CN101730479A - 用于反刍动物的酶产品 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了用于改善反刍动物的草料饲料的消化率的方法。将草料，包括苜蓿、羊草、玉米青贮、秸秆青贮、玉米秸秆、黑麦草或者TMR，用酶产品处理，所述酶产品具有纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的活性。

Description

用于反刍动物的酶产品
本申请要求于2007年6月29日提交的美国专利申请序列号60/937,840的优先权，其通过引用并入本文。
背景技术
本发明概括地涉及反刍动物营养物，更具体地涉及在反刍动物营养物中使用酶混合物以改善反刍动物饲料的营养价值。
反刍动物的胃由四个隔室组成：瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。在这四个隔室中，瘤胃最重要，因为大部分营养素在该隔室中被消化。瘤胃形成的囊为背囊、腹囊、后背(caudodosal)囊和后腹(caudoventral)囊。囊的形成增加有效吸收的表面积。瘤胃中的消化是在无氧环境、恒定的温度和pH以及充分混合的条件下的发酵过程。通过细菌的完全培养实现该发酵过程，细菌各自在消化如纤维素水解、半纤维素水解、蛋白质水解、酸生成、甲烷生成、维生素合成等中发挥不同的作用。发酵的产物或者在瘤胃本身中被吸收，或者流出以进行进一步消化和下游吸收。除了瘤胃之外，皱胃是另一个重要的隔室。皱胃是“真正的胃”，其与单胃动物的胃非常相似。它分泌酸以维持酸性环境。不同于单胃动物的胃，皱胃分泌溶菌酶并因此能够消化细菌。
反刍动物的饲料通常由精饲料和粗饲料组成。粗饲料通常是指草料和青贮饲料。草料是指牧草、豆类、可啃牧的乔木和纤维作物副产品。该饲料中的主要营养素包括淀粉、纤维、蛋白质、脂肪和油。淀粉通常在瘤胃或者皱胃中被降解，而纤维、蛋白质和脂肪/油一般在瘤胃中被瘤胃细菌降解。纤维被纤维素分解细菌和半纤维素分解细菌消化并转化为挥发性脂肪酸(VFA)。蛋白质或者避开瘤胃，或者被蛋白质分解细菌降解并转化为最终被皱胃利用的微生物蛋白质。脂肪/油被脂酶转化为脂肪酸，其被瘤胃壁吸收。
作为典型的反刍动物饲料的主要成分，草料通常是指牧草、豆类和纤维作物副产品例如稻草和玉米秸杆。将草料转化为生产力的效率受限于草料细胞壁的消化率。植物细胞壁通常占典型草料的干物质的40-70％，甚至在理想条件下，总消化道内的细胞壁消化率一般仍然低于65％。因此，草料消化率成为能量利用率的瓶颈，并且使动物不能达到最佳生产力。更糟糕的是，由于缺乏高质量的草料，经常用低质量的草料喂养反刍动物。因为低质量的草料具有非常低的营养价值，进一步限制了反刍动物家畜的生产力。
近年来，已有一些尝试以改进草料的消化率。数量有限的反刍动物酶产品投放市场。这些酶产品中许多仅仅是单胃对应物的衍生品，而其它的显示出无法预测的有效性。然而，部分是由于认为添加的酶不能提高瘤胃的水解能力的看法，以及对这样的酶会因瘤胃蛋白质水解而无效的担心，研究者尚未成功地使用酶来提高反刍动物饲料的利用。一些近期的研究已反驳了这些误解。一些研究已表明在某些实例中，向反刍动物饲料中添加外源性纤维水解酶(fibrolytic enzymes)提高了产乳量(Schingoethe等，1999；Kung等，2000)和平均日增重(ADG)(McAllister等，1999)。这些改善动物性能的实例是因为增强了饲料消化。许多研究已报道了通过原位和体外方法测定的干物质(DM)和纤维的消化的增强(Beauchemin等，2000；Kung等，2000)。
但是，只有纤维素酶和木聚糖酶不足以对反刍动物发挥出最佳潜力。一些其它因素，包括β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶，可能是限制因素。因此，把这些酶包括在内以释放植物细胞壁中的能量是非常重要的。
