PT684770E - Aditivo de racoes enzimatico e racoes para animais que o incluem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ADITIVO DE RAÇÕES ENZIMATICO E RAÇÕES PARA ANIMAIS QUE O INCLUEM" A presente invenção refere-se a um aditivo de rações enzimático e em particular a um aditivo que possa diminuir a taxa de conversão da ração de uma ração à base de cereal e/ou aumentar a sua digestibilidade.

Os melhoramentos em rações para animais para permitir que os animais as digiram mais eficientemente estão constantemente a ser procurados. Uma das principais preocupações é melhorar a taxa de conversão das rações (FCR) de uma ração sem aumentar o seu custo por unidade de peso. A FCR é a razão da quantidade de ração consumida em relação ao ganho em peso de um animal. Uma FCR baixa indica que uma dada quantidade de ração resulta num animal em crescimento ganhando proporcionalmente mais peso. Isto significa que o animal é capaz de utilizar a ração mais eficientemente. Uma maneira pela qual a FCR de uma ração pode ser melhorada é aumentando a sua digestibilidade.

Existem várias limitações sobre a digestibilidade dos componentes nutricionais de uma ração tais como o seu conteúdo em amido, gordura, proteína e aminoácidos. Estas limitações incluem: (i) a viscosidade dos materiais presentes no sistema gastrointestinal do animal. Essa viscosidade é devida, pelo menos em parte, a polissacáridos solúveis que não amido, tais como β-glucanos de ligação mista e arabinoxilanos; (ii) a retenção de nutrientes dentro das paredes das células da ração, particularmente as da camada de 1 ) * aleurona nos cereais. Essa retenção é provocada pelos níveis elevados dos polissacáridos que não relativamente resistentes à quebra pelo sistema digestivo do animal. Isto impede que os nutrientes retidos nas células estejam nutricionalmente disponíveis para o animal; e (iii) uma deficiência na actividade enzimática endógena, tanto do animal como da população microbiana do tubo gástrico, particularmente num animal jovem.

Os problemas acima que interferem com a digestibilidade são particularmente visíveis no caso de dietas à base de cereais, e em particular nas que possuem um conteúdo elevado em cevada.

Devido ao problema da digestibilidade pobre de nutrientes a partir da ração, é normalmente necessário formular rações para conterem níveis superiores de materiais que forneçam energia de modo a suprimir as necessidades nutricionais dos animais. Tais materiais que fornecem energia incluem convencionalmente amido, gordura, açúcares, fibra, etc. A necessidade de incluir estes materiais, ou fontes destes materiais, numa ração adiciona um custo extra considerável que é desvantajoso de um ponto de vista económico.

Numa tentativa de resolver o problema de digestibilidade pobre de rações baseadas em cereais, é conhecida a inclusão de suplementos de enzimas tais como β-glucanases ou xilanases em rações para animais. Por exemplo, WO 91/04673 revela um aditivo de ração para aliviar o síndroma de má absorção em aves que causa digestão reduzida. O aditivo inclui uma celulase e uma xilanase. JP-A-60-75238 revela uma ração para animais domésticos que contém uma mistura de enzimas incluindo actividades de 2 protease, celulase, amilase, e lipase. Esta referência especula que estas várias actividades de enzima permitem a fermentação de micróbios para crescer e rmo estes cc tornam componentes nutricionais úteis da ração. A celulase total é uma mistura de enzimas diferentes que cooperam para hidrolisar a celulose (ligações β-l,4-D-glucano) e/ou derivados destes (por exemplo, celulose embebida em ácido fosfórico) e produz como produtos primários compostos como glucose, celobiose, e celo-oligossacáridos. A celulase total é composta por algumas classificações de enzimas diferentes incluindo enzimas possuindo actividade de exocelobiohidrolase, actividade de endoglucanase e actividade de β-glucosidase.

Por exemplo, a celulase total produzida pelo fungo Trichoderma longibrachiatum compreende duas exocelobiohidrolases, CBHI e CBHII, pelo menos três endoglucanases, EGI, EGII e EGIII, e pelo menos uma β-glucosidase. Uma fermentação representativa de T. longibrachiatum pode produzir uma celulase total incluindo por peso de proteína CBHI a 45-55%, CBHII a 13-15%, EGI a 11-13%, EGII a 8-10%, EGIII a 1-4% e BG a 0,5-1%. No entanto, deve ser notado que as presentes concentrações de um componente específico da celulase variarão de acordo com numerosos factores, incluindo condições de fermentação, concentrações de substrato e tipo da estirpe. Assim, numa fermentação representativa, Trichoderma longibrachiatum produz uma celulase total possuindo 58-70% de celobiohidrolases.

Cada endoglucanase de T. longibrachiatum possui as suas próprias caracteristicas distintas. Assim, é conhecido que adicionalmente à actividade de celulose EGI hidrolisa xilano. EGII e EGIII por comparação não apresentam actividade de xilanase significativa, pelo menos de acordo com a camada de cobertura de PAGE nativa com azo-xilano. Além disso, é sabido que EGI, EGII e EGV contêm estruturalmente domínios de ligação à celulose distintos (CBDs). Por outro lado, EGIII não parece conter um domínio de ligação estruturalmente di eti ni-n foi mostrado que possui uma baixa afinidade para a celulose cristalina quando comparada com EGI ou EGII. WO 92/06209 revela processos para transformação do fungo filamentoso Trichoderma reesei (agora denominado "T. longibrachiatum) que envolve os passos de tratar uma estirpe de T. reesei com ADN recombinante linear substancialmente homólogo para permitir transformação homóloga e então seleccionar os transformantes de T. reesei resultantes. Por exemplo, são descritos transformantes em que certos genes alvo são anulados ou interrompidos no genoma e cópias extra de certos genes nativos tais como os que codificam EGI e EGII são homologarnente recombinados na estirpe. É notado nesta referência que composições de celulase obtidas de estirpes deficientes nos componentes CBHI e CBHII são úteis como componentes de uma composição de detergente de limpeza. Tais composições de celulases são, obviamente, relativamente enriquecidas.

Quando utilizadas in vivo, as endoglucanases e celobiohidrolases são consideradas como actuando sinergisticamente na hidrólise da celulose em pequenos celo-oligossacáridos (principalmente celobiose), que são subsequentemente hidrolisados em glucose por acção da β-glucosidase. Adicionalmente à hidrólise de ligações β—1,4 na celulose, a endo-1,4-p-glucanase (EC 3.2.1.4.) também hidrolisa ligações β-1,4 em β-glucanos contendo também ligações 1,3. As endoglucanases actuam nas ligações internas para produzir celobiose, glucose e celo-oligossacáridos. As celobiohidrolases actuam nos terminais das cadeias dos polímeros de celulose para produzir celobiose como produto principal. A celulose total obtida de T. longibrachiatum foi utilizada em combinação com cevada em campos tais como fermentação de cerveja e em nutrição animal durante vários dias. Um dos benefícios de --- A uuo pHi ri onar rol nl acoc a H -í o à aumentar a digestibilidade de vários componentes presentes na dieta incluindo proteína e aminoácidos. Como resultado, os custos de aditivos da dieta podem ser reduzidos sem perda de desempenho, e a excreção de azoto no estrume pode ser significativamente reduzida. Isto reduz o impacto ambiental da criação de gado intensiva.

As paredes celulares de endosperma de cevada contêm uma elevada proporção de β-(1,3)(1,4)-glucanos de ligações mistas de elevado peso molecular, solúveis em água. Quando solubilizados, estes polissacáridos causam um aumento na viscosidade da solução. Por exemplo, se a cevada for o alimento de frangos para churrasco, isso leva a um nível relativamente alto de viscosidade na região do seu tracto gastrointestinal, que resulta na redução da eficiência da digestão e diminuição do crescimento.

Organismos que produzem ou expressam complexos da enzima celulase expressam também frequentemente actividade de xilanase. Por exemplo, foram identificadas duas enzimas xilanases diferentes produzidas por T. longibrachiatum. A purificação destas duas xilanases diferentes, uma referida como sendo uma xilanase de elevado pi (possuindo um pi de cerca de 9,0) e a outra referida como uma xilanase de baixo pi (possuindo um pi de cerca de 5,2), assim como a clonagem e sequenciação do gene para cada xilanase, são descritas em detalhe na WO 92/06209 e WO 93/24621. A figura 16 deste documento apresenta as sequências de aminoácidos deduzidas para ambos os produtos dos genes de baixo pi e elevado pi. O Exemplo 22 revela também como criar estirpes de T. longibrachiatum que sobre-expressam os genes de xilanases de baixo pi e de elevado pi. 5 » ·

Como acima mencionado, a utilização de celulases como um aditivo para rações para animais é conhecida na técnica. Tais celulases possuem, obviamente. nm equilíbrio natural entre os seus conteúdos de celobiohidrolases e endoglucanases. Também como acima mencionado, em estirpes de T. longibrachiatum que ocorrem naturalmente, as CBHs podem compreender 58-70% em peso das proteínas celulases. A presente invenção é baseada num estudo para identificar que componentes das proteínas celulases são capazes de melhorar os benefícios nutricionais de rações à base de cereais tais como os que incluem cevada. Foi prestada atenção específica aos efeitos das enzimas individuais que constituem a celulase completa, e em particular as endoglucanases, na redução da viscosidade de β-(1-3) (1,4)-glucanos de ligações mistas solúveis da cevada. Isto é porque isto é conhecido como sendo um dos modos primários de acção da celulose total. A presente invenção foi feita como resultado desta pesquisa para identificar os componentes específicos do sistema da enzima celulase, e suas quantidades relativas, que melhoram vantajosamente a taxa de conversão do alimento (FCR) de uma ração à base de cereais e/ou aumentam a sua digestibilidade.

Na descrição e reivindicações que se seguem, o seguinte são definições de alguns dos termos técnicos que são empregues. "Celulase fúngica" significa uma composição derivada de fontes fúngicas ou microrganismos geneticamente modificados de modo a incorporarem e expressarem toda ou parte dos genes de celulase obtidos a partir de uma fonte fúngica. 0 termo "Trichoderma" refere-se a qualquer estirpe fúngica que é ou que foi previamente classificada como Trichoderma ou que é presentemente classificada como Trichoderma. Tais espécies 6

0 termo "EG" refere-se a qualquer endoglucanase, por exemplo, EGI, EGII, EGIII ou EGV produzidas por T. longibrachiatum, ou qualquer derivado de qualquer endoglucanase que possui actividade de endoglucanase.

Um "derivado" de EG inclui, por exemplo, EGI, EGII, EGIII e EGV de Trichoderma em que se faz a adição de um ou mais aminoácidos a qualquer ou ambas as extremidades C- ou N- da EG, a subsituição de um ou mais aminoácidos ao longo da EG, uma delecção de um ou mais aminoácidos no seu interior ou em qualquer das extremidades da EG, ou uma inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na EG de modo que a actividade de endoglucanase é retida na EG derivada. 0 termo "derivado" de EG inclui também os domínios nucleares das enzimas endoglucanases que têm a si ligados um ou mais aminoácidos das regiões ligantes. 0 termo "celulase truncada", como aqui utilizado, refere-se a uma proteína compreendendo uma região nuclear de celulase truncada de exocelobiohidrolase ou endoglucanase, por exemplo, EGI, EGII, EGV, CBHI e CBHII, ou derivados destas. A EGV está descrita em Molecular Microbiology, Vol.13, No.2 (1994) nas páginas 219-228. Como referido acima, crê-se que muitas enzimas celulases, tais como EGI, EGII e EGV sejam bifuncionais, no sentido em que contenham regiões ou domínios que estão dirigidos tanto para a actividade catalítica como hidrolítica em relação ao substrato celulose, e também à actividade não catalítica de ligação à celulose. Assim, uma celulase truncada é uma celulase que não possui o domínio de ligação da actividade de ligação à celulose. 7

Crê-se que o núcleo catalítico e o domínio de ligação à celulose de uma enzima de celulose actuem conjuntamente de uma maneira 3 jlwCITCj iGw j-Cu pujTã ãTGã j-£<« ΙΓ tiinã ÍÚi ÃCl x O x x 3 ò ci íCicnLc uc iiuiãS uc celulose numa ração contendo celulose. Também se crê que a actividade catalítica da celulase e a actividade de ligação à celulose possam ser identificadas como sendo específicas para regiões estruturais distintas, ou possam estar presentes na mesma região estrutural. Por exemplo, como indicado acima, muitas enzimas celulases, incluindo muitas daquelas de T. longibrachiatum são conhecidas por incorporar uma subunidade do domínio do núcleo catalítico que está ligado através de uma região ligante a uma subunidade do domínio de ligação à celulose. Contudo, crê-se que outras enzimas celulases possuam um domínio do núcleo catalítico que é estruturalmente integral para um domínio de ligação à celulose, p. ex., as duas regiões não estão separadas por um ligante e não representam entidades estruturais distintas. Numa tal enzima celulase, crê-se que um péptido específico ou grupo de resíduos de aminoácidos relacionados possam ser responsáveis pela actividade de ligação à celulose. De acordo com o referido, está dentro do âmbito da presente invenção que um tal domínio de ligação seria alterado de modo a reduzir a actividade de ligação à celulose da celulase através de, por exemplo, engenharia genética ou modificação química.

