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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
hohen Spiegeln an neuen verkürzten
bzw. trunkierten Cellulaseproteinen im filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum;
pilzliche Transformanten, die mittels gentechnologischer Techniken
aus Trichoderma longibrachiatum hergestellt werden; und neue Cellulaseproteine,
welche durch solche Transformanten produziert werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Cellulasen
sind Enzyme, welche Cellulose (β-1,4-D-Glucan-Verknüpfungen)
hydrolysieren und als primäre
Produkte Glucose, Cellobiose, Cellooligosaccharide und dergleichen
produzieren. Cellulasen werden von einer Anzahl von Mikroorganismen
hergestellt und umfassen mehrere unterschiedliche Enzymklassifikationen,
einschließlich
jene, die als Exo-Cellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG)
und β-Glucosidasen (BG)
identifiziert werden (Schulein, M., 1988 Methods in Enzymology 160:
235–242).
Außerdem
können
die Enzyme innerhalb dieser Klassifikationen in einzelne Komponenten
aufgetrennt werden. Zum Beispiel besteht die Cellulase, welche durch
den filamentösen
Pilz Trichoderma longibrachiatum, nachfolgend T.longibrachiatum,
hergestellt werden, aus mindestens zwei CBH-Komponenten, d. h. CBHI
und CBHII, und mindestens vier EG-Komponenten, d. h. Komponenten
EGI, EGII, EGIII und EGV (Saloheimo, A. et al. 1993, in "Proceedings of the
second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other
Hydrolases", Espoo,
Finnland, hrsg. von P. Suominen & T.
Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation
Research 8: 139–146)
und mindestens einer β-Glucosidase.
Die Gene, welche diese Komponenten codieren, sind nämlich cbh1,
cbh2, egl1, egl2, egl3 bzw. egl5.
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Das
komplette Cellulasesystem, welches CBH-, EG- und BG-Komponenten
umfasst, wirkt synergistisch, um kristalline Cellulose zu Glucose
umzuwandeln. Die zwei Exo-Cellobiohydrolasen und die vier derzeit bekannten
Endoglucanasen wirken zusammen, um Cellulose zu kleinen Cello-Oligosacchariden
zu hydrolysieren. Die Oligosaccharide (hauptsächlich Cellobiosen) werden
anschließend
zu Glucose durch eine Haupt-β-Glucosidase
(unter möglicher
zusätzlicher
Hydrolyse durch Neben-β-Glucosidase-Komponenten)
hydrolysiert.
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Die
Proteinanalyse der Cellobiohydrolasen (CBHI und CBHII) und hauptsächlichen
Endoglucanasen (EGI und EGII) von T. longibrachiatum haben gezeigt,
dass eine bifunktionelle Organisa tion in Form einer katalytischen
Kerndomäne
und einer kleineren Cellulosebindungsdomäne vorliegt, welche durch einen
Linker oder einen flexiblen Gelenk-Abschnitt von Aminosäuren, die
reich an Prolin- und Hydroxyaminosäuren sind, getrennt sind. Gene
für die
zwei Cellobiohydrolasen, CBHI und CBHII (Shoemaker, S., et al.,
1983, Bio/Technology 1, 691–696,
Teeri, T., et al. 1983, Bio/Technology 1, 696–699, und Teeri, T., et al.,
1987, Gene 51, 43–52),
und zwei Hauptendoglucanasen, EGI und EGII (Penttila, M., et al.,
1986, Gene 45, 253–263,
Van Arsdell, J. N., et al., 1987, Bio/Technology 5, 60–64, und
Saloheimo, M., et al., 1988, Gene 63, 11–21) wurden aus T. longibrachiatum
isoliert, und die Proteindomänenstruktur
ist bestätigt
worden.
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Eine ähnliche
bifunktionelle Organisation von Cellulaseenzymen wird in bakteriellen
Cellulasen gefunden. Die Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) und der katalytische
Kern von Cellulomonas fimi-Endoglucanase A (C. fimi Cen A) wurde
ausführlich
untersucht (Ong, E., et al., 1989, Trends Biotechnol. 7: 239–243, Pilz
et al. 1990, Biochem J. 271: 277–280, und Warren et al. 1987,
Proteins 1: 335–341).
Genfragmente, welche die CBD und die CBD mit dem Linker codieren,
wurden kloniert, in E. coli exprimiert, und von ihnen wurde gezeigt,
dass sie neue Aktivitäten
bezüglich
Cellulosefasern besitzen (Gilkes, N. R., et al. 1991, Microbiol
Rev. 55: 305–315, und
Din, N. et al. 1991, Bio/Technology 9: 1096–1099). Zum Beispiel zerstört isolierte
CBD von C. fimi Cen A, welche genetisch in E. coli exprimiert wird,
die Struktur von Cellulosefasern und setzt kleine Teilchen frei,
besitzt jedoch keine nachweisbare hydrolytische Aktivität. CBD besitzt
ferner eine breite Anwendung bei der Proteinreinigung und Enzymimmobilisierung.
Andererseits zerstört
die katalytische Domäne
von C. fimi Cen A, welche aus Protease-gespalteter Cellulase isoliert
ist, nicht die Fibrillenstruktur von Cellulose und glättet stattdessen
die Oberfläche
der Faser.
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Diese
neuen Aktivitäten
weisen potenzielle Einsätze
in der Textil-, Nahrungsmittel- und Tierfutter-, Waschmittel- und
der Zellstoff- und Papierindustrie auf. Gleichwohl müssen bei
der industriellen Anwendung hocheffiziente Expressionssysteme geschafft
werden, welche höhere
Ausbeuten an trunkierten Cellulaseproteinen produzieren, als wie
sie derzeit verfügbar
sind, um von kommerziellem Wert zu sein. Zum Beispiel wurden Trichoderma
longibrachiatum-CBHI-Kerndomänen proteolytisch
getrennt und gereinigt, jedoch werden nur Milligrammmengen durch
diese biochemische Prozedur isoliert (Offord, D., et al., 1991,
Applied Biochem. and Biotech. 28/29: 377–386). Ähnliche Untersuchungen wurden
bezüglich
einer Analyse der Kern- und Bindungsdomänen von CBHI, CBHII, EGI und
EGII, isoliert aus T. longibrachiatum, nach biochemischer Proteolyse
durchgeführt,
gleichwohl wurde nur genügend
Protein zur Struktur- und Funktional-Analyse gewonnen (Tomme, P.,
et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575–581, und Ajo, S., 1991, FEBS
291: 45–49).
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Um
Stämme
zu erhalten, welche höhere
Anteile an trunkierten Cellulaseproteinen exprimieren, als es bisher
realisiert wurde, haben Anmelder T. longibrachiatum als Mikroorganismus
gewählt, welcher
zur Expression am meisten bevorzugt ist, da er gut bekannt ist für sein Vermögen, ganze
Cellulasen in großen
Mengen zu sezernieren. Somit fingen die Anmelder an, Stämme des
oben erwähnten
filamentösen
Pilzes so gentechnisch zu behandeln, dass sie hohe Anteile an biotechnologisch
bearbeiteten trunkierten Cellulasen exprimieren.
