FI118340B - Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö - Google Patents

Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI118340B
FI118340B FI20055202A FI20055202A FI118340B FI 118340 B FI118340 B FI 118340B FI 20055202 A FI20055202 A FI 20055202A FI 20055202 A FI20055202 A FI 20055202A FI 118340 B FI118340 B FI 118340B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cellulase
gly
amino acid
ser
pro
Prior art date
Application number
FI20055202A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20055202A (fi
FI20055202A0 (fi
Inventor
Jari Vehmaanperae
Marja Paloheimo
Leena Valtakari
Jarno Kallio
Pentti Ojapalo
Marika Alapuranen
Terhi Puranen
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Publication of FI20055202A0 publication Critical patent/FI20055202A0/fi
Priority to FI20055202A priority Critical patent/FI118340B/fi
Priority to MX2007013474A priority patent/MX2007013474A/es
Priority to PCT/FI2006/050161 priority patent/WO2006117432A1/en
Priority to CN200680014750.8A priority patent/CN101171333B/zh
Priority to ES06725936.6T priority patent/ES2458301T3/es
Priority to DK06725936.6T priority patent/DK1874927T3/da
Priority to EP06725936.6A priority patent/EP1874927B1/en
Priority to PT67259366T priority patent/PT1874927E/pt
Priority to BRPI0609906A priority patent/BRPI0609906A8/pt
Priority to HN2006016339A priority patent/HN2006016339A/es
Priority to DO2006000101A priority patent/DOP2006000101A/es
Publication of FI20055202A publication Critical patent/FI20055202A/fi
Priority to NI200700261A priority patent/NI200700261A/es
Application granted granted Critical
Publication of FI118340B publication Critical patent/FI118340B/fi
Priority to MA30319A priority patent/MA29405B1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic

