TWI553121B - 提升耐溫性的纖維素酶 - Google Patents

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Description

提升耐溫性的纖維素酶
本案係關於一種纖維素酶，尤指一種提升耐溫性的纖維素酶。
纖維素是植物細胞壁的主要組成之一，也是地球上主要生物質能(biomass)的來源，因此，現今許多能夠有效分解纖維素的酶蛋白在不同工業上的應用也十分廣泛。纖維素是由葡萄糖為單位，以b-1,4-醣苷鍵(b-1,4-glycosidic bond)所鍵結而成的長鏈多醣，這些多醣體共同組織排列成緊密的結晶型纖維素，進而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中許多草食動物以及微生物等需要藉由將植物細胞壁中的多醣纖維素分解成可以被體內吸收的葡萄單醣，以作為生存能量來源。纖維素酶的催化機制主要是藉由酸鹼反應，將連接兩個單醣的b-1,4-醣苷鍵進行水解作用，進而分解多醣纖維素。而纖維素酶基本上可分成三類，分別為內切葡聚醣酶(endo-glucanase)、外切葡聚醣酶(cellobiohydrolase)以及葡萄醣苷酶(b-glucosidase)。內切葡聚醣酶能夠隨機地將長鏈纖維素切成許多小片段的寡醣；而外切葡聚醣酶則可從長鏈纖維素的還原端或非還原端進行分解，其主要產物為纖維二醣；至於葡萄醣苷酶則可把纖維二醣分解為單醣的葡萄醣。
纖維素酶在工業上的應用十分廣泛，不論是在食品、飼料或紡織業，甚至可運用到現在最受關注的生質能源。針對不同工業的應用，纖維素酶也需有符合其不同的適用條件與範圍。舉例而言：飼料工業上適合偏酸性以及耐溫的酶蛋白，然而紡織工業上則是偏好偏鹼性的纖維素酶。因此，能夠找出更加符合不同工業上所需的酶蛋白也是目前不論是學術或產業界都在努力的目標。目前在許多相關的研究中，為了得到更佳的酶，除了在自然界中篩選出來之外，就是將現有的酶蛋白加以改造。現今主要有兩大改造策略，其一是隨機突變或是將酶基因隨機排列，再於特定的作用條件之下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。此策略的好處是無須深入研究酶的結構或作用機制，而是直接在特定的條件下隨機去找出更好的酶蛋白；然而，其缺點即是需要大量的人力以及時間去進行大量篩選或是要有很好的大量篩選方法來配合。另一種改造策略則是藉由研究酶結構與作用機制以找出對於酶活性或特性具有關鍵性的胺基酸，並針對這些特定胺基酸進行突變並測試，進而得到功能性更強的改造酶蛋白。此優點是不需花費時間與人力在大量突變與篩選的步驟，但需要先了解此酶的蛋白結構以及其作用機制，才能找出具改造潛力的特定胺基酸。
不同的工業製程需要符合其不同作用環境的酶蛋白來配合且參與。即便纖維素酶在工業上被廣泛應用已久，然而許多工業用酶是從嗜常溫菌，如里式木霉( Trichoderma reesei)所篩選出來的，因此耐熱性也較差。另一方面，耐熱性纖維素酶能夠有效地應用於需要高溫作用環境的產業上，包含啤酒製成或是生質能源工業等。具耐熱性的蛋白相對地其蛋白穩定度也會較高，因此能夠在高溫環境中穩定存在，甚至作用地更好。不論是在作用環境或是後段處理過程中，也不需擔心會因為高溫而破壞了酶蛋白本身。此外，酶蛋白的活性也是改良工業酶的一大重點，酶活性愈高就代表成本的下降以及利潤的提高。
根據文獻研究，雙硫鍵有助於蛋白結構的穩定以及提升耐熱性。里式木霉具有許多種纖維素酶，其中屬GH family 5的Cel5A纖維素酶，其蛋白結構(ID 3QR3)在2011年發表，結構內部具有四個雙硫鍵位置在C16-C22、C92-C99、C232-C2683以及C273-C323，因此具有較高的溶解溫度(Tm值)，另外，Cel5A的結構呈現a/b TIM barrel的結構類型(Toni M Lee, Mary F Farrow, Frances H Arnold, and Stephen L Mayo. (2011) Protein Structure Report, nov27; 20(11):1935-40.)。而在2004年Simon R. Andrews等人研究發現， Cellvibrio japonicas木聚醣酶蛋白 CjXyn10A 與 Cellvibrio mixtus的 CmXyn10B，在其N端與C端增加雙硫鍵鍵接，能夠進一步穩定結構進而提升溫度的耐受性，而 CjXyn10A 與 CmXyn 10B 其結構也是屬於a/b TIM barrel型態(Andrews S. R. , Taylor E. J. , Pell G., Vincent F., Ducros V. M., Davies G. J., Lakey J. H., and Gilbert H. J.,(2004) J. Biol. Chem. Dec 24;279(52):54369-79.)。
因此，本案欲藉由改造基因以增加纖維素酶之雙硫鍵鍵接，藉此提升纖維素酶對於溫度的耐受性，以有效增加纖維素酶在工業上應用的產業價值。
本案之目的在於改造現有纖維素酶，利用結構分析及點突變技術，增加纖維素酶之雙硫鍵鍵接，以有效提升纖維素酶之耐溫性，進而增加纖維素酶之工業應用價值。
為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種纖維素酶，其胺基酸序列係為將序列編號2之N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)之序列。其中編碼該序列編號2之基因係從里式木霉( Trichoderma reesei)所分離出來並經優化的基因。
在一實施例中，該纖維素酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
在一實施例中，該纖維素酶之胺基酸序列係為序列編號6之胺基酸序列。
又，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種編碼該纖維素酶的核酸分子及包含該核酸分子的重組質體。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。
本案採用之纖維素酶是從里式木霉( Trichoderma reesei)菌株中所分離出來的基因，並經優化且去除N端91個胺基酸的序列，以提升其蛋白表達能力。此基因未經突變處理，故以野生型纖維素酶稱之(以下簡稱WT纖維素酶)。前述WT纖維素酶之兩端係以 EcoRI與 NotI限制酶位置銜接在pPICZaA載體上，並進行定序及蛋白表達。第1圖即顯示WT纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，WT纖維素酶基因包含984個鹼基 (含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號1標示)以及327個胺基酸 (胺基酸序列以序列編號2標示)。
進一步利用PyMOL軟體分析結構，發現WT纖維素酶之N端與C端之間空間距離約11.3Å，大於形成雙硫鍵的距離。因此，本案嘗試將N端與C端兩端各加上一個Cysteine (半胱氨酸)之外，更在C端Cysteine前增加一個分子較小的Glycine (甘氨酸)或是讓長鏈產生角度偏轉的Proline (脯氨酸)，來減少N端與C端的空間距離而產生雙硫鍵相接，藉此穩定蛋白之N端與C端，進而提升蛋白之耐溫性。換言之，本案係進行兩種突變改造，其中第一種突變改造是在WT纖維素酶之N端加上Cysteine及在C端加上Glycine及Cysteine，第二種突變改造是在WT纖維素酶之N端加上Cysteine及在C端加上Proline及Cysteine。改造後之蛋白包含330個胺基酸，N端之Cysteine位於胺基酸序列的第1個位置，C端之Glycine或Proline位於胺基酸序列的第329個位置，C端之Cysteine則位於胺基酸序列的第330個位置，故本案之第一種突變改造以C1G329C330表示，簡稱CGC纖維素酶，而第二種突變改造以C1P329C330表示，簡稱CPC纖維素酶。
