MX2015005577A - Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasa termolisina. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona variantes de serina proteasa (termolisina) producidas a partir de esta. Específicamente, la presente invención proporciona variantes de la proteasa serina que tienen una o más sustituciones en comparación con una proteasa serina de referencia. Adicionalmente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden estas variantes de la proteasa serina. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una de estas variantes de la proteasa serina.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS QUE COMPRENDEN VARIANTES DE PROTEASA TERMOLISINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los bacilos son bacterias grampositivas que segregan una serie de enzimas industrialmente útiles, que pueden producirse por fermentación a bajo costo y en altos volúmenes. Los ejemplos de enzimas de Bacillus secretadas son las serina proteasas subtilisina, proteasas neutras que contienen zinc, alfa-amilasas y celulasas. Las proteasas de Bacillus se usan ampliamente en la industria textil, de lavandería y del hogar (Galante, Current Organic Chemistry, 7:1399-1422, 2003; y Showell, Handbook of Detergents, Part D: Formulation, Hubbard (ed.), NY: Taylor and Francis Group, 2006). La clasificación de las proteasas que se encuentran en microorganismos se basa en su mecanismo catalítico que produce cuatro grupos: las serina proteasas; metaloproteasas; cisterna proteasas; y aspártico proteasas. Las serina proteasas tienen un pH óptimo alcalino, las metaloproteasas son óptimamente activas cerca de la neutralidad y las cisterna y aspártico enzimas tienen de pH óptimo ácido (Biotechnology Handbooks, Bacillus. vol. 2, editado por Harwood, 1989 Plenum Press, New York). Aunque las proteasas serina se han conocido desde hace mucho en la materia de las enzimas industriales, persiste la necesidad de proteasas Ref.: 255278 modificadas por ingeniería que sean adecuadas para condiciones y usos particulares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción proporciona, entre otros, enzimas termolisina, ácidos nucleicos que codifican estas, y composiciones y métodos relacionados con la producción y el uso de estas.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI, por sus siglas en inglés) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuest as de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI, por sus siglas en inglés) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en raicromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2, 26, 47, 49, 53, 65, 87, 91, 96, 108, 118, 128, 154, 179, 196, 197, 198, 199, 209, 211, 217, 219, 225, 232, 256, 257, 259, 261, 265, 267, 272, 276, 277, 286, 289, 290, 293, 295, 298, 299, 300, 301, 303, 305, 308, 311 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la modificación se selecciona del grupo que consiste en 2 (T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M), 26 (T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M C,D), 47 (R,A,C,H,KJN,D,E G/L M,Q,T), 49 (T,A,D,F,H,I,S,W,L,N,Q,V,E,M,Y) 53 (S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L) 65 (S,I,M,Q,V,L,T,W,A,D,E,P,Y) 87 (n,?,E,O,I,B,R,K,T,a,K,I,M,N,O,??,U), 91 (L,D)EÍF,K,M,P,Q,S,A;N R,W,Y), 96 (N,C,D,I,V,F,TfG,H,Q,R,S,WfK,L,Y), 108 (Q;C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M), 118 (S,C,GfE,A,D,M,Q,R,T,V), 128 (O,O,?,E, ,E,n,I,K,A,L,Y), 154 (G,L,Q S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y), 179 (Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F), 96 (G,D,E,T,K(R,V,H,L,Y,A,W), 197 (I,?,K,I,T,n,??,U,A,H,N,E,O,R,R,O , 198 (X,O,E,R,O,H,I,R,O,T,n,M,N,R^ ,A,K), 199 (G,C,E,F,H,Q,SfT,W,L,A,Y), 209 (A,?,E,E,b,T,n,s,I,K,R,R,U,O,M), 211 (Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R), 217 (Y,Q,S,T,V, ,G,A,R,M,N,O,E), 219 (K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S), 225 (Q,D,G,H,I,R,n, ,A,M,E,O,E,K,E,b), 232 (I,C,E,R,K,M,N,O,??,O,I,R,B,T,n,U), 256 (n,I,T,K,A,?,R,O,H,R,X,N), 257 (G,C,D,E,L,N,P,Q,S,T,Y,K,R), 259 (s,A,s,E,R,H,I,M,??,K,R,N,d,T), 261 (D,A,N,P,V,W,G,H,I,S), 265 (K,A,O,?,M,R,O,E,s,I,I,R,N), 267 (F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y), 272 (T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K), 276 (T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y), 277 (P,Q;SfT,E,F,G(H,N,R,V,W,A,D,Y), 286 ( (AA,,DD,,EE,,FF,,GGffHH,,II,,SS,,PP,,CC,,QQ,,RR,,TT,,KK,,LL,,MM,,NN,,YY)),, 289 ((Vn,.CO,.EE,.FR,.GO,.II,.NN,.SX,.W??,.RR,.TT,.LI,.MM,.YU,.AA)),, 290 (Q,C,D,F/G,L,W,Y,R T V,A,H,N), 293 (T,C E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L 295 (L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W) (S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R) 299 (T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K) 300 (S,C,K,M,R,Y,I L,H,P,V,W,A,G,T,D,N) 301 (Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K) 303 (V,C,H,G,K,L,RfW,A,P,Y) 305 (S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M) 308 (Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L) 311 (D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y) Y 316 (K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 40%, pero menos de 75%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen al menos uno de los criterios mencionados en a, b y c (supra), y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 1, 4, 17, 25, 40, 45, 56, 58, 61, 74, 86, 97, 101, 109, 149, 150, 158, 159, 172, 181, 214, 216, 218, 221, 222, 224, 250, 253, 254, 258, 263, 264, 266, 268, 271, 273, 275, 278, 279, 280, 282, 283, 287, 288, 291, 297, 302, 304, 307 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la modificación se selecciona del grupo que consiste en 1 (I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L), 4 (T E,A,N,R,V,K,L,M,Y), 17 (Q,I,W,Y,C,R,V,T,L), 25 (S,D,F,A,C,K,M,R), 40 (F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L), 45 (K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M), 56 (A,K,Q,V,W,H,I,Y,E,M), 58 (A,N,Y,C,V,E,L), 61 (Q,M,R,W,F,V,C,I,L), 74 (H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W), 86 (N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D), 97 (N,K,C,R,S,Y,E,M), 101 (R,T,C,L,S,H), 109 (G,A,L,S,E,M,R,W), 149 (T,M,V,A,L,D,S,N), 150 (D,A,F,K,N,Q,T,V,S), 158 (Q,A,K,M,N,L,R,Y,S), 159 (N,R, ,A,C,G,M,T,S,Y), 172 (F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H), 181 (N,L,A,G,K,M,T,S), 214 (P,C,G,K,S,N,A,R), 216 (H,C,E,S,T,R,A), 218 (S,K,L,Y,F,G,T,V), 221 (Y,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M), 222 (T,C,D,L,Y,I,V,A,M,K), 224 (T,K,M,F,L,P,Q,V,Y,E,H), 250 (H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y), 253 (V,N,T,I,R,Y,M,Q), 254 (S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W), 258 (I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V), 263 (L,C,I,Q,T,H,K,N,V,A,M), 264 (G,C,R,A,N,P,Q,S,T), 266 (I,A,F,L,S,C,M,T,V), 268 (Y,M,Q,V,A,S,K), 271 (L,A,D,F,I,N,Y,H), 273 (Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N), 275 (L,I,M,V,C,Q,S,T), 278 (T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S), 279 (S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G), 280 (N,A,C,D,E,G,Q,H,T), 282 (S,K,N,R,A,H,L,MfT), 283 (Q,K,L,P,R,W,Y,S), 287 (A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C), 288 (A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M), 291 (S,E,I,L,M,N,V,A,T), 297 (G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N), 302 (E,K,L,G,T,V,D,Q,A), 304 (A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y), 307 (K,A,C,G,I,M,N,Q,RfW,Y,H) y 312 (A,G,M,V,L,N,R,T,C), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 15%, pero menos de 40%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen al menos uno de los criterios mencionados en a, b y c (supra), y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 5, 9, 11, 19, 27, 31, 33, 37, 46, 64, 73, 76, 79, 80, 85, 89, 95, 98, 99, 107, 127, 129, 131, 137, 141, 145, 148, 151, 152, 155, 156, 160, 161, 164, 168, 171, 176, 180, 182, 187, 188, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 220, 227, 234, 235, 236, 237, 242, 244, 246, 248, 249, 252, 255, 270, 274, 284, 294, 296, 306, 309, 310, 313, 314 y 315, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la modificación se selecciona del grupo que consiste en 5 (S,D,N,P,H,L), 9 (V,L,T,I), 11 (R,I,Y,K), 19 (N,L,Y,K,S), 27 (Y,W,A,M,V,C,L), 31 (Q,A,K,V,I,C,Y), 33 (N,S,T,K,A,C,LfM), 37 (N,D,Q,R,L,K), 46 (Y,L,H,N,C), 64 (A,H,Q,T,D,E), 73 (A,I,F,L,M,W), 76 (Y,H,L,M,Q,T), 79 (V,L,Q,T,A,N,S), 80 (T,I,D,A,L,N), 85 (K,E,A,L,N,R,S), 89 (N,L,M,H), 95 (G,A,D,H,M,N,S), 98 (A,C,E,H,R,Y,K,V), 99 (A,E,K,P,R,S), 107 (S,D,K,Y,A,G), 127 (G,C,D,E), 129 (T,I,R,E,Y,L,M), 131 (I,Y,W,L), 137 (I,P,A,E,T,V,L), 141 (A,S,C,G), 145 (T,A,C,E,G,M,N,Q), 148 (V,L,N,Y,M,A,Q), 151 (Y,K,G,H,S,W), 152 (T,S,L,M,G), 155 (L,C,I,M), 156 (I,M,T,L,Q), 160 (E,L,Y,Q), 161 (S,A,N,P,T), 164 (I,L,N,S,T,V,C,A), 168 (I,A,M,T,L), 171 (I,C,E,F,L,S,G), 176 (V,L,N,C), 180 (A,E,G,K,T,S), 182 (K,L,A,W), 187 (E,L,D), 188 (I,L,V), 205 (M,L,A,V,Q), 206 (S,A,C,K,L,M,R), 207 (D,A,H,N), 210 (K,I,L,V), 212 (G,Y,A,D,Q), 213 (D,N,S,L,A,G,W), 220 (R,K,V,A), 227 (N,?,I,U,A), 234 (S,D,N,A,C), 235 (G,M,C,Q,S,A), 236 (I,M,A,O , 237 (I,N,F,M), 242 (Y,C,F,N,V), 244 (I,T,V,F,A,M,L), 246 (Q,E,N,T,L,C,D), 248 (G,A,E,S), 249 (T,K,M,N,L,Y,P), 252 (G,K,Y,A,S,T,W), 255 (V,L,P,A,Y,M,N), 270 (A,C,F,I,L,S,G), 274 (Y,F,H,A,C,Q,T,M), 284 (L,V,W,A,M,Y), 294 (D,A,V,Q,N), 296 (Y,N,L,R,H,W,M), 306 (V,A,S,F,I,L,T), 309 (A,G,S,T,V,C), 310 (F,A,C,W,M), 313 (V,T,A,G,L,I,C), 314 (G,A,E,H,M,S,W,Q) y 315 (V,A C,I,M,L,T), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos una modificación, pero menos de 15% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva, cumplen al menos uno de los criterios mencionados en a, b y c (supra), y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 3, 6, 7, 20, 23, 24, 44, 48, 50, 57, 63, 72, 75, 81, 92, 93, 94, 100, 102, 103, 104, 110, 117, 120, 134, 135, 136, 140, 144, 153, 173, 174, 175, 178, 183, 185, 189, 193, 201, 223, 230, 238, 239, 241, 247, 251, 260, 262, 269 y 285, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la modificación se selecciona del grupo que consiste en 3 (G,Y), 6 (T,C,V), 7 (V,L,I), 20 (I,L,V), 23 (T,F,W), 24 (Y,W), 44 (A,C), 48 (T,E,?), 50 (L,R), 57 (?,K), 63 (F,Y,C), 72 (D,F,W), 75 (U,A), 81 (Y,F), 92 (S,L), 93 (U,T,O , 94 (D,T), 100 (I,L,V), 102 (S,G,N), 103 (S,T), 104 (V,A), 110 (Y,L), 117 (G,H), 120 (M,L), 134 (S,A,P), 135 (G,A), 136 (G,A,S), 140 (V,D), 144 (L,T), 153 (A,T), 173 (G,A,C), 174 (T,C,A), 175 (L,H,S), 178 (F,H,Y), 183 (N,S), 185 (D,E), 189 (G,A), 193 (Y,F), 201 (S,C,A), 223 (G,D,K), 230 (V,A), 238 (N,L,M); 239 (K,A), 241 (A,L,S), 247 (G,A,S), 251 (Y,M), 260 (R,A,N), 262 (K,A), 269 (R,V,K) y 285 (R,K,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación combinable para la actividad, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la mutación combinable para la actividad cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la expresión y estabilidad o termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5, y para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8 y la actividad en Abz-AGLA-Nba es mayor que, o igual a, 1.5 y en donde la posición combinable para la actividad se selecciona del grupo que consiste en 17, 19, 24, 25, 31, 33, 40, 48, 73, 79, 80, 81, 85, 86, 89, 94, 109, 117, 140, 141, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 168, 171, 174, 175, 176, 178, 180, 181, 182, 183, 189, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 214, 218, 223, 224, 227, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 258, 259, 260, 261, 262, 266, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 294, 295, 296, 297, 300, 302, 306, 310 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la modificación se selecciona del grupo que consiste en 17 (E,F,P), 19 (A,D,H,I,R,T,V), 24 (F,H), 25 (H), 31 (L), 33 (Q), 40 (C), 48 (A,R), 73 (Y), 79 (C), 80 (C,R), 81 (H), 85 (C,M,Y), 86 (V), 89 (K,R,T,V), 94 (E), 109 (D), 117 (A,K,R,T), 140 (S), 141 (T), 150 (E,M,W), 151 (A,C,E,I), 152 (D), 153 (V), 156 (H,R), 158 (F,G,I,V), 159 (F,I,K), 160 (S), 161 (Y), 168 (N), 171 (D), 174 (S,V), 175 (C,E,F,G,I), 176 (E,Q), 178 (C,M), 180 (L,W), 181 (Y), 182 (F,R), 183 (H,I,L,M,Q,R,T), 189 (C), 205 (C,F), 206 (F,H,I,T,V,Y), 207 (T), 210 (A,E,F,G,H,T), 212 (F,H,K,M,N,R,S,T), 213 (I,K,R,V,Y), 214 (Q), 218 (R), 223 (Y), 224 (I,R), 227 (C,E,G,K,Q,R,S,T,V), 235 (D,L,T), 236 (P), 237 (A,Q), 238 (A,C,D,E,R,S), 239 (C,G,H,L,Q,R,S,V,Y), 241 (E,F,G,I,T,V), 244 (Q), 246 (K,R), 248 (C,H), 249 (G,V), 250 (F,S), 251 (H), 252 (F,I,L), 253 (A,?,E,R), 254 (C,F,G,H,I,P), 255 (F,Q), 258 (F), 259 (I), 260 (C,D,I), 261 (K,R,T), 262 (C,F,H,L,P,R), 266 (W), 268 (F,R), 269 (P,T,W,Y), 270 (M,N,P,V), 271 (V), 272 (R), 273 (R), 274 (D,E), 276 (G,S), 278 (V), 279 (E), 280 (P,R,V), 282 (P), 283 (A,C#E,G,H,T,V), 294 (T), 295 (R), 296 (E;I), 297 (I,V), 300 (Q), 302 (W), 306 (Y), 310 (I,N) y 312 (Q), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la variante de la enzima termolisina tiene una mejor limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, actividad en Abz-AGLA-Nba o estabilidad o termoestabilidad detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal en todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3; y en donde la posición del residuo se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 127, 128, 180, 181, 195, 196, 197, 198, 199, 211, 223, 224, 298, 299, 300 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la variante de la enzima termolisina tiene una mejor estabilidad o termoestabilidad detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal en todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3; en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 1(I,V), 2 (T,C,I,M,P,Q,V), 127(G,C), 128(Q,C,E,F,I,L,V,Y), 180(A,E,N), 181 (N,A,G,Q,S), 196 (G,L,Y), 197(1,F), 198 (S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y), 211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W), 224 (T,?,H,U), 298(S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y), 299(T,A C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W) y 316(KfA,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2, 87, 96, 198, 277, 293, 295, 298 y 301, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. 1. En modalidades adicionales, la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2 (T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M) 87 (V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y) 96 (N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y) 198 (S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K) 277 (P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y) 293 (T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,Y) 295 (L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W) (S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R) 301 (Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una posición productiva, en donde las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos tres de los parámetros de expresión, estabilidad en detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz-AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 1, y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 278, 283, 180, 244, 48 y 63, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En modalidades adicionales, la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en T278R, Q283E, A180E, I244T, T48E y F63C, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la invención es una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, que comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos tres de los parámetros de expresión, estabilidad detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz-AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 0.5, y no más de uno de los parámetros es menor que 0.8, y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 019, 025, 026, 063, 091, 096, 097, 101, 109, 118, 131, 140, 158, 159, 175, 180, 219, 225, 232, 244, 246, 261, 277, 293, 300, 301, 301, 303, 305 y 311, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En modalidades adicionales, la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en N019D, S025A, T026R, S065A, L091M, N096Q, N096R, N096Y, N097K, R101M, G109A, S118A, I131L, V140D, Q158A, N159E, N159K, L175V, A180R, G196T, G196Y, K219S, Q225E, I232R, I244L, Q246D, D261N, P277G, T293Y, S300G, Q301F, Q301M, V303R, S305A, D311A, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina es una peptidasa M4. En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina es un miembro del clan MA. En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina es un miembro de la familia PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C. En algunas modalidades, la variante tiene al menos 50% de identidad con una termolisina de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina es de un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus, Geobacillus, Alicyclobacillus , Lactobacillus, Exiguobacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Herpe t os iphon, Oceanobacillus, Shewanella, Clostridium, Staphylococcus , Flavobacterium, Stigmatella, Myxococcus , Vibrio, Methanosarcina, Chryseobacterium, Streptomyces , Kribbella, Janibacter, Nocardioides, Xanthamonas, Micromonospora , Burkholderia, Dehalococcoides, Croceibacter, Kordia, Microscilla, Thermoactinomyces, Chloroflexus , Listeria, Plesiocystis , Haliscomenobacter, Cytophaga, Hahella, Arthrobacter, Brachybacterium, Clavibacter , Microbacterium, Intrasporangium, Frankia, Meiothermus , Pseudomonas, Ricinus, Catenulispora, Anabaena, Nostoc, Halomonas, Chromohalobacter, Bordetella , Variovorax, Dickeya, Pectobacteriu , Citrobacter , Enterobacter, Salmonella, Erwinia, Pantoea, Rahnella, Serratia , Geodermatophilus , Gemmata, Xenorhabdus , Photorhabdus , Aspergillus , Neosartorya, Pyrenophora, Saccharopolyspora, Nectria , Gibberella , Metarhizium, Waddlia , Cyanothece, Cellulphaga, Providencia, Bradyrhizobium, Agrobacterium, Mucilaginibacter, Serratia , Sorangium, Streptosporangium, Renibacterium, Aeromonas , Reinekea, Chromobacterium, Moritella, Haliangium, Kangiella , Marinomonas, Vibrionales , Listonella , Salinivibrio , Photobacterium, Alteromonadales , Legionella, Teredinibacter , Reinekea, Hydrogeni irga y Pseudoalteromonas . En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina es de un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus , Geobacillus , Alicyclobacillus , Lactobacillus , Exiguobacterium, Brevibacillus , Paenibacillus , Herpetosiphon, Oceanobacillus , Shewanella , Clostridium, Staphylococcus , Flavobacterium, Stigmatella, Myxococcus , Vibrio, Methanosarcina, Chryseobacterium y Pseudoalteromonas . En algunas modalidades, la enzima termolisina es del género Bacillus .

En algunas modalidades, la invención es una composición de limpieza que comprende al menos una variante indicada anteriormente. En algunas otras modalidades, la composición de limpieza es una composición en gránulos, en polvo, sólida, en barra, líquida, en tableta, en gel o en pasta. En algunas modalidades adicionales, la composición de limpieza es una composición detergente. En algunas modalidades adicionales, la composición de limpieza es una composición detergente de lavandería, una composición detergente para vajilla o una composición de limpieza para superficies duras. En algunas modalidades, la composición detergente para vajilla es una composición detergente para el lavado manual de vajilla o una composición detergente para el lavado automático de vajilla. En algunas modalidades, la composición de limpieza es una composición detergente de lavandería. En algunas modalidades, la composición de limpieza comprende, además, al menos un agente de blanqueo. En algunas modalidades, la composición de limpieza está libre de fosfato. En algunas modalidades, la composición de limpieza contiene fosfato. En algunas modalidades, la composición de limpieza comprende, además, al menos una enzima adicional. En algunas modalidades, la al menos una enzima adicional se selecciona del grupo que consiste en acil transferasas, alfa-amilasas, beta-amilasas, alf -galactosidasas, arabinosidasas, aril esterasas, betagalactosidasas, carragenasas, catalasas, celobiohidrolasas, celulasas, condroitinasas, cutinasas, endo beta-1,4-glucanasas, endo-beta-mananasas, esterasas, exo-mananasas, galactanasas, glucoamilasas, hemicelulasas , hialuronidasas, queratinasas, lacasas, lactasas, ligninasas, lipasas, lipoxigenasas, mananasas, oxidasas, pectato liasas, pectin acetil esterasas, pect inasas, pentosanasas, peroxidasas, fenoloxidasas, fosfatases, fosfolipasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, pululanasas, reductasas, ramnogalacturonasas, beta-glucanasas, tanasas, transglutaminasas, xilan acetil-esterasas, xilanasas, xiloglucanasas y xilosidasas, enzimas metaloproteasas adicionales y combinaciones de estas.

En algunas modalidades, la invención es un método de limpieza que usa una composición de limpieza indicada anteriormente. Un método de limpieza, comprende poner en contacto una superficie o un elemento con una composición de limpieza que comprende al menos una variante de la enzima termolisina de cualquiera de las reivindicaciones 1-33. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto una superficie o un elemento con una composición de limpieza expuesta anteriormente. En algunas modalidades, el método comprende enjuagar la superficie o elemento después de poner en contacto la superficie o elemento, respectivamente, con la composición de limpieza. En algunas modalidades, el elemento es vajilla. En algunas modalidades, el elemento es una tela. En algunas modalidades, el método comprende la etapa de enjuagar la superficie o elemento después de poner en contacto la superficie o elemento con la composición de limpieza. En algunas modalidades, el método comprende la etapa de secar la superficie o elemento después de enjuagar la superficie o elemento. En algunas modalidades, el método comprende proporcionar una composición de limpieza expuesta anteriormente y una superficie o elemento en necesidad de limpieza; y poner en contacto la composición de limpieza con la superficie o elemento en necesidad de limpieza en condiciones adecuadas para limpiar la superficie o elemento, a fin de producir una superficie o elemento limpios. En algunas modalidades, el método comprende la etapa de enjuagar la superficie o elemento limpios para producir una superficie o elemento enjuagados. En algunas modalidades, el método comprende, además, la etapa de secar la superficie o elemento enjuagados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el mapa del plásmido de pHPLT-proteinasaT.

Las Figuras 2A-2C proporcionan un árbol filogenético de 424 miembros de la familia M4 de MEROPS. La posición del eje X es correcta en la Figura 2A, mientras que el eje X de las figuras 2B y 2C se ha movido en la manipulación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona enzimas metaloproteasas mejoradas, especialmente, enzimas útiles para composiciones detergentes. Específicamente, la presente invención proporciona variantes de enzimas metaloproteasa que tienen una o más modificaciones, tales como una sustitución, en comparación con una enzima metaloproteasa genitora. Esto puede lograrse mediante la introducción de mejoras en la enzima al mejorar el desempeño de lavado, la estabilidad de la enzima en las composiciones detergentes y/o la termoestabilidad de la enzima, que mejoran la eficacia de la enzima en un ciclo de lavado. La presente invención proporciona enzimas metaloproteasa variantes, que incluyen, pero no se limitan a, enzimas metaloproteasa termolisina variantes, que son particularmente muy adecuadas y útiles en una variedad de aplicaciones de limpieza. La invención incluye composiciones que comprenden al menos una de las enzimas metaloproteasa variantes (por ejemplo, termolisinas variantes) expuestas en la presente descripción. Algunas de esas composiciones comprenden composiciones detergentes. La invención proporciona diversas especies, que incluyen las enzimas metaloproteasa variantes de las especies Bacillus y Geobacillus , y composiciones que comprenden una o más de esas termolisinas variantes. Las variantes de enzimas metaloproteasa de la presente invención pueden combinarse con otras enzimas útiles en composiciones detergentes. La invención proporciona, además, métodos de limpieza que usan variantes de enzimas metaloproteasa de la presente invención.

La invención incluye variantes enzimáticas de enzimas metaloproteasa que tienen una o más modificaciones a partir de una enzima metaloproteasa genitora. Las variantes enzimáticas pueden ser útiles en una composición detergente al tener un índice de desempeño mínimo para el desempeño de lavado, la estabilidad de la enzima en composiciones detergentes y la termoestabilidad de la enzima, en donde al menos una de estas características está mejorada con respeto a una enzima metaloproteasa genitora.

Además, la invención proporciona modificaciones, tales como una sustitución, en una o más posiciones de aminoácidos en una enzima metaloproteasa, que pueden ser útiles en una composición detergente, donde las modificaciones favorables se traducen en un índice de desempeño mínimo para el desempeño de lavado, la estabilidad de la enzima en las composiciones detergentes y la termoestabilidad de la enzima, donde al menos una de estas características está mejorada con respecto a una enzima metaloproteasa genitora. Estas modificaciones se consideran modificaciones adecuadas de la invención. Estas posiciones de aminoácidos pueden considerarse posiciones útiles para modificaciones combinables de una enzima metaloproteasa genitora. Las posiciones de los aminoácidos de la enzima metaloproteasa que son posiciones útiles pueden caracterizarse, además, por tener múltiples modificaciones que son adecuadas para usar en una composición detergente. Para cada posición, una mayor cantidad de modificaciones adecuadas posibles indica una mayor productividad de una posición particular.

Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden estas variantes de metaloproteasa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una de estas variantes de metaloproteasa.

Debe apreciarse que ciertas características de la invención que, por razones de mayor claridad, se describieron anteriormente y se describen más abajo en el contexto de modalidades separadas, pueden proporcionarse, además, combinadas en una sola modalidad. Por el contrario, diversas características de la invención que, por razones de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, pueden proporcionarse, además, por separado o en cualquier sub combinación.

Definiciones A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención implica téenicas convencionales usadas comúnmente en biología molecular, ingeniería de proteínas, microbiología y ADN recombinante, que se encuentran dentro del conocimiento de la materia. Tales técnicas son conocidas para los expertos en la materia y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia muy conocidos por los expertos en la materia. Todas las patentes, solicitudes de patentes, artículos y publicaciones mencionados en la presente descripción, tanto anteriormente como más abajo, se incorporan expresamente en la presente descripción como referenci .

A menos que se defina de otra manera en la presente descripción, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la materia a la que pertenece la presente invención. Muchos diccionarios técnicos son conocidos para los expertos en la materia. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción es útil en la práctica de la presente invención, la presente descripción proporciona algunos métodos y materiales adecuados. Por lo tanto, los términos definidos en seguida se describen completamente como referencia para la especificación en su totalidad. Además, como se usa en la presente descripción, el singular "un", "uno/a" y "el/la" incluye la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de 5' a 3'; Las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Se sabe que la presente invención no se limita a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos, debido a que pueden variar, en función del contexto que usen los expertos en la materia.

A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención usa téenicas convencionales de purificación de proteínas, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante y secuenciación de proteínas, que se encuentran dentro del conocimiento de los expertos en la materia.

Además, los encabezados proporcionados en la presente descripción no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención que se pueden tomar como referencia para la especificación en general. Por lo tanto, los términos definidos en seguida se definen completamente como referencia para la especificación en general. No obstante, para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se describe una serie de términos.

Se pretende que todo límite numérico máximo dado en esta especificación incluya todo límite numérico inferior, como si tales límites numéricos inferiores estuvieran escritos expresamente en la presente descripción. Todo límite numérico mínimo dado a lo largo de esta especificación incluye todo límite numérico superior, como si tales límites numéricos superiores estuvieran escritos expresamente en la presente descripción. Todo intervalo numérico dado a lo largo de esta especificación incluye todo intervalo numérico más estrecho que se encuentra dentro de tal intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos estuvieran escritos expresamente en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, los términos "proteasa" y "proteinasa" se refieren a una proteína enzimática que tiene la capacidad de descomponer otras proteínas. Una proteasa tiene la capacidad de dirigir la "proteólisis", que empieza el catabolismo de proteínas por hidrólisis de enlaces peptídicos que unen aminoácidos entre sí en un péptido o cadena de polipéptidos que forma la proteína. Esta actividad de una proteasa como enzima de digestión de proteínas se menciona como "actividad proteolítica". Existen muchos procedimientos muy conocidos para medir la actividad proteolítica (ver, por ejemplo, Kalisz, "Microbial Proteinases", en: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, (1988)). Por ejemplo, la actividad proteolítica puede determinarse mediante ensayos comparativos que analizan la capacidad respectiva de la proteasa para hidrolizar un sustrato comercial. Los sustratos ilustrativos útiles para el análisis de la proteasa o de la actividad proteolítica incluyen, pero no se limitan a, dimetil caseína (Sigma C-9801), colágeno bovino (Sigma C-9879), elastina bovina (Sigma E-1625) y queratina bovina (ICN Biomedical 902111). Los ensayos colorimétricos que usan estos sustratos son muy conocidos en la materia (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 99/34011 y la patente de los EE. UU. núm. 6,376,450, que se incorporan en la presente descripción como referencia). El ensayo de pNA (ver, por ejemplo, Del Mar et al . , Anal. Biochem.99:316-320

[1979]) es útil, además, para determinar la concentración de enzimas activas para las fracciones recolectadas durante la elución por gradiente. Este ensayo determina la velocidad a la cual se libera p-nitroanilina a medida que la enzima hidroliza el sustrato sintético soluble, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA). La velocidad de producción de color amarillo a partir de la reacción hidrolítica se determina a 410 nm en un espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de enzimas activas. Además, puede usarse mediciones de absorbancia a 280 nanómetros (nm) para determinar la concentración proteica total. La relación de enzimas activas/total de proteínas proporciona la pureza enzimática.

Como se usa en la presente descripción, el término "termolisina" se refiere a cualquier miembro de la familia de proteasas M4 descrita en MEROPS - The Peptidase Data base (Ver Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucí Acids Res, 34 Database issue, D270-272

[2006]), de la cual la termolisina (TLN; EC 3.4.24.27) es el prototipo. La secuencia de aminoácidos de la termolisina (EC 3.4.24.27), la metalo endo-peptidasa neutra secretada de Bacillus thermoproteolyticus fue informada por primera vez por Titani et al (Titani et al , (1972), Amino-acid sequence of thermolysin. Nature New Biol.238:35-37). Posteriormente, el gen para esta enzima fue clonado por 01Donohue et al (0'Donohue,M.J (1994) Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. Biochem. J. 300:599-603) y la secuencia se expuso como el núm. de acceso P00800 en UniProtKB/Swiss-Prot (sec. con núm. de ident.:4). Las únicas diferencias entre las secuencias de proteína informadas por Titani et al y O'Donohue et al son la confirmación de Asn en la posición 37 (en lugar de Asp) y Gln en la posición 119 (en lugar de Glu). En la presente descripción, los términos "termolisina", "estearolisina", "bacilolisina", "proteinasa-T", "PrT", "proteasa tipo termolisina" y "TLP" se usan indistintamente para referirse a la enzima metaloproteasa neutra de Bacillus thermoproteolyticus .

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido variante" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido genitor o de referencia (que incluye, pero no se limita a, los polipéptidos silvestres).

Como se usa en la presente descripción, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii , B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus g B. thuringiensis. Se reconoce que el género Bacillus continúa experimentando una reestructuración taxonómica. Por lo tanto, se pretende que el género incluya las especies que han sido reclasificadas, que incluyen, pero no se limitan a, tales organismos como B. stearothermophilus, que ahora se denominan "Geobacillus stearothermophilus" . La producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica que define el género Bacillus, aunque esta característica se aplica, además, a los recientemente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus , Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus .

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", que se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a un polímero de cualquier longitud de monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (ácido desoxirribonucleico), un polinucleótido que comprende desoxirribonucleótidos, y el ARN (ácido ribonucleico), un polímero de ribonucleótidos, son ejemplos de polinucleótidos o ácidos nucleicos que tienen distinta función biológica. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, un ADN monocatenario, bicatenario o tricatenario, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido ADN-ARN o un polímero que comprende bases purina y pirimidina, u otras bases nucleotídicas naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: genes, fragmentos de genes, fragmentos cromosómicos, marcador(es) de secuencia expresada (EST), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ribozimas, ADN complementario (ADNc), polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico e cebadores.

Como se usa en la presente descripción, el término "mutación" se refiere a los cambios realizados a una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de referencia. Se prevé que el término abarca sustituciones, inserciones y deleciones .

Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a un constructo de ácido nucleico que se usa para introducir o transferir uno o más ácidos nucleicos en una célula o tejido objetivo. Un vector se usa, típicamente, para introducir ADN foráneo en una célula o tejido. Los vectores incluyen plásmidos, vectores de clonación, bacteriófagos, virus (por ejemplo, vector viral), cósmidos, vectores de expresión, vectores lanzadera, y lo similar. Un vector incluye, típicamente, un origen de replicación, un sitio de multiclonación y un marcador seleccionable. El proceso de inserción de un vector en una célula objetivo se denomina, típicamente, transformación. En algunas modalidades, la presente invención incluye un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de metaloproteasa (por ejemplo, un polipéptido precursor o maduro de metaloproteasa) que está unido operativamente a una prosecuencia adecuada (por ejemplo, secuencia secretora, de péptido señal, etc.) capaz de efectuar la expresión de la secuencia de ADN en un huésped adecuado, y el plegado y la translocación de la cadena del polipéptido recombinante.

Como se usa en la presente descripción, el término "casete de expresión", "plásmido de expresión" o "vector de expresión" se refiere a un constructo de ácido nucleico o vector generado por recombinación o síntesis para la expresión de un ácido nucleico de interés en una célula objetivo. Un vector de expresión o casete de expresión comprende, típicamente, una secuencia promotora de nucleótidos que dirige o promueve la expresión del ácido nucleico foráneo. Además, el vector o casete de expresión incluye, típicamente, cualquier otro elemento de ácido nucleico especificado que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. Un casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están disponibles comercialmente.

En algunas modalidades, los extremos de la secuencia están cerrados, de modo que el constructo de ADN forma un círculo cerrado. La secuencia de ácido nucleico de interés, que se incorpora en el constructo de ADN, con el uso de téenicas muy conocidas en la materia, puede ser un ácido nucleico silvestre, mutante o modificado. En algunas modalidades, el constructo de ADN comprende una o más secuencias de ácido nucleico homologas al cromosoma de la célula hospedera. En otras modalidades, el constructo de ADN comprende una o más secuencias de nucleótidos no homologas. Una vez que el constructo de ADN se ensambla in vitro, puede usarse, por ejemplo, para: 1) insertar secuencias heterólogas en una secuencia objetivo deseada de una célula hospedera; y/o 2) mutagenizar una región del cromosoma de la célula hospedera (por ejemplo, reemplazar una secuencia endógena con una secuencia heteróloga); 3) eliminar los genes objetivo; y/o 4) introducir un plásmido en replicación en un huésped. "Constructo de ADN" y "casete de expresión" se usan indistintamente en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, un "plásmido" se refiere a una molécula de ADN extracromosómico que tiene la capacidad de replicarse independientemente a partir del ADN cromosómico. Un plásmido es bicatenario (be) y puede ser circular y se usa, típicamente, como un vector de clonación.

Como se usa en la presente descripción en el contexto de introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducida" se refiere a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácido nucleico en la célula. Tales métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, fusión, transfección, transformación, electroporación, conjugación y transducción de protoplastos (ver, por ejemplo, Ferrari et al . , "Genetics", en Hardwood et al . (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., págs.57-72

[1989]).

Transformación se refiere a la alteración genética de una célula como consecuencia de la absorción, la incorporación genómica opcional y la expresión de material genético (por ejemplo, ADN).

Como se usa en la presente descripción, un ácido nucleico está "unido operativamente" con otra secuencia de ácido nucleico cuando se encuentra en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o intensificador se une operativamente a una secuencia codificante de nucleótidos si el promotor afecta la transcripción de la secuencia codificante. Un sitio de unión al ribosoma puede estar unido operativamente a una secuencia codificante si se encuentra posicionado de manera que facilita la traducción de la secuencia codificante. Típicamente, las secuencias de ADN "unidas operativamente" se encuentran contiguas. Por el contrario, no se requiere que los potenciadores se encuentren contiguos. La unión se lleva a cabo por unión en sitios de restricción adecuados. Si tales sitios no existen, es posible usar adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional.

Como se usa en la presente descripción, el término "gen" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un segmento de ADN) que codifica un polipéptido e incluye regiones anteriores y posteriores a las regiones codificantes, así como secuencias intervinientes (introñes) entre los segmentos codificantes individuales (exones).

Como se usa en la presente descripción, "recombinante", cuando se usa con referencia a una célula, indica, típicamente, que la célula se ha modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico foráneo o que la célula se deriva de una célula modificada de esa manera.

Por ejemplo, una célula recombinante puede comprender un gen que no se encuentra en forma idéntica dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula, o una célula recombinante puede comprender un gen nativo (que se encuentra en la forma natural de la célula) pero que se ha modificado y reintroducido en la célula. Una célula recombinante puede comprender un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin eliminar el ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen aquellas obtenidas por reemplazo de genes, mutación específica del sitio y téenicas relacionadas conocidas para las personas con experiencia en la materia. La tecnología de ADN recombinante incluye técnicas para la producción de ADN recombinante in vitro y para la transferencia del ADN recombinante en células, en donde se puede expresar o propagar para producir un polipéptido recombinante. "Recombinación", "recombinar" y "recombinado" con respecto a los polinucleótidos o ácidos nucleicos se refieren, generalmente, al ensamblaje o combinación de dos o más cadenas o fragmentos de ácido nucleico o polinucleótidos para generar un polinucleótido o ácido nucleico nuevo. El polinucleótido o ácido nucleico recombinante se menciona, algunas veces, como una quimera. Un ácido nucleico o polipéptido es "recombinante" cuando es artificial o está manipulado genéticamente.

Como se usa en la presente descripción, el término "amplificación" de ácido nucleico o genes se refiere a un proceso por el cual se replica desproporcionadamente secuencias de ADN de manera que el ácido nucleico o gen amplificado esté presente en un número de copia superior en comparación al número presente inicialmente en el genoma. En algunas modalidades, la selección de células por crecimiento en presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima inhibitoria) produce la amplificación del gen endógeno que codifica el producto génico que se requiere para el crecimiento en presencia del fármaco o por amplificación de secuencias exógenas (por ejemplo, de entrada) que codifican este ácido nucleico, producto génico o ambos.

"Amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica la especificidad de la plantilla. Se compara con la replicación de plantilla no específica (es decir, la replicación que depende de una plantilla, pero no depende de una plantilla específica). La especificidad de la plantilla se distingue aquí de la fidelidad de replicación (es decir, síntesis de la secuencia de polinucleótidos propiamente dicha) y de la especificidad del nucleótido (ribo o desoxirribo). La especificidad de la plantilla se describe, frecuentemente, en términos de especificidad del "objetivo". Las secuencias objetivo son "objetivos" en el sentido en que se intenta clasificarlas a partir de otro ácido nucleico. Para esta clasificación se han diseñado, principalmente, téenicas de amplificación.

Como se usa en la presente descripción, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido (un polímero de residuos de nucleótidos), ya sea de origen natural como en una digestión por restricción purificada o producido sintéticamente, que tiene la capacidad de actuar como punto de iniciación de síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebadores complementario a una cadena de ácido nucleico ( por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). Un cebador es, preferentemente, monocatenario para la máxima eficiencia en amplificación, pero, alternativamente, puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para separar sus cadenas antes de usar para preparar los productos de extensión. En algunas modalidades, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para iniciar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. La longitud exacta de una cebador depende de una gran variedad de factores que incluyen temperatura, fuente del cebador y el uso del método.

Como se usa en la presente descripción, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural como en una digestión por restricción purificada o producido sintéticamente, de manera recombinante o por amplificación de PCR, que tiene, típicamente, la capacidad de hibridizarse en otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias génicas particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención se marcará con cualquier "molécula reportera" de manera que sea detectable en cualquiera de los sistemas de detección que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de enzimas (por ejemplo, ELISA, así como ensayos a base de enzimas), fluorescentes, radioactivos y luminescentes. No se pretende limitar la presente invención a ningún sistema o marcador de detección particular.

Como se usa en la presente descripción, el término "objetivo", cuando se usa con referencia a la reacción en cadena de la polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico unida por los cebadores usados para la reacción en cadena de la polimerasa. Por lo tanto, se intenta clasificar la secuencia "objetiva" a partir de otras secuencias de ácido nucleico. Un "segmento" de nucleótido es una región de un ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico objetiva.

Como se usa en la presente descripción, el término "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR, por sus siglas en inglés) se refiere a los métodos de las patentes de los EE.

UU. núms. 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, incorporadas en la presente descripción como referencia, que incluyen métodos para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia objetivo se conoce bien en la materia.

Como se usa en la presente descripción, el término "reactivos de amplificación" se refiere a los reactivos (por ejemplo, desoxirribonucleótido trifosfatos, regulador, etc.) requeridos para la amplificación, excepto por los cebadores, plantilla de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción están colocados y contenidos en un recipiente de reacción (tubo de ensayo, micropocillo, etc.).

Como se usa en la presente descripción, el término "endonucleasa de restricción" o "enzima de restricción" se refiere a una enzima (por ejemplo, enzima bacteriana) que tiene la capacidad de cortar el ADN bicatenario o monocatenario en, o cerca de, una secuencia específica de nucleótidos que se conoce como sitio de restricción. La secuencia de nucleótidos que comprende el sitio de restricción se reconoce y se desdobla mediante una endonucleasa de restricción o enzima de restricción y es, frecuentemente, el sitio para la inserción de fragmentos de ADN. Un sitio de restricción se puede modificar en un vector de expresión o constructo de ADN.

"Recombinación homologa" se refiere al intercambio de fragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN o cromosomas apareados en el sitio de secuencias de nucleótidos idénticas o prácticamente idénticas. En algunas modalidades, la interacción cromosómica es una recombinación homologa.

Se dice que un ácido nucleico o polinucleótido "codifica" un polipéptido si, en su estado natural o cuando se manipula por medio de métodos conocidos para las personas con experiencia en la materia, puede transcribirse y/o traducirse para producir el polipéptido o un fragmento de este. Se dice, además, que la cadena no codificante del ácido nucleico codifica la secuencia.

"Cepa hospedera" o "célula hospedera" se refiere a un hospedero adecuado para un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de interés.

