C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, S. 4767-4771) katalysiert und wurden geprimet mit einem Oligonukleotid, komplementär zum ADH1-Promotor (ZC996: ATT GTT CTC GTT CCC TTT CTT), komplementär zum CYC1-Terminator (ZC3635: TGT ACG CAT GTA ACA TTA), oder mit Oligonukleotiden, komplementär zur interessierenden DNA. Doppelsträngige Matrizen wurden vor der Hybridisierung mit einem Sequenzierungs-Oligonukleotid mit NaOH denaturiert (E.Y. Chen und P.H. Seeburg, DNA 4, 1985, S. 165-170). Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems Model 380A DNA-Synthesizer synthetisiert. Die Oligonukleotide, die für die Sequenzierungsreaktionen verwendet wurden, sind in der Sequenzierungs- Oligonukleotid-Tabelle unten aufgelistet: C-Familie-Cellobiohydrolase-Sequenzierungsprimer F-Familie-Cellulase-spezifische Sequenzierungsprimer C-Familie-Endoglucanase-spezifische Sequenzierungsprimer
• Die DNA-Sequenzen der Vollänge-cDNA-Klone sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in den beigefügten Fig. 11 (C- Familie-Cellobiohydrolase), 12 (F-Familie-Cellulase) und 13 (C-Familie-Endoglucanase) dargestellt.
Beispiel 4 Isolation von Endoglucanase-EGI-Gen aus H. insolens
• Die cDNA-Bibliothek, die in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde auch gescreent mit einer 35 bp langen Oligonukleotidsonde in der Antisense-Konfiguration mit der Sequenz:
• Die Sequenz wurde abgeleitet von einer Aminosäuresequenz eines Alcalase-Fragments von EGI, gereinigt aus H. insolens, unter Verwendung unseres Wissens über Kodon-Bevorzugung in diesem Organismus. Vollständige Klone mit 1,6 kb enthielten die gesamte Kodierungssequenz mit 1,3 kb, wie dargestellt in Fig. 14A-E. Die Sondensequenz NOR-770 ist lokalisiert bei Met&sub3;&sub4;&sub4;- Ala&sub3;&sub5;&sub5;.
Konstruktion von Expressionsplasmiden von EGI (Vollänge) und EGI' (gestutzt)
• Das EGI-Gen, das noch den poly-A-Schwanz enthielt, wurde in ein A. oryzae-Expressionsplasmid inseriert, wie in Fig. 2 umrissen. Die Kodierungsregion von EGI wurde von der NcoI-Stelle im einleitenden Met-Codon bis zur Bam HI-Stelle flußabwärts der poly-A-Region als ein 1450 bp langes Fragment aus pHW480 herausgeschnitten. Dieses wurde an ein 3,6 kb langes NcoI-NarI-Fragment aus pSX224 (Fig. 1) ligiert, das den TAKA-Promotor und den größten Teil von pUC19 enthielt, und an ein 960 bp langes NarI-BamHI-Fragment, das den restlichen Teil mit dem AMG-Terminator enthielt. Das 960 bp lange Fragment wurde aus p960 genommen, das äquivalent ist zu p777 (beschrieben in EP 238 023), mit der Ausnahme des inserierten Gens. Das resultierende Expressionsplasmid wird als pHW485 bezeichnet.
• Das Expressionsplasmid pHW704 mit dem Vollängen-EGI-Gen ohne poly-A-Schwanz ist in Fig. 3 dargestellt. Von der BstEII-Stelle 1300 bp flußabwärts der NcoI-Stelle wurde ein 102 bp langer BstEII-BamHI-Linker (2645/2646) inseriert, ligiert an die BglII-Stelle im Vektor. Der Linker enthält die Kodierungsregion flußabwärts der BstEII-Stelle mit 2 Stop-Codons am Ende und einer PvuI-Stelle nahe dem C-Terminus zur Verwendung für die Addition von CBD und B-Regionen.
• Expressionsplasmid pHW697 mit dem gestutzen EGI'-Gen wurde in ähnlicher Weise unter Verwendung eines BstEII-BamHI-Linkers (2492/2493) mit 69 bp konstruiert. In diesem Linker führten wir eine PstI-Stelle unter Anderung von Val&sub4;&sub2;, zu Leu&sub4;&sub2;&sub1; ein und die letzten 13 Aminosäuren der Kodierungsregion:
• K&sub4;&sub2;&sub3;PKPKPGHGPRSD&sub4;&sub3;&sub5; wurden eliminiert. Der kurze Schwanz mit der ziemlich unüblichen Sequenz wurde abgeschnitten, um EGI' einen C-Terminus zu geben, der demjenigen entspricht, der in T. reesei-EGI unmittelbar flußaufwärts der A- und B-Region zu finden ist.
Konstruktion eines Expressionsplasmids von EGI mit CBD und B- Region aus einer ~43 kD Endoglucanase C-terminal hinzugefügt
• Die ~43 kD-Endoglucanase von H. insolens, beschrieben in DK- Patentanmeldung Nr. 736/91, hat gute Waschleistung gezeigt. Neben der katalytischen Domäne besitzt die 43 kD-Cellulase eine C-terminale CBD und B-region, die zu EGI' transferiert worden ist, das selbst keine CBD oder B-Region besitzt. Die Konstruktion wurde in 2 Schritten durchgeführt, wie in Fig. 4 umrissen. Der PstI-HincII-Linker (028/030 M), der dazu gedacht war, den C-Terminus von EGI mit der B-Region von 43 kD-Cellulase zu verbinden, wurde subkloniert in pUC19-PstI-EcoRI mit C-terminalem, 100 bp langem Hinc2-EcoRI-Fragment aus dem 43 kD-Cellulase-Gen in pSX320 (Fig. 5; wie beschrieben in DK 736/91). Aus dem Subklon pHW767 wurde die CBD und B-Region als ein 250 bp langes PstI-BglII-Fragment herausgeschnitten und an pHW485(Fig. 2)-BstEII-BglII-Fragment mit 5,7 kb und an das restliche BstEII-PstI-Fragment mit 55 bp aus pHW697 (Fig. 3) ligiert. Das resultierende Expressionsplasmid pHW768 besitzt die ~43 kD-Endoglucanase-CBD und -B-Region, hinzugefügt zu Gln&sub4;&sub2;&sub2; von EGI'.
Konstruktion eines Expressionsplasmids von EGI mit der CBD und B-Region aus ~43 kD-Endoglucanase, C-terminal hinzugefügt
• Dieses Plasmid wurde in einer ähnlichen Art und Weise konstruiert wie pHW768, mit der Ausnahme, daß in diesem Falle der C- terminale Linker die vollständige Sequenz von EGI lieferte. Fig. 6 zeigt das Verfahren in drei Schritten. Der PvuI-HincII- Linker (040 M/041 M) wurde in pUC18 subkloniert, um pHW775 zu ergeben, in den ein 1.000 bp langes HincII-EcoRI-Fragment aus pSX 320 (Fig. 5) inseriert wurde, um pHW776 zu ergeben. Aus diesem wurde die CBD und B-Region als ein 250 bp langes PvuI- BglII-Fragment herausgeschnitten und an ein 5,7 kb langes BstEII-BglII-Fragment aus pHW485 (Fig. 2) und ein 90 bp langes BstEII-PvuI-Fragment aus pHW704 (Fig. 3) ligiert. Das resultierende Expressionsplasmid pHW777 enthält die ~43 kD-Endoglucanase-CBD und -B-Region, hinzugefügt zu Asp&sub4;&sub3;&sub5; in der vollständigen EGI-Sequenz.
Expression in A. oryzae von EGI und EGI mit und ohne die CBD und B-Region aus ~ 43 kD-Endoglucanase
• Die Expressionsplasmide pHW485, pHW704, pHW697, pHW768 und pHW777 wurden in A. orvzae IFO 4177 transformiert, wie beschrieben in Beispiel 2. Überstände von Transformanten, die in YPD-Medium gezüchtet worden waren, wie beschrieben, wurden mit SDS-PAGE analysiert, wo das native EGI ein scheinbares MG von 53 kD besitzt. EGI' sieht etwas kleiner aus als erwartet und die Spezies mit der hinzugefügten CBD- und B-Region sind im Molekulargewicht erhöht, entsprechend der Größe der CBD und B- Region, mit etwas hinzugefügten Kohlehydrat. Ein polyklonaler Antikörper AS169, gezüchtet gegen die ~43 kD-Endoglucanase, erkennt EGI und EGI nur, wenn die ~43 kD-CBD und -B-Region hinzugefügt sind, während alle 4 Spezies von einem polyklonalen Antikörper AS78 erkannt werden, der gegen eine Cellulasezubereitung aus H. insolens gezüchtet ist. Alle 4 Spezies besitzen Endoglucanase-Aktivität, wie gemessen auf löslicher Cellulose in der Form von Carboxymethylcellulose. Linker