以下將詳述本案改造纖維素酶之方法及其所得到之改良纖維素酶。
本案係運用點突變技術進行突變改造。首先，使用引子一(如第2圖所示)於纖維素酶N端增加Cysteine之後，再利用引子二(如第3圖所示)於纖維素酶C端增加Glycine與Cysteine，得到C1G329C330 (CGC)之改造基因，接著再運用引子三(如第4圖所示)，將C1G329C330改造基因之第329個胺基酸Glycine點突變為Proline，得到C1P329C330 (CPC)之改造基因。第5圖即顯示改造後之CGC纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，CGC纖維素酶基因包含993個鹼基 (含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號3標示)以及330個胺基酸 (胺基酸序列以序列編號4標示)。第6圖則顯示改造後之CPC纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列，其中，CPC纖維素酶基因包含993個鹼基 (含終止密碼子，核苷酸序列以序列編號5標示)以及330個胺基酸 (胺基酸序列以序列編號6標示)。
將兩種突變改造的DNA質體使用 PmeI限制酶進行線性化之後，以電轉(electroporation)方式送入酵母 Pichia pastorisX33，然後將轉型後的菌液塗到含有100 mg/ml zeocin抗生素的YPD平板上，放置於30℃的培養箱進行兩天的培養。之後挑選單一菌落至5 ml YPD於30℃培養，再接種到50 ml BMGY中30℃培養一天；接下來將菌體換至20 ml的BMMY進行四天的誘導蛋白表達。每24小時取樣並加0.5%甲醇，菌液以3500 rpm轉速離心並收取上清液，進行蛋白量測量及纖維素酶活性測定。
纖維素酶的活性測試方式是取1%羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose, CMC, pH 4.8, 0.05M檸檬酸鈉) 0.2 ml與適當濃度的纖維素酶蛋白液(稀釋緩衝液為 0.05 M 檸檬酸鈉；pH 4.8 ) 0.2 ml，混合均勻後在 50℃下作用15分鐘，接著加入1.2 ml的1% DNS並於100℃沸水中煮沸5分鐘以停止反應且呈色，然後在冷水中降溫10分鐘，在OD 540波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中，酶活性的標準曲線是由葡萄醣標準溶液 0 - 0.35 mg/ml之間制定，而1 unit 的定義為每分鐘釋放1 mmole產物所需的酶蛋白量。
耐溫測試則是將適當濃度的纖維素酶蛋白液(稀釋緩衝液為 0.05 M 檸檬酸鈉；pH 4.8 )放置在不同溫度下處理2分鐘，取出後放置在4℃降溫10分鐘再放置室溫回溫10分鐘，之後再進行50℃的酶活性檢測，以沒有經過熱處理之酶蛋白樣本作為100%對照，分別計算出經過熱處理後的相對殘留活性百分比。
第7圖顯示WT纖維素酶與CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白的耐溫性分析，其中未經熱處理的樣本之纖維素酶活性設定為100%。由第7圖結果可知，在75℃、80℃以及85℃處理2分鐘後，CPC纖維素酶的相對殘留活性為94%、70%以及74%，CGC纖維素酶的相對殘留活性為93%、68%以及75%，兩者遠高於WT纖維素酶的66%、35%以及43%。換言之，CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白在不同溫度下處理2分鐘後的殘留活性皆高於WT纖維素酶原始蛋白，故具有較高的耐溫性，也表示具有較大潛力的工業應用價值。
另一方面，本案亦針對突變蛋白進行雙硫鍵的評估試驗。將適當濃度的CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白以及WT纖維素酶原始蛋白液添加10 mM dithiothreitol (DTT)，進行12.5%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，初步分析突變蛋白是否具有雙硫鍵接。
第8圖顯示評估雙硫鍵接的SDS-PAGE電泳分析，其係運用DTT使蛋白結構裡的雙硫鍵斷裂，並觀察蛋白在電泳膠體中的移動速度。由第8圖結果發現，添加DTT後的CGC纖維素酶突變蛋白與添加DTT的WT纖維素酶原始蛋白的分子量與大小相當，而未添加DTT的CGC纖維素酶突變蛋白位置遠低於未添加DTT的WT纖維素酶原始蛋白，表示CGC纖維素酶突變蛋白產生較多的雙硫鍵接導致蛋白分子空間縮小，在電泳膠體中的移動速度較沒有增加雙硫鍵的原始蛋白來的快。
綜上所述，為了增加纖維素酶的工業應用價值，本案藉由邏輯性的突變設計，使N端與C端產生雙硫鍵穩定蛋白結構來提升纖維素酶的耐溫性。在本案的兩種突變設計中，第一種是在WT纖維素酶之N端加上Cysteine及在C端加上Glycine及Cysteine，得到CGC纖維素酶；第二種則是在WT纖維素酶之N端加上Cysteine及在C端加上Proline及Cysteine，得到CPC纖維素酶。根據耐溫測試結果可知，CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白相較於WT纖維素酶原始蛋白，對於高溫的耐受性更佳，故在面臨溫度的衝擊時能更穩定並能降低其生產成本，可有效增加纖維素酶在工業上應用的產業價值。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。
無
第1圖顯示WT纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第2圖顯示引子一的突變引子序列。 第3圖顯示引子二的突變引子序列。 第4圖顯示引子三的突變引子序列。 第5圖顯示改造後之CGC纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第6圖顯示改造後之CPC纖維素酶的核苷酸序列以及胺基酸序列。 第7圖顯示WT纖維素酶與CGC纖維素酶及CPC纖維素酶兩種突變蛋白的耐溫性分析。 第8圖顯示評估雙硫鍵接的SDS-PAGE電泳分析。
＜110＞ 基酵生物科技股份有限公司 ＜120＞ 提升耐溫性的纖維素酶 ＜160＞ 6   ＜210＞ 1 ＜211＞ 984 ＜212＞ DNA ＜213＞ 里式木霉 ( Trichoderma reesei)   ＜400＞ 1 ggtgttagat ttgctggagt caatatcgca ggattcgatt ttggttgcac taccgatggt       60 acttgtgtca cctctaaggt ttacccacca ttgaagaatt tcactggttc taataactat        120 ccagacggta tcggacaaat gcaacatttt gttaacgatg atggtatgac aatcttcaga    180 ttgccagtcg gatggcaata cttggtcaat aacaatttgg gaggaaactt ggattctact     240 tctatttcta aatatgacca gttggttcag ggatgcttgt ctttgggtgc atactgtatt          300 gttgacattc ataactacgc tagatggaac ggtggtatca ttggacaggg tggtccaact   360 aatgctcaat tcacatcttt gtggtctcaa ttggcatcta agtatgcctc tcagtctaga        420 gtttggtttg gtattatgaa