Um "derivado da celulase truncada" compreende um núcleo de celulase truncada, como aqui definido, em que pode existir uma adição ou delecção de um ou mais aminoácidos em qualquer uma das extremidades terminais C- ou N- da celulase truncada, ou uma substituição, inserção ou delecção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios ao longo da celulase truncada. Os derivados são interpretados para incluir mutantes que preservam o seu carácter como núcleo da celulase truncada, como definido abaixo. Também se pretende que o termo "derivado de uma celulase 8 truncada" inclua domínios do núcleo das enzimas exoglucanase ou endoglucanase que se ligaram a um ou mais aminoácidos das reaiões 1iganhpí.

Um derivado de celulase truncada refere-se ainda a uma proteína substancialmente semelhante em estrutura e actividade biológica a uma proteína do domínio do núcleo da celulase truncada, mas que foi modificada por engenharia genética de modo a conter uma sequência de aminoácidos modificada. Assim, desde que as duas proteínas possuam uma actividade semelhante, elas são consideradas "derivadas" na medida em que este termo é aqui utilizado mesmo que a estrutura primária de uma proteína não possua a sequência de aminoácidos idêntica aquela que se encontra na outra.

Está contemplado que um derivado da celulase truncada possa ser derivado de um fragmento de ADN que codifica para um domínio do núcleo catalítico truncado que contém ainda uma adição de um ou mais nucleótidos internamente ou na extremidade 5' ou 3' do fragmento de ADN, uma delecção de um ou mais nucleótidos internamente ou na extremidade 5' ou 3' do fragmento de ADN, ou uma substituição de um ou mais nucleótidos internamente ou na extremidade 5' ou 3' do fragmento de ADN em que a actividade funcional do domínio do núcleo catalítico (derivado da celulase truncada) está retida. Um tal fragmento de ADN ("variante do fragmento de ADN") compreendendo um núcleo catalítico de celulase pode ainda incluir uma sequência de ADN ligante ou de charneira ou porção desta que está ligada à sequência de ADN do núcleo ou domínio de ligação em qualquer das extremidades 5' ou 3' e em que a actividade funcional do domínio do núcleo da celulase truncada codificado (derivado da celulase truncada) está retida. 0 termo "núcleo da celulase truncada" ou "região da celulase 9 truncada" refere-se aqui a um péptido compreendendo o domínio do núcleo catalítico ou região da exocelobiohidrolase ou endoqlucanase, por exemplo, f.ct. eGII ou EGIII cu um derivado desta que é capaz de clivar enzimaticamente polímeros de celulose, incluindo, mas não estando limitado a polpa ou celulose embebida em ácido fosfórico. Contudo, um núcleo de celulose truncada não possuirá actividade de ligação à celulose atribuível a um domínio ou região de ligação à celulose. Um núcleo de celulase truncada é distinguível de uma celulase não truncada que, numa forma intacta, não possui domínio ou região de ligação à celulose. Um núcleo de celulase truncada pode incluir outras entidades que não incluem actividade de ligação à celulose atribuível ao domínio ou região de ligação à celulose. Por exemplo, a presença de um ligante ou charneira está especificamente contemplada. De forma semelhante, a ligação covalente de outra actividade enzimática ao núcleo da celulase truncada está também especificamente contemplada. 0 desempenho (ou actividade) de uma proteína contendo um núcleo catalítico truncado ou um derivado desta pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica. (Ver Wood, T.M. et al. em Methods in Enzymology, Vol. 160, Editores: Wood, W.A. e Kellogg, S.T., Academic Press, pp. 87-116, 1988). Por exemplo, essas actividades podem ser determinadas por hidrólise de celulose embebida em ácido fosfórico e/ou olissacáridos solúveis seguida por quantificação dos açúcares redutores libertados. Neste caso, os produtos de açúcares solúveis, libertados pela acção de domínios do núcleo de celulase celobiohidrolase ou endoglucanase, ou derivados destes, podem ser detectados através de análise por HPLC ou através da utilização de ensaios colorimétricos para medir açúcares redutores. Espera-se que estes domínios catalíticos ou derivados destes retenham pelo menos 10% da actividade exibida pela enzima intacta quando cada um é ensaiado sob condições semelhantes e doseado com base em 10

quantidades semelhantes de proteína do domínio catalítico. 0 termo "domínio de ligação à celulose" refere-se aqui a uma seouênci a Hp λιπί nnácidos da

UU O C ^uuVpiccnucuuu u domínio de ligação de uma endoglucanase, por exemplo, EGI ou EGII, que se liga não covalentemente a um polissacárido tal como a celulose. Crê-se que os domínios de ligação à celulose (CBDs) funcionam independentemente do núcleo catalítico da enzima endoglucanase para ligar a proteína à celulose. As endoglucanases truncadas utilizadas nesta invenção não possuem o CBD, mas incluem pelo menos o núcleo ou o domínio catalítico. 0 termo "região ligante" ou "região de charneira" refere-se à região peptídica curta que liga juntamente os dois domínios funcionais distintos das endoglucanases fúngicas, i.e., o domínio do núcleo e o domínio de ligação. Estes domínios em celulases de T. longibrachiatum estão ligados por um péptido rico em Ser, Thr e Pro.

Uma "sequência sinal" refere-se a qualquer sequência de aminoácidos ligada à porção N-terminal de uma proteína que facilita a secreção da forma madura da proteína para fora da célula. Esta definição de uma sequência sinal é uma definição funcional. A forma madura da proteína extracelular não possui a sequência sinal que é removida por clivagem durante o processo de secreção. 0 termo "célula hospedeira" significa tanto células como protoplastos originados a partir das células de Trichoderma. 0 termo "construção ou vector de ADN" (aqui utilizado indistintamente) refere-se a um vector que compreende um ou mais fragmentos de ADN ou fragmentos variantes de ADN que codificam para qualquer uma das endonucleases truncadas ou derivadas descritas acima. 11 0 termo "funcionalidade ligada a" significa que uma região reguladora, tal como um promotor, terminador, sinal de secreção ou região Amplificadora está ligada α um gene calj.uÍuicil e controla a expressão desse gene. 0 termo "celulase total" significa o sistema de celulase completo como produzido por um microrganismo que ocorre naturalmente.

Com base nas considerações acima, é um objectivo da presente invenção proporcionar aditivos de rações à base de enzima que melhorem a FCR e/ou aumentem a digestibilidade de uma ração à base de cereais.

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um aditivo de ração à base de enzima que compreende: (i) um ou mais de (a) EGI que não possui o domínio de ligação à celulose, (b) EGII que não possui o domínio de ligação à celulose, e (c) o núcleo da celulose activa de (a) ou de (b) em que: EGI refere-se à endoglucanase derivada de Trichoderma spp., possuindo um pH óptimo de cerca de 4,0-6,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 4,5-4,7 e um peso molecular de cerca de 47-49 kdaltons; e EGII refere-se à endoglucanase derivada de Trichoderma spp., possuindo um pH óptimo de cerca de 4,0-6,0, um pi de cerca de 5,5, e um peso molecular de cerca de 35 kdaltons; e (ii) 0-20% em peso, com base no conteúdo em proteínas celulase no aditivo, de uma celobiohidrolase.

Como mencionado acima, a celulase total de T. longibrachiatum (i.e. estirpes que ocorrem naturalmente) contêm tipicamente 58-70% em peso de celobiohidrolases ou mais, com base no peso total de enzimas que possuem actividade de celulase. O aditivo de 12 ração fornecido pela presente invenção pode ser obtido enriquecendo o conteúdo de endoglucanases produzidas por um

mirrnrnanÍsmn adeouado através endoglucanase purificada ou por adição de outros genes para sobreproduzir endoglucanase

Adicionalmente ou alternativamente, o conteúdo relativo de celobiohidrolases produzidas pelo microrganismo pode diminuir em comparação com a celulase total através de procedimentos de purificação ou modificando ou removendo os genes que codificam para celobiohidrolase. É particularmente preferido que o aditivo de ração não contenha celobiohidrolases, de modo a que o seu conteúdo no aditivo seja de 0% em peso.

Nesse aditivo, o veiculo à base de cereais pode ser trigo moído, milho ou soja moída. Além disso, o veículo pode ser um produto secundário de qualquer um desses materiais.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma ração para animais à base de cereais compreendendo pelo menos um cereal seleccionado de entre cevada, trigo, triticale, centeio e milho, e um aditivo de ração à base de enzima como descrito acima.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir o aditivo de ração à base de enzima acima descrito, compreendendo o passo de construir por manipulação genética uma estirpe geneticamente modificada do fungo Tríchoderma que produz as enzimas desejadas nas quantidades relativas apropriadas, cultivar a estirpe geneticamente modificada, e recolher o aditivo da cultura. A produção dessas endoglucanases estruturalmente modificadas por técnicas de engenharia genética está descrita em detalhe abaixo. As endoglucanases adequadas para utilização na presente invenção incluem as derivadas de Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride ou Trichoderma koningii. 13

Os componentes tipo endoglucanase podem não incluir componentes tradicionalmente classificados como endoglucanase utilizando

testes de srt i fSÍ£ CCmC CGpCiC uti (d/ para hidrolisar derivados da celulase solúveis tais como carboximetilcelulose (CMC), reduzindo assim a viscosidade das soluções contendo CMC, (b) para hidrolisar prontamente as formas hidratadas da celulose tais como celulose embebida em ácido fosfórico (p. ex. celulose de Walseth) hidrolisar menos rapidamente as formas mais altamente cristalinas de celulose (p. ex., Avicel, Solkafloc, etc.) . Por outro lado, crê-se que nem todos os componentes de endoglucanases, como definido por esses testes de actividade, aumentarão o valor nutricional das rações. De acordo com isto, é mais rigoroso para o objectivo aqui proposto definir os componentes tipo endoglucanase como as enzimas que possuem propriedades de aumento nutricional das rações em comparação com as possuídas pelos componentes de endoglucanase de Trichoderma longibrachiatum.

As celulases fúngicas podem conter mais do que um componente tipo endoglucanase. Os componentes diferentes geralmente possuem diferentes pontos isoeléctricos, diferentes pesos moleculares, diferentes graus de glicosilação, diferentes especificidades para o substrato, diferentes padrões de acção enzimática, etc. Os diferentes pontos isoeléctricos dos componentes permitem a sua separação através de cromatografia de troca iónica e afins. De facto, o isolamento dos componentes a partir de diferentes fontes é conhecido na técnica. Ver, por exemplo Bjork et al., Patente U.S. No. 5 120 463; Schulein et al., Pedido

Internacional WO 89/09259; Wood et al., Biochemístry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 31-52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research, Vol. 190, pp. 279-297 (1989); e

Schulein, Methods in Enzymology, Vol. 160, pp. 234-242 (1988). A revelação completa de cada uma destas referências é aqui incorporada por referência. 14 0 termo de*r ί vaiin

'celulase EGI" refere-se ao componente de endoglucanase

Hp T Τ' Ί ph/dWo Ύ*τη Λ 7 Λη/Ύ1 i *>f nr ----------- ----Ξ7 — ~~ ^ “*· ___! _ _ _i . ^aiat,u3ii^auu um pH óptimo de cerca de 4,0 até 6,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 4,5 a 4,7 e um peso molecular de cerca de 47 a 4 9 kdaltons. Preferencialmente, a celulase EGI é derivado ou de Trichoderma longibrachiatum ou de Trichoderma viride. A celulase EGI derivada de Trichoderma longibrachiatum possui um pH óptimo de cerca de 5,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 4,7 e um peso molecular de cerca de 47 até 4 9 kdaltons. A celulase EGI derivada de Trichoderma viride possui um pH óptimo de cerca de 5,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 5,3 e um peso molecular de cerca de 50 kdaltons.

Deve ser notado que a EGII foi anteriormente referida como "EGIII" por alguns autores mas a nomenclatura actual utiliza o termo EGII. Em qualquer dos casos a proteína EGII difere substancialmente da proteína EGIII no seu peso molecular, pi e pH óptimo. O termo "celulase EGII" refere-se ao componente de endoglucanase derivado de Trichoderma spp. caracterizado por um pH óptimo de cerca de 4,0 a 6,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 5,5, e um peso molecular de cerca de 35 kdaltons. Preferencialmente, a celulase EGII é derivada ou de Trichoderma longibrachiatum ou de Trichoderma viride.