Beispiel 5
• ~ 43 kD-Endoglucanase mit verschiedenen CBDs und B-Regionen:
• Um den Einfluß der verschiedenen CBDs und B-Regionen aus den A-Region-Klonen auf die ~ 43 kD-Endoglucanase zu testen, haben wir die ursprüngliche CBD und B-Region aus ~ 43 kD durch die anderen C-terminalen CBDs und B-Regionen ersetzt, d.h. A-1, A- 8, A-9, A-11 und A-19 (vgl. Beispiel 1). Um das Konzept zu testen, haben wir auch eine Konstruktion hergestellt, in der die 43 kD-B-Region weggelassen worden ist.
Fragmente:
• Alle Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Perkin-Elmer/Cetus DNA Amplification Systems unter Befolgung der Herstelleranweisungen hergestellt.
• 1) Ein PCR-Fragment wurde hergestellt, das die DNA von 56 bp flußaufwärts der BamHI-Stelle auf pSX 320 (Fig. 5) bis 717 bp in der Kodierungsregion des ~ 43 kD-Endoglucanase-Gens abdeckt und gleichzeitig eine Kpn I-Stelle an Pos. 708 und eine Sma I-Stelle an Pos. 702 in der Kodierungsregion einführt, was am direkten Beginn der B-Region liegt. Dieses PCR-Fragment wurde mit den Primern NOR 1542 und NOR 3010 hergestellt (siehe Oligonukleotid-Liste unten).
• 2) Ein PCR-Fragment wurde hergestellt, das die CBD und B-Region von A-1 einschließt, wobei eine Kpn I-Stelle am direkten Beginn der B-Region im Rahmen mit der Kpn I-Stelle, die in 1) eingeführt ist, eingeführt wird und eine Xho I-Stelle flußabwärts der Kodierungsregion des Gens eingeführt wird. Verwendete Primer: NOR 3012 flußaufwärts und NOR 3011 flußabwärts.
• 3) Wie 2), mit der Ausnahme, daß das Fragment die CBD und B- Region von A-8 und die Xho I-Stelle im Expressionsvektor flußabwärts vom Gen abdeckte. Primer: NOR 3017 und NOR 2516.
• 4) Wie 2), aber mit den Primern NOR 3016 und NOR 3015, abdekkend die CBD und B-Region von A-9.
• 5) Wie 3), aber mit den Primern NOR 3021 und NOR 2516, abdekkend die CBD und B-Region von A-11.
• 6) Wie 2), aber mit den Primern NOR 3032 und NOR 3022, abdekkend die CBD und B-Region von A-19.
• 7) Ein PCR-Fragment, das die CBD aus ~ 43 kD-Endoglucanase einschließt und die Xho I-Stelle flußabwärts vom Gen auf pSX 320, wobei eine Pvu II-Stelle am direkten Ende der B- Region eingeführt wird.
• Primer: NOR3023 und NOR2516.
Kombinationen:
• 1) + 2) inseriert als Bam HI-Kpn I und Kpn I-Xho I in pToC 68-(beschrieben in DK736/91)Bam HI-Xho I, somit kodierend für das 43 kD-Kernenzym mit der CBD und B-Region aus A-1.
• 1) + 3): Wie oben, was ein 43 kD-Enzym mit der A-8-CBD/B-Region ergibt.
• 1) + 4): Wie oben, aber mit der A-9-CBD und -B-Region.
• 1) + 5): Wie oben, aber mit der A-11-CBD und -B-Region.
• 1) + 6): Wie oben, aber mit der A-19-CBD und -B-Region.
• 1) + 7), inseriert als Bam HI - Sma I und Pvu II - Xho I in pToC-68 Bam HI-Xho I, somit kodierend für das 43 kD-Enzym ohne die B-Region. Oligonukleotide:
Beispiel 6 Fusion einer bakteriellen katalytischen Domäne an eine Pilz- CBD