一些公司宣传他们的产品是乳品特异性的或者反刍动物特异性的。但是，这些产品具有两个缺陷。首先，几乎所有他们的产品均包含淀粉酶。和其它动物一样，反刍动物需要葡萄糖来进行正常的生理功能。淀粉通常在瘤胃中被代谢成挥发性脂肪酸，或者在皱胃(abmason)中被代谢成葡萄糖。如果淀粉在瘤胃中消化太快并留给皱胃极少量的淀粉来产生葡萄糖，则反刍动物可能没有充足的葡萄糖来满足正常的生物需要。因此，优选淀粉避开瘤胃并在皱胃中被消化。因此，淀粉酶不应被包含在反刍动物的饲料添加剂中。实际上，一些农民甚至使用淀粉酶抑制剂以帮助淀粉避开瘤胃。而且，在瘤胃添加剂中把淀粉酶包含在内可能引起酸中毒。其次，这些产品不具有完整的酶分布。需要除了包含作为反刍动物的酶添加剂所公知的木聚糖酶和纤维素酶之外，还包含β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的产品。反刍动物消耗大量的豆类和牧草，因此这些酶对理想的消化率是重要的。但是，在出售的现有产品中缺乏这些酶。
因此，需要基于非常常见的反刍动物饲料的对纤维的消化率进行改善的酶产品。
发明概述
本发明由酶产品组成，其消除或者减少纤维中的限制因素以改善草料中纤维的消化率。该酶产品代表若干纤维素分解酶和半纤维素分解酶的独特组合。此酶产品显著地改善在瘤胃环境中常用的草料饲料的消化。在本发明的一个优选实施方案中，1克酶产品包含约200至约800活性单位之间的纤维素酶，约750至约3000活性单位之间的木聚糖酶，约225至约890活性单位之间的β-葡聚糖酶，约1至约100活性单位之间的果胶酶，约50至约800活性单位之间的β-甘露聚糖酶，和约1至约100活性单位之间的α-半乳糖苷酶。本发明的一个更优选的实施方案1克产物包含约200至约600活性单位之间的纤维素酶，约750至约2250活性单位之间的木聚糖酶，约225至约625活性单位之间的β-葡聚糖酶，约1至约5活性单位之间的果胶酶，约100至约300活性单位之间的β-甘露聚糖酶，和约1至约5活性单位之间的α-半乳糖苷酶。
本发明的一个目的是减少或者消除在纤维消化中的限制因素并释放出更多能量。
本发明的另一个目的是将已报道的改善能量利用的淀粉酶排除，帮助维持正常的葡萄糖水平，并且降低酸中毒的可能性。
附图简述
图1是本发明的优选实施方案对苜蓿12h和24h时的体外产气量(Gp)和24h时的体外有机物消化率(OMD)的影响的图表；对照(左侧柱)是未经酶处理的空白；处理(右侧柱)的剂量是1000g/T。
图2是本发明的优选实施方案对羊草(Chinese wildrye)12h和24h时的体外产气量(Gp)和24h时的体外有机物消化率(OMD)的影响的图表；对照(左侧柱)是未经酶处理的空白；处理(右侧柱)的剂量是1000g/T。
图3是本发明的优选实施方案对全株玉米青贮12h和24h时的体外产气量(Gp)和24h时的体外有机物消化率(OMD)的影响的图表；对照(左侧柱)是未经酶处理的空白；处理(右侧柱)的剂量是1000g/T。
图4是本发明的优选实施方案对模拟全混合日粮(TMR)(苜蓿∶玉米∶大豆＝50∶30∶20)24h时的体外产气量(Gp)和24h时的体外有机物消化率(OMD)的影响图表；对照(左侧柱)是未经酶处理的空白；处理(右侧柱)的剂量，从左侧第二柱起分别是500g/T、1000g/T和2000g/T。
图5是本发明的优选实施方案对提取自黑麦草的中性洗涤纤维(NDF)24h时的体外产气量(Gp)和24h时的体外有机物消化率的影响的图表；对照(左侧柱)是未经酶处理的空白；处理(右侧柱)的剂量是1000g/T。
图6是本发明的酶产品对模拟TMR饲料24h时的体外产气量的影响的图表。
图7表示图6的模拟TMR饲料中的有机物消化率(OMD)。
图8是本发明的酶产品对黑麦草NDF 24h时的体外纤维消化率的影响的图表。
图9是在瘤胃液体存在下纤维素酶和木聚糖酶的稳定性的图表。
图10是在测试期间产乳量的趋势图。
图11是酶样品对乳成分的影响的图表。
图12是酶样品对SCC的影响的图表(柱内带有不同字母的平均值存在差异(P＜0.05))。