0 termo "celulase EGIII" refere-se ao componente de endoglucanase derivado de Trichoderma spp. caracterizado por um pH óptimo de cerca de 5,0 a 7,0, um ponto isoeléctrico (pi) desde cerca de 7,2 a 8,0, e um peso molecular de cerca 23 a 28 kdaltons. Preferencialmente, a celulase EGIII é derivada ou de Trichoderma longibrachiatum ou de Trichoderma viride. A celulase EGIII derivada de Trichoderma longibrachiatum tem um pH óptimo de cerca 5,5 a 6,0, um ponto isoeléctrico de cerca de 7,4 e um peso molecular de cerca de 25 a 28 kdaltons. A celulase EGIII 15 derivada de Trichoderma viride tem um pH óptimo de cerca de 5,5, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 7,7, e um peso molecular de cerca de ?3.5 Mpltonc "Componentes tipo exocelobiohidrolase" ("componentes tipo CBH") referem-se a todos aqueles componentes de celulase que exibem propriedades de actividade de ração similares às de CBHI e de CBHII de Trichoderma longibrachiatum. A este respeito, quando utilizadas em combinação com componentes do tipo EG, os componentes do tipo CBHI e CBHII (como definidos acima) reduzem a eficiência de um suplemento de celulase para rações para animais em termos da taxa de conversão da ração e/ou digestibilidade da ração.

Esses componentes tipo exo-celobiohidrolase podem não incluir componentes tradicionalmente classificados como exocelobiohidrolases utilizando testes de actividade tais como os utilizados para caracterizar CBHI e CBHII de Trichoderma longibrachiatum. Por exemplo, esses componentes (a) são inibidos competitivamente pela celobiose (K; aproximadamente 1 mM); (b) são incapazes de hidrolisar em qualquer grau significativo celuloses substituídas, tais como carboximetilcelulose, etc., e (c) hidrolisam celulose embebida em ácido fosfórico e num grau menor celulose altamente cristalina. Por outro lado, crê-se que alguns componentes de celulase que são caracterizados como componentes CBH por esses testes de actividade, aumentam o valor nutricional das rações. De acordo com isto, crê-se que seja mais rigoroso para os objectivos aqui apresentados definir essas exocelobiohidrolases como componentes tipo EG porque esses componentes possuem propriedades funcionais semelhantes em utilizações animais comparáveis às de componentes de endoglucanase de Trichoderma longibrachiatum. "Componentes de β-glucosidade (BG)" refere-se aos componentes de 16

celulase que exibem actividade de BG, o que é o mesmo que dizer que esses componentes actuam a partir da extremidade não redutora da celobiose e outrco celc-diyusscicái.ido5 ("celobiose") e produzem glucose como o único produto. Os componentes de BG não adsorvem a ou reagem com polímeros de celulose. Além disso, esses componentes da BG são inibidos competitivamente pela glucose (Ki de aproximadamente 1 mM) . Embora num sentido restrito, os componentes da BG não sejam literalmente celulases porque não podem degradar celulose, esses componentes de BG são incluídos dentro da definição de um sistema de celulase porque essas enzimas facilitam a degradação total da celulose degradando ainda mais os produtos de degradação da celulose inibidora (particularmente celobiose) produzidos pela acção combinada de componentes de CBH e componentes EG. Sem a presença de componentes de BG, ocorre hidrólise moderada ou baixa de celulose cristalina. Os componentes de BG são frequentemente caracterizados pela utilização de substratos de arilo tais como β-D-glucósido de p-nitrofenol (PNPG) e por isso são frequentemente denominados glucosidases de arilo. Deve ser notado que nem todos os componentes de BG são glucosidases de arilo, na medida em que alguns não hidrolisam celobiose.

Está contemplado que a presença ou ausência de componentes de BG na composição de celulase podem ser utilizados para regular a actividade de quaisquer componentes CBH na composição.

Especificamente, porque a celobiose é produzida durante a degradação da celulose pelos componentes CBH, e porque as concentrações elevadas de celobiose são conhecidas por inibir a actividade de CBH, e ainda porque essa celobiose é hidrolisada em glucose por componentes de BG, a ausência de componentes de BG na composição da celulase "desligará" a actividade de CBH quando a concentração de celobiose atinge níveis inibidores. Também está contemplado que um ou mais aditivos (p. ex., 17

celobiose, glucose, etc.) podem ser adicionados à composição de celulase para "desligar" eficazmente, directa ou indirectamente, alguma ou todas as activídsdpc do tipo CBIII bem cumu uuLra actividade de CBH. Quando são empregues esses aditivos, a composição resultante é considerada como sendo uma composição adequada para utilização nesta invenção se a quantidade de aditivo for suficiente para baixar a actividade tipo CBH para niveis iguais ou inferiores aos níveis de actividade tipo CBH alcançados através da utilização das composições de celulase aqui descritas.

Por outro lado, uma composição de celulase contendo quantidades adicionadas de componentes de BG podem aumentar a hidrólise geral da celulose se o nível de celobiose originada pelos componentes de CBH se tornar restritivo dessa hidrólise geral na ausência de componentes de BG adicionados.

Os métodos para aumentar ou diminuir a quantidade de componentes de BG na composição de celulase são revelados em U.S. No. Série 07/807 028 arquivado em 10 de Dezembro de 1991, que é em parte uma continuação da U.S. No. Série 07/625 140, arquivada em 10 de Dezembro de 1990 (correspondendo a EP-A-0 562 003), sendo todas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

As celulases de fungos podem conter mais do que um componente de BG. As diferentes composições possuem geralmente diferentes pontos isoeléctricos que permitem a sua separação através de cromatografia de troca iónica e afins. Pode ser empregue quer um componente de BG simples ou uma combinação de componentes de BG.

Numa realização preferida, os componentes da endoglucanase adequados para utilização na presente invenção são os que exibem propriedades semelhantes às obtidas a partir de Trichoderma longibrachiatum, i.e., EGI e EGII. Os métodos para a sua 18 /7 preparação estão descritos em detalhe em WO 92/06209. É possível que outros componentes para além dos componentes tipo CBH presentes na composição celulasc total poaaom uriginar uma viscosidade indesejável do tracto gastrointestinal, aumento da taxa de conversão de rações e um ganho diminuído do peso do animal. Por isso, está contemplado que a utilização de endoglucanases enriquecidas, tais como EGI ou EGII, possam eliminar alguns ou todos os problemas que ocorrem quando é utilizada celulase total.

Verificou-se que a inclusão um aditivo alimentar enriquecido com uma endoglucanase numa dieta à base de cereais de um animal permite ao animal digerir mais eficientemente a dieta. Este é particularmente o caso das rações à base de cereais incluindo cevada em que a presença do aditivo alimentar acima melhora a taxa de conversão alimentar e/ou aumenta a digestibilidade da ração à base de cereais. As rações à base de cereais incluem geralmente pelo menos 25% em peso do cereal e preferencialmente pelo menos 35% em peso. Em adição a ou em vez de cevada, o cereal pode incluir um ou mais de trigo, triticale, centeio e milho.

Os aditivos de rações enriquecidos em endoglucanase proporcionados pela presente invenção também permitem que uma ração à base de cereal convencional seja modificada reduzindo o seu conteúdo em energia, e/ou proteína, e/ou aminoácidos enquanto se mantêm simultaneamente os mesmos níveis nutricionais de energia, proteína, e aminoácidos disponíveis para o animal. Isto significa que as quantidades dispendiosas de suplementos de energia e de proteína convencionalmente incluídos numa ração para animais podem ser reduzidos em comparação com as rações convencionais. Os suplementos de energia incluem gorduras. Os suplementos de proteína incluem farinha de peixe, farinha de trigo, soja, colza e canola. Isto resulta numa redução 19

significativa do custo por unidade de peso da ração para animais sem diminuir o seu valor nutricional. Alternativamente, ou mesmo adicionalmente, as auant-i de suplementes de aminoáuiuus podem ser reduzidas em comparação com rações convencionais que também podem resultar em poupanças financeiras significativas. 0 aditivo de rações enzimático de acordo com a presente invenção pode ser preparado através de um número variado de maneiras. Por exemplo, pode ser preparado simplesmente misturando diferentes enzimas possuindo as actividades apropriadas para produzir uma mistura enzimática. A mistura enzimática pode ser misturada directamente com a ração, ou mais convencionalmente impregnada num material transportador à base de cereal tal como farinha moida de trigo, milho ou soja. Pode ser também utilizado um subproduto de qualquer destes produtos. Um desses transportadores impregnados constitui um aditivo de ração enzimático de acordo com um terceiro aspecto da presente invenção.

Como uma alternativa, um transportador à base de cereal formado a partir de, p. ex. trigo ou milho moído, pode ser impregnado simultaneamente ou sequencialmente com enzimas possuindo as actividades apropriadas. Por exemplo, um transportador de trigo moído pode ser pulverizado com uma ou mais endoglucanases. Podem ser também incorporadas outras enzimas como apropriado. 0 material transportador impregnado com estas enzimas também constitui um aditivo de ração enzimático de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção. 0 aditivo de rações proporcionado pela presente invenção pode ser misturado directamente com a ração para animais, tal como um compreendendo cevada, para preparar a ração final. Alternativamente, o aditivo da ração pode ser misturado com um ou com mais entre outros aditivos de rações tais como um aditivo 20

de ração vitamínico, um aditivo de ração mineral e um aditivo de ração aminoacidico. 0 aditivo de ração resultante incluindo vários tipos diferentes de componentes pode ser énLãu misturado numa quantidade apropriada com a ração. A ração à base de cereal compreende preferencialmente 0,000001-0,1 g/kg de endoglucanases totais, mais preferencialmente 0,00001-0,01 g/kg e como preferência máxima 0,0001-0,001 g/kg. O aditivo de ração enzimático da presente invenção pode ser preparado por construção através de manipulação genética de um microrganismo hospedeiro, tal como o fungo Trichoderma, que produz as enzimas desejadas nas quantidades relativas apropriadas. Isto pode ser realizado por exemplo aumentando o número de cópias do gene que codifica para as endoglucanases e/ou utilizando um promotor forte adequado à frente de qualquer um dos genes de endoglucanase acima. Alternativamente ou adicionalmente a estirpe hospedeira pode ser removida de certas genes de celulase (p.ex. aqueles que codificam CBHI e/ou CBHII). Tais procedimentos são explicados completamente na revelação de WO 92/06209 no caso da transformação de T. reesei. O aditivo de ração enzimático proporcionado pela presente invenção pode também incluir outras enzimas tais como xilanase, protease, a-amilase, glucoamilase, lipase, pectinase, manase, a-galactosidase, α-arabinofuranosidase ou fitase. As enzimas possuindo as actividades desejadas podem por exemplo ser misturadas com as endoglucanases utilizadas na presente invenção quer antes da sua impregnação num transportador à base de cereal ou alternativamente estas enzimas podem ser impregnadas simultaneamente ou sequencialmente nesse transportador à base de cereal. O transportador é então por sua vez misturado com uma ração à base de cereal para preparar a ração final. É também possível formular o aditivo de ração enzimático como uma solução 21

I das actividades enzimáticas individuais e então misturar esta solução com um material de ração pré-formado como pastilhas ou como um puré.

Também é possível incluir o aditivo de ração enzimático na dieta do animal incorporando-o numa segunda (e diferente) ração ou em água para beber à qual o animal também tem acesso. De acordo com o referido, não é essencial que a mistura enzimática fornecida pela presente invenção esteja incorporada na própria comida à base de cereal, embora essa incorporação forme um aspecto particularmente preferido da presente invenção.

Numa realização preferida, a xilanase adicionada como uma enzima adicional é a xilanase de pi elevado e/ou a xilanase de pi baixo que se pode obter a partir de T. longibrachiatum que se pode obter através do método do Exemplo 22 de WO 92/06209. É particularmente preferido que a xilanase seja a xilanase de pi elevado.

De acordo com outra realização preferida, a protease adicionada como uma enzima adicional é uma subtilisina ou mutante desta derivada do género Bacillus. Estirpes adequadas de Bacillus incluem, mas não estão limitadas a, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis, B. subtilis, ou B. alcalophilus. A subtilisina pode também ser uma subtilisina mutante possuindo uma sequência de aminoácidos que não se encontra na natureza, mas que é derivada de uma subtilisina precursora através da inserção, delecção ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos diferentes na subtilisina precursora. Subtilisinas mutantes adequadas são descritas em EP-A-0 130 756 correspondendo a US-Re-34686 (incluindo mutações nas posições +155, +104, +222, +166, +133, +169, +189, +217, +156, +152); EP-A-0 251 446; WO 91/06637 etc. A subtilisina mais preferida é uma 22

subtilisina mutante que compreende uma substituição no resíduo de aminoácido na posição equivalente a tyr+217 da subtilisina de B. amyloliQuefaciens com lmirina

Os métodos para produzir essas subtilisinas mutantes estão descritos em detalhe nas publicações US-Re-34606 e EP-A-0 251 446.