• Die Endoglucanase Endol, produziert von Bacillus lautus NCIMB 40250 (beschrieben in PCT/DK91/00013), besteht aus einer katalytischen Domäne (Kern) (Ala(32)-Val(555)) und einer C-terminalen Cellulosebindungsdomäne (CBD) (Gln556-Pro700), homolog zu der CBD einer B. subtilis-Endoglucanase (R.M. Mackay et al. 1986. Nucleic Acids Res. 14, 9159-70). Die CBD wird proteolytisch abgespalten, wenn das Enzym in B. subtilis oder E. coli exprimiert wird, wodurch ein CMC-abbauendes Kernenzym erzeugt wird. In diesem Beispiel wurde dieses Kernenzym mit der B-Region und CBD der ~ 43 kD-Endoglucanase aus Humicola insolens (beschrieben in DK 736/91) fusioniert.
Konstruktion der Fusion
• Das Plasmid pCaHj 170, das das cDNA-Gen enthält, das die ~ 43 kD-Endoglucanase kodiert, wurde konstruiert, wie in Fig. 7 dargestellt. pCaHj 170 wurde mit Xho II und Sal I verdaut. Das 223 bp lange Xho II-Sal I-Fragment wurde isoliert und in pUC19 (Yanisch-Perron et al. 1985. Gen 33, 103-119), der mit BamHI und Sal I verdaut worden war, ligiert. Die BamHI-Stelle wurde durch diese Xho II-Bamh I-Ligation wiederhergestellt. Das resultierende Plasmid, IM 2, wurde mit Eco R1 und BamHI verdaut und mit dem Linker NDR 3045-NOR 3046 ligiert:
• Das resultierende Plasmid, IM 3, wurde mit EcoR V und SacII verdaut und an das 445 bp lange Hinc II-Sac II-pPL 517-Fragment ligiert. PPL 517 enthält das gesamte Bacillus-Endo 1-Gen (PCT/DK91/00013). Das Produkt dieser Ligation wurde mit IM 4 bezeichnet. Um das Bacillus-Signalpeptid von Endo 1 durch das Pilz-Signalpeptid aus der 43 kdal-Endoglucanase zu ersetzen, wurden vier PCR-Primer für "Splicing by Overlap Extension"(SOE)-Fusion (R M Horton et al. (1989): Gene, 77, 61-68) konstruiert. Die 43 kD-Signalsequenz wurde aus dem Plasmid pCaHj 109 (DK 736/91) amplifiziert, wodurch eine Bcl I-Stelle im 5'-Ende und eine 21 bp lange Homologie zum Bacillus-endo 1- Gen im 3'-Ende unter Verwendung des 5'-Primers NOR 3270 und des 3'-Primers NOR 3275 eingeführt wurde. Der Teil des Endo 1- Gens 5' zur einzigen Sac II-Stelle wurde amplifiziert unter Verwendung des 5'-Primers NOR 3276, wodurch eine 21 bp lange Homologie zum 43 kdal-Gen eingeführt wurde, und des 3'-Primers NOR 3271, der die Sac II-Stelle abdeckt. Die zwei PCR-Fragmente wurden vermischt, geschmolzen, anneliert und aufgefüllt mit der Taq-Polymerase (Fig. 9). Das resultierende Hybrid wurde unter Verwendung der Primer NOR 3270 und NOR 3271 amplifiziert. Das hybride Fragment wurde mit Bcl 1 und SacII verdaut und an das 676 bp lange Sac II-Sal I-Fragment aus IM 4 und den Aspergillus-Expressionsvektor pToC 68 (DK 736/91), verdaut mit BamHI und Xho I, ligiert. Das Produkt dieser Ligation, pCaHj 180 (Fig. 10), enthielt einen offenen Leserahmen, der das 43 kD-Signalpeptid und die ersten vier N-terminalen Aminosäuren der reifen ~ 43 kD-Endoglucanase (Met(1)-Arg(25), fusioniert an den Kern von Endo 1 (Ser(34)-Val(549)), gefolgt vom Peptid Ile-Ser-Glu (kodiert durch den Linker), fusioniert an die 43 kD-B-Region und -CDB (Ile(233)-Leu(285)) enthielt. pCaHj 180 wurde verwendet, um Aspergillus oryzae IFO 4177 unter Selektion auf Acetamid durch Cotransformation mit pToC 90 (vgl. DK 736/91) zu transformieren, wie beschrieben in der veröffentlichten EP-Patentanmeldung Nr. 238 023.
• Die Sequenz des Endo 1-Kerns und der ~ 43 kD-CBD und -B-Region ist in der beigefügten Fig. 15A-D dargestellt.