cgaaccacat gatgttaata tcaacacttg ggctgctact        480 gttcaagaag ttgttactgc tatcagaaac gctggtgcca cttctcagtt tatctctttg         540 ccaggtaacg attggcagtc tgccggtgct ttcatctctg acggttctgc cgctgcattg     600  tctcaggtta ccaaccctga cggatctact actaatttga tctttgacgt ccataagtat         660 ttggactctg acaactctgg tactcatgct gaatgtacaa 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atttcactgg ttctaataac        120 tatccagacg gtatcggaca aatgcaacat tttgttaacg atgatggtat gacaatcttc      180 agattgccag tcggatggca atacttggtc aataacaatt tgggaggaaa cttggattct     240 acttctattt ctaaatatga ccagttggtt cagggatgct tgtctttggg tgcatactgt          300 attgttgaca ttcataacta cgctagatgg aacggtggta tcattggaca gggtggtcca     360 actaatgctc aattcacatc tttgtggtct caattggcat ctaagtatgc ctctcagtct          420 agagtttggt ttggtattat gaacgaacca catgatgtta atatcaacac ttgggctgct        480 actgttcaag aagttgttac tgctatcaga aacgctggtg ccacttctca gtttatctct         540 ttgccaggta acgattggca gtctgccggt gctttcatct ctgacggttc tgccgctgca      600 ttgtctcagg ttaccaaccc tgacggatct actactaatt tgatctttga cgtccataag         660 tatttggact ctgacaactc tggtactcat gctgaatgta caactaacaa cattgatggt        720 gccttttctc ctttggctac ctggttgaga cagaacaaca gacaggctat tttgaccgaa      780 actggaggtg gtaatgttca gtcttgtatt caagatatgt gccaacaaat ccagtacttg       840 aatcaaaatt ctgatgtcta tttgggttac gttggttggg gtgccggttc tttcgactct          900 acatacgttt tgactgaaac tccaaccgga tctggtaact cttggactga tacttctttg        960 gtctcttctt gtttggcaag aaagggttgt taa   ＜210＞ 4 ＜211＞ 330 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜400＞ 4 Cys Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe   1                          5                               10                               15   Gly Cys Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro                              20                               25                              30 Pro Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile                              35                               40                              45 Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn Asp Asp Gly Met Thr Ile Phe                              50                                55                              60 Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly                              65                               70                                75 Gly Asn Leu Asp Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val                              80                            85                                90 Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His                              95                             100                          105 Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro                             110                           115                            120 Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser Lys                             125                            130                           135 Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro                            140                            145                            150 His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr Val Gln Glu Val                            155                            160                             165 Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser                           