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Vor
der Erfindung der Anmelder war es unbekannt, ob die DNA, welche
trunkierte Cellulase-Kerndomänenproteine
codiert, in Trichoderma in einer solchen Weise transformiert werden
könnte,
dass neue trunkierte Cellulasegene zu funktionellen Proteinen, ohne
Abbau in der Wirtszelle, überexprimiert
werden könnten. Kürzlich haben
Nakari und Penttila gezeigt, dass es möglich ist, einen Trichoderma-Wirt
so gentechnologisch zu bearbeiten, dass eine trunkierte Form der
Trichoderma-EGI-Cellulase, speziell die katalytische Kerndomäne, exprimiert
wird, wobei der Grad der Expression der EGI-Kerndomäne niedrig
war (Nakari, T., et al., Abstract P1/63 1st European Conference
on Fungal Genetics, Nottingham, England, 20.–23. August 1992). Außerdem war
es unbekannt, ob eine katalytische Kerndomäne einer Trichoderma-Cellobiohydrolase
mittels rekombinanter genetischer Verfahren produziert werden konnte.
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Demzufolge
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA-Gen-Fragmente in
Stämme
des Pilzes Trichoderma longibrachiatum einzuführen, um Transformantenstämme zu erzeugen,
welche hohe Anteile an neuen trunkierten proteintechnologisch manipulierten
Cellulasen (Gramm/-Liter-Level)
aus den Bindungs- und Kerndomänen
von Trichoderma-Cellulasen exprimieren. Die trunkierten Proteine
werden korrekt prozessiert und extrazellulär in einer aktiven Form sezerniert.
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Zusammenfassung er Erfindung
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Die
Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Cellulaseproteins, welches Exoglucanaseaktivität zeigt, vor, umfassend die
folgenden Schritte:
- (a) Bereitstellen einer
Trichoderma-Wirtszelle, welcher eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten fehlt
und welche mit einem Expressionsvektor, der eine ein Cellulaseprotein
codierende DNA-Sequenz enthält, transformiert
worden ist, wobei das Cellulaseprotein ein CBHI-katalytisches Kernprotein
umfasst, welches Exoglucanaseaktivität zeigt und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt,
unter Bedingungen dergestalt, dass der Expressionsvektor in das
Genom der Zelle integriert wird; und
- (b) Wachsen lassen der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen,
so dass das rekombinante Cellulaseprotein exprimiert wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
besitzt das Cellulaseprotein eine Sequenz, welche aus der in der
SEQ ID NR: 10 dargelegten Aminosäuresequenz
besteht.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz, die den CBHI-katalytischen Kern codiert, so
wie in der SEQ ID NR: 9 dargelegt ist.
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In
einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die Pilzwirtszelle Trichoderma longibrachiatum.
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Das
Verfahren kann ferner den Schritt des Isolierens des rekombinanten
Cellulaseproteins umfassen.
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Das
Verfahren kann ebenfalls den Schritt des Transformierens der Wirtszelle
mit dem Expressionsvektor unter Bedingungen umfassen, so dass der
Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert wird.
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Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1 zeigt
die genomische DNA- und Aminosäure-Sequenz
von CBHI, welche aus Trichoderma longibrachiatum stammt. Die Signalsequenz
beginnt an dem Basenpaar 210 und endet an dem Basenpaar 260 (SEQ
ID NR. 25). Die katalytische Kerndomäne beginnt an dem Basenpaar
261 und geht bis zum Basenpaar 671 des ersten Exons, dem Basenpaar
739 bis zum Basenpaar 1434 des zweiten Exons, und Basenpaar 1498 bis
zum Basenpaar 713 des dritten Exons (SEQ ID NR. 9). Die Linkersequenz
beginnt an dem Basenpaar 714 und endet an dem Basenpaar 1785 (SEQ
ID NR. 17). Die Cellulase-Bindungsdomäne beginnt an dem Basenpaar
1786 und endet an dem Basenpaar 1888 (SEQ ID NR. 1). Die SEQ ID
NR. 26, 10, 18 und 2 repräsentieren die
Aminosäuresequenz
der CBHI-Signalsequenz, die katalytische Kerndomäne, die Linkerregion bzw. die Bindungsdomäne.
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Die 2 zeigt
die genomische DNA- und Aminosäuresequenz
von CBHII, welche von Trichoderma longibrachiatum stammt. Die Signalsequenz
beginnt an dem Basenpaar 614 und endet an dem Basenpaar 685 (SEQ
ID NR. 27). Die Cellulose-Bindungsdomäne beginnt an dem Basenpaar
686 und geht bis zum Basenpaar 707 des Exons eins, und vom Basenpaar
755 bis zum Basenpaar 851 des Exons zwei (SEQ ID NR. 3). Die Linkersequenz
beginnt am Basenpaar 852 und endet am Basenpaar 980 (SEQ ID NR.
19). Der katalytische Kern beginnt am Basenpaar 981 bis Basenpaar
1141 von Exon zwei, Basenpaar 1199 bis Basenpaar 1445 von Exons
drei und Basenpaar 1536 bis Basenpaar 2221 des Exons vier (SEQ ID
NR. 11). Die SEQ ID NR. 28, 4, 20 und 12 repräsentieren die Aminosäuresequenz
der CBHII-Signalsequenz, der Bindungsdomäne, der Linkerregion bzw. der
katalytischen Kerndomäne.
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Die 3 zeigt
die Konstruktion des Expressionsplasmids pTEX (SEQ ID NR. 39–41).
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Die 4 ist
eine Veranschaulichung der Konstruktion vom CBHI-Kerndomänen-Expressionsvektor (SEQ
ID NR. 38).
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Genaue Beschreibung
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Wie
oben angemerkt, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen
das Klonieren und das Exprimieren von neuen trunkierten Cellulaseproteinen
bei hohen Spiegeln im filamentösen
Pilz T. longibrachiatum. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung
werden im weiteren Detail nach einer Definition der hierin angewandten
Begriffe erörtert
werden.
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Der
Begriff "Trichoderma" oder "Trichoderma sp." bezieht sich auf
jeden Pilzstamm, welcher bereits früher als Trichoderma klassifiziert
worden ist, oder welcher derzeit als Trichoderma klassifiziert wird.
Vorzugsweise sind die Spezies Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma
reesei oder Trichoderma viride.
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Die
Ausdrücke "zellulolytische Enzyme" oder "Cellulase-Enzyme" beziehen sich auf
pilzliche Exoglucanasen oder Exocellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen
(EG) und β-Glucosidasen
(BG). Diese drei unterschiedlichen Typen an Cellulaseenzymen wirken
synergistisch, um kristalline Cellulose zu Glucose umzuwandeln.