Description

118340
Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee uusia sellulaasifuusioproteiineja, valmisteita ja koostumuksia, jotka sisältävät näitä sellulaasifuusioproteiineja, eks-5 pressiovektoreita, isäntäsoluja ja menetelmiä näiden valmistamiseksi ja sellu-laasien, valmisteiden ja koostumusten käyttöä tekstiili-, pesuaine- ja kulumassa- ja paperiteollisuudessa.
Keksinnön tausta
Selluloosa on β-1,4-sidosten yhdistämien glukoosiosien suoraketjui-10 nen polysakkaridi. Luonnossa selluloosa liitetään yleensä ligniiniin yhdessä hemiselluloosien, kuten ksylaanien ja glukomannaanien, kanssa. Sellulolyytti-set entsyymit hydrolysoivat selluloosaa ja niitä tuotetaan laajassa valikoimassa bakteereja ja sieniä. Sellulaasit ovat teollisesti tärkeitä entsyymejä, joiden nykyinen vuotuinen markkina-arvo on noin 19 miljoonaa US$. Tekstiiliteollisuu-15 dessa sellulaaseja käytetään denimin viimeistelyssä muodikkaan kivipestyn ulkomuodon luomiseksi denim-kankaille biokivipesumenetelmässä ja niitä käytetään myös esimerkiksi poistamaan nukkaa ja ehkäisemään nyppyjen muodostumista puuvillavaatteiden pintaan. Pesuaineteollisuudessa sellulaaseja käyte-tään värien kirkastamiseksi ja vaatteiden harmaantumisen ja nyppyyntymisen • · · 20 ehkäisemiseksi. Sellulaaseja käytetään edelleen elintarviketeollisuudessa ja eläinten rehun valmistamisessa ja niillä on suuri potentiaali kuitumassa- ja pa- • periteollisuudessa, esimerkiksi siistauksessa värin vapauttamiseksi kuitupin- • ·· · : .·. noista ja vedenpoiston kuitumassasta parantamisessa. Sellullaasien teollisten "*·. käyttötapojen laaja kirjo on muodostanut kaupallisten sellulaasituotteiden tar- • « 25 peen, jotka sisältävät erilaisia sellulaasikomponentteja ja toimivat optimaalises- .. ti erilaisilla pH- ja lämpötilaväleillä.
• ·
Sellulaasien käytännöllistä käyttöä vaikeuttaa tunnettujen sellu- • · *·;·' laasien luonne, jotka ovat usein sellulaasien seoksia, joilla on useita aktiivi- suuksia ja substraattispesifisyyksiä. Tästä syystä on pyritty aikaansaamaan • · :*"· 30 sellulaaseja, joilla olisi vain toivotut aktiivisuudet. Kunkin sellulaasin ainutlaa- • · · , *. tuiset ominaisuudet tekevät joistakin sellulaaseista sopivampia tiettyihin tarkoi- • · ♦ j tuksiin kuin toisista. Entsyymien erotessa toisistaan monin tavoin yksi tär- keimmistä eroista on pH-optimi. Neutraalit sellulaasit ovat aktiivisimpia pH-välillä 6-8 ja emäksiset sellulaasit pH-välillä 7,5-10, kun taas happamat sellu-35 laasit, joiden pH-optimi on pH 4,5-5,5, osoittavat erittäin alhaisia aktiivisuus- 2 118340 tasoja korkeammissa pH-arvoissa. Neutraalit ja happamat sellulaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiiliteollisuudessa. Kankaan käsittelyssä sellulaasit hyökkäävät puuvillakuituja muodostavia selluloosamolekyylien ketjuja vastaan tällä tavoin vaikuttaen kankaan ominaispiirteisiin.
5 Tekstiiliteollisuudessa "kivipesty” ulkonäkö tai kulunut (abraded) ul konäkö ovat olleet denimin tuottajien mielenkiinnon kohteena viime vuosina. Perinteinen kivipesu hohkakivillä vähentää kankaan lujuutta ja kuormittaa pesukoneita. Trendi on ollut kohti entsymaattisia denimin viimeistelymenetelmiä ja sellulaasit ovat korvanneet tai niitä käytetään yhdessä hohkakivien kanssa 10 antamaan kankaalle toivottu "kulunut” ulkonäknö. Kontrolloitu entsyymikäsittely johtaa vaatteiden ja koneiden vähempään vahingoittumiseen ja poistaa kivien hävittämistarpeen.
Denimin käsittelyssä käytetyt sellulaasit jaetaan yleensä kahteen pääryhmään: happamiin ja neutraaleihin sellulaaseihin. Happamat sellulaasit 15 tyypillisesti toimivat pH:ssa 4,5-5,5 ja neutraalit sellulaasit pH-välillä 6-8. Bio- kivipesussa käytetyt happamat sellulaasit ovat pääosin peräisin Trichoderma reeseistä (suvullinen muoto Hypocrea jecorina) ja neutraalit sellulaasit tulevat useista sienistä, mukaan lukien suvut Melanocarpus, Humicola, Thielavia, My- celiophthora, Fusarium, Acremonium ja Chrysosporium (Haakana et ai. 2004).
.·. : 20 T. reesei -entsyymit sisältävät esim. seilulaaseja glykosidiperheestä 5 (endo- • · · ,·./ glukanaasi II, EGII), perheestä 7 (sellobiohydrolaasi I, CBHI) ja perheestä 12 .;*! (endoglukanaasi III, EGIII; Ward et ai. 1993) ja neutraaleja seilulaaseja, / useimmin endoglukanaaseja, perheestä 45 ja perheestä 7 (Henrissat, 1991; |: ; Henrissat ja Bairoch, 1993).
: 25 Sellulaasit käsittävät katalyyttisen domeenin/ytimen (CD), joka il- ··· mentää sellulaasiaktiivisuutta. Katalyyttisen domeenin lisäksi sellulaasimole- kyyli voi käsittää yhden tai useampia selluloosaa sitovia domeeneja (CBD:t), joita kutsutaan myös hiilihydraattia sitoviksi domeeneiksi/moduleiksi :***· (CBD/CBM), jotka voivat sijaita katalyyttisen domeenin joko N- tai C-termi- »·· 30 nuksessa. CBD.eilla on hiilihydraattia sitovaa aktiivisuutta ja ne välittävät sellu- • · · *;*;* laasin sitoutumisen kiteiseen selluloosaan, mutta niillä on vain vähän tai ei φ · '··** lainkaan vaikutusta sellulaasientsyymin hydrolyyttisen aktiivisuuteen liukoisia : substraatteja kohtaan. Nämä kaksi domeenia tyypillisesti yhdistyvät joustavan ♦;··: ja erittäin glykosyloidun linkkerialueen kautta.
35 Sellulaasit, jotka hyökkäävät pääosin kuidun pintaa vastaan, ovat erityisen käyttökelpoisia indigo-värillä värjätyn denimin kivipesussa, koska väri 3 118340 sijaitsee kuidun pinnalla. Käytettäessä puuvillakankaiden käsittelyyn neutraalit sellulaasit yleensä vaativat pidemmän pesuajan kuin happamat sellulaasit. Kuitenkin neutraalit sellulaasit toimivat vähemmän aggressiivisesti puuvillalle kuin happamat sellulaasit eivätkä vaikuta kankaan lujuuteen yhtä paljon kuin 5 happamat sellulaasit. Neutraaleilla sellulaaseilla on laajempi pH-profiili ja siten pH:n lisäyksellä, joka tapahtuu biokivipesun aikana, on pieni vaikutus neutraalien sellulaasientsyymien aktiivisuuteen. Kuitenkin koska sellulaasikäsittelyillä on myös epäsuotavia vaikutuksia, kuten kuitujen vahingoittuminen ja lujuuden häviäminen, täytyy etsiä sopiva tasapaino toivottujen ja ei-haluttujen vaikutus-10 ten välille.
WO97/14804, joka sisällytetään tähän viitteellä, esittää kolme uutta Melanocarpuksesta peräisin olevaa neutraalia sellulaasia, jotka ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiili- ja pesuaineteollisuudessa. Nimenomaisesti 20 kDa:n endoglukanaasi (Cel45A), 50 kDa:n endoglukanaasi (Cel7A) ja 50 kDa:n sel-15 lobiohydrolaasi (Cel7B) kuvataan. Nämä sellulaasit, jotka tässä nimetään ”20K-sellulaasiksi”, ”50K-sellulaasiksi” ja ”50K-sellulaasiB:ksi” mainitussa järjestyksessä, ovat peräisin Melanocarpus albomycesistä ja osoittavat hyviä ki-vipesuvaikutuksia.
Koska erityisesti tekstiili- ja pesuaineteollisuudessa on voimassa 20 oleva vaatimus edelleen parannetuille sellulaaseille, on ehdotettu, että paran- ,···] nuksia sellulaaseissa voitaisiin aikaansaada muodostamalla fuusioproteiineja.
Myös julkaisussa WO97/14804 yleensä ehdotetaan 20K-sellulaasin, 50K- / / sellulaasin ja 50K-sellulaasiB:n fuusioproteiinikostrukteja esimerkiksi Tricho- • · · : derma reesei -sellulaasin, hemisellulaasin tai mannaasin tai niiden toiminnal- | 1 !·! : 25 listen domeenien kanssa. Edelleen uusien ominaisuuksien luomiseksi esitetyil- • · · le sellulaaseille ehdotetaan esitettyjen sellulaasien fuusioita domeenien, kuten selluloosaa sitovan domeenin (CBD), edullisesti sen linkkerin, kanssa. Kuiten-kaan mitään spesifisiä esimerkkejä ei anneta eikä tavoiteltuja uusia ominai-suuksia kuvata.
• · · 30 Sellulaasifuusioproteiinit ovat lisäksi tunnettuja esimerkiksi julkaisus- ta W096/29397, joka esittää endoglukanaaseja, jotka muodostuvat endoglu- • · *·;·* kanaasien Myceliophthora thermophilasta, Macrophomina phaseolinasta ja i'.**: Crinipellis scabellasta ja CBD/linkkerin Humicola insolensista välisellä fuusiol- *;··: la. Näillä endoglukanaaseilla ei luonnollisessa muodossaan ole CBD/linkkeriä.
35 EP 663 950 esittää sellulaasivariantteja, erityisesti Humicola inso- lensin 43 kDa:n sellulaasivariantteja, joissa sellulaasit voivat sisältää sidosalu- 4 118340 een toisesta mikro-organismilajista esimerkiksi saaden aikaan parannettuja ominaisuuksia, kuten parannetun vastustuskyvyn anionisia surfaktantteja, hapettumista tai valkaisuaineita vastaan.
Kuitenkin on jatkuva tarve parannetuille sellulaaseille, jotka ovat 5 myös vähemmän haitallisia kuidulle tekstiiliteollisuudessa ja muilla aloilla, joissa sellulaaseja perinteisesti käytetään. Etenkin on jatkuva tarve tehokkaammille sellulaaseille menetelmän taloudellisuuden parantamiseksi.
Esillä oleva keksintö tähtää tämän tarpeen kohtaamiseen.
Keksinnön lyhyt kuvaus 10 Esillä olevan keksinnön kohde on saada aikaan uusia sellu- laasifuusioproteiineja, joilla on parannetut hydrolyyttiset ominaisuudet käytettäväksi tekstiiliteollisuudessa, erityisesti kivipestyssä denimissä, ja käytettäväksi pesuainekoostumuksissa sekä muilla aloilla. Keksinnön mukaiset uudet sellulaasifuusioproteiinit ovat aktiivisia neutraaleissa ja emäksisissä pH-15 arvoissa, niillä on suuresti parannettu pesuteho tekstiilin bioviimeistely- ja bio-kivipesusovelluksissa ja pesuainesovelluksissa ja ne eivät kuitenkaan vaaranna kankaiden lujuutta. Keksinnön mukaisten sellulaasifuusioproteiinien parannetun tehokkuuden myötä entsyymien valmistusmenetelmä on merkittävästi . taloudellisempi. Lisäetuja saavutetaan myös entsyymituotteiden logistiikan ja * .·..*** 20 varastoinnin suhteen, kun pienempiä määriä entsyymituotetta tarvitaan.
• · ’;·*] Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on saada aikaan polynukleoti- *· " dejä, jotka koodittavat esillä olevan keksinnön mukaisia uusia sellulaasifuusio- • · : proteiineja.
• · · Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on saada aikaan uusia eks- 25 pressioplasmideja tai -vektoreita, jotka sisältävät sellaisia polynukleotideja, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevan keksinnön mukaisten uusien sellu-:**·., laasifuusloproteiinien tuotannossa, ja näillä ekspressioplasmideilla transformoi- .***. tuja uusia isäntiä.
*" Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on saada aikaan entsyymi- * · · *v 30 valmisteita, jotka sisältävät yhtä tai useampia sellulaasifuusioproteiineja, joilla on parannetut hydrolyyttiset ominaisuudet.
• Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan ent- • * · * syymivalmisteiden ja sellulaasifuusioproteiinien käyttömenetelmiä tekstiilien viimeistelemiseksi, erityisesti denimin biokivipesuun.
35 Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan keinot käyttää keksinnön mukaisia entsyymivalmisteita pesuainekoostumuksissa.
5 118340
Esillä oleva keksintö koskee uutta sellulaasifuusioproteiinia, joka käsittää A. valinnaisesti modifioidun yhdestä lajista peräisin olevan sellulaa-sin ytimen ensimmäisen aminohapposekvenssin, ja 5 B. valinnaisesti modifioidun toisesta lajista peräisin olevan linkkeri- alueen ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) toisen aminohapposekvenssin, jossa liitosalue on tuotu ensimmäisen aminohapposekvenssin ja toisen aminohapposekvenssin väliin stabiilin fuusioproteiinin aikaansaamiseksi, 10 jolloin liitosalueella on seuraava yleinen kaava: 1A - 2B - 3C - 4D -5E - 6F, jossa 1A on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 1A on 15 Gly tai Vai, edullisimmin Gly; 2B on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile, Phe, Vai, Glu, Asp, Gin ja Asn; edullisesti 2B on Pro, Gin tai Glu; 3C on valittu ryhmästä Gly, Ala, Lys, Leu, Pro, Ile, Vai, Ser ja Thr; edullisesti 3C on Ile; ;\j 20 4D on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 4D on .···! Gly tai Pro; • · SE on valittu ryhmästä Ser, Pro ja Thr; edullisesti 5E on Ser; ja .* .* eF on valittu ryhmästä Ser, Thr tai poissa oleva, edullisesti 6F on Ser • * * tai poissa oleva; jolloin 1A on liitetty selluiaasin ytimen C-terminaaliseen ami-25 nohapposekvenssiin ja F on liitetty linkkerin ja/tai selluloosaa sitovan domee-nin (CBD) N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen ekspressiovektoria, joka käsit-j'·.. tää ensimmäisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa valinnaisesti modifi- oitua yhdestä lajista peräisin olevaa selluiaasin ytimen ensimmäistä amino-30 happosekvenssiä, ja toisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa valinnai-sesti modifioitua toisesta lajista peräisin olevaa linkkerialueen ja/tai selluloosaa • · '*:** sitovan domeenin (CBD) toista aminohapposekvenssiä, ja mainittuja ensim- ia:*: mäistä ja toista polynukleotidisekvenssiä yhdistävää liitosaluetta koodittavan ·;··· polynukleotidisekvenssin mainittujen polynukleotidisekvenssien koodittaessa 35 keksinnön mukaisten sellulaasifuusioproteiinien vastaavia aminohapposekvenssejä.
6 118340
Esillä oleva keksintö koskee edelleen uusia keksinnön mukaisilla vektoreilla transformoituja isäntiä, erityisesti isäntiä, jotka pystyvät keksinnön mukaisen sellulaasifuusioproteiinin korkeaan ekspressiotasoon.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen entsyymivalmistetta, joka si-5 sältää yhtä tai useampia keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen keksinnön mukaisten entsyy-mivalmisteiden käyttömenetelmää tekstiilien viimeistelemiseksi, erityisesti de-nimin biokivipesuun.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen keksinnön mukaisten entsyy-10 mivaimisteiden käyttöä pesuainekoostumuksissa.
Piirustukset
Kuva 1 on kaaviokuva plasmidista pALK1480.
Kuva 2 on kaaviokuva plasmidista pALK492 Kuva 3 on kaaviokuva plasmidista pALK424.
15 Kuva 4 on kaaviokuva plasmidista pALK1237.
Kuva 5 on kaaviokuva plasmidista pALK1241.
Kuva 6 on kaaviokuva plasmidista p3SR2.
Kuva 7 on kaaviokuva plasmidista pALK1649.
... . Kuva 8 on kaaviokuva plasmidista pALK1694.
20 Kuva 9A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei • · *;*·] -protoplastien transformaatiossa 20K+CBD-fuusioproteiinien tuottamiseksi.
'/'i 20K+CBD-geeni oli cbh 1-promoottorin (cel7A) (cbh1 prom) kontrollin alainen ja : transkription terminaatio varmistettiin käyttämällä cbh1-terminaattorisekvenssiä • · ·.· : (term). amofS-geeni (amdS) ja cbhf-3’-reunasekvenssi (cbh1 3’ flanking) sisäl- 25 lytettiin. Kuva 9B. Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa Melanocarpus al- bomycesin 20K-proteiini (Cel45A) sulautetaan Trichoderma reesein CBHI:n ·*·., (Cel7A) linkkeripeptidiin, jota seuraa selluloosaa sitova domeeni (CBD) * .··*. pALK1434- ja pALK1435-plasmideissa. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on alleviivattu ja CBD-alueen aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla.
*. V 30 CBD-alueen ensimmäinen aminohappo on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
Kuva 10 A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei j -protoplastien transformaatiossa 20K+CBD-fuusioproteiinien tuottamiseksi.
··· · 20K+CBD-geeni oli cbhf-promoottorin (cel7A) (cbh1 prom) kontrollin alainen ja transkription terminaatio varmistettiin käyttämällä cbh f-terminaattorisekvenssiä 35 (term). amdS-geeni (amdS) ja cbh1-3’-reunasekvenssi (cbh1 3’ flanking) sisällytettiin. Kuva 10B. Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa Melanocarpus 7 118340 albomycesin 20K-proteiini (Cel45A) sulautetaan Trichoderma reesein CBHI:n (Cel7A) linkkeripeptidiin, jota seuraa selluloosaa sitova domeeni (CBD) pALK1768-, pALK1769-, pALK1770 ja pALK1775-plasmideissa. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on alleviivattu ja CBD-alueen aminohapposekvenssi on 5 merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen aminohappo on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
Kuva 11 A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei -protoplastien transformaatiossa 20K+CBDmurfuusioproteiinien tuottamiseksi. 20K+CBDmut-geeni oli cbM-promoottorin (cel7A) (cbh1 prom) kontrollin alainen 10 ja transkription terminaatio varmistettiin käyttämällä cbhf-terminaattorisek-venssiä (term). amdS-geeni sisällytettiin transformaatiomarkkerina. Kuva 11B. Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa Metanocarpus albomycesin 20K-proteiini (Cel45A) sulautetaan Trichoderma reesein CBHI:n (Cel7A) linkkeripeptidiin, jota seuraa selluloosaa sitova domeeni (CBD). Aminohapposubsti-15 tuutiot pALK1877-pALK1880 -ekspressiokasettien CBD-alueessa esitetään myös. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on alleviivattu ja CBD-alueen aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen aminohappo ja tyrosiinit tai niiden substituutiot on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
Kuva 12A. T. reesein CBHIrn (Cel7A) interdomeenilinkkeripeptidin 20 aminohapposekvenssi. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on alleviivattu.
,'···[ AG-444 ja AG-460 edustavat aminohappojen 434—444 ja 434-460 linkkeride- • · "*. leetiota mainitussa järjestyksessä. Kuva 12B. Liitoskohdan aminohappose- !* / kvenssi, jossa Meianocarpus albomycesin 20K-proteiini (Cel45A) sulautetaan • · *
Trichoderma reesein CBHIrn (Cel7A) typistettyyn linkkeripeptidiin, jota seuraa »jj 25 koskematon tai mutatoitu selluloosaa sitova domeeni (CBD) pALK1893-, pALK1896-, pALK1899 ja pALK1952-ekspressiokaseteissa. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on alleviivattu ja CBD-alueen aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen aminohappo ja tyrosiinit tai nii-den substituutiot on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
• tt 30 Kuva 13A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei -protoplastien transformaatiossa 50K+CBD-fuusioproteiinien tuottamiseksi.
• · '·;·* 50K+CBD-geeni on T. reesein cbh 1-promoottorin (cbh1 prom) kontrollin alai- jj*: nen ja transkription terminaatio varmistetaan cbhf-terminaattorin (term) lisäyk- ·:··· sellä. amc/S-geeni (amdS) ja cb/if-3’-reunasekvenssi sisällytetään. Kuva 13B.
35 Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa M. albomycesin 50K liitetään T. reesein CBHIrn linkkeri+CBDriin. Linkkerialueen sisältämät aminohapot on ai- 8 118340 leviivattu ja CBD-alueen aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen aminohappo on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
Kuva 14A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei -protoplastien transformaatiossa 50K+CBD-fuusioproteiinien tuottamiseksi.
5 50K+CBD-geeni on T. reesein cbh 1-promoottorin (cbhlprom) kontrollin alainen ja transkription terminaatio varmistetaan cä/if-terminaattorin (term) lisäyksellä. amc/S-geeni (amdS) ja cbh f-3’-reunasekvenssi sisällytetään. Kuva 14B. Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa M. albomycesin 50KB liitetään T. reesein CBHI:n linkkeri+CBD:iin. Linkkeriaiueen aminohapot on alleviivattu ja CBD-10 alueen aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen aminohappo on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
Kuva 15A. Ekspressiokasetti, jota käytettiin Trichoderma reesei -protoplastien transformaatiossa rekombinantin Thermoascus aurantiacuksen CBHI+CBD-fuusioproteiinien tuottamiseksi. CBHI+CBD-geeni oli cbh1-pro-15 moottorin (ceI7A) (cbh1 prom) kontrollin alainen ja transkription terminaatio varmistettiin käyttämällä cbh f-terminaattorisekvenssiä (term). amdS-geeni sisällytettiin transformaatiomarkkerina. Kuva 15B. Liitoskohdan aminohapposekvenssi, jossa Thermoascus aurantiacuksen CBHI-proteiini sulautetaan Trichoderma reesein CBHI:n linkkeripeptidiin, jota seuraa selluloosaa sitova domeeni ;\t: 20 (CBD). Linkkeriaiueen sisältämät aminohapot on alleviivattu ja CBD-alueen .···,' aminohapposekvenssi on merkitty kursiivilla. CBD-alueen ensimmäinen ami- f · nohappo on ilmaistu yläindeksinumeroilla.
.* / Kuva 16. RF5977- ja RF6090-kantojen, jotka ilmentävät keksinnön • « t ;··*/ mukaisia fuusioproteiineja teho verrattuna kaupalliseen 20K-valmisteeseen • · · "•s 25 denim-käsittelyssä. Vaaleuden lisäys entsyymiannoksen funktiona esimerkeis- sä 8 ja 9 kuvatuissa pesuolosuhteissa.
Kuva 17. 20K+CBD-fuusioproteiinien ja vastaavien kaupallisten ent-j'·.· syymivalmisteiden vaikutus denim-kankaan lujuuteen. Kuva 17A. Repäisylu- juus (N), loimi. Kuva 17B. Repäisylujuus (N), kudelanka.
m • · \v 30 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • * :···: Esillä oleva keksintö perustuu pyrkimyksille edelleen parantaa neut- :raaleja sellulaaseja, etenkin niitä, jotka kuvataan julkaisussa WO97/14804, ta-··· · ·...: voitellen kankaan lujuuden häviämisen vähentämistä. Joissakin sovelluksissa 20K-sellulaasi on osoittanut epäsuotavia ominaisuuksia kuidun lujuuden suh-35 teen mahdollisesti pienestä koosta johtuen. Yksinkertainen hypoteesi oli, että entsyymin koon lisääminen vähentäisi entsyymin kykyä tunkeutua kuituihin, joi- 9 118340 loin se heikentäisi kuituja vähemmän, ts. entsyymi olisi vähemmän aggressiivinen. Tämän tekemiseksi julkaisussa WO97/14804 ehdotettua fuusioprote-iinilähestymistapaa käytettiin ja suunniteltiin fuusiokonstrukteja, jotka sisälsivät Melanocarpus-lajien neutraalin sellulaasin ytimen ja T. reesein happaman sel-5 lobiohydrolaasin I linkkeri/CBD:sta koostuvan hännän. Yllättäen kuitenkin tunnetun tekniikan ehdotusten vastaisesti täysin stabiileja fuusioproteiinikonstruk-teja ei voitu aikaansaada vaan fuusiopartnerit erosivat toisistaan viljelyolosuhteissa. Tämä johtui oletettavasti proteaasi(e)n läsnäolosta.
Stabiilien fuusioproteiinien tuottamiseksi yksi lähestymistapa oli 10 suunnitella uusia liitoskonstrukteja, joissa ei olisi vierekkäisiä hydrofobisia aminohappoja (esim. V, I, L, F ja W), jotta estettäisiin pilkkoutuminen aspartyyli-proteaaseilla. Kuitenkin vaikka konstruktit tuottivat fuusioproteiineja, jotain hajoamista havaittiin ajoittain.
Neutraalien sellulaasien, jotka luonnostaan sisältävät linkkeri/CBD-15 hännän, linjauksen perusteella tuotettiin uusia konstrukteja ja viimein nämä konstruktit osoittautuivat stabiileimmiksi ja käyttökelpoisimmiksi jatkotestauk-seen. Lisäksi suunniteltiin fuusiokonstrukteja, joissa oli mutaatioita CBD:ssa, mikä johti vähentyneeseen tai minimaaliseen affiniteettiin tai adsorptioon selluloosaan (Linder et ai. 1995).
.·, ; 20 Uudet konstruktit tuottivat parannettuja lujuusominaisuuksia, kuten * ·· tavoite oli. Yllättäen stabiilit sellulaasifuusioproteiinlt lisäksi osoittivat odottama-;**! tonta parannusta pesutehossa ja olivat jopa kuusi kertaa tehokkaampia kuin • · 9 / / niiden ”emo”sellulaasit. Kuitenkin tuotantosaannot pysyivät noin samalla tasol- • · · :·: : la. Tämä tarkoittaa, että vain yksi kuudesosa siitä määrästä sellulaasiaktiivi- • · : 25 suutta, joka nykyisin tarvitaan, on riittävä saavuttamaan tunnetun tekniikan s·· mukaisen sellulaasin pesutehon. Tämä tuottaa huomattavia säästöjä tuotantovaiheessa ja myös logistiikassa ja varastoinnissa tällä tavoin vähentäen ympä-ristön kuormitusta. Myös sellulaasivalmisteiden epäsuotavat vaikutukset vähe-:***: nivät tällä tavoin tuoden lisäsäästöjä entsyymituotteen loppukäyttäjille. Ottaen /. 30 huomioon, että noin 2 miljardia paria denim-farkkuja tuotetaan vuosittain ja • ® · suurin osa niistä viimeistellään sellulaasilla, etu on erittäin merkittävä.
'···* Sen mukaisesti esillä oleva keksintö koskee uutta sellulaasifuusio- : proteiinia, joka käsittää ·:··· A. valinnaisesti modifioidun yhdestä lajista peräisin olevan sellulaa- 35 sin ytimen ensimmäisen aminohapposekvenssin, ja 10 118340 B. valinnaisesti modifioidun toisesta lajista peräisin olevan linkkeri-alueen ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) toisen aminohapposekvenssin, jossa liitosalue on tuotu ensimmäisen aminohapposekvenssin ja toi-5 sen aminohapposekvenssin väliin, jolloin aikaansaadaan stabiili fuusioproteiini.
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa liitosalueella on seuraava yleinen kaava: 1A - 2B - 3C - 4D - 5E - 6F, jossa 10 1A on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, lie ja Vai; edullisesti 1A on Gly tai Vai, edullisimmin Gly; 2B on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile, Phe, Vai, Glu, Asp, Gin ja Asn; edullisesti 2B on Pro, Gin tai Glu; 15 3C on valittu ryhmästä Gly, Ala, Lys, Leu, Pro, Ile, Vai, Ser ja Thr; edullisesti 3C on Ile; 4D on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 4D on Gly tai Pro; 5E on valittu ryhmästä Ser, Pro ja Thr; edullisesti SE on Ser; ja . 20 eF on valittu ryhmästä Ser, Thr tai poissa oleva; edullisesti eF on Ser • ·· - tai poissa oleva; jolloin A on liitetty sellulaasin ytimen C-terminaaliseen ami- *;·\ nohapposekvenssiin ja ®F on liitetty linkkerin ja/tai selluloosaa sitovan domee- • · · / nin (CBD) N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin.
!·: i Keksinnön erikoisen edullisessa suoritusmuodossa liitosalueella on • · : 25 seuraava yleinen kaava: ··· * · • · ·· · 1Gly - 2B - 3lle - 4D - 5Ser - ®F, jossa • · • · • · · * 2B on Pro, Gin tai Glu; 30 4D on Gly tai Pro; *·*· 5E on Ser; ja *···: eF on ®F on Ser tai poissa oleva.
• · • * · • · · ··· · · 11 118340
Keksinnön toisessa erikoisen edullisessa suoritusmuodossa liitos-alueella on seuraava yleinen kaava: 1 Vai - 2Gln - 3lle - 4Pro - 5Ser - 6Ser.
S
Keksinnön toisessa erikoisen edullisessa suoritusmuodossa liitos-alueella on seuraava yleinen kaava: 1Gly - 2Glu - 3lle - 4Gly - 5Ser.
10
Keksinnön toisessa erikoisen edullisessa suoritusmuodossa liitos-alueella on seuraava yleinen kaava: 1Gly - 2Pro - 3lle - 4Gly - 5Ser.
15
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen aminohapposekvenssi on peräisin neutraalista selluiaasista ja toinen aminohapposekvenssi on peräisin happamasta selluiaasista.
Keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen ... ; 20 aminohapposekvenssi on peräisin perheen 45 (Cel 45) selluiaasista ja toinen aminohapposekvenssi on peräisin perheen 7 (Cel 7) selluiaasista.
• ♦ V\ Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään, ilmaisu "sellulaasin • · · ]· " ydin” tai "ydin” tarkoittaa entsyymin katalyyttistä domeenia/ydintä (CD), joka il- : mentää sellulaasin aktiivisuutta. Tällainen katalyyttinen domeeni voi olla luon-
• I
i 25 nostaan esiintyvässä muodossaan (ts. koskematon) tai edullisesti se modifioi-daan alla määritellyllä tavalla. Ilmaisut "johdannainen” ja funktionaalinen variantti merkitsevät polypeptidejä, jotka ilmentävät samaa sellulaasin aktiivisuut-ta, mutta sisältävät alla määritellyt modifikaatiot.
φ .···. Esillä olevassa yhteydessä perinteisiä yksikirjaimisia aminohappo- 30 koodeja ja kolmikirjaimisia aminohappokoodeja käytetään. Siten A ja Ala mer- • · · kitsevät alaniinia, R ja Arg merkitsevät arginiinia, N ja Asn merkitsevät aspara-giinia, D ja Asp merkitsevät aspartaamihappoa, Cys ja C merkitsevät kyste- : iiniä, E ja Glu merkitsevät glutamiinihappoa, Q ja Gin merkitsevät glutamiinia, »* · ·...: G ja Gly merkitsevät glysiiniä, H ja His merkitsevät histidiiniä, I ja Ile merkitse- 35 vät isoleusiinia, L ja Leu merkitsevät leusiinia, K ja Lys merkitsevät lysiiniä, M ja Met merkitsevät metioniinia, F ja Phe merkitsevät fenyylialaniinia, P ja Pro 12 118340 merkitsevät proliinia, S ja Ser merkitsevät seriiniä, T ja Thr merkitsevät treonii-nia, W ja Trp merkitsevät tryptofaania, Y ja Tyr merkitsevät tyrosiinia ja V ja Vai merkitsevät valiinia. Luonnostaan esiintyvien L-aminihappojen lisäksi D-amino-happoja voitiin käyttää. Keksinnön mukaisissa sellulaaslfuusioproteiineissa 5 neutraali sellulaasi on edullisesti peräisin sienestä. Neutraali sellulaasi voi olla peräisin Melanocarpus-, Humicola-, Thielavia-, Myceliophthora- Fusarium-, Acremonium-, Chrysosporium-, Thermoascus-, Scopulariopsis-, Myriococcum-, Talaromyces- tai Chaetomium-suvuista. Nimenomaan edullisia ovat Melanocarpus sp, Melanocarpus albomycesin ollessa erityisen edullinen. Keksinnön 10 mukaisissa sellulaasifuusioproteiineissa käytetyt happamat sellulaasit ovat peräisin Trichoderma $p.:stä tai Hypocreasta, erityisesti Trichoderma reeselstä.
Keksinnön nimenomaisesti edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen aminohapposekvenssi on sekvenssin nro 2 Melanocarpus albomycesin 20K-sellulaasi tai sen johdannainen ja toinen aminohapposekvenssi on 15 sekvenssin nro 4 Trichoderma reesein sellobiohydrolaasin I linkkeri ja/tai CBD tai sen johdannainen.
Keksinnön yhdessä edullisessa suoritusmuodossa sellulaasifuusio-proteiinit sisältävät modifikaatioita sellulaasin ytimessä ja/tai linkkerissä ja/tai CBD:ssa. Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisu ’’modifioitu” viit-. 20 taa mutaatioihin, kuten deleetioihin, insertioihin tai yhden tai useampien ami- nohappojen substituutioihin tai muihin modifikaatioihin, kuten glykosylaatioihin.
*;··] Esimerkit tällaisista mutaatioista sisältävät Trichoderma reesein CBHI:n CBD:n • t » *· " konservoineiden tyrosiinien asemissa 31 (vastaa kypsän polypeptidin tyrosii- :.: : nia Y492) ja/tai 32 (vastaa kypsän polypeptidin tyrosiinia Y493) substituution • · * 25 apaattisella aminohapolla, edullisesti alaniinilla ja/tai aromaattisella aminoha- polla, kuten tryptofaanilla, kuten kuvataan julkaisussa Linder et ai., 1995. Tällaisten mutaatioiden lisäesimerkit sisältävät Trichoderma reesein CBHI:n inter- ·*·.. linkkerimutaatioita, kuten kuvataan julkaisussa Srisodsuk et ai., 1993, kuten .**·. aminohappojen deleetioita kypsän Trichoderman CBHI-sekvenssin asemasta /* 30 434—444 ja asemasta 434-460. Tällaisten mutaatioiden lisäesimerkit sisältävät *;’·* Alain deleetion asemassa 207, Valin deleetion asemassa 208, Phe209Trp- substituution, ja Proin insertion aseman 206 jälkeen sekvenssin nro 2 Melano- • carpus albomycesin 20K-sellulaasin sekvenssissä.
• · « ·
Keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinit ovat stabiileja. Esillä 35 olevan keksinnön yhteydessä ilmaisu "stabiili sellulaasifuusioproteiini” tarkoittaa, että vähintään 20 %, edullisesti vähintään 40 %, edullisemmin vähintään 13 118340 70 %, edullisimmin 90-100 % tuotetusta sellulaasifuusioproteiinista sisältää pilkkomattoman liitosalueen aminohapposekvenssien välillä fermentaation aikana. Tämä tarkoitta, että 20-100 %:lla, edullisesti 40-100 %:lla, edullisemmin 70-100 %:lla tuotetusta sellulaasista on ensimmäinen ja toinen aminohap-5 posekvenssi sulautuneena yhteen. Ilmaisu "stabiili sellulaasifuusioproteiini" lisäksi tarkoittaa, että sellulaasifuusioproteiinivalmiste voi olla stabiili sellaisenaan tai on stabiloitu esim. kuumennuskäsittelyllä tai pH:n säätämisellä tai lisäämällä stabiloivia aineita tai aineita, jotka vähentävät proteaasiaktiivisuutta tai erottamalla fuusiopoteiini viljelmästä. Kuumennuskäsittely esillä olevassa 10 yhteydessä tarkoittaa käsittelyä lämpötilassa, joka sallii fuusioproteiinin pitämisen valmisteessa riittävän stabiilina. Kuumennuskäsittely voi olla esim. käsittely pH:ssa 6 65 °C:ssa 60-70 minuutin ajan.
Esillä olevassa yhteydessä ilmaisu "koskematon fuusioproteiini” tarkoittaa, että liitos ensimmäisen ja toisen aminohapposekvenssin välillä keksin-15 nön mukaisessa fuusioproteiinissa pysyy rikkoutumattomana, vaikka mainituissa sekvensseissä voi esiintyä tai olla esiintymättä terminaalista hajoamista.
Keksinnön mukaisen sellulaasifuusioproteiinin yhdessä edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen aminohapposekvenssi on Melanocarpus al-bomycesin 20K-sekvenssi, jolla on sekvenssi nro 2, tai sen funktionaalinen va-t.# . 20 hantti. Toisessa edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen aminohappose- kvenssi on Melanocarpus albomycesln 50K-sekvenssi, jolla on sekvenssi nro • · ***** 6, tai sen funktionaalinen variantti. Toisessa edullisessa suoritusmuodossa en- ]· " simmäinen aminohapposekvenssi on Melanocarpus albomycesin 50KB-sek- i.:‘ : venssi, jolla on sekvenssi nro 8, tai sen funktionaalinen variantti. Toisessa • · · 25 edullisessa suoritusmuodossa ensimmäinen aminohapposekvenssi on Ther- moascus aurantiacuksen CBHI-sekvenssi, jolla on sekvenssi nro 10, tai sen funktionaalinen variantti. Keksinnön mukaisen sellulaasifuusioproteiinin vielä ·*·.. yhdessä edullisessa suoritusmuodossa toinen aminohapposekvenssi on .···. Trichoderma reeseln sellobiohydrolaasin I linkkeri ja sellulaasia sitovan do- .·* 30 meenin sekvenssi, jolla on sekvenssi nro 4, tai sen funktionaalinen variantti.
• · · ***** Siten keksinnön mukaisen sellulaasifuusioproteiinin erittäin edulli- • · · sessa suoritusmuodossa sellulaasin ytimen ensimmäinen aminohappose- • ·*· kvenssi valitaan sekvensseistä nro 37, 38, 39, 40, 41, 42 ja 43, erityisesti sek- ·*· « venssistä nro 39 ja linkkeri- ja/tai CBD-sekvenssin toinen aminohappose-35 kvenssi valitaan sekvensseistä nro 44, 45, 46, 47, 48, 49 ja 50. Keksinnön erikoisessa suoritusmuodossa sellulaasin ytimen ensimmäinen aminohapposek- 1A 1 1 8340 14 venssi on sekvenssi nro 39 ja linkkeri- ja/tai CBD-sekvenssin toinen aminohapposekvenssi on sekvenssi nro 47, 49 tai 50.
Esillä oleva keksintö edelleen koskee ekspressiovektoria, joka käsittää ensimmäisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa valinnaisesti modifi-5 oitua yhdestä lajista peräisin olevaa sellulaasin ytimen aminohapposekvenssiä, ja toisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa toisesta lajista peräisin olevan linkkerin ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) valinnaisesti modifioitua toista aminohapposekvenssiä, ja polynukleotidin, joka koodittaa spesifistä liitosaluetta, joka yhdistää mainitut ensimmäisen ja toisen polynukleotidise-10 kvenssin mainittujen polypeptidisekvenssien koodittaessa vastaavia aminohapposekvenssejä kuten nimenomaan määritellään yllä.
Esillä oleva keksintö koskee edelleen sellulaasivalmlsteita, jotka sisältävät yhtä tai useampia keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja yksin tai yhdessä lisäentsyymien ja lisäaineiden kanssa kyseessä olevan erikoisen 15 sovelluksen mukaisesti.
Esillä oleva keksintö edelleen koskee käyttöjä ja menetelmiä keksinnön mukaisten sellulaasifuusioproteiinivalmisteiden käyttämiseksi nimenomaan alla kuvattuihin tarkoituksiin.
Keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinivalmisteet ovat erityisen .·. . 20 käyttökelpoisia tekstiili- ja pesuaineteollisuudessa. Nämä sellulaasit osoittavat erittäin parantunutta kulutusvaikutusta ja näkyvää ja mitattavaa lisäystä vaa- • · *;·'! leudessa. Ne osoittavat hyväksyttävää takaisinvärjäytymistä ja hyvää sekä tar- • · · *· " kentunutta kontrastia biokivipesussa. Ne ovat käyttökelpoisia tekstiiliteollisuu- : dessa kankaiden tai vaatteiden bioviimeistelyyn, esim. nyppyyntymisen es- • · : 25 toon, nukkaantumisen estoon, värin kirkastamiseen, karkeuden vähentämi- ·*.,*.·* seen, erilaisten viimeistelyjen luomiseen (esimerkiksi ’persikkamainen’, ’kulu tettu’, ’hiekkapesty' tai vanha ulkonäkö’-vaikutus) ja lankojen bioviimeistelyyn, esimerkiksi pörröisyyden vähentämiseen ja sileyden parantamiseen. Lisäkäytöt ·***. sisältävät käytön pesuainekoostumuksissa kankaan hoito-ominaisuuksien pa- • · · .·, 30 rantamiseksi nyppyyntymisen estolla, harmaantumisen estolla, värin kirkasta- • · · misella ja pehmentämisellä ja tekstiilien puhdistusvaikutuksen parantamiseksi :···: esimerkiksi lian poistamiseksi.
: Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisu kankaan tai ··· · vaatteen "biokivipesu” tarkoittaa entsyymien käyttöä hohkakivien sijasta tai li-35 säksi kankaan tai vaatteen, erityisesti denimin, käsittelemiseksi.
15 118340
Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisu "bioviimeistely” viittaa entsyymien käyttöön selluloosakuitujen kontrolloidussa hydrolyysissä kankaan tai langan pinnan modifioimiseksi tavalla, joka ehkäisee pysyvästi nyppyyntymistä, parantaa kankaan tuntua, kuten pehmeyttä ja sileyttä, selkeyt-5 tää pintarakennetta vähentämällä nukkaantumista, mikä johtaa värien kirkastumiseen, parantaa kankaan laskeutuvuutta, parantaa kosteuden imeytymistä, mikä voi parantaa myös värjäytyvyyttä.
Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisu "takaisinvärjäy-tyminen” viittaa vapautuneen värin taipumukseen kerrostua uudelleen kangas-10 kuitujen pinnalle.
Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisu ” pesuaine” viittaa puhdistusaineeseen, joka voi sisältää pinta-aktiivisia aineita (anionisia, io-nittomia, kationisia tai amfolyyttisiä surfaktantteja), täyteaineita ja muita valinnaisia ainesosia, kuten uudelleenkerrostumista estäviä ja likaa suspensoivia 15 aineita, optisia kirkasteita, valkaisuaineita, värejä ja pigmenttejä ja hydrolaase-ja. Pesuaineiden sisällön sopiva listaus annetaan US-patentissa nro 5 433 750, surfaktanttien sopiva listaus annetaan US-patentissa nro 3 664 961.
Aminohapposekvenssillä, joka on spesifisen aminohapposekvens-. 20 sin "ekvivalentti” tai "johdannainen”, tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka ei ole identtinen spesifisen aminohapposekvenssin kanssa vaan paremminkin t » *;**! sisältää vähintään joitakin aminohappovaihdoksia (deleetioita, substituutioita, • · « *· *: inversioita, insertioita jne.), jotka eivät olennaisesti vaikuta proteiinin biologi- :.: : seen aktiivisuuteen, kun verrataan spesifisen aminohapposekvenssin saman- • · : 25 laiseen aktiivisuuteen käytettäessä annettuun sovellukseen.
Sellulaasin biologinen aktiivisuus on sen katalyyttinen aktiivisuus ja/tai sen kyky sitoa selluloosamateriaalia.
"·„ Ekspressiovektori on kloonausplasmidi tai vektori, joka pystyy ilmen- .***. tämään DNA:ta, joka koodittaa keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja 30 transformaation toivottuun Isäntään jälkeen. Kun sieniperäistä isäntää käyte- • · · tään, mielenkiinnon kohteena oleva geeni edullisesti kuljetetaan sieniperäiseen isäntään osana kloonaus- tai ekspressiokuljetinta, joka integroituu sieniperäi- : ;*; seen kromosomiin tai sallii mielenkiinnon kohteena olevan geenin integroitua ··· « isäntäkromosomiin, tai itsenäisesti replikoituvana plasmidina. Sekvenssit, jotka 35 ovat kloonauskuljettimen tai ekspressiokuljettimen osia, voidaan myös inte- 16 118340 groida mainittuun DNA:han integraatioprosessin aikana. Lisäksi sienessä eks-pressiovektori tai sen osat voidaan kohdentaa ennalta määrättyihin kohtiin.
DNA, joka koodittaa keksinnön mukaisia fuusioproteiineja, asetetaan myös edullisesti vektorin (joka integroituu mielenkiinnon kohteena olevan 5 geenin kanssa) kuljettamien tiettyjen kontrollisekvenssien, kuten promootto-risekvenssien, kontrollin alaiseksi (ts. leikkauskelpoisesti näihin liitettynä). Vaihtoehtoisesti kontrollisekvenssit voivat olla niitä, jotka ovat insertiokohdas-sa.
Ekspressiovektorin ekspressiota kontrolloivat sekvenssit tulevat 10 vaihtelemaan riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämän tiettyä geeniä prokaryootti- vai eukaryootti-isännässä (esimerkiksi sukkulavektori voi kuljettaa geenin bakteeriperäisten isäntien valintaan). Ekspressiota kontrolloivat sekvenssit voivat sisältää transkriptionaalisia säätelyelementtejä, kuten promoottoreita, vahvistaja-elementtejä ja transkriptionaalisia terminaatiosekvenssejä 15 ja/tai translationaalisia säätelyelementtejä, kuten translationaalisia aloitus- ja terminaatiokohtia.
Polynukleotidimolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan "pystyvän ilmentämään” polypeptidiä, jos se sisältää ekspressiota kontrolloivia sekvenssejä, jotka sisältävät transkriptionaalista säätelyinformaatiota, ja jos tällaiset sek-,.f . 20 venssit on "leikkauskelpoisesti liitetty” nukleotidisekvenssiin, joka koodittaa po- lypeptidiä.
*;··,* Leikkauskelpoinen sidos on sidos, jossa sekvenssi yhdistetään sää- • # · '· " telysekvenssiin (tai sekvensseihin) sillä tavoin, että sekvenssin ekspressio ase- ··: ! tetaan säätelysekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alaiseksi. Kahden DNA- • · : 25 sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssi liitettynä sekvenssiä kooditta- ί.,.ί van proteiinin 5’-päähän) sanotaan olevan leikkauskelpoisesti liitettyjä, jos promoottorin toiminta johtaa transkriptioon.
Keksinnön mukaiset vektorit voivat edelleen käsittää muita leikkaus- • kelpoisesti liitettyjä säätelyelementtejä kuten vahvistaja-sekvenssejä.
30 Edullisessa suoritusmuodossa kostruoidaan geneettisesti stabiileja • · · transformantteja, joiden avulla keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja koodittava DNA integroidaan isäntäkromosomiin transformaatiolla vektorin :kanssa, joka suojaa sekvenssejä, jotka edistävät mainitun vektorin integraatio- • M 9 ·...: ta kromosomiin.
• · 35 Solut, joilla on keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja koodit tava DNA stabiilisti kromosomiinsa integroituna, valitaan myös lisäämällä yksi 17 118340 tai useampia homologisia tai heterologisia markkereita, jotka sallivat ekspres-siovektorin kromosomissa sisältävien isäntäsolujen valinnan, esimerkiksi markkeri voi saada aikaan biosidiresistenssin, esim. resistenssin antibiootteja tai raskasmetalleja, kuten kuparia vastaan, tai markkereita, jotka täydentävät 5 auksotrofista mutaatiota isäntäkromosomissa tms. Valittavissa oleva markkeri-geeni voi joko olla suoraan liitetty ilmennettävään DNA-geenisekvenssiin tai tuodaan samaan soluun yhteistransformaatiolla.
Kun konstrukti(t) sisältävä keksinnön mukainen vektori tai DNA-sekvenssi valmistetaan ilmentämistä varten, DNA-konstruktit tuodaan tarkoi-10 tuksenmukaiseen isäntäsoluun millä tahansa useista sopivista tavoista, mukaan lukien alalla tunnetun mukaisella transformaatiolla. Vektorin tuomisen jälkeen vastaanottajasoluja kasvatetaan valikoivassa väliaineessa, joka valitsee transformoidut solut kasvamaan.
Sopivia isäntäsysteemejä ekspressioon ja tuotantoon ovat esimer-15 kiksi sieniperäiselle Trichoderma- isännälle kehitetty tuotantosysteemi (EP 244 234) tai Asperg/V/us-tuotantosysteemi, kuten A. oryzae tai A. niger (WO 9708325 ja WO 9533386, US 5 843 745, US 5 770 418) tai Fusariumille kehitetty tuotantosysteemi, kuten F. oxysporum (Malardier et ai., 1989). Bakteereille kehitettyjä sopivia tuotantosysteemejä ovat Bacillukselle kehitetty tuo- : 20 tantosysteemi, esimerkiksi B. subtilis tai E colille tai aktinomysete Streptomy- • *· cesille kehitetty tuotantosysteemi. Hiivoille kehitettyjä sopivia tuotantosystee-mejä ovat Saccharomycesille, Shizosaccharomycesille tai Pichia pastorisille • * · / " kehitetyt systeemit. Tuotantosysteemit joissakin muissa mikrobeissa tai nisä- ··! * kässoluissa tai kasveissa ovat myös mahdollisia.
: 25 Kloonatun/kloonattujen geenisekvenssi(e)n ekspressio johtaa toivo- f·· tun proteiinin tuotantoon tai tämän proteiinin fragmentin tuotantoon. Tämä ekspressio voi tapahtua jatkuvalla tavalla transformoiduissa soluissa tai kont-rolloidulla tavalla.
:*“· Fragmenttien ymmärretään olevan nukleiinihappomolekyylien osia, ·«· Λ 30 jotka ovat riittävän pitkiä koodittamaan kuvattua proteiinia tai sen biologisesti * t · aktiivista fragmenttia. Termi "johdannainen” tarkoittaa tässä yhteydessä, että • 9 *·;· näiden molekyylien nukleotidisekvenssit eroavat yllä kuvattujen nukleiinihap- ij’j pomolekyylien sekvensseistä yhdessä tai useammissa kohdissa ja ovat erittäin ·:··: homologisia mainittujen sekvenssien kanssa. Homologian ymmärretään viit- 35 taavan sekvenssien vähintään 40 %:n identtisyyteen, erityisesti vähintään 60 %:n identtisyyteen, edullisesti enemmän kuin 80 %:n ja vielä edullisemmin 18 118340 enemmän kuin 90 %:n. Poikkeamat yllä kuvatuista nukleiinihappomolekyyleis-tä voivat johtua deleetiosta, substituutiosta, insertiosta, additiosta tai kombinaatiosta. Homologia sitä paitsi tarkoittaa, että vastaavat nukleotidisekvenssit tai kooditetut proteiinit ovat toiminnallisesti ja/tai rakenteellisesti ekvivalentteja.
5 Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään ilmaisut "entsyymival- miste” ja "sellulaasivalmiste” viittaavat mihin tahansa entsyymituotteeseen, joka sisältää vähintään yhtä sellulaasifuusiopnoteiinia. Siten tällainen entsyymi-valmiste voi olla käytetty viljelyväliaine tai suodos, joka sisältää yhtä tai useampia sullulaasifuusioproteiineja tai yhtä tai useampia seilulaasifuusioprote-10 iineja ja muita entsyymejä, eristettyä sellulaasifuusioproteiinia tai yhden tai useampien sellulaasifuusioproteiinien seosta tai yhden tai useampien sellu-laasifuusioproteiinien ja yhden tai useampien muiden entsyymien seosta. Sel-lulaasifuusioproteiiniaktiivisuuden lisäksi tällainen valmiste voi sisältää lisäaineita, kuten stabilointiaineita, puskureita, säilöntäaineita, surfaktantteja ja/tai 15 viljelyväliaineen komponentteja. Edulliset lisäaineet ovat sellaisia, joita tavallisesti käytetään sovellukseen, jossa entsyymivalmistetta käytetään, tarkoitetuissa entsyymivalmisteissa. Entsyymivalmiste voi olla nesteen, jauheen tai rakeiden muodossa.
"Käytetyllä viljelyväliaineella” tässä tarkoitetaan isännän viljelyvä-20 liainetta, joka käsittää tuotetut entsyymit. Edullisesti isäntasolut erotetaan mai-.···.' nitusta väliaineesta tuotannon jälkeen.
Entsyymivalmiste voi käsittää yhtä tai useampia esillä olevan kek- .* / sinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja tai muita sellulaasientsyymejä yh- |*γ dessä yhden tai useampien esillä olevan keksinnön mukaisten sellulaasi- • · · *;γ 25 fuusioproteiinien kanssa. Esimerkiksi sellulaasifuusioproteiineja, joilla on erilai- siä ominaisuuksia, voidaan yhdistää entsyymivalmisteen tekemiseksi, joka on käyttökelpoisempi erilaisiin olosuhteisiin.
• · • *·· Keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden aikaansaamiseksi isän- tiä, joilla on toivotut ominaisuudet, (nimittäin isäntiä, jotka pystyvät ilmentä- ,·,*·, 30 mään taloudellisesti toteuttamiskelpoisia määriä keksinnön mukaisia sellu- * · · laasifuusiproteiineja) viljellään sopivissa olosuhteissa, toivotut entsyymit eritty-*:*’ vät isännistä viljelyväliaineeseen ja entsyymivalmiste otetaan talteen mainitus- · ta viljelyväliaineesta alalla tunnetuilla menetelmillä.
*:**: Entsyymivalmiste voi käsittää sellulaasifuusioproteiinin lisäksi yhtä 35 tai useampia muita entsyymejä, jotka voivat olla esimerkiksi amylaaseja, lak-kaaseja ja/tai peroksidaaseja. Vaihtoehtoisesti esillä olevan keksinnön mukai- 18 1 1 8340 silla sellulaasifuusioproteiineilla käsittelyä ennen, sen aikana tai sen jälkeen voidaan suorittaa toinen entsyymikäsittely. Entsyymikäsittely voi käsittää esimerkiksi yhden tai useampia amylaasikäsittelyjä, yhden tai useampia sellu-laasikäsittelyjä ja/tai yhden tai useampia peroksidaasi- ja/tai lakkaasikäsittelyjä.
5 Se, mitä muita entsyymejä sisällytetään entsyymivalmisteeseen tai käytetään entsyymikäsitteiyssä, riippuu sovelluksesta.
Entsyymivalmiste voi olla viljelyväliaine, jossa on tai ei ole natiiveja tai transformoituja isäntäsoluja, tai se otetaan talteen edellä mainitusta soveltamalla alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Kuitenkin koska keksinnön mukai-10 set sellulaasifuusioproteiinit eritetään viljelyväliaineeseen ja ne näyttävät aktiivisuutta sellulolyyttisen liuoksen ympäröivissä olosuhteissa, on keksinnön etu, että keksinnön mukaisia entsyymivalmisteita voidaan käyttää suoraan hyväksi viljelyväliaineesta ilman jatkopuhdistusta. Niin toivottaessa tällaisia valmisteita voidaan pakastekuivata tai entsyymiaktiivisuutta voidaan muulla tavoin väke-15 vöidä ja/tai stabiloida varastointia varten. Keksinnön mukaiset entsyymivalmis-teet ovat hyvin taloudellisia hankkia ja käyttää, koska (1) entsyymit voidaan käyttää raakamuodossa; spesifisten entsyymien eristäminen viljelyväliaineesta on tarpeetonta ja (2) koska entsyymit eritetään viljelyväliaineeseen, vain viljelyväliaine täytyy ottaa talteen toivottujen entsyymivalmisteiden aikaansaami-: 20 seksi; ei ole tarvetta uuttaa entsyymiä isännistä. Edullisesti isäntä tällaisille tuo- ,·*.·,* tannoille on Trichoderma, ja erityisesti T. reesei.
• « l\\ Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voidaan saada aikaan nes- .* / temäisinä tai kiintoaineina, esimerkiksi kuivatussa jauhe-, rae- tai nestemäi- • · · sessä muodossa, erityisesti pölyämättöminä rakeina tai stabiloituna nesteenä » Y 25 tai entsyymivalmiste voidaan muutoin väkevöidä tai stabiloida varastointia tai käyttöä varten. Ajatellaan, että entsyymivalmisteet, jotka sisältävät yhtä tai useampia keksinnön mukaisia neutraaleja sellulaaseja, voidaan edelleen rikas-i*\. taa tai niistä voidaan osittain tai täysin poistaa spesifiset entsyymiaktiivisuudet niin, että ne tyydyttävät spesifisten käyttötarkoitusten vaatimukset erilaisissa t.\t 30 sovelluksissa, esim. tekstiiliteollisuudessa. Isännän ja erityisesti sienen erittä-mien entsyymiaktiivisuuksien seos voidaan valita edulliseksi erityisessä teolli- • ♦ *·;·* sessa sovelluksessa, esimerkiksi biokivipesussa.
jj‘: Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voidaan säätää tyydyttä- ·:*·: mään spesifisten tarpeiden vaatimukset erilaisissa sovelluksissa tekstiili-, pe- 35 suaine- tai kuitumassa- ja paperiteollisuudessa.
20 118340
Sekoituksia voidaan valmistaa muiden makromolekyylien, joita kaikkia ei välttämättä tuoteta samassa isännässä, (esimerkiksi muiden entsyymien, kuten endoglukanaasien, proteaasien, lipaasien, peroksidaasien, oksidaasien tai amylaasien) tai kemikaalien kanssa, jotka voivat lisätä tehoa, stabiiliutta tai 5 toivotun entsyymivalmisteen puskurointia. Pölyämättömät rakeet voidaan pinnoittaa. Nestemäisiä entsyymivalmisteita voidaan stabiloida lisäämällä polyolia, kuten propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boori-happoa tai natriumkloridia vakiintuneiden menetelmien mukaisesti. Keksinnön mukaisten entsyymien suojattuja muotoja voidaan valmistaa, kuten julkaisussa 10 EP 238 216 kuvataan.
Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet voivat sisältää surfaktantte-ja, jotka voivat olla anionisia, ionittomia, kationisia, amfoteerisia tai näiden tyyppien seos, erityisesti kun niitä käytetään pesuainekoostumuksena. Käyttökelpoisia pesuainekoostumuksia kuvataan esim. julkaisussa WO 94/07998, 15 US-patentissa nro 5 443 750 ja US-patentissa nro 3 664 961.
Vaadittaessa toivottu entsyymi voidaan edelleen puhdistaa tavanomaisten olosuhteiden mukaisesti, kuten uutolla, saostuksella, kromatografial-la, affiniteettikromatografialla, elektroforeesilla tai muilla sellaisilla.
Tämän keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet ovat erityisen käyt- .·. : 20 tökelpoisia tekstiiliteollisuudessa edullisesti biokivipesussa ja bioviimeistelyssä • ·· .·./ tai pesuaineteollisuudessa. Muita käyttökelpoisia alueita on kuitumassa-ja pa- • ♦ Γ*. peliteollisuudessa.
/ / Kivipesussa on kolme vaihetta: tärkin poisto, kuluttaminen ja jälkikä- • · · sittely. Ensimmäinen vaihe, tärkin poistoprosessi on normaalisti farkkujen en-: 25 simmäinen märkäkäsittely ja tarkoittaa tärkkelyksen tai muiden liistereiden, joi- *·· ta yleensä käytetään loimilangoille niiden vaurioitumisen ehkäisemiseksi kutomisprosessin aikana. Alfa-amylaaseja käytetään tärkkelyspohjaisen tärkin poistamiseksi parannetun ja yhdenmukaisen märkäprosessoinnin aikaansaa-miseksi. Tärkin poiston jälkeen farkkuja huuhdellaan normaalisti vedellä tai jät- • · · 30 ketään suoraan kulutusvaiheella.
• · ·
Toinen vaihe, kuluttaminen, voidaan suorittaa entsyymeillä tai höh- • · kakivillä tai molemmilla. Kaikissa tapauksissa mekaanista toimintaa tarvitaan : värin poistamiseksi ja käsittely yleensä suoritetaan pesukoneissa, kuten rum- ·:··: pupesukoneissa. Termi "kulunut” tarkoittaa tässä denim-kankaan ulkomuotoa, 35 kun sitä on käsitelty sellulaasientsyymeillä tai kivillä tai molemmilla. Epätasaisen värin poiston seurauksena värjättyjen alueiden ja alueiden, joilta väri on 1 1 8340 21 poistettu, välillä on kontrasti. Synonyymisiä ilmaisuja ovat ’’kivipesty ulkonäkö” tai "kulutettu ulkonäkö”. Entsymaattlsessa kivipesussa tai biokivipesussa kuluttaminen hohkakivillä eliminoidaan täysin tai osittain ja sellulaasi lisätään indigo-värin kuluttamisen helpottamiseksi kuidun pinnasta. Sellulaasikäsittely voi-5 daan tehdä käyttäen neutraaleja tai happamia sellulaaseja tai molempia. Jos kangasta ei ole sellulaasikäsiteity tai kivipesty, kankaan ulkomuodon sanotaan olevan "tylsä”, koska muodikkaat kontrastit puuttuvat. Kun haalistuneempi vaikutus on toivottu, valkaisu käyttäen kemiallisia aineita ja/tai entsymaattisia menetelmiä, kuten lakkaasikäsittelyä voidaan suorittaa.
10 Kuluttamista seuraa yleensä kolmas vaihe, jälkikäsittely, joka sisäl tää pesu- ja huuhteluvaiheita, joiden aikana pesuaineita, optisia valkaisuaineita tai pehmennysaineita voidaan käyttää. Entsymaattisen käsittelyn jälkeen reaktio täytyy pysäyttää käsiteltyjen materiaalien vaurioitumisen ehkäisemiseksi, esimerkiksi lämpötila- ja/tai pH-inaktivoinnilla jälkimmäisen käsittäessä huolel-15 lisen huuhtelemisen ja/tai pesuaineiden poispesun. Tämä varmistaa, että kuidun mekaaninen voima ei enempää vaarannu entsyymin jatkuvalla läsnäololla.
"Denimillä” tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä denim-kan- gasta, yleensä denim-vaatteita, erityisesti farkkuja. Edullisesti denim on indigo- värjättyä denimiä. Denim voidaan myös käsitellä indigolla, indigon johdannai- .*. ; 20 silla tai denim käsitellään indigolla yhdessä joidenkin muiden värien kanssa, • · .‘••I esimerkiksi indigovärjätty denim rikkiväripohjalla.
"*. Käsittely sellulaas(e)illa voi täysin korvata käsittelyn hohkakivillä / / (esimerkiksi 1 kg kaupallista entsyymiä vastaa 100 kg kiviä). Kuitenkin sellu- • · · j*:(: laasikäsittely voidaan yhdistää hohkakivikäsittelyyn, kun on toivottua tuottaa :·: : 25 voimakkaasti kulunut viimeistely. Persikkamainen vaikutus, jossa luodaan hie- • φ · no kerros pinnasta ulostyöntyviä karvoja, saavutetaan myös pesulla, jossa yhdistetään neutraaleja sellulaaseja hohkakivien kanssa. Tämän keksinnön mu-kaiset sellulaasit ovat erityisen käyttökelpoisia kulutetun ulkonäön saamiseksi :***: aikaan ja takaisinvärjäytymisen minimoimiseksi biokivipesussa.
··· 'Λ' 30 Biokivipesu suoritetaan edullisesti pH:ssa noin 4,5-9,5 ja edullisim- min pH:ssa 6,0-8,0. Reaktion lämpötila voi vaihdella noin 40-80 °C, edullisesti *·;·* välillä 50-70 °C ja edullisemmin välillä 55-65 °C ja edullisimmin se on 60 °C.
: Liuossuhde (nesteen tilavuuden suhde kankaan painoa kohti) voi vaihdella ·:··· noin 2:1-30:1, edullisesti 4:1-15:1 ja edullisimmin 5:1-10:1. Entsyymiannos 35 voi vaihdella noin 5-8 000 NCU/g kangasta, edullisesti 20-3 000 NCU/g kangasta ja edullisimmin 30-1 500 NCU/g kangasta. Käsittelyaika voi vaihdella 22 118340 välillä 15 min-4 h, edullisemmin 20 min-90 min ja edullisimmin 30 min-60 min. Täytyy korostaa, että entsyymiannos riippuu suuresti kankaiden, koneiden, prosessiolosuhteiden tyypistä (pH, lämpötila, liuossuhde, käsittelyaika, denim-kuorma, prosessin mittakaava) ja entsyymivalmisteen tyypistä ja muusta sel-5 laisesta. Niin toivottaessa hohkakiviä voidaan käyttää yhdessä fuusiosellu-laasiproteiinien kanssa. Vaadittu entsyymiannos tulee tällöin olemaan merkittävästi alhaisempi. Alan ammattimies pystyy määrittelemään sopivat annokset ja olosuhteet.
Keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinit ovat käyttökelpoisia 10 tekstiiliteollisuudessa kankaiden tai vaatteiden bioviimeistelyyn, esim. nyppyyn-tymisen estoon, nukkaantumisen estoon, värin kirkastamiseen, karkeuden vähentämiseen, erilaisten viimeistelyjen luomiseen (esimerkiksi ’persikkamainen’, 'kulutettu', 'hiekkapesty' tai vanha ulkonäkö’-vaikutus) ja lankojen bioviimeistelyyn (esimerkiksi pörröisyyden vähentämiseen ja siieyden parantamiseen). 15 Tämän keksinnön mukaisia sellulaasifuusioproteiineja voidaan käyttää biovii-meistelyssä happamissa ja neutraaleissa olosuhteissa.
Tämän keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinit ovat käyttökelpoisia pesuainekoostumuksissa kankaan hoito-ominaisuuksien parantamiseksi nyppyyntymisen estolla, harmaantumisen estolla, värin kirkastamisella ja peh- .·. : 20 mentämisellä ja tekstiilien puhdistusvaikutuksen parantamiseksi esimerkiksi li- • · · .•••I an poistamiseksi.
• ·
Tekstiilimateriaali, joka käsitellään keksinnön mukaisilla entsyymi- / / valmisteilla, voidaan valmistaa luonnollisesta selluloosasta, joka sisältää kuitu- • · · ;*:t: ja, tai keinotekoisesta selluloosasta, joka sisältää kuituja tai niiden seoksista.
ί.ί : 25 Esimerkkejä luonnollisista selluloosakuiduista ovat puuvilla, palttina, hamppu, • · · juutti ja rami. Esimerkkejä keinotekoisista selluloosakuiduista ovat viskoosi, selluloosa-asetaatti, selluloosatriasetaatti, rayon, kupro ja lyocell. Yllä mainittu-ja selluloosakuituja voidaan käyttää myös synteettisten kuitujen, kuten polyes-:[[[: teri-, polyamidi- tai akryylikuitujen, sekoituksina. Tekstiilimateriaali voi olla lan- 30 ka tai neulottu tai kudottu tai millä tahansa muulla keinoin muodostettu.
* «
Keksinnön mukaiset sellulaasit paitsi, että ovat erityisen käyttökel- • · **;*' poisia kankaiden käsittelyyn, ovat käyttökelpoisia tavallisesti millä tahansa alu- ·.· · eella, joka vaatii sellulaasiaktiivisuutta.
*:**: Kuitumassa- ja paperiteollisuudessa neutraaleja sellulaaseja voi- 35 daan käyttää esimerkiksi erilaisten kierrätettyjen papereiden ja kartonkien, joilla on neutraali tai emäksinen pH, värin poistossa, kuidun laadun parantami- 23 118340 sessa tai vedenpoiston lisäämisessä paperin valmistuksessa. Muut esimerkit sisältävät painopastan sakeuttamisaineen ja ylimääräisen värin poistamisen tekstiilin painamisen jälkeen ja käsittelynä eläinrehulle. Esimerkiksi jos aiottu sovellus on mekaanisen kuitumassan lujuuden parantaminen, silloin keksinnön 5 mukaiset entsyymivalmisteet voivat saada aikaan yhtä tai useampia näistä proteiineista niin, että ne lisäävät tai helpottavat selluloosakuitujen kykyä sitoutua yhteen. Samalla tavoin kuitumassan jalostuksen sovelluksessa keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinivalmisteet voivat saada aikaan yhtä tai useampia näistä proteiineista tasolla, joka lisää tai helpottaa tällaista turpoamista. Kek-10 sinnön mukaisista fuusioproteiineista erityisen sopivia kuitumassasovelluksiin ovat ne, joilla on Melanocarpus albomycesin 50KB ja Thermoascus auran-tiacuksen CBHI-ydin.
Esillä olevan keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinit saavat aikaan odottamattomia etuja, kun niitä käytetään tekstiiliteollisuudessa ja eri-15 tyisesti biokivipesussa. Keksinnön mukaiset sellulaasifuusioproteiinit ovat huomattavasti tehokkaampia kuin tunnetun tekniikan mukaiset sellulaasit. Biokivipesussa vähintään kaksi kertaa, yleensä vähintään kolme kertaa ja jopa kuusi kertaa matalampia annoksia neutraalin sellulaasln aktiivisuusyksikköinä kankaan painoa kohti annosteltuna voitiin käyttää ilman kankaan lujuuden hei-: 20 kentämistä. Toisin sanoen aina kuuteen kertaan saakka korkeampi teho saa- „···,’ vutetaan käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaisia sellulaasifuusioprote- t · .*. iineja. Koska keksinnön mukaisten sellulaasifuusioproteiinien tuotantosaanto .* .* vastaa tunnetun 20K-sellulaasin saantoa, tuotannon kokonaistehokkuus on · · ;·*'/ merkittävästi parantunut. Tämä voidaan suoraan suhteuttaa suurempiin sääs ti ί 25 töihin tarvitun entsyymin määrissä: mahdollisuus käyttää pienempiä määriä • · · entsyymiä tarjoaa huomattavan taloudellisen arvon sekä valmistuksen että käytön, mukaan lukien logistiikan, osalta.
Keksintö kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä, joiden ei tulkita kaventavan keksinnön suoja-alaa vaan ainoastaan selventävän • · · y,t 30 keksinnön käyttöä.
φ · * • ·
Esimerkki 1. Ekspressiovektoreiden konstruktio 20K+CBD-fuusioproteii- : !·. noille • · · • ·* · ....: Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin DNA:n (plasmidit, DNA-fragmentit) eristämisessä, puhdistamisessa ja entsyymikäsittelyissä, po-35 lymeraasiketjureaktioissa (PCR), E. coli-transformaatioissa jne. Käytetyt perus- 24 1 1 8340 menetelmät kuvataan molekyylibiologian peruskäsikirjoissa, esim. Sambrook et ai. (1989) ja Sambrook ja Russell (2001).
Plasmidikonstruktit suunniteltiin yhdistämään Melanocarpus albo-mycasin 20K:ta (Cel45A, AC# AJ515703; sekvenssi nro 1) koodittavan sek-5 venssin Trichoderma reesein CBHI:n (AC# AR088330; Srisodsuk et ai. 1993; sekvenssi nro 3) linkkerin ja CBD:n koodittavan sekvenssin kanssa. Kaikkiaan kuusi erilaista liitosta suunniteltiin, kuten kuvataan taulukossa 1.
Taulukossa 1 esitetyille konstrukteille #1 ja #2 ainutlaatuinen Nru\-kohta tuotiin 20K:ta koodittavan sekvenssin loppuun. Tämä kohta mahdollistaa 10 suoran fuusion kypsän 20K:n seriiniä #213 koodittavan kodonin jälkeen minkä tahansa tylppäpäisen DNA-fragmentin kanssa. PCR-reaktio ajettiin alukkeiden 20K_Nco (sekvenssi nro 11) ja 20K_NruXho (sekvenssi nro 14) kanssa plas-midin pALK1480 (kuva 1) ollessa templaattina käyttäen ohjelmaa A (taulukko 3). pALK1480:ssä on M. albomycesin cel45A:n (koodittaa Cel45A:ta tai 20K:ta) 15 genominen kopio insertoituna 7. reesein cbh1 -promoottorin alaisuuteen tarkkana fuusiona ja cbM-terminaattori geenistä alavirtaan pUC19-vektorissa (New England Biolabs, Inc., USA). PCR-reaktioseos sisälsi 1 x DyNAzymeMEXT -reaktiopuskuria (Finnzymes, Suomi), 8 mM Mgz+:a (lopullinen konsentraatio säädettiin lisätyllä MgC^illa), 0,2 mM dNTP:ejä, 0,5 μΜ : 20 kutakin aluketta, 1,0 yksikköä DyNazyme™EXT-DNA-polymeraasia (Finnzy- ,···.' mes, Suomi) ja likimäärin 50 ng/100 μΙ templaattia. PCR-tuote digestoitiin t · Λ/col- ja X/iol-restriktioentsyymeillä ja fragmentit eristettiin agaroosigeeliltä !* / elektroforeesin jälkeen. Samalla tavoin pilkotut ja eristetyt pALK1480:n 6,1 • · |,:t! kb:n fragmentit ligoitiin PCR-fragmenttien kanssa ja transformoitiin E. coli XL1- !·· * 25 Blue:hun (Stratagene, USA). Plasmidi-DNA eristettiin transformanteista ja yksi sopiva ehdokas todennettiin sekvensoinnilla. Saatu plasmidi nimettiin pALK1429:ksi.
PCR-reaktiot suoritettiin erikseen kuten yllä alukepareilla 1_BamMly (sekvenssi nro 16) + XhoAge (sekvenssi nro 15) ja 2_BamMly (sekvenssi nro m/.t 30 17) + XhoAge (sekvenssi nro 15) pALK492:n ollessa templaattina (kuva 2) ja saadut PCR-tuotteet, jotka sisälsivät linkkerin ja CBD:n, digestoitiin M/yl:llä (jo- • · **:** ka tuotti tylpän pään juuri ennen linkkerin tai CBD:n koodittavan sekvenssin toivottua ensimmäistä kodonia) ja Agelillä. pALK492 sisältää 7. reesein ·:··· QM6a:n kromosomaalisen DNA:n noin 6,9 kb:n Psfl-fragmentin, joka ankkuroi 35 pUC19:n Psfl-kohtaan subkloonatun cbh1/cel7A~geenm. Yllä saatu pALK1429 digestoitiin Nru\M ja Agekllä ja vektoriosa eristettiin ja ligoitiin erikseen kah- „κ 1 1 8340 den yllä saadun digestoidun PCR-tuotteen kanssa ja transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun. Plasmidi-DNA.t eristettiin, todennettiin sekvensoinnilla ja saadut plasmidit nimettiin pALK1430:ksi (sisälsi 1_BamMly + XhoAge -PCR-tuotteen inserttinä) ja pALK1431:ksi (sisälsi 2_BamMly + XhoAge -PCR-tuotteen insert-5 tinä).
• · * i 1 • »· • · • t· • f • · • f· • · • · · • 1 • · • Φ • 1 · • · · ♦ ·· « • ·
* I I
• · « ··· · • · · • · • · * Φ · • m • · • ·· • · · * · • ♦ ··· • • 1 · • « · • · ··1 • · · • t · • · • · » ··1 f · 26 1 1 8 340 o^'finco'S-co co cd cd cd ό- ό- c- ι-- ι·'- γ·~·
♦. CS ir r- t— T- t— I ·*—> I I I
3 j£ * * * x: * x φ £-£.<£ ·£ ? 1 < < < < < ^ Ö I ^ s
0 Ift a. O. CL CL CL Q. 3 CO ir C CO
3 S vffivcnvOTvcnvovcoO-i^^^coQ
Vi g S ? S ? 8 ? 8 ? g ? K t S ί 1 “ .·
S § ϊ 1 ^ < i5 ^ < !5 < ö “ c I I
i| "T" « 8 5 !8 :£ > CM C C CO Q. — _ o» o o o o o o (DcdoSo) c g o) o e» d) σ> ,σ> > > .-fi .x _ Ö d *1 *, *, A Φ φ = C o υ ? * g g g g g g » co I o o C 3 2 S §. S S S & Mill
S e-------.£ 8. Ö I I
X ® O O O O O O .<2 3 .> .= ~
K *f o> U) to g> g> g> :W^‘>EE
= § l !i !| !] !] 3 & ” s, ” ” F I ® Ξ s 5 2 Ξ Ξ <5 > -c ® ® ΐ ϋ .2 I I I i I i $ .£2 co *S ;ro g * .7 ω ω ω, «>, ω <J g ~ | | s: ίο ι- cm οο co co co 3 .E o E .= •S--------P- — Q- co cö Φ S -k co c c
S 9= 2 o E o c c (N
φ öl E E S f o ! S e 8 8 ? 1 I °, °i 5, s, Jt s | δ ι J £ ° ° -= = = ° c ® 3 5 .£ Φ .*. : S 3 jg 2 5 2 2 2 2 « f s *P *P = :. ·: "S “-l? z z z z z « 1 ® « <s« ... & g <P X X X X X X 8 'S ® Q. fc c ·.,,· K {§ CO CM ° S S ° ° W CO ^ Φ Φ
.·. : .2. §-------2 I 8 o O I
f. i _ _ ~i 2' ~i ”i s ϊ «s 1 : :.:: g | 3 8 8 8 8 8 S ?· | z, z, z, z, z, z, I § ~ 5 g 8 S S S o o o '3 'S o’ € a ^ S —1-------ö .E .2 E | * g d c :2 *5- 2 « :*·.. | & | : i, d g Π I . s
.···. m S, g & B ά % E S 1 I ft I
··:·· | .1 i l | A | I | | 1 ! | I
«v. I l f i g s 1 I s i * s I ΐ ·*· o ί I I ä I fc i 8 "S -S. -2 -¾ ;t : : 2 c B B s ra ra ra 8 2 3 co 2 ^ ... 5 ~ ra ra ra a> σ> ra m -c ,-tc cö E2 • Ό T3 T> Ό T3 Ξ S -Sä O *
:.·. S8I 2 S S S E E
....: ^ | —------S S ε I 5· I
co s 111¾ ®
5o>2 CO CO > CM
3 .2 «5 * CM CO -<t ID CD S ? » ^ ~
3 « g .s i m & :E S
ιΞ Έ ^ o ~ ε ~ is .£2 H Φ h- c/5 “ ^ -*-· ^ 27 118340 '3! φ E pT-Mn^iniosooiOrNn^ioo
j> ^T-T-T-T-T-T-T-T-T-CMCNOJCMCSICMCM
© V)
CD
Eh cd o
E-ι CJ
O E-i
CJ CD CD CJ
Ei Ei CJ Ei
CD CD Ei CD
O O CD O
E-< E-ι U E-<
CD CD O CD
rt CJ CJ CD CJ
CJ CJ E-< CJ CJ
CD CD CD CJ CD
CD O CJ CD CJ
CJ CJ CD < CJ
Ei CD CD rt CD
CJ rt rt CJ CD rt CJ rt rt CJ CD rt
rt CD CD CD CD CD CD
CD CJ CJ rt CD CJ CD CD
CJ CD CJ CD rt CJ CD CD rt
CD CD CD CD CD CD CD CD E-< O
CD CD CJ CJCDCDrtrtCDrtE'* CD
u u rt ucjcjrtuoocD o
O CD CD rtCJCDCDUrtCJE-i CD
CD CD rt rtCJrtCJCJCDCJrtCJrt
CDCDrtCJOtnE-iCJCJCDCJCDCJCJ UUCDCDCDUCJCDCDE-iCDCDrtCJ rtrtE-iOCDCJUCDUCJCJUCJCJ CJUCJE-iE-iUUCJCD^<^«EhOE-iCJ CDCDCDCJE-iCJrtrtCDCJrtCJrtrtCDCJ rtrtrtOEHrtrtrtE-iE-iÖE-irtCDCJO
OCJCJCDUCJCJCJrtrtCDrtCDrtE-'E-1 CJCJCJCDCDCDCDCDCDCDCDCDCJCDCJrt rtrtrtCDCDrtOCDCJCJCDCJCJCJEHU CDCDCDCDrtCJCJCJCJOrtCJOCDrtCD CJCJCJCDCJCDCDCJCDCDCDCDCDrtCDrt J E^E-iE-irtE-iCDCDrtrtrtOrtCDCJUCD
• ®· CDCDCDCDCD^UE-iCDCDrtCDCDCDCJrt
·· rtrtrtUCJtnCDEiUUCDO^rtCJCD
CJCJCJCDCDrtrtrtCDCDCJCDrtCJrtCJ ;· CJCJCJCJE^CJE-tCJCJCJCDCJCDrtCDE-'
• · E-'E-iE-'E-tCDCJCJCJE-iE-iCJE-HCJrtCJCJ
*** CDCDCDrtCDCJCJCJrtrtE-irtÖCJCDO
.·. · CJCJCJCJCJHHE-iUUrtCJCJCJCJCD
: E-iE-<E-iEhO0CDCDE-iE-iCJE-iE-<OHCJ
. ; CDCDCDCDrtrtrtrtCDCD£-<CDCD0E-iCJ
. „ 000rt00CDCDrtrt0rtrtE-i00 : E-iE-itH0rtCJ0CJCDCDrtCDCDrtrt0 rtrtrtcj0ocjcjucj0CJOUE-i0 ···· ‘S OO0E-*OE-,E-*E-*E-*E-*UE-<E-,CD0rt .. S oucjcjE-irtrtrtcjcjFHCJcjcDrtö
··· J2 cDcD0rtcj000rtrturtE-i00U
·;· E CJCJCJE-irtCDCDCD^E-irtEHUrtUCJ
··· * ® rtrtrt00rtrtrt0CDE-i0cjcD00 ··· g e-ie-ie-icjehe-i^&hucj0ue-i0CJu
;· » I I I I I I I I I I CJ I I I I
%f) lO iO lO lO lT) lO lT) u“) u“) lD ϋ") lQ lO lO lO lO
M HS
: ’·· di “ 1 .···. d) apr-mcopo^to^-uscsioecMi^T-eoto ! , ^^iCMcO't^oocooofOcoioiomcocococvj
*·· £ S
? □ 3 :Y: «e c -s.-----------------
··;·' | S
: tm lu o m : * e o a o —
CN| O, ^ °-| I
• * ” O rt1 -J rt1 rt1 S CO
5 Μι”ιχ >'>'>'5655ρΈ 5 _
Ji 8r8 5®222333^2W"2|.c ^ \ *7 < Π3 CO COi.iiCQOQo
00005 I II O O O O Q Q O
H < CMCNCMCNlXT-CMCOCNCMCNCMLOinCMUD
28 118340
Taulukko 3. Käytetyt PCR-reaktio-ohjelmat __Ohjelma____
Valhe__A__B__C__D
1 95 °C 5 min 95 °C 5 min 98 °C 1 min 98 °C 1 min 2 95 °C 1 min 95°C1min 98°C30s 98°C30s 3 55 °C 1 min 60 °C 1 min 72 °C 1 min 65 °C 30 s 4 72 °C 1 min 72 °C 1 min GOTO 2 29x 72 °C 1 min 5 GOTO 2 24x G0T0 2 24x 72 °C 10 min G0T02 29x 6 4 °C HOLD 72 °C Imin 4°CHOLD 72 °C 10 min
7 4 °C HOLD 4 °C HOLD
amc/S-markkeri ja T. reesein cbh f-3’-reunasekvenssi insertoitiin vektoreihin pALK1430 ja pALK1431 seuraavasti: pALK424 (US-patentti 5 583 751; kuva 3) pilkottiin Ecoftl.llä ja Spel.llä, saatu 4,8 kb:n fragmentti tehtiin tylpäksi Klenowin täyttöreaktiolla ja ligoitiin erikseen Stu\:\\ä pilkottujen plasmi-dien pALK1430 ja pALK1431 kanssa mainitussa järjestyksessä ja transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun. Plasmidi-DNA:t eristettiin ja inserttien toivotut orientaatiot tarkistettiin digestiolla tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä. To-·'·,· 10 dennetut plasmidit nimettiin pALK1434:ksi (insertti pALK1430:stä) ja .··. pALK1435:ksi (insertti pALK1431 :stä) mainitussa järjestyksessä (taulukko 1).
,·]*: Taulukossa 1 esitetyille konstrukteille #3, #4, #5 ja #6 otettiin erilai- • te nen lähestymistapa. 20K:n koodittava sekvenssi ja erilaiset modifioidut liitos-kohdat (taulukko 1) suunniteltiin seriiniä koodittavan kodonin, joka muodostaa • · · 15 osan lisätystä Λ/rul-kohdasta, loppuun. Kaikille näille konstrukteille käytettiin *···* samaa inserttiä linkkerin ja CBD:n suurimman osan koodittavan sekvenssin saamikseksi aikaan. Jälkimmäinen konstruoitiin seuraavasti. PCR-reaktio suo-·· * : *·· intettiin yllä kuvatulla reaktioseoksella (paitsi ilman lisättyä Mg2*) ja käyttäen alukeparia 3_BamMly (sekvenssi nro 18) ja XhoAge (sekvenssi nro 15) ja ,v. 20 pALK492-DNA:ta templaattina. Taulukon 3 ohjelmaa B käytettiin. Saatu PCR- « « · l.lm tuote digestoitiin BamH\:\\ä ja Xho\:\\ä, eristettiin ja ligoitiin pBluescript II KS+:n *:* (Stratagene, USA) samalla tavoin pilkotun vektorin osan kanssa ja transformoi- • « :.: I tiin E. coli XL1 Blue:hun. Plasmidi-DNA:t eristettiin, tarkistettiin digestiolla tar- "·*: koituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Yksi 25 plasmidiehdokas, jolla oli toivottu sekvenssi, valittiin ja nimettiin pALK1767:ksi.