Una "proteína" o "polipéptido" comprende una secuencia polimérica de residuos de aminoácidos. En la presente descripción, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente. A lo largo de la presente descripción se usa el código de una sola letra y de tres letras para aminoácidos como se define según la IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). La letra X sola se refiere a cualquiera de los 20 aminoácidos. Además, se comprende que un polipéptido se puede codificar por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético. Las mutaciones pueden nombrarse por el código de una letra para el aminoácido genitora, seguido de un número de posición y luego el código de una letra para el aminoácido variante. Por ejemplo, la mutación de glicina (G) en la posición 87 a serina (S) se representa como "G087S" o "G87S". Las mutaciones pueden nombrarse, además, por el código de tres letras para un aminoácido seguido de su posición en la cadena polipeptídica contando desde el N-terminal; por ejemplo, AlalO por alanina en la posición 10. Las mutaciones múltiples se indican mediante la inserción de un entre las mutaciones. Las mutaciones en las posiciones 87 y 90 están representadas como "G087S-A090Y" o "G87S-A90Y" o "G87S + A90Y" o "G087S + A090Y". Para las deleciones se usa el código de una letra "Z". Para una inserción con relación a la secuencia genitora, el código de una sola letra "Z" se encuentra a la izquierda del número de la posición. Para una deleción, el código de una sola letra "Z" se encuentra a la derecha del número de la posición. Para inserciones, el número de la posición es el número de la posición antes del aminoácido o aminoácidos insertados, más 0.01 por cada aminoácido. Por ejemplo, una inserción de tres aminoácidos alanina (A), serina (S) y tirosina (Y) entre la posición 87 y la 88 se muestra como "Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y. " Por lo tanto, la combinación de las tres mutaciones mencionadas anteriormente más una deleción en la posición 100 es: "G087S-Z087.01A-Z087.02S-Z087.03Y-A090Y-A100Z". Cuando se describe modificaciones, una posición seguida de aminoácidos mencionados entre paréntesis indica una lista de sustituciones en esa posición por cualquiera de los aminoácidos mencionados. Por ejemplo, 6 (L,I) significa que la posición 6 puede sustituirse con una leucina o isoleucina.

"Secuencia propeptídica" o "prosecuencia" se refiere a una secuencia de aminoácidos entre la secuencia del péptido señal y la secuencia de la proteasa madura que es necesaria para el plegamiento y la secreción de proteasa adecuados; a veces se denominan chaperonas intramoleculares. El d ivaje de la prosecuencia o secuencia de propéptidos produce una proteasa activa madura. Frecuentemente, las metaloproteasas bacterianas se expresan como proenzimas.

El término "secuencia señal" o "péptido señal" se refiere a una secuencia de residuos de aminoácidos que puede participar en la secreción o transporte directo de la forma madura o precursora de una proteína. La secuencia señal se localiza, típicamente, N-terminal a la secuencia de proteínas precursoras o maduras. La secuencia señal puede ser endógena o exógena. Normalmente, en la proteína madura la secuencia señal está ausente. Una secuencia señal se desdobla, típicamente, de la proteína mediante una peptidasa señal después de transportar la proteína.

El término forma "madura" de una proteína, polipéptido o péptido se refiere a la forma funcional de la proteína, polipéptido o péptido sin la secuencia de péptidos señal ni la secuencia de propéptidos.

El término forma "precursora" de una proteína o péptido se refiere a una forma madura de la proteína que tiene una prosecuencia unida operativamente al término amino o carbonilo de la proteína. La forma precursora puede tener, además, una secuencia "señal" unida operativamente al término amino de la prosecuencia. El precursor puede tener, además, polipéptidos adicionales que participan en la actividad posterior a la traducción (por ejemplo, polipéptidos clivados de ahí para dejar la forma madura de una proteína o péptido).

El término "silvestre" con referencia a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico indica que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico es una secuencia nativa o de origen natural. Como se usa en la presente descripción, el término "de origen natural" se refiere a cualquier elemento (por ejemplo, proteínas, aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) que se encuentra en la naturaleza.

Como se usa en la presente descripción, el término "de origen no natural" se refiere a cualquier elemento que no se encuentra en la naturaleza como modificación de la secuencia de tipo silvestre (por ejemplo, ácidos nucleicos recombinantes y secuencias de proteínas producidas en el laboratorio).

Como se usa en la presente descripción con respecto a las posiciones de residuos de aminoácidos, "correspondiente a" o "corresponde a" o "corresponde" se refiere a un residuo de aminoácido en la posición enumerada en una proteína o péptido o un residuo de aminoácido que es análogo, homólogo o equivalente a un residuo enumerado en una proteína o péptido. Como se usa en la presente descripción, "región correspondiente" se refiere, generalmente, a una posición análoga en proteínas relacionadas o una proteína de referencia.

Los términos "derivado de" y "obtenido de" se refieren no solo a una proteína producida o que puede producirse por una cepa del organismo en cuestión, sino, además, a una proteína codificada por una secuencia de ADN aislada de esa cepa y producida en un organismo hospedero que contiene esa secuencia de ADN. Además, el término se refiere a una proteína que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc, y que tiene las características de identificación de la proteína en cuestión. Como ejemplo, "proteasas derivadas de Bacillus" se refiere a aquellas enzimas que tienen actividad proteolítica producidas en forma natural por Bacillus, y también a proteasas serina como las producidas por fuentes de Bacillus, pero que a través del uso de téenicas de ingeniería genética son producidas por organismos distintos a Bacillus transformados con un ácido nucleico que codifica las proteasas serina.

El término "idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia, tal como se mide con uno de los siguientes algoritmos de análisis o comparación de secuencias.

Como se usa en la presente descripción, "genes homólogos" se refiere a un par de genes de especies diferentes pero, usualmente, relacionadas que se corresponden entre sí y que son idénticas o muy similares entre sí. El término abarca genes separados por especiación (es decir, el desarrollo de especies nuevas) ( por ejemplo, genes ortólogos), y también genes que se separaron por medio de duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos).

Como se usa en la presente descripción, "% de identidad o porcentaje de identidad" se refiere a la similitud de secuencia. El porcentaje de identidad puede determinarse con el uso de técnicas estándar conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482

[1981]; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.48:443

[1970]; Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444

[1988]; programas, tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de programas Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux et al . , Nucí. Acid Res.12:387-395

[1984]). Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. El algoritmo PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas con el uso de alineamientos progresivos y en pares. Además, puede diagramar un árbol que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (ver Feng y Doolittle, J. Mol. Evol.35:351-360

[1987]). El método es similar al descrito por Higgins y Sharp (ver Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153

[1989]). Los parámetros de PILEUP útiles incluyen una penalización por interrupción predeterminada de 3.00, una penalización por longitud de interrupción predeterminada de 0.10 e interrupciones finales ponderadas. Otro algoritmo útil son los algoritmos BLAST descritos por Altschul et al. (ver Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410

[1990]; y Karlin and Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787

[1993]). El programa BLAST usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se configura en los valores predeterminados.

El algoritmo BLAST del NCBI encuentra las secuencias más relevantes en lo que respecta a similitud biológica, pero no se recomienda para secuencias de consulta menores que 20 residuos (Altschul, SF et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 y Schaffer, AA et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:2994-3005). Los ejemplos de parámetros predeterminados de BLAST para búsquedas de secuencias de ácidos nucleicos son: • Umbral de palabras vecinas: 11 • Corte del valor E-: 10 • Matriz de puntuación: NUC.3.1 (coincidencia = 1, sin coincidencia = -3) • Apertura de interrupción: 5 • Extensión de interrupción: 2 • y los parámetros siguientes para búsquedas de secuencias de aminoácidos: • Tamaño de palabra: 3 • Corte del valor E-: 10 • Matriz de puntuación: BLOSUM62 • Apertura de interrupción: 11 • Extensión de interrupción: 1 Un valor de porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de residuos coincidentes dividido por el número total de residuos de la secuencia de "referencia", que incluye las interrupciones creadas por el programa para el alineamiento óptimo y/o máximo. Si una secuencia es 90% idéntica a la sec. con núm. de ident.: A, la sec. con núm. de ident.: A es la secuencia de "referencia". Los algoritmos BLAST denominan la secuencia de "referencia" como secuencia de "consulta".

El algoritmo CLUSTAL W es otro ejemplo de un algoritmo de alineamiento de secuencias. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son: penalización de apertura de 10.0 interrupción : penalización por extensión de 0.05 interrupción: matriz de peso de proteínas: serie BLOSUM matriz de peso del ADN: IUB % de secuencias divergentes con 40 retardo : distancia de la separación de 8 interrupción: peso de transiciones de ADN: 0.50 lista de residuos hidrófilos: GPSNDQEKR uso de matriz negativa: DESACTIVADO penalizaciones de residuos específicos ACTIVADO cambiados: penalizaciones de hidrofílicos ACTIVADO cambiados: penalización por separación de DESACTIVADO. interrupción final cambiada En los algoritmos CLUSTAL, se incluyen deleciones que tienen lugar en cualquiera de los extremos terminales. Por ejemplo, una variante con una deleción de cinco aminoácidos en cualquier extremo terminal (o dentro del polipéptido) de un polipéptido de 500 aminoácidos tendría un porcentaje de identidad de secuencia de 99% (495/500 residuos idénticos x 100) con respecto al polipéptido de "referencia". Esa variante sería abarcada por una variante que tiene "al menos 99% de identidad de secuencia" con el polipéptido.

Puede decirse que un polipéptido de interés es "sustancialmente idéntico" a un polipéptido de referencia si el polipéptido de interés comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o al menos aproximadamente 99.5% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. La identidad porcentual entre tales polipéptidos puede determinarse manualmente por inspección de las dos secuencias de polipéptidos con alineamiento óptima o con el uso de programas o algoritmos (por ejemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) con el uso de parámetros estándar. Una indicación de que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido tiene reactividad cruzada inmunológica ente con el segundo polipéptido. Típicamente, los polipéptidos que difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos tienen reactividad cruzada inmunológicamente. Por lo tanto, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren únicamente por una sustitución conservadora de aminoácidos o una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

Puede decirse que un ácido nucleico de interés es "prácticamente idéntico" a un ácido nucleico de referencia si el ácido nucleico de interés comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o al menos aproximadamente 99.5% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de referencia. La identidad porcentual entre tales ácidos nucleicos puede determinarse manualmente por inspección de las dos secuencias de ácido nucleico con alineamiento óptima o con el uso de programas o algoritmos (por ejemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) con el uso de parámetros estándar. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas consiste en que las dos moléculas de ácido nucleico se hibridizan entre sí en condiciones rigurosas (por ejemplo, en un intervalo de rigurosidad media a alta).

Un ácido nucleico o polinucleótido se "aísla" cuando se separa al menos parcialmente o totalmente de otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, otras proteínas, ácidos nucleicos, células, etc. De manera similar, un polipéptido, proteína o péptido se "aísla" cuando se separa al menos parcialmente o totalmente de otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, otras proteínas, ácidos nucleicos, células, etc. Sobre una base molar, una especie aislada es más abundante que otras especies de una composición. Por ejemplo, una especie aislada puede comprender al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Preferentemente, la especie de interés se purifica hasta una homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por medio de métodos de detección convencionales). La pureza y homogeneidad pueden determinarse con el uso de una serie de téenicas muy conocidas en la materia, tales como electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida de una muestra de ácido nucleico o una proteína, respectivamente, seguido de la visualización tras la tinción. Si se desea puede usarse una técnica de alta resolución, tal como cromatografía en líquido de alto desempeño (HPLC, por sus siglas en inglés) o un medio similar para la purificación del material.

"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico forma un dúplex, es decir, aparea sus bases, con una cadena complementaria. Se considera que una secuencia de ácido nucleico es "hibridable selectivamente" a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí en condiciones de rigurosidad de hibridación y lavado moderada a alta. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (T ) del ácido nucleico que se une al complejo o la sonda. Por ejemplo, la "rigurosidad máxima" ocurre, típicamente, a aproximadamente Tm-5°C (5o menor que la Tm de la sonda); "rigurosidad alta" a aproximadamente 5-10°C menor que la Tm; "rigurosidad intermedia" a aproximadamente 10-20°C menor que la Tm de la sonda; y "rigurosidad baja" a aproximadamente 20-25°C menor que la Tm. Desde el punto de vista funcional, puede usarse condiciones de rigurosidad máxima para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que puede usarse hibridación de rigurosidad intermedia o baja para identificar o detectar homólogos de secuencia de polinucleótidos.

Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada y alta son muy conocidas en la materia. Las condiciones de hibridación rigurosas se ejemplifican mediante la hibridación bajo las siguientes condiciones: 65°C y 0.IX SSC (en donde IX SSC = NaCl 0.15 M, citrato de Na3 0.015 M, pH 7.0). Los ácidos nucleicos dúplexes, hibridados se caracterizan por una temperatura de fusión (Tm), en donde una mitad de los ácidos nucleicos hibridados no están apareados con la cadena complementaria. Los ácidos nucleicos no coincidentes dentro del dúplex bajan la Tm. Las condiciones de hibridación muy rigurosas comprenden 68°C y SSC 0.IX. Un ácido nucleico que codifica una metaloproteasa variante puede tener una Tm reducida en 1°C - 3°C o más, en comparación con un dúplex formado entre el ácido nucleico de la sec. con núm. de ident .: 4 y su complemento idéntico.

Otro ejemplo de condiciones de rigurosidad alta incluye la hibridación a aproximadamente 42°C en 50% de formamida, SSC 5X, solución de Denhardt 5X, 0.5% de SDS y 100 mg/ml de portador desnaturalizado de ADN, seguido de lavado, dos veces en SSC 2X y 0.5% de SDS a temperatura ambiente y dos veces más en SSC 0.IX y 0.5% de SDS a 42°C. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada incluye una incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende 20% de formamida, SSC 5 x (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN desnaturalizado y cortado de esperma de salmón, seguido del lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37 - 50°C. Los expertos en la materia saben cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. para adaptar factores tales como longitud de la sonda y lo similar.

El término "purificado", tal como se aplica a los ácidos nucleicos o polipéptidos, indica, generalmente, un ácido nucleico o polipéptido que está esencialmente libre de otros componentes, según determinación por medio de téenicas analíticas muy conocidas en la materia (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido purificado forma una banda distinta en un gel electroforético, eluato cromatográfico y/o un medio sujeto a centrifugación en gradiente de densidad). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que origina, prácticamente, una banda en un gel electroforático está "purificado". Un ácido nucleico o polipéptido purificado es al menos aproximadamente 50% puro, usualmente, al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 99.5%, aproximadamente 99.6%, aproximadamente 99.7%, aproximadamente 99.8% o más puro (por ejemplo, por ciento en peso sobre una base molar). En un sentido relacionado, la invención proporciona métodos para enriquecer composiciones para una o más moléculas de la invención, tales como uno o más polipéptidos o polinucleótidos de la invención. Una composición se enriquece para una molécula cuando hay un incremento sustancial en la concentración de la molécula después de aplicar una téenica de purificación o de enriquecimiento. Un polipéptido o polinucleótido sustancialmente puro de la invención (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido de metaloproteasa sustancialmente puro que codifica un polipéptido de metaloproteasa de la invención, respectivamente) comprende, típicamente, al menos aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98, aproximadamente 99%, aproximadamente 99.5% o más en peso (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares de una composición particular.

El término "enriquecido/a" se refiere a un compuesto, polipéptido, célula, ácido nucleico, aminoácido u otro material o componente especificado que está presente en una composición en una concentración relativa o absoluta que es mayor que una composición de partida.

En un sentido relacionado, la invención proporciona métodos de enriquecimiento de composiciones para una o más moléculas de la invención, tales como uno o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, uno o más polipéptidos de metaloproteasas de la invención) o uno o más ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de metaloproteasas de la invención) . Una composición se enriquece para una molécula cuando hay un incremento sustancial en la concentración de la molécula después de aplicar una téenica de purificación o de enriquecimiento. Un polipéptido o polinucleót ido sustancialmente puro comprenden, típicamente, al menos aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98, aproximadamente 99%, aproximadamente 99.5% o más en peso (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares de una composición particular.

Como se usa en la presente descripción, el término "mutagénesis combinable" o "combinable" se refiere a métodos para generar genotecas de variantes de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico de referencia. En estas genotecas, las variantes contienen una o varias mutaciones seleccionadas de un grupo predefinido de mutaciones. Los métodos proporcionan, además, medios para introducir mutaciones aleatorias que no eran elementos del grupo predefinido de mutaciones. Tales métodos incluyen los que se exponen en la patente de los EE. UU. núm.6,582,914, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Tales métodos de mutagénesis combinable incluyen y/o abarcan métodos incorporados en kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de mutagénesis multisitio dirigida QUIKCHANGE® (Stratagene), fusión por PCR/PCR de extensión).

Como se usa en la presente descripción, "que tiene mejores propiedades", usado en relación con una proteasa variante, se refiere a una proteasa variante que tiene un desempeño de lavado o limpieza mayor o mejorado y/o una estabilidad mayor o mejorada, opcionalmente, con un desempeño de lavado o limpieza prolongado, con respecto a la proteasa de referencia correspondiente (por ejemplo, proteasa silvestre o natural). Las propiedades mejoradas de una proteasa variante pueden comprender un desempeño de lavado o limpieza mejorado y/o una estabilidad mejorada. En algunas modalidades, la invención proporciona proteasas variantes de la invención que exhiben una o más de las propiedades siguientes: mejor desempeño en el lavado manual, mejor desempeño en el lavado manual de vajilla, mejor desempeño en el lavado automático de vajilla, mejor desempeño de lavandería y/o mejor estabilidad con respecto a una proteasa de referencia (por ejemplo, proteasa silvestre, tal como una termolisina silvestre).

Como se usa en la presente descripción, el término "ensayo funcional" se refiere a un ensayo que proporciona una indicación de la actividad de una proteína. En algunas modalidades, el término se refiere a sistemas de ensayo en los que se analiza una proteína para evaluar su potencial para funcionar en su capacidad usual. Por ejemplo, en el caso de enzimas, un ensayo funcional implica determinar la eficacia de la enzima para catalizar una reacción.

Como se usa en la presente descripción, el término "propiedad objetivo" se refiere a la propiedad del gen inicial que se alterará. No se pretende limitar la presente invención a ninguna propiedad destino específica. Sin embargo, en algunas modalidades, la propiedad objetivo es la estabilidad de un producto génico (por ejemplo, resistencia a la desnaturalización, la proteólisis u otros factores degradantes), mientras que en otras modalidades se altera el nivel de producción en un hospedero de producción.

El término "propiedad" o equivalentes gramaticales de este en el contexto de un ácido nucleico, como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier característica o atributo de un ácido nucleico que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, una propiedad que afecta la unión a un polipéptido, una propiedad conferida en una célula que comprende un ácido nucleico específico, una propiedad que afecta la transcripción génica (por ejemplo, resistencia del promotor, reconocimiento del promotor, regulación del promotor, función potenciadora), una propiedad que afecta el procesamiento de ARN (por ejemplo, corte y empalme de ARN, estabilidad del ARN, conformación del ARN y modificación posterior a la transcripción), una propiedad que afecta la traducción ( por ejemplo, nivel, regulación, unión del ARNm a proteínas de ribosomas, modificación posterior a la traducción). Por ejemplo, un sitio de unión para un factor de transcripción, polimerasa, factor regulador, etc., de un ácido nucleico puede alterarse para producir características deseadas o para identificar características no deseables.

El término "propiedad" o equivalentes gramaticales de este en el contexto de un polipéptido (que incluye proteínas), como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier característica o atributo de un polipéptido que puede seleccionarse o detectarse. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, estabilidad oxidativa, especificidad del sustrato, actividad catalítica, actividad enzimática, estabilidad térmica, estabilidad alcalina, perfil de actividad al pH, resistencia a la degradación proteolítica, KM, kcat, relación kcat/kM, plegado de proteínas, inducción de una respuesta inmune, capacidad para unirse a un ligando, capacidad para unirse a un receptor, capacidad para secretarse, capacidad para mostrarse en la superficie de una célula, capacidad para oligomerizarse, capacidad para señalizar, capacidad para estimular la proliferación celular, capacidad para inhibir la proliferación celular, capacidad para inducir la apoptosis, capacidad para modificarse por medio de fosforilación o glicosilación y/o capacidad para tratar una enfermedad, etc.

Como se usa en la presente descripción, el término "análisis" tiene el significado habitual en la materia. En un proceso de análisis ilustrativo se proporciona un polipéptido variante o ácido nucleico mutante codificado a partir de allí y se evalúa o determina una propiedad del polipéptido variante o ácido nucleico mutante, respectivamente. La propiedad del polipéptido variante o ácido nucleico mutante determinada puede compararse con una propiedad del ácido nucleico precursor (genitor) o con la propiedad del polipéptido genitor correspondiente, respectivamente.

Resultará evidente para la persona con experiencia en la materia que el procedimiento de análisis para obtener un ácido nucleico o proteína con una propiedad alterada depende de la propiedad del material inicial para la que se pretende facilitar la modificación por medio de la generación del ácido nucleico mutante. Por lo tanto, la persona con experiencia en la materia apreciará que la invención no está limitada a ninguna propiedad específica que se analizará y que la siguiente descripción de propiedades enumera solamente ejemplos ilustrativos. Los métodos de análisis para una propiedad específica se describen, generalmente, en la materia. Por ejemplo, es posible medir la unión, pH, especificidad, etc. antes y después de la mutación, en donde un cambio indica una alteración. Preferentemente, los análisis realizados son de gran productividad e incluyen el análisis simultáneo de muestras múltiples que incluyen, pero no se limitan a, ensayos en los que se usan matrices, exhibición de fagos y múltiples sustratos y/o indicadores.

Como se usa en la presente descripción, en algunas modalidades, un proceso de análisis abarca una o más etapas de selección en las cuales las variantes de interés se enriquecen a partir de una población de variantes. Los ejemplos de estas modalidades incluyen la selección de variantes que confieren una ventaja de crecimiento para el organismo hospedero así como también la exhibición de fagos o cualquier otro método de exhibición, en donde las variantes se pueden captar a partir de una población de variantes en base a sus propiedades de unión o catalíticas. En algunas modalidades, una genoteca de variantes se expone a estrés (por ejemplo, calor, desnaturalización, etc.) y, posteriormente, las variantes que siguen intactas se identifican en un análisis o se enriquecen por medio de selección. Se prevé que el término abarca cualquier medio adecuado para la selección. Ciertamente, no se pretende limitar la presente invención a ningún método de análisis específico.

Los términos "secuencia de ácido nucleico modificada" y "gen modificado" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a una secuencia de ácido nucleico que incluye una deleción, inserción o interrupción de una secuencia de ácido nucleico natural (es decir, silvestre). En algunas modalidades, el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico modificado es una proteína truncada (por ejemplo, si la modificación es una deleción o interrupción de la secuencia). En algunas modalidades, la proteína truncada mantiene la actividad biológica. En modalidades alternativas, el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico modificada es una proteína alargada (por ejemplo, modificaciones que comprenden una inserción en la secuencia de ácido nucleico). En algunas modalidades, una inserción de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico conduce a una proteína truncada (por ejemplo, cuando la inserción produce la formación de un codón de terminación). Por lo tanto, una inserción puede producir una proteína truncada o una proteína alargada como un producto de expresión.

Una secuencia de ácido nucleico "mutante" se refiere, típicamente, a una secuencia de ácido nucleico que tiene una alteración en por lo menos un codón que ocurre en la secuencia silvestre de la célula hospedera de manera que el producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico mutante sea una proteína con una secuencia de aminoácidos alterada con relación a la proteína silvestre. El producto de expresión puede tener una capacidad funcional alterada (por ejemplo, actividad enzimática mejorada).

Como se usa en la presente descripción, la frase "alteración en la especificidad del sustrato" se refiere a cambios en la especificidad del sustrato de una enzima. En algunas modalidades, un cambio en la especificidad del sustrato se define como un cambio en kcat y/o Km para un sustrato específico que resulta de mutaciones de la enzima o la alteración de las condiciones de reacción. La especificidad del sustrato de una enzima se determina mediante la comparación de las eficacias catalíticas que exhibe con sustratos diferentes. Estas determinaciones son particularmente útiles para evaluar la eficacia de enzimas mutantes, tal como se desea, generalmente, para producir enzimas variantes que exhiben relaciones kCat/Km mayores para los sustratos de interés. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a ninguna composición de sustrato o especificidad de sustrato particular.

Como se usa en la presente descripción, "propiedad de la superficie" se usa en referencia a la carga electrostática, así como también las propiedades tales como hidrofobicidad e hidrofilicidad mostradas por la superficie de una proteína.

Como se usa en la presente descripción, el término "carga neta" se define como la suma de todas las cargas presentes en una molécula. Los "cambios en la carga neta" se realizan en una molécula de proteína genitora para producir una variante con una carga neta distinta a la de la molécula genitora (es decir, la variante tiene una carga neta que no es igual a la de la molécula genitora). Por ejemplo, la sustitución de un aminoácido neutro con un aminoácido con carga negativa o de un aminoácido con carga positiva con un aminoácido neutro produce una carga neta de -1 con respecto a la molécula genitora. La sustitución de un aminoácido con carga positiva con un aminoácido con carga negativa produce una carga neta de -2 con respecto a la genitora. La sustitución de un aminoácido neutro con un aminoácido con carga positiva o de un aminoácido con carga negativa con un aminoácido neutro produce una carga neta de +1 con respecto a la genitora. La sustitución de un aminoácido con carga negativa con un aminoácido con carga positiva produce una carga neta de +2 con respecto a la genitora. La carga neta de una proteína genitora se puede alterar, además, mediante la deleción y/o inserción de aminoácidos con carga Los términos "térmicamente estable", "termoestable" y "termoestabilidad" se refieren a proteasas que mantienen un nivel específico de actividad enzimática después de la exposición a temperaturas identificadas durante un periodo de tiempo determinado en condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, de hidrólisis, de limpieza u otro proceso de la invención, mientras están expuestas a temperaturas alteradas. "Temperaturas alteradas" incluyen temperaturas mayores o menores. En algunas modalidades, las proteasas retienen al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de la actividad proteolítica después de la exposición a temperaturas alteradas durante un período de tiempo dado, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 120 minutos, aproximadamente 180 minutos, aproximadamente 240 minutos, aproximadamente 300 minutos, etc.

El término "mejor estabilidad" en el contexto de una proteasa estable a la oxidación, quelación, calor y/o al pH se refiere a una mayor actividad proteolítica retenida en el tiempo en comparación con otras proteasas (por ejemplo, proteasas termolisina) y/o enzimas silvestres.

El término "menor estabilidad" en el contexto de una proteasa estable a la oxidación, quelación, calor y/o al pH se refiere a una menor actividad proteolítica retenida en el tiempo en comparación con otras proteasas (por ejemplo, proteasas termolisina) y/o enzimas silvestres.

El término "actividad de limpieza" se refiere a un desempeño de limpieza obtenido por una proteasa variante o proteasa de referencia en condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, de hidrólisis, limpieza u otro proceso de la invención. En algunas modalidades, el desempeño de limpieza de una proteasa variante o proteasa de referencia puede determinarse con el uso de diversos ensayos para limpieza de una o más manchas diversas sensibles a las enzimas en un artículo o superficie (por ejemplo, una mancha de alimentos, pasto, sangre, tinta, leche, aceite y/o proteína de huevo). Para determinar el desempeño de limpieza de una proteasa variante o de referencia se puede exponer la mancha en el artículo o superficie a una o varias condiciones de lavado estándar y evaluar el nivel de eliminación de la mancha con el uso de diversas metodologías cromatográficas, espectrofotométricas u otras metodologías cuantitativas. Los ensayos y métodos de limpieza ilustrativos son conocidos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la patente núm. WO 99/34011 y patente de los EE. UU. núm. 6,605,458, que se incorporan en la presente descripción como referencia, así como los ensayos y métodos de limpieza incluidos en los ejemplos que se proporcionan más abajo.

El término "cantidad con eficacia limpiadora" de una proteasa variante o proteasa de referencia se refiere a la cantidad de proteasa que logra el nivel deseado de actividad enzimática en una composición de limpieza específica. Un experto en la materia puede determinar fácilmente tales cantidades eficaces y se basan en varios factores, tales como la proteasa particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza y si se requiere una composición líquida o seca ( por ejemplo, granular, tableta, barra), etc.

El término "material adicional de limpieza" se refiere a cualquier material líquido, sólido o gaseoso incluido en la composición de limpieza aparte de una proteasa variante de la invención. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen uno o más materiales adicionales de limpieza. Cada material adicional de limpieza se selecciona, típicamente, según el tipo y la forma particulares de la composición de limpieza ( por ejemplo, líquido, gránulos, polvo, barra, pasta, aerosol, tableta, gel, espuma u otra composición). Preferentemente, cada material adicional de limpieza es compatible con la enzima proteasa usada en la composición.

El término "desempeño mejorado" en el contexto de la actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza incrementada o mayor de una enzima sobre ciertas manchas sensibles a enzimas, tales como huevo, leche, pasto, tinta, aceite y/o sangre, según la evaluación usual después de un ciclo de lavado y/o múltiples ciclos de lavado estándar.

El término "desempeño reducido" en el contexto de la actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza reducida o menor de una enzima sobre ciertas manchas sensibles a enzimas, tales como huevo, leche, pasto o sangre, según la evaluación usual después de un ciclo de lavado estándar .

El desempeño de limpieza puede determinarse al comparar las proteasas variantes de la presente invención con proteasas de referencia en diversos ensayos de limpieza relacionados con las manchas sensibles a las enzimas, tales como pasto, sangre, tinta, aceite y/o leche, determinados por medio de metodologías espectrofotométricas o analíticas comunes después de condiciones estándar de ciclos de lavado.

Como se usa en la presente descripción, el término "producto de consumo" significa un producto para el cuidado de las telas y el hogar. Como se usa en la presente descripción, el término "producto para el cuidado del hogar y de telas" o "producto para el cuidado doméstico y de telas" incluye productos destinados, generalmente, al uso o consumo en la forma en que se venden y que son para el tratamiento de telas, superficies duras y cualquier otra superficie, y sistemas de limpieza para el cuidado y la limpieza de superficies inanimadas, así como productos para el acondicionamiento de telas y otros productos diseñados específicamente para el cuidado y mantenimiento de telas y productos para el cuidado del aire, que incluyen: cuidado del aire, que incluye ambientadores y sistemas de suministro de aromas, cuidado del automóvil, cuidado de mascotas, cuidado del ganado, cuidado personal, cuidado de joyas, lavado de vajilla, acondicionamiento de telas (que incluye ablandamiento y/o desodorización), detergentes de lavandería, aditivos para lavandería y enjuague y/o cuidado, composiciones de pretratamiento para limpieza, limpieza y/o tratamiento de superficies duras, que incluye limpiadores para pisos e inodoros, limpiadores y/o tratamientos para vidrios, limpiadores y/o tratamientos para azulejos, limpiadores y/o tratamientos para cerámica y otros limpiadores para consumidores o el uso institucional. En algunas modalidades, los productos para el cuidado de las telas y el hogar son adecuados para usar en heridas y/o la piel. "Producto para el cuidado de las telas y el hogar" incluye productos para uso doméstico e institucional.

Como se usa en la presente descripción, el término "productos no previstos para el cuidado de las telas y el hogar" se refiere a composiciones que se añaden a otras composiciones para producir un producto final que puede ser un producto para el cuidado de las telas y el hogar.

Como se usa en la presente descripción, el término "composición de limpieza para uso institucional" se refiere a productos adecuados para usar en instituciones que incluyen, pero no se limitan a, escuelas, hospitales, fábricas, almacenes, corporaciones, edificios, restaurantes, complejos y edificios de oficinas, plantas de procesamiento y/o fabricación, hospitales veterinarios, granjas industriales, fincas industriales, etc.

Como se usa en la presente descripción, el término "composición de limpieza y/o tratamiento" es un subconjunto de productos para el cuidado de las telas y el hogar que incluye, a menos que se indique de cualquier otra forma, composiciones adecuadas para limpiar y/o tratar artículos. Esos productos incluyen, pero no se limitan a, productos para el tratamiento de telas, superficies duras y otras superficies en el área del cuidado de telas y el hogar, que incluyen: cuidado del aire, que incluye ambientadores y sistemas de suministro de aroma, cuidado del automóvil, lavado de vajilla, acondicionamiento de telas (que incluye ablandamiento y/o desodorización), detergentes de lavandería, aditivos para lavandería y enjuague y/o cuidado, limpieza y/o tratamiento de superficies duras, que incluye limpiadores para pisos e inodoros, agentes de lavado granulados o en forma de polvo para todo uso o "de gran desempeño", especialmente detergentes limpiadores; agentes de lavado para todo uso en forma de líquido, gel o pasta, especialmente los tipos denominados de gran desempeño; detergentes líquidos para telas delicadas; agentes de lavado manual de vajilla o agentes de bajo desempeño para lavado de vajilla, especialmente los del tipo de alta formación de espuma; agentes para máquinas lavavajilla, que incluyen los diversos tipos en tableta, granulado, líquido y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional: champús para automóviles o alfombras, limpiadores de baño, que incluyen limpiadores de inodoros; así como auxiliares de limpieza, tales como aditivos e blanqueo y limpiamanchas en barra, o tipos de pretratamiento, productos cargados con sustrato, tales como láminas para añadir a la secadora.

Ciertamente, como se usa en la presente descripción, la "composición de limpieza" o "formulación de limpieza" de la invención se refiere a cualquier composición de la invención útil para remover o eliminar un compuesto (por ejemplo, compuesto no deseado) de un objeto, elemento o superficie a limpiar, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, una tela, un artículo de tela, un artículo de vajilla, un artículo de vajilla de mesa, un artículo de cristalería, lentes de contacto, otro sustrato sólido, pelo (champú) (que incluye el pelo de un ser humano o animal), piel (jabón y/o crema), dientes (enjuagues bucales, pastas de dientes), superficie de un artículo u objeto (por ejemplo, superficies duras, tales como la superficie dura de una mesa, tablero, pared, artículo de mobiliario, piso, cielorraso, artículo que no es vajilla, artículo que no es vajilla de mesa, etc.), filtros, membranas (por ejemplo, membranas de filtración que incluyen, pero no se limitan a, membranas de ultrafiltración), etc. El término abarca cualquier material y/o compuesto añadido seleccionado para el tipo específico de composición de limpieza deseado y la forma del producto (por ejemplo, líquido, gel, gránulo, rocío u otra composición), siempre que la composición sea compatible con la proteasa y otra u otras enzimas usadas en la composición. La selección específica de materiales de la composición de limpieza se realiza fácilmente al considerar la superficie, el objeto, artículo o tela que se va a limpiar y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso.

Las composiciones de limpieza y formulaciones de limpieza incluyen cualquier composición adecuada para limpiar, blanquear, desinfectar y/o esterilizar cualquier objeto, artículo y/o superficie. Esas composiciones y formulaciones incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones líquidas y/o composiciones sólidas, que incluyen composiciones de limpieza o detergentes (por ejemplo, composiciones de limpieza o composiciones detergentes líquidas, en tableta, en gel, en barra, en gránulos y/o composiciones sólidas o detergentes de lavandería y composiciones detergentes para telas delicadas; composiciones y formulaciones de limpieza para superficies duras, tales como mostradores de vidrio, madera, cerámica y metal y ventanas; limpiadores para alfombras; limpiadores para hornos; refrescantes para telas; suavizantes para telas; y composiciones detergentes o reforzadoras de limpieza de ropa y textiles, composiciones aditivas de limpieza de ropa y composiciones de limpieza con rastreadores previos de manchas; composiciones para el lavado de vajilla, que incluyen composiciones para el lavado de vajilla a mano o manualmente (por ejemplo, detergentes para el lavado de vajilla "a mano" o "manual") y composiciones para el lavado automático de vajilla (por ejemplo, "detergentes para el lavado automático de vajilla").

Como se usa en la presente descripción, composición de limpieza o formulaciones de limpieza incluyen, a menos que se indique de cualquier otra manera, agentes de lavado en gránulos o en polvo para todo uso o de gran desempeño, especialmente, detergentes de limpieza; agentes de lavado líquidos, en gránulos, en gel, sólidos, en tabletas o en pasta multiusos, especialmente, el denominado detergente líquido de gran desempeño (HDL, por sus siglas en inglés) o detergente en polvo de gran desempeño (HDD, por sus siglas en inglés); detergentes líquidos para telas finas; agentes para el lavado de vajilla a mano o manual que incluyen aquellos altamente espumantes; agentes para el lavado de vajilla a mano o manual, para el lavado automático de vajilla o para el lavado de vajilla o vajilla de mesa que incluyen los diversos tipos en tabletas, en polvo, sólidos, en gránulos, líquidos, en gel y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes líquidos de limpieza y agentes desinfectantes que incluyen los tipos antibacteriales para las manos, barras de limpieza, enjuagues bucales, limpiadores de dentaduras postizas, champús para carros, champús para alfombras, limpiadores de baño; champús para el cabello y/o enjuagues para el cabello, para humanos y otros animales; geles de ducha y baños de espuma, y limpiadores de metales; así como auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y "limpiamanchas en barra" o tipos de tratamiento previo. En algunas modalidades, las composiciones granuladas están en forma "compacta"; en algunas modalidades, las composiciones líquidas están en forma "concentrada".

Como se usa en la presente descripción, las "composiciones para limpiar telas" incluyen composiciones detergentes para lavar ropa a mano o en una máquina que incluyen composiciones aditivas para lavar ropa y composiciones adecuadas para usar en el remojo y/o tratamiento previo de telas manchadas ( p . ej ., prendas de vestir, ropa blanca y otros materiales textiles).

Como se usa en la presente descripción, las "composiciones para limpiar artículos no tejidos" incluyen composiciones de limpieza de superficies no textiles (es decir. , no tejidas) que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, composiciones detergentes para lavar vajilla a mano o manual o en máquina lavaplatos automática, composiciones de limpieza oral, composiciones de limpieza de dentaduras postizas y composiciones de aseo personal.

Como se usa en la presente descripción, el término "composición para el tratamiento de telas y/o limpieza de telas y/o superficies duras" es un subconjunto de composiciones de limpieza y tratamiento que incluyen, a menos que se indique de cualquier otra manera, agentes de lavado para todo uso o "de gran desempeño", en forma granulada o en polvo, especialmente, detergentes de limpieza; agentes de lavado para todo uso en forma de líquido, gel o pasta, especialmente los tipos líquidos denominados de gran desempeño; detergentes líquidos para telas finas; agentes para el lavado manual de vajilla o agentes de bajo desempeño para el lavado de vajilla, especialmente los del tipo de alta formación de espuma; agentes para máquinas lavavajilla, que incluyen los diversos tipos en tableta, granulado, líquido y auxiliares de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes líquidos para limpieza y desinfección, champús para automóviles o alfombras, limpiadores de baño que incluyen limpiadores de inodoros; productos para el acondicionamiento de telas, que incluyen ablandamiento y/o desodorización, que pueden ser en forma líquida, sólida y/o láminas para secadora; así como auxiliares de limpieza, tales como aditivos de blanqueo y limpiamanchas en barra, o tipos de pretratamiento, productos cargados con sustrato, tales como láminas para añadir a la secadora. Todos esos productos que son aplicables pueden estar en forma estándar, concentrada o incluso altamente concentrada aun hasta el alcance en que los productos pueden ser, en cierto aspecto, no acuosos.

Como se usa en la presente descripción, el término "composición detergente" o "formulación detergente" se usa con referencia a una composición prevista para usar en un medio de lavado para la limpieza de objetos manchados o sucios, que incluyen objetos o artículos tejidos y/o no tejidos particulares. Tales composiciones de la presente invención no se limitan a ninguna composición o formulación detergente particular. Ciertamente, en algunas modalidades, los detergentes de la invención comprenden al menos una proteasa variante de la invención y, adicionalmente, uno o más tensioactivos, transíerasa(s), enzimas hidrolíticas, oxidorreductasas, adyuvantes (por ejemplo, una sal adyuvante), agentes de blanqueo, activadores de blanqueo, agentes azulantes, tintes fluorescentes, inhibidores de endurecimiento, agentes de enmascaramiento, activadores de enzimas, antioxidantes y/o solubilizantes. En algunos casos una sal adyuvante es una mezcla de una sal silicato y una sal fosfato, preferentemente, con más silicato (por ejemplo, metasilicato sódico) que fosfato (por ejemplo, tripolifosfato sódico) . Algunas composiciones de la invención, tales como, pero sin limitarse a, las composiciones de limpieza o composiciones detergentes, no contienen ningún fosfato (por ejemplo, sal fosfato o adyuvante de fosfato).

Como se usa en la presente descripción, el término "blanqueo" se refiere al tratamiento de un material (por ejemplo, tela, ropa, pulpa, etc.) o superficie durante el tiempo suficiente y/o con las condiciones adecuadas de pH y/o temperatura para conseguir una mejora ( por ejemplo, blanqueo) y/o limpieza del material. Los ejemplos de sustancias químicas adecuadas para el blanqueo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, CIO2, H2O2, perácidos, NO2, etc.

Como se usa en la presente descripción, "desempeño de lavado" de una proteasa (por ejemplo, una proteasa variante de la invención) se refiere a la contribución de una proteasa variante para el lavado que proporciona un desempeño de limpieza adicional al detergente en comparación con el detergente en cuya composición no se añade la proteasa variante. El desempeño de lavado se compara en condiciones relevantes de lavado. En algunos sistemas de prueba, otros factores relevantes tales como la composición detergente, la concentración de espuma, la dureza del agua, la mecánica del lavado, el tiempo, el pH y/o la temperatura, se pueden controlar a manera de imitar las condiciones típicas para la aplicación doméstica en un cierto segmento del mercado (por ejemplo, lavado de vajilla a mano o manual, lavado automático de vajilla, limpieza de vajilla, limpieza de vajilla de mesa, limpieza de telas, etc.).

El término "condiciones relevantes de lavado" se usa en la presente descripción para indicar las condiciones, particularmente, la temperatura del lavado, el tiempo, la mecánica del lavado, la concentración de espuma, el tipo de detergente y la dureza del agua, que se usan realmente en hogares en un segmento del mercado de detergente para lavado manual de vajilla, para lavado automático de vajilla o para lavado de ropa.

El término "desempeño de lavado mejorado" se usa para indicar que se obtiene un mejor resultado final en la eliminación de manchas en condiciones relevantes de lavado, o que se requiere menos proteasa variante, en peso, para obtener el mismo resultado final con relación a la proteasa silvestre o proteasa genitora inicial correspondiente.

Como se usa en la presente descripción, el término "desinfectar" se refiere a eliminar los contaminantes de las superficies, así como inhibir o matar los microbios en las superficies de artículos. La presente invención no pretende limitarse a ninguna superficie, artículo o contaminante(s) o microbios particulares a eliminar.

La forma "compacta" de las composiciones de limpieza en la presente descripción se refleja mejor por la densidad y, en términos de composición, por la cantidad de sal inorgánica de relleno. Las sales inorgánicas de relleno son ingredientes convencionales de composiciones detergentes en polvo. En las composiciones detergentes convencionales las sales de relleno están presentes en cantidades sustanciales, típicamente, de aproximadamente 17 a aproximadamente 35% en peso de la composición total. E Enn ccoonnttrraassttee,, en las composiciones compactas la sal de relleno está presente en cantidades no mayores que aproximadamente 15% de la composición total. En algunas modalidades, la sal de relleno se encuentra presente en cantidades que no exceden aproximadamente 10% o, con mayor preferencia, aproximadamente 5%, en peso de la composición. En algunas modalidades, las sales inorgánicas de relleno se seleccionan de sales álcali y de metal de tierra alcalina de sulfatos y cloruros. En algunas modalidades, la sal de relleno es sulfato de sodio.

En la presente descripción, la posición de un residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos dada se numera, típicamente, con la numeración de la posición del residuo de aminoácido correspondiente de la secuencia de aminoácidos de termolisina de G. caldoproteolyticus que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3. La secuencia de aminoácidos de termolisina de G. caldoproteolyticus que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3, sirve, por lo tanto, como secuencia de referencia. Una secuencia de aminoácidos dada, tal como una secuencia de aminoácidos de proteasa variante descrita en la presente descripción, puede alinearse con la secuencia de G. caldoproteolyticus (sec. con núm. de ident.: 3) con el uso de un algoritmo de alineamiento descrito en la presente descripción, y un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos dada que se alinea (preferentemente, se alinea de manera óptima) con un residuo de aminoácido de la secuencia de G. caldoproteolyticus puede numerarse convenientemente por referencia al residuo de aminoácido correspondiente en la secuencia de termolisina de G. caldoproteolyticus .