Die Analyse der CBHI, CBHII und EGI und EGII codierenden Gene zeigt
eine Domänenstruktur,
welche eine katalytische Kernregion (CCD), eine Scharnier- oder
Linkerregion (hierin austauschbar verwendet) und eine Cellulose-Bindungsregion
(CBD) umfasst.
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Der
Ausdruck "trunkierte
Cellulasen", wie
hierin verwendet, bezieht sich auf die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen,
zum Beispiel CBHI und CBHII.
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Ein "Derivat" der trunkierten
Cellulasen umfasst die Kerndomänen
der Cellobiohydrolasen, zum Beispiel CBHI oder CBHII, von Trichoderma
sp., wobei eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an entweder
einem oder beiden der C- und N-terminalen Enden der trunkierten
Cellulase, eine Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an
einer oder mehreren Stellen in der gesamten trunkierten Cellulase,
eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb oder an einem
oder an beiden Enden des trunkierten Cellulaseproteins oder eine
Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren
Stellen in dem trunkierten Cellulaseprotein vorliegen kann, so dass
Exoglucanaseaktivitäten
in den derivatisierten trunkierten CBH-Proteinen mit katalytischem
Kern erhalten bleiben. Es ist ebenfalls beabsichtigt, mit dem Ausdruck "Derivat einer trunkierten
Cellulase" Kerndomänen der
Exoglucanaseenzyme einzuschließen,
an denen eine oder mehrere Aminosäuren von der Linkerregion gebunden
sind.
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Ein
trunkiertes Cellulaseproteinderivat betrifft ferner ein Protein,
welches im Wesentlichen hinsichtlich der Struktur und der biologischen
Aktivität
zu einer Cellulase-Kerndomäne ähnlich ist,
welches die in der Natur gefundenen zellulolytischen Enzyme umfasst,
welches jedoch so technologisch bearbeitet ist, dass es eine modifizierte
Aminosäuresequenz
enthält.
Mit der Maßgabe,
dass die zwei Proteine eine ähnliche
Aktivität
besitzen, werden sie somit als "Derivate" angese hen, da der
Ausdruck hierin selbst dann verwendet wird, wenn die Primärstruktur
eines Proteins nicht die identische Aminosäuresequenz zu der in dem anderen
gefundenen besitzt.
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Der
Ausdruck "katalytische
Cellulase-Kerndomänen-Aktivität" bezieht sich hierin
auf eine Aminosäuresequenz
der trunkierten Cellulase, welche die Kerndomäne der Cellobiohydrolasen umfasst,
zum Beispiel CBHI oder CBHII oder ein Derivat davon, welche in der
Lage ist, Cellulose-Polymere
wie Zellstoff oder Phosphorsäure-gequollene
Cellulose enzymatisch zu spalten.
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Die
Aktivität
der trunkierten katalytischen Kernproteine oder Derivate davon,
wie hierin definiert, kann mittels im Fachbereich allgemein bekannter
Verfahren bestimmt werden (siehe Wood, T. M., et al., in Methods in
Enzymology, Bd. 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg, S. T.,
Academic Press, S. 87–116,
1988). Zum Beispiel können
solche Aktivitäten
mittels der Hydrolyse von Phosphorsäure-gequollener Cellulose und/oder
löslichen
Oligosacchariden, gefolgt von einer Quantifizierung der freigesetzten
reduzierenden Zucker, bestimmt werden. In diesem Fall können die
löslichen
Zuckerprodukte, die durch die Wirkung von katalytischen CBH-Domänen oder
Derivaten davon freigesetzt werden, mittels HPLC-Analyse oder durch
Anwendung von colorimetrischen Assays zur Messung von reduzierenden
Zuckern nachgewiesen werden. Es wird erwartet, dass diese katalytischen
Domänen
oder Derivate davon mindestens 10% der Aktivität, welche von dem intakten
Enzym aufgezeigt wird, beibehalten werden, wenn jedes unter ähnlichen
Bedingungen getestet wird und auf der Basis von gleichen Mengen
an katalytischem Domänen-Protein
dosiert wird.
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Der
Ausdruck "Cellulose-Bindungsdomänen-Aktivität" bezieht sich hierin
auf eine Aminosäuresequenz
der Cellulase, welche die Bindungsdomäne von Cellobiohydrolasen und
Endoglucanasen, zum Beispiel EGI, EGII, CBHI oder CHBII oder eines
Derivates davon, umfasst, welche nicht-kovalent an ein Polysaccharid wie
Cellulose bindet. Es wird angenommen, dass Cellulose-Bindungsdomänen (CBDs)
unabhängig
von dem katalytischen Kern des Cellulase-Enzyms funktionieren, um
das Protein an Cellulose zu binden.
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Andere
Verfahren, die im Fachbereich allgemein bekannt sind, welche die
katalytische Cellulaseaktivität
mittels der physikalischen oder chemischen Eigenschaften von besonders
behandelten Substraten messen, können
ebenfalls in der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Zum Beispiel
wird bei Verfahren, welche physikalische Eigenschaften eines behandelten
Substrats messen, das Substrat bezüglich der Modifizierung der
Form, Textur, Oberfläche
oder struktureller Eigenschaften, der Modifikation des "Nass"-Verhaltens, z. B. der
Fähigkeit
von Substraten, Wasser zu absorbieren, oder der Modifizierung des
Quellens analysiert. Andere Parameter, welche die Aktivität bestimmen
können,
schließen
das Messen der Änderung
in den chemischen Eigenschaften von behandelten festen Substraten
ein. Zum Beispiel können
die Diffusionseigenschaften von Farbstoffen oder Chemikalien nach
der Behandlung von festem Substrat mit dem trunkierten Cellulasebindungsprotein
oder Derivaten davon, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden,
untersucht werden. Geeignete Substrate zur Evaluierung der Aktivität schließen zum
Beispiel Avicel, Rayon, Zellstofffasern, Baumwoll- oder Ramie-Fasern,
Papier, Kraft- oder Holzmehlpulpe ein. (Siehe Wood, T. M., et al.
in "Methods in Enzymology", Bd. 160, Herausgeber:
Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988.) Der
Ausdruck "Linker-
oder Gelenkregion" bezieht
sich auf die kurze Peptidregion, welche die zwei separaten funktionellen
Domänen
der pilzlichen Cellulasen verbindet, d. h. die Kerndomäne und die
Bindungsdomäne. Diese
Domänen
in T. longibrachiatum-Cellulasen werden mittels eines Peptids verknüpft, welches
reich an Ser, Thr und Pro ist.
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Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf
eine beliebige Sequenz von Aminosäuren, welche an den N-terminalen
Bereich eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen
Form des Proteins aus der Zelle heraus erleichtert. Diese Definition
einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins
fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsprozesses
abgespalten wird.