170                             175                          180 Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp                             185                            190                           195 Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser                            200                            205                             210 Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp                            215                            220                             225 Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly                            230                             235                            240 Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln                            245                             250                              255 Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile                           260                             265                            270 Gln Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp                              275                           280                              285 Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser                             290                            295                             300 Thr Tyr Val Leu Thr Glu Thr Pro Thr Gly Ser Gly Asn Ser Trp                             305                            310                            315 Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys Gly Cys                             320                           325                              330   ＜210＞ 5 ＜211＞ 993 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜400＞ 5 tgtggtgtta gatttgctgg agtcaatatc gcaggattcg attttggttg cactaccgat         60 ggtacttgtg tcacctctaa ggtttaccca ccattgaaga atttcactgg ttctaataac        120 tatccagacg gtatcggaca aatgcaacat tttgttaacg atgatggtat gacaatcttc      180 agattgccag tcggatggca atacttggtc aataacaatt tgggaggaaa cttggattct     240 acttctattt ctaaatatga ccagttggtt cagggatgct tgtctttggg tgcatactgt          300 attgttgaca ttcataacta cgctagatgg aacggtggta tcattggaca gggtggtcca     360 actaatgctc aattcacatc tttgtggtct caattggcat ctaagtatgc ctctcagtct          420 agagtttggt ttggtattat gaacgaacca catgatgtta atatcaacac ttgggctgct        480 actgttcaag aagttgttac tgctatcaga aacgctggtg ccacttctca gtttatctct         540 ttgccaggta acgattggca gtctgccggt gctttcatct ctgacggttc tgccgctgca      600 ttgtctcagg ttaccaaccc tgacggatct actactaatt tgatctttga cgtccataag         660 tatttggact ctgacaactc tggtactcat gctgaatgta caactaacaa cattgatggt        720 gccttttctc ctttggctac ctggttgaga cagaacaaca gacaggctat tttgaccgaa      780 actggaggtg gtaatgttca gtcttgtatt caagatatgt gccaacaaat ccagtacttg       840 aatcaaaatt ctgatgtcta tttgggttac gttggttggg gtgccggttc tttcgactct          900 acatacgttt tgactgaaac tccaaccgga tctggtaact cttggactga tacttctttg        960 gtctcttctt gtttggcaag aaagccatgt taa   ＜210＞ 6 ＜211＞ 300 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列   ＜400＞ 6 Cys Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe   1                          5                               10                               15   Gly Cys Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro                              20                               25                              30 Pro Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile                              35                               