Claims (18)

1. Ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym, das aus einem anderen Pilz als Trichoderma oder Phanerochaete gewonnen werden kann und das eine Kohlehydratbindungsdomäne umfaßt, die homolog ist zu einer terminalen A-Region von Trichoderma reesei-Cellulasen, wobei diese Kohlehydratbindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt

worin

in Position 1, die Aminosäure Trp oder Tyr ist;

in Position 2, die Aminosäure Gly oder Ala ist;

in Position 7, die Aminosäure Gln, Ile oder Asn ist;

in Position 8, die Aminosäure Gly oder Asn ist;

in Position 9, die Aminosäure Trp, Phe oder Tyr ist;

in Position 10, die Aminosäure Ser, Asn, Thr oder Gln ist;

in Position 12, die Aminosäure Pro, Ala oder Cys ist;

in Position 13, die Aminosäure Thr, Arg oder Lys ist;

in Position 14, die Aminosäure Thr, Cys oder Asn ist;

in Position 18, die Aminosäure Gly oder Pro ist;

in Position 19, die Aminosäure (wenn vorhanden) Ser, Thr, Phe, Leu oder Ala ist;

in Position 20, die Aminosäure Thr oder Lys ist;

in Position 22, die Aminosäure Thr, Arg, Glu oder Lys ist;

in Position 23, die Aminosäure Lys, Gln oder Ala ist; oder

in Position 22 und 23, die Aminosäuren Thr Lys, Arg Gln, Val Lys, Lys Lys, Arg Ala oder Glu Lys sind;

in Position 24, die Aminosäure Gln oder Ile ist;

in Position 26, die Aminosäure Gln, Asp oder Aia ist;

in Position 27, die Aminosäure Trp oder Phe ist;

in Position 29, die Aminosäure Ser, His, Tyr oder Ala ist; und/oder

in Position 32, die Aminosäure Leu, Ile, Gln, Val oder Thr ist,

oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein unlösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken.

2. Ein Enzym nach Anspruch 1, das gewonnen werden kann aus einem Stamm von Humicola, Fusarium oder Myceliopthora.

3. Ein Cellulose oder Hemicellulose abbauendes Enzym, das aus einem anderen Pilz als Trichoderma oder Phanerochaete gewonnen werden kann und das eine Kohlehydratbindungsdomäne umfaßt, die homolog ist zu einer terminalen A-Region von Trichoderma reesei-Cellulasen, wobei die Kohlehydratbindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt

oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein unlösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken.

4. Ein Enzym nach Anspruch 3, das gewonnen werden kann aus einem Stamm aus Humicola, Fusarium oder Myceliopthora.

5. Ein Enzym nach einem der Ansprüche 1-4, das außerdem eine Aminosäuresequenz umfaßt, die eine verknüpfende B-Region definiert, die die Kohlehydratbindungsdomäne mit der katalytisch aktiven Domäne des Enzyms verbindet, wobei die B- Region die folgende Aminosäuresequenz umfaßt

6. Ein Enzym nach einem der Ansprüche 1-5, das eine Kohlehydratbindungsdomäne, die abgeleitet ist von einem natürlich auftretenden Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, einer Aminosäuresequenz, die eine verknüpfende B-Region definiert, wobei diese Aminosäuresequenz abgeleitet ist von einem anderen natürlich auftretenden Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, sowie eine katalytisch aktive Domäne umfaßt, die abgeleitet ist von dem Enzym, das entweder die Kohlehydratbindungsdomäne oder B-Region liefert, oder von einem dritten Enzym.