图13是实施例12中的产乳量的趋势图。
图14是酶样品对产乳量(Kg/d)的影响的图表(P值如图所示)。
图15是酶样品对乳脂肪的影响的图表(P值如图所示)。
图16是酶样品对乳品蛋白质的影响的图表(P值如图所示)。
图17是酶样品对SCC的影响的图表(P值如图所示)。
图18是在实施例13中产乳量的趋势图。
图19是酶样品对产乳量的影响的图表(P值如图所示)；a，b-柱内带有不同字母的平均值存在显著性差异(p＜0.01)。
图20是酶样品对乳脂肪的影响的图表(P值如图所示)；A，B，C-带有符号后不同字母的平均值存在差异(P＜0.05)。
图21是酶样品对乳蛋白质的影响的图表(P值如图所示)。
图22A和22B是酶样品对乳糖(图22A)和NFS(图22B)的影响的图表(P值如图所示)；a，b-带有符号后不同字母的平均值存在显著性差异(p＜0.01)。
图23是酶样品对SCC的影响的图表(P值如图所示)；a，b-带有符号后不同字母的平均值存在显著性差异(p＜0.01)。
优选实施方案详述
本发明提供了适合在乳牛饲料中使用以改善草料消化的酶产品。
用纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的组合生产所述酶产品。所述产品中的其它配料可以包括，但不限于，载体、调味剂和酶稳定化合物。
在此方法中使用的酶配料可以是液体或者固体。可以将固体酶与其它配料直接混合。可以首先将液体酶喷洒在载体上，然后与其它配料混合。
在与草料混合之前可以将所述酶产品施用于种子浓缩物。
可以将所述酶产品施用于乳牛、绵羊、羔羊和山羊的日粮。
该酶产品的优选剂量取决于反刍动物饲料。本领域技术人员会认识到，该剂量取决于饲料中纤维的百分比和纤维的组成。典型的剂量在100-2000g/吨处理的草料之间。在优选实施方案中，对于每吨饲料产品的最终施用在300,000和12,000,000酶活性单位之间。
可以任选地施用该酶，作为饲料添加剂施用于反刍动物的精饲料中，作为在全混合日粮(TMR)混合期间的配料施用，或者作为在自制全价饲料混合期间的成分施用。
在本发明的一个优选实施方案中，1克酶产品包含约200至约800活性单位之间的纤维素酶，约750至约3000活性单位之间的木聚糖酶，约225至约890活性单位之间的β-葡聚糖酶，约1至约100活性单位之间的果胶酶，约50至约800活性单位之间的β-甘露聚糖酶，约1至约100活性单位之间的α-半乳糖苷酶。本发明的一个更优选的实施方案1克酶产品包含约200至约600活性单位之间的纤维素酶，约750至约2250活性单位之间的木聚糖酶，约225至约625活性单位之间的β-葡聚糖酶，约1至约5活性单位之间的果胶酶，约100至约300活性单位之间的β-甘露聚糖酶，约1至约5活性单位之间的α-半乳糖苷酶。对具有这些范围之间的酶成分活性的酶产品进行了制备和测试。
体外评价
相对于未经处理的标准系列饲料样品，测定了本发明的酶产品的影响。
Menke等于1979年建立的并于1988年得到发展的体外方法是模拟体内发生的消化过程的经典方法。在此方法中，瘤胃液体由被插入套管的反刍动物得到并在某些条件下与底物饲料一起温育。因为在此方法中发现体外产气量和体内消化率之间存在高度相关性(Menke等，1979；Menke等，1988)，所以测量产气量作为消化率和代谢能含量水平的指标。此方法已表明产气量和动物体内性能之间的高度一致性。在最近二十年中，广泛地应用此方法来评价草料的营养价值。
三只发育完全的绵羊被用作供体动物并安装瘤胃套管。在相同的时间内(8:30，am；4:30，pm)用相同的饲料(30％精饲料和70％干草)喂养全部三只供体动物。在收集瘤胃液体之前，需要8小时或者更长的日间间隔。供体绵羊的实验用饲料的配料和化学组成如表1所示。
表1.供体绵羊的实验用饲料的配料和化学组成
  配料   比例
  精饲料添加剂，％
  玉米   50.0
  糠   15.0
  大豆   10.0
  配料   比例
  油菜子   9.0
  NaHCO3   10.0