29 118340
Taulukon 1 konstruktille #3 PCR-reaktio suoritettiin käyttäen aluke-paria 20K_Nco_2 (sekvenssi nro 12) ja 20K-NruXho_GPI (sekvenssi nro 19) ja pALK1480-DNA:ta templaattina. Kahta reaktioseosta käytettiin: yhtä, jolla oli yllä pALK1767:n konstruktiolle kuvattu koostumus, ja toista, johon oli lisätty 5 DMSO:ta 3 %:iin (tilavuus/tilavuus) saakka. Nämä kaksi reaktioseosta puolitettiin ja ajettiin taulukon 3 ohjelmilla C ja D. Kaikki reaktiot tuottivat odotetun kokoisia DNA-fragmentteja ja valmisteet yhdistettiin ja digestoitiin Nco\:\\ä ja Xhol: llä. DNA-fragmentit eristettiin ja ligoitiin samalla tavoin pilkotun ja eristetyn pALK1480:n 6,1 kb:n fragmentin kanssa ja transformoitiin E. coli XL1 10 Blue:hun. Plasmidi-DNA:t eristettiin, tarkistettiin digestiolla tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Yksi plasmidiehdo-kas, jolla oli toivottu sekvenssi, valittiin ja nimettiin pALK1758:ksi.
Taulukon 1 konstruktille #4 PCR-reaktio suoritettiin käyttäen aluke- paria 20K_Nco_3 (sekvenssi nro 13) ja 20K-NruXho_WGEI (sekvenssi nro 20) 15 ja pALK1480-DNA:ta templaattina. PCR-reaktioseos sisälsi 1 x Phusion™GC- reaktiopuskuria (Finnzymes, Suomi), 0,2 mM dNTP:ejä, 0,5 μΜ kutakin aluket- ta, 3 % (tilavuus/tilavuus) DMSO:ta ja 1,0 yksikköä Phusion™DNA-polymeraa- sia (Finnzymes, Suomi) ja likimäärin 70 ng/100 μΙ templaattia. Reaktioseos puolitettiin ja ajettiin taulukon 3 ohjelmilla C ja D. Molemmat reaktiot tuottivat 20 odotetun kokoisia DNA-fragmentteja ja valmisteet yhdistettiin ja digestoitiin ,···] Ncol:llä ja Xhol:llä. DNA-fragmentit eristettiin ja ligoitiin samalla tavoin pilkotun • · ja eristetyn pALK1480:n 6,1 kb:n fragmentin kanssa ja transformoitiin E. coli / / XL1 Blue:hun. Plasmidi-DNA:t eristettiin, tarkistettiin digestiolla tarkoituksen- • · · j*:(: mukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Yksi plasmi- ··:: 25 diehdokas, jolla oli toivottu sekvenssi, valittiin ja nimettiin pALK1759:ksi.
··»
Taulukon 1 konstruktille #5 PCR-reaktio suoritettiin käyttäen aluke- paria 20K_Nco_2 (sekvenssi nro 12) ja 20K-NruXho_PavQIPS (sekvenssi nro 21) ja pALK1480-DNA:ta templaattina. Kahta reaktioseosta käytettiin: yhtä, jol- :***: la oli yllä pALK1759:n konstruktiolle kuvattu koostumus, ja toista ilman «·· a/.( 30 DMSO:ta. Nämä kaksi reaktioseosta puolitettiin ja ajettiin taulukon 3 ohjelmilla **!;* C ja D. Kaikki reaktiot tuottivat odotetun kokoisia DNA-fragmentteja ja valmis- • · **:*’ teet yhdistettiin ja digestoitiin Ncol:\\ä ja Xhol:llä. DNA-fragmentit eristettiin ja j(:‘: ligoitiin samalla tavoin pilkotun ja eristetyn pALK1480:n 6,1 kb:n fragmentin ·;··· kanssa ja transformoitiin E. co//XL1 Blue:hun. Plasmidi-DNA eristettiin, tarkis- 35 tettiin digestiolla tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Yksi plasmidiehdokas valittiin ja nimettiin pALK1760:ksi; se oli 30 118340 saanut mutaation ainutlaatuiseen X/7o/-kohtaan, mutta tämä ei aiheuttanut ongelmia jatkosubkloonauksessa.
Taulukon 1 konstruktille #6 PCR-reaktio suoritettiin käyttäen aluke-paria 20K_Nco_3 (sekvenssi nro 13) ja 20K-NruXho_WGEI-2 (sekvenssi nro 5 22) ja pALK1480-DNA:ta templaattina (70 ng/100 μΙ). Käytettiin samaa reak-tioseoskoostumusta kuin plasmidin pALK1767 luomiseksi ja se ajettiin taulukon 3 ohjelmalla C. Valmiste digestoitiin Nco\M ja Xftolillä. DNA-fragmentit eristettiin ja ligoitiin samalla tavoin pilkotun ja eristetyn pALK1480:n 6,1 kb:n fragmentin kanssa ja transformoitiin E. coli XL1 Blue:hun. Plasmidi-DNA:t eris-10 tettiin, tarkistettiin digestiolla tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Yksi plasmidiehdokas valittiin ja nimettiin pALK1773: ksi.
Plasmidit pALK1758, pALk1759, pALK1760 ja pALK1773 pilkottiin erikseen Nru\.\\ä ja Agel.llä ja vektorin osat eristettiin. Kukin valmiste ligoitiin 15 pALK1767:stä eristetyn 235 bp:n fragmentin kanssa Mly\- ja Agel-digestion jälkeen ja kukin ligaatioseos transformoitiin erikseen E. coli XL10-Gold:iin. Plas-midi-DNA:t eristettiin, tarkistettiin digestiolla tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja todennettiin sekvensoinnilla. Todennetut plasmidit nimettiin pALK1764:ksi, pALK1765:ksi, pALK1766:ksi ja pALK1774:ksi mainitussa jär-•*.j 20 jestyksessä (taulukko 1).
amdS-markkeri ja T. reesein cbhf-3’-reunasekvenssi insertoitiin vektoreihin pALK1764, pALK1765, pALK1766 ja pALK1774 seuraavasti: / pALK424 pilkottiin EcoRIM ja Spel.Hä, saatu 4,8 kb:n fragmentti tehtiin tyl- • · · ••y päksi Klenowin täyttöreaktiolla ja ligoitiin erikseen Sful.llä pilkottujen plasmidi- :;y 25 en pALK1764, pALK1765, pALK1766 ja pALK1774 kanssa mainitussa järjes- tyksessä ja transformoitiin E. coli XL10-Gold:iin. Plasmidi-DNA:t eristettiin ja inserttien toivotut orientaatiot tarkistettiin tarkoituksenmukaisten restriktioent-;**.· syymien digestiolla. Todennetut plasmidit nimettiin pALK1768:ksi, pALk1769:ksi, pALK1770:ksi ja pALK1775:ksi mainitussa jäijestyksessä (tau- t»\t 30 lukko 1) (kuva 10).
• · * • · ’· ”/· Esimerkki 2.20K+CBD-fuusioproteiinien tuotanto T. teeseissä • 8,7 kb:n lineaariset ekspressiokasetit plasmideista pALK1434 ja ··· · pALK1435 eristettiin vektorirungosta EcoRI-digestion jälkeen ja transformoitiin T. reesein A47-protoplasteihin. Transformaatiot suoritettiin, kuten kuvataan jul-35 kaisussa Penttilä et ai. (1987) niiden modifikaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen et ai. (1993), valiten asetamidilla ainoana typen lähtee- 31 118340 nä. Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioiden kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla (perunadekstroosiagariila).
Transformanttien 20K+CBD-tuotanto analysoitiin ravistelijoissa kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja 5 kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellulaasin ilmentymistä indusoivassa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella KH2P04:lla pH:ssa 5,5. Fuusioproteiinin entsyymiaktiivisuus mitattiin pelkistettyjen sokenen vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta (3 % CMC) 50°C:ssa 50 mM Hepes-puskurissa pH:ssa 7,0 10 minuutissa (NCU-aktiivi-10 suus, nkat; Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana et ai., 2004). Parhaiten tuottavien transformanttien NCU-aktiivisuudet esitetään taulukossa 4. Valittujen transformanttien genotyypit varmennettiin käyttämällä Southem-blottauksia, joihin sisällytettiin useita genomisia digestejä ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena. 20K+CBD-proteiini detektoitiin viljelysupematanteista 15 käyttäen puhdistettua neutraalia Melanocarpus albomycesin 20K-sellulaasia vastaan tuotettuja polyklonaalisia vasta-aineita (Haakana et ai. 2004) ja Proto-Blot Western blot AP -systeemiä (Promega). Westem-blottausanalyysit osoittivat, että 20K+CBD-fuusioentsyymit tuotettiin pääasiassa stabiileina fuusiopro-teiineina T. reeseissä.
20 Taulukko 4. Valittujen 20K+CBD-transformanttien NCU-aktiivisuudet ra- • · :: vlstelijoissa kasvatettavista pulloviljelmistä
«*» f"·"......." ..........................I I I I
Transformantti Konstruktio RF-numsro Neutraali sellu- Endogeenisen e e :.*·· nro laasiaktiivisuus, sellulaasin ;t| ;____NCU/ml__fenotyyppi i A47/pALK1434/#20 #1 RF5580 3278 CBHI- ees e — A47/pALK1434/#23 #1 RF5581 2091 (CBHI+) e»t 111 ...... — ' 111 " ·'· · ..... ................ ........ ...... .......
A47/pALK1434/#37__#1__RF5582__2330__CBHI- A47/pALK1435/#3__#2__RF5583__3624__CBHI- '.···. A47/pALK1435/#7 #2 RF5584 3211 CBHI- e · -— --- [·[ A47/pALK1435/#11__#2__RF5585__1172__(CBHI+) A47/pALK1435/#14 #2 RF5586 3152 CBHI-
ees I * I
e · e e eet e : Taulukossa 4 konstruktionumero viittaa taulukkoon 1; RF-numero eee e viittaa nimeen, jolla transformantit nimettiin RF-kantoina.
32 118340
Ekspressiokasetin mahdollinen kohdentaminen obM-lokukseen (cel7A) seulottiin CBHI-negatiivisena fenotyyppinä Westem-blottauksella. CBHI-proteiinin detektio suoritettiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita Cl-258 tai CI-261 (Aho et ai. 1991) ja ProtoBlot Western Blot AP-systeemiä (Pro-5 mega, USA). Valittujen transformanttien genotyypit varmennettiin käyttämällä Southem-blottauksia, joihin sisällytettiin useita genomisia digestejä, ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena.
8,7 kb:n lineaariset ekspressiokasetit esimerkissä 1 valmistetuista plasmideista pALK1768, pALK1769, pALK1770 ja pALK1775 eristettiin vektori-10 rungosta EcoRI-öigestion jälkeen ja transformoitiin T. reesein RF5796- ja RF5798-protopiasteihin (molemmat kannat olivat peräisin QM6a-kannasta (Bailey ja Nevalainen, 1981) ja niillä oli fenotyyppi CBHI- CBHII- EGI- EGII-endogeenisille T. reesel·sellulaaseille) valiten asetamidilla ainoana typen lähteenä. Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioiden kaut-15 ta, ennen kuin ne idätettiin PD.IIa.
Transformanttien 20K+CBD-tuotanto analysoitiin ravistelijoissa kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellulaasin ilmentymistä indusoivassa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella 20 KH2P04:lla pH:ssa 5,5. Tuotettujen 20K+CBD-fuusioproteiinin NCU-aktiivisuus . . analysoitiin sitten, kuten yllä kuvattiin. Valittujen transformanttien NCU-aktiivi- • · suudet esitetään taulukossa 5. Valittujen transformanttien genotyypit varmen-nettiin käyttämällä Southem-blottauksia, joihin sisällytettiin useita genomisia • · :.**i digestejä, ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena. 20K+CBD- 25 proteiini detektoitiin viljelysupematanteista käyttäen puhdistettua neutraalia M.
: albomycesin 20K-sellulaasia vastaan tuotettuja polyklonaalisia vasta-aineita :***: (Haakana et ai. 2004) ja ProtoBlot Western blot AP -systeemiä (Promega, • · USA). Western-blottausanalyysit osoittivat, että transformantit tuottivat :·. 20K+CBD-fuusioentsyymin. Jotkut viljelmät osoittivat myös juovan, joka reagoi • · · 30 anti-20K-antiseerumin kanssa ja jolla oli villityypin 20K-proteiinin liikkuvuus, *!1 mikä ilmaisi, että linkkeri+CBD:n jotakin pilkkoutumista oli mahdollisesti tapah- • · tunut viljelyn aikana. pALK1770-transformanttien tuottama 20K+CBD-fuusio- • · · proteiini valittiin jatkotutkimuksiin stabiiliutensa vuoksi.
· • · · • » · ··· · · 33 118340
Taulukko 5. Valittujen 20K+CBD-transformanttien NCU-aktiivisuudet ra-vistelijoissa kasvatettavista pulloviljelmistä
Transformantti Konstruktio RF-numero Neutraali sellu- nro laasiaktiivisuus, ____NCU/ml RF5796/pALK1768/#6__#3__RF5966__3622_ RF5796/pALK1768/#7__#3__RF5967__1316 RF5796/pALK1768/#9__#3__RF6035__6605 RF5798/pALK1768/#11 #3__RF5970__1525 RF5798/pALK1768/#17 #3__RF5971__2885 RF5798/pALK1768/#20 #3__RF5972__2598 RF5796/pALK1769/#7__#4__RF5968 4344 RF5796/pALK1769/#10 #4__RF5969 4858 RF5796/pALK1769/#11 #4__RF6036__6145 RF5798/pALK1769/#4__#4__RF5973__4505 RF5798/pALK1769/#8 #4__RF5974__4895 RF5796/pALK1770/#13 #5__RF5975 3073 RF5796/pALK1770/#17 #5__RF5976__2256 RF5796/pALK1770/#22 #5__RF5977__2107_ .·"! RF5798/pALK1770/#10 #5__RF5978__1907_ RF5798/pALK1770/#14 #5 RF5979 3661 • * • · • * * RF5796/pALK1775/#8__M__RF6078__2431 RF5796/pALK1775/#13 #6__RF6079__3505 RF5796/pALK1775/#21 #6__RF6080__2541_ RF5798/pALK1775/#22 #6__RF6081__1697 RF5798/pALK1775/#29 #6 RF6082 3096 • · • · ··· :V: Taulukossa 5 konstruktionumero viittaa taulukkoon 1; RF-numero 5 viittaa nimeen, jolla transformantit nimettiin RF-kantoina.
: ;.t T. reesei -kantoja RF5582, RF5583, RF6036, RF5977 ja RF5978 :y \ kasvatettiin bioreaktorissa sovellustestejä varten. Jotkin valmisteet kuumakäsi- teltiin (pH 6,0, 65 °C, 60-70 min) kaiken jäljelle jääneen T. reesein endogeeni- 34 118340 sen entsyymiaktiivisuuden inaktivoimiseksi. 20K+CBD on suhteelliset stabiili kuumuudessa (Miettinen-Oinonen et ai. 2004) eikä denaturoidu käsittelyn aikana.
Esimerkki 3. 20K+CBD-affiniteettimutanttifuusioproteiinien tuotanto T.
5 reeseissä
Melanocarpus albomycesin 20K-entsyymi (cel45A, AC# AJ515703) sulautettiin Trichoderma reesein CBHI:n selluloosaa sitovaan domeeniin (CBD), jossa konservoituneet tyrosiinit asemissa 31 (vastaa kypsän polypepti-din Y492:ta) ja/tai 32 (vastaa kypsän polypeptidin Y493:a) mutatoitiin alaniinik-10 si, kuten kuvataan julkaisussa Linder et ai., 1995. Lisäksi tyrosiini asemassa 31 korvattiin tryptofaanilla, aminohapolla, jota luonnostaan löytyy esim. Humi-cola grisean CBHI:n (Azevedo et ai., 1990) ja T. reesein EGV:n (Cel45A, Salo-heimo et ai., 1994) CBD-alueelta. Mutatoidut CBD:t konstruoitiin PCR:lla ja Y31A-, Y32A-, Y31W ja Y31A_Y32A-aminohapposubstituutiot sisällytettiin T. 15 reesein CBHI:n selluloosaa sitovaan domeeniin (numerointi CBD:n aminohapposekvenssin mukaisesti). Kaikissa konstrukteissa forward-aluketta 3_BamMly: 5’-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCG-3’ (sekvenssi nro18) käytettiin. Erilaisten CBDmurtuotteiden monistamiseen käytetyt reverse-alukkeet kuvataan taulukossa 6. PCR-reaktioseokset sisälsivät 1 x 20 PfuUltra™HF-reaktiopuskuria (Stratagene, USA), joka sai aikaan 2 mM Mg2+-:,1·· konsentraation, 0,2 mM dNTP:ejä, 2 μΜ kutakin aluketta ja 1,5 yksikköä
PfuUltra™HF-DNA-polymeraasia (Stratagene, USA) ja likimäärin 45 ng :1·.· pALK492-plasmidia templaattina. pALK492-plasmidi (kuva 2.) sisältää T. ree- * · : sein cbh1-geenin. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraavat: 2 min alku- :**,·1. 25 denaturaatiota 95 °C:ssa, jota seurasi 30 1 minuutin sykliä 95 °C:ssa, 1 minuu- • · 1 [···[ tin alukkeiden kiinnittymisvaihe 65 °C:ssa (±5 °C —gradientti), 2 min alukkeiden « · pidentymisvaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan.
• · • i1 · · · • · • ·1 • · · · • · · • · • · · 1 * 1 • · · • 1 • 1 1 • · · Φ · t · · I-1-^-1-r5-! 1 1 8340 *2 w ^ ‘S __ » _ '55 _ <3 w c- «joo wo wo
C Q C CM C CM CCS C CO
® E a)., a)., ® .. ® ..
>c >o>o>o>o
φ Q)CqCqjCqC
(/) <Λ ΙΛ <0 (/) .2 < 3 S'
0 2 D < < 5 C
.E Λ ;M T- CM ^ Λ e Ω. 4-» co co co 1 i s > > > i
3 CO
M > 0 0 0 0 0 0 CD 0 rt rt rt rt u u 0 0 E-< E-* E-* E-* +* Eh Eh Eh Eh Φ 0 0 0 0 φ 0 0 0 0 a 0 0 0 0 I s s s s 3 0 EH 0 0 — 0000 <P rt u rt o
f EH 0 Eh CD
q; 0000 0 S 5 S g n rt e rt rt 1 0 0 u 0
Λ) H H H
S O O CJ u fe u u o o Φ e> o u o > 0 CD o o 2rt rt rt c
U U U (J
** < < rt rt w E-< Eh Eh £h 3 Eh Eh Eh Eh S Eh Eh Eh Eh Λ) CJ u u o £S ο 0 ο o •s rt rt rt rt C e> o e> 0 C o o o o ^ o o o u 3 S g Ö s (A 0 0 0 0 0 0 O 0 c eh eh eh eh flj Eh Eh Eh Eh
X EH Eh Eh EH
® 0 0 0 0 W 0 0 0 0 ·“ O 0 0 0
:·.: I S S S S
• · JS EH EH EH EH
... t: 0 0 0 0 .***. <2 0 0 0 0 • 3 0 0 0 0
·*· £ EH Eh EH EH
. · O Λ» 0 0 0 0 • · · c in 0000 ·. *1 C E 0 0 0 0 • _ Φ 0 0 0 0 • ·. C > rt rt rt rt d)S 00O0 :**.· s ^ g g 0 g :: : ® gj Z £ £ £ ··· · *3 *2 0 0 0 o ··· O « rt rt rt rt .· Χ ® (3000
·.,,· 3 a EH EH EH EH
* I I I I
A Φ k <t >k b y w ιΟ ifl I LO l ld QQ----- ·· O < : *.. z. » o Λ *,,, £ § 5; :2 ot ct o c»
.··*. .Si, .3 -* D CO CO CD CD
*...· 3 £ i *» .*. o —----- • · · +d • * · m ^ * · 42 <
·** 3 N
*...* E £ . *. cd < < 5 *i * h- cm »- v- ·*· O co co co co *** I .2 >-, >, >-.
·;··; -¾ cd φ φ a»
— Φ O) σ> Ui CT
3-2 <£ <£ <
S 3 O O O O
TO x: ^ jo x: 1-3 x x x x 36 118340
Kaikki alukeyhdistelmät tuottivat spesifisen DNA-fragmentin PCR-reaktioissa alukkeiden 60 °C:n kiinnittymislämpötilassa. PCR-tuotteet eristettiin näistä reaktioista, digestoitiin Xho\- ja BamHI-restriktioentsyymeillä ja sitten kloonattiin pBluescript II KS+:aan (Stratagene, USA). Saadut plasmidit nimet-5 tiin pALK1884:ksi (V31A-mutaatio), pALK1885:ksi (Y32A-mutaatio), pALK1886:ksi (Y31W-mutaatio) ja pALK1887:ksi (Y31A_Y32A-mutaatiot). PCR-fragmentit plasmideissa varmennettiin sekvensoinnilla. Plasmidien pALK1884 ja pALK1887 M/yl- ja Agel-digestoidut insertit ligoitiin edelleen Nru\-ja Agel-digestoituun pALK1760-vektorifragmenttiin, joka sisälsi täysimittaisen 10 Melanocarpus albomycesin 20K-geenin sulautuneena T. reesein cbh1 (cel7A) -promoottoriin ja -terminaattoriin. 20K-geenin C-terminaalinen osa pALK1760:ssa modifioitiin niin, että CBD-fragmentin ligaatio tuotti PAV-QIPSS:n (konstrukti #5) liitoskohdan, jonka osoitettiin johtavan stabiiliin fuu-siotuotteeseen T. reeselssä, kuten kuvataan esimerkeissä 1 ja 2. Viimeisessä 15 vaiheessa amdS-markkeri lisättiin p3SR2-plasmidin (kuva 6) tylppäpäisenä Spel-EcoRI-fragmenttina (4,5 kb) pALK1877:n (Y31A-mutaatio), pALK1878:n (Y32A-mutaation), pALK1879:n (Y31W-mutaatio) ja pALK1880:n (Y31A_Y32A-mutaatio) ekspressiovektoreiden saamiseksi 20K+CBDmurfuusio-entsyymien tuottamiseksi T. reaseissä. 20K-proteiinin aminohapposekvenssin 20 fuusio linkkeripeptidiin, jota seuraa mutatoitu CBD-alue esitetään kuvassa 11B. Ekspressioplasmidit varmennettiin sekvensoinnilla ja 8,4 kb:n lineaariset eks-*·.’·: pressiokasetit (Kuva 11 A) eristettiin vektorirungosta Λ/ofl-digestion jälkeen ja f · · transformoitiin T. reesein RF5796-protoplasteihin. Transformaatiot suoritettiin, :/·· kuten julkaisussa Penttilä et ai. (1987), niiden modifikaatioiden kanssa, jotka ! :*: 25 kuvataan julkaisussa Karhunen et ai. (1993), valiten asetamidilla ainoana ty- • ;*; pen lähteenä. Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioi- • · · .*·*. den kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla.
Transformanttien 20K+ CBDmurtuotanto analysoitiin ravistetijoissa ;·, kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja • ·· 30 kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellulaasin ilmentymistä indusoivas-*"·* sa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella • m ·/·,' KH2P04:lla pH:ssa 5,5. Fuusioproteiinin entsyymiaktiivisuus mitattiin pelkistet- Γ': tyjen sokerien vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta (3 % CMC) ; ’·. 50°C:ssa 50 mM Hepes-puskurissa pH:ssa 7,0 10 minuutissa (NCU-aktilvi- • 44 35 suus, nkat; Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana et ai., 2004). Parhaiten tuottavien transformanttien NCU-aktiivisuudet esitetään taulukossa 7. Valittujen 37 118340 transformanttien genotyypit varmennettiin käyttämällä Southern-blottauksia, joihin sisällytettiin useita genomisia digestejä ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena. 20K+CBDmurproteiini detektoitiin viljelysupernatanteista käyttäen puhdistettua neutraalia Melanocarpus albomycesin 20K-sellulaasia 5 vastaan tuotettuja polyklonaalisia vasta-aineita (Haakana et ai. 2004) ja Proto-Blot Western blot AP -systeemiä (Promega). Western-blottausanalyysit osoittivat, että 20K+CBDmurfuusioentsyyrnit tuotettiin stabiileina fuusioproteiineina T. reeseissä.
Taulukko 7. Valittujen 20K+CBDmurtransformanttien NCU-aktiivisuudet 10 ravistelijoissa kasvatettavista pulloviljelmistä
Transformantti Aminohapposubstttuutio RF-numero Neutraali sellulaasi-____aktiivisuus, NCU/ml pALK1877/#26 Y31A__RF6084__3658_ pALK1877/#34 Y31A__RF6085__2447_ pALK1878/#02 Y32A__RF6086__3434_ pALK1878/#13 Y32A__RF6088__2915_ pALK1879/#13 Y31W__RF6090__2545_ pALK1879/#24 Y31W__RF6091__3452_ pALK1880/#06 Y31A_Y32A__RF6092__3415_ pALKl880/#25 Y31A_Y32A RF6094 2727 • et RF-numero viittaa nimeen, jolla transformantit nimettiin RF-kantoina.
Kannat RF6084-RF6086, RF6088, RF6090-RF6092 ja RF6094 fermentoitiin materiaalin saamiseksi sovellustesteihin (katso esimerkit 9-11).
e e • · · ees • es e : Esimerkki 4. 20K+CBD-linkkerideleetiofuusioproteiinien tuotanto T. ree- "··! 15 seissä •
Melanocarpus albomycesin 20K-entsyymi sulautettiin Trichoderma ·'. reesein CBHI:n selluloosaa sitovaan domeeniin (=CBD), joka edelleen modifi- • ·· oitiin tuomalla deleetioita interdomeenilinkkeripeptidiin. Linkkerideleetiot suun-**:** niteltiin julkaisun Srisodsuk et ai., 1993 mukaisesti. Aminohappojen deleetio 20 kypsän polypeptidin asemista 434—444 (Mutantti AG-444) poistaa likimäärin yhden kolmasosan linkkeristä, mukaan lukien glysiini- ja proliinirikkaan toistu-. \ van sekvenssin, mutta jättää kaikki oletetut O-glykosylaatiokohdat koskemat- • · e torniksi. Aminohappojen deleetio asemista 434—460 (Mutantti ÄG-460) poistaa käytännöllisesti katsoen koko linkkerin (kuva 12 A). 20K+CBD-linkkerin lisäde- 38 118340 leetioita, joilla oli affiniteettikaksoismutaatio Y31A_Y32A CBD-alueella, myös konstruoitiin.
PCR-reaktiot suoritettiin deleetioiden tuomiseksi linkkeripeptidiin sekä aminohapposubstituutioiden tuomiseksi CBD-alueelle. PCR-monistamiset 5 tehtiin, kuten kuvataan esimerkissä 3 paitsi, että käytettiin 60°C:n (±5°C:n gradientti) alukkeiden kiinnittymislämpötilaa. Forward-alukkeita 5’-TAGGAT CCGAGT CCCATTACCGGCAACCCTAGCACCACC-ACCACCCGCCGCCCAGCC-3’ (sekvenssi nro 31) ja 10 5’-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCCCTACCC- AGTCTCACTACGGCCAGTGC-3’ (sekvenssi nro 32) käytettiin linkkerideleetioiden AG-444 ja AG-460 syntetisoimiseksi mainitussa järjestyksessä. Vastaavasti reverse-aluketta 5’-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCT-15 TTACAGG-3’ (sekvenssi nro 33) käytettiin monistamaan T. reesein CBHI:n koskematonta CBD- aluetta.
Y31 A_Y32A-mutaatio CBD-alueeseen kehitettiin reverse-alukkeella 5’-T GACT CGAGACCGGTGCGTCAGGCTTT CGCACGGAGCTT- . 20 TACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG-3’ (sekvenssi nro 30) *;./ Kaikki alukeyhdistelmät tuottivat spesifisen DNA-fragmentin PCR- • · *;·*! reaktioissa välin 55,2 °C-65,0 °C alukkeiden kiinnittymislämpötiloissa. Eks- pressioplasmidit pALK1893 (AG-444-deleetio), pALK1896 (AG-460-deleetio), : pALK1899 (AG-444-deleetio, Y31A_Y32A-mutaatio) ja pALK1952 (AG-460- :.· * 25 deleetio, Y31A_Y32A-mutaatio) konstruoitiin, kuten kuvataan esimerkissä 3.
20K-proteiinin aminohapposekvenssien fuusio typistettyyn linkkeripeptidiin, jota seuraa koskematon tai mutatoitu CBD, esitetään kuvassa 12B. 8,3 kb:n li-:*.a> neaariset ekspressiokasetit eristettiin vektorirungosta EcoRI-digestion jälkeen ,···. ja transformoitiin T. reesein RF5796-protoplastiin. Transformaatio, transfor- • · 30 mäntin puhdistus, ravistelijoissa kasvatettavat pulloviljelmät, aktiivisuusmitta-ukset, Southern-blottaushybridisaatiot ja Westem-blottausanalyysit suoritettiin, • · · kuten kuvataan esimerkissä 3.
• · • * · • · · ··* · * • · 39 118340
Taulukko 8. Valittujen 20K+CBD-linkkerideleetiotransformanttien NCU-aktiivisuudet ravistelijoissa kasvatettavista pulloviljelmistä.
Transformantti Linkkerideleetio/ RF-numero Neutraali sellulaasi- __Aminohapposubstituutio___aktiivisuus, NCU/ml pALK1893/#08 AG-444__RF6107__1182_ pALK1893/#10 AG-444__RF6108__2058_ pALK1896/#05 AG-460__RF6110__2576_ pALK1896/#07 AG-460__RF6111__2628_ pALK1899/#07 AG-444, Y31A_Y32A__RF6112__1947_ pALK1899/#20 AG-444, Y31A_Y32A__RF6114__2462_ pALK1952/#01 AG-460, Y31 A_Y32A__RF6115__2428_ pALK1952/#17 AG-460, Y31A_Y32A__RF6116 [ 1738_ RF-numero viittaa nimeen, jolla transformantit nimettiin RF-kantoina.
Valitut kannat RF6107, RF6108, RF6110-RF6112 ja RF6114-RF6116 fer-5 mentoitiin materiaalin saamiseksi sovellustesteihin (esimerkit 9-11). Westem-blottausanalyysit osoittivat, että 20K+CBD-linkkerideleetiofuusioentsyymit tuotettiin stabiileina fuusioproteiineina T. reeseissä.
Esimerkki 5. Rekombinantin Melanocarpus albomycesin 50K+CBD-fuu-.·. : sioproteiinin tuotanto T. reeseissä • · e .···. io Plasmidikonstrukteja suunniteltiin yhdistämään Melanocarpus al- ,·"· bomycesin 50K:ta (cel7A, AC# AJ515704) koodittava sekvenssi T. reesein e · · .*'/ CBHI:n linkkerialueen ja selluloosaa sitovan domeenin (CBD) kanssa (cel7A, :.*Y AC# AR088330; Srisodsuk et ai. 1993). Plasmidi pALK1237 (kuva 4), joka on • · · :*j>: lähtökohta uusille konstrukteille, sisältää ce/7A-geenin T. reesein cbh1- 15 promoottorin säätelyn alaisena tarkkana fuusiona.
Ensin ainutlaatuinen A/rul-restriktiokohta tuotiin lähelle 50K:ta koo-• *·· dittavan sekvenssin C-terminusta. Tämä mahdollistaa minkä tahansa tylppä- päisen DNA:n suoran fuusion kypsän 50K-polypeptidin (kuva 13B) aminoha-.·*.·. pon S393 jälkeen. PCR-reaktio suoritettiin alukkeiden 2_50K_NrulSpel (5’ *:!:* 20 CGGCACTAG!!" CGCGACCCGATCT CGCCCCAGCGCAGG 3’; sekvenssi nro: 25) ja 50K_Xhol (5’ CGCCGAGGGCCGGCTCGAGAGCATCC 3’; sek- I.:': venssi nro: 26) kanssa käyttäen pALK1237:ä templaattina. PCR-reaktio sisälsi
*:*·: 1 x DyNAzyme™EXT-reaktiopuskuria (Finnzymes, Suomi), 0,25 mM
dNTP:ejä, 0,5 μΜ kutakin aluketta, 2,0 yksikköä DyNAzyme™EXT DNA-poly-25 meraasia (Finnzymes, Suomi) ja likimäärin 50 ng/100 μΙ pALK1237-templaatti- 40 118340 DNA:ta. PCR-monistuksen olosuhteet olivat seuraavat: 5 min alkudenaturaa-tiota 96°C:ssa, jota seurasi 25 15 sekunnin sykliä 96°C:ssa, 60 sekunnin alukkeiden kiinnittymisvaihe 56 °C:ssa tai 61 °C:ssa, 60 sekunnin alukkeiden pidentymisvaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C:ssa 10 minuutin 5 ajan. PCR-tuote digestoitiin Xho\- ja Spel-restriktioentsyymeillä ja puhdistettiin agaroosigeeliltä. Puhdistettu PCR-fragmentti ligoitiin plasmidin pALK1237 6,9 kb:n ΧΛοΙ-Spel-restriktiofragmenttiin ja transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Plasmidi-DNA eristettiin transformanteista ja kolme ehdokasta todennettiin sekvensoinnilla. Valittu klooni nimettiin pALK1703:ksi.
10 T. reesein CBHI.n linkkeri+CBD monistettiin PCR:lla alukkeiden 3_BamMly_50 (5’ TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3’; sekvenssi nro: 36) ja XhoAge (5’ TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGC-TTTCGC 3’; sekvenssi nro: 15) kanssa käyttäen pALK492:a templaattina. PCR-reaktio-olosuhteet olivat yllä kuvatun kaltaiset paitsi, että pidennysvai-15 heen aika monistusreaktiossa oli 90 s. PCR-tuote digestoitiin Mly\- ja AgeI-entsyymeillä ja puhdistettiin agaroosigeeliltä. Linkkeri+CBD:n sisältävä PCR-fragmentti ligoitiin pALK1703:n 6,8 kb:n Agel-A/rul-restriktiofragmenttiin ja transformoitiin E. co//XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Transformantit analysoitiin, kuten yllä kuvataan, ja sopiva klooni nimettiin pALK1704:ksi.
: 20 T. reesei -transformanttien valinnan mahdollistamiseksi amdS- • ·· m···] markkerigeeni ja T. reesein cbhl-3’-reunasekvenssi insertoitiin vektoriplasmi- V'! diin pALK1704. pALK424 (US 5 837 515) 4,8 kb:n EcoRI-Spel-restriktio- / / fragmentti eristettiin ja fragmentin päät täytettiin Klenow-entsyymillä. Tylppä- • » · j”t: päinen amdS-markkerifragmentti ligoitiin Sful-digestoituun pALK1704:ään ja : 25 transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Plasmidi-DNA eristet- • · · tiin transformanteista ja insertin toivottu orientaatio todennettiin restriktioent-syymidigestiolla. Valittu transformantti nimettiin pALK1708:ksi.
9,2 kb:n lineaarinen ekspressiokasetti (kuva 13A) pALK1708:n run- :***: gosta eristettiin EcoRI-digestiolla, transformoitiin T. reesein RF5636-protoplas- • · · 30 teihin (peräisin QM6a-kannasta; Bailey ja Nevalainen, 1981) ja transformantit iS valittiin asetamidilla ainoana typen lähteenä. Isäntäkannalta puuttuu kolme en- ’·;·* dogeenistä pääsellulaasia: CBHII (Cel6A), EGI (Cel7B) ja EGII (Cel5A). Trans- : formaatio suoritettiin julkaisun Penttilä et ai. (1987) mukaisesti niiden modifi- ·:··· kaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen et ai. (1993). Trans- 35 formantit puhdistettiin valintamaljoilia yksittäisten konidioiden kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla.
41 118340
Transformanttien 50K+CBD-fuusioproteiinin tuotanto analysoitiin ra-vistelijoissa kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellulaasin ilmentymistä indusoivassa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-5 prosenttisella KhfePO^IIa pH:ssa 5,5. Fuusioproteiinin entsyymiaktiivisuus mitattiin pelkistettyjen sokerien vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta (3 % CMC) 50 °C:ssa 50 mM Hepes-puskurissa pHrssa 7,0 (NCU-aktiivisuus; Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana et ai., 2004). Transformanttien aktiivisuus vaih-teli 2035-3633 NCU/ml. 50K+CBD-proteiini detektoitiin viljelysupematanteista 10 ProtoBlot Western blot AP -systeemillä (Promega) käyttäen puhdistettua neutraalia Melanocarpus albomycesin 50K -sellulaasia vastaan tuotettuja polyklo-naalisia vasta-aineita (Haakana et ai. 2004). Westem-blottausanalyysit osoittivat, että T. reeseistä tuotettu 50K+CBD-fuusioproteiini oli stabiili. Valittujen transformanttien genotyypit analysoitiin Southem-blottauksella käyttäen eks-15 pressiokasettia koettimena. Ekspressiokasetin mahdollinen kohdentaminen cbhl-lokukseen todennettiin myös Westem-blottauksella käyttäen monoklonaa-lisia CBHI-vasta-aineita (CI-261, Aho et ai. 1991) CBHI-proteiinin detektoimi-seksi.
Esimerkki 6. Rekombinantin Melanocarpus albomycesin 50KB+CBD-fuu- :· “ 20 sioproteiinin tuotanto T. reeseissä • · · • · *···] Plasmidikonstruktit suunniteltiin yhdistämään Melanocarpus albo- :.**i mycesin 50KB:tä (cel7B, AC# AJ515705) koodittava sekvenssi T. reesein · CBHI:n (cel7A, AC# AR088330; Srisodsuk et ai. 1993) linkkerialueen ja sellu- loosaa sitovan alueen (CBD) kanssa. Plasmidi pALK1241 (kuva 5), joka on f": 25 lähtökohta uusille konstrukteille, sisältää ce/76-geenin T. reesein cö/ϊ f-pro moottorin säätelyn alaisena tarkkana fuusiona.
:*. Ensin ainutlaatuinen A/rul-restriktiokohta tuotiin lähelle 50KB:tä koo- e ·· !···. dittavan sekvenssin C-terminusta. Tämä mahdollistaa minkä tahansa tylppä- • · päisen DNA:n suoran fuusion kypsän 50KB-polypeptidin (kuva 14B) aminoha-30 pon S426 jälkeen. PCR-reaktio suoritettiin alukkeiden 50KB_NrulXhol (5' C: TCGTCTCGAGTCGCGATGGGGCCGAAGCGGATGTTGG 3’; sekvenssi nro: : !*. 23) ja 50KB_Sphl (5’ GGAGGGCATGCCCAACAGCAGCGAGATCACC 3’; !!!.: sekvenssi nro: 24) kanssa käyttäen pALK1241:ä templaattina. PCR-reaktio si sälsi 1 x DyNAzyme™EXT-reaktiopuskuria (Finnzymes, Suomi), 0,25 mM 35 dNTP:ejä, 0,5 μΜ kutakin aluketta, 2,0 yksikköä DyNAzyme™EXT DNA-poly-meraasia (Finnzymes, Suomi) ja likimäärin 50 ng/100 μΙ pALK1241-templaatti- 42 118340 DNA:ta. PCR-monistuksen olosuhteet olivat seuraavat: 5 min alkudenaturaa-tiota 96°C:ssa, jota seurasi 25 15 sekunnin sykliä 96°C:ssa, 60 sekunnin alukkeiden kiinnittymisvaihe 56 °C:ssa tai 60 °C:ssa, 60 sekunnin alukkeiden pidentymisvaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C:ssa 5 minuutin 5 ajan. PCR-tuote digestoitiin Xho\- ja Spel-restriktioentsyymeillä ja puhdistettiin agaroosigeeliltä. Puhdistettu PCR-fragmentti ligoitiin plasmidin pALK1241 6,9 kb:n XPol-SpÄ7l-restriktiofragmenttiin ja transformoitiin E coli XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Plasmidi-DNA eristettiin transformanteista ja yksi ehdokas todennettiin sekvensoinnilla. Valittu klooni nimettiin pALK1705:ksi.
10 T. reesein CBHI:n linkkeri+CBD monistettiin PCR:lla alukkeiden 3_BamMly_50 (5’ TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3’; sekvenssi nro: 18) ja XhoAge (5’ TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTT-CGC 3’; 15) kanssa käyttäen pALK492:a templaattina. PCR-reaktion olosuhteet olivat yllä kuvatun kaltaiset paitsi, että pidennysvaiheen aika monistusre-15 aktiossa oli 90 s. PCR-tuote digestoitiin Mly\~ ja Agrel-entsyymeillä ja puhdistettiin agaroosigeeliltä. Linkkeri+CBD:n sisältävä PCR-fragmentti ligoitiin pALK1705:n 7,2 kb:n Agel-A/rul-restriktiofragmenttiin ja transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Transformantit analysoitiin, kuten yllä kuvataan ja sopiva klooni nimettiin pALK1706:ksi.
.·. : 20 T. reesei -transformanttien valinnan mahdollistamiseksi amdS- * · · markkerigeeni ja T. reesein aW?l-3’-reunasekvenssi insertoitiin vektoriplasmi- *"*! diin pALK1706. pALK424 (US 5 837 515) 4,8 kb:n EcoRI-Spel-restriktio- * « / / fragmentti eristettiin ja fragmentin päät täytettiin Klenovv-entsyymillä. Tylppäin ί päinen amofS-markkerifragmentti ligoitiin Sfcvl-digestoituun pALK1706:een ja : 25 transformoitiin E. coli XL1-Blue:hun (Stratagene, USA). Plasmidi-DNA eristet- ··· tiin transformanteista ja insertin toivottu orientaatio todennettiin restriktioent- syymidigestiolla. Valittu transformantti nimettiin pALK1709:ksi.
9,6 kb:n lineaarinen ekspressiokasetti (kuva 14A) pALK1709:n run- ;***. gosta eristettiin EcoRI-digestiolla, transformoitiin T. reesein RF5636-protoplas- »·· 30 teihin ja transformantit valittiin asetamidilla ainoana typen lähteenä. Isäntäkan- • · · *^‘ naita puuttuu kolme endogeenistä pääsellulaasia: CBHII (Cel6A), EGI (Cel7B) *·;·* ja EGII (Cel5A). Transformaatio suoritettiin julkaisun Penttilä et ai. (1987) mu- : kaisesti niiden modifikaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen • · · · ·;··: et ai. (1993). Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioi- 35 den kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla.
43 118340
Transformanttien 50KB+CBD-fuusioproteiinin tuotanto analysoitiin ravistelijoissa kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellulaasin ilmentymistä indusoivassa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-5 prosenttisella KhfePO^IIa pH:ssa 5,5. Fuusioprotelinin sellobiohydrolaasiaktiivi-suus mitattiin käyttäen 4-metyyliumbelliferyyli-p-D-laktosidisubstraattia (MUL-aktiivisuus; van Tilbeurgh et ai. 1988). 50KB+CBD-protelini detektoitiin viljelysupematanteista ProtoBlot Western blot AP -systeemillä (Promega) käyttäen puhdistettua Melanocarpus albomycesin 50KB-sellulaasla vastaan tuotettuja 10 polyklonaalisia vasta-aineita (Haakana et ai. 2004). Westem-blottausanalyy-seissä villityypin 50KB-proteiinia ei detektoitu, mikä osoittaa, että T. reeseistä tuotettu 50KB+CBD-fuusioproteiini on stabiili. Valittujen transformanttien genotyypit analysoitiin Southem-blottauksella käyttäen ekspressiokasettia koettimena. Ekspressiokasetin mahdollinen kohdentaminen cbhl-lokukseen toden-15 nettiin myös Western-blottauksella käyttäen monoklonaalisia CBHI-vasta-ainei-ta (CI-261, Aho et ai. 1991) CBHI-proteiinin detektoimiseksi.
Esimerkki 7. Rekombinanttien Thermoascus aurantiacuksen CBHI+CBD-fuusiproteiinien tuotanto T. reeseissä . . Thermoascus aurantiacuksen CBHI (AC# AF478686, Hong et ai., • · 20 2003; sekvenssi nro: 9) sulautettiin Trichoderma reesein CBHI:n (AC# !···] AR088330, Srisodsuk et ai. 1993; sekvenssi nro:3) linkkeriin ja CBD:iin. Ensin :.‘-i T. reesein CBHI:n linkkerin ja CBD:n koodittava sekvenssi syntetisoitiin • · · PCR:lla käyttäen seuraavia alukkeita: : 5’-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATTGGCA- ♦ *· t 25 GCACCGGCAACCCTAGCGGC-3’ (forward-sekvenssi, sekvenssi nro: 34) ja 5’-TATATGCGGCCGCACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACG-GAGCTTT-:·. >e ACAGGC-3’ (reverse-sekvenssi, sekvenssi nro:35).