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Der
Ausdruck "Variante" bezieht sich auf
ein DNA-Fragment, welches die CBH-Kerndomäne codiert, die ferner eine
Addition von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder an dem
5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes,
eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder an
dem 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes
oder eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden intern
oder an dem 5'-
oder 3'-Ende des
DNA-Fragmentes enthalten kann, wobei die funktionelle Aktivität der Kerndomäne beibehalten bleibt.
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Ein
variantes DNA-Fragment, welches die Kerndomäne umfasst, ist weiterhin beabsichtigt,
um anzugeben, dass eine Linker- oder Gelenk-DNA-Sequenz oder ein
Abschnitt davon an die Kerndomänen-DNA-Sequenz
entweder an dem 5'-
oder 3'-Ende angebunden
sein kann, wobei die funktionelle Aktivität des codierten trunkierten
Kerndomänenproteins
beibehalten bleibt.
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Der
Ausdruck "Wirtszelle" steht sowohl für die Zellen
als auch für
die Protoplasten, die aus den Zellen von Trichoderma sp. erzeugt
werden.
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Der
Ausdruck "DNA-Konstrukt
oder Vektor" (hierin
austauschbar verwendet) bezieht sich auf einen Vektor, welcher ein
oder mehrere DNA-Fragmente oder variante DNA-Fragmente, die eine
beliebige der oben beschriebenen neuen trunkierten Cellulasen oder
Derivate codieren, umfasst.
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Der
Ausdruck "funktionell
gebunden an" bedeutet,
dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal
oder Enhancer-Region, an ein strukturelles Gen gebunden ist und
die Expression dieses Gens kontrolliert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von trunkierten
Cellulasen, indem eine Wirtszelle, welche mit einem DNA-Konstrukt,
umfassend mindestens ein Fragment von DNA, codierend eine Kernregion
von CBHI, das funktionell an einen Promotor gebunden ist, transformiert
ist, bereitgestellt wird, die Wirtszelle wachsen gelassen wird,
um die trunkierte Cellulase zu exprimieren, und anschließend die
trunkierte Cellulase bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt
wird.
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Transformierte
Mikroorganismenkulturen werden typischerweise bis zur stationären Phase
wachsen gelassen, filtriert, um die Zellen zu entfernen, und der
restliche Überstand
wird mittels Ultrafiltration konzentriert, um eine trunkierte Cellulase
oder ein Derivat davon zu erhalten.
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Das
Medium, welches verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen
zu kultivieren, kann jedes beliebige Medium sein, welches für die Cellulaseproduktion
Trichoderma geeignet ist. Die trunkierten Cellulasen oder Derivate
davon werden aus dem Medium mittels herkömmlicher Techniken gewonnen,
einschließlich Abtrennungen
der Zellen aus dem Medium mittels Zentrifugation oder Filtration,
der Präzipitation
der Proteine in dem Überstand
oder Filtrat mit Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt von
Chromatographieprozeduren, wie der Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie
und dergleichen.
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Alternativ
kann das letztendliche Proteinprodukt isoliert und gereinigt werden,
indem es an ein Polysaccharidsubstrat oder eine Antikörpermatrix
gebunden wird. Die Antikörper
(polyklonal oder monoklonal) können
gegen Cellulase-Kern- oder Bindungsdomänen-Peptide gezogen werden,
oder synthetische Peptide können
aus Teilen der Kerndomäne
oder Bindungsdomäne
hergestellt werden und verwendet werden, um polyklonale Antikörper heranzuzüchten.
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Es
fehlt der Trichoderma-Wirtszelle eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten. Deshalb
kann die Trichoderma-Wirtszelle bereits im Voraus durch gentechnologische
Bearbeitung manipuliert worden sein, um jedwede Wirtsgene zu entfernen,
welche intakte Cellulasen codieren.
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Die
trunkierte Cellulase kann rückgewonnen
werden und von beliebigen intakten Cellulasen, die gleichzeitig
in der Wirtszelle exprimiert werden, mittels herkömmlicher
Prozeduren, die oben diskutiert sind, einschließend Größenchromatographie, getrennt
werden. Eine Bestätigung
der Expression von trunkierten Cellulasen oder Derivaten wird mittels
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Immunoblot-Analyse
bestimmt, um trunkierte von intakten Cellulaseproteinen zu unterscheiden.
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Es
wird in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches die trunkierte
Cellulasekerndomäne codiert,
etwa durch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen innerhalb
des Gens verändert
werden kann, um eine DNA-Variante erzeugen, welche ein aktives trunkiertes
Cellulasederivat codiert.
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Es
wird ferner in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches
die trunkierte Cellulase codiert, funktionell an eine pilzliche
Promotorsequenz, zum Beispiel den Promotor vom cbh1- oder egl1-Gen, gebunden
werden kann.
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Die
Trichoderma-Wirtszelle wird mittels Transformation manipuliert,
so dass das DNA-Fragment,
welches die trunkierte Cellulase codiert, innerhalb des Genoms inseriert
wird. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass mehr als eine
Kopie des trunkierten Cellulase-DNA-Fragmentes in den Stamm rekombiniert
werden kann.
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Ein
selektierbarer Marker muss zuerst gewählt werden, so dass eine Detektion
des transformierten Pilzes ermöglicht
wird. Jedes selektierbare Markergen, welches in Trichoderma sp.
exprimiert wird, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
so dass seine Anwesenheit in den Transformanten die Eigenschaften
davon materiell nicht beeinflussen wird. Der selektierbare Marker
kann ein Gen sein, welches ein, einem Test zugängliches Produkt codiert. Der
selektierbare Marker kann eine funktionelle Kopie eines Trichoderma sp.-Gens
sein, welches, wenn es in dem Wirtsstamm fehlt, dazu führt, dass
der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp zeigt.
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Die
verwendeten Wirtsstämme
könnten
Derivate von Trichoderma sp. sein, welche ein nicht-funktionelles Gen
oder Gene, entsprechend dem gewählten
selektierbaren Marker, ermangeln oder aufweisen. Wenn zum Beispiel
der selektierbare Marker pyr4 gewählt wird, dann wird ein spezifischer
pyr-Derivat-Stamm als Rezipient bei der Transformationsprozedur
verwendet. Andere Beispiele von selektierbaren Markern, welche in der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die
Trichoderma sp.-Gene, welche äquivalent
zu den Aspergillus nidulans-Genen argB, trpC, niaD sind, und dergleichen
ein. Der entsprechende Rezipientenstamm muss deshalb ein Derivatstamm
wie argB–,
trpC–,
niaD– und
dergleichen sein.
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Der
Stamm wird von einem Ausgangswirtsstamm abgeleitet, welcher ein
beliebiger Trichoderma sp.-Stamm ist. Gleichwohl ist es bevorzugt,
einen T. longibrachiatum-Cellulase überproduzierenden Stamm, wie
RL-P37, der von Sheir-Neiss et al. in Appl. Microbiol. Biotechnology,
20 (1984), S. 46–53,
beschrieben wurde, zu verwenden, da dieser Stamm erhöhte Mengen
an Cellulaseenzymen sezerniert. Dieser Stamm wird dann verwendet,
um die in dem Transformationsprozess verwendeten Derivatstämme herzustellen.