7. Ein Enzym nach Anspruch 6, wobei die katalytisch aktive Domäne abgeleitet ist von einem Enzym, das in der Natur im wesentlichen aus einer katalytisch aktiven Domäne besteht.

8. Ein Enzym nach einem der Ansprüche 1-7, das eine Cellulase, z.B. eine Endoglucanase, Cellobiohydrolase oder β-Glucosidase, ist.

9. Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein Enzym nach einem der Ansprüche 1-8 kodiert.

10. Ein Expressionsvektor, der ein inseriertes DNA-Konstrukt nach Anspruch 9 trägt.

11. Eine Zelle, die mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 9 oder mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 10 transformiert ist.

12. Eine Zelle nach Anspruch 11, die eine Pilzzelle ist, die z.B. zu einem Stamm von Aspergillus, z.B. Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae, gehört, oder eine Hefezelle, die z.B. zu einem Stamm von Saccharomyces, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, gehört.

13. Ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Zelle nach Anspruch 11 oder 12 unter Bedingungen kultiviert wird, die für die Produktion des Enzyms förderlich sind, und das Enzym anschließend aus der Kulturbrühe gewonnen wird.

14. Ein Mittel zum Abbau von Cellulose oder Hemicellulose, wobei das Mittel ein Enzym nach einem der Ansprüche 1-8 umfaßt.

15. Ein Mittel nach Anspruch 14, das eine Kombination von zwei oder mehreren Enzymen nach einem der Ansprüche 1-8 umfaßt oder eine Kombination von einem oder mehreren Enzymen nach einem der Ansprüche 1-8 mit einem oder mehreren anderen Enzymen mit Cellulose oder Hemicellulose abbauender Aktivität.

16. Eine Kohlehydratbindungsdomäne, die homolog ist zu einer terminalen A-Region von Trichoderma reesei-Cellulasen, wobei diese Kohlehydratbindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt

worin

in Position 1, die Aminosäure Trp oder Tyr ist;

in Position 2, die Aminosäure Gly oder Ala ist;

in Position 7, die Aminosäure Gln, Ile oder Asn ist;

in Position 8, die Aminosäure Gly oder Asn ist;

in Position 9, die Aminosäure Trp, Phe oder Tyr ist;

in Position 10, die Aminosäure Ser, Asn, Thr oder Gln ist;

in Position 12, die Aminosäure Pro, Ala oder Cys ist;

in Position 13, die Aminosäure Thr, Arg oder Lys ist;

in Position 14, die Aminosäure Thr, Cys oder Asn ist;

in Position 18, die Aminosäure Gly oder Pro ist;

in Position 19, die Aminosäure (wenn vorhanden) Ser, Thr, Phe, Leu oder Ala ist;

in Position 20, die Aminosäure Thr oder Lys ist;

in Position 22, die Aminosäure Thr, Arg, Glu oder Lys ist;

in Position 23, die Aminosäure Lys, Gln oder Ala ist; oder in Position 22 und 23, die Aminosäuren Thr Lys, Arg Gln, Val Lys, Lys Lys, Arg Ala oder Glu Lys sind;

in Position 24, die Aminosäure Gln oder Ile ist;

in Position 26, die Aminosäure Gln, Asp oder Ala ist;

in Position 27, die Aminosäure Trp oder Phe ist;

in Position 29, die Aminosäure Ser, His, Ala oder Tyr ist; und/oder

in Position 32, die Aminosäure Leu, Ile, Gln, Val oder Thr ist,

oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein uniösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken.

17. Eine Kohlehydratbindungsdom;ne, die zu einer terminalen A- Region von Trichoderma reesei-Cellulasen homolog ist, wobei die Kohlehydratbindungsdomäne die folgende Aminosäuresequenz umfaßt

oder eine Untersequenz derselben, die in der Lage ist, die Bindung des Enzyms an ein unlösliches Cellulose- oder Hemicellulosesubstrat zu bewirken.

18. Eine verknüpfende B-Region, abgeleitet von einem Cellulose oder Hemicellulose abbauenden Enzym, wobei besagte Region die folgende Aminosäuresequenz umfaßt