]···. PCR-reaktioseos sisälsi 1 x DyNAzyme™EXT-reaktiopuskuria • * (Finnzymes, Suomi), 15 mM Mg2+:a, 0,2 mM dNTP:ejä, 2 μΜ kutakin aluketta, \v 30 0,6 yksikköä DyNazyme™EXT-DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja liki-··· määrin 75 ng/30 μΙ pALK492~templaattia. pALK-plasmidi sisältää T. reesein ; !·. cö/71-geenin (cel7A). Olosuhteet PCR-reaktiolle olivat seuraavat: 2 min alku- denaturaatiota 98 °C:ssa, jota seurasi 30 30 sekunnin sykliä 98 °C:ssa, 30 se- • · kunnin alukkeiden kiinnittymisvaihe 68 °C:ssa (±4 °C -gradientti), 30 sekunnin 35 alukkeiden pidentymisvaihe 72 °C:ssa ja lopullinen pidentymisvaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Spesifinen DNA-fragmentti PCR-reaktiossa aikaansaatiin vä- 44 118340
Iin 64 °C-68,5 °C alukkeiden kiinnittymislämpötilassa. Syntetisoitu CBD-frag-mentti, joka sisälsi myös Thermoascus aurantiacuksen cbh1-geenin 3’-termi-naalisen nukleotidisekvessin, digestoitiin Λ/del- ja A/ofl-restriktioentsyymeillä ja fragmentti eristettiin agaroosigeeliltä elektroforeesin jälkeen. Sen jälkeen eris-5 tetty PCR-fragmentti ligoitiin Λ/del- ja Λ/ofl-digestoituun pALK1649-vektori-fragmenttiin (kuva 7), joka sisälsi täysimittaisen Thermoascus aurantiacuksen cbi?1-geenin. Aikaansaatu plasmidi nimettiin pALK1888:ksi ja PCR-monistettu fragmentti plasmidissa varmennettiin sekvensoinnilla. Fuusion seurauksena Thermoascus aurantiacuksen CBHI:n C-terminaalinen osa pALK1888-plas-10 midissa sisältää GPIGST.n liitoskohdan (kuva 15B). Plasmidin pALK1888 Sa-cll- ja Agel-digestoitu insertti ligoitiin Sacll- ja Agel-digestoituun pALK1694-vaktorifragmenttiin (kuva 8), mikä johtaa Thermoascus aurantiacuksen CBHI+CBD:n fuusioon T. reesein cbh1 (ce!7A) -promoottoriin (tarkka fuusio) ja -terminaattoriin. Viimeisessä vaiheessa amdS-markkerifragmentti lisättiin, ku-15 ten kuvataan esimerkissä 3, pALK1890:n ekspressioplasmidin aikaansaamiseksi rekombinantin Thermoascus aurantiacuksen CBHI+CBD-fuusioentsyy-min tuottamiseksi T. reeseissä. Thermoascus aurantiacuksen CBHI-proteiinin aminohapposekvenssin fuusio linkkeripeptidiin, jota seuraa T. reesein CBHI:n CBD-alue, esitetään kuvassa 15B.
.·.; 20 Ekspressioplasmidi varmennettiin restriktioentsyymidigestioilla ja 8,9 • ·· kb:n lineaarinen ekspressiokasetti (kuva 15A) eristettiin vektorirungosta NotI-digestion jälkeen ja transformoitiin T. reesein RF5796-protoplasteihin. Trans- • · « / " formaatiot suoritettiin, kuten julkaisussa Penttilä et ai. (1987), niiden modifikaa- ··· : tioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen et ai. (1993). Transfer- • · : 25 mäntit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioiden kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla.
Transformanttien Thermoascus aurantiacuksen CBHI+CBD-tuotan- to analysoitiin ravistelijoissa kasvatettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysuper- :***; natanteista. Transformantteja kasvatettiin 7 päivän ajan kompleksisessa sellu- ··· 30 laasin ilmentymistä indusoivassa väliaineessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli i * i puskuroitu 5-prosenttisella KF^PO^IIa pH:ssa 5,5. Sellobiohydrolaasiaktiivi-suus analysoitiin käyttäen 4-metyyliumbelliferyyli-p-D-laktosidisubstraattia j :*: (MUL) julkaisun van Tilbeurgh et ai. 1988 mukaisesti. Valittujen transformantti- ····· en genotyypit varmennettiin käyttämällä Southern-blottauksia, joihin sisällytet- 35 tiin useita genomisia digestejä ja ekspressiokasettia käytettiin koettimena.
1 1 8340 45 SDS-PAGE-analyysit osoittivat, että rekombinantin Thermoascus aurantiacuk-sen CBHI+CBD-entsyymi tuotettiin stabiilina fuusioproteiinina T. reeseissä.
Esimerkki 8. 20K+CBD-fuusiproteiinivalmisteiden teho denimin viimeiste-iyssä/biokivipesussa 5 Esimerkissä 2 kuvatun kaltaisia Trichodermaa isäntänä käyttäen tuotettuja 20K+CBD-fuusioproteiineja testattiin niiden kyvyn suhteen denimin kivipesussa luoda samanlainen kulunut ulkonäkö, joka saadaan aikaan hohka-kivillä. Denimin viimeistelyssä tehokasta kaupallista 20K-valmistetta käytettiin vertailuun.
10 Indigo-värjätystä denim-twill-kankaasta rikkiväripohjalla tehtyjä eng lantilaisia farkkuja käytettiin testimateriaalina tarkin poiston ECOSTONE® A200-a!fa-amylaasilla jälkeen. Kankaan loimi- ja kudelankoja rengaske h rättiin. Sellulaasikäsittelyt suoritettiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesula-koneella taulukossa 9 kuvatuissa olosuhteissa.
15 Taulukko 9. Sellulaasikäsittelyissä käytetyt testiolosuhteet Prosessiparametri__
Denim-kuorma__1,3 kg_
Vesi 19 I
• * —.....— ------— :·**ϊ Puskuri/pH-kontrolli (pH 6,5) 31,6 g Na2HP04 x H20 ·«· 10,5 g sitruunahappo e * "' ' .....
·.*·: Aika__55 min_ Lämpötila__60 °C_
Sellulaasiannos__250-3000 NCU/g kangasta • · t • · • · • · ·
Entsyymit annosteltiin neutraaleina sellulaasiaktiivisuusyksikköinä :\t (NCU) kankaan painoa kohti. Sellulaasientsyymi inaktivoitiin vedenpoiston jäl- ,···, keen nostamalla pH yli 11 lisäämällä 5 g NaOH:a (10 min, 40 °C) ja huuhtele- T 20 maila kolme kertaa. Farkut kuivattiin kuivausrummussa. Kaksi paria farkkuja v.: käytettiin kussakin testissä.
• · ·
Biokivipesuvaikutus/kulutustaso arvioitiin mittaamalla väri heijastus- : .*. suhdearvoina Minolta CM 2500- tai CM 1000 -spektrofotometrillä käyttäen !!*..: L*a*b*-väriavaruuskoordinaatteja (valolaji D65/20). Väri denimin oikealta ja nur- • « 25 jalta puolelta (aineisto ei näkyvissä) mitattiin tarkin poiston jälkeen (ts. ennen sellulaasikäsittelyä) ja sellulaasikäsittelyn jälkeen. Kukin mittaus oli likimäärin 46 118340 40 mittauksen keskiarvo. Kaksi paria farkkuja käytettiin kussakin testissä ja lopullinen tulos on niiden keskiarvo. Vaaleutta tai vaaleuden lisäystä entsyymi-käsittelyn jälkeen käytettiin kulutusvaikutuksen arvioimiseen (teho tai bioklvi-pesuvaikutus). Tulokset osoitetaan taulukoissa 10 ja 11, joissa lihavointia käy-5 tetään korostamaan samanlaisia kulutustasoja ja ekvivalentteja annoksia. Käsittelyjä 20K:lla tai ilman mitään entsyymiä käytettiin vertailuun. Jotkin valmisteista (taulukko 11) oli kuumakäsitelty (pH 6,0, 65 °C, 60-70 min) kaiken jäljelle jääneen T. reesein endogeenisen entsyymiaktiivisuuden inaktivoimiseksi ja/tai kuumakäsittelyn vaikutuksen entsyymin stabiiliuteen testaamiseksi.
• * • · * • ·· • * ··· • · • * • i* * · * · · • ·· • · • · I I · • t · ··· · • · • · · * · • M · ··· • · • · * · · ·· • · • · · ·· • · • · • · · • · • · · • ft · • · • ft · • · • · • •ft • • ft ft ft · ft ft ft ··· ft ft ft 47 1 1 8 3 4 0 ~ί III I~ ‘5 n o in o n t n ~ ^ c\j <n t-_ co σ> c T-" < e e e s co ll e O) r N O) N O ® >, * CO Γ-. CD |s.
φ ϋ cn" t" ^ ^ M T~ T— T T— T— T— T—
^ g I I I I I I I
owe » » e V V* fli £ W £ S S «o E w —>
C 3 CO O 00 O T~ r^~ CO
.E = « T- o e> oo oo o_ cq
:(5 ® —1 CO Tfr CN CN CN LO
> (/) t- CN (N CM CN CNI CM
C
® O--------—- 3 Q.
c, “> o {§ Zi 5 co re ~ *o)r^- -oj-co ® g Λ O) ® o o ® o o>" .
I I » ' t t ' T · a lit i I S s 3 _(/) r C C :(0 Λν ·*·· N O CO 00 to r- £ ··-· oc * soos^coss” .···. &iS -‘““SSSSSf ^ * .·. : *= c \ ·: e_________° : iS re i> • · · js + ··· · re co .
.* .·. = re re :.: : re g» Λ c ··· c £ 2 2 o o o 9 =» :: :sJS o S S o S o S ^ *·· Ä S “Ϊ m cm m ^ » o 5» 00 c o. = £
:·. o o I
• <0 Ä (0 ... 3__________ • · S' c ·... <B o • Λ *2 * ::: ω έ q q q q „ * ! O £ K CO DO DQ OQ (0 s :: + c £ 0000*3 to
... ^(A C’-'-+ + + +3P
• ο -Μ : CN C ·— OOOOOO TO 5 ·,· · LU LU CM CN CM CM CM CN TO > ....: _ φ φ
St © S fs s S = -¾ Λ , , . ο σ> σ> co co 5 3j2 1 1 1 m n m in c ^ 3 C IL IL IL 1L i 3 re «3 Q£ Q£ Q£ CC * v
I— Si I
48 1 1 8 3 4 0
sJ I I I I I I I I I I I
«5 CNJOlOT-CDh-IOlOr-'^-IO
— if CO N » in CO O O ¢0 t- ^ c T-" rC <d in of h-' id oo" iff in to *" _l 4-· fl) (Λ c "5i Sj O)T-CMO5C000iniOh-h-in 3 * co <o in T- σ> i*-_ <n in co in JS 5 B cJ ΐ in" V ^ ΐ 4j .— V 't— T— T— T— T— 1— .— .— .—
— ^ I I I I I I I I 1 I I
E >.
Έ a) :(0 V__________ > S F |5 0) ΐ S «*
o 2 oooooT-cncoincococDO
a ® « V_ 0_ O» <D CO O» I»» s. h- h- O
il 2 J oo Ί·' n ci <o n « a·" ci T-" n
= t-NNMNNNNNNPI
C V
m W
Φ Ö c :(0 F =? inoSgoCDcoeocsigh- ._ * * m n s a e a s C S Λ O) of ° ° ° of o> of of 2 of fl>« 1 1 V V V 1 ' ' ' Y ' Ό jg F in * 8------------ ω "5 +* — Μ Φ
.22 « N-OCOOCO^-OCO(NICNCO(H
Ή c * (--. oo_ ν·_ cn oo cq r-_ i--_ u>_ <q in +3 “ ® -J φ" φ" (Ο φ" ο φ φ’ (£>* φ (D ID “
(0 C
'35 m .£_____________5 • · t “ c • ·· V _ ·—· • · -g JS to
·" P « S
: : fc « φ . . O C OOOOOnOOnar- :.··; »3 =>88888g88ggo_i • * * ,H % ^ w :.: : ·*? g + iu : .·. o z to r ... CD +3 Tz ... . /j-------- c <3
.···. JU u LU
.: o , _L J. _L _L -L 3
*·· Ä ^ X X X X X W_L
£ ± ω oo co ω co gooooo«a5l
:**.. Ξ 2- r * δ S S S S Έ O
• <D Φ __ 4= '4= IS IS '43 S '33 ... — .ti.-ä I! TK <n« -^uzjzjrjzjuc-r ... *S ;J5 ;i9 u ύ ϋ « ύ ύ ύ οϊ • -5£-ί£ *=ιηιηιηιηιηιη ΟΖΙ .. <Λ 2 5 Jöcccccc* /Λ ... :(β Ρ F εοοοοοο-α'Η ... 0; :(q§§ * * m C D 3 i i i i i I i ΛΓ .···. S Έ t^^^QQQQQDQ c(j -2
:: e e Ssj fljrktamcQCQmODOG^CO
··· 3 δ wÄÄg00000003'c ::: *- c .-oooooooooows .... - LU Unnimnnnwimnn n?
(iif. o-_____________> C
. : to o)
O o Φ .E
V t ®OJCMCMCOCOCOh-TO =
ϊ§ « csiSSSSSSSjcoS
3 JS 1 1 'mmioioinioinincE- — c υ.ϋ.υ.ϋ.υ.ϋ.υ-ΐι.£3 2 ro ο:ο;ο;ο;χα:οία: — π
,w Si * V
H _i 49 118340
Tulokset taulukossa 10 ja kuvassa 16 osoittavat, että keksinnön mukaisten 20K+CBD-fuusioproteiinien pesutehoa denimin käsittelyssä parannettiin suuresti verrattuna 20K-kantoihin. Kannan RF5977 kanssa niin matalaa entsyymiannosta kuin 250 NCU/g kangasta voitiin käyttää aikaansaamaan 5 samanlainen kulutustaso (vaaleus L*) kuin se, joka aikaansaatiin 20K:n annoksella 1500 NCU/g. Siten kuusi kertaa parempi pesuteho aikaansaatiin ja kontrasti oli hyvä. Myös kannalla RF5978 aikaansaatu pesuteho oli samanlainen kuin se, joka aikaansaatiin RF5977:llä.
Fuusioproteiinivalmisteiden kuumakäsittely näytti jotenkin pienentä- 10 vän kivipesuvaikutusta, esimerkiksi kannan RF5977 kanssa annos 500 NCU/g kangasta tarvittiin aikaansaamaan sama kulutustaso kuin annoksella 250 NCU/g kuumakäsittelemätöntä entsyymivalmistetta (Taulukko 10). Siitä huolimatta 3-kertainen parannus pesutehossa saavutettiin kun verrataan tunnetun tekniikan mukaiseen valmisteeseen.
15 Esimerkki 9. 20K+CBD-affiniteettimutanttifuusioproteiini- ja 20K+CBD-linkkerideleetiofuusioproteiinivalmisteiden teho denimin viimeistelyssä/-kivipesussa
Esimerkissä 3 kuvatut Trichodermaa isäntänä käyttäen tuotetut 20K+CBD-affiniteettimutanttifuusioentsyymit ja esimerkissä 4 kuvatut Tricho-. 20 dermaa isäntänä käyttäen tuotetut 20K+CBD-linkkerideleetiofuusioproteiinit testattiin niiden kyvyn denimin biokivipesussa suhteen. Denimin viimeistelyssä tehokasta 20K-valmistetta käytettiin vertailuun.
• ·
Denim ja testisysteemit biokivipesua varten olivat samat kuin esi-: merkissä 8. Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioitiin myös kuten esimerkissä 8.
• ·*; 25 Biokivipesutestien tulokset esimerkillisille 20K+CBD-affiniteettimutanttifuusio- !"·! proteiini- ja 20K+CBD-linkkerideleetiofuusioproteiinivalmisteille osoitetaan tau lukossa 12.
.. Kanta RF6090 Y31W-aminohapposubstituution kanssa osoitti erin- • · • '* omaista pesutehoa (noin 6 kertaa parempi kuin 20K) ja hyvää kontrastia. Kan- • · · 30 nan RF6090 tehokkuus verrattuna 20K:hon voidaan selvästi nähdä myös ku-.·!·. vassa 16. Kanta RF6084 Y31A-aminohapposubstituution kanssa oli noin 1,5 kertaa parempi kuin 20K. 20K+CBDmut-fuusioproteiineilla Y32A- tai **:*’ Y31A_Y32A-aminohapposubstituutioiden kanssa oli matalampi biokivipesuvai- kutus kuin 20K:lla. 20K+CBD-linkkerideleetioproteiinien pesutehoa denimin *:··· 35 käsittelyssä parannettiin suuresti verrattuna 20K-kantaan ja aikaansaatiin hyvä kontrasti. Kannan RF6108 (AG-444) kanssa pesuteho oli vähintään 6 kertaa parempi kuin 20K:n kanssa ja kannan RF6110 (AG-460) kanssa noin 3 kertaa parempi.
50 118340 e -————————————I- I - -1........
S s, ·-> '{8 OIOlOMNNrDOlip O I» h» 0 s 1·_ n n n e n n n b ϋ) n ® o
g c T-' s (o ui (o1 e e oo' «f r-Γ <o h-T
1 ij C-------------—“ — — tt Ό c r- l^· 05
t C , n S (O T-_ Tf CM. CM f--. O t-. N; o> CO
— — U N M-" Tf ΜΓ Tf ^ Tf rj·' M-" CO Tf ®w T-T—T— T— T— T— T— T— T— T— T— T— T—
B I I t I I I I I I I III
** s "5 wc :ra 2 g ___________
» iS
B % :2.
jr 3 OOOOOLDOlOOOCDh- O CM I» Φ = «--ΟΛΟίΟ^Λτ-ΟΟΙ o. CD. t-_ · .E ,¾ J co ci n n o ti in t-" n mF co — w t-cmcmcmcmcmcmcmcmcm CM CM CM C/5
% I
a--------- 5 O c » £ ® <3 C— 3 2 lOoJScOCDCMCMCMOCD O 05 CM = jg 2 o> co r·- m- co cm oo co r--_ in r-.
O <2 ® OI OI 2 β" β 05 05 05" 05" 05" O)" O) O)" CL
·— 40 i I V ······ · I I « —.
Φ1 1 -J
© . en 0) 5 ^ ® s _________________
•e = B
Φ o e S _ I'-OCOCOOOCOOSh-OO'·- O W 2- 3 1 C « C- 00. Γ--. 00 CO 00. h~. N·. N·. N·. 00. CD. 00. 3 tC e —l co" co" co" co" co" co" cd" co" to" co" co" cd" cd ^
. . Q ω I
. . υ----------- ro .3. + _ "ö * -E? ^
· O g S C
: cm 3 2 οοοοο0οοο o o o *· m m !, 0oooooSooq o S o .
:.·. -s. > f ··· · ™j 5 JS + ·1 .1. ? < ω :.: ; ro________________e ·.. t; 3 • · 3 n
* « ϊ 7Z
•M E (0 :·. j i s s i • ·· — 3 CO CO ~
• C 3 >- >- CO
i Ί < < < 5 § <' <' — g *:1 t | § g s s s s κ s § 1 s ^ ^ b £ £ b b 'T ’T ?
*.·.· K® S .ro 33¾¾¾¾¾ O O
··. o« a i e ε ε ε ε ε ε 3, < m :: + -¾ e S I, QQQQQQQ QQti ··· Se 5 t -e £ oQcommoQcQcQ ω ω 3 o « e o 42 οουοουο oo® CMC.En ;·—οοοοοοοοο 0005 2 ... · Τ' LLI md LUcmcsicmcmcsicmcmcmcm cm cm cm 3 • : O f-----------------8 JS _ £ CD CD m- O O M- M- 000 -£2 •X C C op 00 OO 05 05 O 05 O^-ro 3 Φ im OOOOOOO r1 1“ e _ — jS » · 1 35 35 35 SS 25 $ ' cd o e 3 O C LL LL LL LL. LL LL LL LL LL ~ Q3M 0:0:0:0:0:0:0: 0:0:«
Ha1 _i 51 1 1 8340
Esimerkki 10.20K+CBD-fuusioproteiinien vaikutus denimin lujuuteen
Joitakin farkkuja, jotka saatiin pesutesteistä 20K+CBD-fuusiopro-teiinien kanssa (esimerkit 8 ja 9) ja joilla oii samanlainen kulutustaso (L1 2 3-arvo noin 23 tai 24 sellulaasikäsittelyn jälkeen), valittiin lujuusmittauksiin. Repäisylu-5 juus käsittelyn 20K+CBD-fuusioproteiineilla ja kontrollinäytteillä jälkeen mitattiin Elmendof-menetelmäliä standardin SFS-ΕΝ ISO 13937-1 mukaisesti. Näytekappaleet leikattiin sekä loimi- että kudesuunnassa. Tulokset osoitetaan taulukossa 13.
Sellulaasifuusioproteiinit aiheuttivat oleellisesti saman tai matalam-10 man lujuushäviön kuin 20K, ts. joillakin valmisteilla kankaan lujuus pysyi jopa korkeampana. Matalin lujuushäviö sekä loimi- että kudesuunnassa aikaansaatiin kannalla RF6108 linkkerideleetion äG-444 kanssa. Myös affiniteettimutantti RF6090 Y31W-aminohapposub$tituution kanssa aiheutti vähemmän lujuushä-viötä kuin 20K. Kannalla RF5977 oli melko samanlainen vaikutus kankaan lu-15 juuteen kuin 20K:lla.
Myös joitakin kuumakäsitellyillä fuusioproteiinivalmisteilla (esimerkki 8, taulukko 11) pestyistä farkuista valittiin repäisylujuusmittauksiin. Huomattiin, että kankaan lujuus parantui joillakin kuumakäsitellyistä valmisteista, mutta vä- a.a . lientyneen pesutehon vuoksi täytyi käyttää korkeampia annoksia saman kulu- 20 tustason aikaansaamiseksi.
• · • · ··· • ♦ • · ♦ • ·· • · • » • · · • 1 · ··# · • · • · · • · · ··· · ·1· • ♦ • · ·· ·· • 1 • ·· ·»· • 1 • 1 ··· • 1 • · · • · · • · »«· • 1 • · *·· • · · 2 • · » 3 ·
• S
52 118340 ω tn ύά 3
S
E ————————[—1———— 3 λ K o w a w «) w to csj in 3 «S S σί σ» m-' co Ό-' i-" cm' cd' m·'
.3, '-'c3cOCDCDCDh~^~ (O s (O
□ ^ £------------ .S2 z a ^ » Φ u 5
*· .i N O) i- _ <D O) 05 CM OO
c 2 co" t-‘ cm' S a o·’ ovi co' ui oi
φ >, Tf CO CO CO CO CO CM CO CM
3 ία X Q.
t * ^------------- E — °- M-. co, CD 05 T-_ CO. in CO. CO.
•n jS 2 S ^ ID 00 S CD S N
>> — “ i— r- i— !— i— c- co i"~- "35---------- j; '55 z :n c - ·* I w n ° 3 = J .2, CM CO. ·>-. CO CM. CD. mT CD. CO. M-_ ‘5 -2 cm' co' oo' co' h-' co" oo" h-" -O·" co S ^CDM'M'M'M'Tl'O· O' LO Tf .E tn I t
: SS
• ·♦ λ • · CL I_____________
*·· O
! ; ’JJ ^ σi σι <χ co, o» oo cd
··· 3 J —-esi esT co" co" co" cm" co" CO
/, I ± CM CM CM CM CM CM CM CM CM
• M «C
• · T------------ • *** S 2 ... · ΓΓ -5* tn o m o o /—i o o i_.o ·· Od«*0oSoo§® o S o ··· + o 5>°ld?3ooSo o K o xZc '-"cot-^co co "
.*·*. o JS
: : cm____________ — _ "in cm • · « (rt • · ffl s» ··. 3 < < 5 < —. —.
: · e - cmt-t-t- o· o ... CE co co co co M; <o • C 'S > > > > 7 t **'·’ cl f E E E E — — ω ·.. * g> e S ωωοοωω m ω ,ί»
JCt tn O O O O O OOC
:.·. £ "k £ £ £ ί: :£ 'k ί ί « ... e __ o o o o o o ooo> ·· ; 111 CM CM CM CM CM CM CM CM CM ^ ··**· ▼*---“--------φ
On .E
J* C f— Cp M· O o- 00 O = WC Γ*- 00 OO 05 05 O <- m = _ 050000 T- T- o.
3<3 1 1 LP CD CO CD CD CD CO O' 3 "E LL LL LL LL LL LL LL jr et cc o; cc a: te te Λ I- * - 53 118340
Esimerkki 11. Valittujen 20K+CBD-fuusioproteiinivalmisteiden vertailu tunnetun tekniikan mukaisiin entsyymivalmisteisiin
Parhaat 20K+CBD-fuusioproteiinit esimerkeistä 8 ja 9 testattiin toisen tyypin denimillä. Denimin viimeistelyssä tehokasta 20K-valmistetta (Ecos-5 tone® NP8500) ja kahta kaupallisesti saatavilla olevaa tunnetun tekniikan mukaista valmistetta, DeniMax® 399S Novozymesiltä ja Mex 500 Meijiltä, joka on väkevin kaupallisesti saatavilla oleva kiinteä entsyymivalmiste, käytettiin vertailuun.
Testisysteemi biokivipesuun oli sama kuin esimerkissä 8 paitsi, että 10 denim-kuorma oli 1 kg ja liuossuhde siksi hieman korkeampi. Down Under Denim twillistä (Bradmill Textiles Pty, Australia) tehtyä viittä denimin palaa (Tah-keet”) käytettiin kuhunkin testiin tärkin poiston jälkeen. Kankaan loimi- ja kude-lankoja rengaskehrättiin. Entsyymit annosteltiin NCU-aktiivisuusyksikköinä niin, että samanlaisia kulutustasoja (mitattu denimin oikean puolen vaaleutena sel-15 lulaasikäsittelyn jälkeen) aikaansaatiin. Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioitiin kuten esimerkissä 8 paitsi, että 20 värimittausta mitattiin lahjetta kohden.
Kaksi lahjetta, joilla oli samanlainen kulutustaso (L1-arvo noin 26 sellulaasikäsittelyn jälkeen), kustakin pesutestistä valittiin lujuusmittauksiin.
.a . Repäisylujuus käsittelyn 20K+CBD-fuusioproteiineilla ja kontrollinäytteillä jäi- :./ 20 keen mitattiin kuten esimerkissä 10. Tulokset osoitetaan taulukossa 14 ja ku- • · */·1 vissa 17A ja 17B.
:1’1i Kuteen, joka on tyypillisesti heikompi lanka kuin loimi, repäisylujuus • · : oli korkeampi kantojen RF5977, RF6090, RF6108 ja RF6110 fuusioproteiineilla kuin 20K:lla. Kaikilla fuusioproteiinikannoilla aikaan saatiin huomattavasti kor-25 keampi lujuus sekä loimi- että kudesuunnassa verrattuna DeniMAx 399S:ään ja Mex500:aan. Myös 20K-kanta oli vähemmän haitallinen kankaan lujuudelle kuin muut tunnetun tekniikan mukaiset valmisteet.
• »1 *
• M
• · • · »· • · * · · • 1 · • ·
• M
• · • 1 ·1· · • · • · · ·»· · * • · 54 1 1 8340
Taulukko 14. Keksinnön mukaisilla 20K+CBD-fuusioproteiineilla, 20K:lla ja tunnetun tekniikan mukaisilla valmisteilla käsitellyn denimin repäisylu-juusmittaukset
Entsyymi__Muoto L*__Loimi__Kude_
Repäisylujuus Repäisylujuus _____(N)__(N)
Ecostone NP8500__jauhe 25,9 58,0__40,3_ RF5977, 20K+CBD__rakeet 26,0__56J__44,4
Mex 500, Meiji__jauhe 26,1__48,4__31J_
DeniMAx 399S, Novozymes rakeet 25,5__5(^6__38J_ RF6090, 20K+CBDmtlt (Y31W) neste 26,0__57JJ__43,4 RF6108, 20K+CBD (AG-444) neste 25,9__55β__43,9 RF6110,20K+CBD (AG-460) neste 26,2 59,8 45,4 L* ilmaisee denimin oikean puolen vaaleutta sellulaasikäsittelyn jälkeen 5 • t * ·
• M
• · • ee • e • · • •e • · e e e • e· e e • e e # e • e e ··· e e e • · e • e e s·· e • ee • · e · • ee ee • e • ee e • ee e e e e eee • e e • · e • e e • e ··· e e • e eee • e eee • e e • e# e • • ' e 55 1 1 8340
Viitteet
Aho S, V Olkkonen, T Jalava, M Paloheimo, R Biihler, M-L Niku-Paavola, EH Bamford ja M Korhola. 1991. Monoclonal antibodies against core 5 and cellulose-binding domains of Trichoderma reesei cellobiohydrolases I and II and endoglucanase I. Eur. J. Biochem. 200:643-649.
Azevedo Mde O, Felipe MS, Astolfi-Filho S, Radford A. 1990. Cloning, sequencing and homologies of the cbh-1 (exoglucanase) gene of Humi-cola grisea var. thermoidea. J Gen Microbiol. 136:2569-2576.
10 Bailey MJ ja Nevalainen KMH. 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enz Microbiol Technol. 3:153-157.
Haakana H, Miettinen-Oinonen A, Joutsjoki V, Mäntylä A, Suominen P ja Vehmaanperä J. 2004. Cloning of cellulase genes from Meianocarpus al-15 bomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz Microbiol Technol. 34:159-167.
Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316.
. Henrissat B. ja Bairoch A. (1993) New families in the classification 20 of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J.
?—! 293:781-788.
t t
Hong J, Tamaki H, Yamamoto K ja Kumagai H. 2003. Cloning of a • · :.:: gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus ; and its expression in yeast. Appi Microbiol Biotechnol 63:42-50.
:’t": 25 Joutsjoki W, Torkkeli TK ja Nevalainen KMH. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) ·*.„ gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr.
.···. Genet. 24:223-228.
• ·
Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993.
*’·].** 30 High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglu- canase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515-522.
: Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the as- ··· · ....: sembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Linder M, Mattinen ML, Kontteli M, Lindeberg G, Stählberg J, Dra-35 kenberg T, Reinikainen T, Pettersson G, Annila A. 1995. Identification of func- 118340 56 tionally important amino acids in the cellulose-binding domain of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I. Protein Science 4:1056-1064.
Lowry OH, NJ Roseborough, AL Farr ja RJ Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol Chem 193: 265-275.
5 Malardier L, Daboussi MJ , Julien J, Roussel F, Scazzocchio C ja
Brygoo Y. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 15:147-156.
Miettinen-Oinonen A, Londesborough J, Joutsjoki V, Lantto R ja 10 Vehmaanperä, J. 2004. Three cellulases from Melanoarpus albomyces with applications in the textile industry. Enz Microbiol Technol. 34: 332-341.
Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155-164.
15 Saloheimo A, Henrissat B, Hoffren AM, Teleman O, Penttilä M.
1994. A novel, small endoglucanase gene, egl5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast. Mol Microbiol 13: 219-228.
Sambrook J, EF Fritsch ja T Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
,·. : 20 Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory • «· J./ manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
;*·] Srisodsuk M, Reinikainen T, Penttilä M, Teeri TT. 1993. Role of the • · · *· " interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its in- ! teraction with crystalline cellulose. J. Biol. Chem. 268: 20756-20761.
:.: : 25 Van Tilbeurgh H, Loonties F, de Bruyne C, Clayssens M 1988.
···
Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbo-hydrases. Meth. Enzymol. 160: 45-59.
Ward M, Shan W, Dauberman J, Weiss G, Larenas E, Bower B, Rey M, Clarkson K ja Bott R. (1993) Cloning, sequence and preliminary struc- ··· .·. 30 tural analysis of a small, high pi endoglucanase (EGIII) from Trichoderma reesei. Proceedings of the second TRICEL symposium on TRICHODERMA REESEI CELLULASES AND OTHER HYDROLASES, Espoo, Finland, 1993, : toim. P. Suominen ja T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial ·:«·· Fermentation Research 8 (1993): 153-158.
35 118340
SEKVENSSILISTAUS
<110> AB Enzymes GmbH <120> Parannetut sellulaasit <130> 2050016 <160> 50 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 936
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces <400> 1 tcgcccctaa ccgagaacca aagactccaa gaatgcgctc tactcccgtt ctccgcgccc 60 tcctggccgc agcattgccc ctcggggccc tcgccgccaa cggtcagtcc acgaggtaac 120 tgatcacccg cctcattacg cgtgccgacc ggaccgcgtt cagggctcac tgctcaccgc 180 atccagatac tgggactgct gcaagccgtc gtgcggctgg gccggaaagg gccccgtgaa 240 ccagcccgto tactcgtgcg acgccaactt ccagcgcatc cacgacttcg atgccgtctc 300 gggctgcgag ggcggccccg ccttctcgtg cgccgaccac agcccctggg ccattaatga 360 caacctctcg tacggcttcg cggcgactgc actcagcggc cagaccgagg agtcgtggtg 420 • · ctgtgcctgc tacgcgtgag tgtgcttggg cccaacgtcg gtgattccgg agttcagacc 480 • ·· • · .**·. aotgacccag cgacccgctc gccagtctga cctttacatc gggtcccgtg gccggcaaga 540
Ml* ccatggtcgt ccagtcgacc agcacgggcg gcgacctcgg cagcaaccac ttcgacctca 600 • · • · •tj · acatccccgg cggcggcgtc ggcctcttcg acggctgcac tccccagttc ggcggcctcc 660 • · • * · ; cgggcgcacg gtacggcggc atctcgtcgc gccaggagtg cgactcgttc cccgagccgc 720 ··· • * ··· tcaagcccgg ctgccagtgg cgcttcgact ggttccagaa cgccgacaac ccgtccttta 780 ,, ccttcgagcg ggtccagtgc cccgaggagc tggtcgctcg gaccggctgc aggcgccacg 840 • · • ·« ,···# acgacggcgg cttcgccgtc ttcaaggccc ccagcgcctg atccgttttt gggcagtgtc 900 • « • · * cgtgtgacgg cagctacgtg gaacgacctg gagctc 936 • * * • I · * • * · <210> 2 . *. <211> 214
ί · · <212> PRT
• · · · ,4i>· <213> Melanocarpus albomyces • · <400> 2
Ala Asn Gly Gin Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15 2 118340
Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gin Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30
Ala Asn Phe Gin Arg Ile His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45
Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala Ile Asn 50 55 60
Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gin Thr 65 70 75 80
Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95
Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110
Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Vai 115 120 125 m· t · Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140 »·· • · * I • · · ;*·.· Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gin Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu .* .* 145 150 155 160 • · * • * · · · · « · • · · : Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gin Asn Ala .***. 165 170 175 • · t · · .. Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Vai Gin Cys Pro Glu Glu Leu ; '·· 180 185 190 * · · • · • · • · ·
Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Vai :.V 195 200 205 • · · • · • I • · « , *. Phe Lys Ala Pro Ser Ala : : : 210 ··· · · <210> 3 <211> 1820 118340
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei <400> 3 ccgcggactg cgcatcatgt atcggaagtt ggccgtcatc tcggccttct tggccacagc 60 tcgtgctcag tcggcctgca ctctccaatc ggagactcac ccgcctctga catggcagaa 120 atgctcgtct ggtggcactt gcactcaaca gacaggctcc gtggtcatcg acgccaactg 180 gcgctggact cacgctacga acagcagcac gaactgctac gatggcaaca cttggagctc 240 gaccctatgt cctgacaacg agacctgcgc gaagaactgc tgtctggacg gtgccgccta 300 cgcgtccacg tacggagtta ccacgagcgg taacagcctc tccattggct ttgtcaccca 360 gtctgcgcag aagaacgttg gcgctcgcct ttaccttatg ggcagcgaca cgacctacca 420 ggaattcacc ctgcttggca acgagttctc tttcgatgtt gatgtttcgc agctgccgta 480 agtgacttac catgaacccc tgacgtatct tcttgtgggc tcccagctga ctggccaatt 540 taaggtgcgg cttgaacgga gctctctact tcgtgtccat ggacgcggat ggtggcgtga 600 gcaagtatcc caccaacacc gctggcgcca agtacggcac ggggtactgt gacagccagt 660 gtccccgcga tctgaagttc atcaatggcc aggccaacgt tgagggctgg gagccgtcat 720 ccaacaacgc aaacacgggc attggaggac acggaagctg ctgctctgag atggatatct 780 gggaggccaa ctccatctcc gaggctctta ccccccaccc ttgcacgact gtcggccagg 840 .·. ; agatctgcga gggtgatggg tgcggcggaa cttactccga taacagatat ggcggcactt 900 • ·· • Φ .***. gcgatcccga tggctgcgac tggaacccat accgcctggg caacaccagc ttctacggcc 960 • t* : ·.; ctggctcaag ctttaccctc gataccacca agaaattgac cgttgtcacc cagtccgaga 1020 • · • Φ ·.· · cgtcgggtgc catcaaccga tactatgtcc agaatggcgt cactttccag cagcccaacg 1080 • Φ • · · : ccgagcttgg tagttactct ggcaacgagc tcaacgatga ttactgcaca gctgaggagg 1140 *·· • Φ • Φ ··· cagaattcgg cggatcctct ttctcagaca agggcggcct gactcagttc aagaaggcta 1200 .. cctctggcgg catggttctg gtcatgagtc tgtgggatga tgtgagtttg atggacaaac 1260 • • *· ,·»·. atgcgcgttg acaaagagtc aagcagctga ctgagatgtt acagtactac gccaacatgc 1320 • Φ • Φ* .'. tgtggctgga ctccacctac ccgacaaacg agacctcctc cacacccggt gccgtgcgcg 1380 • · Φ Φ t « * · .···. gaagctgctc caccagctcc ggtgtccctg ctcaggtcga atctcagtct cccaacgcca 1440 • Φ ··· . *. aggtcacctt ctccaacatc aagttcggac ccattggcag caccggcaac cctagcggcg 1500 • Φ · Φ Φ φ ΦΦΦ Φ ....: gcaaccctcc cggcggaaac ccgcctggca ccaccaccac ccgccgccca gccactacca 1560 Φ Φ ctggaagctc tcccggacct acccagtctc actacggcca gtgcggcggt attggctaca 1620 4 118340 gcggccccac ggtctgcgcc agcggcacaa cttgccaggt cctgaaccct tactactctc 1680 agtgcctgta aagctccgtg cgaaagcctg acgcaccggt agattcttgg tgagcccgta 1740 tcatgacggc ggcgggagct acatggcccc gggtgattta ttttttttgt atctacttct 1800 gacccttttc aaatatacgg 1820 <210> 4 <211> 497
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei <400> 4
Gin Ser Ala Cys Thr Leu Gin Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gin Gin Thr Gly Ser Val 20 25 30
Val lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr 35 40 45
Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn 50 55 60 .·. · Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser V1; 65 70 75 80 ··· • · • · «· ·1·,; Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser lie Gly Phe Val .1 .1 85 90 95 • » · • · · *·· · * !.i : Thr Gin Ser Ala Gin Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Gly .**·. 100 105 110 • · • · · ,. Ser Asp Thr Thr Tyr Gin Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser ; ".· 115 120 125 • · # • · « · ···
Phe Asp Val Asp Val Ser Gin Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu ί 130 135 140 ··· • 1 • · *·· . 1. Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr :.: : 145 150 155 leo
Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin Cys 165 170 175 a 5 118340
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly Trp 180 185 190
Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly He Gly Gly His Gly Ser 195 200 205
Cys Cys Ser Glu Met Asp He Trp Glu Ala Asn Ser He Ser Glu Ala 210 215 220
Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gin Glu He Cys Glu Gly 225 230 235 240
Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys 245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser 260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu 275 280 285
Thr Val Val Thr Gin Ser Glu Thr Ser Gly Ala He Asn Arg Tyr Tyr 290 295 300 • · » · · * ·1 2 • · .3. Val Gin Asn Gly Val Thr Phe Gin Gin Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser *···' 305 310 315 320 • · • · » * · · • · • · ;.· · Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala : .·, 325 330 335 • t · • · · · · · • · ···1 Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gin Phe 340 345 350 2 * t 3 • ·· • ,···. Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp 355 360 365 • · • · · • 1 · • ♦ .···. Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn *...1 370 375 380 • · • 1 · • · · • · « ....: Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser * 1 385 390 395 400
Ser Gly Vai Pro Ala Gin Val Glu Ser Gin Ser Pro Asn Ala Lys Val 405 410 415 118340
Thr Phe Ser Asn lie Lys Phe Gly Pro lie Gly Ser Thr Gly Asn Pro 420 425 430
Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr 435 440 445
Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gin Ser 450 455 460
His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys 465 470 475 480
Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gin Cys 485 490 495
Leu <210> 5 <211> 1895
<212> DNA
<213> Melanocarpus albomyces • » ·.**: <400> 5 ,*··. gaattcgggg gttgccaggg agtcgtacag gggtgggtgg agggggatgg gggatggaag 60 • · ··· *"·.· ggggatggag aagaaagcat atatgggacg tttgtgctcg ccggctcccc tctgccacgt 120 • · • ft •4j « tcccttgcct ccttgcctgg gttgttgttg gtcttccctt caccatccga caaaccaacc 180 • · • ft ft ; tgctgcgggt gaactcgcag agcgccttcg gacgacgaca gacagacgca ccatgactcg 240 • ·· • · • · ··· caacatcgcc ctgctcggcg ccgcgtcggc gctcctgggc ctcgcccacg gccagaagcc 300 .* gggcgagacg cccgaggtgc acccgcagct gacgacgttc cggtgcacca aggcggacgg 360 • · • ·· .**·. gtgccagccg cggaccaact acattgtgct ggactcgctg tcgcacccgg tgcaccaggt 420 • ft ftftft ggacaacgac tacaactgcg gcgactgggg gcagaagccc aacgcgacgg cgtgcccgga 480 • ft ft ft ft ft • ft '···' cgtcgagtcg tgcgcgcgca actgcatcat ggagggcgtg cccgactaca gccagcacgg 540 ft ft ··· . *. cgtcacgacg agcgacacgt cgctgcgcct gcagcagctc gtcgacggcc gcctcgtcac 600 ft ft ft • ft ft *·· · ....: gccgcgcgtc tacctgctcg acgagaccga gcaccgctac gagatgatgc acctgaccgg 660 • ft ccaggagttc acctttgagg tcgacgccac caagctgccc tgcggcatga acagcgccct 720 7 118340 ctacctgtcc gagatggacc cgaccggcgc ccggagcgag ctcaaccccg gcggtgccta 780 ctacggcacc ggctactgcg acgcccagtg cttcgtgacg ccattcatca acggcattgt 840 gagtgttccc ctttggcccc ccccctgaaa atagatgtac ctgggtgcta accccggggt 900 gtcgcaccaa aacagggcaa catcgagggc aagggctcgt gctgcaacga gatggacatc 960 tgggaggcca actcgcgggc gacgcacgtg gcgccgcaca cgtgcaacca gacgggtctg 1020 tacatgtgcg agggcgccga gtgcgagtac gacggcgtgt gcgacaagga cgggtgcggg 1080 tggaacccgt accgggtcaa catcaccgac tactacggca actcggacgc gttccgcgtc 1140 gacacgcggc ggcccttcac cgtggtgacg cagttcccgg ccgacgccga gggccggctc 1200 gagagcatcc accggctgta cgtgcaggac ggcaaggtga tcgagtcgta cgtcgtcgac 1260 gcgccgggcc tgccccggac cgactcgctc aacgacgagt tctgcgccgc cacgggcgcc 1320 gcgcgctacc tcgacctcgg cggcaccgcg ggcatgggcg acgccatgac gcgcggcatg 1380 gtgctggcca tgagcatctg gtgggacgag tccggcttca tgaactggct cgacagcggc 1440 gaggccggcc cctgcctgcc cgacgagggc gaccccaaga acattgtcaa ggtcgagccc 1500 agccccgagg tcacctacag caacctgcgc tggggcgaga tcgggtcgac ctttgaggcc 1560 gagtccgacg acgacggcga cggcgacgac tgctagataa ctaactagtg ggcggaaagg 1620 gcgggggatg cgtaacttac atacagcccg gagttgtttt gagtgtagag tattgagctt 1680 j tcgatgtgtt agttgagtgg aatggaaaat tcgcgtcttt gccccggtgg ttgcgataaa 1740 • ·« • · .***, caatagtcgg ctggtgcatt tgtgacactt caattgcgct gttggcttgg tgacagacac 1800 ··· ·**·! ggcagcgtcg atgacccgac acccagaata attcgcatgg ttgattattg ttattgtgct 1860 • · • · ttaaatcgga ggctgatgct catctcttcg aattc 1895 • ft • t · • · · ··· · .***. <210> 6 *·*·* <211> 408
<212> PRT
.. <213> Melanocarpus albomyces • · • ** <400> 6 * · ··« **, Gin Lys Pro Gly Glu Thr Pro Glu Val His Pro Gin Leu Thr Thr Phe V,: 15 10 15 ··* • · * · *·· . *. Arg Cys Thr Lys Ala Asp Gly Cys Gin Pro Arg Thr Asn Tyr lie Val :.: : 20 25 30 * • ·
Leu Asp Ser Leu Ser His Pro Val His Gin Val Asp Asn Asp Tyr Asn 35 40 . 45 8 118340
Cys Gly Asp Trp Gly Gin Lys Pro Asn Ala Thr Ala Cys Pro Asp Val 50 55 60