As rações para animais à base de cereais incluindo o aditivo da presente invenção são adequadas para animais tais como porcos, ruminantes tais como ovelhas e vacas, e aves tais como galinhas, perus; gansos e patos. Contudo, as rações são particularmente adequadas para aves e porcos, e em particular para galinhas para churrasco.

Como mencionado anteriormente, o aditivo de ração enzimático de acordo com a presente invenção é preferencialmente obtido através do crescimento de uma estirpe geneticamente modificada do fungo Trichoderma. Isto é devido à sua bem conhecida capacidade para segregar celulases completas em grandes quantidades. Esta estirpe modificada pode ser derivada de T. longibrachiatum, T. reesei ou T. viride. O genoma dessas estirpes pode ser modificado de modo a sobre-expressar ou remover um ou mais dos componentes enzimáticos que constituem a celulase completa.

As culturas de microrganismos são cultivadas até uma fase estacionária, filtradas para remover as células e o sobrenadante restante é concentrado por ultrafiltração para obter a endoglucanase ou derivado desta.

Num aspecto particular do método acima, o meio utilizado para cultivar as células hospedeiras transformadas pode ser qualquer meio adequado para a produção de glucanase em Trichoderma. A 23 endoglucanase ou derivado desta é recuperada a partir do meio através de técnicas convencionais incluindo separação das células do meio por centrifugação, ou filtração, precipitação das proteínas no sobrenadante ou filtrado com sal, por exemplo, sulfato de amónio, seguido por procedimentos de cromatografia tais como cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade e afins.

Alternativamente, o produto da proteína final pode ser isolado e purificado através de ligação a um substrato de polissacárido ou matriz de anticorpo. Os anticorpos (policlonais ou monoclonais) podem ser produzidos contra péptidos do domínio do núcleo da endoglucanase, ou podem ser preparados péptidos sintéticos a partir de porções do domínio do núcleo e utilizados para produzir anticorpos policlonais.

Também está contemplado pela presente invenção que o fragmento de ADN ou variante do fragmento de ADN que codifica para a endoglucanase ou derivado pode ser funcionalmente ligado a uma sequência do promotor de fungos, por exemplo, o promotor do gene cbhl ou egll. Também está contemplada pela presente invenção a manipulação da estirpe de Trichoderma através de transformação, de modo a que o fragmento de ADN que codifica para uma endoglucanase ou derivado desta seja inserido no genoma. Também está contemplado que mais do que uma cópia de um fragmento de ADN de endoglucanase ou fragmento de ADN variante possa ser recombinado e inserido na estirpe.

Deve ser primeiro escolhido um marcador selectivo de modo a permitir a detecção do fungo transformado. Qualquer marcador selectivo que é expresso em Trichoderma pode ser utilizado na presente invenção de modo a que a sua presença nos transformantes não afecte materialmente as propriedades deste. 0 marcador selectivo pode ser um gene que codifique para um 24

produto que possa ser ensaiado. 0 marcador selectivo pode ser uma cópia funcional de um gene de Trichoderma que se não existir na estirpe hospede-i rs re><=nita na estirpe hospedeij.a que apresenta um fenótipo auxotrófico.

As estirpes hospedeiras utilizadas podem ser derivadas de Trichoderma que não possuem um gene ou genes, ou os possuem numa forma não funcional, que correspondem ao marcador selectivo escolhido. Por exemplo, se for escolhido o marcador selectivo de pyr4, então é utilizada uma estirpe derivada de pyr específica como um recipiente no procedimento de transformação. Outros exemplos de marcadores selectivos que podem ser utilizados na presente invenção incluem os genes de Trichoderma equivalentes aos genes de Aspergillus nidulans argB, trpC, niaD e afins. A estirpe receptora correspondente tem assim de ser uma estirpe derivada tal como uma argB', trpC', niaD' e afins. A estirpe é derivada de uma estirpe hospedeira de partida que é qualquer estirpe de Trichoderma. Contudo, é preferível utilizar uma estirpe de T. longihrachiatum sobre-produtora de celulase tal como RL-P37, descrita por Sheir-Neiss et al. em Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53, uma vez que esta estirpe segrega quantidades elevadas de enzimas celulases. Esta estirpe é então utilizada para produzir as estirpes derivadas utilizadas no processo de transformação. A estirpe derivada de Trichoderma pode ser preparada através de um número de técnicas conhecidas na técnica. Um exemplo é a produção de estirpes derivadas de pyr4' sujeitando as estirpes a ácido fluororótico (FOA). O gene pyr4 codifica para descarboxilase de 5'-monofosfato de orotidina, uma enzima necessária para a biossíntese da uridina. As estirpes com um gene pyr4 intacto crescem num meio sem uridina mas são sensíveis a ácido fluororótico. É possível seleccionar estirpes derivadas 25

pyr4' que não possuem uma enzima descarboxilase de monofosfato de orotidina funcional e necessitam de uridina para crescer através da seleccão para resi sfpnri 5 ?_ FOA. Utilizando a técnica de selecção com FOA, é também possível obter estirpes que requerem uridina que não possuem uma transferase de pirofosforribosilo de orotato. É possível transformar estas células com uma cópia funcional do gene que codifica para esta enzima (Berges e Narreau, 1991, Curr. Genet. 19 pp359-365). Uma vez que é fácil seleccionar estirpes derivadas utilizando a técnica de resistência a FOA na presente invenção, é preferível utilizar o gene pyr4 como um marcador selectivo.

Numa realização preferida da presente invenção, as estirpes de células hospedeiras de Trichoderma são destituídas de um ou mais genes de celobiohidrolase antes da introdução de uma construção de ADN ou plasmídeo contendo o fragmento de ADN que codifica para a endoglucanase de interesse. É preferível expressar uma endoglucanase, derivada desta ou derivada do domínio da endoglucanase ligado covalentemente num hospedeiro que não possui um ou mais genes de celobiohidrolase de modo a simplificar a identificação e procedimentos de purificação subsequentes. Qualquer gene de Trichoderma que foi clonado pode ser removido tal como cbhl ou cbh2. 0 gene desejado que se quer remover do transformante é inserido num plasmídeo por métodos conhecidos na técnica. Este plasmídeo é seleccionado de modo a que nele estejam presentes sítios únicos para enzimas de restrição para permitir que o fragmento de ADN de Trichoderma seja subsequentemente removido como um pedaço linear único. 0 plasmídeo contendo o gene a ser removido ou interrompido é então cortado no sítio(s) da(s) enzima(s) de restrição apropriado(s), internamente em relação à região codificante, a sequência que codifica para o gene ou parte desta pode ser removida dele e o marcador selectivo (p. ex. pyr 4) 26

inserido. As sequências de ADN flanqueadoras do locus do gene a ser removido ou interrompido, preferencialmente entre cerca de 0,5 a 2,0 kb, permanecem em qnslmipr hos lados dc gcnc marcador selectivo.

Um fragmento de ADN único contendo a construção de delecção é então isolado a partir do plasmídeo e utilizado para transformar o hospedeiro de Trichoderma pyr~ apropriado. Os transformantes são seleccionados com base na sua capacidade para expressarem o produto do gene pyr4 e assim complementar a auxotrofia para a uridina da estirpe hospedeira. A análise de transferência de Southern é então realizada nos transformantes resultantes para identificar e confirmar um processo de integração por cruzamento duplo que substitui parte ou toda a região codificante do gene a ser removido com os marcadores selectivos pyr4.

Embora sejam descritos acima vectores plasmídicos específicos, a presente invenção não está limitada à produção desses vectores. Vários genes podem ser removidos e substituídos na estirpe de Trichoderma utilizando as técnicas acima. Podem ser utilizados quaisquer marcadores selectivos disponíveis, como discutido acima. Potencialmente, qualquer gene de Trichoderma que tenha sido clonado, e por isso identificado, pode ser removido do genoma utilizando a estratégia acima descrita. O vector de expressão da presente invenção transportando o fragmento de ADN inserido ou variante de fragmento de ADN que codifica para a endoglucanase ou derivado desta da presente invenção pode ser qualquer vector que seja capaz de se replicar autonomamente num dado organismo hospedeiro, tipicamente um plasmídeo. Em realizações preferidas, são contemplados dois tipos de vectores de expressão para obter a expressão de genes ou versões truncadas destes. O primeiro contém sequências de ADN nas quais as sequências do promotor, da região codificante do 27

gene, e do terminador têm todas origem no gene a ser expresso. Se for necessário um gene truncado, isso é obtido através da remoção das sequências de ADN indesejáveis (que codificam pare domínios indesejáveis) para deixar que o domínio seja expresso sob o controlo das suas próprias sequências reguladoras de transcrição e tradução. Está também contido no vector um marcador selectivo que permite a selecção para a integração no vector de cópias múltiplas das novas sequências génicas.

Por exemplo, uma construção de ADN que pode ser denominada pEGID3'pyr contém o domínio do núcleo da celulase EGI sob o controlo das sequências do promotor, terminador e de sinal de EGI. A extremidade 3' na região que codifica para EGI contendo o domínio de ligação à celulose foi removido. 0 plasmídeo também contém o gene pyr4 para o objectivo da selecção. 0 segundo tipo de vector de expressão é pré-montado e contém sequências exigidas para transcrição de alto nível e um marcador selectivo. Está contemplado que a região de codificação para um gene ou parte deste pode ser inserida neste vector de expressão geral de modo que esteja sob o controlo de transcrição das cassetes de sequências de promotor e terminador.

Por exemplo, pTEX é uma destes vectores de expressão geral. Genes ou parte destes podem ser inseridos a jusante do promotor forte de CBHI.

No vector, a sequência de ADN que codifica a endoglucanase deve ser operacionalmente ligada a sequências de transcrição e de tradução, isto é, uma sequência de promotor adequada e uma sequência sinal na leitura de grelha do gene estrutural. 0 promotor pode ser a sequência de ADN que apresenta actividade de transcrição na célula hospedeira e pode ser derivada de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas na célula 28

hospedeira. O péptido sinal proporciona uma expressão extracelular de endoglucanase ou derivados destes. A sequência de ADN sinal é preferenr.í λ 1 mpnte a sequência sinal nsturalmente associada com o gene truncado a ser expresso, no entanto, a sequência sinal de qualquer endoglucanase está contemplada na presente invenção.

Os procedimentos utilizados para ligar as sequências de ADN que codificam para as endoglucanases truncadas ou derivados desta com o promotor, e inserção em vectores adequados contendo a informação necessária para replicação na célula hospedeira são bem conhecidos na técnica. 0 vector ou construção de ADN acima descrito pode ser introduzidos na célula hospedeira de acordo com técnicas conhecidas tais como transformação, transfecção, microinjecção, microporação, bombardeamento biolistico e afins.

Numa realização preferida da presente invenção, a estirpe modificada é derivada de Trichoderma sp. contendo genes removidos ou interrompidos de CBHI e/ou CBHII sendo assim incapazes de produzir celobiohidrolase cataliticamente activa. As enzimas celulases produzidas por tal organismo serão enriquecidas em endoglucanases e incluem não mais do que 20% de celobiohidrolases com base no peso combinado das proteínas celulases que produz. É particularmente preferido que a estirpe modificada seja incapaz de produzir CBHI cataliticamente activa na medida em que esta enzima forma a maior proporção de qualquer componente da celulase total de Trichoderma sp. A estirpe modificada contém adicionalmente ADN recombinante permitindo a expressão e secreção de núcleos catalíticos truncados de EGI ou EGII. Embora não querendo estar presos à teoria, crê-se que a presença de um domínio de ligação à celulose numa celulase possa ser responsável por certas 29

propriedades indesejáveis observadas quando os animais são alimentados com rações suplementadas com celulase, por exemplo, viscosidade gastrointestinal aumentada. n0 mesmo modo, por remoção do domínio de ligação à celulose e retendo um núcleo de celulase intacto, é possível limitar ou eliminar estas propriedades.