  NaCl   1.5
  Ca(HCO3)   21.0
  CaCO3   1.5
  维生素预混料   1.9
  化学组成   0.1
  精饲料添加剂
  水分，％   13.5
  CP，％   14.7
  Ca*，％   1.6
  P*，％   0.8
  NE*，NND   2.3
  羊草，％
  水分   8.7
  CP   6.6
  NDF   59.3
  OMD   95.5
“*”计算值，其它是测量值
按照Menke等(1988)所述采集并处理瘤胃液体。简言之，在早晨喂养之前，从三只瘤胃插入套管的绵羊采集瘤胃液体。用吸瓶(suction bottle)(约2L)收集液体。用中间带孔的橡皮塞密封此瓶，并通过管连接至略弯的PVC导管(直径约10mm)。通过瘤胃套管，将在远端具有约十个小孔的导管导入瘤胃。使用手动操作的真空泵从瘤胃吸出瘤胃液体。
按照Menke等(1988)所述将来自三只绵羊的瘤胃液体与厌氧缓冲液/矿物质溶液(1∶2，v/v)混合，在预热至39℃的水浴中带到实验室，通过四层干酪包布过滤，并保存在充满CO2的温热的绝热瓶中。在39℃振荡水浴中，在充满30ml用缓冲液处理的瘤胃液体的100ml注射器中温育添加酶的样品(200mg，DM)。使用无酶添加剂的空白样品作为对照。进行两轮温育，在各轮温育中一式三份地进行。在0、2、4、6、9、12和24h记录产气量。
用Menke给出的等式从24h时的产气量计算底物24h时的有机物消化率(OMD24h)：
OMD24h，％＝0.986×Gp24h+0.0606×CP％+11.3
其中OMD24h、Gp24h和CP分别是24h时的有机物消化率、24h时的产气量和底物的粗蛋白含量。
使用统计软件SAS(v6.12，1996)，通过T检验比较数据。当p＜0.05时表明有差异，当p＜0.01时表明有显著性差异。
在第一轮温育中，使用乳牛的模拟全混合日粮(TMR)来研究酶对TMR消化的影响。模拟TMR的配料如表2所述。
表2.模拟TMR的配料
  配料   比例，％
苜蓿粉 50.0
  玉米粉   30.0
  大豆粉   20.0
  总量   100.0
在第二轮中，使用纯NDF作为底物来研究酶配方对纤维消化的影响。按照Robertson和Van Soest(1981)以及Van Soest等(1991)所述，从黑麦草提取NDF。简言之，黑麦草经淀粉酶处理，然后用中性洗涤剂清洗。在39℃下，将提取的NDF整夜浸没在1M硫酸铵((NH4)2SO4)溶液中，以除去矿质状态的微量洗涤剂(Schofield和Pell，1995)。然后分步地在热水和乙醇中清洗样品，用多孔板过滤至坩埚中，然后在50℃下烘干。
通过方法WI-KAE-021、WI-KAE-022和KCCM-005(参见以下酶测定)测定纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的活性。对于表5、7、9和11使用所谓的瘤胃方法。瘤胃方法与相应的上述方法相同，只是瘤胃方法中的温育条件(使用39℃和pH 6.0)不同。
制备酶样品  在实验室中，为第一轮发酵制备了4种初始的酶配方，称为KAC023-001、KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004。主要的酶活性如表3所示。以0.5g/Kg、1.0g/Kg和2.0g/Kg的剂量将酶加入底物中。
表3.各酶的活性，U/g
  KAC023-001   KAC023-002   KAC023-003   KAC023-004
  纤维素酶   1000   1000   1000   1000
  木聚糖酶   4000   4000   4000   4000
  β-葡聚糖酶   --   400   --   400
  果胶酶   --    --   200   200