Glu Ser Cys Ala Arg Asn Cys lie Met Glu Gly Val Pro Asp Tyr Ser 65 70 75 80
Gin His Gly Val Thr Thr Ser Asp Thr Ser Leu Arg Leu Gin Gin Leu 85 90 95
Val Asp Gly Arg Leu Val Thr Pro Arg Val Tyr Leu Leu Asp Glu Thr 100 105 110
Glu His Arg Tyr Glu Met Met His Leu Thr Gly Gin Glu Phe Thr Phe 115 120 125
Glu Val Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ser Ala Leu Tyr 130 135 140
Leu Ser Glu Met Asp Pro Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro Gly 145 150 155 160
Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys Phe Val Thr 165 170 175 • · • · • ·· • t ,··1 2 3. Pro Phe lie Asn Gly lie Gly Asn lie Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys *·1·' 180 185 190 • · « · 1 • · t · ϊ ϊ ϊ Asn Glu Met Asp lie Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Thr His Val Ala "V 195 200 205 * » · • · · • · · · ··· • · *...1 pro His Thr Cys Asn Gin Thr Gly Leu Tyr Met Cys Glu Gly Ala Glu 210 215 220 ·· • · • ·1 • ,··1, Cys Glu Tyr Asp Gly Val Cys Asp Lys Asp Gly Cys Gly Trp Asn Pro 225 230 235 240 · · 2 • 1 1 • 1 .···, Tyr Arg Val Asn lie Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Asp Ala Phe Arg *...! 245 250 255 • · • 1 ·
* 1 I
3 · >t#tj Val Asp Thr Arg Arg Pro Phe Thr Val Val Thr Gin Phe Pro Ala Asp * 1 260 265 270 9 118340
Ala Glu Gly Arg Leu Glu Ser Ile His Arg Leu Tyr Vai Gin Asp Gly 275 280 285
Lys Vai Ile Glu Ser Tyr Vai Vai Asp Ala Pro Gly Leu Pro Arg Thr 290 295 300
Asp Ser Leu Asn Asp Glu Phe Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Arg Tyr 305 310 315 320
Leu Asp Leu Gly Gly Thr Ala Gly Met Gly Asp Ala Met Thr Arg Gly 325 330 335
Met Vai Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe Met Asn 340 345 350
Trp Leu Asp Ser Gly Glu Ala Gly Pro Cys Leu Pro Asp Glu Gly Asp 355 360 365
Pro Lys Asn Ile Vai Lys Vai Glu Pro Ser Pro Glu Vai Thr Tyr Ser 370 375 380
Asn Leu Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp 385 390 395 400 ,·. · Asp Asp Gly Asp Gly Asp Asp Cys 405 *·· * · • » M· :*·,· <2io> 7
.* <211> 2100 },· : <212> DNA
• <213> Melanocarpus albomyces • ♦ ♦ M| · .*··. <400> 7 **· cccggtctgg agacggggag cgcgccagcg acgcaggata agaaggcgac gaccgcgcct 60 ccgagccagg cccaggacag caggagaact cgccacgcgc aagcagcacg cccgatcgac 120 9 ' 9 • ·· ,*··. agtgtcccgc tctgcccaca gcactctgca accatgatga tgaagcagta cctccagtac 180 • ♦ ··· ctcgcggccg cgctgccgct cgtcggcctc gccgccggcc agcgcgctgg taacgagacg 240 1« * • * * .*#·. cccgagaacc accccccgct cacctggcag aggtgcacgg ccccgggcaa ctgccagacc 300 • * ··· ' . *. gtgaacgccg aggtcgtcat tgacgccaac tggcgctggc tgcacgacga caacatgcag 360 • · · • · · ·*· « aactgctacg acggcaacca gtggaccaac gcctgcagca ccgccaccga ctgcgctgag 420 • · aagtgcatga tcgagggtgc cggcgactac ctgggcacct acggcgcctc gaccagcggc 480 10 118340 gacgccctga cgctcaagtt cgtcaccaag cacgagtacg gcaccaacgt cggctcgcgc 540 ttctacctca tgaacggccc ggacaagtac cagatgttca acctcatggg caacgagctt 600 gcctttgacg tcgacctctc gaccgtcgag tgcggcatca acagcgccct gtacttcgtc 660 gccatggagg aggacggcgg catggccagc tacccgagca accaggccgg cgcccggtac 720 ggcactgggg tgagttgagc tccgctttgt ttcgagtcgc aacgaggcac tttctgggcg 780 ccggctaact ctctcgattc ctccgacagt actgcgatgc ccaatgcgct cgtgatctca 840 agttcgttgg cggcaaggcc aacattgagg gctggaagtc gtccaccagc gaccccaacg 900 ctggcgtcgg cccgtacggc agctgctgcg ctgagatcga cgtctggtga gtgcgagacc 960 gtccacccag gttcggatgc ggggtggaaa tttcgcggct aacggagcac cccccaggga 1020 gtcgaatgcc tatgccttcg ctttcacgcc gcacgcgtgc acgaccaacg agtaccacgt 1080 ctgcgagacc accaactgcg gtggcaccta ctcggaggac cgcttcgccg gcaagtgcga 1140 cgccaacggc tgcgactaca acccctaccg catgggcaac cccgacttct acggcaaggg 1200 caagacgctc gacaccagcc gcaagttcac gtgcgtgacc ccttgtggcg caacctttct 1260 ctgcctgcct ggacacactg aaactgacac gtcgttttcg gctgcagcgt cgtctcccgc 1320 ttcgaggaga acaagctctc ccagtacttc atccaggacg gccgcaagat cgagatcccg 1380 ccgccgacgt gggagggcat gcccaacagc agcgagatca cccccgagct ctgctccacc 1440 • · atgttcgatg tgttcaacga ccgcaaccgc ttcgaggagg tcggcggctt cgagcagctg 1500 • ·· • » ,**·, aacaacgccc tccgggttcc catggtcctc gtcatgtcca tctgggacga cgtaagtacc 1560 M·* j**,j cgccgacctc cctagccaca caagccgcat ccggcgaggc acgccatcgc tgctgctaac 1620 ' · * 9 · ϊ.ί j acgagaccgt tcgtagcact acgccaacat gctctggctc gactccatct acccgcccga 1680 • ·
• » I
... ; gaaggagggc cagcccggcg ccgcccgtgg cgactgcccc acggactcgg gtgtccccgc 1740 ··· • ♦ *·· cgaggtcgag gctcagttcc ccgacgcgta agacttgccc ccgaccccaa gcttccactt 1800 .. ctggatgccg aatgctaaca cgcgaaacag ccaggtcgtc tggtccaaca tccgcttcgg 1860 * ' · • ·· ccccatcggc tcgacctacg acttctaagc cggtccatgc actcgcagcc ctgggcccgt 1920 * * ·· ,s. cacgcccgcc acctcccctc gcggaaactc tccgtgcgtc gcgggctcca aagcattttg 1980 • · · • · · ·'· »·· gcctcaagtt tttttcgttc atgtttcagt tctttccgca tgtatcctaa gctccgatag 2040 • · ··· . *. caagagaaat tgccagtctg agttttggga acctgtgatc cacatcatgg acgcataatg 2100 t I « • · ♦ »*· · • <210> 8 <211> 430
<212> PRT
118340 π <213> Melanocarpus albomyces <400> 8
Gin Arg Ala Gly Asn Glu Thr Pro Glu Asn His Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Arg Cys Thr Ala Pro Gly Asn Cys Gin Thr Vai Asn Ala Glu Vai 20 25 30
Vai Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asp Asp Asn Met Gin Asn 35 40 45
Cys Tyr Asp Gly Asn Gin Trp Thr Asn Ala Cys Ser Thr Ala Thr Asp 50 55 60
Cys Ala Glu Lys Cys Met Ile Glu Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Gly Thr 65 70 75 80
Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Vai Thr 85 90 95
Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Vai Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Asn 100 105 110 · Gly Pro Asp Lys Tyr Gin Met Phe Asn Leu Met Gly Asn Glu Leu Ala \**j 115 120 125 ··· • t • « ···
Phe Asp Vai Asp Leu Ser Thr Vai Glu Cys Gly Ile Asn Ser Ala Leu 130 135 140 t · · « · « ··· · • · Ϊ.Ι J Tyr Phe Vai Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser .·**. 145 150 155 160 • · ··1
Asn Gin Ala Gly Ala Arg Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys ! 1.. 165 170 175 • · · • 1 • · ···
Ala Arg Asp Leu Lys Phe Vai Gly Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp iso iss 190 ··» % t • I • · · , \ Lys Ser Ser Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Pro Tyr Gly Ser · 195 200 205
Cys Cys Ala Glu Ile Asp Vai Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Phe Ala 210 215 220 · 118340
Phe Thr Pro His Ala Cys Thr Thr Asn Glu Tyr His Val Cys Glu Thr 225 230 235 240
Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala Gly Lys Cys 245 250 255
Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Pro Asp 260 265 270
Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Leu Asp Thr Ser Arg Lys Phe Thr Val 275 280 285
Val Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys Leu Ser Gin Tyr Phe lie Gin Asp 290 295 300
Gly Arg Lys Ile Glu He Pro Pro Pro Thr Trp Glu Gly Met Pro Asn 305 310 315 320
Ser Ser Glu He Thr Pro Glu Leu Cys Ser Thr Met Phe Asp Val Phe 325 330 335
Asn Asp Arg Asn Arg Phe Glu Glu Val Gly Gly Phe Glu Gin Leu Asn 340 345 350 • · • I * • M • · «1, Asn Ala Leu Arg Val Pro Met Val Leu Val Met Ser He Trp Asp Asp *···* 355 360 365 * · • · ♦ * ·· • · • · j4· · His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser He Tyr Pro Pro Glu Lys • V 370 375 380 • t t • I Φ ··· · • · *···" Glu Gly Gin Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp Cys Pro Thr Asp Ser Gly 385 390 395 400 ·· • * ♦ ··
Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gin Phe Pro Asp Ala Gin Val Val Trp ·...* 405 410 415 • · * « · • · · • · ,···, Ser Asn He Arg Phe Gly Pro He Gly Ser Thr Tyr Asp Phe 420 425 430 * * • · · • · · <2io> 9 * * <211> 3459
<212> DNA
<213> Thermoascus aurantiacus 13 118340 <400> 9 gaattctaga cctttatcct ttcatccgac cagacttccc tttttgacct tggcgccctg 60 ttgactacct acctacctag gtagtaacgt cgtcgaccct cttgaatgat ccttgtcaca 120 ctgcaaacat ccgaaaacat acggcaaaag atgattgggc atggatgcag gagacatcga 180 atgagggctt agaaggaaat gaaaacctgg gaccaggacg ctaggtacga tgaaatccgc 240 caatggtgaa actttaagtc gtgcctacag cacaggctct gtgaagattg cgctgttcag 300 acttaatctt ctcatcacag tccaagtctt tatgaaaagg aaaaagagag ggaagagcgc 360 tatttcgagc tgttggcctc atagggagac agtcgagcat accagcggta tcgacgttag 420 actcaaccaa gaataatgac gagaataaac acagaagtca accttgaact ggatagcagg 480 gttccagcag cagatagtta cttgcataaa gacaactccc cgagggctct ctgcatacac 540 caggatgttc cggaattatt cactgctcgt ttccgacgtg gcgtcagtga tccgtctcca 600 cagaactcta cctgggaata acccagggga ggaatctgca agtaagaact taataccaat 660 ccccggggct gccgaggtga atcgaatctc ccgcgggaaa ttaaacccat acgatgtttt 720 tgcaccacat gcatgcttag cacgatttct ccgcaaggga gtcacagaga aagacatatt 780 tcgcatacta ctgtgactct gcagagttac atatcactca ggatacattg cagatcattg 840 tccgggcatc aaaaatggac ctgcaggatc aacggcccga caaaacacaa gtggctaaag 900 . . ctgggggatg cccgaaaccc tctggtgcaa tatcatttga tggatgttcc ccccgcattt 960 · · • « ,**·. ctaagacatc gacggatcgg cccgcatact aatcctttta tcaaccaaaa gttccactcg 1020 t · ·«· ;*·,· actagagaaa aaaaaggcca aggccactag ttgcagtcgg atactggtct tttcgccgtc 1080 • · • · • βΪ · caacaccttc atccatgatc cccttagcca ccaatgcccc acataataca tgttgacata 1140 » · • Φ · ; ggtacgtagc tctgttatcc aatcggatcc gaacctcttt aacggacccc tcctacacac 1200 • ·· • · ···* cttatcctaa cttcagaaga ctgttgccca ttggggattg aggaggtccg ggtcgcagga 1260 ,. tgcgttctag gctaaattct cggccggtag ccatctcgaa tctctcgtga agccttcatc 1320 • · • · · #··· tgaacggttg gcggcccgtc aagccgatga ccatgggttc ctgatagagc ttgtgcctga 1380 • · · * .*, ccggccttgg cggcatagac gagctgaaca catcaggtat gaacagatca gatataaagt 1440 • · · • · · • · t···' cggattgagt cctagtacga agcaatccgc caccaccaaa tcaagcaacg agcgacacga 1500 • · • · · . *. ataacaatat caatcgaatc gcaatgtatc agcgcgctct tctcttctct ttcttcctcg 1560 Φ · · • * · ··· · ccgccgcccg cgcgcacgag gccggtaccg taaccgcaga gaatcaccct tccctgacct 1620 • · ggcagcaatg ctccagcggc ggtagttgta ccacgcagaa tggaaaagtc gttatcgatg 1680 14 1 1 8340 cgaactggcg ttgggtccat accacctctg gatacaccaa ctgctacacg ggcaatacgt 1740 gggacaccag tatctgtccc gacgacgtga cctgcgctca gaattgtgcc ttggatggag 1800 cggattacag tggcacctat ggtgttacga ccagtggcaa cgccctgaga ctgaactttg 1860 tcacccaaag ctcagggaag aacattggct cgcgcctgta cctgctgcag gacgacacca 1920 cttatcagat cttcaagctg ctgggtcagg agtttacctt cgatgtcgac gtctccaatc 1980 tcccttgcgg gctgaacggc gccctctact ttgtggccat ggacgccgac ggcaatttgt 2040 ccaaataccc tggcaacaag gcaggcgcta agtatggcac tggttactgc gactctcagt 2100 gccctcggga tctcaagttc atcaacggtc aggtacgtca gaagtgataa ctagccagca 2160 gagcccatga atcattaact aacgctgtca aatacaggcc aacgttgaag gctggcagcc 2220 gtctgccaac gacccaaatg ccggcgttgg taaccacggt tcctcgtgcg ctgagatgga 2280 tgtctgggaa gccaacagca tctctactgc ggtgacgcct cacccatgcg acacccccgg 2340 ccagaccatg tgccagggag acgactgtgg tggaacctac tcctccactc gatatgctgg 2400 tacctgcgac cctgatggct gcgacttcaa tccttaccag ccaggcaacc actcgttcta 2460 cggccccggg aagatcgtcg acactagctc caaattcacc gtcgtcaccc agttcatcac 2520 cgacgacggg acaccctccg gcaccctgac ggagatcaaa cgcttctacg tccagaacgg 2580 caaggtgatc ccccagtcgg agtcgacgat cagcggcgtc accggcaact caatcaccac 2640 . . cgagtattgc acggcccaga aggcagcctt cggcgacaac accggcttct tcacgcacgg 2700 • · · • · ,···. cgggcttcag aagatcagtc aggctctggc tcagggcatg gtcctcgtca tgagcctgtg 2760 • · • · ggacgatcac gccgccaaca tgctctggct ggacagcacc tacccgactg atgcggaccc 2820 • · ♦ · jtj I ggacacccct ggcgtcgcgc gcggtacctg ccccacgacc tccggcgtcc cggccgacgt 2880 • · * * · ; tgagtcgcag aaccccaatt catatgttat ctactccaac atcaaggtcg gacccatcaa 2940 • · · • · "···* ctcgaccttc accgccaact aagtaagtaa cgggcactct accaccgaga gcttcgtgaa 3000 ., gatacagggg tagttgggag attgtcgtgt acaggggaca tgcgatgctc aaaaatctac 3060 • · • ·· atcagtttgc caattgaacc atgaagaaaa gggggagatc aaagaagtct gtcagaagag 3120 »·· aggggctgtg gcagcttaag ccttgttgta gatcgttcag agaaaaaaaa agtttgcgta 3180 • · · • · · • · .··· cttattatat taggtcgatc attatccgat tgactccgtg acaagaatta aaaagagtac 3240 • · • · · , *. tgcttgcttg cctatttaaa ttgttatata cgccgtagcg cttgcggacc acccctcaca 3300 • · · • · » • · · · ...,· gtatatcggt tcgcctcttc ttgtctcttc atctcacatc acaggtccag gtccagcccg 3360 • · gcccggtccg ggtgccatgc atgcacaggg ggactaatat attaatcgtg accctgtvcc 3420 118340 taagctaggg tccctgcatt ttgaacctgt ggacgtctg 3459 <210> 10 <211> 440 <212> PRT ' <213> Thermoascus aurantiacus <400> 10
Gin Gin Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Gin Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gin Asn Gly Lys Val 20 25 30
Val lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr 35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser lie Cys Pro Asp Asp 50 55 60
Val Thr Cys Ala Gin Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly 65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe Val 85 90 95 · • · · • · · • t .1·1, Thr Gin Ser Ser Gly Lys Asn lie Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gin *···1 100 105 110 • « • · · * 1 · • · * · * Asp Asp Thr Thr Tyr Gin lie Phe Lys Leu Leu Gly Gin Glu Phe Thr ΓΥ 115 120 125 • · · • · · ··· · · • · *···1 phe Asp yai Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu 130 135 140 • · • · » 2 3 ,1·1. Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro Gly 145 150 155 160 « 2 • · • 1 1 • · · t···' Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin Cys 165 170 175 • « • « · • 1 · 3 «
Pro Arg Asp Leu Lys Phe lie Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly Trp *·"1 180 185 190
Gin Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Asn His Gly Ser 195 200 205 16 1 1 8340
Cys Cys Ala Glu Met Asp Vai Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala 210 215 220
Vai Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gin Thr Met Cys Gin Gly 225 230 235 240
Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys 245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gin Gly Asn His Ser 260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Gly Gin Ile Vai Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Vai 275 280 285
Vai Thr Gin Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu Thr 290 295 300
Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Vai Gin Asn Gly Lys Vai Ile Pro Gin Ser 305 310 315 320 . Glu Ser Thr Ile Ser Gly Vai Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr :.**· 325 330 335 • · · • m • *
• M
·*·,· Cys Thr Ala Gin Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe Thr .* 340 345 350 • · · * · ·*· · • · ! His Gly Gly Leu Gin Lys Ile Ser Gin Ala Leu Ala Gin Gly Met Vai .*·*. 355 360 365 • ·
• •I
,, Leu Vai Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu ; *.. 370 375 380 • · · • · • · • * · ,*. Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Vai Ala : : : 385 390 395 400 • · »·* • · * · * · * . *, Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Vai Pro Ala Asp Vai Glu Ser i :: 405 410 415 ··· · # ·
Gin Tyr Pro Asn Ser Tyr Vai Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Vai Gly Pro 420 425 430 17 118340
Ile Asn Ser Thr Phe Thr Ala Asn 435 440 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Primer <400> 11 tacgccatgg tcgtccagtc gaccagc 27 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Primer <400> 12 tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacg ggcgg 35 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> Primer <4 00> 13 tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacg ggcggcgacc tcggca 46 • · :.*·· <210> 14 .···, <211> 40
*···* <212> DNA
;*·,· <213> Primer « · : <4oo> 14 • · · · • . cgtactcgag tcatcgcgag ggggccttga agacggcgaa 40 • Φ · ··· · ·* • Φ ···* <210> 15 <211> 30
.. <212> DNA
! *.. <213> Primer ΦΦ· \„· <4 00> 15 tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc 30 Φ · · Φ Φ Φ m φ Φ · » <210> 16 . *. <211> 34
; <212> DNA
<213> Primer Φ Φ <400> 16 taggatccga gtcccattgg cagcaccggc aacc 34 18 118340 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Primer <400> 17 taggatccga gtcctagcgg cggcaaccct cccggc 36 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Primer <400> 18 taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcg 34 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Primer <400> 19 cgtactcgag tcatcgcgag ccgatggggc cgaaggcgaa gccgccgtcg tcgtg 55 <210> 20 <211> 52
<212> DNA
. . <213> Primer • · · • ·· • * .···. <400> 20 *«..* cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccagaagcc gccgtcgtcg tg 52 • · • · · • ·· • · : <2io> 21 • ·« · . <211> 58 * <2i2> dna .···, <213> Primer • ·
• M
<400> 21 ,. cgtactcgag tcatcgcgac gaggggatct ggacggcggg gaagccgccg tcgtcgtg 58 » · • ·· <210> 22 .*. <211> 52 <2i2> dna ··· <213> Primer Φ · • · • · , *. <400> 22 * cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccaggcgaa gccgccgtcg tc 52 • · <210> 23 <211> 37 19 118340 <212> DNA <213> Primer <400> 23 tcgtctcgag tcgcgatggg gccgaagcgg atgttgg 37 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Primer <400> 24 ggagggcatg cccaacagca gcgagatcac c 31 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Primer <400> 25 cggcactagt tcgcgacccg atctcgcccc agcgcagg 38 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Primer <400> 26 cgccgagggc cggctcgaga gcatcc 26 • · · · • * * * · .**·. <210> 27 *···* <211> 69
;*·.· <212> DNA
.* .* <213> Primer • · · • · * »·· · • · <400> 27 • · * I.! ; tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agagtaggca 60 ·»» * · ·** gggttcagg 69 j*·.· <210> 28 <211> 69 <212> DNA <213> Primer * * · • t · ··· <400> 28 • · *...* tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agaggcgtaa 60 • t :.: : gggttcagg 69 • * <210> 29 <211> 69 20 118340 <212> DNA <213> Primer <400> 29 tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agagtaccaa 60 gggttcagg 69 <210> 30 <211> 69 <212> DNA <213> Primer <400> 30 tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agaggcggca 60 gggttcagg 69 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Primer <400> 31 taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcaccacca ccacccgccg cccagcc 57 <210> 32
<211> 60 <212> DNA
• · <213> Primer * * · • ·* • * .*··, <400> 32 ···* taggatccga gtcccattac cggcaaccct agccctaccc agtctcacta cggccagtgc 60 • · » • * · <210> 33 . ... <211> 45 :.:: <2i2> dna .***, <213> Primer • » • 9· <4 00> 33 .. tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acagg 45 • ' · • ·*
Ml :...J <210> 34 <211> 67
♦ <212> DNA
··· <213> Primer • · • · ··« . \ <400> 34 ί ttaaacatat gttatctact ccaacatcaa ggtcggaccc attggcagca ccggcaaccc 60
Ml·· * ’ tagcggc 67 21 118340 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Primer <400> 35 tatatgcggc cgcaccggtg cgtcaggctt tcgcacggag ctttacaggc 50 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Primer <400> 36 ttggatccga gtcgcagcac cggcaaccct agcg 34 <210> 37
<211> 208 <212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <400> 37
Ala Asn Gly Gin Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15
Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gin Pro Val Tyr Ser Cys Asp 20 25 30 • #* * *. *ϊ Ala Asn Phe Gin Arg lie His Asp Phe Asp Ala Val Ser Gly Cys Glu 35 40 45 • · *·· • · • * · • ·· .* ,* Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn ·.; : 50 55 60 • · • « · • · * ··· « .1. Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gin Thr *···* 65 70 75 80 ·· • *·· Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly ,···, 85 90 95 • * • 1« 9 • ?,·,· Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly ,···. 100 105 110 # ·
• M
• · ; Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Val 115 120 125 • ·
Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 22 118340 130 135 140
Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gin Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160
Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gin Asn Ala 165 170 175
Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gin Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Phe 195 200 205 <210> 38 <211> 207
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <400> 38
Ala Asn Gly Gin Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15
Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gin Pro Val Tyr Ser Cys Asp 20 25 30 • · • · · • ·« • * ,*·*. Ala Asn Phe Gin Arg lie His Asp Phe Asp Ala Val Ser Gly Cys Glu **··* 35 40 45 • · • · · * ·· * · • · ;.ϊ I Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn • *V 50 55 60 • · » ··· · 1 2
Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Val * * 115 120 125 • ' · 2
Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gin Thr 65 70 75 80 ·· • * · • ·· 4 .·*·, Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly *...* 85 90 95 # • · • · · 4 4 4 .···. Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly *...* 100 105 110 • · • « · t · ·
··· I
Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140 118340 23
Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gin Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160
Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gin Asn Ala 165 170 175
Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gin Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Trp 195 200 205 <210> 39
<211> 208 <212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <4 00> 39
Ala Asn Gly Gin Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15
Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gin Pro Val Tyr Ser Cys Asp . 20 25 30 • ·· • t ···
• I
**··* Ala Asn Phe Gin Arg lie His Asp Phe Asp Ala Val Ser Gly Cys Glu :*·.· 35 40 45 • · • * • · * • · · ·*· · » ,«, Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn :.:: 50 55 eo * »· · • · *·«
Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gin Thr .. 65 70 75 80 • · ♦ ·· ··· • *·.·* Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95 • · · • * · • · ··· • · »··* Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly . *. 100 105 110 • « · • · * ft·# · * * Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Val 115 120 125 24
Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140 118340
Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gin Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160
Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gin Asn Ala 165 170 175
Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gin Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Pro Ala 195 200 205 <210> 40
<211> 208 <212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <400> 40
Ala Asn Gly Gin Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 1 5 10 15 t· . Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Val Asn Gin Pro Val Tyr Ser Cys Asp V·: 20 25 30
Ml • ft • ft ft··
Ala Asn Phe Gin Arg lie His Asp Phe Asp Ala Val Ser Gly Cys Glu .· / 35 40 45 ft ft ft ft ft ft • •ft · • * ; Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn ,···. 50 55 60 • ft • ft· ,. Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gin Thr Ϊ 65 70 75 80 ··· • * • · ··· /, Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly ::: 85 90 95 ft ft 1
Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Val 115 120 125 • ft ft ft ··· , *, Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly ::: 100 105 110 • ft· ft ft ft ft
Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140 118340 25
Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gin Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160
Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gin Asn Ala 165 170 175
Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Val Gin Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Trp 195 200 205 <210> 41 <211> 388
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <400> 41
Gin Lys Pro Gly Glu Thr Pro Glu Val His Pro Gin Leu Thr Thr Phe 15 10 15 • · *.**; Arg Cys Thr Lys Ala Asp Gly Cys Gin Pro Arg Thr Asn Tyr lie Val . —, 20 25 30 • · • · · • · • · · ,* m‘ Leu Asp Ser Leu Ser His Pro Val His Gin Val Asp Asn Asp Tyr Asn :35 40 45 ··« · • · • · · • · 9 «9Φ # .1. Cys Gly Asp Trp Gly Gin Lys Pro Asn Ala Thr Ala Cys Pro Asp Val *...* 50 55 60 I Glu Ser Cys Ala Arg Asn Cys lie Met Glu Gly Val Pro Asp Tyr Ser *... 65 70 75 80 • · • · ··· « : : : Gin His Gly Val Thr Thr Ser Asp Thr Ser Leu Arg Leu Gin Gin Leu 85 90 95 • · • ♦ • ·· • · : J : val Asp Gly Arg Leu Val Thr Pro Arg Val Tyr Leu Leu Asp Glu Thr | 100 105 110 • t
Glu His Arg Tyr Glu Met Met His Leu Thr Gly Gin Glu Phe Thr Phe 26 118340 115 120 125
Glu Vai Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ser Ala Leu Tyr 130 135 140
Leu Ser Glu Met Asp Pro Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro Gly 145 150 155 160
Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys Phe Vai Thr 165 170 175
Pro Phe Ile Asn Gly Ile Gly Asn Ile Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys 180 185 190
Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Thr His Vai Ala 195 200 205
Pro His Thr Cys Asn Gin Thr Gly Leu Tyr Met Cys Glu Gly Ala Glu 210 215 220
Cys Glu Tyr Asp Gly Vai Cys Asp Lys Asp Gly Cys Gly Trp Asn Pro 225 230 235 240
Tyr Arg Vai Asn Ile Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Asp Ala Phe Arg , . 245 250 255 • · · • · Φ • · ΦΦΦ • Φ *···' Vai Asp Thr Arg Arg Pro Phe Thr Vai Vai Thr Gin Phe Pro Ala Asp .1. : 260 265 270 • ΦΦ • · · Φ · · • · Φ I1'.1 Ala Glu Gly Arg Leu Glu Ser Ile His Arg Leu Tyr Vai Gin Asp Gly ·.: · 275 280 285 • · • · • Φ Φ
Lys Vai Ile Glu Ser Tyr Vai Vai Asp Ala Pro Gly Leu Pro Arg Thr 290 295 300 Φ · Φ · Φ φ t Φ ·...1 Asp Ser Leu Asn Asp Glu Phe Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Arg Tyr 305 310 315 320 Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ • Φ Φ *...1 Leu Asp Leu Gly Gly Thr Ala Gly Met Gly Asp Ala Met Thr Arg Gly . 1. 325 330 335 Φ Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ · Met Vai Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe Met Asn 340 345 350 27 118340
Trp Leu Asp Ser Gly Glu Ala Gly Pro Cys Leu Pro Asp Glu Gly Asp 355 360 365
Pro Lys Asn Ile Vai Lys Val Glu Pro Ser Pro Glu Val Thr Tyr Ser 370 375 380
Asn Leu Arg Trp 385 <210> 42 <211> 421
<212> PRT
<213> Melanocarpus albomyces <4 00> 42
Gin Arg Ala Gly Asn Glu Thr Pro Glu Asn His Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Arg Cys Thr Ala Pro Gly Asn Cys Gin Thr Val Asn Ala Glu Val 20 25 30
Val lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asp Asp Asn Met Gin Asn 35 40 45 >*t · Cys Tyr Asp Gly Asn Gin Trp Thr Asn Ala Cys Ser Thr Ala Thr Asp :.*·· 50 55 60 • ·· • · • · ·· ;*·.· Cys Ala Glu Lys Cys Met lie Glu Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Gly Thr .* 65 70 75 80 • · · • · · ··· · • · :.: : Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val Thr .·*·. 85 90 95 • · ·· .. Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Val Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Asn j 100 105 110 ··· • ·
Gly Pro Asp Lys Tyr Gin Met Phe Asn Leu Met Gly Asn Glu Leu Ala I I Ϊ 115 120 125 • · Φ · · • · • · • ·
Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Vai Glu Cys Gly He Asn Ser Ala Leu : : : 130 135 140 ··· · • ·
Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser 145 150 155 160
7Q
118340 Äsn Gin Ala Gly Ala Arg Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys 165 170 175
Ala Arg Asp Leu Lys Phe Vai Gly Gly Lys Ala Asn Ile Glu Gly Trp 180 185 190
Lys Ser Ser Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Pro Tyr Gly Ser 195 200 205
Cys Cys Ala Glu Ile Asp Vai Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Phe Ala 210 215 220
Phe Thr Pro His Ala Cys Thr Thr Asn Glu Tyr His Vai Cys Glu Thr 225 230 235 240
Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala Gly Lys Cys 245 250 255
Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Pro Asp 260 265 270
Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Leu Asp Thr Ser Arg Lys Phe Thr Vai 275 280 285 • · ♦ « • ·♦ • · .·**. Vai Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys Leu Ser Gin Tyr Phe Ile Gin Asp *—* 290 295 300 • · • · · t ·· • Φ f · j^· ! Gly Arg Lys Ile Glu Ile Pro Pro Pro Thr Trp Glu Gly Met Pro Asn ΓΥ 305 310 315 320 III III Ml · Φ·* • Φ *···* Ser Ser Glu Ile Thr Pro Glu Leu Cys Ser Thr Met Phe Asp Val Phe 325 330 335 «· Φ · • ΦΦ Φ ··· Asn Asp Arg Asn Arg Phe Glu Glu Val Gly Gly Phe Glu Gin Leu Asn 340 345 350 Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ · Φ • Φ φ··· Asn Ala Leu Arg Val Pro Met Val Leu Val Met Ser lie Trp Asp Asp 355 360 365 • • Φ • · Φ Φ Φ · ·♦· Φ
His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser lie Tyr Pro Pro Glu Lys * : 370 375 380 29 118340
Glu Gly Gin Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp Cys Pro Thr Asp Ser Gly 385 390 395 400
Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Gin Phe Pro Asp Ala Gin Vai Val Trp 405 410 415
Ser Asn lie Arg Phe 420 <210> 43 <211> 430
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus <400> 43
Gin Gin Ala Gly Thr Val Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Gin Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gin Asn Gly Lys Val 20 25 30
Val lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr 35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser lie Cys Pro Asp Asp . . 50 55 60 • 1 I «· · ·1· * « *···1 Val Thr Cys Ala Gin Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly I1·.· 65 70 75 80 • · • · • 1 • I · • Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe Val :.: : 85 90 95 • · · • · • · ···
Thr Gin Ser Ser Gly Lys Asn lie Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gin .. 100 105 110 * t • ·· • « · *...1 Asp Asp Thr Thr Tyr Gin lie Phe Lys Leu Leu Gly Gin Glu Phe Thr .1. 115 120 125 • · « * · I • · ·1· • 1 *...1 Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu . 1. 130 135 140 • · · • · · ·1· · 1 Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro Gly 145 150 155 160 30 118340
Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin Cys 165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly Trp 180 185 190
Gin Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Val Gly Asn His Gly Ser 195 200 205
Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser lie Ser Thr Ala 210 215 220
Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gin Thr Met Cys Gin Gly 225 230 235 240
Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys 245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gin Gly Asn His Ser 260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Gly Gin He Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Val 275 280 285 • * ·,*·· Vai Thr Gin Phe He Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu Thr .···. 290 295 300 ·*· • · • · · • ·· .* Glu He Lys Arg Phe Tyr Val Gin Asn Gly Lys Val He Pro Gin Ser : 305 310 315 320 ·*· · * « • ψ · • · · ♦ ·♦ · .··*. Glu Ser Thr He Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser He Thr Thr Glu Tyr *···’ 325 330 335 ·· ! Cys Thr Ala Gin Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe Thr 340 345 350 • · • · ··· ϊ^* His Gly Gly Leu Gin Lys He Ser Gin Ala Leu Ala Gin Gly Met Val M 355 360 365 • · • · »*· • · ί#; · Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu 370 375 380 • ' ·
Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Val Ala 31 118340 385 390 395 400
Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ser 405 410 415
Gin Tyr Pro Asn Ser Tyr Val lie Tyr Ser Asn lie Lys Val 420 425 430 <210> 44 <211> 69
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei <400> 44
Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly 15 10 15
Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly 20 25 30
Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly 35 40 45
Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Tyr 50 55 60 • · • · · • * · • · .*·*, Tyr Ser Gin Cys Leu ··· 65 • · • · f • ·· ' · · : :*: <2io> 45 ··· 1 . <211> 69 :.: ; <2i2> prt .·*·, <213> Trichoderma reesei • ♦ ··· <400> 45 ·· • *.· Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly .···. 15 10 15 • · ··· • · ».»,· Thr T^r Thr Thr Ar9 Ar9 Pro Ala Thr Thr Thr G1Y Ser Ser Pro Gly ..... 20 25 30 • · ··· • · :.: : Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly ..... 35 40 45 • ·
Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Ala 50 55 60 32 118340
Tyr Ser Gin Cys Leu 65 <210> 46 <211> 69
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei <400> 46
Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly 15 10 15
Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly 20 25 30
Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly 35 40 45
Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Tyr 50 55 60
Ala Ser Gin Cys Leu 65 • · • · · • # · • * ,···. <210> 47 <211> 69
.*· : <212> PRT
9 · · #* <213> Trichoderma reesei • * · • · · <4 00> 47 • * · • · · «·· · .*··, Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly **··* 15 10 15 · • #·* Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly ··· 20 25 30 t * • · I·· f • · i Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly *·· 35 40 45 • · • « ·«· * • · ί^ϊ * Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Trp so 55 eo • ·
Tyr Ser Gin Cys Leu 65 33 118340 <210> 48 <211> 69
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei <4 00> 48
Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly 15 10 15
Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly 20 25 30
Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly He Gly Tyr Ser Gly 35 40 45
Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Ala 50 55 60
Ala Ser Gin Cys Leu 65 <210> 49 <211> 58
. . <212> PRT
·, ·; <213> Trichoderma reesei ·*** <4 00> 49 • ·
• » I
* ·· ,* / Thr Gly Asn Pro Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr ::: 1 5 10 15 ··· · • » • · · • * · ··« · .*·*, Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly *···* 20 25 30 : He Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin *... 35 40 45 • · « »·* Ψ « · ί^ϊ S Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu • · · 50 55 # · • · ··· : :*: <2io> 50 ··· · <211 > 42
***** <212> PRT
<213> Trichoderma reesei <4 00> 50 118340 34
Thr Gly Asn Pro Ser Pro Thr Gin Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly 15 10 15 lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin 20 25 30
Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu 35 40 24 34 34 • * • · · • ·· • · *·· • ft • * • It • ft • ft ft • ·· • ft • · • t I ft ft ft • ftft · • · • · * ft ft ft ··« * *·« • ft • · ΜΦ • ft • · • »· ·* · • · ft·· • • ft • · ft • · ft ft ft ft ft ft ft ft • ft • «ft • ft ft ft · ft ft ft · ft·· ft ft • •••ft ft ·