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Der
Derivatstamm von Trichoderma sp. kann mittels einer Vielzahl von
im Fachbereich bekannten Techniken hergestellt werden. Ein Beispiel
ist die Herstellung von pyr4–-Derivatstämmen, indem
die Stämme Fluororotsäure (FOA)
unterzogen werden. Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-monophosphat-decarboxylase, ein Enzym,
welches für
die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen
wachsen in einem Medium, welchem es an Uridin mangelt, sind jedoch
gegenüber
Fluororotinsäure
empfindlich. Es ist möglich,
pyr4–-Derivat stämme zu selektieren,
welchen es an einem funktionellen Orotidinmonophosphat-Decarboxylaseenzym
mangelt und welche Uridin zum Wachstum erfordern, indem hinsichtlich
FOA-Resistenz selektiert
wird. Unter Verwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls
möglich,
Uridin erfordernde Stämme
zu erhalten, welchen es an einer funktionellen Orotat-Pyrophosphoribosyl-Transferase
mangelt. Es ist möglich,
diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, das dieses
Enzym codiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr.
Genet. 19, S. 359–365).
Da es leicht ist, Derivatstämme
unter Verwendung der FOA-Resistenz-Technik in der vorliegenden Erfindung
zu selektieren, wird es bevorzugt, dass pyr4-Gen als einen selektierbaren
Marker zu verwenden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wurden bei Trichoderma-Wirtszellstämmen ein
oder mehrere Cellulasegen(e) vor der Einführung eines DNA-Konstrukts
oder -Plasmids, enthaltend das DNA-Fragment, welches das trunkierte
Cellulaseprotein von Interesse codiert, deletiert. Es ist bevorzugt,
eine trunkierte Cellulase, ein Derivat davon oder kovalent verknüpfte trunkierte
Cellulasedomänenderivate
in einem Wirt zu exprimieren, welchem ein oder mehrere Cellulasegene
fehlen, um die Identifizierung und anschließende Reinigungsprozeduren
zu vereinfachen. Jedes beliebige Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert
worden ist, kann deletiert werden, wie cbh1, cbh2, egl1, egl3 und
dergleichen. Das Plasmid zur Gendeletion wird so ausgewählt, dass
einzigartige Restriktionsenzymstellen darin vorliegen, um zu ermöglichen, dass
das Fragment von homologer Trichoderma sp.-DNA als ein einzelnes
lineares Stück
entfernt wird.
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Das
gewünschte
Gen, welches aus der Transformante zu deletieren ist, wird in das
Plasmid mittels Verfahren inseriert, die im Fachbereich bekannt
sind. Das Plasmid, welches das zu deletierende oder zu zerstörende Gen
enthält,
wird dann an (einer) geeigneten Restriktionsenzymstelle(n), die
intern zu der codierenden Region liegen, geschnitten, die Gen-codiernde
Sequenz oder einen Teil davon kann daraus entfernt werden, und der
selektierbare Marker wird inseriert. Flankierende DNA-Sequenzen
von dem Locus des zu deletierenden oder zu zerstörenden Gens, vorzugsweise zwischen
etwa 0,5 und 2,0 kB, verbleiben auf beiden Seiten des selektierbaren
Markergens.
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Ein
einzelnes DNA-Fragment, welches das Deletionskonstrukt enthält, wird
dann aus dem Plasmid isoliert und verwendet, um den geeigneten pyr–-Trichoderma-Wirt
zu transformieren. Transformanten werden basierend auf ihrem Vermögen selektiert,
das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und komplementieren somit die Uridin-Auxotrophie
des Wirtsstammes. Eine Southern-Blot-Analyse wird dann an den resultierenden
Transformanten ausgeführt,
um ein Doppel-Cross-Over-Integrationsereignis
zu identifizieren und zu bestätigen,
welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region des
zu deletierenden Gens mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.
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Obgleich
oben spezifische Plasmidvektoren beschrieben sind, ist die vorliegende
Erfindung nicht auf die Herstellung dieser Vektoren beschränkt. Verschiedene
Gene können
in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Verwendung der obigen Techniken
deletiert und ersetzt werden. Jedwede verfügbaren selektierbaren Marker können verwendet
werden, wie oben diskutiert. Potenziell kann jedes Trichoderma sp.-Gen,
welches kloniert worden ist und somit identifiziert worden ist,
aus dem Genom unter Verwendung der oben beschriebenen Strategie
deletiert werden. Alle diese Varianten sind innerhalb der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen.
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Der
Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, welcher das inserierte
DNA-Fragment oder variantes DNA-Fragment, codierend die trunkierte
Cellulase oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung, trägt, kann
jeder beliebige Vektor, welcher in der Lage ist, autonom in einem
gegebenen Wirtsorganismus zu replizieren, typischerweise ein Plasmid,
sein. In bevorzugten Ausführungsformen
werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalt der Expression
von Genen oder Trunkierungen davon in Betracht gezogen. Der erste
enthält
DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, die Gen-codierende Region
und Terminatorsequenz alle von dem zu exprimierenden Gen stammen.
Die Gen-Trunkierung wird erhalten, indem die unerwünschten DNA-Sequenzen
(welche für
nicht erwünschte
Domänen
codieren) deletiert werden, wodurch die Domäne, die unter der Kontrolle
ihrer eigenen transkriptionellen und translationalen regulatorischen
Sequenzen exprimiert werden soll, zurückbleibt. Ein selektierbarer
Marker ist ebenfalls auf dem Vektor vorhanden, welcher die Selektion
hinsichtlich Integration von mehreren Kopien der neuen Gensequenzen
in den Wirt ermöglicht.
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Der
zweite Typ von Expressionsvektor ist vorgefertigt und enthält Sequenzen,
die für
ein hohes Transkriptionsniveau erforderlich sind, und einen selektierbaren
Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region
für ein
Gen oder ein Teil davon in diesen Allzweck-Expressionsvektor inseriert werden kann, so
dass sie unter der transkriptionellen Kontrolle der Expressionskassettenpromotor-
und Terminatorsequenzen steht.
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Zum
Beispiel ist pTEX ein solcher Allzweck-Expressionsvektor. Gene oder
Teile davon können
stromabwärts
des starken CBHI-Promotors inseriert werden. Die hierin beschriebenen
Beispiele sind eingeschlossen, bei denen gezeigt wird, dass Cellulase-katalytische
Kern- und Bindungsdomänen
unter Verwendung dieses Systems exprimiert werden.