Antes de descrever os métodos de produção de tais endoglucanases truncadas, o que se segue proporciona uma descrição detalhada das figuras que é necessária para a compreensão destas técnicas de produção. A Figura 1 apresenta o ADN genómico e a sequência de aminoácidos de EGI. A sequência sinal começa no par de bases 113 e termina no par de bases 178 (Seq ID No. 13) . 0 domínio catalítico nuclear começa no par de bases 179 até ao 882 do exão um, e do par de bases 963 ao par de bases 1379 do segundo exão (Seq ID No.5). A região ligante começa no par de bases 1380 e termina no par de bases 1460 (Seq ID No. 9) . 0 domínio de ligação à celulose começa no par de bases 1461 e termina no par de bases 1616 (Seq ID No. 1) . As Seq ID Nos. 14, 6, 10 e 2 representam a sequência de aminoácidos da sequência sinal de EGI, domínio do núcleo catalítico, região ligante e domínio de ligação, respectivamente. A Figura 2 apresenta o ADN genómico e a sequência de aminoácidos de EGII. A sequência sinal começa no par de bases 262 e termina no par de bases 324 (Seq. ID No. 15) . O domínio de ligação à celulose começa no par de bases 325 e termina no par de bases 432 (Seq ID No. 3) . A região ligante começa no par de bases 433 e termina no par de bases 534 (Seq ID No. 11) . O domínio do núcleo catalítico começa no par de bases 535 até ao par de bases 590 no exão um, e no par de bases 765 até ao par de bases 1689 no exão dois (Seq ID No. 7) . As Seq ID Nos 16, 4, 12 e 8 30

representam a sequência de aminoácidos da sequência sinal de EGII, domínio de ligação, região ligante e domínio do núcleo catalítico, respectivamente. A Figura 3 apresenta o ADN genómico e a sequência de aminoácidos de EGIII. A sequência sinal começa no par de bases 151 e termina no par de bases 198 (Seq. ID No. 19) . 0 domínio do núcleo catalítico começa no par de bases 199 até ao par de bases 557 no exão um, no par de bases 613 até ao par de bases 833 no exão dois e do par de bases 900 até ao par de bases 973 no exão três (Seq ID No. 17) . As Seq ID Nos 20 e 18 representam a sequência de aminoácidos da sequência sinal de EGIII e domínio do núcleo catalítico, respectivamente. A Figura 4 ilustra a construção do vector de expressão do domínio do núcleo catalítico de EGI (Seq ID No. 21). A Figura 5 é um gráfico demonstrando a actividade de redução de viscosidade inicial da celulase total e várias preparações enriquecidas em endoglucanases a diferentes pH.

Como acima mencionado, as uma ou mais endoglucanases presentes no aditivo alimentar de enzima da presente invenção são derivadas de EG truncadas que não possuem o domínio de ligação à celulose (que podem ser denominadas núcleo EGI) e/ou EGII não possuindo também o domínio de ligação à celulose. Estes derivados são preparados por métodos recombinantes por transformação de uma célula hospedeira, uma construção de ADN compreendendo pelo menos um fragmento de ADN codificando uma porção ou toda a região nuclear das endoglucanases, por exemplo, EGI ou EGII funcionalmente ligadas a um promotor, cultivando a célula hospedeira para expressar a endoglucanase truncada, derivado de endoglucanase truncada ou derivados de interesse de domínios de endoglucanase truncada covalentemente ligados. A 31

endoglucanase truncada resultante pode ser utilizada uma vez separada das células de microrganismos como um aditivo alimentar. Como uma alternativa, a endoglucor.ccc truncada, ou derivado desta pode adicionalmente ser purificada até uma homogeneidade substancial antes da utilização.

Os seguintes Exemplos de Referência 1 e 2 são fornecidos de modo a ilustrar técnicas para a produção de composições de enzimas enriquecidas em endoglucanase por transformação e cultivo de microrganismos geneticamente modificados.

Exemplo de Referência 1

Clonagem e Expressão do Domínio do Núcleo de EGI Utilizando o Seu Próprio Promotor, Terminador e Sequência Sinal.

Parte 1. Clonagem. 0 gene completo egll utilizado na construção do plasmídeo de expressão do domínio do núcleo catalítico de EGI, pEGlD3'pyr, foi obtido a partir do plasmídeo pUC218::EGl. (Ver FIG. 4). A região 3' do terminador de egll foi ligada a pUC218 (Korman, D. et al., Curr Genet 17:203-212, 1990) como um fragmento Bsml-

EcoRI (o sítio Bsml está a 4 6 pb 3' do codão de terminação de egll) em conjunto com um ligante sintético concebido para substituir o domínio de ligação à celulose de egll com um codão de terminação e continua com as primeiras 4 6 pb da sequência de terminação de egll. O plasmídeo resultante, pEGlT, foi digerido com HindIII e Bsml e o fragmento do vector com o terminador de egll foi isolado do digerido por electroforese em gel de agarose seguida por electroeluição. A sequência do promotor do gene egll e o domínio do núcleo de egll foram isolados de pUC218::EGl como um fragmento tfindlII-Sstl de 2,3 kb e ligada ao mesmo fragmento ligante sintético e o pEGlT digerido com HindiII-SsmI para 32

Cc formar pEGlD3'. 0 resultado liquido destas oper^r-n^·? é substituir o intrão 3' e o domínio de ligação à celulose de egll com os oligonucleótidos sintéticos de 53 e 55 nt. Isto coloca um codão de terminação TAG após a serina 415 e daí em diante continua o terminador de egll até ao sítio BsmI.

Seguidamente, o marcador selectivo de T. logibrachiatum, pyr4 foi obtido a partir de um clone anterior p219M (Smith et al. , 1991), como um fragmento isolado EcoRI-HindIII de 1,6 kb. Este foi incorporado no plasmídeo de expressão final, pEGlD3'pyr, numa ligação com três elementos com o plasmídeo pUC18 digerido com EcoRI e desfosforilado utilizando fosfatase alcalina de vitela e um fragmento EindIII-EcoRI contendo o domínio do núcleo de egll de pEGlD3'.

Parte 2. Transformação e Expressão.

Foi realizada uma · preparação de ADN em larga escala de pEGlD3'pyr e deste foi isolado o fragmento EcoRI contendo o domínio do núcleo de egll e o gene pyr4, através de electroforese em gel preparativa. 0 fragmento isolado foi transformado por introdução numa estirpe (lA52pyrl3) na qual os genes cbhl, cbh2, egll e egl2 tinham sido removidos e que era pyr4' (descrita em WO 92/06209) e foram identificados os transformantes estáveis.

Para seleccionar que transformantes expressam o domínio do núcleo de egll os transformantes foram cultivados em frascos de cultura em condições que favorecem a indução dos genes da celulase (meio de Vogel + lactose a 1%) . Após 4-5 dias de cultura, foi concentrada a proteína dos sobrenadantes e 1) aplicada em géis de poliacrilamida na presença de SDS antes da 33 detecção do domínio do núcleo de EGI através de análise de Western utilizando anticorpos policlonais anti-EGI ou 2) os •Ç />» v —» wi Ο- \»/ -L» νΛΙΙΙ

V^IIOUXOUUO uxl‘è^Laiucii l.c utilizando carboximetilcelulose Azul Brilhante de Remazol (RBB) como um substrato específico para endoglucanase e os resultados foram comparados com a estirpe mãe (1A52) como um controlo. Os transformantes candidatos foram identificados como produzindo possivelmente uma proteína do domínio do núcleo de EGI truncada. 0 ADN genómico e o ARNm total foram isolados a partir destas estirpes após a cultura em meio de Vogel + lactose a 1% e as experiências de transferência de Southern e de Northern realizadas utilizando um fragmento de ADN isolado contendo apenas o domínio do núcleo de egll. estas experiências demonstraram que podiam ser isolados transformantes possuindo uma cópia da cassete de expressão do domínio do núcleo de egll integrada no genoma de 1A52 e que estes mesmos transformantes produzem ARNm do domínio do núcleo de egll.

Foi cultivado um transformante utilizando meios adequados para a produção de celulase em Trichoderma bem conhecido na técnica, que foi suplementado com lactose (Warzymoda, M. et ai., 1984 Patente Francesa No. 2555603) num fermentador de 14 L. 0 caldo resultante foi concentrado e as proteínas aí contidas foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e a proteína do domínio do núcleo de EGI foi identificada por análise de Western. Foi subsequentemente estimado que a concentração de proteína do sobrenadante da fermentação foi de cerca de 5-6 g/L dos quais aproximadamente 1,7-4,4 g/L era domínio do núcleo de EGI com base na actividade da CMCase. Este valor foi baseado numa média de várias fermentações do núcleo de EGI que foram realizadas.

De um modo semelhante, qualquer outra endoglucanase quer seja truncada ou não ou um derivado desta pode ser produzida através 34 -*7 de procedimentos semelhantes aos discutidos acima. Assim, a produção de EGI pode ser alcançada através da utilização de técnicas semelhantes excentn λ Helecçãe do domínio de liyayãvj à celulose ser omitido. Podem ser utilizadas técnicas correspondentes para produzir EGII, EGIII, e EGII completas, a partir das quais o domínio de ligação à celulose é omitido.

Exemplo de Referência 2.

Purificação dos núcleos catalíticos de EGI e EGII Parte 1. Núcleo catalítico de EGI 0 núcleo de EGI foi purificado do seguinte modo. 0 caldo concentrado (UF) foi diluído para 14 mg/mL de Acetato de Na a 23 mM pH 5,0. Foram adicionadas duzentas gramas de gel de celulose de avicel (FMC Bioproducts, Tipo PH-101) ao caldo de núcleo de EGI diluído e misturadas à temperatura ambiente durante quarenta e cinco minutos. A avicel foi removida do caldo por centrifugação, resultando numa solução de núcleo de EGI enriquecida. Esta solução foi então sujeita a troca de tampão para TES a 10 mM pH 7,5 utilizando um concentrador de células com agitação da Amicon com uma membrana PM 10 (membranas de ultrafiltração diaflo, Amicon Cat # 13132MEM 5468A). A amostra de núcleo de EGI foi então carregada numa coluna de permuta aniónica (Q-sepharose de caudal rápido, Pharmacia Cat # 17-0510-01) e eluída num gradiente de sal de NaCl de 0 a 0,5 M em TES a 10 mM pH 7,5. As fracções que continham o núcleo de EGI foram combinadas e concentradas utilizando a célula com agitação do concentrador Amicon mencionada acima.

Parte 2. Núcleo catalítico de EGII

Está contemplado que a purificação do núcleo catalítico da EGII 35 é semelhante à da celulase EGII devido às suas propriedades bioquímicas semelhantes. 0 pi teórico do núcleo de EGII é menor em mais do que metade de uma uniH^Hp de pH em relação ao da EGII. Também, o núcleo da EGII é aproximadamente 80% do peso molecular da EGII. Por isso, o seguinte protocolo de purificação é baseado na purificação de EGII. 0 método pode envolver a filtração do caldo concentrado por UF através de diatomitos e adição de (NH4)2S04 para levar a solução até 1 M de (NH4)2S04. Esta solução pode então ser carregada numa coluna hidrofóbica (fenil-sepharose de caudal rápido, Pharmacia, cat #17-0965-02) e a EGII pode ser eluída em descontínuo com (NH4)2S04 a 0,15 M. As fraeções contendo o núcleo de EGII podem então ser sujeitas a troca de tampão para citrato-f osfato pH 7, 0,18 mOhm. Este material pode então ser carregado numa coluna de permuta aniónica (Q-sepharose de caudal rápido, Pharmacia, cat. #17-0510-01) equilibrada no tampão citrato-fosfato acima. Espera-se que o núcleo de EGII não se ligue à coluna e por isso seja recolhido no fluxo de passagem. A presente invenção será explicada em maior detalhe ainda através dos seguintes Exemplo de Referência 3 e Exemplo 1. No Exemplo 1, faz-se referência a unidades de actividade de β-glucanase. Esta actividade é medida através do seguinte ensaio.

Uma unidade de actividade de β-glucanase é a quantidade de enzima que liberta uma μιηοΐ de açúcares redutores (expressa como equivalentes de glucose) a partir do substrato num minuto sob as condições descritas.

Reagentes 1. Substrato de β-glucano a 1,0% (p/v)

Humedeça 1,0 g de β-(1,3) (1,4)-glucano de ligações mistas (Biocon Biochemicals Ltd.) com 10 mL de etanol. Adicione cerca de 80 mL de água 36

destilada e aqueça até à fervura. Continue a fervura com agitação vigorosa até que o β-glucano dissolvido c ocja obtida uma solução turva. Arrefeça a solução turva até à temperatura ambiente agitando continuamente e ajuste a concentração de β-glucano para 1,0% (p/p) através da adição de água destilada. Filtre através de um papel de filtro de fibra de vidro. 0 substrato pode ser utilizado imediatamente. 0 substrato é utilizável durante dois dias se armazenado numa câmara fria. 2. Tampão acetato de sódio a 0,1 M, pH 5,0 A. Dissolva 8,2 g de acetato de sódio anidro em água destilada e encha até 1000 mL com água destilada. B. Dissolva 6,0 g de ácido acético glacial em água destilada e encha até 1000 mL com água destilada. Ajuste o pH da solução A para 5,0 com solução B. 3. Reagente de ácido dinitrossalicilico (DNS)

Suspenda 20,0 g de ácido 3,5-dinitrossalicilico em cerca de 800 mL de água destilada. Adicione gradualmente 300 mL de solução de hidróxido de sódio (32,0 g de NaOH em 300 mL de água destilada) mantendo uma agitação constante. Aqueça a suspensão num banho de água (a temperatura não pode exceder +48°C) mantendo a agitação até que a solução clarifique. Adicione gradualmente 600 g de tartarato de sódio e potássio. Aqueça a solução (a temperatura não pode exceder +48°C) se necessário 37

até que a solução clarifique.

Encha até 2000 mL com água destilada e filtre através de nm filtro de vidre grosseiro sinterizado.