Claims (54)

118340 57
1. Sellulaasifuusioproteiini, joka käsittää A. valinnaisesti modifioidun yhdestä lajista peräisin olevan sellu-5 laasin ytimen ensimmäisen aminohapposekvenssin, ja B. valinnaisesti modifioidun toisesta lajista peräisin olevan linkkeri-alueen ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) toisen aminohapposekvenssin, tunnettu siitä, että liitosalue on tuotu ensimmäisen aminohap-10 posekvenssin ja toisen aminohapposekvenssin väliin stabiilin fuusioproteiinin aikaansaamiseksi, jolloin liitosalueella on seuraava yleinen kaava: 1A - 2B - 3C - 4D - 5E - 6F, jossa 15 1A on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 1A on Gly tai Vai, edullisimmin Gly; 2B on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile, Phe, Vai, Glu, Asp, Gin ja Asn; edullisesti 2B on Pro, Gin tai Glu; . . 3C on valittu ryhmästä Gly, Ala, Lys, Leu, Pro, Ile, Vai, Ser ja Thr; • · · 20 edullisesti 3C on Ile; *«·’ 4D on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 4D on %'·? Gly tai Pro • * . i.: · E on valittu ryhmästä Ser, Pro ja Thr; edullisesti E on Ser; ja 6F on valittu ryhmästä Ser, Thr tai poissa oleva; edullisesti 6F on Ser 25 tai poissa oleva; ··· jolloin 1A on liitetty sellulaasin ytimen C-terminaaliseen aminohappo- :% sekvenssiin ja 6F on liitetty linkkerin ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) .···. N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin.
• · *·' 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sellulaasifuusioproteiini, t u n - • · \v 30 n e 11 u siitä, että liitosalueella on seuraava yleinen kaava: ··» ? : ··· : !·. 1Gly - 2B - 3lle - 4D - 5Ser - 6F, • * » Ml · • · jossa 35 2B on Pro, Gin tai Glu; 4D on Gly tai Pro 118340 58 5E on Ser; ja 6F on Ser tai poissa oleva.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen selluiaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että liitosalueeila on seuraava kaava: 5 1Val - 2Gln - 3lle - 4Pro - 5Ser - 6Ser
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen selluiaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että liitosalueeila on seuraava yleinen kaava: 10 1Gly - 2GIu - 3lle - 4Gly - 5Ser tai 1Gly - 2Pro - 3lle - 4Gly - 5Ser.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen selluiaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi on peräisin 15 neutraalista selluiaasista ja toinen aminohapposekvenssi on peräisin happamasta sellulaasista.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen selluiaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi on peräisin perheen 45 sellulaasista ja toinen aminohapposekvenssi on peräisin perheen 7 sellulaasis- .·. : 20 ta.
• ·« '·*·/ 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen selluiaasifuusioproteiini, t u n - .*"! nettu siitä, että neutraali sellulaasi on peräisin sienestä.
• · · [ / 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen selluiaasifuusioproteiini, t u n - • · * ··· * nettu siitä, että neutraali sellulaasi on peräisin suvusta Melanocarpus, • · : 25 Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium, Chrysosporium, ··· Thermoascus, Scopulariopsis, Myriococcum, Talaromycas tai Chaetomium, edullisesti Melanocarpus sp., edullisimmin Melanocarpus albomyces.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen selluiaasifuusioproteiini, t u n - ·***. nettu siitä, että sellulaasi on Melanocarpus albomyces 20K -sellulaasi, 50K ··· Λ 30 -sellulaasi, 50KB -sellulaasi tai niiden johdannainen. • · ·
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen selluiaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että sellulaasi on Thermoascus aurantiacus CBHI tai sen • johdannainen. ··· ·
11. Patenttivaatimuksen 5 mukainen selluiaasifuusioproteiini, t u n -35 nettu siitä, että sellulaasi on peräisin Trichoderma sp.:stä tai Hypocreasta, edullisesti Trichoderma reeseistä. 118340 59
12. Patenttivaatimuksen 5 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että neutraali sellulaasi on sekvenssin nro 2 mukainen 20K -sel-lulasi Melanocarpus albomycestä tai sen johdannainen ja toinen aminohapposekvenssi on sekvenssin nro 4 mukainen Trichoderma reesei sellobiohydro- 5 laasi I linkkeri ja/tai CBD tai sen johdannainen.
13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi ja/tai toinen aminohapposekvenssi on modifioitu.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, 10 tunnettu siitä, että toisen aminohapposekvenssin tyrosiiniaminohappo kypsän Trichoderma reesein CBHI:n asemassa 492 (CBD:n asemassa 31) ja/tai 493 (CBD:n asemassa 32) on substituoitu alifaattisella aminohapolla, edullisesti alaniinilla, ja/tai aromaattisella aminohapolla, edullisesti tryptofaanilla.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen sellulaasifuusioproteiini, 15 tunnettu siitä, että toinen aminohapposekvenssi on valittu ryhmästä sekvenssit nro: 45, 46, 47 ja 48.
16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että toisen aminohapposekvenssin aminohapot 434 444 tai 434-460 kypsän Trichoderma reesein CBHI:n sekvenssin mukaisessa ase- : 20 massa on deletoitu. • Il
'·./ 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen sellulaasifuusioproteiini, * * Γ*. tunnettu siitä, että toinen aminohappo on valittu ryhmästä sekvenssit nro: / / 49 ja 50. • 9 · j·*
' 18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, : 25 tunnettu siitä, että ensimmäisen aminohapposekvenssin valiiniaminohap- ·· po sekvenssin nro 2 mukaisen Melanocarpus albomycesin 20K -sellulaasin asemassa 208 on deletoitu.
19. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäisen aminohapposekvenssin alaniiniamino- ··· 30 happo sekvenssin nro 2 mukaisen Melanocarpus albomycesin 20K -sellulaasin • · # • * · * asemassa 207 on deletoitu. M
20. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, ; tunnettu siitä, että ensimmäisen aminohapposekvenssin fenyylialaniiniami- ··· · nohappo sekvenssin nro 2 mukaisen Melanocarpus albomycesin 20K -sellu-35 laasin asemassa 209 on substituoitu Trp:llä. 118340 60
21. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi sisältää insertoi-dun proliinin sekvenssin nro 2 mukaisen Melanocarpus albomycesin 20K -sel-lulaasin aseman 206 jälkeen.
22. Patenttivaatimuksen 13 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi on valittu ryhmästä sekvenssit nro: 37, 38, 39 ja 40.
23. Jonkin patenttivaatimuksista 1-22 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että fuusioproteiini on stabiili.
24. Jonkin patenttivaatimuksista 1-22 mukainen sellulaasifuusiopro teiini, tunnettu siitä, että fuusioproteiinin sisältävä valmiste on edelleen stabiloitu kuumakäsittelyllä.
25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että ensimmäisestä sellulaaista luonnostaan puuttuu CBD.
26. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sellulaasifuusioproteiini, tun nettu siitä, että ensimmäisestä sellulaasista CBD on deletoitu.
27. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa valinnaisesti modifioidun yhdestä lajista peräisin olevan sellulaasin ytimen ensimmäisen aminohapposek- ,·, . 20 venssin, ja toisen polynukleotidisekvenssin, joka koodittaa valinnaisesti modifi- • ·· oidun toisesta lajista peräisin olevan linkkerialueen ja/tai selluloosaa sitovan '"*! domeenin (CBD) toisen aminohapposekvenssin, ja mainittuja ensimmäistä ja • · * / " toista polynukleotidisekvenssiä yhdistävää liitosaluetta koodittavan polynukle- : otidisekvenssin, jolloin mainittu ekspressiovektori pystyy ilmentämään sellu- φ · : 25 laasifuusioproteiinia, joka sisältää mainitun ensimmäisen ja toisen aminohap- ♦...·* posekvenssin, joita yhdistää liitosalue, jolla on yleinen kaava: 1a-2B-3C-4D-5E-6F, jossa »·· • · • · /* 30 1A on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 1A on Gly tai Vai, edullisimmin Gly; 2B on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile, Phe, Vai, Glu, Asp, • ;*; Gin ja Asn; edullisesti 2B on Pro, Gin tai Glu; *·« i * 3C on valittu ryhmästä Gly, Ala, Lys, Leu, Pro, Ile, Vai, Ser ja Thr; 35 edullisesti 3C on Ile; 118340 61 4D on valittu ryhmästä Gly, Ala, Leu, Pro, Ile ja Vai; edullisesti 4D on Gly tai Pro 5E on valittu ryhmästä Ser, Pro ja Thr; edullisesti 5E on Ser; ja 6F on valittu ryhmästä Ser, Thr tai poissa oleva; edullisesti 6F on Ser 5 tai poissa oleva; jolloin 1A on liitetty sellulaasin ytimen C-terminaaliseen aminohappo-sekvenssiin ja 6F on liitetty linkkerin ja/tai selluloosaa sitovan domeenin (CBD) N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin.
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen ekspressiovektori, tun-10 nettu siitä, että ensimmäinen polynukleotidisekvenssi koodittaa neutraalin sellulaasin ydintä ja toinen polynukleotidisekvenssi koodittaa happaman sellulaasin linkkeriä ja/tai selluloosaa sitovaa domeenia (CBD).
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että neutraali sellulaasi on peräisin suvusta Melanocarpus, 15 Humicola, Thielavia, Mycaliophthora, Fusarium, Acremonium, Chrysosporium; Thermoascus, Scopulariopsis, Myriococcum, Talaromyces tai Chaetomium, edullisesti Melanocarpus sp., edullisimmin Melanocarpus albomyces.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että sellulaasi on Melanocarpus albomyces 20K -sellulaasi, ,·, · 20 50K -sellulaasi, 50KB -sellulaasi tai niiden johdannainen. * ·· a*./
31. Patenttivaatimuksen 29 mukainen ekspressiovektori, tun- nettu siitä, että sellulaasi on Thermoascus aurantiacus CBHI.
♦ · · / / 32. Patenttivaatimuksen 27 mukainen ekspressiovektori, t u n - ί·ϊ ϊ nettu siitä, että hapan sellulaasi on peräisin Trichoderma sp.istä tai Hypoc- • · : 25 reasta, edullisesti Trichoderma reeseistä.
·,„! 33. Patenttivaatimuksen 27 mukainen ekspressiovektori, tun nettu siitä, että neutraali sellulaasi on sekvenssin nro 1 tai sen johdannaisen i\. koodittama Melanocarpus albomyces 20K -selluaasi ja toinen aminohappo- .*··. sekvenssi on sekvenssin nro 3 tai sen johdannaisen koodittama Trichoderma .·. 30 reesei sellobiohydrolaasi I linkkeri ja/tai CBD. • f ·
34. Jonkin patenttivaatimuksista 27-33 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi ja/tai toinen ami- • ·*· nohapposekvenssi on modifioitu. ··· ·
35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen ekspressiovektori, t u n -35 nettu siitä, että toinen polynukleotidisekvenssi koodittaa aminohapposekvenssiä, joka on valittu ryhmästä sekvenssit nro: 45,46, 47 ja 48. 1 1 8340 62
36. Patenttivaatimuksen 34 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että toinen polynukleotidisekvenssi koodittaa aminohapposekvenssiä, joka on valittu ryhmästä sekvenssit nro: 49 ja 50.
37. Patenttivaatimuksen 34 mukainen ekspressiovektori, tun-5 n e 11 u siitä, että ensimmäinen polynukleotidisekvenssi koodittaa aminohapposekvenssiä, joka on valittu ryhmästä sekvenssit nro: 37, 38, 39 ja 40.
38. Patenttivaatimuksen 27 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että ensimmäinen polynukleotidisekvenssi koodittaa aminohapposekvenssiä, josta luonnostaan puuttuu CBD.
39. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää jossakin patentti vaatimuksessa 27-38 määritellyn ekspresslovektorin.
40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on peräisin sienestä.
41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen isäntäsolu, tunnettu επί 5 tä, että se on peräisin filamenttihomeesta.
42. Patenttivaatimuksen 40 tai 41 mukainen isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että se kuuluu sukuun Trichoderma tai Aspergillus.
43. Patenttivaatimuksen 39 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Trichoderma reesei. : 20
44. Menetelmä jossakin patenttivaatimuksessa 1-26 määritellyn sel- ,’··] lulaasifuusioproteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsit- • · .I". tää vaiheet, joissa viljellään jonkin patenttivaatimuksen 40-43 mukaista isän- .1 / täsolua ja otetaan proteiini talteen viljelyväliaineesta. • · ·
45. Entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se käsittää jossakin ·1·: : 25 patenttivaatimuksessa 1-26 määritellyn sellulaasifuusioproteiinin. • · 1
46. Menetelmä biokivipesuun, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa lisätään jossakin patenttivaatimuksessa 1-26 määritel-tyä sellulaasifuusioproteiinia taikka patenttivaatimuksen 45 mukaista valmistet-ta puuvillaa sisältävälle kankaalle tai vaatteelle. • · · .·. 30
47. Patenttivaatimuksen 46 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · « **[;1 tä, että kangas tai vaate on denimiä. • · *”·1
48. Menetelmä bioviimeistelyyn, tunnettu siitä, että menetelmä : käsittää vaiheet, joissa lisätään jossakin patenttivaatimuksessa 1-26 määritel- ··· ♦ •:-j tyä sellulaasifuusioproteiinia tai patenttivaatimuksen 45 mukaista valmistetta 35 tekstiilimateriaaleille kuten vaatteelle tai langalle. 118340 63
49. Patenttivaatimuksen 48 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekstiilimateriaalit on valmistettu selluloosaa sisältävistä luonnonkuiduista tai selluloosaa sisältävistä keinotekoisista kuiduista tai niiden seoksista.
50. Patenttivaatimuksen 48 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että tekstiilimateriaalit ovat synteettisten kuitujen ja selluloosaa sisältävien kuitujen seoksia.
51. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää jossakin patenttivaatimuksessa 1-26 määriteltyä sellulaasifuusioproteiinia tai patenttivaatimuksen 45 mukaista entsyymivalmistetta ja apuaineita, kuten pinta- 10 aktiivisia aineita, surfaktantteja, valkaisuaineita tai täyteaineita.
52. Menetelmä selluloosakuitua sisältävän tekstiilimateriaalin käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä saatetaan mainittu tekstiili-materiaali kosketukseen patenttivaatimuksen 51 mukaisen pesuainekoostu-muksen kanssa.
53. Menetelmä puusta peräisin olevan kuitumassan tai kuidun käsit telemiseksi, tunnettu siitä, että lisätään jossakin patenttivaatimuksessa 1 -26 määriteltyä sellulaasifuusioproteiinia tai patenttivaatimuksen 45 mukaista valmistetta puusta peräisin olevaan mekaaniseen tai kemialliseen massaan tai kierrätyskuituun. : 20
54. Menetelmä eläinten rehun laadun parantamiseksi, tunnettu • · · #λ." siitä, että käsitellään kasvimateriaalia jossakin patenttivaatimuksessa 1-26 määritellyllä sellulaasifuusioproteiinilla tai patenttivaatimuksen 45 mukaisella / / valmisteella. · · • i · »·· · • · * · ♦ • · · ··· ♦ ··· • » • · ♦ «· · • · • ·· ·»· • · * · ··· • · • · · * · » • · ··« • ♦ • « *·· • · • · · • · · ·· ♦ 1 · 64 1 1 8340
FI20055202A 2005-04-29 2005-04-29 Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö FI118340B (fi)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055202A FI118340B (fi) 2005-04-29 2005-04-29 Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö
EP06725936.6A EP1874927B1 (en) 2005-04-29 2006-04-25 Improved cellulases
BRPI0609906A BRPI0609906A8 (pt) 2005-04-29 2006-04-25 proteína de fusão de celulase, seu processo de produção e composição detergente contendo a mesma, vetor de expressão, célula hospedeira, preparação de enzima, processos para desbotamento e para bioacabamento e métodos de tratamento de fibra celulósica contendo material têxtil, para tratar fibra ou polpa derivada de madeira e para melhorar a qualidade de ração animal
CN200680014750.8A CN101171333B (zh) 2005-04-29 2006-04-25 改善的纤维素酶
ES06725936.6T ES2458301T3 (es) 2005-04-29 2006-04-25 Celulasas mejoradas
DK06725936.6T DK1874927T3 (da) 2005-04-29 2006-04-25 Forbedrede cellulaser
MX2007013474A MX2007013474A (es) 2005-04-29 2006-04-25 Celulasas mejoradas.
PT67259366T PT1874927E (pt) 2005-04-29 2006-04-25 Celulases melhoradas
PCT/FI2006/050161 WO2006117432A1 (en) 2005-04-29 2006-04-25 Improved cellulases
HN2006016339A HN2006016339A (es) 2005-04-29 2006-04-28 Celulasas mejoradas
DO2006000101A DOP2006000101A (es) 2005-04-29 2006-05-02 Proteinas de fusion de celulasa con una region de empalme estable
NI200700261A NI200700261A (es) 2005-04-29 2007-10-12 Celulasas mejoradas
MA30319A MA29405B1 (fr) 2005-04-29 2007-10-25 Cellulases ameliorees