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In
dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die trunkierte Cellulase
oder andere neue Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, in
funktionsfähiger
Weise an transkriptionale und translationale Sequenzen, d. h. an
eine geeignete Promotorsequenz und Signalsequenz im Leseraster zu
dem Strukturgen, gebunden werden. Der Promotor kann jede beliebige
DNA-Sequenz sein, welche transkriptionale Aktivität in der
Wirtszelle zeigt und kann von Genen abstammen, welche Proteine codieren,
die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Das
Signalpeptid ermöglicht
die extrazelluläre
Expression der trunkierten Cellulase oder von Derivaten davon. Die DNA-Signalsequenz
ist vorzugsweise die Signalsequenz, welche in natürlicher
Weise mit dem zu exprimierenden trunkierten Gen assoziiert ist,
gleichwohl wird die Signalsequenz von beliebigen Cellobiohydrolasen
oder Endoglucanase in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
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Die
Prozeduren, welche verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, welche
die trunkierten Cellulasen, Derivate davon oder andere neue Cellulasen
der vorliegenden Erfindung codieren, mit dem Promotor zu ligieren,
und zur Inserierung in geeignete Vektoren, die die notwendigen Informationen
zur Replikation in der Wirtszelle enthalten, sind im Fachbereich
allgemein bekannt.
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Der
DNA-Vektor oder das Konstrukt, welche oben beschrieben sind, können in
die Wirtszelle gemäß bekannten
Techniken, wie der Transformation, Transfektion, Mikroinjektion,
Mikroporation, biolistischer Bombardierung und dergleichen, eingeführt werden.
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In
der bevorzugten Transformationstechnik muss berücksichtigt werden, dass, da
die Permeabilität
der Zellwand in Trichoderma sp. sehr gering ist, die Aufnahme der
gewünschten
DNA-Sequenz, des
Gens oder des Genfragmentes bestenfalls minimal ist. Es gibt eine
Vielzahl von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand
in dem Derivatstamm (d. h. dem ein funktionelles Gen fehlt, das
dem verwendeten selektierbaren Marker entspricht) vor dem Transformationsprozess
zu erhöhen.
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Das
bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung
von Trichoderma sp. zur Transformation involviert die Herstellung
von Protoplasten von pilzlichem Mycelium. Das Mycelium kann aus
ausgekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Mycelium wird
mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was zu
Protoplasten führt.
Die Protoplasten werden dann durch die Anwesenheit eines osmotischen
Stabilisators in dem Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol,
Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Für gewöhnlich variiert
die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M bis 1,2 M.
Es ist bevorzugt, eine Lösung
von etwa 1,2 M an Sorbitol in dem Suspensionsmedium zu verwenden.
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Die
Aufnahme der DNA in den Trichoderma sp.-Wirtsstamm hängt von
der Calciumionenkonzentration ab. Im Allgemeinen werden zwischen
etwa 10 mM CaCl2 und 50 mM CaCl2 bei
einer Aufnahmelösung
verwendet. Neben dem Anfordernis nach dem Calciumion bei der Aufnahmelösung sind
andere Stoffe, die üblicherweise
eingebracht werden, ein Puffersystem wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA)
oder 10 mM MOPS-Puffer pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und
Polyethylenglykol (PEG). Man nimmt an, dass das Polyethylenglykol
dahingehend wirkt, die Zellmembranen zu verschmelzen, wodurch ermöglicht wird,
dass der Inhalt des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stamms
zugeführt
wird und die Plasmid- DNA
zu dem Zellkern transferiert wird. Diese Fusion hinterlässt häufig mehrere
Kopien der Plasmid-DNA, die tandemartig in dem Wirtschromosom integriert
sind.
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Für gewöhnlich wird
eine Suspension, die Trichoderma sp.-Protoplasten oder Zellen enthält, welche einer
Permeabilitätsbehandlung
bei einer Dichte von 108 bis 109/ml,
vorzugsweise 2 × 108/ml unterzogen worden sind, in der Transformation
verwendet. Diese Protoplasten oder Zellen werden der Aufnahmelösung hinzugesetzt,
zusammen mit dem gewünschten
linearisierten selektierbaren Marker mit im Wesentlichen homologen
flankierenden Regionen an beiden Seiten des Markers, um eine Transformationsmischung
zu bilden. Im Allgemeinen wird eine hohe Konzentration von PEG der
Aufnahmelösung
hinzugesetzt. Von 0,1 bis 1 Volumen 25%iges PEG 4000 können der
Protoplastensuspension hinzugesetzt werden. Gleichwohl ist es bevorzugt, etwa
0,25 Volumen zu der Protoplastensuspension hinzuzugeben. Additive
wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen
können
der Aufnahmelösung
hinzugesetzt werden und bei der Transformation helfen.
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Im
Allgemeinen wird die Mischung dann bei etwa 0°C für einen Zeitraum von 10 bis
30 Minuten inkubiert. Zusätzliches
PEG wird dann der Mischung hinzugesetzt, um die Aufnahme des gewünschten
Gens oder der DNA-Sequenz weiter zu steigern. Das 25%ige PEG 4000
wird allgemein in Volumina vom 5- bis 15fachen des Volumens der
Transformationsmischung hinzugesetzt; gleichwohl können größere oder
geringere Volumina geeignet sein. Das 25%ige PEG 4000 entspricht
vorzugsweise etwa dem 10fachen des Volumens der Transformationsmischung.
Nachdem das PEG hinzugesetzt worden ist, wird die Transformationsmischung dann
bei Raumtemperatur inkubiert, und zwar vor der Zugabe einer Sorbitol-
und CaCl2-Lösung. Die Protoplastensuspension
wird dann ferner zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums
hinzugesetzt. Dieses Wachstumsmedium erlaubt nur das Wachstum von
Transformanten. Jedes Wachstumsmedium kann in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, welches geeignet ist, die gewünschten Transformanten wachsen zu
lassen. Wenn jedoch Pyr+-Transformanten
selektiert werden, ist es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden,
welches kein Uridin enthält.
Die anschließenden
Kolonien werden transferiert und auf einem Wachstumsmedium, welches
kein Uridin enthält,
gereinigt.
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In
diesem Stadium wurden stabile Transformanten von nichtstabilen Transformanten
durch ihre schnelle Wachstumsrate und die Bildung von kreisförmigen Kolonien
mit eher glatten als zerfurchten Umrissen auf einem festen Kulturmedium,
dem es an Uridin fehlte, unterschieden. Zusätzlich wurde in einigen Fällen ein weiterer
Test der Stabilität
durchgeführt,
indem die Transformanten auf einem festen nicht-selektiven Medium (d.
h. Uridin enthaltend) wachsen gelassen wurden, Sporen von diesem
Kulturmedium abgeerntet wurden und der Prozentanteil dieser Sporen
bestimmt wurde, welche anschließend
auskeimen und auf einem selektiven Medium, welchem Uridin fehlte,
wachsen werden.