基于第一轮发酵的结果，选择最好的配方KAC023-004，并进一步优化成两个新的配方，KAC023-005和KAC023-006。主要的酶活性如表4所示。以1.0g/Kg的剂量将样品加入纯的黑麦草NDF中，并在体外产气法中与空白对照一起温育。
表4.用于第二轮测试中的样品的酶活性，U/g
  KAC023-005   KAC023-006
  纤维素酶   2000   2800
  木聚糖酶   10000   10000
  B-葡聚糖酶   400   400
  果胶酶   200   200
  B-甘露聚糖酶   200   200
  A-半乳糖苷酶   存在   存在
以与产气测试相似的方法测定瘤胃中纤维素酶和木聚糖酶的稳定性，只是使用的剂量显著更高(100kg/T)以使来自内源性酶活性的噪音最小化。底物与KAC023-005或者KAC023-006连同瘤胃液体一起温育。在0、1、2、4、6和12h测定这两种酶的活性。按照以下等式计算剩余活性与初始活性的比，其用于反映瘤胃中酶的稳定性。比，％＝(At-A0)×100/At，其中，At和A0是th和0h时的酶活性。
酶测定
方法WI-KAE-022
甘露聚糖酶是能够切断含有甘露糖单元的多糖链的酶。甘露聚糖酶将刺槐豆胶(Locust bean gum)甘露聚糖底物水解成还原糖单元。还原糖与3，5-二硝基水杨酸(DNS)反应。产生的颜色变化与释放的还原糖(以甘露糖表示)的量成正比，继而与存在于样品中的甘露聚糖酶的活性成正比。
通过将14.7g(+/-0.01g)柠檬酸三钠溶于900ml去矿质水中，然后用去矿质水稀释至1000ml来配制50nM柠檬酸钠缓冲溶液。通过将10.5g(+/-0.01g)一水合柠檬酸溶于900ml去矿质水中，然后用去矿质水稀释至1000ml来配制50mM柠檬酸缓冲溶液。通过将0.5g Sigma刺槐豆胶甘露聚糖溶于70ml柠檬酸缓冲液(pH 5.3)中，然后搅拌20分钟或者直至甘露聚糖完全溶解来配制0.5％(w/v)刺槐豆胶甘露聚糖底物。用柠檬酸钠缓冲液(pH 5.3)稀释至100ml，并检测底物溶液的最终pH为5.3(+/-0.05)。通过在环境条件下的瓶中将1.6g氢氧化钠溶于70ml去矿质水中来配制3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液100ml。加入1g 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，接着加入30g酒石酸钾钠，并用去矿质水稀释至100ml。在室温下该DNS溶液可以保存1个月。通过用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.3)溶解0.1g(+/-0.001g)甘露糖，然后使用100ml容量瓶加满至100ml来配制1000μg/ml甘露糖储备溶液。通过用柠檬酸钠缓冲液稀释适量的甘露糖储备溶液来配制含有0到500μg/ml之间(以50μg/ml递增)的标准甘露糖溶液。
在磁搅拌器上(烧杯)，在Y ml缓冲液中提取Xg(+/-0.01g)样品10分钟。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在缓冲液中将该溶液稀释Z倍。移取0.9ml 0.5％底物溶液至试管中(应测定各样品两次)。在50℃的水浴中温育此混合物2分钟。启动计时器并立即以30秒的间隔将0.1ml酶溶液加入试管中。在Vortex混合器上充分振摇各管，并将管重置于水浴中。在50℃的水浴中精确地温育试管10分钟。通过加入1.5ml DNS溶液，以30秒的间隔终止反应，并充分振摇以终止反应。在对照管中，加入DNS溶液后，加入酶溶液。对于甘露糖标准溶液，移取1000μl至各试管中，然后加入1.0ml DNS。将试管置于沸水浴(100℃)中5分钟。冷却并在540nm读取光密度。
一活性单位是在给定的测定条件下，每60分钟从甘露聚糖释放1mg甘露糖的酶的量。
其中f＝稀释因子＝YxZx1/X。
方法WI-KAE-005