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20055202A FI118340B (fi) 2005-04-29 2005-04-29 Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö
FI20055202 2005-04-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20055202A0 FI20055202A0 (fi) 2005-04-29
FI20055202A FI20055202A (fi) 2006-10-30
FI118340B true FI118340B (fi) 2007-10-15

Family

ID=34508201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20055202A FI118340B (fi) 2005-04-29 2005-04-29 Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101171333B (fi)
FI (1) FI118340B (fi)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI122028B (fi) * 2008-12-30 2011-07-29 Ab Enzymes Oy Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
CN101915709B (zh) * 2010-06-11 2012-11-21 天津工业大学 一种金属镀膜织物耐磨性的检测方法及装置
CN103045565B (zh) * 2012-12-14 2014-06-18 南京林业大学 一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用
CN111670250B (zh) * 2017-12-21 2024-02-13 生化酶股份有限公司 真菌纤维素酶的变体
CN109234174B (zh) * 2018-11-12 2021-04-27 陕西科技大学 一种产纤维素酶的嗜热真菌及其应用
EP3653705A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-20 AB Enzymes Oy Fungal cellulase variants with improved stability
CN110981965B (zh) * 2019-11-06 2022-11-15 天津科技大学 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
CN101085985B (zh) * 1996-09-17 2012-05-16 诺沃奇梅兹有限公司 纤维素酶变体

Also Published As

Publication number Publication date
CN101171333A (zh) 2008-04-30
CN101171333B (zh) 2014-04-02
FI20055202A (fi) 2006-10-30
FI20055202A0 (fi) 2005-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1874927B1 (en) Improved cellulases
US7981654B2 (en) Cellulases and their uses
DK1969123T3 (en) Hitherto UNKNOWN ENZYMS
EP2007884B1 (en) Cellulase fusion proteins and their use
US7256032B2 (en) Enzymes
DK2370573T3 (en) Svampeendoglucanaser, their production and use
FI122028B (fi) Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
EP1994148B1 (en) Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
JP5193997B2 (ja) エンドグルカナーゼｐｐｃｅおよびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
FI118340B (fi) Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö
US7361487B2 (en) Enzyme fusion proteins and their use
FI119325B (fi) Uusia endoglukanaasi polypeptidejä ja niiden tuotto ja käyttö
JP3532577B2 (ja) 熱安定性エンド−β−１，４−グルカナーゼ
DK1344820T3 (en) Endoglucanase OF Zygomycetes-ORIGIN WITHOUT CELLULOSE BINDING DOMAIN
US10927358B2 (en) Endoglucanase compositions and methods

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: AB ENZYMES OY

Free format text: AB ENZYMES OY

FG Patent granted

Ref document number: 118340

Country of ref document: FI