Generalmente, la nomenclatura usada en la presente descripción y muchos de los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, biología molecular, química de ácidos nucleicos y química de proteínas que se describen a continuación son muy conocidos y las personas con experiencia en la materia los usan comúnmente. Los métodos para la producción y manipulación de métodos recombinantes de ácidos nucleicos, síntesis de ácidos nucleicos, métodos de cultivos celulares e incorporación de transgenes (por ejemplo, transfección, electroporación) son conocidos para aquellos con experiencia en la materia y se describen en numerosos textos estándar. Las etapas de síntesis y purificación de oligonucleótidos se llevan a cabo, típicamente, de conformidad con las especificaciones. Las téenicas y procedimientos se llevan a cabo, generalmente, de conformidad con métodos convencionales muy conocidos en la materia y varias referencias generales que se proporcionan a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos en la presente descripción son muy conocidos para las personas con experiencia en la materia y se proporcionan para la conveniencia del lector.

Enzimas termolisina de la invención Como se usa en la presente descripción, una enzima termolisina incluye una enzima, un polipéptido o proteína, o un fragmento activo de esta, que presenta actividad proteolítica. Esto incluye a miembros de la familia M4 de peptidasas, de la cual la termolisina (TLN; EC 3.4.24.27) es el prototipo.

Posiciones productivas de enzimas termolisina La invención proporciona las posiciones de aminoácidos en una enzima termolisina que pueden ser útiles en una composición detergente, en donde las modificaciones favorables producen un índice de desempeño mínimo para el desempeño de lavado, la estabilidad de la enzima en composiciones detergentes y la termoestabilidad de la enzima, en donde al menos una de estas características están mejoradas con respecto a una enzima termolisina genitora. Estas modificaciones se consideran modificaciones adecuadas de la invención.

La estabilidad de las enzimas termolisina de la presente invención puede compararse con la estabilidad de una termolisina estándar, por ejemplo, la termolisina de G. caldoproteolyticus de la sec. con núm. de ident.: 3.

Los términos "estabilidad térmica" y "termoestabilidad" se refieren a termolisinas de la presente descripción que retienen una cantidad especificada de actividad enzimática tras la exposición a una temperatura identificada, frecuentemente, durante un período de tiempo determinado, en condiciones que prevalecen durante procesos proteolíticos, de hidrólisis, de limpieza u otro proceso descrito en la presente descripción, por ejemplo, mientras se exponen a temperaturas alteradas. Las temperaturas alteradas incluyen temperaturas aumentadas o disminuidas. En algunas modalidades, la termolisina variante retiene al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de la actividad termolisina tras la exposición a temperaturas alteradas durante un período de tiempo determinado, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 120 minutos, aproximadamente 180 minutos, aproximadamente 240 minutos, aproximadamente 300 minutos, etc.

Como se usa en la presente descripción, propiedades mejoradas de una enzima termolisina variante incluye una enzima termolisina variante con un desempeño mejorado o potenciado de lavado o limpieza y/u, opcionalmente, estabilidad mejorada o potenciada con retención del desempeño de lavado o limpieza, con respecto a la enzima termolisina genitora correspondiente (por ejemplo, enzima termolisina silvestre o de origen natural). Las propiedades mejoradas de una enzima termolisina variante pueden comprender un mejor desempeño de lavado o limpieza y/o una mejor estabilidad. En algunas modalidades, la invención proporciona enzimas termolisina variantes de la invención que exhiben una o más de las propiedades siguientes: mejor desempeño en el lavado manual, mejor desempeño en el lavado manual de vajilla, mejor desempeño en el lavado automático de vajilla, mejor desempeño en el lavado de ropa y/o mejor estabilidad con respecto a una enzima termolisina de referencia (por ejemplo, enzima termolisina silvestre, tal como una termolisina silvestre que tiene la sec. con núm. de ident.: 3) Las posiciones productivas se describen como las posiciones dentro de una molécula que son de mayor utilidad para elaborar variantes combinables que exhiben una característica mejorada, donde la propia posición permite al menos una mutación combinable. Las mutaciones combinables pueden describirse como las sustituciones en una molécula que pueden usarse para elaborar variantes combinables. Las mutaciones combinables son las que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras no disminuyen significativamente la: expresión, actividad o estabilidad.

Las mutaciones combinables son las que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras no disminuyen significativamente la: expresión, actividad o estabilidad. Por ejemplo, las mutaciones combinables en la termolisina pueden determinarse con el uso de los valores del índice de desempeño (PI) obtenidos de los ensayos descritos en el Ejemplo 1: ensayo de proteasa en Abz-AGLA-Nba (actividad), ensayo en micromuestras de tela de PAS-38 (actividad), ensayos de estabilidad y termoestabilidad en detergente y determinación de proteína (expresión).

Además de las mutaciones combinables, un segundo grupo de mutaciones para la termolisina son las mutaciones combinables para la actividad. Las mutaciones combinables para la actividad son las que mejoran al menos una propiedad de actividad de la molécula, con un índice de desempeño mayor que, o igual a, 1.5, mientras no disminuyen los valores de PI para la expresión o estabilidad menor que 0.5. Estas mutaciones combinables para la actividad pueden usarse para modificar la molécula a fin de lograr una propiedad deseada sin disminuir significativamente otras propiedades conocidas y deseadas de la molécula (por ejemplo, la expresión o estabilidad).

Las posiciones de aminoácidos de la enzima termolisina que han demostrado ser útiles pueden tener diversas modificaciones que son adecuadas para usar en una composición detergente. Las modificaciones pueden incluir una inserción, deleción o sustitución en la posición particular. En una modalidad, una modificación es una sustitución. Para cada posición, un mayor número de modificaciones adecuadas posibles se traduce en una mayor puntuación de productividad para la posición. Por ejemplo, las posiciones de aminoácidos pueden tener como modificaciones adecuadas al menos 75%, 40% o 15% de las modificaciones evaluadas en una posición productiva, en donde la modificación cumple al menos uno de los criterios de idoneidad siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; o c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5 Las posiciones de la enzima termolisina de la presente invención que tienen como modificaciones adecuadas al menos 75% de las modificaciones evaluadas incluyen las posiciones 2, 26, 47, 49, 53, 65, 87, 91, 96, 108, 118, 128, 154, 179, 196, 197, 198, 199, 209, 211, 217, 219, 225, 232, 256, 257, 259, 261, 265, 267, 272, 276, 277, 286, 289, 290, 293, 295, 298, 299, 300, 301, 303, 305, 308, 311 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Las modificaciones adecuadas incluyen 2 (T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M) 26 (T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D) 47 (R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T), 49 (T,A,D,F,H,I,S,W,L,N,Q,V,E,M,Y) 53 (S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L) 65 (S,I,M,Q,V,L,T,W,A,D,E,P,Y) 87 (V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y), 91 (L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y), 96 (N,s,?,i,n,r,t,s,H,V,r,b,n?,k,?,g), iob (O,s,E,R,H,A,?,I,K,N,I,M), 118 (S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V), 128 (Q,C,D,E,R,S,V,I,K,A,L,Y), 154 (G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y), 179 (Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F), 96 (s,?,E,T,K,R,n,H,I,U,A,??), 197 (I,?,K,I,T,n,??,U,A,H,N,E,V,R,R,O , 198 (S,C,E#F,GfH,I,R,O,T,n,M,N,R,N,A,K), 199 (G,C,E,F,H,Q,S T,W,L,A,U), 209 (A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M), 211 (Y A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R), 217 (Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L), 219 (K,?,R,s,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S), 225 (V,?,s,H,i,r,n^ ,A,M,r,a,E,k,L,S), 232 (I,C,E,F,K,M,N,Q,W,G,L,R,S,T,V,Y), 256 (V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S7N), 257 (G,C,D,E,L,N,R,Q,S,T,Y,K,R), 59 (G,A,C,E,F,H,L,M,W,K R/N,S,T), 261 (D,A,N,R,V,W,G,H,I,S), 65 (K,A,C,D,M,P,Q,S,G,I,L,R,N), 267 (F,E,G,N,S,V,W,A,C,H,I,K,L,M,T,Y), 272 (T,E,L,V,W,P,Y,CJF,N,Q/A K), 276 (T,C,F,I,R,Q,W,H,A,L,V,U), 77 (P,Q,S,T,E,F,G,H,N,R,V WíA,DfY), 286 (A,D,E,F,G,H,I,b,R,O,O,R,T,K,I,M,N,U), 289 (V,C,E,F,G,I,N,S,W R,T,L,M,Y,A), 290 (Q,C,D,F,G,L,W,Y,R T,V,A,H,N), 293 (T,O,E,R,O,H,V,e,N,n,n?,A,I,K,E,,M,Y), 295 (L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W) (S,C,T,W,Y,E,N,P,A,G,K,M,R) 299 (T,a,R,I,M,E^ ,R,?,V,N,A,K), 300 (S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,W,A,G,T,D,N) 301 (Q,E,H,P,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K) 303 (V,C,H,G,K,L,R,W,A,P,U) 305 (S,G,I,L,N,W,Y,Q,H,T,V,A,K,M), 308 (Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,A,L) 311 (D,C,E,F,G,I,Q,S,T,A,K,L,M,V,W,Y) y 316 (K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M) en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Las posiciones de la enzima termolisina de la presente invención que tienen como modificaciones adecuadas al menos 40%, pero menos de 75%, de las modificaciones evaluadas incluyen las posiciones 1, 4, 17, 25, 40, 45, 56, 58, 61, 74, 86, 97, 101, 109, 149, 150, 158, 159, 172, 181, 214, 216, 218, 221, 222, 224, 250, 253, 254, 258, 263, 264, 266, 268, 271, 273, 275, 278, 279, 280, 282, 283, 287, 288, 291, 297, 302, 304, 307 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Las modificaciones adecuadas incluyen 1 (I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L), 4 (T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y), 17 (Q,I,W,Y,C,R,V,T,L), 25 (S,D,F,A,C,K,M,R), 40 (F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L), 45 (K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M), 56 (A,K,Q,V,W,H,I,U,E,M), 58 (A,N,Y,C,V,E,L), 61 (Q,M,R,W,F,V,C,I,L), 74 (H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W), 86 (N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D), 97 (N,K,C,R,S,Y,E,M), 101 (R,T,C,L,S,H), 109 (G,A,L,S,E,M,R,W), 149 (T,M,n,A,L,D,S,N), 150 (D,A,F,K,N,Q,T,V,S), 158 (Q,A,K,M,N,L,R,Y,S), 159 (N,R, ,A,C,G,M,T,S,Y), 172 (F,G,L,M,Q,S,V,W,Y,D,H), 181 (N,L,A,G,K,M,T,S), 214 (P,C#G,K,S,N,A,R), 216 (H,C,E,S,T,R,A), 218 (E,K,E,U,R,s,T,n), 221 (U,K,N,Q,R,S,T,V,A,F,G,M), 222 (T,C,D,L,U,I,n,A,M,K), 224 (T,K,M,F,L,R,Q,V,U,E,H), 250 (H,A,O,K,M,N,R,O,R,n,U), 253 (V,N,T,I,R,U,M,Q), 254 (S,A,M,R,U,K,L,N,V,W), 258 (I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,Q,V), 263 (L,C,I,O,T,H,K,N,n,A,M), 264 (G,C,R,A,N,P,Q,S,T), 266 (I,A,R,I,b,a,M,T,n), 268 (U,M,Q,V,A,S,K), 271 (L,A,D,F,I,N,Y#H), 273 (Q,A,H,Y,C,S,W,E,G,N), 275 (L,I,M,V;C,Q,S T), 278 (T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S), 279 (S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G), 280 (N,A,C,D,E,G,Q,H,T), 282 (S,K,N,R,A,H,L,M,T), 283 (Q,K,L,P,R,W,Y,S), 287 (A,I,L,N,V,Y,K,R,T,D,C), 288 (A,C,I,S,T,V,U,N L,M), 291 (S,E,I,I,M,N,n,A,T), 297 (G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N), 302 (E,KfL,G,T,V,D#Q,A), 304 (A,CfD,L,N,R,S,T,W,E,K,Y), 307 (K,A,C,G,I,M,N,Q,R;W,U,H) y 312 (A,G,M,V,L,N,R,T,C), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Las posiciones de la enzima termolisina de la presente invención que tienen como modificaciones adecuadas al menos 15%, pero menos de 40%, de las modificaciones evaluadas incluyen las posiciones 5, 9, 11, 19, 27, 31, 33, 37, 46, 64, 73, 76, 79, 80, 85, 89, 95, 98, 99, 107, 127, 129, 131, 137, 141, 145, 148, 151, 152, 155, 156, 160, 161, 164, 168, 171, 176, 180, 182, 187, 188, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 220, 227, 234, 235, 236, 237, 242, 244, 246, 248, 249, 252, 255, 270, 274, 284, 294, 296, 306, 309, 310, 313, 314 y 315, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Las modificaciones adecuadas incluyen 5 (S,D,N,P,H,L), 9 (V,L,T,I), 11 (R,I,Y,K), 19 (N,L,Y,K,S), 27 (Y,W,A,M,V,C,L), 31 (Q,A,K,V,I,C,Y), 33 (N,S,T,K,A,C,L,M), 37 (N,D,Q,R,L,K), 46 (Y,L,H,N,C), 64 (A,H,Q,T,D,E), 73 (A,I,F,L,M,W), 76 (Y,H,L,M,Q,T), 79 (V,L,Q,T,A,N,S), 80 (T,I,D,A,L,N), 85 (K,E,A,L,N,R,S), 89 (N,L,M,H), 95 (G,A,D,H,M,N,S), 98 (A,C,E,H,R,Y,K,V), 99 (A,E,K,P,R,S), 107 (S,D,K,Y,A,G), 127 (G,C,D,E), 129 (T,I,R,E,Y,L,M), 131 (I,Y,W,L), 137 (I,P,A,E,T,V,L), 141 (A,S,C,G), 145 (T,A,C,E,G,M,N,Q), 148 (V,L,N,Y,M,A,Q), 151 (Y,K,G,H,S,W), 152 (T,S,L,M,G), 155 (L,C,I,M), 156 (I,M,T,L,Q), 160 (E,L,Y,Q), 161 (S,A,N,P,T), 164 (I,L,N,S,T,V,C,A), 168 (I,A,M,T,L), 171 (I,C,E,F,L,S,G), 176 (V,L,N,C), 180 (A,E,G,K,T,S), 182 (K,L,A,W), 187 (E,L,D), 188 (I,L,V), 205 (M,L,A,V,Q), 206 (S,A,C,K,L,M,R), 207 (?,A,H,N), 210 (K,I,L,V), 212 (G,Y,A,D,Q), 213 (D,N,S,L,A,G,W), 220 (R,K,V,A), 227 (N,D,L,Y,A), 234 (S,D,N,A,C), 235 (G,M,C,Q,S,A), 236 (I,M,A,O , 237 (I,N,R,M), 242 (Y,C,F,N,V), 244 (I,T,V,F,A,M,L), 246 (Q,E,N,T,L,C,D), 248 (G,A,E,S), 249 (T,K,M,N,L,Y,P), 252 (G,K,Y,A,S,T,W), 255 (V,L,R,A,U,M,N), 270 (A,C,F,I,L,S,G), 274 (Y,F,H,A,C,Q,T,M), 284 (L,V,W,A,M,U), 294 (D,A,V,Q,N), 296 (Y,N,L,R,H,W,M), 306 (V,A,S,F,I,L,T), 309 (A,G,S,T,V,C), 310 (F,A,C,W,M), 313 (V,T,A,G,L,1,0 , 314 (G,A,E,H,M,S,W,Q) y 315 (V,A,C,I,M,L,T), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Las posiciones de la enzima termolisina de la presente invención que tienen como modificaciones adecuadas al menos una modificación, pero menos de 15%, de las modificaciones evaluadas incluyen las posiciones 3, 6, 7, 20, 23, 24, 44, 48, 50, 57, 63, 72, 75, 81, 92, 93, 94, 100, 102, 103, 104, 110, 117, 120, 134, 135, 136, 140, 144, 153, 173, 174, 175, 178, 183, 185, 189, 193, 201, 223, 230, 238, 239, 241, 247, 251, 260, 262, 269 y 285, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Las modificaciones adecuadas incluyen 3 (G,Y), 6 (T,C,V), 7 (V,L,I), 20 (I,L,V), 23 (T,F,W), 24 (Y,W), 44 (A,C), 48 (T,E,D), 50 (L,P), 57 (D,K), 63 (F,Y,C), 72 (D,F,W), 75 (Y,A), 81 (Y,F), 92 (S,L), 93 (Y,T,C), 94 (D,T), 100 (I,L,V), 102 (S,G,N), 103 (S,T), 104 (V,A), 110 (Y,L), 117 (G,H), 120 (M,L), 134 (S,A,P), 135 (G,A), 136 (G,A,S), 140 (V,D), 144 (L,T), 153 (A,T), 173 (G,A,C), 174 (T,C,A), 175 (L,H,S), 178 (F,H,Y), 183 (N,S), 185 (D,E), 189 (G,A), 193 (Y,F), 201 (S,C,A), 223 (G,D,K), 230 (V,A), 238 (N,L,M), 239 (K,A), 241 (A,L,S), 247 (G,A,S), 251 (Y,M), 260 (R,A,N), 262 (K,A), 269 (R,V,K) y 285 (R,K,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Estas posiciones de aminoácidos pueden considerarse posiciones útiles para modificaciones combinables con respecto a una enzima termolisina genitora. Por lo tanto, la invención incluye enzimas termolisina que tienen una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones anteriores. Las modificaciones adecuadas incluyen 1(I,V), 2(T,C,I,M,P,Q,V), 127(G,C), 128(Q,C,E,F,I,L,V,Y), 180(A,E,N), 181 (N,A,G,Q,S), 196 (G,L,Y), 197(1,F), 198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y), 211(Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W), 224(T,?,H,U), 298 (S,A,C,E,F,G,K,M,N,R,Q,R,T,W,Y), 299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N/P,Q,R,S,W) y 316(K,A,D,E,H,M,N,R,Q,S,T,V,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Modificaciones adecuadas de enzimas termolisina La invención incluye variantes enzimáticas de enzimas termolisina que tienen una o más modificaciones a partir de una enzima termolisina genitora. Las variantes enzimáticas pueden ser útiles en una composición detergente al tener un índice de desempeño mínimo para el desempeño de lavado, la estabilidad de la enzima en composiciones detergentes y la termoestabilidad de la enzima, donde al menos una de estas características está mejorada con respeto a una enzima termolisina genitora.

Las posiciones de las enzimas termolisina de la presente invención que tienen una mejor estabilidad o termoestabilidad en detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal para todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3 incluyen las posiciones 1, 2, 127, 128, 180, 181, 195, 196, 197, 198, 199, 211, 223, 224, 298, 299, 300 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Las variantes de estabilidad de la termolisina pueden incluir modificaciones en una posición que tiene un mayor factor de temperatura, con base en los factores de temperatura cristalográficos, que son una medida del movimiento relativo de los átomos individuales de una macromolécula. Los factores de temperatura surgen como un producto de refinamiento de modelos cristalográficos, de manera que el patrón de difracción calculado, dado como intensidades individuales de máximos de difracción de rayos x de cristales, coincide mejor con el patrón observado. El factor de temperatura puede refinarse como un factor de atenuación para reflejar que los átomos con mayor movimiento tendrán un efecto de disminución de la difracción general de agregados macromoleculares como función del ángulo de dispersión (theta), con el uso de la fórmula -exp(-Bsin20/A), en donde B es el factor de temperatura (Blundell, T. L. y Johnson L. N., Protein Crystallography, Academic Press, 1976, pág. 121). Además, es probable que las regiones con mayor movilidad general puedan representar lugares en los que la macromolécula plegada es menos estable y, por lo tanto, podrían ser lugares donde comienza el desplegamiento a medida que la molécula es sometida a estrés por el aumento de temperatura o por desnaturalizantes. Sería de esperar, además, que estas regiones de mayor movilidad general fueran regiones donde los factores de temperatura promedio sean los más altos.

Las regiones calculadas como regiones de flexibilidad consenso para la termolisina incluyen las regiones 1-2, 127-128, 180-181, 195-199, 211, 223-224, 298-300 y 316. Cada una de estas regiones puede usarse para modificar la termolisina, a fin de lograr termoestabilidad o un mejor desempeño de lavandería. Las variantes combinables que confieren termoestabilidad o mejor desempeño de lavandería mediante la modificación de una posición con un factor de temperatura alto (región de flexibilidad alta), incluyen las posiciones 1, 2, 127, 128, 180, 181, 196, 197, 198, 211, 224, 298, 299 y 316. Las modificaciones adecuadas incluyen 1 (I,V), 2 (T,C,I,M,P,Q,V), 127 (G,C), 128 (Q,C,E,F,I,L,V,Y), 180 (A,E,N), 181 (N,A,G,Q,S), 196 (G,L,Y), 197 (I,F), 198 (S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y), 211 (Y,A,C,E,F,H,I,Q,S,T,V,W), 224 (T,?,H,U), 298 (S,A,C,E,F,G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y), 299 (T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W), 316 (K,A,?,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Mutaciones combinables para la actividad Además de las mutaciones combinables, un segundo grupo de mutaciones para la termolisina son las mutaciones combinables para la actividad. Las mutaciones combinables para la actividad son las que tienen una limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8 y actividad en Abz-AGLA-Nba mayor que, o igual a 1.5, mientras los valores de estabilidad en detergente o el PI de termoestabilidad no disminuyen a menor que 0.5. Las posiciones de mutaciones combinables para la actividad incluyen las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 17, 19, 24, 25, 31, 33, 40, 48, 73, 79, 80, 81, 85, 86, 89, 94, 109, 117, 140, 141, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 168, 171, 174, 175, 176, 178, 180, 181, 182, 183, 189, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 214, 218, 223, 224, 227, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 258, 259, 260, 261, 262, 266, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 294, 295, 296, 297, 300, 302, 306, 310 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Las mutaciones combinables para la actividad incluyen 17 (E,F,P), 19 (A,D,H,I,R,T,V), 24 (F,H), 25 (H), 31 (L), 33 (Q), 40 (C), 48 (A,R), 73 (Y), 79 (C), 80 (C,R), 81 (H), 85 (C,M,Y), 86 (V), 89 (K,R,T,V), 94 (E), 109 (D), 117 (A,K,R,T), 140 (S), 141 (T), 150 (E,M,W), 151 (A,C,E,I), 152 (D), 153 (V), 156 (H,R), 158 (F,G,I,V), 159 (F,I,K), 160 (S), 161 (Y), 168 (N), 171 (D), 174 (S,V), 175 (C,E,F,G,I), 176 (E,Q), 178 (CfM), 180 (L,W), 181 (Y), 182 (F,R), 183 (H,I,L,M,Q,R,T), 189 (C), 205 (C,F), 206 (F,H,I,T,V,Y), 207 (T), 210 (A,E,F,G,H,T), 212 (F,H#K,M,N,R,S,T), 213 (I,K,R,V,Y), 214 (Q), 218 (R), 223 (Y), 224 (I,R), 227 (C,E,G,K,Q,R,S,T,V), 235 (D,L,T), 236 (P), 237 (A,Q), 238 (A,C,D,E,R,S), 239 (C,G,H,L,Q,R,S,V,Y), 241 (E,F,G,I,T,V), 244 (Q), 246 (K,R), 248 (C,H), 249 (G,V), 250 (F,S), 251 (H), 252 (F,I,L), 253 (A,?,E,R), 254 (C,F,G,H,I,P), 255 (F,Q), 258 (F), 259 (I), 260 (C,D,I), 261 (K,R,T), 262 (C,F,H,L,P,R), 266 (W), 268 (F,R), 269 (P,T,W,Y), 270 (M,N,P,V), 271 (V), 272 (R), 273 (R), 274 (D,E), 276 (G,S), 278 (V), 279 (E), 280 (P,R,V), 282 (P), 283 (A,C,E,G,H,T,V), 294 (T), 295 (R), 296 (E,I), 297 (I,V), 300 (Q), 302 (W), 306 (Y), 310 (I,N) y 312 (Q), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con nú . de ident. : 3.

Polipeptidos de la invención La presente invención proporciona polipéptidos novedosos, que pueden denominarse, colectivamente , "polipéptidos de la invención". Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos de la enzima termolisina variante aislados, recombinantes, sustancialmente puros o de origen no natural, que incluyen, por ejemplo, los polipéptidos de la enzima termolisina variante que tienen actividad enzimática (por ejemplo, actividad termolisina). En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención son útiles en aplicaciones de limpieza y pueden incorporarse en composiciones de limpieza que son útiles en métodos para la limpieza de un elemento o una superficie (por ejemplo, de la superficie de un elemento) en necesidad de limpieza.

En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante de una enzima termolisina genitora del género Bacillus o Geobacillus. Se ha descubierto varias enzimas termolisina del género Bacillus o Geobacillus que tienen una identidad alta entre sí y con la enzima termolisina que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3. Ver, por ejemplo, la Tabla 4.1 y la Figura 4.1 del Ejemplo 4. En otras modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante de una enzima termolisina genitora de cualquiera de los géneros que figuran en la Tabla 4.2, que incluyen los géneros seleccionados del grupo que consiste en Bacillus , Geobacillus , Alicyclobacillus , Lactobacillus , Exiguobacterium, Brevibacillus , Paenibacillus, Herpetosiphon, Oceanobacillus, Shewanella, Clostridium, Staphylococcus , Flavobacterium, Stigmatella , Myxococcus , Vibrio, Methanosarcina, Chryseobacterium, Streptomyces , Kribbella , Janibacter , Nocardioides , Xanthamonas, Micromonospora , Burkholderia, Dehalococcoides , Croceibacter , Kordia, Microscilla, Thermoactinomyces , Chloroflexus , Listeria, Plesiocystis, Haliscomenobacter, Cytophaga, Hahella, Arthrobacter, Brachybacterium, Clavibacter, Microbacterium, Intrasporangium, Frankia, Meiothermus , Pseudomonas, Ricinus , Catenulispora, Anabaena, Nostoc, Halomonas, Chromohalobacter, Bordetella, Variovorax, Dickeya, Pectobacterium, Citrobacter, Enterobacter , Salmonella , Erwinia, Pantoea , Rahnella , Serratia, Geodermatophilus , Gemmata, Xenorhabdus, Photorhabdus , Aspergillus , Neosartorya, Pyrenophora, Saccharopolyspora, Nectria, Gibberella, Metarhizium, Waddlia, Cyanothece, Cellulphaga, Providencia, Bradyrhizobium, Agrobacterium, Mucilaginibacter, Serratia , Sorangium, Streptosporangium, Renibacterium, Aeromonas , Reinekea , Chromobacterium, Moritella, Haliangium, Kangiella, Marinomonas , Vibrionales , Listonella, Salinivibrio , Photobacterium, Alteromonadales , Legionella, Teredinibacter, Reinekea, Hydrogeni irga y Pseudoalteromonas . En diversas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante de una enzima termolisina genitora de cualquiera de las especies descritas en las Tablas 4.1 o 4.2. En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante de una termolisina genitora de un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus , Geobacillus , Alicyclobacillus , Lactobacillus , Exiguobacterium, Brevibacillus , Paenibacillus , Herpetosiphon, Oceanobacillus , Shewanella, Clostridium, Staphylococcus, Flavobacterium, Stigmatella , Myxococcus , Vibrio, Methanosarcina , Chryseobacterium y Pseudoalteromonas .

En algunas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante que tiene 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una enzima termolisina del género Bacillus o Geobacillus. En diversas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante que tiene 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una enzima termolisina de cualquier género de la Tabla 4.1. En diversas modalidades, la variante de la enzima termolisina puede ser una variante que tiene 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con una enzima termolisina de cualquier género de la Tabla 4.2.

En una modalidad particular, la invención es una enzima derivada del género Bacillus o Geobacillus. En una modalidad particular, la invención es una enzima derivada de una enzima termolisina de la especie Geobacillus caldoproteolyticus .

Se describe composiciones y métodos relacionados con termolisina clonada de Geobacillus caldoproteolyticus. Las composiciones y métodos se basan, en parte, en la observación de que la termolisina clonada y expresada tiene actividad proteolítica en presencia de una composición detergente. La termolisina demuestra, además, una estabilidad excelente en composiciones detergentes. Estas características de la termolisina la hacen muy adecuada para usar en una variedad de aplicaciones de limpieza, en donde la enzima puede hidrolizar proteínas en presencia de tensioactivos y otros componentes que se encuentran en las composiciones detergentes.

En un aspecto, las presentes composiciones y métodos proporcionan un polipéptido de termolisina variante. El polipéptido de la termolisina genitora se aisló de la (sec. con núm. de ident.:4). El polipéptido de la termolisina madura tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident .: 3. De manera similar, los polipéptidos de termolisina sustancialmente idénticos pueden ser de origen natural, por ejemplo, en otras cepas o aislados de G. caldoproteolyticus . Estos y otros polipéptidos recombinantes de termolisina se encuentran incluidos en las presentes composiciones y métodos.

En algunas modalidades, la invención incluye la enzima termolisina variante aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad termolisina, cuyo polipéptido comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99.5% o 100% de identidad de secuencia con una enzima termolisina genitora provista en la presente descripción.

En algunas modalidades, el polipéptido variante es una variante que tiene un grado específico de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de termolisina ejemplificado, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o incluso al menos 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 o 4. La homología puede determinarse por alineamiento de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, mediante el uso de un programa tal como BLAST, ALIGN o CLUSTAL, como se describe en la presente descripción.

Además, se proporciona una secuencia aislada, recombinante, sustancialmente pura, o de origen no natural que codifica una enzima termolisina variante que tiene actividad termolisina; esa enzima termolisina variante (por ejemplo, termolisina variante) comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:4 en no más de 50, no más de 40, no más de 30, no más de 35, no más de 25, no más de 20, no más de 19, no más de 18, no más de 17, no más de 16, no más de 15, no más de 14, no más de 13, no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 residuo(s) de aminoácido, en donde las posiciones de aminoácidos de la termolisina variante se numeran de acuerdo con la numeración de las posiciones de aminoácidos correspondientes en la secuencia de aminoácidos de la termolisina que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3, determinada por el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la enzima termolisina variante con la secuencia de aminoácidos de termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus .

Como se señaló anteriormente, los polipéptidos de la enzima termolisina variante de la invención tienen actividades enzimáticas (por ejemplo, actividades termolisina) y, por lo tanto, son útiles en aplicaciones de limpieza, que incluyen, pero no se limitan a, métodos para la limpieza de elementos de vajilla, elementos de vajilla de mesa, telas y elementos que tienen superficies duras (por ejemplo, la superficie dura de una mesa, encimera, pared, mueble, piso, techo, etc.). Los ejemplos de composiciones de limpieza que comprenden uno o más polipéptidos de la enzima termolisina variante de la invención se describen más abajo. La actividad enzimática (por ejemplo, actividad enzimática termolisina) de un polipéptido de la enzima termolisina variante de la invención puede determinarse fácilmente con el uso de procedimientos muy conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos que se presentan más abajo describen métodos para evaluar la actividad enzimática, el desempeño de limpieza y la estabilidad y/o termoestabilidad en detergente. El desempeño de las enzimas termolisina variantes de la invención en la eliminación de manchas (por ejemplo, una mancha de lípidos), la limpieza de superficies duras o la limpieza de ropa, vajilla o elemento(s) de vajilla de mesa puede determinarse fácilmente con el uso de procedimientos muy conocidos en la materia y/o con el uso de los procedimientos que se exponen en los ejemplos.

Un polipéptido de la invención puede someterse a varios cambios, tales como una o más inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos, ya sea conservadoras o no conservadoras, que incluyen aquellas en donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad enzimática del polipéptido. De la misma manera, un ácido nucleico de la invención se puede someter, además, a varios cambios, tales como una o más sustituciones de uno o más ácidos nucleicos en uno o más codones, de manera que un codón particular codifica el mismo aminoácido o uno distinto, lo que resulta ya sea en una variación silenciosa (por ejemplo, la mutación en una secuencia de nucleótidos produce una mutación silenciosa en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, cuando la mutación de ácido nucleico no altera el aminoácido codificado) o variación no silenciosa, una o más deleciones de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia, una o más adiciones o inserciones de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia y/o clivaje de uno o más truncamientos de uno o más ácidos nucleicos (o codones) en la secuencia. Muchos de estos cambios en la secuencia de ácidos nucleicos pueden no alterar sustancialmente la actividad enzimática de la enzima termolisina variante codificada obtenida, en comparación con la enzima termolisina variante codificada por la secuencia inicial de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico de la invención puede modificarse, además, para incluir uno o más codones que proporcionan la expresión óptima en un sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de expresión bacteriana), mientras que, si se desea, el codón o codones continúan con la codificación del aminoácido o aminoácidos .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un género de polipéptidos que comprenden polipéptidos de la enzima termolisina variante que tienen la actividad enzimática deseada (por ejemplo, actividad enzimática termolisina o actividad de desempeño de limpieza) que comprenden secuencias que tienen las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente descripción y, además, que comprenden una o más sustituciones adicionales de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas y no conservativas, en donde el polipéptido exhibe, mantiene o aproximadamente mantiene la actividad enzimática deseada (por ejemplo, actividad enzimática termolisina o actividad proteolítica, que se refleja en la actividad o el desempeño de limpieza de la enzima termolisina variante). Las sustituciones de aminoácidos de conformidad con la presente invención pueden incluir, pero sin limitarse a, una o más sustituciones no conservadoras y/o una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una sustitución conservadora de residuos de aminoácidos implica, típicamente, intercambiar un elemento dentro de una clase funcional de residuos de aminoácidos por un residuo que pertenece a la misma clase funcional (los residuos de aminoácidos idénticos se consideran funcionalmente homólogos o se conservan al calcular el porcentaje de homología funcional). Una sustitución conservadora de aminoácidos implica, típicamente, sustituir un aminoácido en una secuencia de aminoácidos con un aminoácido funcionalmente similar. Por ejemplo, la alanina, glicina, serina y treonina son funcionalmente similares y, por lo tanto, pueden funcionar como sustituciones conservadoras de aminoácidos entre sí. El ácido aspártico y el ácido glutámico pueden funcionar como sustituciones conservadoras entre sí. La asparagina y la glutamina pueden funcionar como sustituciones conservadoras entre sí. La arginina, lisina e histidina pueden funcionar como sustituciones conservadoras entre sí. La isoleucina, leucina, metionina y valina pueden funcionar como sustituciones conservadoras entre sí. La fenilalanina, la tirosina y el triptófano pueden funcionar como sustituciones conservadoras entre sí.

Se puede prever otros grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos pueden agruparse por función similar, estructura química o composición (por ejemplo, acídicos, básicos, alifáticos, aromáticos, que contienen azufre). Por ejemplo, un grupo alifático puede comprender: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I). Otros grupos que contienen aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras unas con otras incluyen: aromáticos: fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); que contienen azufre: metionina (M), cisteína (C); básicos: arginina (R), lisina (K), histidina (H); acídicos: ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); residuos sin carga no polares, cisteína (C), metionina (M) y prolina (P); residuos sin carga hidrofílíeos: serina (S), treonina (T), asparagina (N) y glutamina (Q). Otros grupos de aminoácidos son muy conocidos para los expertos en la materia y se describen en varios libros de texto estándar. El listado de una secuencia de polipéptidos de la presente descripción, en conjunto con los grupos de sustitución mencionados anteriormente, proporciona un listado explícito de todas las secuencias de polipéptidos sustituidas conservadoramente.

En las clases de residuos de aminoácidos que se describieron anteriormente existe sustituciones más conservadoras que también o alternativamente pueden ser adecuadas. Los grupos de conservación para sustituciones más conservadores incluyen: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

Las variaciones sustituidas de manera conservadora de una secuencia polipeptídica de la invención (por ejemplo, proteasas variantes de la invención) incluyen sustituciones de porcentaje pequeño, a veces menos de 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7% o 6% de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, o menos de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% o menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l sustituciones de aminoácidos de la secuencia polipeptídica, con un aminoácido seleccionado de manera conservadora del mismo grupo de sustitución conservadora.

Como se describe en mayor detalle en otra parte de la presente descripción y en los ejemplos proporcionados en la presente descripción, los polipéptidos de la invención pueden tener capacidades de limpieza comparables con proteasas conocidas, que incluyen metaloproteasas conocidas.

En algunas modalidades, la variante de proteasa comprende una o más mutaciones y tiene una carga neta total de -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4 o 5 con respecto a la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus (sec. con núm. de ident.: 3) En algunas modalidades, las variantes de proteasa termolisina de fuerza iónica alta forman parte de una composición detergente que se diluye en agua, típicamente, dentro de una máquina de lavandería, para formar un licor de lavado de detergente de lavandería, cuya conductividad es de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3.5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o, incluso, de aproximadamente 4 ms/cm a aproximadamente 10 mS/cm.

La carga de las variantes de proteasa termolisina se expresa con respecto a la proteasa termolisina silvestre de Geobacillus caldoproteolyticus que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3. Los aminoácidos que imparten una sola carga negativa son D y E, y los que imparten una sola carga positiva son R, H y K. Para calcular la carga de la variante de proteasa termolisina se usa cualquier cambio de aminoácido contra la sec. con núm. de ident.: 2 que cambia una carga. Por ejemplo, la introducción de una mutación de carga negativa de una posición neutra silvestre se añade una carga neta de -1 a la variante de proteasa termolisina, mientras que la introducción de una mutación de carga negativa (D o E) de un residuo de aminoácido positivo silvestre (R, H o K) añade una carga neta de -2. La suma de los cambios de carga de todos los residuos de aminoácidos que son diferentes para la variante proteasa frente a la termolisina proteasa silvestre de Geobacillus caldoproteolyticus que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 proporciona el cambio de carga de la variante proteasa. Al seleccionar correctamente la carga, puede obtenerse niveles de desempeño de limpieza termolisina inesperadamente mejorados. Las "soluciones detergentes para ropa de conductividad baja" se definen como soluciones con una conductividad de aproximadamente 0.1 S/cm a aproximadamente 3 mS/cm, de aproximadamente 0.3 mS/cm a aproximadamente 2.5 mS/cm o incluso de aproximadamente 0.5 mS/cm a aproximadamente 2 mS/cm. Las "soluciones detergentes para ropa de conductividad alta" se definen como soluciones con una conductividad de aproximadamente 3 mS/cm a aproximadamente 30 mS/cm, de aproximadamente 3.5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm o incluso de aproximadamente 4 mS/cm a aproximadamente 10 mS/cm. No se pretende que los ejemplos mencionados anteriormente sean limitantes. Una vez que las mutaciones se combinan para optimizar el desempeño de la termolisina, la carga enzimática puede equilibrarse, además, por mutaciones en otras posiciones.

En algunas modalidades, la invención proporciona una proteasa variante (por ejemplo, termolisina) aislada, recombinante, prácticamente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolítica; esa proteasa variante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3 en no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 25, no más de 20, no más de 19, no más de 18, no más de 17, no más de 16, no más de 15, no más de 14, no más de 13, no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9 o no más de 8 residuos de aminoácidos, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con la numeración de las posiciones de aminoácidos correspondientes en la secuencia de aminoácidos de termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3, determinada por el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteasa variante con la secuencia de aminoácidos de la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus .

En algunas modalidades, la invención proporciona una proteasa variante (por ejemplo, termolisina variante) aislada, recombinante, prácticamente pura o de origen no natural que tiene actividad proteolítica; esa proteasa variante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.:2 en no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 25, no más de 20, no más de 19, no más de 18, no más de 17, no más de 16, no más de 15, no más de 14, no más de 13, no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 residuos de aminoácidos, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con la numeración de las posiciones de aminoácidos correspondientes en la secuencia de aminoácidos de termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3, determinada por el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteasa variante con la secuencia de aminoácidos de la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus . Ácidos nucleicos de la invención La invención proporciona ácidos nucleicos aislados que no son de origen natural o recombinantes (mencionados, además, en la presente descripción como "polinucleótidos") y que colectivamente se pueden denominar "ácidos nucleicos de la invención" o "polinucleótidos de la invención", que codifican polipéptidos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención, que incluyen todos los que se describen a continuación, son útiles en la producción recombinante (por ejemplo, expresión) de los polipéptidos de la invención, típicamente, mediante la expresión de un vector de expresión plasmídico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de interés o fragmento de este. Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos incluyen polipéptidos de proteasa variante, que incluyen polipéptidos de termolisina variante que tienen actividad enzimática (por ejemplo, actividad proteolítica) que son útiles en aplicaciones de limpieza y composiciones de limpieza para limpiar un elemento o una superficie (por ejemplo, la superficie de un elemento) en necesidad de limpieza.

En algunas modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier polipéptido (que incluye cualquier proteína de fusión, etc.) de la invención descrito anteriormente en la sección titulada "polipéptidos de la invención" y en cualquier otro lugar de la presente descripción. La invención proporciona, además, un ácido nucleico aislado, recombinante, prácticamente puro o de origen no natural que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una combinación de dos o más polipéptidos de la invención descritos anteriormente y en cualquier otro lugar de la presente descripción.

En algunas modalidades, la invención incluye un polinucleótido que codifica una enzima variante termolisina aislada, recombinante, sustancialmente pura o de origen no natural que tiene actividad termolisina, cuyo polipéptido comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99.5% o 100% de identidad de secuencia con una enzima termolisina genitora provista en la presente descripción.

En algunas modalidades, el polipéptido variante es una variante que tiene un grado específico de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de termolisina ejemplificado, por ejemplo, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o incluso al menos 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las sec. con núm. de ident.: 3 o 4. La homología puede determinarse por alineamiento de secuencia de aminoácidos, por ejemplo, mediante el uso de un programa tal como BLAST, ALIGN o CLUSTAL, como se describe en la presente descripción.

Además, se proporciona un ácido nucleico aislado, recombinante, sustancialmente puro o de origen no natural, que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteasa variante que tiene actividad proteolítica; esa proteasa variante (por ejemplo, termolisina variante) comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2 en no más de 50, no más de 40, no más de 30, no más de 35, no más de 25, no más de 20, no más de 19, no más de 18, no más de 17, no más de 16, no más de 15, no más de 14, no más de 13, no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 residuo de aminoácido(s), en donde las posiciones de aminoácidos de la termolisina variante se numeran de acuerdo con la numeración de las posiciones de aminoácidos correspondientes en la secuencia de aminoácidos de termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3, determinada por el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la proteasa variante con la secuencia de aminoácidos de la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus .

La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican una variante de la termolisina de Geobacillus o Bacillus , en donde la variante de termolisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica, y comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos indicados en la especificación, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden producirse con el uso de cualquier síntesis adecuada, manipulación y/o téenicas de aislamiento, o combinaciones de estas. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención se puede producir con el uso de técnicas estándar de síntesis de ácido nucleico, tales como las técnicas de síntesis en fase sólida que son muy conocidas para aquellos con experiencia en la materia. En esas técnicas, se sintetizan, típicamente, fragmentos de hasta 50 o más bases de nucleótidos, después, se unen (por ejemplo, por métodos de unión enzimática o química, o por métodos de recombinación mediada por la polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua de ácido nucleico deseada. La síntesis de los ácidos nucleicos de la invención puede facilitarse, además, (o alternativamente, lograrse) por cualquier método adecuado conocido en la materia, que incluye, pero no se limita a, la síntesis química que usa el método clásico de la fosforamidita (ver, por ejemplo, Beaucage et al . Tetrahedron Letters 22:1859-69

[1981]); o el método que describen Matthes et al . (vér Matthes et al . , EMBO J.3:801-805

[1984], tal como se practica, típicamente, en métodos de síntesis automáticos. Los ácidos nucleicos de la invención pueden producirse, además, con el uso de un sintetizador automático de ADN. Puede adquirirse ácidos nucleicos adaptados de una gran variedad de fuentes comerciales (por ejemplo, The Midland Certified Reagent Company, the Great American Gene Company, Operon Technologies Inc. y DNA2.0). En la materia se conocen otras téenicas para sintetizar ácidos nucleicos y los principios relacionados (ver, por ejemplo, Itakura et al., Ann. Rev. Biochem.53:323

[1984]; e Itakura et al . , Science 198:1056

[1984]).