Armazene num frasco escuro à temperatura ambiente. 0 reagente é estável durante um máximo de 6 meses.

Procedimento 1. Amostra de enzima

Equilibre 1 mL de diluição de enzima (em tampão acetato de sódio a 0,1 M, pH 5,0) a +30°C. Adicione 1 mL de substrato de β-glucano, agite e incube a +30°C durante exactamente 10 minutos. Adicione 3 mL de reagente de DNS, agite e ferva a mistura de reacção durante exactamente 5 minutos. Arrefeça a mistura de reacção num banho de água fria até à temperatura ambiente e meça a absorvência a 540 nm contra água destilada. 2. Branco para a enzima

Incube 1 mL de substrato de β-glucano a +30°C durante 10 minutos. Adicione 3 mL de solução de DNS e agite. Adicione 1 mL de diluição de enzima (em tampão de acetato de sódio a 0,1 M, pH 5,0) e agite. Ferva a mistura durante exactamente 5 minutos. Arrefeça a mistura de reacção num banho de água fria até à temperatura ambiente e meça a absorvência a 540 nm contra água destilada. A diferença de absorvência entre a amostra de enzima e o branco para a enzima deve ser de 0,3-0,5. 38

~7 3. Curva padrão

Prepare soluções padrão a partir de glucose anidra e água destilada. A concentração de glucose nos padrões deve ser de 0,1-0,6 mg/mL. Pipete 1 mL de solução padrão de glucose, 1 mL de água destilada e 3 mL de reagente de DNS para um tubo de ensaio. Misture e ferva durante exactamente 5 minutos. Arrefeça num banho de água fria até à temperatura ambiente e meça a absorvência a 540 nm contra o branco padrão. No branco padrão, a solução de glucose é substituída por 1 mL de água destilada. Nos restantes casos o branco padrão é tratado como padrão de glucose.

Represente num gráfico a concentração de glucose como uma função da absorvência. É preparada uma curva padrão nova para cada reagente de DNS novo. Cálculos A actividade de β-glucanase da amostra é calculada de acordo com a seguinte equação:

Actividade (U/g) = ([A(X) - A(O)] x k + C·) x 1000 x Df PMgXu x t em que: A (X) A (O) k C· 1000 Df absorvência da amostra de enzima absorvência do branco da enzima o declive da curva padrão a intercepção da curva padrão da glucose factor, mmol -> pmol factor de diluição (mL/g) 39 PMgiu = peso molecular da glucose (180,16 mg/mmol) t = temoo de reerr-Sn (in minutos) 0 Exemplo de Referência 3 faz referência à medição da actividade de redução da viscosidade da β-glucanase. Esta actividade é medida através do seguinte ensaio.

Principio A β-glucanase catalisa a hidrólise de β-glucano que resulta na redução da viscosidade da solução de β-glucano. A viscosidade especifica recíproca como uma função do tempo é uma função linear no momento inicial da reacção. Utilizando o declive da curva linear pode ser determinada a actividade da β-glucanase. A viscosidade específica recíproca é determinada utilizando um viscosímetro capilar. Instrumentos Viscosímetro capilar Ostwald (Brand, No. 11, 75- 100 seg)

Banho de água controlado a 30°C

Agitador magnético

Cronómetro

Filtros de vidro sinterizado n° 3 e 4 Agitador magnético com placa de aquecimento

Reagentes 1. Tampão acetato a 0,5 M, pH 4,0

Dilua 30 g de ácido acético glacial (BDH AnalaR 10001) em 900 mL de água destilada. Ajuste o pH para 4,0 com 2,5 g de NaOH (Merck 6498). Encha com água destilada para 1000 mL. 2. Tampão acetato a 0,05 M, pH 4,0

Dilua 100 mL de tampão acetato a 0,5 M, pH 4,0 40

de água destilada. Ajuste o pH se para 4,0 com NaOH a 1 M ou ácido A « A Π P A A A a j A 1 A Λ Λ - · ^ · maawixua x kj \j \j itt-Li vjuiu dy ud

Filtre através de um filtro de vidro n° 4. 3. Solução de β-glucano

Pese 1,0 g de β-(1,3)(1,4)-glucano de ligação mista (Biocon Biochemicals) numa proveta tarada. Adicione aprox. 6 mL de etanol e misture com uma vareta de mistura metálica até que o β-glucano de ligação mista fique totalmente molhado. Adicione aprox. 80 mL de água destilada, misture com agitador magnético e aqueça a solução até à fervura. Continue a ferver até que o β-glucano de ligação mista tenha dissolvido totalmente. Assegure que não existe material nas paredes da proveta. Arrefeça a solução até à temperatura ambiente mantendo uma agitação constante. Adicione 10 mL de tampão acetato a 0,5 M, pH 4,0. Se necessário ajuste o pH para 4,0 com NaOH a 1 M ou ácido acético glacial. Adicione água destilada até que o peso total da solução de substrato seja 100 g. Filtre com filtro de vidro sinterizado n° 3. Armazene a solução de substrato durante um máximo de dois dias a +4°C.

Procedimento em 800 mL necessário destilada. sinterizado 1. Determinação de viscosidade reciproca específica

Antes da determinação da actividade assegure que o viscosímetro está limpo através de lavagem com água destilada e acetona (nesta sequência). Seque o viscosímetro removendo a acetona com ar 41

solução de substrato e ser equmoraaas a ju-t 15 minutos antes da comprimido ou em vácuo Todas as amostras, viscosimetro tem que durante pelo menos determinação. A viscosidade especifica reciproca segue a equação 1 dT0 1/μ3ρ = -------------- (Equação 1) dTs - dT0 em que 1/μ3ρ = viscosidade especifica reciproca dT0 = tempo de queda do tampão acetato (em segundos) dTs = tempo de queda da solução da amostra (em segundos) 0 tempo de queda para soluções segue a equação 2 dTi = T2 - Ti - h (Equação 2) em que dTi = tempo de queda das soluções T2 - Ti = tempo utilizado pela solução para cair entre as marcas superior e inferior no capilar (em segundos) h = Factor Hagenbach

Factores Hagenbach: 42

Tempo de queda (dTj.) h s < 54,2 1,0 54, 3 - 57,3 0,9 57, 4 - 60, 5 0,8 60, 6 - 65, 5 0,7 65, 6 - 70, 8 0,6 70, 9 - 78,5 0,5 78, 6 - CO 00 0,4 89, 0 - 105 0,3 105 - 135 0,2 135 - 240 0,1 > 240 0

Inicie a determinação do tempo de queda com um viscosimetro limpo e seco bombeando 7,5 mL de solução para o capilar de modo a que a superfície da solução exceda a marca superior do capilar. Determine com um cronómetro o tempo necessário para a solução cair entre as marcas superior e inferior no capilar. 2. Determinação do tempo de queda para o tampão acetato

Determine o tempo de queda (dTo) para o tampão acetato a 0,05 M, pH 4,0, como descrito acima sempre que é determinada a actividade da β-glucanase. 3. Ajuste da solução de β-glucano 43

A viscosidade especifica reciproca na hidrólise de [3-glucano tem que ser de 0,13. A viscosidade na solução de β-glucano varia de lote para lote e isso tem que ser compensado fazendo variar a razão entre a solução de β-glucano e a amostra de modo a que a viscosidade inicial esteja correcta.

Produza 5 misturas diferentes de β-glucano/tampão acetato a 0,05 M, pH 4,0 pipetando β-glucano (A) 5,0-6,5 mL e respectivamente 2,5-1,0 mL de tampão acetato a 0,05 M, pH 4,0, para perfazer o volume total de cada mistura para 7,5 mL. Determine as viscosidades destas soluções e calcule as viscosidades especificas reciprocas.

Represente graficamente a viscosidade especifica como uma função de β-glucano. A partir do gráfico determine a quantidade de β-glucano que corresponde ao valor de viscosidade especifica reciproca de 0,13. Esta quantidade de β-glucano será utilizada posteriormente em todas as determinações de actividade de β-glucanase com a solução de β-glucano. A viscosidade inicial da solução de β-glucano tem de ser determinada sempre que a actividade da β-glucanase seja determinada. 4. Determinação da actividade da β-glucanase Pipete o volume de β-glucano (A) determinado como 44

descrito acima para o tubo de ensaio e equilibre a 30°C durante pelo menos 15 minutos. Adicione V mL (v = 7,5 mu - h) de amostra do onzima diluída em tampão acetato a 0,05 M, pH 4,0 e equilibrado a 30°C durante pelo menos 15 minutos. Pare o cronómetro. Misture a solução correctamente e transfira-a para o viscosimetro. Determine o tempo de queda dTs 4-5 vezes durante 20-30 minutos a partir da mistura das soluções.

As determinações têm que ser realizadas a partir de pelo menos duas diluições diferentes e com pelo menos 3 determinações em paralelo a partir de cada diluição. A diluição correcta da amostra depende do produto da mistura enzimática e da alimentação final a serem ensaiados. As diluições são indicadas separadamente. Para misturas enzimáticas o factor de diluição total é tipicamente de 1/2000-1/15000 e para alimentações finais de 1/5-1/20. Cálculos

Calcule as viscosidades especificas reciprocas de acordo com a equação 1. Represente graficamente a viscosidade reciproca especifica como uma função do tempo de hidrólise (em segundos). A actividade da β-glucanase é determinada como um aumento da viscosidade reciproca (IRV) num minuto, equação 3. k x D x 60

Actividade de β-glucanase (Equação 3) (IRVU/g) = ----------

V em que k = declive da curva D = factor de diluição total 60 = factor de conversão, s -> min 45

V = volume da amostra

Bibliografia The Institute of Brewing (1979) J. Inst. Brew, 85, 92-94.

Analyse av β-glukanaseaktivitet ved viskosimetrisk metode, Norges Veterinaerhogskole.

Exemplo de Referência 3 0 primeiro ensaio que foi realizado foi a comparação da eficácia in vitro de várias celulases diferentes possuindo um conteúdo enriquecido em endoglucanases em comparação com a celulase total. Assim, foram preparadas sete preparações de enzimas diferentes, a primeira a partir de T. longibrachiatum que ocorre naturalmente e as segunda-sétima a partir de estirpes geneticamente modificadas destas de acordo com a seguinte Tabela 1:

Tabela 1

Preparação Enzimática Genotipo da Estirpe Celulase Total EGI+ EGII+ EGIII+ CBHI* CHBII+ EGI Enriquecida EGI+++ EGII+ EGIII+ CBHI" CHBII" EGI.Acbd Enriquecida EGI.Acbd+ EGI" EGII" EGIII+ CBHI" CBHII" EGII Enriquecida EGI+ EGII+++ EGIII+ CBHI" CBHII" EGIII Enriquecida EGI" EGII" EGIII+ CBHI" CBHII" EGIII Purificada EGI" EGII" EGIII+ CBHI" CBHII"

Na Tabela 1 acima, a estirpe produtora de EGI contém genes múltiplos codificando para EGI. De forma semelhante, as estirpes produzindo EGII e EGIII enriquecidas, respectivamente, contêm cópias múltiplas dos genes que codificam para EGII e EGIII.

As preparações enzimáticas de EGI.EGII enriquecida, EGIII enriquecida e EGIII purificada foram obtidas seguindo os 46

procedimentos descritos em PCT WO 92/06209. A EGIII purificada foi a mesma do que EGIII enriquecida, excepto que o sobrenadante contendo a EGIII segregada toí sujeita ao proceaimento de purificação com PEG descrito na Patente U.S. No. 5 328 841 para remover a actividade da xilanase. 0 núcleo de EGI truncado foi produzido de acordo com as técnicas descritas no Exemplo de Referência 1 e purificado de acordo com o Exemplo de Referência 2. A actividade de redução de viscosidade em β-glucano de cevada de ligação mista solúvel foi medida para cada uma das preparações enzimáticas acima, de acordo com o ensaio descrito acima.

Os resultados deste teste estão ilustrados no gráfico da Figura 5, Uma vez que a β-glucanase de T. longibrachiatum é doseada com um aditivo de rações com base na actividade medida pelo método de ensaio de açúcar de redução de DNS, a adição de enzima para a actividade de redução de viscosidade foi padronizado por este procedimento.

Os resultados ilustrados na Figura 5 demonstram que a actividade de redução de viscosidade da celulase total é significativamente superior à de cada uma das preparações de endoglucanase enriquecidas independentemente do pH.