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In
einer besonderen Ausführungsform
des obigen Verfahrens werden die trunkierten Cellulasen in aktiver
Form aus der Wirtszelle [entweder] als ein Ergebnis der geeigneten
posttranslationalen Prozessierung der trunkierten Cellulase gewonnen.
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Die
Verwendung von isolierten katalytischen Cellulase-Kerndomänen gegenüber der
Verwendung des intakten Cellulaseenzyms kann in mehreren Anwendungen
von Vorteil sein. Solche Anwendungen schließen das Stonewashing oder das
Biopolishing ein, wobei es in Betracht gezogen wird, dass eine Farbstoff/Färbemittel/Pigment-Rückfärbung oder
-Wiederablagerung reduziert oder eliminiert werden können, indem
neue trunkierte Cellulaseenzyme zur Anwendung kommen, welche so
modifiziert worden sind, dass ihnen eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt.
Darüber
hinaus wird es in Betracht gezogen, dass die Aktivität bezüglich bestimmter
Substrate von Interesse beispielsweise in der Textil-, Waschmittel-,
Zellstoff- und Papier-, Tierfutter-, Nahrungsmittel-, Biomassenindustrie
in signifikanter Weise gesteigert oder verringert werden kann, wenn
die Bindungsdomäne
entfernt wird, so dass die Bindungsaffinität des Enzyms für Cellulose
gesenkt wird.
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Es
wird ferner in Betracht gezogen, dass die Expression und Verwendung
von einigen katalytischen Domänen
von Cellulaseenzymen eine verbesserte Rückgewinnbarkeit vom Enzym,
Selektivität,
wenn eine geringere Aktivität
bezüglich
eines kristallineren Substrates erwünscht ist, oder Selektivität, wenn
eine hohe Aktivität
bei amorphem/löslichem
Substrat erwünscht
ist, bereitstellen.
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Ferner
können
katalytische Domänen
von Cellulaseenzymen brauchbar sein, um die Synergie mit anderen
Cellulasekomponenten, Cellulase- oder Nicht-Cellulase-Domänen und/oder
anderen Enzymen oder Portionen davon bei Cellulose enthaltenden
celluloseartigen Materialien in Anwendungen wie der Biomasseumwandlung,
Reinigung, Stonewashing, Biopolishing von Textilien, dem Weichmachen,
der Zellstoff/Papier-Verarbeitung, der Tierfutternutzung, dem Pflanzenschutz
und der Schädlingsbekämpfung,
der Stärkeprozesszierung
oder der Produktion von pharmazeutischen Intermediaten, Disacchariden
oder Oligosacchariden zu steigern.
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Außerdem könnten die
Einsätze
von katalytischen Cellulase-Kerndomänen oder Derivaten davon einige
der schädlichen
Eigenschaften, die mit dem intakten Enzym bei Cellulosestoffen wie
Zellstoff, Baumwolle oder anderen Fasern oder Papier assoziiert
sind, verringern. Eigenschaften von Interesse schließen Faser/Gewebe-Festigkeitsverlust,
Faser/Gewebe-Gewichtsverlust, Fusselerzeugung und Fibrillierungs-Beschädigung ein.
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Es
wird ferner in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen eine
geringere Faseraufrauung oder eine verringerte Färbemittel-Wiederabscheidung/rückfärbung aufzeigen
könnten.
Ferner können
diese trunkierten katalytischen Kern-Cellulasen oder Derivate davon
eine Option zur verbesserten Rückgewinnung/Recycling
dieser neuen Cellulasen bieten.
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Darüber hinaus
wird in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen selektive
Aktivitätsvorteile
beinhalten könnten,
wo die Hydrolyse der löslichen
oder stärker
amorphen cellulosischen Regionen des Substrates erwünscht ist,
jedoch die Hydrolyse der stärker
kristallinen Region nicht erwünscht
ist. Dies kann bei Anwendungen wie der Bioumwandlung wichtig sein,
wo eine selektive Modifizierung der Körnchen/Fasern/Pflanzen-Materialien
von Interesse ist.
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Eine
noch weitere Anwendung für
katalytische Cellulase-Kerndomänen
oder Derivate ist die Erzeugung von mikrokristalliner Cellulose
(MCC). Ferner wird in Betracht gezogen, dass das MCC weniger gebundenes
Enzym enthält,
oder dass das gebundene Enzym leichter entfernt werden kann.
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Einige
der folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Andere stellen
einen brauchbaren Hintergrund zur Verfügung.
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BEISPIELE
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Beispiel I
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Klonierung und Expression
der CBHII-Kerndomäne
unter Verwendung des CBHI-Promotors, Terminators und der Signalsequenz
von CBHII.
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Teil 1. Konstruktion des
T. longibrachiatum-Allzweck-Expressionsplasmids-PTEX.
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Das
Plasmid PTEX wurde konstruiert, indem die Methoden von Sambrook
et al. (1989), oben, nachvollzogen wurden, und es ist in der 7 veranschaulicht. Dieses Plasmid wurde
als ein Mehrzweck-Expressionsvektor zur Verwendung in dem filamentösen Pilz
Trichoderma longibrachiatum entworfen. Die Expressionskassette weist
mehrere einzigartige Merkmale auf, welche sie für diese Funktion brauchbar
machen. Die Transkription wird unter Verwendung des starken CBHI-Gen-Promotors
und Terminatorsequenzen für
T. longibrachiatum reguliert. Zwischen dem CBHI-Promotor und Terminator
gibt es einzigartige PmeI- und SstI-Restriktionsstellen, welche
verwendet werden, um das zu exprimierende Gen zu inserieren. Das
selektierbare T. longibrachiatum pyr4-Markergen wurde in den CBHI-Terminator
inseriert, und die ganze Expressionskassette (CBHI-Promotor-Insertionsstellen-CBHI-Terminator-pyr4-Gen-CBHI-Terminator) kann
unter Verwendung der einmaligen NotI-Restriktionsstelle oder der
einmaligen NotI- und NheI-Restriktionsstellen herausgeschnitten werden.
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Dieser
Vektor basiert auf dem bakteriellen Vektor pSL1180 (Pharmacia Inc.,
Piscataway, New Jersey), welcher ein Vektor vom PUC-Typ ist, und
zwar mit einer verlängerten
multiplen Klonierungsstelle. Ein im Fachbereich Erfahrener würde in der
Lage sein, diesen Vektor basierend auf dem in der 3 veranschaulichten Flussdiagramm
zu konstruieren. (Siehe ebenfalls die U.S.-Patentanmeldung 07/954
113 für
die Konstruktion des PTEX-Expressionsplasmids.) Es wäre möglich, Plasmide
zu konstruieren, welche zu PTEX-trunkierten Cellulasen oder Derivaten
davon, beschrieben in der vorliegenden Erfindung, ähnlich sind,
welche ein anderes Stück
an DNA-Sequenz enthalten, die das trunkierte Cellulasegen ersetzt.
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Teil 2. Klonierung.