Como se indicó anteriormente, las técnicas de ADN recombinante útiles en la modificación de ácidos nucleicos son muy conocidas en la materia. Por ejemplo, técnicas tales como digestión de endonucleasas de restricción, unión, transcripción inversa y producción de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa (es decir, PCR) son conocidas para los expertos en la materia y las usan fácilmente. Los nucleótidos de la invención se pueden obtener, además, mediante evaluación de genotecas de ADNc (por ejemplo, genotecas de ADNc generadas con el uso de téenicas de mutagénesis usadas comúnmente en la materia, que incluyen las descritas en la presente descripción) con el uso de una o más sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarse en o amplificar por PCR los polinucleótidos que codifican uno o varios polipéptidos de las proteasas variantes de la invención. Los procedimientos para evaluar y aislar clones de ADNc y los procedimientos de amplificación de PCR son muy conocidos para los expertos en la materia y se describen en referencias estándar conocidas para aquellos con experiencia en la materia. Algunos ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener al alterar una cadena principal de polinucleótidos de origen natural (por ejemplo, que codifica una enzima o proteasa genitora) mediante, por ejemplo, un procedimiento de mutagénesis conocido (por ejemplo, mutagénesis sitio dirigida, mutagénesis de saturación del sitio y recombinación in vitro ) .

Métodos para preparar proteasas variantes modificadas de la invención En la materia se conocen diversos métodos adecuados para generar polinucleótidos modificados de la invención que codifiquen proteasas variantes de la invención que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, mutagénesis de saturación del sitio, mutagénesis de detección, mutagénesis insercional, mutagénesis por deleción, mutagénesis aleatoria, mutagénesis sitio dirigida y evolución dirigida, así como varios métodos recombinatorios diferentes. Los métodos para preparar polinucleótidos y proteínas modificados (por ejemplo, proteasas variantes) incluyen metodologías de reordenamiento de ADN, métodos basados en la recombinación no homologa de genes, tales como ITCHY (ver Ostermeier et al., 7:2139-44

[1999]), SCRACHY (ver Lutz et al . 98:11248-53

[2001]), SHIPREC (ver Sieber et al . , 19:456-60

[2001]) y NRR (ver Bittker et al., 20:1024-9

[2001]; Bittker et al., 101:7011-6

[2004]) y métodos basados en el uso de oligonucleótidos para insertar mutaciones, deleciones y/o inserciones aleatorias y dirigidas (ver Ness et al., 20:1251-5

[2002]; Coco et al., 20:1246-50

[2002]; Zha et al., 4:34-9

[2003]; Glaser et al., 149:3903-13).

Vectores, células y métodos para producir proteasas variantes de la invención La presente invención proporciona vectores aislados o recombinantes que comprenden al menos un polinucleótido de la invención descrito en la presente descripción (por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteasa variante de la invención descrita en la presente descripción), vectores de expresión o casetes de expresión aislados o recombinantes que comprenden al menos un ácido nucleico o polinucleótido de la invención, constructos de ADN aislados, sustancialmente puros o recombinantes que comprenden al menos un ácido nucleico o polinucleótido de la invención, células aisladas o recombinantes que comprenden al menos un polinucleótido de la invención, cultivos celulares que comprenden células que comprenden al menos un polinucleótido de la invención, cultivos celulares que comprenden al menos un polinucleótido de la invención, cultivos celulares que comprenden al menos un ácido nucleico o polinucleótido de la invención y composiciones que comprenden uno o más de tales vectores, ácidos nucleicos, vectores de expresión, casetes de expresión, constructos de ADN, células, cultivos celulares, o cualquier combinación o mezclas de estos.

En algunas modalidades, la invención proporciona células recombinantes que comprenden al menos un vector (por ejemplo, vector de expresión o constructo de ADN) de la invención, que comprende al menos un ácido nucleico o polinucleótido de la invención. Algunas de estas células recombinantes se transforman o transfectan con él por lo menos único vector. Tales células se mencionan, típicamente, como células hospedero. Algunas de estas células comprenden células bacterianas que incluyen, pero no se limitan a, células de Bacillus sp., tales como células de B. subtilis. La invención proporciona, además, células recombinantes (por ejemplo, células hospedero recombinantes) que comprenden al menos una proteasa variante de la invención.

En algunas modalidades, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico o polinucleótido de la invención. En algunas modalidades, el vector es un vector de expresión o casete de expresión en el que una secuencia de polinucleótidos de la invención que codifica una proteasa variante de la invención se une operativamente a uno o más segmentos adicionales de ácido nucleico requeridos para una expresión génica eficiente ( por ejemplo, un promotor unido operativamente al polinucleótido de la invención que codifica una proteasa variante de la invención). Un vector puede incluir un terminador de transcripción y/o un gen de selección, tal como un gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento cultural continuo de células hospederas infectadas por plásmidos mediante el crecimiento en medios que contienen antimicrobianos.

Un vector de expresión puede derivarse de ADN de plásmidos o viral o, en modalidades alternativas, contiene elementos de ambos. Los vectores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, pXX, pC194, pJHlOl, pE194, pHP13 (ver Harwood y Cutting [eds.], Capítulo 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wilcy & Sons

[1990]; los plásmidos replicantes adecuados para B. subtilis incluyen los mencionados en la pág.92; Ver, además, Perego, Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis , en Sonenshein et al . , [eds.] Bacillus subtilis and Other Gram- Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Geneties, American Society for Microbiology, Washington, D.C.

[1993], págs. 615-624).

Para la expresión y producción de una proteína de interés (por ejemplo, proteasa variante) en una célula, al menos un vector de expresión que comprende al menos una copia de un polinucleótido que codifica la proteasa modificada y que comprende, preferentemente, múltiples copias, se transforma en una célula en las condiciones adecuadas para la expresión de la proteasa. En algunas modalidades de la presente invención, una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteasa variante (así como otras secuencias incluidas en el vector) se integra en el genoma de la célula hospedera, mientras que en otras modalidades, un vector plasmídico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteasa variante permanece como un elemento extracromosómico autónomo dentro de la célula. La presente invención proporciona tanto elementos extracromosómicos de ácido nucleico como secuencias de nucleótidos entrantes que se integran en el genoma de la célula hospedera. Los vectores descritos en la presente descripción son útiles para la producción de las proteasas variantes de la invención. En algunas modalidades, un constructo de polinucleótidos que codifica la proteasa variante está presente en un vector de integración que facilita la integración y, opcionalmente, la amplificación del polinucleótido que codifica la proteasa variante en el cromosoma bacteriano. Los ejemplos de sitios para integración son conocidos por aquellos con experiencia en la materia. En algunas modalidades, un promotor que es el promotor silvestre para la proteasa precursora seleccionada realiza la transcripción de un polinucleótido que codifica una proteasa variante de la invención. En otras modalidades, el promotor es heterólogo para la proteasa precursora, pero es funcional en la célula hospedera. Específicamente, los ejemplos de los promotores adecuados para usar en células hospederas bacterianas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los promotores amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpalI, el promotor del gen de la amilasa maltogénica de B . stearothermophilus, el gen de la amilasa de B. amyloliquefaciens (BAN), el gen de la proteasa alcalina de B . subtilis, el gen de la proteasa alcalina de B. clausii, el gen de la xilosidasa de B. pumilis, crylIIA de B. thuringiensis y el gen de la alfa-amilasa de B. licheniformis . Los promotores adicionales incluyen, pero no se limitan a, al promotor A4, así como los promotores PR O PL del fago lambda y los promotores lac, trp o tac de E. coli .

Las proteasas variantes de la presente invención se pueden producir en células hospederas de cualquier microorganismo Grampositivo adecuado que incluye bacterias y hongos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la proteasa variante se produce en células hospederas de origen fúngico y/o bacteriano. En algunas modalidades, las células hospederas son Bacillus sp. , Streptomyces sp. , Escherichia sp. o Aspergillus sp. En algunas modalidades, las proteasas variantes son producidas por células hospederas de Bacillus sp. Los ejemplos de las células hospederas de Bacillus sp. que son útiles en la producción de las proteasas variantes de la invención incluyen, pero no se limitan a, B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus , B. alkalophilus , B. coagulans, B. circulans, B. pumilis, B. thuringiensis, B. clausii y B. megaterium, así como otros organismos dentro del género Bacillus . En algunas modalidades, las células hospederas de B. subtilis se usan para la producción de proteasas variantes. Las patentes de los EE. UU. núms. 5,264,366 y 4,760,025 (RE 34,606) describen varias cepas hospederas de Bacillus que pueden usarse para producir las proteasas variantes de la invención, aunque es posible usar otras cepas adecuadas.

Las diversas cepas bacterianas industriales que pueden usarse para producir proteasas variantes de la invención incluyen cepas de Bacillus sp. no recombinantes (es decir, silvestres), así como variantes de cepas de origen natural y/o cepas recombinantes. En algunas modalidades, la Cepa hospedera es una cepa recombinante, en donde un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés se ha introducido en el huésped. En algunas modalidades, la Cepa hospedera es una Cepa hospedera de B . subtilis y, particularmente, una Cepa hospedera recombinante de Bacillus subtilis . Se conocen muchas cepas de B. subtilis, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, las cepas 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 through PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110 y PEP 211 (ver, por ejemplo, Hoch et al., Genetics 73:215-228

[1973]; Ver, además, las patentes de los Estads Unidos núms. 4,450,235 y 4,302,544 y la patente europea EP 0134048, cada una de los cuales se incorpora en su totalidad como referencia). El uso de B. subtilis como célula hospedera de expresión es muy conocido en la materia (ver, por ejemplo, Palva et al . , Gene 19:81-87

[1982]; Fahnestock y Fischer, J.

Bacteriol., 165:796-804

[1986]; y Wang et al . , Gene 69:39-47

[1988]).

En algunas modalidades, la célula hospedera de Bacillus es una Bacillus sp. que incluye una mutación o deleción en al menos uno de los siguientes genes: degU, degS, degR y degQ.

Preferentemente, la mutación es en un gen degU y, con mayor preferencia, la mutación es degU (Hy) 32 (ver, por ejemplo, Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834

[1990]; y Olmos et al., Mol. Gen. Genet.253:562-567

[1997]). Una Cepa hospedera adecuada es una Bacillus subtilis que porta una mutación degU32 (Hy) . En algunas modalidades, el huésped de Bacillus comprende una mutación o deleción en scoC4 {ver, por ejemplo, Caldwell et al . , J. Bacteriol.183:7329-7340

[2001]); spoIIE {ver, p. ej . , Arigoni et al . , Mol. Microbiol.31:1407-1415

[1999]); y/o oppA u otros genes del operón opp (ver, por ejemplo, Perego et al., Mol. Microbiol. 5:173-185

[1991]).

Ciertamente, se contempla que cualquier mutación en el operón opp que causa el mismo fenotipo que una mutación en el gen oppA es útil en algunas modalidades de la cepa alterada de Bacillus de la invención. En algunas modalidades, estas mutaciones se producen solas, mientras que en otras modalidades se encuentran combinaciones de mutaciones. En algunas modalidades, una cepa alterada de la célula hospedera de Bacillus que puede usarse para producir una proteasa variante de la invención es una Cepa hospedera de Bacillus que ya incluye una mutación en uno o más de los genes mencionados anteriormente. Adicionalmente, son útiles las células hospederas de Bacillus sp. que comprenden una mutación o mutaciones y/o deleciones de los genes de la proteasa endógena. En algunas modalidades, la célula hospedera de Bacillus comprende una deleción de los genes aprE y nprE. En otras modalidades, la célula hospedera de Bacillus sp. comprende una deleción de 5 genes de proteasa, mientras que en otras modalidades, la célula hospedera de Bacillus sp. comprende una deleción de 9 genes de proteasa (ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos, núm.2005/0202535, incorporada en la presente descripción como referencia).

Las células hospederas se transforman con al menos un ácido nucleico que codifica al menos una proteasa variante de la invención con el uso de cualquier método adecuado conocido en la materia. Ya sea que el ácido nucleico se incorpore en un vector o que se use sin la presencia de ADN de plásmidos, este se introduce, típicamente, en un microorganismo, en algunas modalidades, preferentemente, una célula de E. coli o una célula de Bacillus competente. Los métodos para introducir un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en células de Bacillus o de E. coli que usan constructos de ADN o vectores plasmídicos y que transforman tales constructos de ADN o vectores plasmídicos en tales células son muy conocidos. En algunas modalidades, los plásmidos se aíslan, posteriormente, de las células de E. coli y se transforman en células de Bacillus. Sin embargo, no es esencial usar microorganismos intermedios, tales como E. coli , y en algunas modalidades, un constructo o vector de ADN se introduce directamente en un huésped de Bacillus .

Los expertos en la materia conocen los métodos adecuados para introducir las secuencias de ácido nucleico o secuencias de polinucleótidos de la invención en células de Bacillus (ver, p. ej . , Ferrari y col . , "Genetics" en Harwood y col . [eds.], Bacillus, Plenutn Publishing Corp.

[1989], pp.57-72; Saunders et al . , J. Bacteriol.157:718-726

[1984]; Hoch et al . , J. Bacteriol.93:1925 -1937

[1967]; Mann et al . , Current Microbiol. 13:131-135

[1986]; Holubova, Folia Microbiol. 30:97

[1985]; Chang et al . , Mol. Gen. Genet. 168:11-115

[1979]; Vorobjeva et al . , FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263

[1980]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634

[1986]; Fisher et al ., Arch. Microbiol. 139:213-217

[1981]; y McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203

[1984]). Ciertamente, tales métodos como la transformación, que incluye la transformación y congresión de protoplastos, transducción y fusión de protoplastos, son muy conocidos y adecuados para usar en la presente invención. Los métodos de transformación se usan para introducir un constructo o vector ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una proteasa variante de la presente invención en una célula hospedera. Los métodos conocidos en la materia para transformar células de Bacillus incluyen métodos tales como la transformación de rescate de marcadores plasmídicos, que involucra la captación de un plásmido donante por células competentes que portan un plásmido residente parcialmente homólogo (ver Contente et al . , Plasmid 2:555-571

[1979]; Haima et al . , Mol. Gen. Genet. 223:185-191

[1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol.154:1077-1087

[1983]; y Weinrauch et al . , J. Bacteriol.169:1205-1211

[1987]). En este método el plásmido donante entrante se recombina con la región homologa del plásmido "ayudador" residente en un proceso que se asemeja a la transformación cromosómica.

Además de los métodos usados comúnmente, en algunas modalidades, las células hospederas se transforman directamente con un constructo o vector de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una proteasa variante de la invención (es decir, no se usa una célula intermedia para amplificar o de cualquier otra forma procesar el constructo o vector de ADN antes de introducirlos en la célula hospedera). La introducción del constructo de ADN o vector de la invención en la célula hospedera incluye los métodos físicos y químicos conocidos en la materia para introducir una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ADN) en una célula hospedera sin la inserción en un plásmido o vector. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la precipitación con cloruro cálcico, electroporación, ADN desnudo, liposomas y similares. En modalidades adicionales los constructos o vectores de ADN se cotransforman con un plásmido sin insertarse en el plásmido. En otras modalidades se elimina un marcador selectivo de la cepa alterada de Bacillus mediante métodos conocidos en la materia (ver Stahl et al . , J. Bacteriol.158:411-418

[1984]; y Palmeros et al . , Gene 247:255 -264

[2000]).

En algunas modalidades, las células transformadas de la presente invención se cultivan en medios con nutrientes convencionales. Las condiciones de cultivo específicas adecuadas, tales como temperatura, pH y similares son conocidas para las personas con experiencia en la materia y se describen bien en la literatura científica. En algunas modalidades, la invención proporciona un cultivo ( por ejemplo, un cultivo celular) que comprende al menos una proteasa variante o al menos un ácido nucleico de la invención. Además, se proporcionan composiciones que comprenden al menos un ácido nucleico, vector o constructo de ADN de la invención.

En algunas modalidades, las células hospederas transformadas con al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una proteasa variante de la invención se cultivan en un medio con nutrientes adecuados en condiciones que permiten la expresión de la proteasa de la presente, después de lo cual la proteasa resultante se recupera del cultivo. El medio usado para cultivar las células comprende cuando medio convencional adecuado para cultivar las células hospederas, tal como los medios mínimos o complejos que contienen los suplementos adecuados. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar de conformidad con recetas publicadas (ver, por ejemplo, los catálogos de la American Type Culture Collection (Colección Estadounidense de Cultivos Tipo). En algunas modalidades, la proteasa producida por las células se recupera del medio de cultivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, separar las células hospederas del medio por centrifugación o filtración, precipitar los componentes proteicos del sobrenadante o filtrado por medio de una sal (por ejemplo, sulfato de amonio), purificación cromatográfica (por ejemplo, intercambio de iones, filtración de gel, afinidad, etc.). En la presente invención puede usarse cualquier método adecuado para recuperar o purificar una proteasa variante.

En algunas modalidades, una proteasa variante producida por una célula hospedera recombinante se secreta en el medio de cultivo. Se puede usar una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio que facilita la purificación para facilitar la purificación de proteínas solubles. Un vector o constructo de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteasa variante puede comprender, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio facilitador de purificación para facilitar la purificación de la proteasa variante (ver, por ejemplo, Kroll et al . , DNA Cell Biol. 12:441-53

[1993]). Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, péptidos quelantes de metales, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados (ver, Porath, Protein Expr. Purif. 3:263-281

[1992]), dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio usado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (por ejemplo, dominios de proteína A disponibles de Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusión de una secuencia conectora escindible, tal como el Factor XA o la enterocinasa (por ejemplo, secuencias disponibles de Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y la proteína heteróloga es útil, además, para facilitar la purificación.

Se conocen los ensayos para detectar y determinar la actividad enzimática de una enzima, tal como una proteasa variante de la invención. Además, varios ensayos para detectar y determinar la actividad de las proteasas (por ejemplo , proteasas variantes de la invención) son del conocimiento de las personas con conocimiento ordinario en la materia. Particularmente, existen ensayos para determinar la actividad de las proteasas basados en la liberación de péptidos solubles en ácido a partir de caseína o hemoglobina, medida como absorbancia a 280 nm o, colorimétricamente, con el uso del método Folin, conocido para las personas con experiencia en la materia. Otros ensayos ilustrativos implican la solubilización de sustratos cromogénicos (ver, por ejemplo, Ward, "Proteinases", en Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, Londres,

[1983], págs.251-317). Otros ensayos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-para nitroanilida (suc-AAPF-pNA) y el ensayo de la sal sódica de 2,4,6-trinitrobencenosulfonato (ensayo de TNBS). Numerosas referencias adicionales conocidas para los expertos en la materia proporcionan métodos adecuados (ver, por ejemplo, Wells et al . , Nucleic Acids Res.11:7911-7925

[1983]; Christianson et al . , Anal. Biochem. 223:119 -129

[1994]; y Hsia et al., Anal Biochem.242:221-227

[1999]).

Es posible usar diversos métodos para determinar el nivel de producción de una proteasa madura (por ejemplo, proteasas variantes maduras de la presente invención) en una célula hospedera. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, métodos que usan anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteasa. Los métodos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos fluorescentes (FIA) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Estos y otros ensayos son muy conocidos en la materia (ver, por ejemplo, Maddox et al . , J. Exp. Med.158:1211

[1983]).

En otras modalidades, la invención proporciona métodos para preparar o producir una proteasa variante madura de la invención. Una proteasa variante madura no incluye un péptido señal o una secuencia de propéptidos. Algunos métodos comprenden preparar o producir una proteasa variante de la invención en una célula hospedera bacteriana recombinante, tal como, por ejemplo, una célula de Bacillus sp. ( por ejemplo, una célula de B. subtilis) . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir una proteasa variante de la invención; el método comprende cultivar una célula hospedera recombinante que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteasa variante de la invención en condiciones que favorecen la producción de la proteasa variante. Algunos de esos métodos comprenden, además, recuperar la proteasa variante del cultivo.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para producir una proteasa variante de la invención; el método comprende: (a) introducir un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteasa variante de la invención en una población de células (por ejemplo, células bacterianas, tales como células de B. subtilis) ; y (b) cultivar las células en un medio de cultivo en condiciones propicias para producir la proteasa variante codificada por el vector de expresión. Algunos de tales métodos comprenden, además,: (c) aislar la proteasa variante de las células o del medio de cultivo.

Productos para el cuidado de las telas y el hogar En algunas modalidades, las variantes de proteasa de la presente invención pueden usarse en composiciones que comprenden un material adicional y una variante de proteasa, en donde la composición es un producto para el cuidado de las telas y el hogar.

En algunas modalidades, las composiciones de productos para el cuidado de telas y del hogar que comprenden al menos una variante de termolisina comprenden uno o más de los ingredientes siguientes (con base en el peso total de la composición): de aproximadamente 0.0005% en peso a aproximadamente 0.1% en peso, de aproximadamente 0.001% en peso a aproximadamente 0.05% en peso o, incluso, de aproximadamente 0.002% en peso a aproximadamente 0.03% en peso de esa variante de proteasa termolisina; y uno o más de los siguientes: de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.1% en peso de agente matizante de telas; de aproximadamente 0.001% en peso a aproximadamente 5% en peso de cápsulas de perfume; de aproximadamente 0.001% en peso a aproximadamente 1% en peso de abrillantadores solubles en agua fría; de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.1% en peso de catalizadores de blanqueador; de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.1% en peso de 1ipasas del primer lavado; de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.1% en peso de celulasas de limpieza bacteriana; y/o de aproximadamente 0.05% en peso a aproximadamente 20% en peso de tensioactivos no iónicos de Guerbet.

En algunas modalidades, la composición del producto para el cuidado de las telas y el hogar es un detergente líquido para ropa o un detergente para el lavado de vajilla.

El producto para el cuidado de las telas y el hogar puede proporcionarse en cualquier forma adecuada que incluye formas líquidas o sólidas. El producto para el cuidado de las telas y el hogar puede estar en forma de una bolsita de dosis unitaria, especialmente, cuando está en la forma de un líquido y, típicamente, el producto para el cuidado de las telas y el hogar está al menos parcialmente o aun completamente contenido dentro de una bolsita soluble en agua. Además, en algunas modalidades de los productos para el cuidado de las telas y el hogar que comprenden al menos una variante de proteasa, el producto para el cuidado de las telas y el hogar puede tener cualquier combinación de parámetros y/o características detalladas anteriormente. Composiciones de limpieza A menos que se indique de otra manera, todos las concentraciones de componentes o composiciones que se proporcionan en la presente descripción se hacen con referencia a la concentración activa de ese componente o composición, y excluyen las impurezas, por ejemplo, solventes residuales o subproductos, que pueden estar presentes en fuentes disponibles comercialmente. Los pesos de los componentes de enzimas se basan en la proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso, a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en base a la composición total, a menos que se indique de otra manera. En las composiciones de detergentes ilustrativas, los niveles de enzimas se expresan por enzima pura en peso de la composición total y a menos que se especifique lo contrario, los ingredientes del detergente se expresan en peso de las composiciones totales.

Tal como se indica en la presente descripción, en algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, materiales adicionales que incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, adyuvantes, blanqueadores, activadores de blanqueo, catalizadores de blanqueamiento, otras enzimas, sistemas de estabilización de enzimas, quelantes, abrillantadores ópticos, polímeros para liberar la suciedad, agentes de transferencia de tinte, dispersantes, reductores de espuma, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrótropos, fotoactivadores, fluorescentes, acondicionadores de tela, tensioactivos hidrolizables, conservadores, antioxidantes, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, germicidas, fungicidas, partículas de color, agentes para el cuidado de metales de plata, antideslustre y/o anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes, portadores, adyuvantes de procesamiento, pigmentos y agentes de control del pH (ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia). Las modalidades de los materiales específicos de composición de limpieza se ilustran en detalle más abajo. En modalidades en las cuales los materiales adicionales de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, se usan, entonces, métodos adecuados para mantener los materiales adicionales de limpieza y la o las proteasas separadas (es decir, no en contacto el uno con el otro) hasta que la combinación de los dos componentes sea apropiada. Tales métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la materia (por ejemplo, cápsulas de gel, encapsulación, tabletas, separación física, etc.).

Las composiciones de limpieza de la presente invención se emplean ventajosamente, por ejemplo, en aplicaciones para el lavado de ropa, limpieza de superficies duras, aplicaciones para el lavado de vajilla, así como también aplicaciones para cosméticos tales como dentaduras postizas, dientes, pelo y piel. Además, debido a las únicas ventajas de eficacia mejorada en soluciones de temperatura más baja, las enzimas de la presente invención se adecúan, idealmente, para las aplicaciones para el lavado de ropa. Además, las enzimas de la presente invención son útiles en composiciones en gránulos y líquidas.

Las proteasas variantes de la presente invención son útiles, además, en productos aditivos de limpieza. En algunas modalidades, se usan las aplicaciones para limpieza con soluciones a baja temperatura. En algunas modalidades, la presente invención proporciona productos aditivos de limpieza que incluyen al menos una enzima de la presente invención y que son idealmente adecuados para incluirse en un proceso de lavado cuando se desea obtener una eficacia de blanqueamiento adicional. Dichas instancias incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones para limpieza con solución a baja temperatura. En algunas modalidades, el producto aditivo se encuentra en su forma más simple, una o más proteasas. En algunas modalidades, el aditivo se empaca en forma de dosis para añadirlo a un proceso de limpieza. En algunas modalidades, el aditivo se empaca en forma de dosis para añadirlo a un proceso de limpieza, en donde una fuente de peróxigeno se emplea y se desea una eficacia mejorada blanqueador. Toda forma de unidad de dosis simple adecuada puede usarse con la presente invención e incluye, pero no se limita a, pastillas, tabletas, cápsulas de gel u otras unidades de dosis simples tales como polvos o líquidos medidos previamente. En algunas modalidades, se incluyen materiales portadores o rellenadores para aumentar el volumen de dichas composiciones. Los materiales portadores o rellenadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, varias sales de sulfato, carbonato y silicato así como también talco, arcilla y similares. Los materiales portadores o rellenadores adecuados para composiciones líquidas incluyen, pero no se limitan a, agua o alcoholes secundarios y primarios de bajo peso molecular que incluyen polialcoholes y dioles. Los ejemplos de los alcoholes incluyen, pero no se limitan, a metanol, etanol, propanol e isopropanol. En algunas modalidades, las composiciones contienen de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de los materiales. Los rellenadores acídicos pueden usarse para reducir el pH. Alternativamente, en algunas modalidades, el aditivo para limpieza incluye componentes menores, como se describe en mayor detalle más abajo.

Las composiciones de limpieza y aditivos de limpieza de la presente invención requieren una cantidad eficaz de al menos una de las variantes de proteasa proporcionadas en la presente descripción, solas o en combinación con otras proteasas y/o enzimas adicionales. La concentración de enzima requerida se logra mediante la adición de una o más variantes de la proteasa de la presente invención. Típicamente, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden al menos aproximadamente 0.0001 por ciento en peso, de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1 o aun de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 por ciento en peso de al menos una de las proteasas variantes de la presente invención.

Las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan, típicamente, de manera tal que durante el uso en operaciones de limpieza acuosa, el agua de lavado tendrá un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5 o aun de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 10.5. Las formulaciones de producto líquido se formulan, típicamente, para tener un pH puro de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 9.0, o incluso de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Los productos granulares para el lavado de ropa se formulan, típicamente, para tener un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 11. Las téenicas para controlar el pH a niveles recomendados de uso incluyen el uso de reguladores, bases, ácidos, etc. y son muy conocidas para aquellos con experiencia en la materia.

Las "composiciones de limpieza con pH bajo" adecuadas tienen, típicamente, un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 y están, típicamente, libres de tensioactivos que se hidrolizan en tales condiciones de pH. Tales tensioactivos incluyen tensioactivos de alquilsulfato de sodio que comprenden por lo menos una entidad de óxido de etileno o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 moles de óxido de etileno. Dichas composiciones de limpieza comprenden, típicamente, una cantidad suficiente de un modificador de pH, tales como hidróxido sódico, monoetañolamína o ácido clorhídrico, para proporcionar dicha composición de limpieza con un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Tales composiciones comprenden, típicamente, por lo menos una enzima ácida estable. En algunas modalidades, las composiciones son líquidas, mientras que en otras modalidades, son sólidas. El pH de tales composiciones líquidas se determina, típicamente, como un pH neto. El pH de tales composiciones sólidas se determina como una solución con 10% de sólidos de la composición, en donde el solvente es agua destilada. En estas modalidades, todas las mediciones de pH se toman a 20°C, a menos que se indique lo contrario.

En algunas modalidades, cuando la o las proteasas variantes se usan en una composición en gránulos o líquida, se prefiere que la proteasa variante esté en la forma de una partícula encapsulada para proteger la proteasa variante de otros componentes de la composición en gránulos durante el almacenamiento. Adicionalmente, la encapsulación es, además, un medio para controlar la disponibilidad de la proteasa variante durante el proceso de limpieza. En algunas modalidades, la encapsulación mejora el desempeño de la o las proteasas variantes y/o enzimas adicionales. En este sentido, las proteasas variantes de la presente invención se encapsulan con cualquier material de encapsulación conocido en la materia. En algunas modalidades, el material de encapsulación encapsula, típicamente, al menos una parte del catalizador para la o las proteasas variantes de la presente invención. Típicamente, el material de encapsulación es soluble en agua y/o dispersables en agua. En algunas modalidades, el material de encapsulación tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) de 0°C o mayor. La temperatura de transición vitrea se describe en mayor detalle en la patente núm. WO 97/11151. El material de encapsulación se selecciona, típicamente, del grupo que consiste en carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina, quitosana, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivinílico, polietilenglicol, ceras de parafina y combinaciones de estos. Cuando el material de encapsulación es un carbohidrato se selecciona, típicamente, de monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de estos. En algunas modalidades típicas, el material de encapsulado es un almidón (ver, por ejemplo, la patente núm. EP 0 922 499; patente de los EE. UU. núm. 4,977,252; patente de los EE. UU. núm.5,354,559 y patente de los EE. UU. núm. 5,935,826). En algunas modalidades, el material de encapsulado es una microesfera fabricada de plástico tal como termoplásticos, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrillonitrilo y mezclas de estos; Las microesferas disponibles comercialmente útiles incluyen, pero no se limitan a, las comercializadas por EXPANCEL® (Stockviksverken, Suecia) y PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® y SPHERICEL® (PQ Corp., Vallcy Forge, PA).

Como se describe en la presente descripción, las proteasas variantes de la presente invención son especialmente útiles en la industria de la limpieza e incluyen, pero no se limitan a, detergentes para el lavado de ropa y vajilla. Estas aplicaciones colocan a las enzimas bajo una diversa tensión ambiental. Las proteasas variantes de la presente invención proporcionan ventajas con respecto a muchas enzimas usadas actualmente, debido a su estabilidad en diversas condiciones.

Claramente, existe una variedad de condiciones para lavado que incluyen la variación de formulaciones de detergentes, volúmenes de agua para lavado, temperaturas del agua para lavado y períodos de tiempo de lavado, a los cuales se exponen las proteasas involucradas en el lavado. Adicionalmente, las formulaciones detergentes usadas en distintas áreas geográficas tienen distintas concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, los detergentes europeos tienen, típicamente, aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado, mientras que los detergentes japoneses tienen, típicamente, aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente, en los Estados Unidos, los detergentes tienen, típicamente, aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema con concentración detergente baja incluye detergentes en donde menos de aproximadamente 800 ppm de los componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses se consideran, típicamente, sistemas con concentración detergente baja debido a que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Una concentración media de detergente incluye detergentes, en donde los componentes de detergente en el agua de lavado se encuentran presentes entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm. Los detergentes de Norteamérica se consideran, generalmente, sistemas con concentración detergente media debido a que tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene, típicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema con alta concentración detergente incluye detergentes, en donde más de aproximadamente 2000 ppm de los componentes detergentes están presentes en el agua de lavado. Generalmente, se considera que los detergentes europeos son sistemas con alta concentración detergente debido a que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

Los detergentes latinoamericanos son, generalmente, detergentes espumosos con alta concentración de adyuvantes de fosfato y la concentración de los detergentes usados en Latinoamérica puede ser tanto media como alta debido a que se encuentran en el intervalo de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se mencionó anteriormente, Brazil tiene, típicamente, aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías, que no se limitan a otros países de Latinoamérica, de detergentes espumosos con alta concentración de adyuvantes de fosfato pueden tener sistemas con alta concentración detergente hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

En virtud de lo el anteriormente, es evidente que las concentraciones de las composiciones de detergentes en soluciones típicas de lavado en todo el mundo varían desde menos de aproximadamente 800 ppm de composición del detergente ("geografías con baja concentración de detergente"), por ejemplo, a aproximadamente 667 ppm en Japón, a entre aproximadamente 800 ppm a aproximadamente 2000 ppm ("geografías con concentración media de detergente"), por ejemplo, aproximadamente 975 ppm en Estados Unidos y aproximadamente, 1500 ppm en Brasil, más de aproximadamente 2000 ppm ("geografías con concentración alta de detergente"), por ejemplo, aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en geografías con adyuvantes de fosfato de alta espuma.

Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los Estados Unidos una lavadora automática típica soporta un volumen de aproximadamente 64.41 de solución de lavado. Por lo tanto, para obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente dentro de una solución de lavado se debe agregar aproximadamente 62.79 g de composición detergente a los 64.4 1 de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica que determina el consumidor en el agua de lavado con el uso de la taza medidora proporcionada con el detergente.

Como ejemplo adicional, las distintas geografías usan distintas temperaturas de lavado. En Japón la temperatura del agua de lavado es, típicamente, menor que la temperatura que se usa en Europa. Por ejemplo, la temperatura del agua de lavado en Norteamérica y Japón se encuentra, típicamente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30°C ( por ejemplo, aproximadamente 20°C), mientras que la temperatura del agua de lavado en Europa se encuentra, típicamente, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60°C ( por ejemplo, aproximadamente 40°C). Sin embargo, en el interés de ahorrar energía, muchos consumidores ahora realizan el lavado con agua fría. Además, en algunas otras regiones, el agua fría se usa, típicamente, para el lavado de ropa, así como también en aplicaciones para el lavado de vajilla. En algunas modalidades, el "lavado con agua fría" de la presente invención usa un "detergente para agua fría" adecuado para lavar a temperaturas de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, así como todas las combinaciones en el intervalo de aproximadamente 15°C a aproximadamente 35°C y todos los intervalos de 10°C a 40°C.

Como un ejemplo adicional, las distintas geografías tienen, típicamente, distintas durezas del agua. La dureza del agua se describe, usualmente, en términos de granos por galón de Ca2+/Mg2+ mezclado. La dureza es una medición de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayor parte de agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de dureza varía. El agua de moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tiene de 60 a 181 partes por millón (partes por millón convertidas a granos por galón de Estados Unidos es núm. de ppm dividido por 17.1 equivalente a granos por galón) de minerales con dureza.

La dureza del agua europea es, típicamente, mayor que aproximadamente 0.180 (10.5) (por ejemplo, de aproximadamente 0.180 a aproximadamente 0.34 (de 10.5 a aproximadamente 20.0)) gramos por litro (granos por galón) de una mezcla de Ca2+/Mg2+ (por ejemplo, aproximadamente 0.26 gramos por litro (15 granos por galón) de una mezcla de Ca2+/Mg2+). La dureza del agua en Norteamérica es, típicamente, mayor que la dureza del agua en Japón, pero menor que la dureza del agua en Europa. Por ejemplo, la dureza del agua de Norteamérica puede estar entre aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.7 gramos (3 a aproximadamente 10 granos), de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5 gramos o de aproximadamente 0.4 gramos (3 a aproximadamente 8 granos o aproximadamente 6 granos). La dureza del agua japonesa es, típicamente, menor que la dureza del agua de Norteamérica, usualmente, menor que aproximadamente 0.07 (4), por ejemplo, aproximadamente 0.05 gramos por litro (3 granos por galón) de mezcla de Ca2+/Mg2+.

Consecuentemente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona proteasas variantes que muestran un desempeño de lavado en al menos un grupo de condiciones de lavado (por ejemplo, temperatura del agua, dureza del agua y/o concentración del detergente). En algunas modalidades, las proteasas variantes de la presente invención son comparables en desempeño de lavado con otras proteasas termolisina. En algunas modalidades de la presente invención, las proteasas variantes proporcionadas en la presente descripción muestran una mejor estabilidad oxidativa, mejor estabilidad térmica, mejores capacidades de limpieza en diversas condiciones y/o mejor estabilidad quelante. Adicionalmente, las proteasas variantes de la presente invención son útiles en composiciones de limpieza que no incluyen detergentes, ya sea solos o en combinación con adyuvantes y estabilizadores.

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% en peso de la composición, y el resto (por ejemplo, de aproximadamente 99.999% a aproximadamente 90.0%) comprende materiales adicionales de limpieza, en peso de la composición. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden al menos una proteasa variante en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% en peso de la composición, y el resto de la composición de limpieza (por ejemplo, de aproximadamente 99.9999% a aproximadamente 90.0%, de aproximadamente 99.999% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 99.995% a aproximadamente 99.5% en peso) comprende materiales adicionales de limpieza.

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden una o más enzimas adicionales de detergente que proporcionan beneficios en el desempeño de limpieza y/o cuidado de las telas y/o lavado de la vajilla. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hemicelulasas, celulasas, peroxidasas, proteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, b-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, lacasa y amilasas o cualquier combinación o mezcla de estas. En algunas modalidades, se usa una combinación de enzimas (es decir, un "cocktail") que comprende enzimas convencionales aplicables como proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa que se usan en conjunto con amilasa.

Además de las variantes de proteasa proporcionadas en la presente descripción, cualquier otra proteasa adecuada es útil en las composiciones de la presente invención. Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. En algunas modalidades, se usan proteasas microbianas. En algunas modalidades, se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. En algunas modalidades, la proteasa es una proteasa de serina, preferentemente, una proteasa microbiana alcalina o una proteasa del tipo tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas incluyen subtilisinas, especialmente, aquellas derivadas de Bacillus (por ejemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168). Los ejemplos adicionales incluyen aquellas proteasas mutantes descritas en las patentes de los EE. UU. núms. RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628, que se incorporan en la presente descripción como referencia. Los ejemplos de proteasas adicionales incluyen, pero no se limitan a, tripsina { or ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en la patente num. WO 89/06270. En algunas modalidades, las enzimas proteasa disponibles comercialmente que se usan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™ y PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® y ESPERASE® (Novozymes); variantes BLAP™ y BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany) y KAP (B. alkalophilus subtilisin; Kao Corp., Tokio, Japón). Varias proteasas se describen en la patentes núm. W095/23221, WO 92/21760, publicación de patentes de los EE. UU. núm. 2008/0090747 y la patente de los EE. UU. núm. 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, patente de los EE . UU. republicada núm. 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936 y 6,482,628 y varias otras patentes. En algunas otras modalidades, las metaloproteasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la metaloproteasa neutra descrita en la patente núm. WO 07/044993.

Adicionalmente, cualquier lipasa adecuada es útil en la presente invención. Las 1ipasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados química o genéticamente están incluidos en la presente invención. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola lanuginosa (ver, por ejemplo, las patentes europeas núms. EP 258068 y EP 305216), lipasas de Rhizomucor miehei (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 238023) , lipasas de Candida, tal como lipasas de C. ant rctica (por ejemplo, las lipasas A o B de C. ant rctica; ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 214 761), lipasas de Pseudomonas tales como lipasas de P. alcaligenes y lipasas de P. pseudoalcaligenes (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 218 272), lipasas de P. cepacia (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 331 376), lipasas de P. stutzeri (ver, por ejemplo, la patente británica núm. GB 1,372,034), lipasas de P. fluorescens, lipasas de Bacillus (por ejemplo, lipasas de B. subtilis [Dartois et al . , Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260

[1993]); lipasas de B. stearothermophilus [ver, por ejemplo, la patente japonesa núm. JP 64/744992]; y lipasas de B . pumilus [ver, por ejemplo, la patente núm. WO 91/16422]).

Además, en algunas modalidades de la presente invención son útiles diversas lipasas clonadas que incluyen, pero no se limitan a, lipasas de Penicillium camembertii (ver Yamaguchi et al . , Gene 103:61-67

[1991]), lipasas de Geotricum candidum (ver Schimada et al . , J. Biochemver, por ejemplo, 106:383-388

[1989]) y varias lipasas de Rhizopus , tales como lipasas de R. delemar (ver Hass et al . , Gene 109:117-113

[1991]), una lipasa de R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719

[1992]) y lipasas de R. oryzae .

En algunas modalidades de la presente invención, se usa, además, otros tipos de enzimas termolisina, tales como las cutinasas, que incluyen, pero no se limitan a, la cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina (ver la patente núm. WO 88/09367) y la cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (ver la patente núm. WO 90/09446).

Las lipasas adicionales adecuadas incluyen las lipasas disponibles comercialmente, tales como MI LIPASA™, LUMA FAST™ y LIPOMAX™ (Genencor); LIPEX®, LIPOLASE® y LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); y LIPASA P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japón).

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, lipasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de lipasa adicional en peso de la composición y la csp son materiales adicionales de limpieza en peso de la composición. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, lipasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de lipasa en peso de la composición.

En algunas modalidades de la presente invención, cualquier amilasa adecuada es útil para la presente invención. En algunas modalidades puede usarse, además, cualquier amilasa adecuada ( por ejemplo, alfa y/o beta) para usar en soluciones alcalinas. Las amilasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. En algunas modalidades se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. Las amilasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, a-amilasas obtenidas de B. licheniformis (ver, por ejemplo, la patente núm. GB 1,296,839). Las amilasas disponibles comercialmente útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA® y BAN™ (Novozymes), así como POWERASE™, RAPIDASE® y MAXAMYL® P (Genencor).

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, amilasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de amilasa adicional en peso de la composición y la csp son materiales adicionales de limpieza en peso de la composición. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, amilasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0 . 001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de amilasa en peso de la composición.

En otras modalidades, cualquier celulosa adecuada es útil en las composiciones de limpieza de la presente invención. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. En algunas modalidades se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulasas Humicola insolens (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 4,435,307) . Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen beneficios de cuidado de los colores (ver, por ejemplo, la patente núm. EP 0 495 257). Las celulasas comercialmente disponibles que se usan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) y KAC-500 (B)™ (Kao Corporation). En algunas modalidades, las celulasas se incorporan como partes de fragmentos de variantes de celulasas o del tipo salvaje madura, en donde una porción del N-terminal se elimina (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,874,276). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, celulasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de celulasa adicional en peso de la composición y la csp son materiales adicionales de limpieza en peso de la composición. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, celulasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de celulasa en peso de la composición.

Cualquier mananasa adecuada útil en las composiciones detergentes es, además, útil en la presente invención. Las mannanasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen bacteriano o fúngico. En algunas modalidades se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. Se conoce varias mananasas que se usan en la presente invención (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm.6,566,114, patente de los EE. UU. núm.6,602,842 y patente de los EE. UU. núm. 6,440,991, todas las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, mananasas en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de mananasa adicional, en peso de la composición, y el resto son materiales adicionales de limpieza, en peso de la composición. En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, mananasas en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de mananasa, en peso de la composición.