Exemplo 1

Treze grupos de galinhas de churrasco, cada um incluindo inicialmente um grupo de 49 galinhas, foram alimentadas com a ração à base de cevada apresentada na Tabela 2 entre os 8 e os 21 dias de idade. A ingestão de ração e o ganho de peso corporal foram medidos entre os dias 8 e 21. 47

Tabela 2 n —-:- ingreaientes p—-;-—------1 rerceniagem Feso Cevada 58,56% 585,63 Soja ml 48 31,63% 316,26 Óleo de soja 6, 07% 60, 65 Sal 0,29% 2,90 Metionina DL 0,28% 2,76 Lisina HC1 0,04% 0,44 Pedra de cal 1,41% 14,06 Fos Dicálcio 1,23% 12,31 VIT/MIN 0, 50% 5, 00 TOTAL 100,00% 1000,00 0 valor nutritivo da ração acima pode ser sujeito a análise por computador utilizando por exemplo o programa "Format" disponível de Format International. Este proporciona uma análise do conteúdo nutritivo das rações incluindo por exemplo os níveis nutricionais esperados de vários metabolitos. Os resultados de uma tal análise para as rações da Tabela 2 é apresentado na seguinte Tabela 3. 48

Dieta à Base de Cevada rp U Λ Ί - o j. «j

Nutriente Alvo Valor Proteína Bruta % 22,00 22,00 Aves ME kcal/kg 3000,00 3000,00 Porco DE Kcal 3363,16 Cálcio % 0, 90 0, 90 Fos % 0,66 Fos disponível % 0,40 0,40 Gordura % 7,28 Fibra % 4,00 Met % 0,58 Cys % 0,37 Met + Cys % 0, 95 0,95 Lys % 1,25 1,25 His % 0,52 Tryp % 0,24 0,30 Thr % 0, 80 0,82 Arg % 1, 40 1,44 Iso % 1,01 Leu % 1,59 Phe % 1,11 Vai % 1,10 Gly % 0,99 Phe + Tyr % 1,89 Na % 0, 15 0, 15 Cl % 0,29 K % 0, 96 Ácido Linoleico % 1,00 3,00 Na + K + HC1 2,29

As rações à base de cevada fornecidas para alimentar doze dos grupos de galinhas foram suplementadas com quantidades 49

variadas de cada uma das preparações enzimáticas apresentadas na Tabela 1 acima. Cada uma das preparações enzimáticas foi testada a uma concentração de actividade de β-glucanase de 120 unidades/kg da ração e 240 unidades/kg da ração. A actividade da β-glucanase foi medida utilizando o ensaio de actividade de β-glucanase descrito acima. A dieta do décimo terceiro grupo, o grupo de controlo, não foi suplementada com qualquer das preparações enzimáticas.

Os resultados destes vários testes são apresentados nas seguintes Tabelas 4 e 5. Os resultados apresentados na Tabela 4 são para dietas suplementadas com 120 unidades de actividade de β-glucanase por kg de ração, enquanto que os resultados apresentados na Tabela 5 são para rações suplementadas com 240 unidades de actividade de β-glucanase por kg de ração. Os resultados apresentados nas Tabelas 4 e 5 proporcionam o ganho de peso corporal, a taxa de conversão da ração e a viscosidade na região gastrointestinal dos vários grupos de galinhas de churrasco. Os resultados foram ajustados para mortalidade.

Tabela 4 GPC(g) FCR Viscosidade (cps) Controlo 329 1,72 15, 3 EGI enriquecida 358 1, 60 12,6 EGI.Acbd enriquecida 437 1, 42 10,5 (Invenção) EGII enriquecida 396 1,50 13, 6 EGIII enriquecida 356 1, 66 6,0 EGIII Purificada 332 1,85 7,9 Celulase Completa 381 1,62 10,3 50

Tabela 5 GPC(g) FCR Viscosidade (cps) Controlo 329 1,72 15,3 EGI enriquecida 376 1,60 14,5 EGI.Acbd enriquecida 395 1,57 5,6 (Invenção) EGII enriquecida 377 1,70 11,6 EGIII enriquecida 423 1,54 8,1 EGIII Purificada 401 1,56 7,7 Celulase Completa 404 1,66 6,4 A partir dos resultados acima, pode ser observado que o ganho de peso corporal, a taxa de conversão da ração e a viscosidade para o grupo de controlo sem o suplemento enzimático foram relativamente pobres. Em comparação com os resultados para os outros ensaios, a EGI.Acbd enriquecida proporcionou resultados superiores tanto a 120 como a 240 unidades/kg de ração. Esta preparação enzimática removida do domínio de ligação para a celulose proporciona resultados superiores a ambas as concentrações testadas em comparação com o tipo EGI natural enriquecido. Estes resultados também sugerem fortemente que as diferentes preparações enzimáticas possuem doses óptimas diferentes em termos dos seus efeitos no ganho de peso corporal e taxas de conversão de rações.

Comparando os resultados do Exemplo de Referência 3 e Exemplo 1, pode observar-se que os diferentes resultados são obtidos em testes in vitro e in vivo. Assim, nos testes in vitro do Exemplo de Referência 3, a actividade de redução da viscosidade de celulase total foi superior à das preparações enriquecidas de EGI, EGII, EGIII e EGI.Acbd. 51

Os efeitos demonstrados acima de redução das taxas de conversão das rações e/ou das viscosidades gastrointestinais podem também scr obtidos guando as iaques (jj-tipctiadas de acoroo com a presente invenção mas baseadas noutros cereais tais como trigo, triticale, centeio e milho são fornecidas a outros animais tais como perus, gansos, patos, porcos, ovelhas e vacas, bem como às galinhas. 52 }

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 159 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: junção(1..82, 140..159) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CAC TGG GGG CAG TGC GGT GGC ATT GGG TAC AGC GGG TGC AAG ACG TGC 48

His Trp Gly Gin Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys 15 10 15 ACG TCG GGC ACT ACG TGC CAG TAT AGC AAC GAC T GTTCGTATCC 92

Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gin Tyr Ser Asn Asp 20 25 CCATGCCTGA CGGGAGTGAT TTTGAGATGC TAACCGCTAA AATACAG AC TAC TCG 147

Tyr Tyr Ser 30 CAA TGC CTT TA 159

Gin Cys Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: 53

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

His Trp Gly Gin Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys 15 10 15

Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gin Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gin Cys 20 25 30

Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..108 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: CAG CAG ACT GTC TGG GGC CAG TGT GGA GGT ATT GGT TGG AGC GGA CCT 48

Gin Gin Thr Vai Trp Gly Gin Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro 15 10 15 54

ACG AAT TGT GCT CCT GGC TCA GCT TGT TCG AC C CTC AAT CCT TAT TAT 96 Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr 20 O A GCG CAA TGT ATT 108 Ala Gin Cys Ile 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Gin Gin Thr Vai Trp Gly Gin Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro 15 10 15

Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr 20 25 30

Ala Gin Cys Ile 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1201 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 55

(ix) CARACTERISTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (D) LOCALIZAÇAG; j un^ciu (I. . 704 , 775..I2ÚÍ) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: CAG CAA CCG GGT ACC AGC > o o CCC GAG GTC CAT CCC AAG TTG ACA ACC 48 Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Vai His Pro Lys Leu Thr Thr 1 5 10 15 TAC AAG TGT ACA AAG TCC GGG GGG TGC GTG GCC CAG GAC ACC TCG GTG 96 Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Vai Ala Gin Asp Thr Ser Vai 20 25 30 GTC CTT GAC TGG AAC TAC CGC TGG ATG CAC GAC GCA AAC TAC AAC TCG 144 Vai Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser 35 40 45 TGC ACC GTC AAC GGC GGC GTC AAC ACC ACG CTC TGC CCT GAC GAG GCG 192 Cys Thr Vai Asn Gly Gly Vai Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala 50 55 60 ACC TGT GGC AAG AAC TGC TTC ATC GAG GGC GTC GAC TAC GCC GCC TCG 240 Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Vai Asp Tyr Ala Ala Ser 65 70 75 80 GGC GTC ACG ACG TCG GGC AGC AGC CTC ACC ATG AAC CAG TAC ATG CCC 288 Gly Vai Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gin Tyr Met Pro 85 90 95 AGC AGC TCT GGC GGC TAC AGC AGC GTC TCT CCT CGG CTG TAT CTC CTG 336 Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Vai Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu 100 105 110 GAC TCT GAC GGT GAG TAC GTG ATG CTG AAG CTC AAC GGC CAG GAG CTG 384 Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Vai Met Leu Lys Leu Asn Gly Gin Glu Leu 115 120 125 56

AGC TTC GAC GTC GAC CTC TCT GCT CTG CCG TGT GGA GAG AAC GGC TCG 432 Ser Phe Asp Vai Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser 130 135 1/1 n CTC TAC CTG TCT CAG ATG GAC GAG AAC GGG GGC GCC AAC CAG TAT AAC 480 Leu Tyr Leu Ser Gin Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gin Tyr Asn 145 150 155 160 ACG GCC GGT GCC AAC TAC GGG AGC GGC TAC TGC GAT GCT CAG TGC CCC 528 Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys Pro 165 170 175 GTC CAG ACA TGG AGG AAC GGC ACC CTC AAC ACT AGC CAC CAG GGC TTC 576 Vai Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gin Gly Phe 180 185 190 TGC TGC AAC GAG ATG GAT ATC CTG GAG GGC AAC TCG AGG GCG AAT GCC 624 Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala 195 200 205 TTG ACC CCT CAC TCT TGC ACG GCC ACG GCC TGC GAC TCT GCC GGT TGC 672 Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys 210 215 220 GGC TTC AAC CCC TAT GGC AGC GGC TAC AAA AG GTGAGCCTGA 714 Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser 225 230 235 TGCCACTACT ACCCCTTTCC TGGCGCTCTC GCGGTTTTCC ATGCTGACAT GGTTTTCCAG 774 C TAC TAC GGC CCC GGA GAT ACC GTT GAC ACC TCC AAG ACC TTC ACC 820

Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Vai Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr 240 245 250 ATC ATC ACC CAG TTC AAC ACG GAC AAC GGC TCG CCC TCG GGC AAC CTT 868

Ile Ile Thr Gin Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu 255 260 265 57

GTG AGC ATC ACC CGC AAG TAC CAG CAA AAC GGC GTC GAC ATC CCC AGC 916 Vai Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gin Gin Asn Gly Vai Asp Ile Pro Ser 270 o ^ c Λ Λ Λ έ,υυ GCC CAG CCC GGC GGC GAC ACC ATC TCG TCC TGC CCG TCC GCC TCA GCC 964 Ala Gin Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala 285 290 295 TAC GGC GGC CTC GCC ACC ATG GGC AAG GCC CTG AGC AGC GGC ATG GTG 1012 Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Vai 300 305 310 CTC GTG TTC AGC ATT TGG AAC GAC AAC AGC CAG TAC ATG AAC TGG CTC 1060 Leu Vai Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu 315 320 325 330 GAC AGC GGC AAC GCC GGC CCC TGC AGC AGC ACC GAG GGC AAC CCA TCC 1108 Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser 335 340 345 AAC ATC CTG GCC AAC AAC CCC AAC ACG CAC GTC GTC TTC TCC AAC ATC 1156 Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Vai Vai Phe Ser Asn Ile 350 355 360 CGC TGG GGA GAC ATT GGG TCT ACT ACG AAC TCG ACT GCG CCC CCG 1201 Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro 365 370 375 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 377 amínoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: 58 »

Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro 1 5 Tyj. Ly a Cy a Tiil uy a OC1 vjxy uiy 20 Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp 35 40 Cys Thr Vai Asn Gly Gly Vai Asn 50 55 Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile 65 70 Gly Vai Thr Thr Ser Gly Ser Ser 85 Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser 100 Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Vai Met 115 120 Ser Phe Asp Vai Asp Leu Ser Ala 130 135 Leu Tyr Leu Ser Gin Met Asp Glu 145 150 Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser 165 Vai Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr 180 Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu 195 200 Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala 210 215 Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly 225 230 Asp Thr Vai Asp Thr Ser Lys Thr 245 Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly 260 Tyr Gin Gin Asn Gly Vai Asp Ile 275 280

Glu Vai His Pro Lys Leu Thr Thr 10 15 o V Cl X rix α VJXI1 nôp X 11X UCi- tr_ 1 V Cl X 25 30 Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser 45 Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala 60 Glu Gly Vai Asp Tyr Ala Ala Ser 75 80 Leu Thr Met Asn Gin Tyr Met Pro 90 95 Vai Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu 105 110 Leu Lys Leu Asn Gly Gin Glu Leu 125 Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser 140 Asn Gly Gly Ala Asn Gin Tyr Asn 155 160 Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys Pro 170 175 Leu Asn Thr Ser His Gin Gly Phe 185 190 Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala 205 Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys 220 Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly 235 240 Phe Thr Ile Ile Thr Gin Phe Asn 250 255 Asn Leu Vai Ser Ile Thr Arg Lys 265 270 Pro Ser Ala Gin Pro Gly Gly Asp 285 59

Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr 290 295 300 M a +· “ — J T TTO — J w Μ λ T nn o ~ ». O ~ V* r» l *» V*I X7-. 1 T ^st·» tt-,1 ΓΜ~ Λ O ~ X 1 — ^ X V m . 305 310 315 320 Asn Asp Asn Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly 325 330 335 Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn 340 345 350 Pro Asn Thr His Vai Vai Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly 355 360 365 Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro 370 375 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1158 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: junção(1..56, 231..1158) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GGG GTC CGA TTT GCC GGC GTT AAC ATC GCG GGT TTT GAC TTT GGC TGT Gly Vai Arg Phe Ala Gly Vai Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys 1 5 10 15 ACC ACA GA ( 3TGAGTACCC TTGTTTCCTG GTGTTGCTGG CTGGTTGGGC Thr Thr Asp GGGTATACAG CGAAGCGGAC GCAAGAACAC CGCCGGTCCG CCACCATCAA GATGTGGGTG 156 GTAAGCGGCG GTGTTTTGTA CAACTACCTG ACAGCTCACT CAGGAAATGA GAATTAATGG 216 60

AAGTCTTGTT ACAG T GGC ACT TGC GTT ACC TCG AAG GTT TAT CCT CCG 264

Gly Thr Cys Vai Thr Ser Lys Vai Tyr Pro Pro 20 25 30 TTG AAG AAC TTC ACC GGC TC A AAC AAC TAC CCC GAT GGC ATC GGC CAG 312 Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly Gin 35 40 45 ATG CAG CAC TTC GTC AAC GAG GAC GGG ATG ACT ATT TTC CGC TTA CCT 360 Met Gin His Phe Vai Asn Glu Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro 50 55 60 GTC GGA TGG CAG TAC CTC GTC AAC AAC AAT TTG GGC GGC AAT CTT GAT 408 Vai Gly Trp Gin Tyr Leu Vai Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp 65 70 75 TCC ACG AGC ATT TCC AAG TAT GAT CAG CTT GTT CAG GGG TGC CTG TCT 456 Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gin Leu Vai Gin Gly Cys Leu Ser 80 85 90 CTG GGC GCA TAC TGC ATC GTC GAC ATC CAC AAT TAT GCT CGA TGG AAC 504 Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Vai Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn 95 100 105 110 GGT GGG ATC ATT GGT CAG GGC GGC CCT ACT AAT GCT CAA TTC ACG AGC 552 Gly Gly Ile Ile Gly Gin Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gin Phe Thr Ser 115 120 125 CTT TGG TCG CAG TTG GCA TCA AAG TAC GCA TCT CAG TCG AGG GTG TGG 600 Leu Trp Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Vai Trp 130 135 140 TTC GGC ATC ATG AAT GAG ccc CAC GAC GTG AAC ATC AAC ACC TGG GCT 648 Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Vai Asn Ile Asn Thr Trp Ala 145 150 155 61

GCC ACG GTC CAA GAG GTT GTA ACC GCA ATC CGC AAC GCT GGT GCT ACG 696 Ala Thr Vai Gin Glu Vai Vai Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr 160 165 170 TCG CAA TTC ATC TCT TTG CCT GGA AAT GAT TGG CAA TCT GCT GGG GCT 744 Ser Gin Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gin Ser Ala Gly Ala 175 180 185 190 TTC ATA TCC GAT GGC AGT GCA GCC GCC CTG TCT CAA GTC ACG AAC CCG 792 Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Vai Thr Asn Pro 195 200 205 GAT GGG TCA ACA ACG AAT CTG ATT TTT GAC GTG CAC AAA TAC TTG GAC 840 Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Vai His Lys Tyr Leu Asp 210 215 220 TCA GAC AAC TCC GGT ACT CAC GCC GAA TGT ACT ACA AAT AAC ATT GAC 888 Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp 225 230 235 GGC GCC TTT TCT CCG CTT GCC ACT TGG CTC CGA CAG AAC AAT CGC CAG 936 Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Asn Asn Arg Gin 240 245 250 GCT ATC CTG ACA GAA ACC GGT GGT GGC AAC GTT CAG TCC TGC ATA CAA 984 Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Vai Gin Ser Cys Ile Gin 255 260 265 270 GAC ATG TGC CAG CAA ATC CAA TAT CTC AAC CAG AAC TCA GAT GTC TAT 1032 Asp Met Cys Gin Gin Ile Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Vai Tyr 275 280 285 CTT GGC TAT GTT GGT TGG GGT GCC GGA TCA TTT GAT AGC ACG TAT GTC 1080 Leu Gly Tyr Vai Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Vai 290 295 300 62

CTG ACG GAA ACA CCG ACT AGC AGT GGT AAC TCA TGG ACG GAC ACA TCC 1128 Leu Thr Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser 305 C TTG GTC AGC TCG TGT CTC GCA AGA AAG TA 1158 Leu Vai Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys 320 325 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 327 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Gly Vai Arg Phe Ala Gly Vai Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys 15 10 15

Thr Thr Asp Gly Thr Cys Vai Thr Ser Lys Vai Tyr Pro Pro Leu Lys 20 25 30

Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly Gin Met Gin 35 40 45

His Phe Vai Asn Glu Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro Vai Gly 50 55 60

Trp Gin Tyr Leu Vai Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr 65 70 75 80

Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gin Leu Vai Gin Gly Cys Leu Ser Leu Gly 85 90 95

Ala Tyr Cys Ile Vai Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly 100 105 110 63

Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Vai Trp Phe Gly 130 135 140

Ile Met Asn Glu Pro His Asp Vai Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr 145 150 155 160

Vai Gin Glu Vai Vai Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gin 165 170 175

Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gin Ser Ala Gly Ala Phe Ile 180 185 190

Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Vai Thr Asn Pro Asp Gly 195 200 205

Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Vai His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp 210 215 220

Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly Ala 225 230 235 240

Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Asn Asn Arg Gin Ala Ile 245 250 255

Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Vai Gin Ser Cys Ile Gin Asp Met 260 265 270

Cys Gin Gin Ile Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Vai Tyr Leu Gly 275 280 285

Tyr Vai Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Vai Leu Thr 290 295 300 64

Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Vai 305 310 315 320 Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys 325 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 81 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..81 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: CCC CCG CCT GCG TCC AGC ACG ACG TTT TCG ACT ACA CCG AGG AGC TCG 48

Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser 15 10 15 ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG ACT 81

Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gin Thr 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: 65 /

Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser 15 10 15

Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gin Thr 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 102 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..102 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: CCG GGA GCC ACT ACT ATC ACC ACT TCG ACC CGG CCA o o > TCC GGT CCA 48 Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro 1 5 10 15 ACC ACC ACC ACC AGG GCT ACC TCA ACA AGC TCA TCA ACT CCA CCC ACG 96 Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr 20 25 30 AGC TCT 102

Ser Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: linear 66

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro 15 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr 20 25 30

Ser Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..66 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ATG GCG CCC TCA GTT ACA CTG CCG TTG ACC ACG GCC ATC CTG GCC ATT 48

Met Ala Pro Ser Vai Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile 15 10 15 GCC CGG CTC GTC GCC GCC 66

Ala Arg Leu Vai Ala Ala 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos 67

(B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: pnjLtiiiia (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Met Ala Pro Ser Vai Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile 15 10 15

Ala Arg Leu Vai Ala Ala 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..63 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: ATG AAC AAG TCC GTG GCT CCA TTG CTG CTT GCA GCG TCC ATA CTA TAT 48

Met Asn Lys Ser Vai Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr 15 10 15 GGC GGC GCC GTC GCA 63

Gly Gly Ala Vai Ala 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 68

-~7 (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido / n \ mr\n at τ n i · \uj iuroiiooin. imccu (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Met Asn Lys Ser Vai Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr 15 10 15

Gly Gly Ala Vai Ala 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 777 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: AAACCAGCTG TGACCAGTGG GCAACCTTCA CTGGCAACGG CTACACAGTC AGCAACAACC 60 TTTGGGGAGC ATCAGCCGGC TCTGGATTTG GCTGCGTGAC GGCGGTATCG CTCAGCGGCG 120 GGGCCTCCTG GCACGCAGAC TGGCAGTGGT CCGGCGGCCA GAACAACGTC AAGTCGTACC 180 AGAACTCTCA GATTGCCATT CCCCAGAAGA GGACCGTCAA CAGCATCAGC AGCATGCCCA 240 CCACTGCCAG CTGGAGCTAC AGCGGGAGCA ACATCCGCGC TAATGTTGCG TATGACTTGT 300 TCACCGCAGC CAACCCGAAT CATGTCACGT ACTCGGGAGA CTACGAACTC ATGATCTGGT 360 AAGCCATAAG AAGTGACCCT CCTTGATAGT TTCGACTAAC AACATGTCTT GAGGCTTGGC 420 69

AAATACGGCG ATATTGGGCC GATTGGGTCC TCACAGGGAA CAGTCAACGT CGGTGGCCAG 480 x x riv-* x ri x vjj να ov^^nx vjv^rxnvj U<irn X X X ioi ACCAACACTA CCAACTACAG CGGAGATGTC AAGAACTTCT TCAATTATCT CCGAGACAAT 600 AAAGGATACA ACGCTGCAGG CCAATATGTT CTTAGTAAGT CACCCTCACT GTGACTGGGC 660 TGAGTTTGTT GCAACGTTTG CTAACAAAAC CTTCGTATAG GCTACCAATT TGGTACCGAG 720 CCCTTCACGG GCAGTGGAAC TCTGAACGTC GCATCCTGGA CCGCATCTAT CAACTAA 777 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 218 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Gin Thr Ser Cys Asp Gin Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr 15 10 15

Vai Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys 20 25 30

Vai Thr Ala Vai Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp 35 40 45

Gin Trp Ser Gly Gly Gin Asn Asn Vai Lys Ser Tyr Gin Asn Ser Gin 50 55 60

Ile Ala Ile Pro Gin Lys Arg Thr Vai Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro 65 70 75 80

Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Vai 70

"*7 85 90 95

Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala a«n pro _a£n hís Vai Thr Tyr Ger 100 105 no

Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly 115 120 125

Pro Ile Gly Ser Ser Gin Gly Thr Vai Asn Vai Gly Gly Gin Ser Trp 130 135 140

Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gin Vai Tyr Ser Phe Vai 145 150 155 160

Ala Gin Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Vai Lys Asn Phe Phe 165 170 175

Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gin Tyr Vai 180 185 190

Leu Ser Tyr Gin Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu 195 200 205

Asn Vai Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 210 215 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: 71 49

ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2Ω: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

Met Lys Phe Leu Gin Vai Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGCG 57

Ásboa, 9 de Agosto de 2001 STE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

72

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES Aditivo da rações ã base de enzima que compreende: (i) um ou mais de (a) EGI que não possui o domínio de ligação à celulose, (b) EGII que não possui o domínio de ligação à celulose, e (c) o núcleo da celulase activa de (a) ou (b) em que: EGI refere-se à endoglucanase derivada de Trichoderma spp., possuindo um pH óptimo de cerca de 4,0-6,0, um ponto isoeléctrico (pi) de cerca de 4,5-4,7 e um peso molecular de cerca de 47-49 kdaltons; e EGII refere-se à endoglucanase derivada de Trichoderma spp., possuindo um pH óptimo de cerca de 4,0-6,0, um pi de cerca de 5,5, e um peso molecular de cerca de 35 kdaltons; e (ii) 0-20% em peso, com base no conteúdo em proteínas de celulase no aditivo, de uma celobiohidrolase. Aditivo de rações à base de enzima de acordo com a reivindicação 1, sem qualquer celobiohidrolase. Aditivo de rações à base de enzima de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o aditivo compreende ainda uma ou mais enzimas adicionais seleccionadas de entre uma xilanase, uma protease, uma a-amilase, uma glucoamilase, uma lipase, uma pectinase, uma mananase, uma α-glalactosidase, uma α-arabinofuranosidase e uma fitase. Aditivo de rações à base de enzima de acordo com a reivindicação 3, em que a xilanase é a xilanase de pi elevado e/ou a xilanase de pi baixo de T. longibrachiatum.
2. 5. Aditivo de rações à base de enzima de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que a protease é uma subtilisiπλ ou mutante desta derivada do género Bacillus.
3. 6. Ração para animais à base de cereal compreendendo pelo menos um cereal seleccionado de cevada, trigo, triticale, centeio e milho, e um aditivo de rações à base de enzima de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.
4. 7. Ração para animais à base de cereal de acordo com a reivindicação 6, em que o cereal é pelo menos cevada.
5. 8. Método para produzir um aditivo de rações à base de enzima de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo o passo de construir por manipulação genética uma estirpe geneticamente modificada do fungo Trichoderma que produz as enzimas desejadas nas quantidades relativas apropriadas, cultivar a estirpe geneticamente modificada, e recolher o aditivo da cultura.
6. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a estirpe geneticamente modificada é derivada de T. longibrachiatum, T. reesei ou T. viride cujo genoma foi modificado de modo a que seja enriquecido na sua produção de uma ou mais das endoglucanases e/ou seja incapaz de produzir uma ou mais celobiohidrolases funcionalmente activas.
7. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o genoma da estirpe geneticamente modificada é incapaz de produzir EGI e/ou EGII funcionalmente activas. Lisboa, 9 de Agosto de 2001 r-—_ A aGEOTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 2