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Das
komplette cbh2-Gen, welches bei der Konstruktion des CBHII-Kerndomänen-Expressionsplasmids,
PTEX-CBHII-Kern, verwendet wurde, wurde aus dem Plasmid PUC219::CBHII
erhalten (Korman, D., et al., 1990, Curr. Genet. 17: 203–212). Die
Cellulose-Bindungsdomäne,
positioniert an dem 5'-Ende
des cbh2-Gens, ist zweckdienlicherweise zwischen einer XbaI- und
Sna-BI-Restriktionsstelle
lokalisiert. Um die XbaI-Stelle zu nutzen, wurde eine zusätzliche
XbaI-Stelle in dem
Polylinker zerstört.
PUC219::CBHII wurde partiell mit XbaI verdaut, sodass der Hauptteil
des Produktes linear war. Die XbaI-Überhänge wurden unter Verwendung
von T4 DNA-Polymerase aufgefüllt
und unter Bedingungen aneinander ligiert, welche die Selbstligation
des Plasmids begünstigen.
Dies hat den Effekt der Zerstörung
der stumpf-gemachten Stelle, bei welcher es sich in 50% der Plasmide
um die XbaI-Stelle in dem Polylinker handelte. Ein solches Plasmid
wurde identifiziert und mit XbaI und SnaBI verdaut, um die Cellulose-Bindungsdomäne freizusetzen.
Die Vektor-CBHII-Kerndomäne
wurde isoliert und mit den folgenden synthetischen Oligonukleotiden
ligiert, die entworfen waren, um die XbaI-Stelle mit der SnaBI-Stelle
an der Signal-Peptidase-Spaltungsstelle und dem Papain-Spaltungspunkt
in der Linkerdomäne
zu verbinden.
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Das
resultierende Plasmid pUCΔCBD
CBHII wurde mit NheI verdaut, und die Enden wurden durch die Inkubation
mit T4 DNA-Polymerase und dNTPs stumpf gemacht. Danach wurde die
lineare stumpf gemachte Plasmid-DNA mit BglII verdaut, und das Nhe(stumpf)-BglII-Fragment,
welches die CBHII-Signalsequenz und Kerndomäne enthielt, wurde isoliert.
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Das
letztliche Expressionsplasmid wurde technologisch bearbeitet, und
zwar durch den Verdau des Allzweck-Expressionsplasmids pTEX (beschrieben
in 07/954 113) mit SstII und PmeI und Ligieren des CBHII NheI(stumpf)-BglII-Fragmentes
stromabwärts
von dem cbh1-Promotor unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids
mit der Sequenz CGCTAG, um den BglII-Überhang
mit dem SstII-Überhang
aufzufüllen.
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Das
pTEX-CBHI-Kern-Expressionsplasmid wurde in einer ähnlichen
Weise wie pTEX-CBHII-Kern,
der in dem obigen Beispiel beschrieben ist, hergestellt. Seine Konstruktion
ist in der 4 beispielhaft dargelegt.
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Teil 3. Transformation
und Expression.
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Eine
DNA-Präp.
im großen
Maßstab
wurde aus dem pTEX-CBHII-Kern vorgenommen, und aus dieser wurde
das NotI-Fragment, welches die CBHII-Kerndomäne unter der Kontrolle der
transkriptionellen Elemente von cbh1 und das pyr4-Gen enthielt,
durch präparative
Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die
Uridin-auxotrophe Version des Quaddeletierten Stammes 1A52 pyr13
transformiert, und stabile Transformanten wurden identifiziert.
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Um
zu selektieren, welche Transformanten die cbh2-Kerndomäne exprimierten,
wurde genomische DNA aus Stämmen
isoliert, gefolgt von einem Wachstum auf Vogels + 1% Glukose, und
es wurden Southern-Blot-Experimente unter Verwendung eines isolierten
DNA-Fragmentes, das nur die cbh2-Kerndomäne enthielt, durchgeführt. Transformanten
wurden isoliert, die eine Kopie der cbh2-Kerndomänen-Expressionskassette integriert
in das Genom von 1A52 aufwiesen. Gesamt-mRNA wurde aus den zwei
Stämmen
isoliert, im Anschluß an
ein 1-tägiges
Wachstum auf Vogels + 1% Laktose. Die mRNA wurde einer Northern-Analyse unter
Verwendung der cbh2-Codierregion
als einer Sonde unterzogen. Transformanten, welche mRNA der cbh2-Kerndomäne exprimierten,
wurden identifiziert.
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Zwei
Transformanten wurden unter den gleichen Bedingungen, wie bereits
vorher in Beispiel 1 beschrieben, in einem 141 großen Fermentor
wachsen gelassen. Die resultierende Nährlösung wurde konzentriert, und
die darin enthaltenden Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt,
und das CBHII-Kerndomänen-Protein
wurde mittels Western-Analyse identifiziert. Eine Transformante,
# 15, produzierte ein Protein der korrekten Größe und Reaktivität gegenüber polyklonalen
CBHII-Antikörpern.
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Es
wurde anschließend
abgeschätzt,
dass die Proteinkonzentration des Fermentationsüberstandes nach der Reinigung
10 g/l betrug, wovon 30–50%
die CBHII-Kerndomäne
war (siehe Beispiel 2).
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Beispiel 2
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Reinigung von katalytischen
CBHI-Kernen
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Der
CBHI-Kern wurde aus Nährmedium
von T. longibrachiatum, welcher den pTEX-CBHI-Kern-Expressionsvektor enthielt, auf
die folgende Weise gereinigt. Die ultrafiltrierte (UF) CBHI-Kern-Nährbrühe wurde unter
Verwendung von Diatomeenerde filtriert und in 10 mM TES, pH 6,8,
bis zu einer Leitfähigkeit
von 1,5 mOhm verdünnt.
Der verdünnte
CBHI-Kern wurde dann auf eine Anionenaustauschsäule (Q-Sepharose-Fast Flow,
Pharmacia Kat. # 17-0510-01),
welche in 10 mM TES, pH 6,8, äquilibriert
worden war, geladen. Der CBHI-Kern wurde von dem Hauptteil der anderen
Proteine in der Brühe
unter Verwendung einer Gradientenelution in 10 mM TES, pH 6,8, von
0 bis 1 M NaCl getrennt. Die Fraktionen, welche den CBHI-Kern enthielten, wurden
dann auf einem Amicon-Rührzellen-Konzentrator
mit einer PM 10-Membran (Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen, Amicon
Kat. # 13132MEM 5468A) konzentriert. Dieser Schritt konzentrierte
den Kern und separierte ihn gleichfalls von Proteinen mit niedrigerem
Molekulargewicht. Die resultierenden Fraktionen waren über 85%
reiner CBHI-Kern.
Die reinste Fraktion wurde bezüglich
der Sequenz dahingehend verifiziert, dass es sich dabei um den CBHI-Kern
handelte.
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