En algunas modalidades se usan peroxidasas en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente de este (por ejemplo, un percarbonato, perborato o persulfato) en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades alternativas, las oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para el "blanqueamiento de la solución" (es decir, prevenir la transferencia de tinte de textiles de una tela teñida a otra tela cuando las telas se lavan juntas en un líquido de lavado), preferentemente, junto con un agente de mejoramiento (ver, por ejemplo, las patentes núm. WO 94/12621 y WO 95/01426). Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. En algunas modalidades se incluyen mutantes modificados química o genéticamente. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, adicionalmente, enzimas peroxidasa y/u oxidasa en un nivel de aproximadamente 0.00001% a aproximadamente 10% de peroxidasa y/u oxidasa adicional en peso de la composición y la csp son materiales adicionales de limpieza en peso de composición. En otras modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, enzimas peroxidasa y/u oxidasa en un nivel de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 2%, de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 0.5% de enzimas peroxidasa y/u oxidasa en peso de la composición.

En algunas modalidades, se usan enzimas adicionales, que incluyen pero sin limitarse a, perhidrolasas (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 05/056782). Además, en algunas modalidades, las mezclas de las enzimas mencionadas anteriormente están incluidas en la presente invención, particularmente, una o más proteasas, amilasas, lipasas, mananasas adicionales, y/o al menos una celulasa. Ciertamente, se contempla que varias mezclas de estas enzimas son útiles en la presente invención. Se contempla, además, que los niveles de variación de la o las proteasas variantes y una o más enzimas adicionales puede ser, independientemente, de hasta aproximadamente 10%, la csp de la composición de limpieza son materiales adicionales de limpieza. La selección específica de los materiales adicionales de limpieza se realiza, fácilmente, al considerar la superficie, elemento o tela que se va a limpiar y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso (por ejemplo, mediante el uso de detergente de lavado).

Los ejemplos de materiales adicionales de limpieza adecuados incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, adyuvantes, blanqueadores, activadores de blanqueamiento, catalizadores de blanqueamiento, otras enzimas, sistemas de estabilizadores de enzima, quelantes, abrillantadores ópticos, polímeros para liberar la suciedad, agentes de transferencia de tinte, agentes inhibidores de transferencia de tinte, materiales catalíticos, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes para la eliminación de suciedad de arcilla, agentes elastizantes de estructuras, dispersantes, reductores de espuma, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrótropos, fotoactivadores, fluorescentes, acondicionadores para ropa, suavizantes para ropa, portadores, hidrótropos, adyuvantes de procesamiento, disolventes, pigmentos, tensioactivos hidrolizables , conservadores, antioxidantes, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, germicidas, fungicidas, partículas de color, agentes para el cuidado de cubiertos, antideslustre y/o anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes, portadores, adyuvantes de procesamiento, pigmentos y agentes de control del pH (ver, por ejemplo, las patentes de los EE . UU. núms. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, incorporadas en la presente descripción como referencia). Las modalidades de los materiales específicos de composición de limpieza se ilustran en detalle más abajo. En modalidades en las cuales los materiales adicionales de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, se usan, entonces, métodos adecuados para mantener los materiales adicionales de limpieza y la o las proteasas separadas es decir, no en contacto el uno con el otro) hasta que la combinación de los dos componentes sea apropiada. Tales métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la materia ( por ejemplo, cápsulas de gel, encapsulación, tabletas, separación física, etc.).

En algunas modalidades, una cantidad eficaz de una o más proteasas variantes proporcionadas en la presente descripción se incluye en las composiciones útiles para limpiar diversas superficies que requieren la limpieza de manchas proteicas. Dichas composiciones de limpieza incluyen composiciones de limpieza para dichas aplicaciones, tales como limpieza de superficies duras, telas y vajilla. Ciertamente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de telas, mientras que en otras modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de material no tejido. Notablemente, la presente invención proporciona, además, composiciones de limpieza adecuadas para el cuidado personal que incluye el cuidado oral (que incluyen dentífricos, pastas dentales, enjuagues bucales, etc., así como también composiciones de limpieza de dentaduras postizas), cuidado de la piel, y composiciones de limpieza para el pelo. La presente invención abarca cualquier forma de las composiciones detergentes (es decir, en forma líquida, de gránulos, en barra, semisólidas, geles, emulsiones, tabletas, cápsulas, etc.).

Por ejemplo, varias composiciones de limpieza, en donde las proteasas variantes de la presente invención son útiles, se describen con mayor detalle a continuación. En algunas modalidades en las cuales las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan como composiciones adecuadas para uso en los métodos de lavado en lavadoras automáticas, las composiciones de la presente invención contienen, preferentemente, al menos un tensioactivo y al menos un compuesto adyuvante, así como también uno o más materiales adicionales de limpieza, preferentemente, seleccionados de compuestos poliméricos orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, reductores de espuma, dispersantes, dispersantes de jabón de cal, agentes de suspensión y antirredepósito de la suciedad e inhibidores de corrosión. En algunas modalidades, las composiciones para ropa contienen, además, agentes suavizantes (es decir, como materiales adicionales de limpieza agregados). Las composiciones de la presente invención son útiles, además, en productos aditivos detergentes en forma sólida o líquida. Tales productos aditivos están previstos para complementar y/o mejorar el desempeño de las composiciones detergentes convencionales y se pueden agregar en cualquier etapa del proceso de limpieza. En algunas modalidades, la densidad de las composiciones de detergentes para ropa en la presente invención varía de aproximadamente 400 a aproximadamente 1200 g/litro, mientras en otras modalidades, varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 950 g/litro de composición medida a 20°C.

En modalidades formuladas como composiciones para uso en métodos manuales para lavado de vajilla, las composiciones de la invención contienen, preferentemente, al menos un tensioactivo y, preferentemente, al menos un material adicional de limpieza seleccionado de compuestos poliméricos orgánicos, agentes para mejorar la espuma, iones metálicos del grupo II, disolventes, hidrótropos y enzimas adicionales.

En algunas modalidades, varias composiciones de limpieza tales como aquellas proporcionadas en la patente de los EE. UU. núm.6,605,458 se usan con las proteasas variantes de la presente invención. Por lo tanto, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención son una composición de limpieza en gránulos compacta para telas, mientras que en otras modalidades, la composición es una composición de limpieza en gránulos para telas útil para el lavado de telas de color, en otras modalidades, la composición es una composición de limpieza en gránulos para telas que proporciona suavidad a través de la capacidad de lavado, en modalidades adicionales, la composición es una composición de limpieza líquida de alto desempeño para telas. En algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención son composiciones de limpieza para telas tales como aquellas descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,610,642 y 6,376,450. Adicionalmente, las proteasas variantes de la presente invención se usan en composiciones detergentes en gránulos para ropa de utilidad específica según las condiciones europeas o japonesas de lavado (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 6,610,642).

En algunas modalidades alternativas, la presente invención proporciona composiciones de limpieza para superficies duras que comprenden al menos una proteasa variante proporcionada en la presente descripción. Por lo tanto, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención son una composición de limpieza para superficies duras tales como las descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,610,642, 6,376,450 y 6,376,450.

Incluso en otras modalidades, la presente invención proporciona composiciones para el lavado de vajilla que comprenden al menos una proteasa variante proporcionada en la presente descripción. Por lo tanto, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención son una composición de limpieza para superficies duras tales como las descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,610,642 y 6,376,450. En otras modalidades, la presente invención proporciona composiciones para el lavado de vajilla que comprenden al menos una proteasa variante proporcionada en la presente descripción. En algunas otras modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención comprenden composiciones para el cuidado oral tales como aquellas descritas en las patentes de los EE. UU. núms. 6,376,450 y 6,376,450. Las formulaciones y descripciones de los compuestos y materiales adicionales de limpieza contenidos en las patentes de los EE. UU. núms.6,376,450, 6,605,458, 6,605,458 y 6,610,642 mencionadas anteriormente son útiles con las proteasas variantes proporcionadas en la presente descripción.

Las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan por cualquier proceso seleccionado por el formulador. Los ejemplos no limitantes de estos se describen en las patentes de los EE. UU. núms. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392 y 5,486,303, incorporadas en la presente descripción como referencia. Cuando se prefiere una composición de limpieza de pH bajo, el pH de dicha composición se ajusta mediante la adición de un material tal como monoetanolamina o un material acídico tal como HCl.

Aunque no son esenciales para los propósitos de la presente invención, la lista no limitante de complementos que se ilustran de aquí en adelante son adecuados para usar en las composiciones de limpieza instantáneas. En algunas modalidades, estos adicionales se incorporan, por ejemplo, para ayudar o mejorar el desempeño de limpieza, para tratamiento del sustrato que se va a limpiar, o modificar la estética de la composición de limpieza como es el caso con perfumes, colorantes, tintes o similar. Se entiende que tales complementos son adicionales a las proteasas variantes de la presente invención. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales y las concentraciones de incorporación de estos dependen de la forma física de la composición y de la naturaleza de la operación de limpieza para la que se van a usar. Los materiales adicionales apropiados incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, adyuvantes, agentes quelantes, agentes inhibidores de transferencia de tinte, aditivos de deposición, dispersantes, enzimas adicionales y estabilizadores de enzima, materiales catalíticos, activadores de blanqueamiento, reforzadores de blanqueamiento, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, eliminación de suciedad de arcilla/agentes antirredepósito, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, agentes de elasticidad de estructura, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, adyuvantes de procesamiento y/o pigmentos. Además de la descripción a continuación, los ejemplos adecuados de tales otros complementos y concentraciones de uso se encuentran en las patentes de los EE. UU. núm. 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348, que se incorporan como referencia. Los componentes menores antes mencionados pueden constituir el equilibrio de las composiciones de limpieza de la presente invención.

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de conformidad con la presente invención comprenden al menos un tensioactivo y/o un sistema de tensioactivo, en donde el tensioactivo se selecciona de tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfolíticos, tensioactivos zwitteriónicos , tensioactivos no iónicos semipolares y mezclas de estos. En algunas modalidades de composición de limpieza con pH bajo (por ejemplo, composiciones que tienen un pH neto de aproximadamente 3 a aproximadamente 5), la composición no contiene, típicamente, alquil sulfato etoxilado, dado que se cree que el tensioactivo puede hidrolizarse por medio de los contenidos acídicos de las composiciones. En algunas modalidades, el tensioactivo está presente en un nivel de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 60%, mientras que en modalidades alternativas el nivel es de aproximadamente 1% a aproximadamente 50%, mientras que aun en otras modalidades el nivel es de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, en peso de la composición de limpieza.

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden uno o más adyuvantes o sistemas adyuvantes de detergentes. En algunas modalidades que incluyen al menos un adyuvante, las composiciones de limpieza comprenden al menos aproximadamente 1%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 60% o aun de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% de adyuvante en peso de la composición de limpieza. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, metales alcalinos, sales de amonio y alcanolamonio de polifosfatos, silicatos de metales alcalinos, tierras alcalinas y carbonatos de los metales alcalinos, aluminosilicatos, componentes de policarboxilato, éter hidroxipolicarboxilatos, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o vinil metil éter, 1, 3, 5-trihidroxi benceno-2, 4, 6-ácido trisulfónico y ácido carboximetiloxi succínico, varios metales alcalinos, amonio y sal amónica sustituida de ácidos poliacéticos, tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético, así como también policarboxilatos tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benceno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxi-succínico y sales solubles de estos. Ciertamente, se contempla que cualquier adyuvante adecuado es útil en varias modalidades de la presente invención.

En algunas modalidades, los adyuvantes forman complejos de iones de dureza solubles en agua (por ejemplo, adyuvantes secuestrantes), tales como citratos y polifosfatos (por ejemplo, tripolifosfato sódico y tripolifosfato sódico hexahidratado, tripolifosfato potásico y sodio y tripolifosfato potásico mezclados, etc.). Se contempla que cualquier adyuvante adecuado es útil en la presente invención y estos incluyen aquellos conocidos en la materia (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 2100 949).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen al menos un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes quelantes de cobre, hierro y/o manganeso y mezclas de estos. En modalidades en las cuales se usa al menos un agente quelante, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15% o aun de aproximadamente 3.0% a aproximadamente 10% de agente quelante en peso de la composición de limpieza en cuestión.

En algunas otras modalidades, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente invención contienen al menos un aditivo coadyuvante para la deposición. Los agentes de ayuda para la deposición adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, glicol del polipropileno, policarboxilato, polímeros para liberar la suciedad, tales como ácido politeleftálico, arcillas tales como caolinita, montmorillonita, atapulgita, illita, bentonita, halloisita, y mezclas de estas.

Tal como se indica en la presente descripción, en algunas modalidades, los agentes antirredepósito se usan en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades se usan tensioactivos no iónicos. Por ejemplo, en modalidades de lavado de vajilla automático, los tensioactivos no iónicos se usan para la modificación de superficie, particularmente para escurrido, para evitar la formación de películas y manchas y mejorar el brillo. Estos tensioactivos no iónicos son útiles, además, para prevenir el redepósito de la suciedad. En algunas modalidades, el agente antirredepósito es un tensioactivo no iónico como se conoce en la materia (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 2 100 949) .

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen uno o más agentes inhibidores de transferencia de tinte. Los agentes poliméricos inhibidores de transferencia de colorante adecuados incluyen, pero no se limitan a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. En modalidades en las cuales se usa al menos un agente inhibidor de transferencia de tinte, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% o aun de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición de limpieza.

En algunas modalidades se incluyen silicatos dentro de las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, se usan silicatos de sodio ( por ejemplo, disilicato sódico, metasilicato sódico y filosilicatos cristalinos). En algunas modalidades, los silicatos están presentes en un nivel de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%. En algunas modalidades, los silicatos están presentes en un nivel de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso de la composición.

En aun otras modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen, además, dispersantes. Los materiales adecuados orgánicos solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, ácidos homo o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende, al menos, dos radicales carboxilos separados uno del otro por no más de dos átomos de carbono.

En algunas otras modalidades, las enzimas usadas en las composiciones de limpieza se estabilizan por medio de cualquier téenica adecuada. En algunas modalidades, las enzimas empleadas en la presente se estabilizan por la presencia de fuentes de iones de magnesio y/o calcio solubles en agua en las composiciones terminadas que proporcionan los iones a las enzimas. En algunas modalidades, los estabilizadores enzimáticos incluyen oligosacáridos , polsacáridos y sales metales divalentes inorgánicas, que incluyen metales de tierras alcalinas, tales como sales de calcio. Se contempla que las diversas técnicas de estabilización enzimática son útiles en la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas empleadas en la presente invención se estabilizan por la presencia, en las composiciones terminadas, de fuentes de zinc (II), calcio (II) y/o iones (II) magnesio solubles en agua, que proporcionan los iones a las enzimas, así como también otros iones de metal (por ejemplo, bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estaño (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) y oxovanadium (IV). En algunas modalidades de la presente invención se usan, además, cloruros y sulfatos. Los ejemplos de oligosacáridos y polisacáridos adecuados (por ejemplo, dextrinas) se conocen en la materia (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 07/145964). En algunas modalidades, se usan, además, inhibidores reversibles de proteasa, tales como compuestos que contienen boro (por ejemplo, borato, ácido 4-formil fenil borónico) y/o un aldehido tripeptídico para aumentar, adicionalmente, la estabilidad según se desee.

En algunas modalidades, los blanqueadores, activadores de blanqueamiento y/o catalizadores de blanqueamiento están presentes en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden uno o varios compuestos blanqueadores inorgánicos y/o orgánicos. Los blanqueadores inorgánicos incluyen, pero no se limitan a, sales de perhidrato (por ejemplo, sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) . En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas son sales de metales alcalinos. En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas se incluyen como el sólido cristalino, sin protección adicional, aunque en algunas modalidades, se recubre la sal. En la presente invención se usa cualquier sal adecuada conocida en la materia (ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 2100 949).

En algunas modalidades, los activadores de blanqueamiento se usan en las composiciones de la presente invención. Los activadores de blanqueo son, típicamente, precursores perácidos orgánicos que mejoran la acción de blanqueo en el curso de la limpieza a temperaturas de 60°C y menores. Los activadores de blanqueamiento adecuados para usar en la presente descripción incluyen compuestos que, bajo condiciones de perhidrólisis, suministran ácidos alifáticos peroxicarboxílicos que tienen, preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos de carbono, particularmente, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono y/o ácido perbenzoico opcionalmente sustituido. Los activadores de blanqueamiento adicionales se conocen en la materia y se usan en la presente invención (ver, por ejemplo, la patente núm. EP 2100 949).

En algunas modalidades y tal como se describe adicionalmente en la presente descripción, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden, además, al menos un catalizador de blanqueamiento. En algunas modalidades, se usan el triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, así como también complejos de cobalto, cobre, manganeso e hierro. En la presente invención se usan catalizadores adicionales de blanqueamiento (ver, por ejemplo, las patentes de los EE . UU. núms. 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, patente núm. WO 99/06521 y patente núm.

EP 2100 949).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen uno o más complejos de metales catalíticos. En algunas modalidades, puede usarse un catalizador de blanqueamiento que contiene metal. En algunas modalidades se usa el catalizador de blanqueamiento con contenido de metal que comprende un sistema catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica de blanqueamiento definida (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso), un catión de metal auxiliar que tiene poca o ninguna actividad catalítica de blanqueamiento ( por ejemplo, cationes de zinc o aluminio) y un secuestrante que tiene constantes de estabilidad definida para los cationes de metal auxiliares y catalíticos, particularmente, ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminotetra (ácido metilenofosfónico) y sales solubles en agua de estos (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm.4,430,243). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención se catalizan por medio de un compuesto de manganeso. Los compuestos y niveles de uso son muy conocidos en la materia (ver, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. num. 5,576,282). En modalidades adicionales, los catalizadores de blanqueamiento de cobalto se usan en las composiciones de limpieza de la presente invención. Mise. catalizadores de blanqueamiento de cobalto se conocen en la materia (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núms. 5,597,936 y 5,595,967) y se preparan fácilmente por procedimientos conocidos.

En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropolicíclico (MRL). En forma práctica y no como una limitación, en algunas modalidades, las composiciones y los procesos de limpieza proporcionados por la presente invención se ajustan para proporcionar en el orden de al menos una parte por ciento de millones de las especies MRL activos en el medio de lavado acuoso y, en algunas modalidades preferidas, proporcionan de aproximadamente 0.005 ppm a aproximadamente 25 ppm, con mayor preferencia, de aproximadamente 0.05 ppm a aproximadamente 10 ppm, y, con la máxima preferencia, de aproximadamente 0.1 ppm a aproximadamente 5 ppm, de MRL en el líquido de lavado.

En algunas modalidades, los metales de transición en el catalizador de blanqueamiento de metal de transición instantáneo incluyen, pero no se limitan a, manganeso, hierro y cromo. Los MRL incluyen, además, pero sin limitarse a, ligandos ultrarrígidos especiales de puente cruzado ( por ejemplo, 5 ,12-dietil-l,5,8,12-tetraazabiciclo [6.6.2]hexadecano). Los MRL de metal de transición adecuados se preparan, fácilmente, por procedimientos conocidos (ver por ejemplo, en la patente núm. WO 2000/32601, y la patente de los EE. UU. núm.6,225,464).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden agentes para el cuidado de metales. Los agentes para el cuidado de metales se usan para prevenir y/o reducir el deslustre, corrosión, y/o oxidación de metales, que incluyen aluminio, acero inoxidable y metales no ferrosos (por ejemplo, plata y cobre). Los agentes adecuados para el cuidado de metales incluyen aquellos descritos en la patente núm. EP 2 100 949, en las patentes núm. WO 9426860 y WO 94/26859). En algunas modalidades, el agente para el cuidado de metales es una sal de zinc. En algunas otras modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% en peso de uno o más agentes para el cuidado de metales.

En algunas modalidades, la composición de limpieza es una composición líquida de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) que tiene una proteasa termolisina variante. El detergente líquido de lavandería HDL puede comprender un tensioactivo detersivo (10%-40%), que comprende un tensioactivo detersivo aniónico (seleccionado de un grupo de sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos alcoxilados de alquilo, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo y carboxilatos de alquilo, todos de cadena lineal o ramificada o aleatoria, sustituidos o no sustituidos, y/o mezclas de estos); y, opcionalmente, un tensioactivo no iónico (seleccionado de un grupo de alcohol alcoxilado de alquilo, por ejemplo un alcohol alcoxilado de alquilo de Ca-CIB y/o alquil fenol alcoxilatos de C6-C12), todos de cadena lineal o ramificada o al azar, sustituidos o no sustituidos, opcionalmente, en donde la proporción de peso de tensioactivo detersivo aniónico (con un índice hidrófilo (HIc) de 6.0 a 9) a tensioactivo detersivo no iónico es mayor que 1: 1.

La composición puede comprender, opcionalmente, un polímero reforzador de la surfactancia, que consiste en polímeros de limpieza basados en grasa alcoxilada anfifílica (seleccionados de un grupo de polímeros alcoxilados que tienen propiedades hidrófilas e hidrófobas, tales como polialquileniminas alcoxiladas en el intervalo de 0.05% en peso - 10% en peso) y/o polímeros de injerto aleatorios (típicamente, que comprenden una cadena principal hidrófila, que comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en: ácidos carboxílicos insaturados de C1-C6, éteres, alcoholes, aldehidos, cetonas, ésteres, unidades de azúcar, unidades alcoxi, anhídrido maleico, polialcoholes saturados tales como glicerol, y mezclas de estos; y cadena (s) lateral (es) hidrófoba(s) seleccionadas del grupo que consiste en: grupo alquilo de C4-C25, polipropileno, polibutileno, áster de vinilo de un ácido monocarboxílico saturado de C1-C6, alquil áster de C1-C6 de ácido acrílico o metacrílico, y mezclas de estos.

La composición puede comprender polímeros adicionales, tales como polímeros para el desprendimiento de la suciedad (que incluyen poliésteres con remate aniónico, por ejemplo SRP1, polímeros que comprenden al menos una unidad monomérica seleccionada de un sacárido, ácido dicarboxílico, poliol y combinaciones de estos, en una configuración aleatoria o en bloque, polímeros basados en tereftalato de etileno y copolímeros de estos, en una configuración aleatoria o en bloque, por ejemplo, Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325, Marloquest SL), polímeros antirredepósito (0.1% en peso a 10% en peso, que incluyen polímeros de carboxilato, tales como polímeros que comprenden al menos un monómero seleccionado de ácido acrílico, ácido maleico (o anhídrido maleico), ácido fumárico, ácido itacónico, ácido aconítico, ácido mesacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico y cualquier mezcla de estos, homopolímero de vinilpirrolidona y/o polietilenglicol, con un peso molecular en el intervalo de 500 a 100,000 Da); polímero celulósico (que incluye los seleccionados de alquilcelulosa, alquilalcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquilcarboxialquilcelulosa, cuyos ejemplos incluyen carboximetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y mezclas de estas) y carboxilato polimérico (tal como copolímero aleatorio de maleato/acrilato u homopolímero de poliacrilato).

La composición puede comprender, además, ácidos grasos saturados o insaturados, preferentemente, ácidos grasos saturados o insaturados de C12-C24 (0% en peso a 10% en peso); agentes de depósito (ejemplos de los cuales incluyen polisacáridos, preferentemente, polímeros celulósicos, haluros de poli dialil dimetil amonio (DADMAC), y copolímeros de DAD MAC con vinil pirrolidona, acrilamidas, imidazoles, haluros de imidazolinio, y mezclas de estos, en una configuración aleatoria o de bloque, goma de guar catiónica, celulosa catiónica tal como hidroxietil celulosa catiónica, almidón catiónico, policilamidas catiónicas, y mezclas de estos.

La composición puede comprender, además, agentes inhibidores de la transferencia de colorantes, cuyos ejemplos incluyen ftalocianina de manganeso, peroxidasas, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles y/o mezclas de estos; agentes quelantes, cuyos ejemplos incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); ácido dietilentriaminopenta metilenfosfónico (DTPMP); ácido hidroxietano difosfónico (HEDP); ácido etilendiamino-N,N'-disuccínico (EDDS); ácido metil glicina diacético (MGDA); ácido dietilentriamino penta acético (DTPA); ácido propilendiaminotetracético (PDTA); 2-hidroxipiridin-N-óxido (HPNO); o ácido metil glicina diacético (MGDA); ácido glutámico, ácido N,N-diacético (sal tetrasódica de ácido N,N-dicarboximetil glutámico (GLDA); ácido nitrilotriacético (NTA); ácido 4,5-dihidroxi-m-bencenodisulfónico; ácido cítrico y sales de este; ácido N-hidroxietiletilendiaminotriacético (HEDTA), ácido trietilentetraaminohexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilendiaminotetraprópionico (EDTP) y derivados de estos.

La composición puede comprender, además, enzimas (de 0.01% en peso de enzima activa a 0.03% de enzima activa) seleccionadas de un grupo de proteasas; amilasas; lipasas; celulasas; colina oxidasas; peroxidasas/oxidasas; pectato liasas; cutinasas; cutinasas; lacasas; fosfolipasas; lisofosfolipasas; aciltransferasas; perhidrolasas; arilesterasas y cualquier mezcla de estas. La composición puede comprender un estabilizador enzimático (cuyos ejemplos incluyen polioles tales como propilenglicol o glicerol, azúcares o alcoholes de azúcares, ácido láctico, inhibidor reversible de proteasa, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático o un derivado de ácido fenil borónico, tal como ácido 4-formilfenil borónico).

La composición puede comprender, además, supresores de espuma con base en silicona o ácidos grasos; colorantes de matizado, cationes de calcio y magnesio, ingredientes de señalización visual, agentes anti-espuma (de 0.001% en peso a aproximadamente 4.0% en peso) y/o estructurantes/espesantes (de 0.01% en peso a 5% en peso, seleccionados del grupo que consiste en diglicéridos y triglicéridos, diestearato de etilenglicol, celulosa microcristalina, materiales con base en celulosa, celulosa de microfibra, biopolímeros, goma de xantana, goma gelana, y mezclas de estos).

Los tensioactivos detersivos adecuados incluyen, además, tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquil piridinio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de fosfonio cuaternario de alquilo, compuestos de sulfonio ternarios de alquilo, y/o mezclas de estos); tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfoteros (seleccionados de un grupo de alcanolamina sulfo-betaínas); tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos y mezclas de estos.

La composición puede ser de cualquier forma líquida, por ejemplo una forma líquida o gel, o cualquier combinación de estas. La composición puede estar en cualquier forma de dosis unitaria, por ejemplo, una bolsa.

En algunas modalidades, la composición de limpieza es una composición en polvo de alta densidad (HDD, por sus siglas en inglés) que tiene una proteasa termolisina variante. El detergente de lavandería en polvo HDD puede comprender un tensioactivo detersivo que incluye tensioactivos detersivos aniónicos (seleccionados de un grupo de sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos alcoxilados de alquilo, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo y carboxilatos de alquilo, todos de cadena lineal o ramificada o al azar, sustituidos o no sustituidos, y/o mezclas de estos), tensioactivos detersivos no iónicos (seleccionados de un grupo de etoxilatos de alquilo de Ce-Cíe y/o alquil fenol alcoxilatos de C6-C12), tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquil piridinio, compuestos de alquilamonio cuaternario, compuestos de alquilfosfonio cuaternario, compuestos de alquil sulfonio ternario y mezclas de estos), tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfotéricos (seleccionados de un grupo de alcanolamina sulfo-betaínas); tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos y mezclas de estos; adyuvantes (adyuvantes libres de fosfato [por ejemplo, adyuvantes de zeolita, cuyos ejemplos incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita MAP en el intervalo de 0% en peso a menos de 10% en peso]; coadyuvantes de fosfato [cuyos ejemplos incluyen tri-polifosfato de sodio en el intervalo de 0% en peso a menos de 10% en peso]; ácido cítrico, sales de citrato y ácido nitrilotriacético, o sales de estos, en el intervalo de menos de 15% en peso); sal de silicato (silicato de sodio o potasio, o meta-silicato de sodio en el intervalo de 0% en peso a menos del 10% en peso, o de silicato estratificado (SKS-6)); sal de carbonato (carbonato de sodio y/o bicarbonato de sodio en el intervalo de 0% en peso a menos de 10% en peso); y agentes de blanqueo (fotoblanqueadores, cuyos ejemplos incluyen ftalocianinas de zinc sulfonado, ftalocianinas de aluminio sulfonado, colorantes de xantenos, y mezclas de estos; activadores de blanqueo hidrófobos o hidrófilos (cuyos ejemplos incluyen sulfonato de dodecanoil oxibenceno, sulfonato de decanoil oxibenceno, ácido decanoil oxibenzoico o sales de estos, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoil oxibenceno, tetraacetil etilendiamina (TAED) y sulfonato de nonanoiloxibenceno (NOBS), quats de nitrilo, y mezclas de estos; peróxido de hidrógeno; fuentes de peróxido de hidrógeno (sales de perhidrato inorgánico, cuyos ejemplos incluyen sales sódicas de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato o persilicato mono o tetrahidratadas); perácidos hidrófilos y/o hidrófobos preformados (seleccionados de un grupo que consiste en ácidos y sales percarboxílíeos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos) & mezclas de estos y/o catalizadores de blanqueo (tales como reforzadores de blanqueo de imina, cuyos ejemplos incluyen cationes y poliiones de iminio; zwiteriones de iminio; aminas modificadas; óxidos de amina modificados; N-sulfonil iminas; N-fosfonil iminas; N-acil iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas cíclicas de azúcar y mezclas de estos; catalizadores de blanqueo que contienen metales, por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno o manganeso, junto con cationes de metales auxiliares, tales como zinc o aluminio, y un secuestrante, tal como ácido etilendiaminotetraacético, ácido etilendiaminotetra (metilenfosfónico) y sales solubles en agua de estos).

La composición puede comprender, además, enzimas seleccionadas de un grupo de proteasas; amilasas; lipasas; celulasas; colina oxidasas; peroxidasas/oxidasas; pectato liasas; cutinasas; cutinasas; lacasas; fosfolipasas ; lisofosfolipasas; aciltransferasas; perhidrolasas ; arilesterasas y cualquier mezcla de estas.

La composición puede comprender, además, ingredientes detergentes adicionales que incluyen microcápsulas de perfume, popurrí de perfume encapsulado en almidón, agentes de matizado, polímeros adicionales, que incluyen polímeros catiónicos y para la integridad de las telas, ingredientes de bloqueo de colorantes, agentes suavizantes de telas, abrillantadores (por ejemplo, abrillantadores fluorescentes C.I.), agentes floculantes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, agentes de depósito para telas y/o ciclodextrina.

En algunas modalidades, la composición de limpieza es una composición detergente para el lavado automático de vajilla (ADW, por sus siglas en inglés) que tiene una proteasa termolisina variante. El detergente ADW puede comprender dos o más tensioactivos no iónicos seleccionados de un grupo de tensioactivos no iónicos etoxilados, tensioactivos de alcohol alcoxilado, alcoholes poli (oxialquilados) con remate en epoxi o tensioactivos de óxido de aminas presentes en cantidades de 0 a 10% en peso; adyuvantes en el intervalo de 5-60% que comprenden fosfato (onofosf tos, difosfatos, polifosfatos o tripolifosfatos o fosfatos oligoméricos, adyuvantes preferidos de tripolifosfato de sodio, STPP, o libres de fosfato [compuestos con base en aminoácidos, cuyos ejemplos incluyen MGDA (ácido metil-glicina-diacético) y sales y derivados de este, GLDA (ácido glutámico-N,N-diacético) y sales y derivados de este, IDS (ácido iminodisuccínico) y sales y derivados de este, metil carboxiinulina y sales y derivados de esta, y mezclas de estos, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilentriaminopenta acético (DTPA), ácido B-alaninodiacético (B-ADA) y sus sales], homopolímeros y copolímeros de ácidos policarboxílicos y sus sales parcialmente o totalmente neutralizadas, ácidos policarboxílicos monoméricos y ácidos hidroxicarboxílicos y sus sales, en el intervalo de 0.5% a 50% en peso; polímeros sulfonados/carboxilados (proporcionan estabilidad dimensional al producto) en el intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 50% en peso; auxiliares de secado en el intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% en peso (seleccionados de poliésteres, especialmente, poliésteres aniónicos opcionalmente, junto con otros monómeros con 3 a 6 funcionalidades que son propicias para la policondensación, específicamente, funcionalidades ácido, alcohol o áster, compuestos de policarbonato, poliuretano y/o poliurea-poliorganosiloxano, o compuestos precursores de estos, del tipo carbonato cíclico reactivo y urea); silicatos en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% en peso (silicatos de sodio o potasio, por ejemplo, disilicato de sodio, meta-silicato de sodio y filosilicatos cristalinos); blanqueadores inorgánicos (por ejemplo sales perhidratadas, tales como sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) y orgánicos (por ejemplo, peroxiácidos orgánicos que incluyen diacil y tetraacilperóxidos, especialmente, ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico y ácido diperoxihexadecanodioico); activadores de blanqueo con precursores de perácidos orgánicos en el intervalo de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10% en peso; catalizadores de blanqueo (seleccionados de triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, bispiridilamina de Co, Cu, Mn y Fe, y complejos relacionados, y pentamina acetato de cobalto (III) y complejos relacionados); agentes para el cuidado de metales en el intervalo de aproximadamente 0.1% a 5% en peso (seleccionados de benzatriazoles, sales y complejos metálicos, y/o silicatos); enzimas en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 5.0 mg de enzima activa por gramo de composición detergente para el lavado automático de vajilla (seleccionado de un grupo de proteasas; amilasas; lipasas; celulasas; colina oxidasas; peroxidasas/oxidasas; pectato liasas; cutinasas; cutinasas; lacasas; fosfolipasas; lisofosfolipasas; aciltransferasas; perhidrolasas; arilesterasas y cualquier mezcla de estas); y componentes de estabilizadores enzimáticos (seleccionados de oligosacáridos, polisacáridos y sales de metales divalentes inorgánicos).

Las tablas más abajo muestran composiciones detergentes representativas, útiles como composiciones que tienen una termolisina variante de la presente invención.

- D U3 00 t£> 15 15 5 10 15 NJ O U> NJ O NJ O i_p 10 15 - - - Composiciones detergentes de alta densidad para el lavado automático de vajilla Se completa hasta 100% de humedad y/o ingredientes secundarios* * Abrillantador / colorante / SRP1 / carboximetilcelulosa de Na / fotoblanqueador / MgS04 / PVPVI/ supresor de espuma / PEG de alto peso molecular/arcilla.

El pH de los Ejemplos (I) a (VI) es de aproximadamente 9.6 a I— > 15 iciones detergentes en tableta Formulacio b ill d / / b i il l l d N f t bl d M S04 5 iI— O* 15 15 Composiciones detergentes líquidas de bajo rendimiento para el lavado de vajilla C - - - N ro J h NJ 00 15 NJ UJ NJ 15 G? U) -R 15 15 Composiciones detergentes líquidas de lavandería adecuadas para lavadoras automáticas de carga superior 5 ) il 16 il t NH 10 15 G? U o) 10 NJ - oR» NJ -p* 10 15 ISJ -P u> 15 5 10 15 Composiciones detergentes líquidas de lavandería adecuadas para lavadoras automáticas de carga superior (1 &2) y lavadoras de carga frontal (3). 1 Copolímero de injerto aleatorio es un copolímero de óxido de polietileno injertado con acetato de polivinilo que tiene una cadena principal de óxido de polietileno y múltiples cadenas laterales de acetato de polivinilo. El peso molecular de la cadena principal de óxido de polietileno es de aproximadamente 6000 y la relación de peso del óxido de polietileno y acetato de polivinilo es aproximadamente 40 a 60 y no mayor que 1 punto de injerto por 50 unidades de óxido de etileno. 2 Polietilenimina (PM = 600) con 20 grupos de etoxilato por - 3 Polímero de limpieza de grasa alcoxilada anfifílica es una polietilenimina (PM = 600) con 24 grupos etoxilato por -NH y 16 grupos propoxilato por -NH 15 15 15 15 Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de - - - Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de - Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de - Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de esta invención se añade por separado a estas formulaciones. 5 en 10 15 Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de Composiciones detergentes granuladas de lavandería y sus componentes. La proteasa de - N <tJ > 10 15 0 5 0 5 - - - - - - -- - 1 El copolímero comprende: i) monómeros del grupo de ácidos carboxílicos mono o poliinsaturados; ii) monómeros de fórmula general R1(R2)C=C(R3)-X-R4, en la que R1 a R3 indican, independientemente, -H, -CH3 o -C2H5, X indica un grupo espaciador opcionalmente presente que se selecciona de -CH2-,-C(O)O- y -C(O)-NH-, y R4 indica un residuo alquilo saturado de cadena lineal o ramificada con 2 a 22 átomos de carbono o indica un residuo insaturado, preferentemente, aromático, con 6 a 22 átomos de carbono; iii) opcionalmente otros monómeros 2 Tensioactivo no iónico de fórmula general R1-CH(OH)CH2O- (AO)w-(A'0)c-(A"0)y-(A"'0)Z-R2, en el que R1 indica un residuo alquilo o alquenilo saturado, o mono o poliinsaturado de C6 -24, de cadena lineal o ramificada; R2 indica un residuo de hidrocarburo lineal o ramificado con 2 a 26 átomos de carbono; A, A', A" y A1" indican, independientemente, un residuo del grupo que comprende - CH2CH2 , -CH2CH2 - CH2 , - CH2CH2- -CH (CH3 ) , CH2-CH2-CH2CH2 , - CH2-CH-(CH3)-CH2-, -CH2-CH(CH2-CH3), w, x, y, y z indican valores entre 0.5 y 120, en donde x, y y/o z pueden ser, además, O. 5 10 15 La matriz 1 con base en ácidos grasos se compone de 20% en peso de sal sódica de ácidos grasos de coco, 50% en peso de polioles no poliméricos (sorbitol, glicerina, propilenglicol, sacarosa y glucosa) , 15% en peso de tensioactivos aniónicos y no iónicos, y 15% en peso de agua.

La matriz 2 con base en ácidos grasos se compone de 20% en peso de sal sódica de ácido esteárico, 3% en peso de sal 0 sódica de ácido láurico, 3% en peso de sal sódica de ácido mirístico, 50% en peso de polioles no poliméricos (sorbitol, glicerina y propilenglicol), 2% en peso de ácido láurico, 2% en peso de ácido esteárico, 10% en peso de tensioactivo aniónico y 10% en peso de agua. 5 0 5 0 5 0 5 Como se indicó anteriormente, las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan por cualquier proceso seleccionado por el formulador. Los ejemplos no limitantes de estos se describen en las patentes de los EE. UU. núm. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392 y 5,486,303, que se incorporan en la presente descripción como referencia. En algunas modalidades en las cuales se prefiere una composición de limpieza de pH bajo, el pH de dicha composición se ajusta mediante la adición de un material acídico tal como HCl.

Las composiciones de limpieza descritas en la presente descripción se usan para limpiar un sitio (por ejemplo, una superficie, elemento, vajilla o tela). Típicamente, al menos una parte del sitio se contacta con una modalidad de la presente composición de limpieza, en forma pura o diluida en un líquido de lavado, y, después, opcionalmente, el sitio se lava y/o se enjuaga. Para los propósitos de la presente invención, el "lavado" incluye, pero no se limita a, restregado y agitación mecánica. En algunas modalidades, las composcionesde limpieza son empleadas, típicamente, en concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en soluciónn. Cuando el disolvente es agua, la temperatura del agua varía, típicamente, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90°C y, cuando el sitio es una tela, el agua de la relación en masa de la tela es, típicamente, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.

Procesos para preparar y usar composiciones de limpieza Las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y se preparan por cualquier proceso adecuado seleccionado por el formulador, {ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, 5,486,303, 4,515,705, 4,537,706, 4,515,707, 4,550,862, 4,561,998, 4,597,898, 4,968,451, 5,565,145, 5,929,022, 6,294,514 y 6,376,445).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención se proporcionan en la forma de dosis unitaria que incluyen tabletas, cápsulas, saquitos, bolsas y bolsitas con múltiples compartimentos. En algunas modalidades, el formato de dosis unitaria está diseñado para proporcionar una liberación controlada de los ingredientes dentro de una bolsa con múltiples compartimientos (u otro formato de dosis unitaria). Los formatos de dosis unitaria y de liberación controlada son conocidos en la materia {ver, por ejemplo, la patente europea núm. EP 2100 949, la patente núm. WO 02/102955 y las patentes de los EE. UU. núms. 4,765,916 y 4,972,017 y la patente núm. WO 04/111178 para los materiales adecuados para los formatos de dosis unitaria y de liberación controlada). En algunas modalidades, la forma de dosis unitaria se proporciona en tabletas recubiertas con una película soluble en agua o bolsas solubles en agua. La patente europea núm. EP 2100 947 proporciona varios formatos para dosis unitarias y son conocidos en la materia.

Métodos de uso En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención son útiles para limpiar superficies (por ejemplo, vajilla), lavar ropa, limpiar superficies duras, limpiar lentes de contacto, etc. En algunas modalidades, al menos una porción de la superficie se pone en contacto con al menos una modalidad de las composiciones de limpieza de la presente invención en forma pura o diluida en un líquido de lavado y, después, la superficie, opcionalmente, se lava y/o enjuaga. Para los propósitos de la presente invención, el "lavado" incluye, pero no se limita a, restregado y lavado mecánico. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención se usan en concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en solución. En algunas modalidades en las que el disolvente de lavado es agua, la temperatura del agua varía, típicamente, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90°C.