40                              45 Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn Asp Asp Gly Met Thr Ile Phe                              50                                55                              60 Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly                              65                               70                                75 Gly Asn Leu Asp Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val                              80                            85                                90 Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His                              95                             100                          105 Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro                             110                           115                            120 Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser Lys                             125                            130                           135 Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro                            140                            145                            150 His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr Val Gln Glu Val                            155                            160                             165 Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser                           170                             175                          180 Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp                             185                            190                           195 Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser                            200                            205                             210 Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp                            215                            220                             225 Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly                            230                             235                            240 Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln                            245                             250                              255 Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile                           260                             265                            270 Gln Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp                              275                           280                              285 Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser                             290                            295                             300 Thr Tyr Val Leu Thr Glu Thr Pro Thr Gly Ser Gly Asn Ser Trp                             305                            310                            315 Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys Pro Cys                             320                           325                              330

Claims (6)

  1. 一種纖維素酶，其胺基酸序列係為將序列編號2之N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)之序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之纖維素酶，其中編碼該序列編號2之基因係從里式木霉( Trichoderma reesei)所分離出來並經優化的基因。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之纖維素酶，其中該纖維素酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之纖維素酶，其中該纖維素酶之胺基酸序列係為序列編號6之胺基酸序列。
  5. 一種編碼如申請專利範圍第1項所述之纖維素酶之核酸分子。
  6. 一種重組質體，其係包含如申請專利範圍第5項所述之核酸分子。
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