La presente invención proporciona métodos para limpiar o lavar un artículo o superficie [por ejemplo, superficie dura) que requiere limpieza e incluyen, pero no se limitan a, métodos para limpiar o lavar un artículo de vajilla, un artículo de vajilla de mesa, un artículo de tela, ropa, un elemento para el cuidado personal, etc. o similares, y métodos para limpiar o lavar una superficie dura o blanda (por ejemplo, una superficie dura de un artículo).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para limpiar un elemento, objeto o superficie en necesidad de limpieza; el método comprende poner en contacto el elemento o superficie (o una parte del elemento o superficie que se desea limpiar) con al menos una proteasa termolisina variante de la presente invención, o una composición de la presente invención, durante un tiempo suficiente y/o en condiciones adecuadas y/o eficaces para limpiar el elemento, objeto o superficie hasta un grado deseado. Algunos de los métodos comprenden, además, enjuagar el artículo, objeto o superficie con agua. Para algunos de tales métodos, la composición de limpieza es una composición detergente para lavado de vajilla y el artículo u objeto a limpiar es un artículo de loza o un artículo de vajilla de mesa. Como se usa en la presente descripción, un "artículo de vajilla" es un artículo usado, generalmente, para servir o ingerir alimentos. Un artículo de vajilla puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, un plato, una taza, un tazón, etc., y similares. Como se usa en la presente descripción, "vajilla de mesa" es un término más amplio que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, platos, cubiertos, cuchillos, tenedores, cucharas, palillos, cristalería, jarras, salseras, vasos, artículos para servir, etc. Se contempla que "artículo de vajilla de mesa" incluye cualquiera de estos artículos o artículos similares para servir o ingerir alimentos. Para algunos de tales métodos, la composición de limpieza es una composición detergente para lavado automático de vajilla o una composición detergente para lavado manual de vajilla y el artículo u objeto a limpiar es un artículo de loza o de vajilla de mesa. En algunos de estos métodos, la composición de limpieza es una composición detergente de lavandería ( por ejemplo, una composición detergente en polvo de lavandería o una composición detergente líquida de lavandería) y el artículo a limpiar es un artículo de tela. En otras modalidades, la composición de limpieza es una composición de pretratamiento para ropa.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para la limpieza o el lavado de un artículo de tela que, opcionalmente, requiere limpieza o lavado, respectivamente. En algunas modalidades, los métodos comprenden proporcionar una composición que comprende la proteasa variante que incluye, pero no se limita a, composiciones de limpieza para telas o ropa, y un artículo de tela o artículo de ropa que requiere limpieza, y poner en contacto el artículo de tela o artículo de ropa (o una porción del artículo que se desea limpiar) con la composición en condiciones adecuadas o efectivas para limpiar o lavar el artículo de tela o ropa hasta un grado deseado.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para limpiar o lavar un elemento o superficie (por ejemplo, una superficie dura) opcionalmente, en necesidad de limpieza; el método comprende proporcionar un elemento o superficie a limpiar o lavar y poner en contacto el elemento o superficie (o una porción del elemento o superficie que se desea limpiar o lavar) con al menos una variante de termolisina de la invención, o una composición de la invención, que comprende al menos una de esas variantes de termolisina durante un tiempo suficiente y/o en condiciones suficientes o eficaces para limpiar o lavar el elemento o la superficie hasta un grado deseado. Tales composiciones incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una composición de limpieza o composición detergente de la invención (por ejemplo, una composición detergente para el lavado manual de vajilla, una composición de limpieza para el lavado manual de vajilla, una composición detergente para ropa o detergente para telas o composición de limpieza para ropa o tela, un detergente liquido para ropa, una composición de limpieza líquida para ropa, una composición detergente en polvo para ropa, una composición de limpieza en polvo para ropa, una composición detergente para el lavado automático de vajilla, una composición detergente o de limpieza intensificadora para ropa, un aditivo de limpieza para ropa y una composición para la limpieza previa de manchas de la ropa, etc.). En algunas modalidades, el método se repite una o más veces, particularmente, si se desea una limpieza o lavado adicional. Por ejemplo, en algunos casos, el método comprende, además, opcionalmente, permitir que el artículo o superficie se mantengan en contacto con al menos una proteasa variante o composición por un periodo suficiente o efectivo para limpiar o lavar el artículo o superficie hasta el grado deseado. En algunas modalidades, los métodos comprenden, además, enjuagar el artículo o superficie con agua y/u otro líquido. En algunas modalidades, los métodos comprenden, además, poner en contacto el artículo o superficie con al menos una proteasa variante de la invención o una composición de la invención nuevamente y permitir que el artículo o superficie se mantenga en contacto con al menos una proteasa variante o composición por un periodo suficiente para limpiar o lavar el artículo o superficie hasta el grado deseado. En algunas modalidades, la composición de limpieza es una composición detergente para el lavado de vajilla y el artículo a limpiar es un artículo de vajilla o vajilla de mesa. En algunas modalidades de los métodos de la presente, la composición de limpieza es una composición detergente para el lavado automático de vajilla o una composición detergente para el lavado manual de vajilla y el artículo a limpiar es un artículo de vajilla o vajilla de mesa. En algunas modalidades de los métodos, la composición de limpieza es una composición detergente para ropa y el artículo a limpiar es un artículo de tela.

La presente invención proporciona, además, métodos para limpiar un elemento de vajilla de mesa o vajilla en una máquina lavavajillas automática; el método comprende proporcionar una máquina lavavajillas automática, colocar una cantidad de una composición para el lavado automático de vajilla, que comprende al menos una variante de termolisina de la presente invención, o una composición de la invención, suficiente para limpiar la vajilla de mesa o elemento de vajilla en la máquina (por ejemplo, al colocar la composición en un compartimento de detergente apropiado o proporcionado, o dispensador en la máquina), poner un elemento de vajilla o vajilla de mesa en la máquina y hacer funcionar la máquina para limpiar la vajilla de mesa o elemento de vajilla ( por ejemplo, según las instrucciones del fabricante). En algunas modalidades, los métodos incluyen cualquier composición para lavado automático de vajilla descrita en la presente descripción, que comprende, pero sin limitarse a, al menos una variante de termolisina proporcionada en la presente descripción. La cantidad de la composición para el lavado automático de vajilla que se va a usar puede determinarse fácilmente de conformidad con las instrucciones o sugerencias del fabricante y puede usarse cualquier forma de composición para el lavado automático de vajilla que comprende al menos una proteasa variante de la presente invención ( por ejemplo, líquido, polvo, sólido, gel, tableta, etc.), que incluye cualquiera de las descritas en la presente descripción.

La presente invención proporciona, además, métodos para limpiar una superficie, elemento u objeto, opcionalmente, en necesidad de limpieza; el método comprende poner en contacto el elemento o superficie (o una porción del elemento o superficie que se desea limpiar) con al menos una termolisina variante de la presente invención, o una composición de limpieza de la invención, en forma pura o diluida en un licor de lavado durante un tiempo suficiente y/o en condiciones suficientes o eficaces para limpiar o lavar el elemento o superficie hasta un grado deseado. Después, la superficie, el artículo u objeto se puede (opcionalmente) lavar y/o enjuagar si se desea. Para los fines de la presente invención, "lavado" incluye, pero no se limita a, por ejemplo, restregado y agitación mecánica. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza se usan en concentraciones de aproximadamente 500 ppm a aproximadamente 15,000 ppm en la solución ( por ejemplo, solución acuosa). Cuando el disolvente de lavado es agua, la temperatura del agua varía, típicamente, de aproximadamente 5°C a aproximadamente 90°C y cuando la superficie, artículo u objeto comprende una tela, la relación entre el agua y la masa de la tela es, típicamente, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1.

La presente invención proporciona, además, métodos para limpiar un elemento de lavandería o tela en una máquina de lavado; el método comprende proporcionar una máquina de lavado, colocar una cantidad de una composición detergente de lavandería que comprende al menos una termolisina variante de la invención, suficiente para limpiar el elemento de lavandería o tela en la máquina ( por ejemplo, al colocar la composición en un compartimento de detergente apropiado o proporcionado, o dispensador en la máquina), colocar el elemento de lavandería o tela en la máquina y hacer funcionar la máquina para limpiar el elemento de lavandería o tela {por ejemplo, según las instrucciones del fabricante). Los métodos de la presente invención incluyen cualquier composición detergente de lavandería descrita en la presente descripción, que comprende, pero sin limitarse a, al menos una de cualquier termolisina variante proporcionada en la presente descripción. La cantidad de la composición detergente para ropa que se va a usar puede determinarse fácilmente de conformidad con las instrucciones o sugerencias del fabricante y puede usarse cualquier forma de composición detergente para ropa que comprende por lo menos una proteasa variante de la presente invención (por ejemplo, sólido, polvo, líquido, gel, tableta, etc.), que incluye cualquiera de las descritas en la presente descripción.

Experimental Ejemplo 1 Ensayos Los ensayos siguientes son ensayos estándar usados en los ejemplos descritos más abajo. Ocasionalmente, algunos protocolos específicos requieren desviaciones de estos ensayos estándar. En esos casos, las desviaciones de estos protocolos de ensayo estándar descritos más abajo se identifican en los ejemplos.

A. índice de desempeño El índice de desempeño (PI) compara el desempeño de la enzima variante (valor medido) y la enzima estándar (valor teórico) a la misma concentración de proteína. Adicionalmente, los valores teóricos se pueden calcular con el uso de los parámetros de la ecuación Langmuir de la enzima estándar.

Un índice de desempeño (PI) mayor que 1 (PI>1) indica un desempeño mejorado por una variante, en comparación con la estándar (por ejemplo, termolisina), mientras que un PI de 1 (PI=1) identifica una variante cuyo desempeño es igual al de la estándar, y un PI menor que 1 (Pi l) identifica una variante cuyo desempeño es peor que la estándar.

B. Ensayo de proteasa en Abz-AGLA-Nba en placas de microtitulación de 96 pocilios Para determinar la actividad proteasa de la metaloproteasa termolisina y variantes de metaloproteasa termolisina, se mide la hidrólisis de la 2-aminobenzoil-L-alanilglicil-L-leucil-L-alanino-4-nitrobencilamida (Abz-AGLA-Nba).

Las soluciones de reactivos usadas son: i) Amortiguador MES (52.6 mM de MES, ajustado a pH 6.5 con NaOH y que contiene 2.6 mM de CaCl2 y 0.00526% (v/v) de TWEEN®-80); ii) Solución estándar de Abz-AGLA-Nba (48 mM de Abz-AGLA-Nba en DMF), mantenida a temperatura ambiente y protegida de la luz; iii) Amortiguador para dilución enzimática con propilenglicol (10 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2 y 0.005% (v/v) de TWEEN®-80, 10% de propilenglicol).

Para preparar una solución de trabajo 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba, se añade 1 mi de solución estándar de Abz-AGLA-Nba a 19 mi de amortiguador MES y se mezcla completamente durante al menos 10 segundos. La solución se mantiene a temperatura ambiente y protegida de la luz.

Para preparar las soluciones de proteasa, los sobrenadantes de cultivo filtrados de variantes de termolisina se diluyen 50 veces en el amortiguador para dilución enzimática.

El ensayo se realiza en microplacas desechables de 96 pocilios, de poliestireno negro y fondo plano, adecuadas para la lectura de fluorescencia (por ejemplo, Greiner 655076). Primero, se añade 195 mL de solución de trabajo 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba a cada pocilio de las microplacas de ensayo de 96 pocilios, seguido de la adición de 5 ml de muestras diluidas de proteasa. Las soluciones se mezclan durante 5 segundos y el cambio de fluorescencia se mide en modo cinético (9 lecturas en 180 segundos, longitud de onda de excitación 350 nm, longitud de onda de emisión 415 nm, sin filtro de corte) a 25°C con el uso de un espectrofluorómetro de microplacas (SpectraMAX Gemini EM, Molecular Devices). La velocidad de cambio de fluorescencia en RFU/s (RFU = unidades de fluorescencia relativa) proporciona una medida de la actividad proteasa.

C. Ensayos de estabilidad La termoestabilidad de las variantes de termolisina con respecto a la enzima termolisina silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3 se determina mediante la incubación de las muestras de proteasa en condiciones definidas, ya sea en amortiguador HEPES o en una solución detergente. La temperatura de incubación se elige de manera que la actividad restante de la termolisina silvestre después de la incubación sea igual a aproximadamente 30% de la actividad inicial. Las actividades iniciales y residuales de la termolisina se determinan con el uso del ensayo en Abz-AGLA-Nba descrito anteriormente en la sección B.

Las soluciones de reactivos que se usan para este conjunto de ensayos son: 1. Solución de trabajo 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba (ver la sección B anterior) 2. Amortiguador de dilución: 10 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 0.005% (v/v) de TWEEN®80 3. Amortiguador HEPES: 10 mM de HEPES, 0.1 mM de CaCl2, 0.005% (v/v) de TWEEN®-80, pH 7.15 4. Detergente de fórmula AT pH 8 (2.5 g/1 en agua 21°GH) 5. Sun All-in-1 Turbo Gel pH 6.3 (3 g/1 en agua 21°GH) 6. Sobrenadantes de cultivo filtrados de variantes de termolisina El equipo usado para este conjunto de ensayos incluye un robot Biomek FX (Beckman Coulter), un espectrofluorómetro de microplacas SpectraMAX Gemini EM (Molecular Devices) y un termocielador Tetrad2 Peltier (Bio-Rad).

Ensayo de termoestabilidad en regulador.

Los sobrenadantes de cultivo de variantes de termolisina se diluyen hasta ~1 yg/ml en amortiguador HEPES y 50 ml/pocillo de muestra de enzima diluida se transfieren a una placa de PCR de 96 pocilios. La actividad inicial de las muestras de enzima se mide mediante el ensayo en Abz-AGLA-Nba descrito en la sección B más arriba, al transferir 5 ml de muestra de enzima a una microplaca de ensayo negra de 96 pocilios (por ejemplo, Greiner 655076) que contiene 195 m? de solución de sustrato 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba. La placa de PCR que contiene los 45 m?/pocillo restantes de las muestras de enzima se sella con un sello adhesivo de hoja delgada (sello B de Bio-Rad), se coloca en el termocielador Tetrad2 y se incuba durante 15 min a 83°C. Después de la incubación, las muestras en la placa de PCR se enfrían hasta temperatura ambiente y se mide la actividad residual de las muestras de enzima mediante un ensayo en Abz-AGLA-Nba descrito en la sección B anterior, al transferir 5 ml de muestra de enzima a una microplaca de ensayo negra de 96 pocilios (por ejemplo, Greiner 655076) que contiene 195 ml de solución de sustrato 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba.

La proporción de actividad de termoestabilidad se calcula con base en la actividad de la enzima después de la incubación con calor dividido por la actividad de la enzima antes de la incubación con calor, y se expresa como porcentaje de la actividad restante. El índice de desempeño para la termoestabilidad se determina al comparar la proporción de actividad de la enzima variante con la de la enzima termolisina silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3, tratada de manera similar.

Ensayos de estabilidad en detergente.

La estabilidad en detergente de las variantes de termolisina se monitorea mediante la incubación de las variantes en condiciones de estrés en una solución 0.3% (p/v) de detergente líquido para lavado automático de vajilla conocido comercialmente como Sun All-in-1 Turbo Gel (Unilever, Países bajos) y en una solución 0.25% (p/v) de detergente de fórmula AT (descrito en la sección E) de pH 8 a temperatura elevada. La inactivación por calor de enzima presente en el detergente disponible comercialmente Sun All-in-1 Turbo Gel se realiza mediante la incubación de una solución de detergente al 10% a 80°C durante 2 horas. Al término de la incubación, el valor de pH medido es 6.3.

Los sobrenadantes de cultivo de las variantes de termolisina se diluyen hasta ~1 mg/ml en la solución de detergente y 50 ml/pocillo de muestra de enzima diluida se transfieren a una placa de PCR de 96 pocilios. La placa de PCR se sella con un sello de hoja delgada de adhesivo (sello B de Bio-Rad), se coloca en el termocielador Tetrad2 y se incuba durante 15 min. La temperatura de incubación se elige de manera que la actividad restante de la termolisina silvestre después de la incubación sea igual a aproximadamente 30% de la actividad inicial. Las muestras en el Sun All-in-1 Turbo Gel inactivado por calor se incuban a 81°C durante 15 min; las muestras en el detergente de fórmula AT a pH 8 se incuban a 69°C durante 15 min. Después de la incubación, las muestras en la placa de PCR se enfrían hasta temperatura ambiente y se mide la actividad residual de las muestras de enzima mediante un ensayo en Abz-AGLA-Nba descrito en la sección B anterior, al transferir 5 ml de muestra de enzima a una microplaca de ensayo negra de 96 pocilios (por ejemplo, Greiner 655076) que contiene 195 ml de solución de sustrato 2.4 mM de Abz-AGLA-Nba.

La proporción de actividad en detergente se calcula con base en la actividad enzimática en la solución de detergente después de la incubación con calor dividido por la actividad de la enzima en amortiguador HEPES antes de la incubación con calor y se expresa como porcentaje de actividad restante.

El índice de desempeño para la estabilidad en detergente se determina al comparar la proporción de la actividad de la enzima variante, con la de la enzima termolisina silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3, tratada de manera similar.

D. Ensayo en micromuestras de tela PAS-38: El desempeño limpiador de las variantes de termolisina se prueba con el uso de un ensayo en micromuestras de tela poliacrílica que se manchan previamente con yema de huevo y pigmentos (Center for Testmaterials, CFT, Países bajos), en un formato de microplaca de 96 pocilios El principio de este ensayo de desempeño de lavado de proteasas se basa en la liberación de partículas de yema de huevo y un colorante de negro de carbono debido a la hidrólisis de la yema de huevo incorporada en una micromuestra de tela. Se mide la absorbancia del líquido de lavado a 405 nm, y así se proporciona una medida de la actividad proteasa en la muestra analizada (en las condiciones deseadas: pH, temperatura, detergente).

Reactivos y soluciones usados. 1. Micromuestras de tela PAS-38 (yema de huevo en tela poliacrílica, envejecida y coloreada con colorante negro de carbono; CFT-Vlaardingen, Países bajos) 2. Detergente con base en citrato, pH 8, con y sin PAP (formulación AT, ver la sección E) 3. Detergente líquido disponible comercialmente Sun All-in-1 Turbo Gel inactivado por calor 4. 100 mM de amortiguador CAPS pH 10.2 (amortiguador de enjuague) 5. Amortiguador de dilución con propilenglicol: 10 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 0.005% de solución de TWEEN®80, 10% de propilenglicol Detergentes y condiciones.

Las muestras de proteasa (sobrenadantes filtrados de cultivos bacterianos realizados en placas MTP) se ensayan a concentraciones apropiadas en varias condiciones.

Detergente de fórmula AT, pH 6, 50°C; concentración final de proteasa en el ensayo ~ 0.3 mg/ml Detergente de fórmula AT, pH 8, 50°C; concentración final de proteasa en el ensayo ~ 0.2 mg/ml Detergente de fórmula AT, pH 8 + PAP, 50°C; concentración final de proteasa en el ensayo ~ 0.15 pg/ml Detergente Sun All-in-1 Turbo Gel, pH 6.3, 50°C; concentración final de proteasa en el ensayo ~ 0.5 pg/ml Metodo Las micromuestras de tela PAS-38 se cortan en trozos de 5 tnm de diámetro y se colocan en cada pocilio de una microplaca de 96 pocilios. Las muestras de sobrenadante de cultivo se diluyen en amortiguador de dilución hasta aproximadamente 10 pg/ml. Con un robot de pipeteo Biome FX, se añade la solución detergente y las muestras de enzima diluida a una microplaca de 96 pocilios que contiene micromuestras de tela PAS-38 hasta un volumen final de 180 ml/pocillo. La MTP se sella con un sello adhesivo, se coloca en el incubador/agitador iEMS (Thermo Scientific) y se incuba durante 30 minutos a 50°C con agitación lateral a 1150 rpm. Después de la incubación, 100 ml de líquido de lavado de cada pocilio se transfieren a una nueva MTP y se mide la absorbancia a 405 nm con el uso de un espectrofotómetro de microplacas SpectraMax (Molecular Devices). Este valor se denomina "líquido de desempeño inicial". El líquido de lavado restante de la placa de micromuestra de tela se desecha y, posteriormente, la micromuestra de tela se enjuaga una vez con 200 ml de agua. Finalmente, a cada pocilio se añade 180 ml de amortiguador CAPS 0.1 M y la MTP se incuba durante un período adicional de 10 minutos en el incubador/agitador iEMS a 50°C con agitación lateral a 1150 rpm. Después de esta etapa de incubación, se transfiere, nuevamente, 100 m? de líquido a una nueva MTP y se mide la absorbancia a 405 nm con el uso de un espectrofotómetro de microplacas SpectraMax (Molecular Devices). Este valor se denomina "líquido de enjuague". Las dos medidas ("líquido de desempeño inicial" y "líquido de enjuague") se suman y representan el "desempeño total".

Los pocilios de control que contienen una micromuestra de tela y detergente, pero no contienen enzima, se incluyen para descontar el fondo.

Cálculo del desempeño de lavado El valor de absorbancia obtenido se corrige para el valor del blanco (obtenido después de la incubación de micromuestras de tela en ausencia de enzima) y la absorbancia obtenida es una medida de la actividad hidrolítica. Se calcula un índice de desempeño (PI) para cada muestra. Para el cálculo del PI para los índices de desempeño de lavado, se usa un ajuste de la curva de Langmuir con base en la termolisina silvestre. Con el uso de la concentración de proteína de las variantes, se calcula el desempeño esperado con base en el ajuste de la curva. El desempeño observado se divide por el desempeño calculado y este valor se divide por el desempeño de la enzima termolisina silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3.

E. Detergentes Se usan dos detergentes: 1. Sun ALL-in-1 Turbo Gel (Unilever, Países bajos) adquirido en el mercado en 2010. 2. Fórmula AT, con ingredientes indicados más abajo en la Tabla 1.1 Tabla 1.1. Composición de la fórmula detergente AT * PAP, recién se añadió a la fórmula AT para preparar la fórmula detergente AT a pH 8 + PAP.

** El pH de la fórmula detergente AT se ajusta al valor deseado con ácido cítrico. Para los ensayos de estabilidad y desempeño de lavado se usa una solución de 0.25% en agua 21 °GH.

F. Determinación de proteínas La determinación de proteína de variantes de termolisina a partir de sobrenadantes de cultivo se realiza con el uso de un sistema de HPLC Agilent 1200. Se prepara una curva de calibración (18 ppm-400 ppm) con el uso de proteína purificada de termolisina silvestre (la concentración se determina a la absorbancia A222) en amortiguador de dilución (10 mM de NaCl, 0.1 mM de CaCl2, 0.005% de solución de TWEEN®-80, 10% de propilenglicol). Todas las muestras se transfieren a icroplacas de 96 pocilios pretratadas con ácido clorhídrico (concentración final, 0.3 M) y se incuban a 4°C durante 5 minutos. Antes de cargar las muestras, con el uso de un muestreador automático, a una columna de exclusión por tamaño BioSuite 250 UHR 4 mhi, 4.6 x 300 mm (aters Corporation, Milford, Massachusetts), las muestras se tratan con dodecilsulfato de sodio (SDS) hasta una concentración final de 2% (p/v). Las muestras se eluyen de la columna con 25 mM de fosfato de sodio, pH 6, que contiene 2% (p/v) de SDS. El caudal es de 0.4 ml/min en un experimento de 14 min. 32G La absorción de las muestras se mide a 222 nm con un detector de UV y la concentración de proteína se determina con base en la curva de calibración.

El índice de desempeño se determina al comparar la expresión de la enzima variante con la de la enzima termolisina de Bacillus thermoproteolyticus que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3. Ejemplo 2 Generación de genotecas de evaluación de sitios ("SEL", por sus siglas en ingles) de la termolisina de Bacillus thermopro teolyticus Las proteasas de tipo termolisina (TLP, por sus siglas en inglés) son miembros de la familia M4 de peptidasas, de las cuales la termolisina (TLN; EC 3.4.24.27) es el prototipo. La secuencia de aminoácidos de la termolisina, (EC 3.4.24.27) la metalo endo-peptidasa neutral secretada de Bacillus thermoproteolyticus fue informada por primera vez por Titani et al (Titani et al , (1972), Ámino-acid sequence of thermolysin. Nature New Biol.238:35-37). Posteriormente, el gen para esta enzima fue clonado por O'Donohue et al (O'Donohue,M.J (1994) Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin. Biochem. J. 300:599-603) y la secuencia se estableció como el núm. de acceso P00800 en UniProtKB/Swiss- Prot (sec. con núm. de ident.:4). Las únicas diferencias entre las secuencias de proteína informadas por Titani et al y O'Donohue et al son la confirmación de Asn en la posición 37 (en lugar de Asp) y Gln en la posición 119 (en lugar de Glu).

La proteína termolisina de longitud completa de Bacillus thermoproteolytícus (01Donohue,M.J (1994) Biochem. J. 300:599-603) (que en la presente descripción se muestra en la sec. con núm. de ident.:4) es más que 99% idéntica a: la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus (Chen et al (2004). Extremophiles 8:489-498 y descrita en la patente núm. W02009058303) al producto del gen nprS de Bacillus stearothermophilus (Nishiya,Y. and Imanaka,T. (1990) J. Bacteriol. 172:4861-4869) y al nprM de Bacillus stearothermophilus (M. Kubo and T. Imanaka, J. Gen . Microbiol. 134:1883-1892, 1988). En la presente descripción, los términos "termolisina", "estearolisina", "bacilolisina", "proteinasa-T", "PrT", "proteasa tipo termolisina" y "TLP" se usan indistintamente para referirse a la enzima metaloproteasa neutra de Bacillus thermoproteolytícus.

La única diferencia de secuencia entre la proteína termolisina de longitud completa de Bacillus thermoproteolytícus (sec. con núm. de ident.:4) y la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus (sec. con núm. de ident.:5), es la presencia de Ala en la posición 115 (dentro de la pro-región) en lugar de Ser, lo que proviene de un cambio de un nucleótido en el codón para esa posición.(TCG a GCG).

El plásmido pHPLT-ProteinasaT fue proporcionado a BaseClear (Leiden, Países bajos) para la generación de las genotecas de evaluación de sitios (SEL, por sus iglas en inglés). Este plásmido codifica la secuencia codificante de la proteína termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus . La secuencia de proteína de longitud completa (sec. con núm. de ident.: 2) difiere en un aminoácido dentro de la pro-región de la molécula clonada originalmente (sec. con núm. de ident.: 5), pero ambas producen proteínas maduras idénticas de 316 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína termolisina madura se muestra en la sec. con núm. de ident.: 3. BaseClear generó genotecas de posición en cada uno de los sitios en la proteína termolisina madura.

Este plásmido de expresión de B. subtilis, pHPLT-ProteinasaT, contiene el casete de expresión de la termolisina que se muestra más abajo, el promotor LAT de B. licheniformis (Plat) y elementos adicionales de pUBU O (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986) que incluyen un gen de replicasa (reppUB), un gen de resistencia a la neomicina/canamicina (neo) y un marcador de resistencia a la bleomicina (bleo) (Figura 4 de patente de los Estados Unidos núm. 6,566,112). El mapa del plásmido pHPLT-ProteinasaT se proporciona en la Figura 1. La secuencia del casete de expresión de la termolisina se proporciona más abajo en la sec. con núm. de ident.:l.

La sec. con núm. de ident.:1 expone la secuencia de nucleótidos del gen de la termolisina a partir del plásmido de expresión pHPLT-ProteinasaT (la secuencia señal nativa se muestra en letras minúsculas, el propéptido nativo en minúsculas con texto subrayado y la secuencia madura en mayúsculas): atgaaaatgaaaatgaaattagcatcgtttggtcttgcagcaggactagcggcccaagtat ttttaccttacaatgcgctggcttcaacggaacacgttacatggaaccaacaatttcaaac ccctcaattcatctccggtgatctgctgaaagtgaatggcacatccccagaagaactcgtc tatcaatatgttgaaaaaaacgaaaacaagtttaaatttcatgaaaacgctaaggatactc tacaattgaaagaaaagaaaaatgataaccttggttttacgtttatgcacttccaacaaac gtataaagggattcctgtgtttggagcagtagtaactgcgcacgtgaaagatggcacgctg acggcgctatcagggacactgattccgaatttggacacgaaaggatccttaaaaagcggga agaaattgagtgagaaacaagcgcgtgacattgctgaaaaagatttagtggcaaatgtaac aaaggaagtaccggaatatgaacagggaaaagacaccgagtttgttgtttatgtcaatggg gacgaggcttctttagcgtacgttgtcaatttaaactttttaactcctgaaccaggaaact ggctgtatatcattgatgccgtagacggaaaaattttaaataaatttaaccaacttgacgc cgcaaaaccaggtgacgtcaagtcgATAACAGGAACATCAACTGTCGGAGTGGGAAGAGGA GTACTTGGTGATCAAAAAAATATTAATACAACCTACTCTACGTACTACTATTTACAAGATA ATACGCGTGGAAATGGGATTTTCACGTATGATGCGAAATACCGTACGACATTGCCGGGAAG CTTATGGGCAGATGCAGATAACCAATTTTTTGCGAGCTATGATGCTCCAGCGGTTGATGCT CATTATTACGCTGGTGTGACATATGACTACTATAAAAATGTTCATAACCGTCTCAGTTACG ACGGAAATAATGCAGCTATTAGATCATCCGTTCATTATAGCCAAGGCTATAATAACGCATT TTGGAACGGTTCGCAAATGGTGTATGGCGATGGTGATGGTCAAACATTTATTCCACTTTCT GGTGGTATTGATGTGGTCGCACATGAGTTAACGCATGCGGTAACCGATTACACAGCCGGAC TCATTTATCAAAACGAATCTGGTGCAATTAATGAGGCAATATCTGATATTTTTGGAACGTT AGTCGAATTTTACGCTAACAAAAATCCAGATTGGGAAATTGGAGAGGATGTGTATACACCT GGTATTTCAGGGGATTCGCTCCGTTCGATGTCCGATCCGGCAAAGTATGGTGATCCAGATC ACTATTCAAAGCGCTATACAGGCACGCAAGATAATGGCGGGGTTCATATCAATAGCGGAAT TATCAACAAAGCCGCTTATTTGATTAGCCAAGGCGGTACGCATTACGGTGTGAGTGTTGTC GGAATCGGACGCGATAAATTGGGGAAAATTTTCTATCGTGCATTAACGCAATATTTAACAC CAACGTCCAACTTTAGCCAACTTCGTGCTGCCGCTGTTCAATCAGCCACTGACTTGTACGG TTCGACAAGCCAGGAAGTCGCTTCTGTGAAGCAGGCCTTTGATGCGGTAGGGGTGAAA La sec. con núm. de ident.: 2 expone la secuencia de aminoácidos de la termolisina a partir del plásmido de expresión pHPLT-ProteinasaT (la secuencia señal nativa se muestra en letras minúsculas, el propéptido nativo en minúsculas con texto subrayado y la secuencia madura en mayúsculas) mkmkmklasfglaaglaaqvf lpynalastehvtwnqqf qtpqf isgdllkvngtspeelv yqyveknenkfkfhenakdtlqlkekkndnlgf tfmhf qqtykgipyfgawtahvkdgtl talsgtlipnldtkgslksgkklsekqardiaekdlvanvtkevpeyeqgkdtefwyvng deaslaywnlnf ltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqldaakpgdvksITGTSTVGVGRG VLGDQKN I NTT Y S T Y Y YLQDNTRGNG I FT YDAKYRTTL PGS LWAD ADNQ F FAS YDAP AVD A HYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLS GGIDWAHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTP GISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSW GIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK La sec. con núm. de ident.: 3 expone la secuencia de aminoácidos de la proteína termolisina madura producida a partir del plásmido pHPLT-ProteinasaT (316 residuos): I TGT S T VGVGRGVLGDQKN I NTT Y ST Y Y YLQDNTRGnG I FT YD AKYRTT L PGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAI RSSVHYSQGYNNAF NGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDWAHELTHAVTD YTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGD S LRSMSD P AKY GD PDH Y S KRYTGTQDNGGVH I NS G 11 NKAAYL I S QGGTH YGVSWGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTS QEVASVKQAFDAVGVK La sec. con núm. de ident.:4 expone la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la termolisina de Bacillus thermoproteolyticus, núm. de acceso P00800 de UniProtKB/Swiss-Prot mkmkmklasfglaaglaaqvflpynalastehvtwnqqfqtpqfisgdllkvngtspeelv yqyveknenkfkfhenakdtlqlkekkndnlgftfmrfqqtykgipyfgaw tshvkdgtl talsgtlipnldtkgslksgkklsekqardiaekdlvanvtkevpcyeqgkdtefw yvng deaslayw nlnfltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqldaakpgdvksITGTSTVGVGRG VLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDA HYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDG NAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLS GGIDW AHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTP GISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSW GIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK La sec. con núm. de ident.:5 expone la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la termolisina de Geobacillus caldoproteolyticus (Chen et al (2004). Extremophiles 8:489-498 y descrita en la patente núm.

W02009058303). mkmkmklasfglaaglaaqvflpynalastehvtwnqqfqtpqfisgdllkvngtspeelv yqyveknenkfkfhenakdtlqlkekkndnlgftfmrfgqtykgipvfgaw tahvkdgtl talsgtlipnldtkgslksgkklsekqardiaekdlvanvtkevpcyeqgkdtefw yvng deaslayw nlnfltpepgnwlyiidavdgkilnkfnqldaakpgdvksITGTSTVGVGRG VLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDA HYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLS GGIDW AHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTP GISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSW GIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK Producción de variantes de termolisina Las genotecas de posición para cada uno de los 316 residuos fueron construidas por BaseClear BV (Leiden, Países bajos). Las genotecas consistieron en células transformadas de B. subtilis que contienen plásmidos de expresión que codifican secuencias de variantes de termolisina en las 316 posiciones de la proteína madura. Cada variante se confirmó por análisis de secuenciación del ADN antes de la evaluación de la actividad de la proteína. Los clones individuales se cultivaron como se describe a continuación a fin de obtener las diferentes variantes de termolisina para la caracterización funcional.

Expresión de proteínas Los transformantes de . subtilis que contienen variantes de termolisina se cultivaron en placas de 96 pocilios durante 16 horas en caldo de soja tríptico (TSB) con 10 mg/ml de neomicina, y se añadió 10 ml de este precultivo a MTP Corning 3599 llenadas con 190 ml de medios de cultivo (descritos más abajo) suplementados con 10 pg/ml de neomicina. Las placas se incubaron durante 22-26 horas a 37°C y 80% de humedad con mezcla rotativa constante a 300 rpm. Las células se recolectaron por centrifugación a 2500 rpm durante 10 minutos y se filtraron a través de una placa de filtro Multiscreen de Millipore con el uso de un sistema de vacío Millipore. Después de la cosecha, se añadió propilenglicol a los sobrenadantes de cultivo hasta una concentración final de 10% y estas muestras se usaron para los ensayos. Los medios de cultivo eran un medio enriquecido semidefinido, con base en amortiguador de fosfato, glucosa y maltodextrina como las principales fuentes de carbono, y estaban suplementados con 0.2% de Soytone y 0.14%de extracto de levadura para un crecimiento celular robusto.

Ejemplo 3 Identificación de mutaciones combinables Las posiciones productivas se describen como las posiciones dentro de una molécula que son de mayor utilidad para elaborar variantes combinables que exhiben una característica mejorada, en donde la propia posición permite al menos una mutación combinable. Las mutaciones combinables pueden describirse como las sustituciones en una molécula que pueden usarse para elaborar variantes combinables. Las mutaciones combinables son las que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras no disminuyen significativamente la: expresión, actividad o estabilidad.

Las mutaciones combinables son las que mejoran al menos una propiedad deseada de la molécula, mientras no disminuyen significativamente la: expresión, actividad o estabilidad. Las mutaciones combinables de la termolisina se determinaron con el uso de los valores índice de desempeño (PI) obtenidos en los ensayos descritos en el Ejemplo 1: ensayo de proteasa en Abz-AGLA-Nba (actividad), ensayo en micromuestras de tela de PAS-38 (actividad), ensayos de estabilidad y termoestabilidad en detergente y determinación de proteína (expresión).

Además de las mutaciones combinables, un segundo grupo de mutaciones para la termolisina son las mutaciones combinables para la actividad. Las mutaciones combinables para la actividad son las que mejoran al menos una propiedad de actividad de la molécula, con un índice de desempeño mayor que, o igual a, 1.5, mientras no disminuyen los valores de PI para la expresión o estabilidad menor que 0.5.

Las mutaciones combinables se agruparon de acuerdo con los criterios siguientes (resumidos en la Tabla 3.1): Una variante en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0 (Grupo A) Una variante en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2 (Grupo B) Una variante en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5 (Grupo C) Tabla 3.1 Resumen de los criterios usados para agrupar las mutaciones combinables de variantes de termolisina 0 Los Grupos A, B y C contienen, además, posiciones de aminoácidos que tienen grados diferentes de tolerancia a las sustituciones múltiples. Para identificar posiciones productivas, se mide el grado de sustituciones toleradas en cada posición y se asigna una puntuación de productividad a 5 cada posición. La puntuación de productividad se asignó de acuerdo con el porcentaje de sustituciones (calculado con base en todas las variantes evaluadas) dentro de cada posición comprendidas dentro de los grupos A, B, o C, según los criterios que se exponen más abajo. 0 Las posiciones productivas se definen como las posiciones que mostraron un cierto grado de tolerancia a las sustituciones múltiples, mientras que al mismo tiempo cumplen con una serie de criterios de capacidad de combinación que se exponen más abajo. 5 Los criterios para determinar la puntuación de productividad para las posiciones productivas son los siguientes: • Las posiciones en donde menos de 15% de las sustituciones en una posición determinada queda comprendido dentro de los grupos A, B, o C obtienen una Puntuación de productividad de "1".

• Las posiciones en donde menos del 40%, pero más de, o al menos 15% de las sustituciones en una posición determinada queda comprendido dentro de los grupos A, B, o C obtienen una puntuación de productividad de "2".

• Las posiciones donde menos de 75%, pero más de, o al menos 40% de las sustituciones en una posición determinada queda comprendido dentro de los grupos A, B, o C obtienen una puntuación de productividad de "3".

• Las posiciones donde 75% o más de las sustituciones en una posición determinada queda comprendido dentro de los grupos A, B, o C obtienen una puntuación de productividad de "4".

Estas sustituciones de aminoácidos reciben, además, una puntuación de idoneidad con base en los grupos (A, B, C), en donde aparece la sustitución, y donde una mayor puntuación de idoneidad representa una sustitución más adecuada para usar en la obtención de variantes combinables. Las puntuaciones de idoneidad se definen en la Tabla 3.2.

La Tabla 3.2 define cada puntuación de idoneidad como si se refiriera a los grupos de mutaciones combinables y posiciones productivas.

La Tabla 3.3 muestra las posiciones productivas en la termolisina comprendidas dentro de la puntuación de productividad descrita anteriormente de "4" y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables. La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3.

Tabla 3.3 0 5 0 5 La Tabla 3.4 muestra las posiciones productivas en la termolisina comprendidas dentro de la puntuación de productividad descrita anteriormente de "3" y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables. La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3.

Tabla 3.4 La Tabla 3.5 muestra las posiciones productivas en la termolisina comprendidas dentro de la puntuación de productividad descrita anteriormente de "2" y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables. La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3. 0 5 0 5 La Tabla 3.6 muestra las posiciones productivas en la termolisina comprendidas dentro de la puntuación de productividad descrita anteriormente de "1" y las sustituciones dentro de esas posiciones que son combinables La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3.

Tabla 3.6 0 5 0 5 Ejemplo 4 dutacione combinables iones de idoneidad Como se muestra en el Ejemplo 3 las mutaciones en la termolisina se determinaron con el uso de los valores del índice de desempeño (PI) obtenidos de los ensayos descritos en el Ejemplo 1.

Las mutaciones combinables se asignaron a los grupos A, B o C, de acuerdo con los criterios expuestos en el Ejemplo 3. Estas sustituciones reciben, además, una puntuación de idoneidad con base en los grupos (A, B, C), en donde aparece la sustitución, y en donde una mayor puntuación de idoneidad representa una sustitución más adecuada para usar en la obtención de variantes combinables. Las puntuaciones de idoneidad se definen en la Tabla 4.1. Las puntuaciones de idoneidad para sustituciones individuales de la termolisina que se ajustan a los criterios anteriores se presentan más abajo.

La Tabla 4.1 define cada puntuación de idoneidad como si se refiriera a los grupos de mutaciones combinables y posiciones productivas.

Variantes con puntuación de idoneidad +++++: I001L, T002A, T002C, T002I, T002K, T002M, T004K, T004L T004M, T004Y, Q017L, N037K, F040K, F040L, K045A, K045G, K045M, T049E, T049M, T049Y, L050P, S053C, S053L, A056M, A058E, A058L, Q061L, F063C, A064D, A064E, S065A, S065D, S065E, S065P, S065Y, V087C, V087K, V087L, V087M, V087N, V087Q, V087W, V087Y, N096K, N096L, N096Y, R101H, Q108L, Q108M, G109E, G109M, G109R, G109W, S118A, S118D, S118M, S118Q, S118R, S118T, S118V, Q128A, Q128L, Q128Y, I131L, I137L, T149N, G154A, G154H, G154K, G154M, G154Y, L155M, I164A, N181S, G196A, G196W, I197C, S198A, S198K, G199A, G199Y, A209C, A209M, H216A, Y217C, Y217L, T222K, N227A, I244L, Q246D, V256N, L263A, L263M, T272K, Q273N, Y274M, P277A, P277D, P277Y, L284A, L284M, L284Y, A286K, A286L, A286M, A286N, A286Y, A287C, A288L, A288M, V289A, S291A, S291T, T293A, T293I, T293K, T293L, T293M, T293Y, L295A, L295K, L295M, L295W, Y296M, G297N, S298A, S298G, S298K, S298M, S298R, T299A, T299K, S300D, S300N, Q301K, E302A, V303A, V303P, V303Y, A304E, A304K, A304Y, S305A, S305K, S305M, V306L, V306T, A309C, F310M, D311A, D311K, D311L, D311M, D311V, D311W, D311Y y A312C Variantes con puntuación de idoneidad ++++: T002Q, T004V, V007I, V009I, R011K, I020L, I020V, S025A, S025C, S025K, S025M, S025R, T026C, T026D, Y027C, Y027L, N037L, F040A, A044C, K045F, K045H, K045Q, K045Y, Y046C R047D R047E, R047G R047L, R047M, R047Q, R047T T049L, T049N, T049Q, T049V, S053A, S053N, S053V, A056E, Q061C, Q061I, A064T, S065L, S065T, S065W, A073F, A073L, A073M, A073W, H074C, H074F, H074M, H074N, H074Q, H074W, T080L, T080N, K085S, N086D, V087R, V087T, L091A, L091N, L091R, L091W, L091Y, S092L, Y093C, N096G, N096H, N096Q, N096R, N096S, N096W, N097E, N097M, A099R, A099S, R101C, R101L, R101S, S102N, S107G, Q108I, Q108K, Q108N, G109S, S118E, M120L, Q128I, Q128K, T129L, T129M, I131W, S134P, G136S, I137E, I137T, I137V, V140D, V148A, V148Q, T149D, T149S, T152G, G154C, G154N, L155I, N159S, N159Y, I164C, I168L, I171G, Y179F, A180S, G189A, Y193F, G196H, G196L, G196Y, I197F, S198M, S198N, S198R, S198W, S201A, A209G, A209I, A209K, A209R, A209R, A209U, Y211E, Y211R, P214A, P214R, Y217A, Y217F, Y217M, Y217N, K219A, K219E, K219R, K219S, R220A, Y221A, Y221F, Y221G, Y221M, T222A, T222M, Q225C, Q225E, Q225K, Q225L, Q225S, I232L, I232R, I232S, I232T, I232V, I232U, S234A, S234C, G235A, I236C, I244A, I244M, Q246C, V256S, G257K, G257R, I258A, I258C, I258K, I258Q, I258V, G259N, G259S, G259T, L263H, L263K, L263N, L263V, G264A, G264N, G264P, G264Q, G264S, G264T, K265N, I266C, I266M, I266T, I266V, F267A, F267C, F267H, F267I, F267K, F267L, F267M, F267T, F267Y, R269K, A270G, L271H, T272A, Q273E, Q273G, L275C, L275Q, L275S, L275T, T276A, T276L, T276V T276U, R277E P277F, P277G, R277H, R277N P277R, P277V, P277W, S279G, R285Y, A286C, A286Q, A286R, A286T A288N, V289L, V289M , V289Y, Q290A, Q290H, Q290N, S291V, T293N, T293V, T293W , D294N, L295F, L295G, Y296W, G297D, S298E, S298N, S298P , T299N, S300A, S300G, S300T, Q301M, Q301S, Q301T, Q301V , E302D, E302Q, V303G, V303K, V303L, V303R, V303W, A304R , A304S, A304T, A304W, S305H, S305T, S305V, V306I, Q308A , Q308L, F310C, F310W, D311F, D311G, D311I, D311Q, D311S, D311T, V313C, G314Q, V315L , V315T, K316A y K316M Variantes con puntuación de idoneidad +++: I001K, I001M, I001V, T002F, T002L. T002P T002S T002V, T002W, T002Y, T004E, S005D, S005N, S005P, T006C, R011I, Q017I, Q017W, Q017Y, S025D, S025F, T026K, T026L, T026R, T026V, T026Y, Y027 , Q031A, Q031K, Q031V, N033S, N033T, N037D, N037Q, N037R, F040E, F040G, F040M, F040Q, F040S, F040Y, K045E, K045L, K045S, Y046L, R047A, R047C, R047H, R047K, R047N, T048E, T049A, T049D, T049F, T049H, T049I, T049S, S053F, S053H, S053I, S053M, S053Q, S053T, S053W, A056K, A056Q, A056V, A056W, Q061M, S065I, S065M, S065Q, S065V, D072F, H074E, H074L, Y076H, Y076L, Y076M, Y076Q, V079L, V079Q, V079T, T080I, Y081F, K085E, N086L, N086S, V087D, V087E, V087G, V087I, V087S, L091D, L091E, L091F, L091K, L091M, L091P, L091Q, L091S, Y093T, G095A, G095D, G095H, G095M, G095N, G095S, N096C, N096D, N096I, N096V, N097K, A098C, A098E, A098H, A098R, A099E, A099K A099P, S107D Q108C, Q108E Q108F, Q108H G127C, G127D G127E, Q128C, Q128D, Q128E, Q128R, Q128S, T129I, T129R, S134A, I137P, A141S, T145A, T145C, T145E, T145G, T145M, T145N, T145Q, V148L, V148N, V148Y, T149M, T149V, Y151K, T152S, A153T, G154L, G154Q, G154S, G154T, L155C, Q158A, Q158K, Q158M, Q158N, N159R, N159W, S161A, S161N, S161P, S161T, I164L, I164N, I164S, I164T, I164V, I171C, I171E, I171F, I171L, I171S, F172G, F172L, F172M, F172Q, F172S, F172V, F172 , F172Y, G173A, G173C, T174C, V176L, V176N, N181L, G196D, G196E, G196T, I197D, I197K, I197L, I197T, I197V, I197W, I197Y, S198C, S198E, S198F, S198G, S198H, S198I, S198P, S198Q, S198T, S198V, G199C, G199E, G199F, G199H, G199Q, G199S, G199T, G199W, M205L, A209D, A209E, A209L, A209S, A209T, A209V, Y211A, Y211C, Y211D, Y211F, Y211G, Y211H, Y211I, Y211L, Y211N, Y211Q, Y211S, Y211T, D213N, D213S, P214C, P214G, P214K, P214S, H216C, H216E, H216S, H216T, Y217Q, Y217S, Y217T, Y217V, Y217W, S218K, S218L, S218Y, K219D, K219F, K219G, K219H, K219I, K219M, K219N, K219Q, K219T, R220K, R220V, Y221K, Y221N, Y221Q, Y221R, Y221S, Y221T, Y221V, T222C, T222D, T222L, T222U, T224K, T224M, Q225D, Q225G, Q225H, Q225I, Q225P, Q225V, Q225W, I232C, I232E, I232F, I232K, I232M, I232N, I232Q, I232W, S234D, G235M, I236M, Y242C, Y242F, U242N, Y242V, I244T, I244V, Q246E, Q246N, Q246T, G247A, G247S, T249K, T249M, T249N H250A, H250C G252K, G252Y, V253N, V253T S254A, S254M S254R, S254Y V255L, V255P V256L, V256T G257C , G257D, G257E, G257L, G257N, G257P, G257Q, G257S, G257T, G257Y, I258E, I258L, I258M, I258N, G259A, G259C, G259E, G259F, G259H, G259L, G259M, G259W, D261A, D261N, L263C, L263I, L263Q, L263T, K265A, K265C, K265D, K265M, K265R, K265Q, K265S, I266A, I266F, I266L, I266S, F267E, F267G, F267N, F267S, F267V, F267W, U268M, Y268Q, Y268V, A270C, A270F, A270I, A270L, A270S, L271A, L271D, L271F, L271I, T272E, T272L, T272V, T272W, Q273A, Q273H, Q273Y, Y274F, U274H, L275I, L275M, L275V, T276C, T276F, T276I, T276R, T276Q, T276W, P277Q, P277S, R277T, T278G, S279A, S279D, S279I, S279L, S279M, S279N, S279Q, S279T, N280A, N280C, N280D, N280E, S282K, S282N, L284V, L284W, R285K, A286D, A286E, A286F, A286G, A286H, A286I, A286S, A287I, A287L, A287N, A287V, A287U, A288C, A288I, A288S, A288T, A288V, V289C, V289E, V289F, V289G, V289I, V289N, V289S, V289W, Q290C, Q290D, Q290F, Q290G, Q290L, Q290W, S291E, T293C, T293E, T293F, T293G, T293H, T293Q, T293S, L295C, L295I, L295N, U296N, G297A, G297M, G297R, G297Y, S298C, S298T, S298W, S298Y, T299C, T299F, T299L, T299M, T299R, T299W, S300C, S300K, S300M, S300R, S300Y, Q301E, Q301H, Q301P, Q301R, V303C, V303H, A304C, A304D, A304L, A304N, S305G, S305I, S305L, S305N, S305W, S305Y, V306A, V306S, K307A, K307C, K307G, K307I, K307M, K307N, K307Q, K307R, K307W, K307U Q308C, Q308D Q308F, Q308G Q308I, Q308M A309G, A309S, D311C, D311E, A312G, A312M, A312V, V313T, G314A G314E, G314H, G314M, G314S, G314W, V315A, V315C, V315I, V315M, K316D, K316E, K316F, K316G, K316H, K316L, K316N, K316P, K316Q, K316R, K316S, K316V, K316W y K316Y Variantes con puntuación de idoneidad ++: I001C, T004R, T006V, Q017T , N019K , N019S, T023F, T023W, Y024W , T026F, T026G, T026H, T026I, T026M, Y027M, Y027V, Q031C , Q031Y, N033A, N033C, N033L, N033M, Y046H, Y046N, T048D , T049W, A058C, A058V, Q061F, Q061V, A064H, A064Q, D072W , A073I, H074V, Y076T, V079S, T080A, K085A, K085L, K085N , K085R, N086A, N086C, N086E, N086F, N086G, N086K, N089H , N096F, N096T, N097C, N097R, N097S, N097Y, A098K, A098V , I100L, I100V, R101T, S102G, S103T, S107A, Q108D, G117H , S118G, Q128V, T129Y, G136A, A141G, L144T, V148M, D150S , Y151G, Y151H, Y151S, Y151W, G154D, G154I, G154W, I156L , I156Q, Q158S, N159A, N159C, N159G, N159M, N159T, E160Q , I168A, I168M, I168T, F172D, F172H, L175S, V176C, F178H , F178Y, Y179A, Y179D, Y179H, Y179M, Y179N, Y179Q, Y179S , Y179T, Y179W, A180E, A180G, A180K, A180T, N181G, N181K , N181M, N181T, K182A, K182W, N183S, D185E, E187D, I188V , G196K, G196R, G196V, I197E, I197Q, I197R, G199L, S201C , M205Q, S206M, S206R, D207H, D207N, K210I, K210L, K210V , G212A, G212D, G212Q, D213A, D213G, D213W, P214N, Y217G , S218G, S218T, S218V, T222I, T222V, G223D, G223K, T224E , T224H, Q225A, Q225M, Q225R, V230A, I232G, S234N G235C, G235Q, G235S, I237F, I237M, I244F, G248A, G248E G248S, T249R, Y251M, G252A, G252S, G252T, G252W, V253M, V253Q, S254N, S254V, S254W, V255M, V255N, V256A, V256D, V256F, V256G, V256H, V256R, I258R, I258S, G259K, G259R, R260A, R260N, D261G, D261H, D261I, D261S, G264C, G264R, K265G, K265I, K265L, K265R, U268K, L271N, L271Y, T272C, T272F, T272N, T272Q, Y274C, Y274Q, U274T, T276H, T278C, T278H, T278M, T278N, T278Q, T278S, N280H, N280T, S282A, S282H, S282L, S282M, S282T, Q283S, A286R, A287D, A288Y, V289R, V289T, Q290R, Q290T, Q290V, D294Q, L295T, L295V, U296H, G297C, G297F, G297K, G297T, T299D, T299Q, S300H, S300P, S300V, S300W, Q301C, Q301F, Q301G, Q301W, E302G, E302T, E302V, S305Q, V306F, K307H, Q308R, Q308V, Q308 , Q308Y, A309T, A309V, I 12T y V313I Variantes con puntuación de idoneidad +: I001A, I001H, I0( 1W, I001Y, G003Y , T004A, T004N, S005H, S005L , V007L, V009L, V009T, R011Y, Q017C, Q017R, Q017V, N019L , N019Y, T026W, Y027A, Q031I, N033K, F040W, S053K, S053R , A056H, A056I, A056Y, D057K, A058N, A058Y, Q061R, Q061W , F063Y, Y075A, V079A, V079N, T080D, N086Y, V087P, N089L , N089M, D094T, A098Y, V104A, S107K, S107Y, Q108A, G109A , G109L, Y110L, S118C, T129E, I131Y, G135A, I137A, A141C , T149A, T149L, D150A, D150F, D150K, D150N, D150Q, D150T , D150V, T152L, T152M, I156M, I156T, Q158L, Q158R, Q158Y , E160L, E160Y, T174A, L175H, N181A, K182L, E187L I188L, I197A, I197H, I197N, M205A, M205V, S206A, S206C S206K, S206L, D207A, G212Y, D213L, H216R, S218F, T224F, T224L, T224P, T224Q, T224V, T224Y, N227D, N227L, N227Y, I236A, I237N, N238L, N238 , K239A, A241L, A241S, Q246L, T249L, T249Y, H250K, H250M, H250N, H250P, H250Q, H250R, H250V, H250Y, V253I, V253R, V253Y, S254K, S254L, V255A, V255Y, V256K, D261P, D261V, D261W, K262A, Y268A, Y268S, R269V, T272P, T272Y, Q273C, Q273S, Q273W, Y274A, T278K, T278R, T278Y, N280G, N280Q, S282R, Q283K, Q283L, Q283P, Q283R, Q283W, Q283Y, A287K, A287R, A287T, Q290Y, S291I, S291L, S291M, S291N, D294A, D294V, Y296L, Y296R, T299P, S300I, S300L, Q301L, E302K, E302L, F310A, A312L, A312N, A312R, V313A, V313G y V313L La Tabla 4.2 muestra las variantes combinables para la actividad en la termolisina. La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3. 0 5 0 5 0 5 0 5 0 Además, se mencionan variantes seleccionadas de posición productiva de la termolisina. La numeración de la posición se basa en la proteína termolisina madura que figura en la sec. con núm. de ident.: 3. T002I, T002M, T048E, A058L, F063C, 5 V087L, N096H, Q128Y, Y151R, A180E, S198A, I244T, Q273N, P277R, T278R, Q283E, T293L, T293N, L295F, S298A, Q301I, N019D, S025A, T026R, T049K, T049Q, F063L, S065A, S065T, L091M, N096Q, N096R, N096Y, N097K, R101M, G109A, S118A, I131L, V140D, Q158A, N159E, N159K, L175V, A180R, G196H, 0 G196T, G196Y, K219S, Q225E, I232R, I244L, Q246D, D261N, P277G, T293Y, S300G, Q301F, Q301M, V303R, S305A, D311A. 5 Identificación de homólogos de termolisina A_._ Identificación de moleculas relacionadas en la base de datos MEROPS de proteasas En la base de datos MEROPS de proteasas, la termolisina de Bacillus thermoproteolyticus se clasifica dentro de la familia M4 (M es por metaloproteasa) (http://merops.sanger.ac.uk). La termolisina es el prototipo de la familia M4 (familia de termolisinas) de metaloproteasas y el ejemplo típico del clan MA. Además, se clasifica dentro del sub-clan MA(E) conocido, además, como Glu-Zincinas , debido a que el tercer ligando de zinc es un glutamato. La termolisina de Bacillus thermoproteolyticus recibió en Merops el número de acceso MER001026.

La base de datos MEROPS usa una clasificación jerárquica, basada en la estructura de las peptidasas (proteasas). En esto, cada peptidasa se asigna a una Familia sobre la base de similitudes estadísticamente significativas en la secuencia de aminoácidos, y las familias que se consideran homologas se agrupan en un clan. La clasificación de las peptidasas por estructura molecular y homología se desarrolló en la década de 1990, porque depende de la disponibilidad de datos de secuencias de aminoácidos y estructuras tridimensionales en cantidades que se descubrieron por ese entonces. En 1993, Rawlings & Barrett describieron un sistema en el que se asignaron peptidasas individuales a familias, y las familias se agruparon en clanes (Rawlings, N.D. & Barrett, A.J. (1993) Evolutionary families of peptidases. Biochem J 290, 205-218).

Todas las peptidasas de la familia M4 se unen a un solo ion de zinc catalítico. Como en muchas otras familias de metalopeptidasas, hay un motivo HEXXH, en el que las histidinas son ligandos de zinc y el glutamato es un residuo de sitio activo. La mayoría de los miembros de esta familia son endopeptidasas activas a pH neutro y provienen casi exclusivamente de bacterias, y la termoestabilidad se ha atribuido a la unión de iones de calcio. Las proteínas y los péptidos son degradados con una preferencia por la escisión de Xaa+Yaa, en la que Xaa es un residuo hidrófobo y Yaa es Leu, Phe, lie o Val. La termolisina tiene una estructura de dos dominios, con el sitio activo entre los dominios. El dominio N-terminal incluye una hoja beta distintiva de seis hebras con dos hélices, una de los cuales porta el motivo de unión al zinc, HEXXH. El dominio C-terminal, que es único para la familia, es predominantemente helicoidal y porta el tercer ligando de zinc.

Una búsqueda BLAST de homólogos de proteína termolisina madura (sec. con núm. de ident.: 3) dentro de MEROPS (versión 9.5) produjo los resultados que se muestran más abajo (Tabla 5.1). Cada enzima figura en la lista de la base de datos MEROPS con un número de acceso único, origen genético y muestra el porcentaje de identidad calculado por el programa. Tabla 5.1. Salida de la base de datos MEROPS para los miembros de la familia M4 de metaloproteasas, que incluye termolisina.

Núm. de Origen % de ident . de ident.

MEROPS MERO 01026 termolisina (Bacillus 100.00% thermoproteolyticus) MERO 01027 - termolisina (Geobacillus 100.00% stearothermophilus) MER212338 - termolisina (Geobacillus sp. C56-T3) 87 .13% MER168133 - termolisina (Geobacillus sp. Y412MC61) 87.13% MER001353 - termolisina (Alicyclobacillus 86.13 acidocaldarius) MERO 01927 - termolisina (Bacillus sp.) 87.13 MER234417 - termolisina (Geobacillus sp. Y412MC52) 87.13% MER001034 - termolisina (Bacillus caldolyticus) 86.80 MER001025 - estearolisina (Geobacillus 86.14 stearothermophilus) MER040474 - termolisina (Geobacillus kaustophilus) 87.76% MER109364 - estearolisina (Bacillus sp. SG-1) 74.75% MER187808 - termolisina (Bacillus cereus) 73.42% MER176709 - termolisina (Bacillus pseudomycoides) 73 75% MER003181 - termolisina (Bacillus thuringiensis) 7375% MER061817 - termolisina (Bacillus cereus) 73 42% MEROO1031 - termolisina (Bacillus megaterium) 73 18% MER001030 - termolisina (Bacillus cereus) 73 75% MER001354 - termolisina (Lactobacillus sp.) 72 76% MER187798 - termolisina (Bacillus mycoides) 73 75% MER187790 - termolisina (Bacillus pseudomycoides) 72 76% MER021824 - termolisina (Bacillus anthracis) 72 76% MER109427 - termolisina (Bacillus sp. SG-1) 72 88% MER109389 - termolisina (Bacillus 73 42% weihenstephanensis) MER187794 - termolisina (Bacillus mycoides) 72 43% MER091675 - termolisina (Exiguobacterium sibiricum) 70 61% MER124526 - termolisina (Exiguobacterium sp. ATlb) 68 90% MEROO1028 - termolisina (Brevibacillus brevis) 67 55% MER169677 - termolisina (Brevibacillus brevis) 63 04% MER187793 - termolisina (Bacillus pseudomycoides) 61 24% MER187797 - termolisina (Bacillus mycoides) 60 91% MER187765 - peptidasas no asignadas de la familia M459 67% (Paenibacillus larvae) MEROO1033 - peptidasas no asignadas de la familia M456 62% (Paenibacillus polymyxa) MER001029 - peptidasa B neutra (Bacillus subtilis) 54 05% MER187796 - peptidasa B neutra (Bacillus mycoides) 55.26% MER187792 - peptidasa B neutra (Bacillus 55.26% pseudomycoides) MER038281 - peptidasas no asignadas de la familia M457.89% (Bacillus vietnamensis) MER091650 - peptidasas no asignadas de la familia M456.90% (Herpetosiphon aurantiacus) MER084165 - peptidasas no asignadas de la familia M455.59% (Bacillus cereus) MER187771 - peptidasas no asignadas de la familia M457.05% (Bacillus coahuilensis) MER151875 - peptidasa B neutra (Bacillus cereus) 54.93% MER187800 - peptidasa B neutra (Bacillus mycoides) 53.95% MER028887 - peptidasa B neutra (Bacillus cereus) 54.05% MER084215 - peptidasa B neutra (Bacillus 53.62% we ihenstephanensis) MER187810 - peptidasa B neutra (Bacillus cereus) 53.95% MER039810 - peptidasa B neutra (Bacillus 54.28% thuringiensis) MER062589 peptidasas M4 no asignadas (Bacillus sp. 56.62% NRRL B-14911) MER021804 - peptidasa B neutra (Bacillus anthracis) 54.61% MER109478 peptidasas M4 no asignadas (Bacillus sp. 55.45% SG-1) MER187779 - peptidasa B neutra (Bacillus 52.98% thuringiensis) MER187806 - peptidasa B neutra (Bacillus cereus) 52.63% MER168882 - termolisina (Paenibacillus larvae) 53.33% MER062591 - peptidasas no asignadas de la familia M452.72% (Bacillus cereus) MER187770 - peptidasas no asignadas de la familia M452.40% (Bacillus cereus) MERO80987 - peptidasas no asignadas de la familia M452.40% (Bacillus thuringiensis) MER187805 - peptidasas no asignadas de la familia M452.55% (Bacillus cereus) MER050323 - peptidasas no asignadas de la familia M453.21% (Bacillus cereus) MER187780 - peptidasas no asignadas de la familia M453.21% (Bacillus thuringiensis) MER022038 - peptidasa B neutra (Oceanobacillus 49.50% iheyensis) MER187809 - peptidasas no asignadas de la familia M449.05% (Bacillus cereus) MER117663 - peptidasas no asignadas de la familia M451.03% (Shewanella halifaxensis) MER014937 - peptidasas no asignadas de la familia M448.04% (Clostridium acetobutylicum) MER002103 - toxina lambda (Clostridium perfringens) 46.86% MER08471 - bacilolisina (Brevibacillus 49.51 laterosporus) MER001035 - bacilolisina (Bacillus 49.51% amyloliquefaciens) MER001038 - bacilolisina (Bacillus sp.) 49.51% MER054676 - bacilolisina (Bacillus sp. B16) 49.18% MER057051 - aureolisina (Staphylococcus 47.02% saprophyticus) MER080743 - bacilolisina (Bacillus sp. RH219) 49.66% MER187789 - peptidasas no asignadas de la familia M448.72% (Bacillus thuringiensis) MER003790 - peptidasas no asignadas de la familia M447.71% (Clostridium histolyticum) MER080014 - bacilolisina (Bacillus subtilis) 49.32% MER001032 - bacilolisina (Bacillus subtilis) 47.37% MER091634 - bacilolisina (Bacillus pumilus) 47.37% MER014941 - toxina lambda (Clostridium 45.48% acetobutylicum) MER091620 - peptidasas no asignadas de la familia M445.40% (Flavobacterium columnare) MER155135 - aureolisina (Macrococcus caseolyticus) 48.65% MER203088 - peptidasas no asignadas de la familia M449.82% (Shewanella violácea) MER086404 - peptidasas no asignadas de la familia M445.11% (Stigmatella aurantiaca) MERO68045 - peptidasas no asignadas de la familia M445.39% (Myxococcus xanthus) MER187787 - peptidasas no asignadas de la familia M458.88% (Bacillus thuringiensis) MER251173 - peptidasas no asignadas de la familia M445.39% (Myxococcus fulvus) MER091640 - peptidasas no asignadas de la familia M448.43% (Stigmatella aurantiaca) MER086488 - peptidasas no asignadas de la familia M444.44% (Stigmatella aurantiaca) MER025442 - peptidasas no asignadas de la familia M446.49% (Vibrio vulnificus) MER001869 - aureolisina (Staphylococcus epidermidis) 46.13% MER178903 - aureolisina (Staphylococcus capitis) 47.47% MER01767 - peptidasas no asignadas de la familia M444.14% (Methanosarcina acetivorans) MER062832 - peptidasas no asignadas de la familia M445.71% (Flavobacterium johnsoniae) MER187814 - aureolisina (Staphylococcus warneri) 45.21% MERO04711 - aureolisina (Staphylococcus aureus) 46.28% MER229315 - peptidasas no asignadas de la familia M444.15% (Vibrio mimicus) MER011075 - aureolisina (Staphylococcus chromogenes) 43.00! MER179736 - aureolisina (Staphylococcus 45.83% pseudintermedius) MER187776 - peptidasas no asignadas de la familia M442.81% (Chryseobacterium gleum)] MER068475 - peptidasas no asignadas de la familia M443.84% (Myxococcus xanthus) MER063156 - peptidasas no asignadas de la familia M446.56% (Pseudoalteromonas tunicata) MER252532 - peptidasas no asignadas de la familia M446.32% (Myxococcus fulvus) MER091643 - peptidasas no asignadas de la familia M445.64% (Stigmatella aurantiaca)] Puede efectuarse un análisis adicional de los miembros de las diversas familias de la base de datos MEROPS, tal como la generación de árboles filogenéticos. Más abajo se proporciona la arquitectura de los 424 miembros del árbol filogenético de la familia M4 (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famwrap/famcards/trees/m4_tree.htm) (Figuras 2A- 2C).

En la Figura 2 anterior se muestra la clave de las secuencias y la arquitectura del árbol filogenético de la familia M4 PepSY~Peptidasa_M4~Peptidas a._M4_ C 1 Stigmatella aurantiaca) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER086404) P_propro teina~Peptidasa_M4~Peptida sa_M4_ C 2 ( Stigmatella aurantiaca ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER086488) 3 ( Myxococcus xanthus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER068045) Peptidasa_M4~ Pep tidas a_M4_ C~PPC~PPC 4 ( Pseudoalteromonas tunicata) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER063156) Pep tidasa_M4~Pepti dasa_M4_ C 5 M04.017 (Streptomyces avermitilis) griselisina (MER028561) 6 M04.017 ( Streptomyces sviceus) griselisina (MER144000) 7 M04.017 ( Streptomyces viridochromogenes) griselisina (MER229668) 8 M04.017 (Streptomyces coelicolor) griselisina (MER012275) 9 M04.017 ( Streptomyces scabiei) griselisina (MER200776) 10 M04.017 ( Kribbella flavida) griselisina (MER076577) 11 M04.017 ( Janibacter sp. HTCC2649) griselisina (MER119370) 12 M04.017 ( Nocardioides sp. JS614 ) griselisina (MER075575) PepS Y~Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 13 M04.017 ( Stigmatella aurantiaca) griselisina (MER086497) 14 M04.017 ( Xanthomonas campestris) griselisina (MER070193) 15 M04.017 ( Xanthomonas axonopodis) griselisina (proteína XAC0465) (MERO19560) 16 M04.017 ( Xanthomonas oryzae) griselisina (MER113870) 17 M04.017 ( Micromonospora sp. L5) griselisina (MER230635) 18 M04.017 ( Streptomyces avermitilis) griselisina (proteína SAV1037) (MER028563) 19 M04.017 ( Streptomyces sviceus) griselisina (MER187827) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 20 M04.017 ( Streptomyces pristinaespiralis ) griselisina (MER137080) 21 M04.017 ( Streptomyces sp. SPB74) griselisina (MER163965) 22 M04.017 ( Streptomyces albus) griselisina (MER187823) 23 M04.017 ( Streptomyces avermitilis) griselisina (proteína SAV2795) (MER028566) 24 M04.017 (Streptomyces sviceus) griselisina (MER137175) 25 M04.017 ( Streptomyces ghanaensis) griselisina (MER187817) 26 M04.017 (Streptomyces coelicolor) griselisina (MER019351) PepSY ~ Pep ti da sa_M4 ~Pep ti da sa_M4_ C 27 M04.017 (Streptomyces scabiei) griselisina (MER200969) Pep ti dasa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C~ P_propro teína 28 M04.017 (Streptomyces sp. SPB74) griselisina (MER137964) 29 M04.017 (Streptomyces sviceus) griselisina (MER187826) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C~He_PIG 30 M04.017 (Streptomyces avermitilis) griselisina (MER028567) Peptidasa_M4~Peptidas SL_M4_ C 31 M04.017 (Streptomyces septatus) griselisina (MER108931) 32 M04.017 (Streptomyces scabiei) griselisina (MER200878) 33 M04.017 ( Streptomyces sp. Mgl) griselisina (MER180683) 34 M04.017 ( Streptomyces sviceus) griselisina (MER187825) Pep t i dasa_M4 ~Pep t i dasa_M4_ C~P_proproteina 35 M04.017 ( Streptomyces coelicolor) griselisina (MER011085) 36 M04.017 (Streptomyces scabiei) griselisina (MER200968) 37 M04.017 ( Streptomyces ghanaensis) griselisina (MER187816) 38 M04.017 ( Streptomyces griseus) griselisina (MER004744) 39 M04.017 ( Streptomyces filamentosus) griselisina (MER187821) 40 M04.017 ( Streptomyces avermitilis) griselisina (MER028565) 41 M04.017 ( Streptomyces sp. Mgl) griselisina (MER163416) Pep t i dasa_M4 ~ Pep ti dasa_M4_ C 42 M04.017 ( Streptomyces griseus) griselisina (MER121393) 43 M04.017 ( Streptomyces filamentosus) griselisina (MER187820) 44 M04.017 ( Streptomyces sp. TH-3) griselisina (MER169964) PepSY~ Pep t idasa_M4 ~ Pept ida sa_M4_ C 45 M04.017 ( Janibacter sp. HTCC2649) griselisina (MER109443) 46 M04.017 ( Janibacter sp. HTCC2649) griselisina (MER109417) 47 M04.017 (Kribbella flavida) griselisina (MER096497) 48 M04.017 ( Streptomyces avermitilis) griselisina (MER028564) 49 M0 .022 ( Burkholderia pseudomallei) peptidasa ZmpA (MER029961) 50 M04.022 ( Burkholderia allei) peptidasa ZmpA (MER040142) 51 M04.022 ( Burkholderia thailandensis) peptidasa ZmpA (MER058477) 52 M04.022 ( Burkholderia oklahomensis) peptidasa ZmpA (MER187766) 53 M04.022 ( Burkholderia cenocepacia) peptidasa ZmpA (MER050804) 54 M04.022 ( Burkholderia cepacia) peptidasa ZmpA (MER028622) 55 M04.022 (Burkholderia ambifaria) peptidasa ZmpA (MER055697) 56 M04.022 ( Burkholderia sp. 383) peptidasa ZmpA (MER056816) 57 M04.022 ( Burkholderia uhonensis) peptidasa ZmpA.

(MER166266) 58 ( Dehalococcoides sp. VS) peptidasas M4 no asignadas (MER109883) 59 ( euhacterium SCB49 no identificada) peptidasas M4 no asignadas (MER137229) 60 ( Croceibacter atlanticus) peptidasas M4 no asignadas (MER118340) PepS Y~Peptida sa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C~fn3 61 (Flavobacterium johnsoniae) peptidasas M4 no asignadas (MER062832) 62 (Flavobacterium columnare) peptidasas M4 no asignadas (MERO91620) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 63 ( Croceibacter atlanticus) peptidasas M4 no asignadas (MER109847) 64 ( Chryseobacterium gleum) peptidasas M4 no asignadas (MER187776) 65 ( Kordia algicida) peptidasas M4 no asignadas (MER166403) PepSY ~ Pep tidasa_M4~Peptidas a._M4_ C-MAM 66 ( Microscilla marina ) peptidasas M4 no asignadas (MERO91624) 67 ( Croceibacter atlanticus) peptidasas M4 no asignadas (MER117388) 68 ( Croceibacter atlanticus) peptidasas M4 no asignadas (MER138802) 69 ( Paenibacillus larvae) peptidasas M4 no asignadas (MER187765) 70 M04.001 ( Paenibacillus larvae) termolisina (MER168882) Pept idas a_M4~Pept idas a_M4_ C 71 (Paenibacillus polymyxa) peptidasas M4 no asignadas (MERO01033) PepSY ~ Pep tidasa_M4 -Pept idas a_M4_ C 72 M04.001 ( Brevibacillus brevis) termolisina (MER001028) 73 M04.001 ( Brevibacillus brevis) termolisina (proteína npr) (MER169677) 74 M04.001 ( Bacillus pseudomycoides) termolisina (MER187790) 75 M04.001 ( Bacillus mycoides) termolisina (MER187794) 76 M04.001 ( Bacillus cereus) termolisina (MER061817) 77 M04.001 ( Bacillus cereus) termolisina (MER187808) 78 M04.001 ( Bacillus weihenstephanensis) termolisina (MER109389) 79 M04.001 ( Bacillus mycoides) termolisina (MER187798) 80 M04.001 (Bacillus cereus) termolisina (MER001030) 81 M04.001 ( Bacillus thuringiensis) termolisina (MER003181) 82 M04.001 (Bacillus pseudomycoides) termolisina (MER176709) 83 M04.001 (Lactobacillus sp. ) termolisina (MER001354) 84 M04.001 (Bacillus anthracis) termolisina (MER021824) 85 M04.001 (Bacillus megaterium) termolisina (MER001031) 86 M04.001 (Bacillus sp . SG-1) termolisina (MER109427) 87 M04.001 (Bacillus caldolyticus ) termolisina (MER001034) 88 M04.018 ( Geobacillus stearothermophilus) estearolisina (MER001025) 89 M04.001 (Geobacillus sp. Y412MC52) termolisina (MER234417) 90 M04.001 (Alicyclobacillus acidocaldarius) termolisina (MER001353) 91 M04.001 (Bacillus sp . ) termolisina (MER001927) 92 M04.001 (Geobacillus sp. Y412MC61) termolisina (MER168133) 93 M04.001 (Geobacillus sp. C56-T3) termolisina (MER212338) 94 M04.001 (Geobacillus kaustophilus) termolisina (MER040474) 95 M04.001 (Bacillus thermoproteolyticus) termolisina (MER001026) 96 M04.001 (Geobacillus stearothermophilus) termolisina (MERO01027) 97 M04.018 (Bacillus sp . SG-1) estearolisina (MER109364) 98 M04.001 ( Exi guobacterium sibiricum) termolisina (MER091675) 99 M04.001 ( Exiguobacterium sp. ATlb) termolisina (MER124526) 100 M04.001 ( Bacillus mycoides ) termolisina (MER187797) 101 M04.001 (Bacillus pseudomycoides) termolisina (MER187793) 102 (Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER187787) 103 M04.012 (Bacillus thuringiensis) peptidasa B neutra (MER039810) 104 M04.012 (Bacillus cereus) peptidasa B neutra (MER028887) 105 M04.012 (Bacillus weihenstephanensis) peptidasa B neutra (MERO84215) 106 M04.012 (Bacillus mycoides) peptidasa B neutra (MER187800) 107 M04.012 (Bacillus cereus) peptidasa B neutra (MER151875) 108 M04.012 (Bacillus anthracis) peptidasa B neutra (MER021804) 109 M04.012 (Bacillus pseudomycoides) peptidasa B neutra (MER187792) 110 M04.012 (Bacillus mycoides) peptidasa B neutra (MER187796) 111 (Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER084165) 112 M04.012 (Bacillus cereus) peptidasa B neutra (MER187810) 113 M04.012 (Bacillus cereus) peptidasa B neutra (MER187806) 114 M04.012 (Bacillus thuringiensis) peptidasa B neutra (MER187779) 115 M04.012 (Oceanobacillus iheyensis) peptidasa B neutra (MER022038) 116 M04.012 ( Bacillus subtilis) peptidasa B neutra (MER001029) Peptidasa_M4~ Pep ti das a_M4_ C 117 ( Herpetosiphon aurantiacus) peptidasas M4 no asignadas (MER091650) 118 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER187809) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 119 M04.009 ( Staphylococcus epidermidis ) aureolisina (MERO01869) 120 M04.009 ( Staphylococcus capitis) aureolisina (MER178903) 121 M04.009 ( Staphylococcus aureus) aureolisina (MER004711) 122 M04.009 ( Macrococcus caseolyticus) aureolisina (MER155135) 123 M04.009 ( Staphylococcus pseudintermedius) aureolisina (MER179736) 124 M04.009 ( Staphylococcus warneri) aureolisina (MER187814) 125 M04.009 ( Staphylococcus chromogenes) aureolisina (MERO11075) 126 M04.009 ( Staphylococcus saprophyticus ) aureolisina (MER057051) 127 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER050323) 128 ( Bacillus t huringiensis peptidasas M4 no asignadas (MER187780) 129 ( Bacillus cereus) peptidasas no asignadas (MER062591) 130 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER187770) 131 ( Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER080987) 132 ( Bacillus cereus peptidasas M4 no asignadas (MER187805) 133 ( Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER187789) 134 ( Bacillus vietnamensis) peptidasas M4 no asignadas (MER038281) 135 ( Bacillus sp. NRRL B-14911) peptidasas M4 no asignadas (MER062589) 136 ( Bacillus sp. SG-1) peptidasas M4 no asignadas (MER109478) 137 ( Bacillus coahuilensis) peptidasas M4 no asignadas (MER187771) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PPC 138 M04.021 ( Thermoactinomyces sp. 27a) peptidasa neutra (MER029719) PepSY~ Pep t i dasa_M4~ Pep ti da sa_M4_ C 139 M04.014 ( Bacillus subtilis) bacilolisina (MER080014) 140 M04.014 ( Bacillus sp. RH219) bacilolisina (MER080743) 141 M04.014 ( Bacillus sp . B16) bacilolisina (MER054676) Pept idas a_M4 ~ Peptidas a M4_ C 142 04.014 ( Brevibacillus laterosporus) bacilolisina (MER048471) PepSY-Peptida sa_M4 ~Peptida sa_M4_ C 143 M04.014 ( Bacillus amyloliquefaciens) bacilolisina (MER001035) 144 M04.014 ( Bacillus sp. ) bacilolisina (MER001038) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 145 M04.014 ( Bacillus pumilus) bacilolisina (MER091634) PepS Y ~ Pep ti da sa_M4 ~ Pept ida sa_M4_ C 146 M04.014 ( Bacillus subtilis) bacilolisina (MER001032) 147 ( Clostridium acetobutylicum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER014937) 148 M04.011 ( Clostridium perfringens ) toxina lambda (MER002103) 149 M04.011 ( Clostridium acetobutylicum) toxina lambda (MER014941) 150 ( Clostridium histolyticum) peptidasas M4 no asignadas (MER003790) Pept i das a_M4 ~ Pept i das a_M4_ C-PPC 151 ( Chloroflexus aurantiacus ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER001453) 152 ( Chloroflexus sp. U-400-fl) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER155497) 153 M04.008 ( Listeria innocua) peptidasa Mpl ( Listeria sp.) (MER229925) PepS Y~ Pep t ida sa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C 154 M04.008 ( Listeria mono cyt ogenes) peptidasa Mpl (MEROO1047) 155 M04.008 ( Listeria ivanovii) peptidasa pl (MER045739) 156 M04.008 ( Listeria seeligeri) peptidasa Mpl (MER045740) 157 ( Plesiocystis pacifica) peptidasas M4 no asignadas (MER160603) Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PPC~PPC 158 ( Stigmatella aurantiaca) peptidasas M4 no asignadas (MER091643) 159 (Stigmatella aurantiaca) peptidasas M4 no asignadas (MER091640) Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C 160 (Myxococcus xanthus) peptidasas M4 no asignadas (MER068475) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C-PPC-PPC 161 Myxococcus xanthus) peptidasas M4 no asignadas (MERO17624) Peptidasa_M4~ Pep ti das a_M4_ C 162 ( Shewanella halifaxensis) peptidasas M4 no asignadas (MER117663) 163 ( Shewanella violácea) peptidasas M4 no asignadas (MER203088) 164 ( Haliscomenohacter hydrossis) peptidasas M4 no asignadas (MER248570) 165 ( Cytophaga hutchinsonii) peptidasas M4 no asignadas (MER023927) 166 ( Vibrio imicus) peptidasas M4 no asignadas (MER229315) Peptidas a_M4 - Peptidas a_M4_ C 167 ( Vibrio vulnificus) peptidasas M4 no asignadas (MER025442) 168 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER187802) 169 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER091678) 170 ( Bacillus anthracis ) peptidasas M4 no asignadas (MER019065) 171 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER054507) 172 ( Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MERO39813) 173 ( Bacillus cereus ) peptidasas M4 no asignadas (MER187804) 174 ( Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER091674) PepSY~Peptidasa_M4 -Peptidas a_M4_ C~Big_3~ Gra m_pos_ anchor 175 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER028889) 176 (Bacillus thuringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER039811) 177 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER028890) 178 ( Bacillus anthracis) peptidasas M4 no asignadas (MER020840) 179 ( Bacillus mycoides) peptidasas M4 no asignadas (MER187799) 180 ( Bacillus weihenstephanensis) peptidasas M4 no asignadas (MER109684) 181 ( Bacillus pseudomycoides) peptidasas M4 no asignadas (MER187791) 182 ( Bacillus mycoides) peptidasas M4 no asignadas (MER187795) 183 ( Bacillus mycoides) peptidasas M4 no asignadas (MER187801) 184 ( Bacillus t huringiensis) peptidasas M4 no asignadas (MER039814) Peptidasa_M4~ Pep ti da sa_M4_ C 185 ( Bacillus cereus) peptidasas M4 no asignadas (MER028888) 186 ( Bacillus anthracis) peptidasas M4 no asignadas (MER020835) 187 ( Hahella chejuensis) peptidasas M4 no asignadas (MERO58667) PepSY~Pep t i dasa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C 188 ( Clostridium botulínum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr) (MER088299) PepS Y ~ Pep t i dasa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C 189 ( Clostridium botulinum ) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr-1) (MER079342) 190 ( Clostridium sporogenes) peptidasas M4 no asignadas (MER137542) 191 (Clostridium botulinum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (proteína npr) (MER187767) 192 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr_l) (MER187754) 193 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (MER187753) 194 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (MER079338) 195 ( Clostridium sporogenes) peptidasas M4 no asignadas (MER144884) 196 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr) (MER079341) 197 ( Clostridium sporogenes) peptidasas M4 no asignadas (MER187769) 198 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr_2) (MER187755) 199 ( Clostridium botulinum) peptidasas 4 no asignadas (MER079340) 200 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr-4) (MER095317) 201 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr-4) (MER094802) 202 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr) (MER094801) 203 ( Clostridium sporogenes) peptidasas M4 no asignadas (MER136684) 204 ( Clostridium botulinum) peptidasas M4 no asignadas (proteína npr) (MER079339) 205 ( Clostridium sporogenes) peptidasas M4 no asignadas (MER178275) Peptidas a_M4~ Pep tidas a_M4_ C~ P_propro teína ~ P_propro teína 206 ( Methanosarcina acetivorans ) peptidasas M4 no asignadas (MER017697) 207 ( Streptomyces ghanaensis) peptidasas M4 no asignadas (MER187818) Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C 208 ( Streptomyces coelicolor ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER011082) 209 ( Streptomyces scabiei) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER200705) 210 ( Streptomyces avermitilis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (ER028562) 211 ( Streptomyces sviceus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER137373) 212 ( Streptomyces sp. Mgl) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER137463) 213 ( Streptomyces griseus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER121447) 214 ( Streptomyces filamentosus ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187819) 215 ( Streptomyces pristinaespiralis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER140364) 216 ( Streptomyces albus ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187822) 217 ( Streptomyces sp. SPB74) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER163861) 218http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/pepsum?id=M04.UPW ( Streptomyces clavuligerus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187824) 219 (Arthrobacter chlorophenolicus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER126758) 220 ( Arthrobacter phenanthrenivorans) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER240183) 221 ( Arthrobacter sp. FB24) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER050759) 222 (Arthrobacter aurescens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER075195) 223 ( marine actinobacterium PHSC20C1) peptidasas no asignadas de la familia M4 224 ( Brachybacterium faecium) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER127552) 225 ( Clavibacter michiganensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER121216) 226 ( Clavibacter michiganensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER115299) 227 ( Microbacterium testaceum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER247399) 228 ( Intrasporangium calvum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER231738) 229 (Janibac ter sp. HTCC2649 ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER115301) 230 ( Frankia alni) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091651) 231 ( Frankia sp. CcI3) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER051510) 232 ( Frankia sp. EANlpec) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER051747) 233 ( Meiothermus silvanus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER038269) 234 ( Pseudomonas fluorescens ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187756) 235 (Myxococcus xanthus ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER068095) 236 ( Burkholderia sp. CCGE1002) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER203878) 237 (Ricinus communis ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER162821) 238 (Catenulispora acidiphila) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER132795) 239 ( Brevibacterium linens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER115300) 240 (Anabaena variabilis ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER054976) 241 ( Nostoc sp. PCC 7120) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER016719) 242 ( Nostoc puncti forme) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER024259) 243 ( Xanthomonas axonopodis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER019561) 244 (Xanthomonas campestris) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER070175) 245 ( Xanthomonas oryzae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER027496) 246 (Xanthomonas campestris) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER019416) 247 ( Thermomonospora curvata) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER129229) 248 (Halomonas elongata) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER223548) 249 ( Chromohalobacter salexigens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER050897) 250 (Bordetella parapertussís) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER030706) 251 (Bordetella hronchiseptica) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER030781) 252 (Bordetella petrii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER114690) 253 (Variovorax paradoxus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187757) 254 ( Variovorax paradoxus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER235281) 255 (Pseudomonas brassicacearum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER244770) 256 (Pseudomonas fulva) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER249215) 257 ( Pseudomonas stutzeri) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER094699) 258 ( Dickeya dadantii ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER223843) 259 ( Dickeya dadantii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER193415) 260 ( Dickeya zeae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187758) 261 ( Pectobacterium carotovorum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER001045) 262 (Pectobacterium wasabiae ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187830) 263 (Dickeya dadantii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER182707) 264 M04.023 (Citrobacter rodentium) peptidasa zpx (MER196184) 265 M04.023 (Enterobacter cancerogenus) peptidasa zpx (MER187772) 266 M04.023 (Salmonella enterica) peptidasa zpx (MER108712) 267 M04.023 (Enterobacter sakazakii) peptidasa zpx (zpx protein) (MER091601) 268 M04.023 ( Erwinia amylovora) peptidasa zpx (proteína prtl) (MER202074) 269 M04.025 ( Erwinia billingiae) protealisina (proteína mpr) (MER220902) 270 M04.025 ( Pantoea sp. At-9b) protealisina (MER232022) 271 M04.025 ( Pantoea ananatis ) protealisina (MER202817) 272 M04.025 ( Rahnella sp. Y9602) protealisina (MER237139) 273 M04.025 {Serratia grimesii) protealisina (MER115298) 274 M04.025 ( Serratia sp. A2) protealisina (MER119664) 275 M04.025 ( Serratia proteamaculans) protealisina (MER059439) 276 M04.025 ( Serratia sp. AS9) protealisina (MER249825) 277 M04.025 ( Serratia sp . AS12) protealisina (MER249807) 278 ( Geodermatophilus obscurus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER132589) 279 ( Gemmata obscuriglobus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187768) 280 (Nocardioides sp. JS614 ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER049523) 281 M04.024 ( Xenorhabdus bovienii) peptidasa PrtS ( Photorhabdus luminescens) (MER200616) 282 M04.024 ( Xenorhabdus nematophila) peptidasa PrtS (MER219816) 283 M04.024 ( Xenorhabdus nematophila) peptidasa PrtS (MER219815) 284 M04.024 ( Photorhabdus asymbiotica) peptidasa PrtS (MER187759) 285 M04.024 (Photorhabdus luminescens) peptidasa PrtS (MER033481) 286 M04.024 ( Photorhabdus sp. Az29) peptidasa PrtS (MER115297) 287 ( Aspergillus terreus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091644) 288 (Neosartorya fischeri) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091615) 289 ( Pyrenophora tritici -repentis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER138903) 290 ( Saccharopolyspora erythraea) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER088688) 291 ( Nectria haematococca) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER243771) 292 ( Gibberella zeae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER064838) 293 (Metarhizium anisopliae ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER243770) 294 ( Metarhizium acridum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER243769) 295 ( Waddlia chondrophila ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER211844) 296 ( Pseudomonas savastanoi) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER232822) 297 ( Pseudomonas syringae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER052672) 298 ( Pseudomonas coronafaciens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187813) 299 ( Cyanothece sp. ATCC 51142) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER103362) 300 ( Bacillus t huringíensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187783) 301 ( Bacillus cereus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER178978) 302 ( Bacillus cereus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187811) 303 ( Bacillus t huringíensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187778) 304 ( Bacillus cereus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187807) 305 ( Methanosarcina acetivorans ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER017698) 306 ( Bacillus t huringíensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187784) 307 ( Bacillus thuringiensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187788) 308 ( Cellulophaga algicola) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER235562) 309 (Aspergillus niger) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MERO91631) 310 ( Providencia rustigianii ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187773) 311 (Providencia alcalifaciens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187774) 312 ( Providencia rettgeri) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187775) 313 ( Providencia stuartii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER122839) 314 ( Mycobacterium abscessus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER117364) 315 (Mycobacterium abscessus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER117363) 316 (Bradyrhizobium j aponicum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER026988) 317 (Agrobacterium vitis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER162454) 318 (Mucilaginibacter paludis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER229316) Peptidasa_M4_C 319 (Serratia marcescens) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER001046) 320 (Streptomyces ghanaensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187815) Peptidas a_M4 - Peptidas a_M4_ C 321 (Sorangium cellulosum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER114292) Peptidasa_M4 -Peptidas a_M4_ C 322 ( Streptomyces filamentosus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091679) PepSY-Pep ti da sa_M4 - Pep t i dasa_M4_ C 323 ( Streptomyces avermitilis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER028519) 324 ( Streptosporangium roseum ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187812) Pep t i dasa_M4 -Pep t i dasa_M4_ C 325 M04.007 (Enterococcus faecium ) coccolisina (MER187749) 326 M04.007 ( Enterococcus faecalis) coccolisina (MER002810) 327 ( Renibacterium salmoninarum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER002083) 328 ( Kribbella flavida) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MERO79366) 329 ( Herpetosiphon aurantiacus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER085851) Pep t idas a_M4 -Pep t idas a_M4_ C 330 M04.016 (Aer omonas jandaei) peptidasa PA (tipo Aer omonas) (MER079815) 331 M04.016 ( Aeromonas eucrenophila) peptidasa PA ( tipo Aeromonas) (MERO79803) PepSY~Pep t i dasa_M4 -Pepti dasa_M4_ C~ PPC 332 M04.016 ( Aeromonas punctata) peptidasa PA (tipo Aeromonas) (MER029943) Peptidasa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C 333 M04.016 ( Aeromonas encheleia) peptidasa PA (MER079817) 334 M04.016 ( Aeromonas bestiarum) peptidasa PA (MER079816) 335 M04.016 ( Aeromonas media) peptidasa PA (MER079802) 336 M04.016 ( Aeromonas salmonicida) peptidasa PA (MER079819) PepSY~Pep t i dasa_M4 -Pep t i dasa_M4_ C~ PPC 337 M04.016 ( Aeromonas punctata) peptidasa PA (MER030073) Peptidasa_M4~ Pep ti das a_M4_ C 338 M04.016 ( Aeromonas encheleia) peptidasa PA (MER079804) 339 M04.016 ( Aeromonas popoffii) peptidasa PA (MER079805) 340 M04.016 ( Aeromonas hydrophila) peptidasa PA (MER011853) 341 M04 .016 ( Aeromonas sp. CDC 2478-85) peptidasa PA (MER079818) 342 M04.016 ( Aeromonas schubertii) peptidasa PA ( Aeromonas -type) (MER079806) PepSY~Pep ti da sa_M4 - Pep t i dasa_M4_ C~ PPC 343 ( Aeromonas veronii) peptidasas M4 no asignadas (MER055154) Pept idasa_M4 ~ Pep ti das a._M4_ C 344 ( Aeromonas sobria) peptidasas M4 no asignadas (MER079820) FTP- PepSY- Pept idasa_M4 -Pept idas a_M4_ C-PPC-PPC 345 (Reinekea sp. MED297) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER083727) 346 (Shewanella denitrificans ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER050231) PepSY~Pep t i dasa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C~ PPC~ PKD 347 ( Shewanella báltica) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER048895) 348 ( Shewanella amazonensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER048811) 349 ( Shewanella woodyi ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MERO87265) PepS Y ~ Pep t i dasa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C 350 ( Chromobacterium violaceum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER027350) PepSY~Pep t i dasa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C~ PPC~ PPC 351 ( Pseudoalteromonas sp. SB-B1) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER140592) 352 ( Pseudoalteromonas sp. SM9913) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091617) 353 ( Pseudoalteromonas sp. A28) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER019098) 354 ( Antarctic bacterium cepa 643) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER012255) 355 ( Pseudoalteromonas sp. SM495) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187748) 356 ( Pseudoalteromonas piscicida) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER019099) 357 ( Pseudoalteromonas ruthenica) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187751) 358 ( Pseudoalteromonas tunicata) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER108855) 359 ( Moritella viscosa) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER139442) 360 ( Haliangium ochraceum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER114761) 361 ( Haliangium ochraceum) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER124450) 362 (Kangiella koreensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER065613) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PPC 363 M04.003 ( Marinomonas sp. MED121) vibriolisina (MER139826) 364 ( Vibrio splendidus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER122486) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PPC~PKD 365 ( Vibrionales bacterium SWAT-3) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER139254) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PKD 366 ( Vibrio tubiashii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187750) 367 ( Vibrio harveyi) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091688) 368 ( Vibrio campbellii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER139568) PepSY ~ Pep t i dasa_M4 ~ Pep t i dasa_M4_ C 369 ( Shewanella sp. MR- 7) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER072768) 370 (Shewanella sp. MR-4) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER073030) 371 ( Shewanella sp. ANA-3) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER073381) 372 (Shewanella amazonensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER049928) 373 (Shewanella woodyi) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER087209) 374 ( Vibrio parahaemolyticus ) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER027936) PepSY~Pepti dasa_M4~ Pept idas SL_M4_ C-PPC 375 (Vibrio sp. Ex25) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER139749) 376 ( Vibrio harveyi) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER109271) 377 (Hahella chejuensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER080002) 378 M04.003 (Moritella sp. PE36) vibriolisina (MER113768) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C~PPC~PPC~P_proprotein 379 ( bacteria no cultivada pTW3) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER164961) 380 ( bacteria no cultivada pTW2) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER164951) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C 381 M04.005 ( Pseudomonas aeruginosa) pseudolysin (MER001024) PepSY~Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C-PPC 382 M04.003 ( Vibrio tubiashii ) vibriolisina (MER139044) 383 M04.003 ( Vibrio proteolyticus ) vibriolisina (MER001043) 384 M04.003 ( Listonella anguillarum) vibriolisina (MER120583) 385 M04.003 ( Vibrio anguillarum) vibriolisina (MER001044) 386 M04.003 (Listonella anguillarum) vibriolisina (MER120671) 387 M04.003 ( Vibrio aestuarianus) vibriolisina (MER113809) 388 M04.003 ( Vibrio vulnificus) vibriolisina (MER003353) 389 M04.010 ( Vibrio splendidus) vimelisina (MERO91636) 390 M04.010 ( Vibrio sp. MED222) vimelisina (MER113711) 391 M04.010 ( Vibrio sp. T-1800) vimelisina (MER029796) 392 M04.010 ( Vibrionales bacterium SWAT-3) vimelisina (MER109237) 393 M04.003 ( Vibrio cholerae) vibriolisina (MER001041) 394 M04.003 ( Vibrio mimicus) vibriolisina (MER122299) 395 M04.003 ( Vibrio fluvialis) vibriolisina (MER019097) 396 M04.003 ( Salinivibrio sp. AF-2004) vibriolisina (MER091639) 397 M04.010 (Photobacterium sp. SKA34 ) vimelisina (MER110034) 398 M04.010 ( Vibrio angustum) vimelisina (MER109056) 399 M04.010 ( Photobacterium angustum) vimelisina (MER187763) 400 M04.010 ( Vibrio angustum) vimelisina (MER109302) Peptidasa_M4~ Pep ti das a_M4_ C 401 ( Moritella sp. PE36) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER109180) Pep ti dasa_M4 - Pep ti da sa_M4_ C 402 ( Alteromonadales bacterium TW-7) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER091610) 403 ( Shewanella violácea) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER203253) 404 ( Vibrio campbellii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER168125) PepSY~Pep t i dasa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C 405 ( Legionella longbeachae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER198565) 406 M04.020 ( Vibrio sp. AND4) peptidasa pap6 (MER187764) PepS Y - Pep ti da sa_M4 - Pep t i dasa_M4_ C 407 04.020 ( Vibrio campbellii) peptidasa pap6 (MER118605) 408 M04.020 ( Vibrio harveyi) peptidasa pap6 (MER020240) PepS Y - Pep t i dasa_M4 -Pep ti dasa_M4_ C 409 ( Vibrio splendidus) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER139945) Pept idasa_M4 -Pep t idas a._M4_ C 410 M04.006 ( Legionella pneumophila) peptidasa Msp ( tipo Legionella) (MER001039) 411 M04.006 ( Legionella drancourtii) peptidasa Msp (tipo Legionella) (MER187828) PepS Y~Pepti dasa_M4~ Pep t i dasa_M4_ C 412 M04.006 ( Legionella longbeachae) peptidasa Msp ( tipo Legionella) (MER002394) 413 ( Legionella pneumophila) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER040780) 414 ( Legionella drancourtii) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187829) 415 ( Legionella longbeachae) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER198471) 416 ( Legionella pneumophila) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER040782) 417 ( Legionella pneumophila) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER040781) Peptidasa_M4~Peptidas a_M4_ C~ PKD ~ PKD ~ PKD 418 M04.019 ( Pseudoalteromonas piscicida) MprIII (MER024591) 419 ( Teredinibacter turnerae) peptidasas M4 no asignadas (MER187760) Pep tidasa_M4~Pept idas a_M4_ C~ PKD ~ PKD ~ PKD ~ PKD 420 ( Reinekea sp. MED297) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER083722) 421 ( Reinekea blandensis) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER187762) Peptidas a_M4 ~ Peptidas a_M4_ C 422 ( Reinekea sp. MED297) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER117392) 423 ( Alteromonas sp. SN2) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER247991) PepSY~ Pep ti das a_M4_ C 424 ( Hydrogenivirga sp. 128-5-R1 -1) peptidasas no asignadas de la familia M4 (MER142070) B._ Identificación de moleculas relacionadas con el uso del algoritmo de búsqueda Genome Quest Un análisis BLAST de proteínas (Altschul SF, Madden TL, Sch ffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402) realizado en Genome Quest (www.genomequest.com) contra bases de datos de patentes y de dominio público, con el uso de la secuencia de la termolisina (sec. con núm. de ident.: 3) como consulta produjo los resultados que se muestran más abajo (Tabla 5.2). BLAST es la implementación de GenomeQuest del algoritmo BLAST2 del NCBI y encuentra las secuencias más relevantes en lo que respecta a similitud biológica. La secuencia de búsqueda tiene los siguientes parámetros predeterminados BLAST para las búsquedas de proteínas: Tamaño de palabra: 3, Corte del valor E-: 10, Matriz de puntuación: BLOSUM62, Apertura de interrupción: 11, Extensión de interrupción: 2 Tabla 5.2. ína termolisina (sec. con nú . de ident.: 3) identificados por análisis BLAST. Términos usados:% ID = porcentaje de identidad de secuencia, Identificador = número de patente-núm. de ident. de sec. o número de acceso de dominio público. o GO 15 o o en 15 15 -P^ o 00 15 o 15 Ejemplo 6 Uso de factores de temperatura para identificar variantes de termolisina con estabilidad mejorada Los factores cristalográficos de temperatura son una medida del movimiento relativo de los átomos individuales de una macromolécula. Estos factores de temperatura surgen como producto del refinamiento del modelo, de manera que el patrón de difracción calculado, dado como intensidades individuales de máximos de difracción de rayos x cristales, coincide mejor con el patrón observado. El factor de temperatura se refina como un factor de atenuación para reflejar que los átomos con mayor movimiento tendrán un efecto de disminución de la difracción general de agregados macromoleculares como función del ángulo de dispersión (theta), con el uso de la fórmula -exp (-Bsin20/A), en donde B es el factor de temperatura (Blundell, T. L. y Johnson L. N., Protein Crystallography, Academic Press, 1976, pág.121).

Además, es probable que las regiones con mayor movilidad general puedan representar lugares en los que la macromolécula plegada es menos estable y, por lo tanto, podrían ser lugares en donde comienza el desplegamiento a medida que la molécula es sometida a estrés por el aumento de temperatura o por desnaturalizantes. Sería de esperar, además, que estas regiones de mayor movilidad general fueran regiones donde los factores de temperatura promedio sean los más altos.

La estructura cristalográfica de la proteína termolisina de Bacillus thermoproteolyticus se ha determinado por una serie de laboratorios independientes. Se seleccionó tres modelos independientes de la proteína del Protein Data Bank con identificaciones de entrada 8TLN, 2TLX y 3D01. Se buscó las regiones de movilidad general al seleccionar regiones de la estructura cristalina, en donde los factores de temperatura para la cadena principal fueran los más altos y, específicamente, en el factor de la temperatura promedio de la cadena principal excediera al menos 1.5 veces la varianza observada del promedio. Las Tablas 6a-6c indican los residuos para los que el factor de temperatura promedio de la cadena principal tiene una puntuación z mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal de la molécula total en un modelo cristalográfico dado. En estas tres estructuras, se comprueba que las mismas regiones exhiben factores de temperatura mayores que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal de la cadena principal de todos los residuos de la termolisina. Estas regiones representan regiones de flexibilidad de consenso e incluyen los residuos siguientes: 1-2 (residuos del N-terminal), 127-128, 180-181, 195-199, 211, 223-224,298-300 y 316 (residuo del C-terminal). 0 5 0 5 0 5 Todos los sitios de la termolisina se seleccionaron al efectuar la mayor cantidad de 0 sustituciones individuales posibles de aminoácidos en la molécula. Se comprobó que muchas variantes que confieren termoest abi1idad o desempeño mejorado de lavado a temperaturas elevadas en formulaciones diferentes de detergentes de lavandería se 5 encontraban en un sitio correspondiente a una de estas regiones de flexibilidad consenso. En la Tabla 6.2 se indican sustituciones representativas de las regiones de flexibilidad consenso que confieren un mejor desempeño de lavandería en Sun All-in-1 Turbo Gel o detergente fórmula AT y pH 8 o mejor termoes tabi 1idad . La hipótesis de trabajo es que estas regiones flexibles son los sitios iniciales del desplegamiento de la proteína. Con base en esta hipótesis, podría predecirse combinaciones de variantes procedentes de regiones diferentes de flexibilidad consenso para proporcionar más estabilización. La estabilización simultánea de varias regiones flexibles seleccionadas de las que se muestran en la Tabla 2 se traduciría en una molécula sustancialmente más estable.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (54)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caraterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2, 87, 96, 198, 277, 293, 295, 298 y 301, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2 (T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M), 87 (V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y), 96 (N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y), 198 (S,C,E,F,G,H,I,P,Q,T,V,M,N,R,W,A,K), 277 (P Q S,T,E,F,G,H,N,R,V,W,A,D,Y), 293 (T,C,E,F,G,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L;,M,U), 295 (L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,M,W), 298 (S,C,T,W,Y,E,N,R,A,G,K,M,R), 301 (Q,E,H,R,R,L,C,F,G,W,M,S,T,V,K), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

3. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una posición productiva, en donde las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos tres de los parámetros de expresión, estabilidad en detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz- AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 1, y; en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 278, 283, 180, 244, 48 y 63, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

4. La variante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en T278R, Q283E, A180E, I244T, T48E y F63C, en donde las posiciones de aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

5. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos todos los parámetros de expresión, estabilidad en detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz- AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 0.5 y no más de uno de los parámetros es menor que 0.8, y; en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 019, 025, 026, 063, 091, 096, 097, 101, 109, 118, 131, 140, 158, 159, 175, 180, 219, 225, 232, 244, 246, 261, 277, 293, 300, 301, 301, 303, 305 y 311, caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

6. Una variante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en N019D, S025A, T026R, S065A, L091M, N096Q, N096R, N096Y, N097K, R101M, G109A, S118A, I131L, V140D, Q158A, N159E, N159K, L175V, A180R, G196T, G196Y, K219S, Q225E, I232R, I244L, Q246D, D261N, P277G, T293Y, S300G, Q301F, Q301M, V303R, S305A, D311A, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

7. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2, 26, 47, 49, 53, 65, 87, 91, 96, 108, 118, 128, 154, 179, 196, 197, 198, 199, 209, 211, 217, 219, 225, 232, 256, 257, 259, 261, 265, 267, 272, 276, 277, 286, 289, 290, 293, 295, 298, 299, 300, 301, 303, 305, 308, 311 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

8. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, caracterizada porque al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 2, 26, 47, 53, 87, 91, 96, 108, 118, 154, 179, 197, 198, 199, 209, 211, 217, 219, 225, 232, 256, 257, 259, 261, 265, 267, 272, 276, 277, 286, 289, 290, 293, 295, 298, 299, 300, 301, 303, 305, 308, 311 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

9. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 40%, pero menos de 75%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 1, 4, 17, 25, 40, 45, 56, 58, 61, 74, 86, 97, 101, 109, 149, 150, 158, 159, 172, 181, 214, 216, 218, 221, 222, 224, 250, 253, 254, 258, 263, 264, 266, 268, 271, 273, 275, 278, 279, 280, 282, 283, 287, 288, 291, 297, 302, 304, 307 y 312, caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

10. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende, además, una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 40%, pero menos de 75%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 1, 4, 17, 25, 40, 45, 61, 74, 86, 97, 101, 109, 149, 150, 158, 159, 172, 181, 214, 216, 218, 221, 222, 224, 250, 253, 254, 258, 263, 264, 266, 268, 271, 275, 279, 282, 283, 287, 288, 291, 297, 302, 304, 307 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

11. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 15%, pero menos de 40%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 5, 9, 11, 19, 27, 31, 33, 37, 46, 64, 73, 76, 79, 80, 85, 89, 95, 98, 99, 107, 127, 129, 131, 137, 141, 145, 148, 151, 152, 155, 156, 160, 161, 164, 168, 171, 176, 180, 182, 187, 188, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 220, 227, 234, 235, 236, 237, 242, 244, 246, 248, 249, 252, 255, 270, 274, 284, 294, 296, 306, 309, 310, 313, 314 y 315, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

12. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende, además, una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 15%, pero menos de 40%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micro uestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y caracterizada porque la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 5, 9, 11, 19, 27, 31, 33, 37, 46, 64, 73, 76, 79, 80, 85, 89, 95, 98, 99, 107, 127, 129, 131, 137, 141, 145, 148, 152, 155, 160, 161, 164, 168, 171, 176, 180, 182, 187, 188, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 220, 227, 234, 235, 236, 237, 242, 244, 246, 248, 249, 252, 255, 270, 274, 284, 294, 296, 306, 309, 310, 313, 314 y 315, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

13. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos una modificación, pero menos de 15% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 3, 6, 7, 20, 23, 24, 44, 48, 50, 57, 63, 72, 75, 81, 92, 93, 94, 100, 102, 103, 104, 110, 117, 120, 134, 135, 136, 140, 144, 153, 173, 174, 175, 178, 183, 185, 189, 193, 201, 223, 230, 238, 239, 241, 247, 251, 260, 262, 269 y 285, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

14. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende, además, una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos una modificación, pero menos de 15% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición productiva se selecciona del grupo que consiste en 3, 7, 20, 23, 24, 44, 48, 50, 57, 72, 81, 92, 93, 94, 100, 102, 103, 104, 110, 117, 120, 134, 135, 136, 140, 144, 153, 173, 174, 175, 178, 183, 185, 189, 193, 201, 223, 230, 238, 239, 241, 247, 251, 260, 262, 269 y 285, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

15. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 75% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 2 (T,F,L,P,S,V,W,Y,Q,A,C,I,K,M), 26 (T,K,L,R,V,Y,W,F,G,H,I,M,C,D), 47 (R,A,C,H,K,N,D,E,G,L,M,Q,T), 49 (T,A,F,H, V,E,Y), 53 (S,F,H,I,M,Q,T,W,K,R,A,N,V,C,L), 65 (S,I,M,Q,L,A), 87 (V,D,E,G,I,S,P,R,T,C,K,L,M,N,Q,W,Y), 91 (L,D,E,F,K,M,P,Q,S,A,N,R,W,Y), 96 (N,C,D,I,V,F,T,G,H,Q,R,S,W,K,L,Y), 108 (Q,C,E,F,H,A,D,I,K,N,L,M), 118 (S,C,G,E,A,D,M,Q,R,T,V), 128 (Q,D,E,R,S,K,A), 154 (G,L,Q,S,T,D,I,W,C,N,A,H,K,M,Y), 179 (Y,A,D,H,M,N,Q,S,T,W,F), 196 (G,E,T,K,V,L,Y,A,W), 197 (I,D,K,L,T,V,W,Y,A,H,N,E,Q,R,F,C), 198 (S,C,E,F,G,H,I, ,Q,T,V,M,N,R,W,A,K), 199 (G,C,E,F,H,Q,S,T,W,L,A,Y), 209 (A,D,E,L,S,T,V,G,I,K,P,R,Y,C,M), 211 (Y,A,C,D,F,G,H,I,L,N,Q,S,T,E,R), 217 (Y,Q,S,T,V,W,G,A,F,M,N,C,L), 219 (K,D,F,G,H,I,M,N,Q,T,A,E,R,S), 225 (Q,D,G,H,I,R,n, ,A,M,K,O,E,K^ ,X), 232 (I,O,E,R,K, ,N,O,??,s,I,,K,S,T,V,Y), 256 (V,L,T,K,A,D,F,G,H,R,S,N), 257 (G,C,D,E,L,NfP,Q,S,TfY,K,R), 259 (G,A,C,E,F,H,L,M,W,K,R,N,S T), 261 (D,A,N,P,V,W,G,H,I,S), 265 (K,A,O,?,M,R,O,b,s,I,I,R,N), 267 (F,E,G,N,S,V,W,A,C,HfI,K,L, ,T,Y), 272 (T,E,L,V,W,P,Y,C,F,N,Q,A,K), 276 (T,C,F,I,P,Q,W,H,A,L,V,Y), 277 (R,O,E,T,E,R,O,H,N,R,n, ,A,?,U), 286 (A,?,E,R,s,H,I,S,P,C,Q,R,T,K^ ,M,N,U), 289 (V,C,E,F,G,I,N,S,W,R,T,L,M,Y,A), 290 (Q,C,D,F,G,L,W,Y,R,T,V,A,H,N), 293 (T,C,EfFfG,H,Q,S,N,V,W,A,I,K,L,,M,U), 295 (L,C,I,N,T,V,F,G,A,K,IVI,W), 298 (S,C,T,W,U,E,N,P,A,G,K,M,R), 299 (T,C,F,L,M,R,W,P,D,Q,N,A,K), 300 (S,C,K,M,R,Y,I,L,H,P,V,WfA,G,T,D,N), 301 (Q,E,H,P,R,L,C,FfG,W,M,S,T,V,K), 303 (n,O,H,s,K,E,R, ,A,R,U), 305 (S,G,I,L,N W,Y,Q,H,T V,A,K,M), 308 (Q,C,D,F,G,I,M,R,V,W,Y,AfL), 311 (?,O,E,R,O,I,O,b,T,A,K,I,,M,n,??,U) y 316 (K,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,V,W,Y,A,M), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

16. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 40%, pero menos de 75%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 1 (I,K,M,V,A,H,W,Y,C,L), 4 (T,E,A,N,R,V,K,L,M,Y), 17 (Q,I,W,Y,C,R,V,T,L), 25 (S,D,F,A,C,K,M,R), 40 (F,E,G,M,Q,S,Y,W,A,K,L), 45 (K,E,L,S,F,H,Q,Y,A,G,M), 56 (A,K,Q,V,W,H,I,M), 58 (A,N,Y,V,L), 61 (Q,M,R,W,F,V,C,I,L), 74 (H,E,L,V,C,F,M,N,Q,W), 86 (N,L,S,Y,A,C,E,F,G,K,D), 97 (N,K,C,R,S,Y,E,M), 101 (R,T,C,L,S,H), 109 (G,A,L,S,E,M,R,W), 149 (T,M,V,A,L,D,S,N), 150 (D,A,F,K,N,Q,T,V,S), 158 (Q,A,K,M,N,L,R,Y,S), 159 (N,R,W,A,C,G,M,T,S,Y), 172 (R,s,I,M,V,b,n,??,U,O,H), 181 (N,L,A,G,K,M,T,S), 214 (P,C,G,K,S,N,A,R), 216 (H,C,E,S,T,R,A), 218 (S,K,L,Y,F,G,T,V), 221 (U,K,N,O,K,X,T,n,A,R,O,M), 222 (T,O,?,E,U,I,n,A,M,K), 224 (T,K,M,R,E,R,O,n,U,E,H), 250 (H,A,C,K,M,N,P,Q,R,V,Y), 253 (V,N,T,I,R,U,M,Q), 254 (S,A,M,R,Y,K,L,N,V,W), 258 (I,E,L,M,N,R,S,A,C,K,QfV), 263 (L,C,I,V,T,H,K,N,U,A,M), 264 (G,C,R,A,N,P,Q,S,T), 266 (I,A,F,L,S,C,M,T,V), 268 (U,M,Q,V,A,S,K), 271 (L,A,D,F,I,N,Y,H), 273 (O,A,H,U,O,E,n?,E,s,N), 275 (L,I,M,V,C,Q,S,T), 278 (T,G,K,R,Y,C,H,M,N,Q,S), 279 (S,A,D,I,L,M,N,Q,T,G), 280 (N,A,C,D,E,G,Q,H,T), 282 (S,K,N,R,A,H,L,M,T), 283 (Q,K,L,P,R,W,Y,S), 287 (A,I,I,N,n,U,K,E,T,?,O , 288 (A,C,I,S,T,V,Y,N,L,M), 291 (S,E,I,L,M,N,V,A,T), 297 (G,A,M,R,Y,C,F,K,T,D,N), 302 (E,K,L G,T,V,D,Q,A), 304 (A,C,D,L,N,R,S,T,W,E,K,Y), 307 (K,A,C,G,I,M,N,Q,R,W,Y,H) y 312 (A,O,M,n,E,N,R,T,O), caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

17. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos 15%, pero menos de 40%, de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde e los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz-AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 5 (S,D,N,P,H,L), 9 (V,L,T,I), 11 (R,I,Y,K), 19 (N,L,Y,K,S), 27 (Y,W,A,M,V,C,L), 31 (Q,A,K,V,I,C,Y), 33 (N,S,T,K,A,C,L,M), 37 (N,D,Q,R,L,K), 46 (Y,L,H,N,C), 64 (A,H,Q,T,D,E), 73 (A,I,F,L,M,W), 76 (Y,H,L,M,Q,T), 79 (V,L,Q,T,A,N,S), 80 (T,I,D,A,L,N), 85 (K,E,A,L,N,R,S), 89 (N,L,M,H), 95 (G,A,D,H,M,N,S), 98 (A,C,E,H,R,Y,K,V), 99 (A,E,K,P,R,S), 107 (S,D,K,Y,A,G), 127 (G,C,D,E), 129 (T,I,R,E,Y,L,M), 131 (I,Y,W,L), 137 (I,P,A,E,T,V,L), 141 (A,S,C,G), 145 (T,A,C,E,G,M,N,Q), 148 (V,L,N,Y,M,A,Q), 151 (Y,G), 152 (T,S,L,M,G), 155 (L,C,I,M), 156 (I,L,Q), 160 (E,L,Y,Q), 161 (S,A,N,P,T), 164 (I,L,N,S,T,V,C,A), 168 (I,A,M,T,L), 171 (I,C,E,F,L,S,G), 176 (V,L,N,C), 180 (A,E,G,K,T,S), 182 (K,L,A,W), 187 (E,L,D), 188 (I,L,V), 205 (M,L,A,V,Q), 206 (S,A,C,K,L,M,R), 207 (?,A,H,N), 210 (K,I,L,V), 212 (G,Y,A,D,Q), 213 (D,N,S,L,A,G,W), 220 (R,K,V,A), 227 (N,D,L,Y,A), 234 (S,D,N,A,C), 235 (G,M,C,Q,S,A), 236 (I,M,A,O , 237 (I,N,F,M), 242 (Y,C,F,N,V), 244 (I,T,V,F,A,M,L), 246 (Q,E,N,T,L,C,D), 248 (G,A,E,S), 249 (T,K,M,N,I,U,R), 252 (G,K,Y,A,S,T,W), 255 (V,L,R,A,U,M,N), 270 (A,C,F,I,L,S,G), 274 (Y F,H,A,C,Q,T,M), 284 (L,V,W,A,M,U), 294 (D,A,V,Q,N), 296 (Y,N,L,R,H,W,M), 306 (V,A,S,F,I,L,T), 309 (A,G,S,T,V,C), 310 (F,A,C,W,M), 313 (V,T,A,G,L,I,C) 314 (G,A,E,H,M,S,W,Q) y 315 (V,A,C,I,M,L,T), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

18. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación está en una posición productiva de la variante de la enzima termolisina, en donde al menos una modificación, pero menos de 15% de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumplen con al menos uno de los criterios siguientes: a) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.9 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.0; b) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.8 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.2; c) una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, la actividad en Abz- AGLA-Nba, y la estabilidad y termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5 y tienen, además, un PI para cualquiera de estas pruebas que es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 3 (G,Y), 6 (T,C,V), 7 (V,L,I), 20 (I,L,V), 23 (T,F,W), 24 (Y,W), 44 (A,C), 48 (T,E,D), 50 (L,P), 57 (D,K), 63 (F,Y,C), 72 (D,F,W), 75 (Y,A), 81 (Y,F), 92 (S,L), 93 (Y,T,C), 94 (D,T), 100 (I,L,V), 102 (S,G,N), 103 (S,T), 104 (V,A), 110 (Y,L), 117 (G,H), 120 (M,L), 134 (S,A,P), 135 (G,A), 136 (G,A,S), 140 (V,D), 144 (L,T), 153 (A,T), 173 (G,A,C), 174 (T,C,A), 175 (L,H,S), 178 (F,H,Y), 183 (N,S), 185 (D,E), 189 (G,A), 193 (Y,F), 201 (S,C,A), 223 (G,D,K), 230 (V,A), 238 (N,L,M), 239 (K,A), 241 (A,L,S), 247 (G,A,S), 251 (Y,M), 260 (R,A,N), 262 (K,A), 269 (R,V,K) y 285 (R,K,Y), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

19. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación combinable para la actividad, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la actividad combinable cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la expresión y estabilidad o termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5, y para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8 la actividad en Abz-AGLA-Nba es mayor que, o igual a, 1.5; y en donde la posición combinable para la actividad se selecciona del grupo que consiste en 17, 19, 24, 25, 31, 33, 40, 48, 73, 79 80, 81, 85, 86, 89, 94, 109, 117, 140, 141, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 161, 168, 171, 174, 175, 176, 178, 180, 181, 182, 183, 189, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 214, 218, 223, 224, 227, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 258, 259, 260, 261, 262, 266, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 294, 295, 2 6, 297, 300, 302 , 306, 310 y 312 en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

20. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación combinable para la actividad, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la actividad combinable cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los indices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la expresión y estabilidad o termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5, y para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8 la actividad en Abz-AGLA-Nba es mayor que, o igual a, 1.5 y en donde la posición combinable para la actividad se selecciona del grupo que consiste en 17, 19, 24, 25, 31, 33, 40, 48, 73, 79, 80, 81, 85, 86, 89, 94, 109, 117, 140, 141, 150, 152, 153, 158, 159, 160, 161, 168, 171, 174, 175, 176, 178, 180, 181, 182, 183, 189, 205, 206, 207, 210, 212, 213, 214, 218, 223, 224, 227, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 244, 246, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 258, 259, 260, 261, 262, 266, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 276, 278, 279, 280, 282, 283, 294, 295, 296, 297, 300, 302, 306, 310 y 312, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

21. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación combinable para la actividad, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la actividad combinable cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para la expresión y estabilidad o termoestabilidad en detergente son mayores que, o iguales a, 0.5, y para la limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8 y actividad en Abz-AGLA-Nba es mayor que, o igual a, 1.5 y en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 17 (E,F,P), 19 (A,D,H,I,R,T,V), 24 (F,H), 25 (H), 31 (L), 33 (Q), 40 (C), 48 (A,R), 73 (Y), 79 (C), 80 (C,R), 81 (H), 85 (C,M,Y), 86 (V), 89 (K,R,T,V), 94 (E), 109 (D), 117 (A,K,R,T), 140 (S), 141 (T), 150 (E,M,W), 151 (A,C,E,I), 152 (D), 153 (V), 156 (H,R), 158 (F,G,I,V), 159 (F,I,K), 160 (S), 161 (Y), 168 (N), 171 (D), 174 (S,V), 175 (C,E,F,G,I), 176 (E,Q), 178 (C,M), 180 (L,W), 181 (Y), 182 (F,R), 183 (H,I,L,M,Q,R,T), 189 (C), 205 (C,F), 206 (F,H,I,T,V,Y), 207 (T), 210 (A,E,F,G,H,T), 212 (F,H,K,M,N,R,S,T), 213 (I,K,R,V,Y), 214 (Q), 218 (R), 223 (Y), 224 (I,R), 227 (C,E,G,K,QfR,S,T,V), 235 (D,L,T), 236 (P), 237 (A,Q), 238 (A,C,D,E,R,S), 239 (C,G,H,L,Q,R,S,V,Y), 241 (E,F,G,I,T,V), 244 (Q), 246 (K,R), 248 (C,H), 249 (G,V), 250 (F,S), 251 (H), 252 (F,I,L), 253 (A,?,E,R), 254 (C,F,G,H,I,P), 255 (F,Q), 258 (F), 259 (I), 260 (C,D,I), 261 (K,R,T), 262 (C,F,H,L,P,R), 266 (W), 268 (F,R), 269 (P,T,W,Y), 270 (M,N,P,V), 271 (V), 272 (R), 273 (R), 274 (D,E), 276 (G,S), 278 (V), 279 (E), 280 (P,R,V), 282 (P), 283 4S5 (A,C,E,G,H,T,V), 294 (T), 295 (R), 296 (E,I), 297 (I,V), 300 (Q), 302 (W), 306 (Y), 310 (I,N) y 312 (Q), en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

22. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la variante de la enzima termolisina tiene una mejor limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, actividad en Abz-AGLA-Nba, o estabilidad o ter oestabilidad detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal para todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3; y en donde la posición del residuo se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 127, 128, 180, 181, 195, 196, 197, 198, 199, 211, 223, 224, 298, 299, 300 y 316, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

23. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la variante de la enzima termolisina tiene una mejor limpieza en micromuestras de tela PAS-38 a pH 6 o pH 8, actividad en Abz-AGLA-Nba, o estabilidad o termoestabilidad detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal para todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3; y en donde la posición del residuo se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 127, 180, 181, 195, 196, 197, 198, 199, 211, 223, 224, 298, 299, 300 y 316, caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

24. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la variante de la enzima termolisina tiene una mejor estabilidad o termoestabilidad en detergente en comparación con la enzima termolisina genitora, y en donde la modificación está en una posición que tiene un factor de temperatura mayor que 1.5 veces la varianza observada por encima del promedio del factor de temperatura de la cadena principal para todos los residuos de la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3; en donde la modificación se selecciona del grupo que consiste en 1(I,V), 2 (T,C,I,M,P,Q,V), 127(G,C), 128(Q,E,F), 180 (A,E,N), 181(N,A,G,Q,S) 196(G,L,Y), 197 (I,F), 198(S,A,C,D,E,H,I,M,P,Q,T,V,Y), 211(Y,A,C,E F/H,I;Q#S,T,V,W), 224 (T,D,H,Y), 298(S,A,C,E,F G,K,M,N,P,Q,R,T,W,Y) 299(T,A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W) y 316(K,A,D,E,H,M,N,P,Q,S,T,V,Y) posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

25. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación productiva, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los Indices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos tres de los parámetros de expresión, estabilidad en detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz- AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 1, y y en donde la posición combinables para la actividad se selecciona del grupo que consiste en 002, 048, 063, 087, 096, 180, 198, 244, 277, 283, 293, 295, 298 y 301, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

26. Una variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, caracterizada porque comprende una modificación de aminoácidos con respecto a una enzima termolisina genitora, en donde la modificación es una mutación productiva, en donde al menos una modificación de las modificaciones evaluadas en la posición productiva cumple con los criterios siguientes: una posición en donde los índices de desempeño (PI) mínimos con respecto a la termolisina genitora para al menos tres de los parámetros de expresión, estabilidad en detergente, termoestabilidad, actividad de limpieza en micromuestras de tela PAS-38 o actividad en Abz- AGLA-Nba son mayores que, o iguales a, 1, y y en donde la posición combinable para la actividad se selecciona del grupo que consiste en T002I, T002M, T048E, A058L, F063C, V087L, N096H, A180E, S198A, I244T, P277R, T278R, Q283E, T293L, T293N, L295F, S298A y Q301I, en donde las posiciones de los aminoácidos de la variante de termolisina se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

27. La variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque es una peptidasa M4.

28. La variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque es un miembro del clan MA.

29. La variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque es un miembro de la familia PepSY~Peptidasa_M4~Peptidasa_M4_C.

30. La variante de la enzima termolisina, o un fragmento activo de esta, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque tiene al menos 50% de identidad con una termolisina de la termolisina expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3.

31. La variante de la enzima termolisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizada porque es de un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus, Geobacillus , Alícyclobacillus, Lactobacillus, Exiguobacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Herpetosiphon, Oceanobacillus, Shewanella, Clostridium, Staphylococcus, Flavobacterium, Stigmatella, Myxococcus, Vibrio, Methanosarcina, Chryseobacterium, Streptomyces, Kribbella, Janibacter, Nocardioides, Xanthamonas, Micromonospora, Burkholderia, Dehalococcoides, Croceibacter, Kordia, Microscilla, Thermoactinomyces, Chloroflexus, Listeria, Plesiocystis, Haliscomenobacter, Cytophaga, Hahella, Arthrobacter , Brachybacterium, Clavibacter, Microbacterium, Intrasporangium, Frankia, Meiothermus, Pseudomonas, Ricinus, Catenulispora , Anabaena, Nostoc, Halomonas, Chromohalobacter , Bordetella , Variovorax, Dickeya, Pectobacterium, Citrobacter, Enterobacter, Salmonella, Erwinia, Pantoea, Rahnella, Serratia , Geodermatophilus , Gemmata, Xenorhabdus , Photorhabdus , Aspergillus, Neosartorya, Pyrenophora, Saccharopolyspora, Nectria, Gibberella, Metarhizium, Naddlia, Cyanothece , Cellulphaga, Providencia, Bradyrhizobium, Agrobacterium, Mucilaginibacter, Serratia , Sorangium, Streptosporangium, Renibacterium, Aeromonas , Reinekea, Chromobacterium, Moritella , Haliangium, Kangiella , Marinomonas , Vibrionales , Listonella , Salinivibrio , Photobacterium, Al teromonadales , Legionella, Teredinibacter , Reinekea, Hydrogenivirga y Pseudoalteromonas .

32. La variante de la enzima termolisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizada porque es de un género seleccionado del grupo que consiste en Bacillus, Geobacillus , Alicyclobacillus , Lactobacillus , Exiguobacterium, Brevibacillus , Paenibacillus , Herpetosiphon, Oceanobacillus , Shewanella , Clostridium, Staphylococcus , Flavobacterium, Stigmatella, Myxococcus , Vibrio, Methanosarcina, Chryseobacterium y Pseudoalteromonas .

33. La variante de la enzima termolisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizada porque es del género Bacillus .

34. Una composición de limpieza caracterizada proque comprende al menos una variante de la enzima termolisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33.

35. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque es una composición granulada, en polvo, sólida, en barra, líquida, en tableta, gel o pasta.

36. La composición de limpieza de conformidad con las reivindicaciones 34 o 35, caracterizada porque es una composición detergente.

37. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizada porque la composición detergente de lavandería, una composición detergente para el lavado de vajilla o una composición de limpieza de superficies duras.

38. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el detergente para el lavado de vajilla es una composición detergente para el lavado manual de vajilla o una composición detergente para el lavado automático de vajilla.

39. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es una composición detergente de lavandería.

40. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-39, caracterizada porque comprende, además, al menos un agente de blanqueo.

41. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-40, caracterizada porque está libre de fosfato.

42. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-40, caracterizada porque contiene fosfato.

43. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-42, caracterizada porque comprende, además, al menos una enzima adicional.

44. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la al menos una enzima adicional se selecciona del grupo que consiste en acil transferasas, alfa-amilasas, beta-amilasas, alfa-galactosidasas, arabinosidasas, aril esterasas, betagalactosidasas, carragenasas, catalasas, celobiohidrolasas, celulasas, condroitinasas, cutinasas, endo beta-1,4-glucanasas, endo-beta-mananasas , esterasas, exo-mananasas, galactanasas, glucoamilasas, hemicelulasas, hialuronidasas, queratinasas, lacasas, lactasas, ligninasas, lipasas, lipoxigenasas, mananasas, oxidasas, pectato liasas, pectin acetil esterasas, pectinasas, pentosanasas, peroxidasas, fenoloxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, pululanasas, reductasas, ramnogalacturonasas, beta-glucanasas, tanasas, transglutaminasas, xilan acetil-esterasas, xilanasas, xiloglucanasas y xilosidasas, enzimas metaloproteasas adicionales y combinaciones de estas.

45. Un método de limpieza caracterizado porque comprende poner en contacto una superficie o un elemento con una composición de limpieza que comprende al menos una variante de la enzima termolisina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33.

46. Un método de limpieza caracterizado porque comprende poner en contacto una superficie o un elemento con una composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33.

47. El método de conformidad con las reivindicaciones 45 o 46, caracterizado porque comprende, además, enjuagar la superficie o elemento después de poner en contacto la superficie o elemento, respectivamente, con la composición de limpieza.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-47, caracterizado porque el elemento es vajilla de mesa.

49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-47, caracterizado porque el elemento es una tela.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-49, caracterizado porque comprende, además, la etapa de enjuagar la superficie o elemento después de poner en contacto la superficie o elemento con la composición de limpieza.

51. El método de conformidad con reivindicación 50, caracterizado porque comprende, además, la etapa de secar la superficie o artículo después de enjuagar la superficie o el artículo.

52. Un método de limpieza de una superficie o elemento caracterizado porque comprende: proporcionar la composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-44 y una superficie o elemento en necesidad de limpieza; y poner en contacto la composición de limpieza con la superficie o elemento en necesidad de limpieza en condiciones adecuadas para limpiar la superficie o elemento, a fin de producir una superficie o elemento limpios.

53. El método de conformidad con reivindicación 52, caracterizado porque comprende, además, la etapa de enjuagar la superficie o elemento limpios para producir una superficie o elementos enjuagados.

54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 o 53, caracterizado porque comprende, además, la etapa de secar la superficie o elemento enjuagados.