α-半乳糖苷酶从pNP-α-D-吡喃半乳糖苷释放对硝基苯酚。通过分光光度法可以测定释放的对硝基苯酚的量，它是α-半乳糖苷酶活性的量度。
通过将18.45g(+/-0.01g)柠檬酸三钠和2.62g(+/-0.01g)柠檬酸溶于225ml去矿质水中来配制柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.5，0.25M)。检测pH(5.5±0.1)，并且如果需要，用NaOH或者柠檬酸调节。用去矿质水稀释至250ml。当与要求的pH相比pH变化大于0.05单位时弃去。通过将15(±0.1)mg对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷溶于5ml去矿质水中来配制对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的溶液。通过将5g(+/-0.01g)Na2CO3溶于100ml去矿质水中来配制5％Na2CO3溶液。
在磁搅拌器上，在Yml缓冲液中提取Xg(+/-0.01g)样品10分钟。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在缓冲液中将溶液稀释Z倍。将1ml柠檬酸钠缓冲液、0.2ml 0.01MpNP-α-D-吡喃半乳糖苷和0.4ml去矿质水置于试管中。在37℃的水浴中温育此混合物5分钟。启动计时器，并立即以30秒间隔将0.4ml酶溶液加入试管中。在Vortex混合器上充分振摇各管，并将管重置于水浴中。在37℃的水浴中精确地温育试管15分钟。通过加入2ml 5％Na2CO3溶液，以30秒的间隔终止反应，并充分振摇以终止反应。在对照管中，加入Na2CO3溶液后，加入酶溶液。以水为对照，在410nm读取吸光度。
一活性单位是在给定的测定条件下，每分钟从pNP-α-D-比喃半乳糖苷释放1μmol对硝基苯酚的酶的量。对硝基苯酚的摩尔消光系数是18240M-1cm-1。
εm＝A/C*l＝18240M-1cm-1
其中A是吸光度，C是摩尔浓度，而l是程长。
U/g＝(A样品-A空白)*36.55*f/1000
其中f＝稀释因子＝YxZx1/X。
方法WI-KAE-021
β-葡聚糖酶与β-葡聚糖反应释放出葡萄糖。纤维素酶复合物将纤维素水解成低分子量的还原碳水化合物，主要是葡萄糖和纤维二糖。戊聚糖酶(木聚糖酶)水解木聚糖。果胶酶水解果胶。转化酶使蔗糖分子断裂成果糖和葡萄糖，它们是还原糖。然后按照Somogyi-Nelson法测定所形成的还原糖。
反应条件
表A
通过将25.0g碳酸钠(无水)、25.0g四水合酒石酸钾钠、20.0g碳酸氢钠和200.0g硫酸钠(无水)溶于950ml去矿质水中并稀释至1000ml来配制Nelson试剂A(1000ml)。
通过将15.0g五水合硫酸铜(II)溶于100ml去矿质水中来配制Nelson试剂B(100ml)。加入两滴浓硫酸H2SO4。
通过在烧杯中将25ml Nelson试剂A与1ml Nelson试剂B混合来配制Nelson试剂C(26ml)。
通过将50.0g四水合七钼酸铵溶于800ml去矿质水中来配制Nelson颜色试剂(砷钼酸盐)(1000ml)。加入42ml浓硫酸H2SO4。将6.0申酸钠(Na2HAsO4·7H2O)溶于50ml去矿质水中，然后将其加入钼酸盐溶液中。使用容量瓶用去矿质水加满至1000ml。该试剂应是黄色而无绿色着色。
β葡聚糖酶测定
在磁搅拌器上(烧杯)，在Yml缓冲液中提取Xg(+/-0.01g)样品10分钟。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在缓冲液中将该溶液稀释Z倍。移取1mL最终溶液至试管中。此时空白仍是空的。一式两份地测定样品。移取1mL各标准溶液至相应的管中，用去矿质水作为零标准。在精确的37℃的水浴中，将试管预热5分钟。以30秒的间隔，将1ml 0.5％β-葡聚糖底物加入各管。在Vortex混合器上充分振摇各管，并将管重置于37℃的水浴中。在37℃下精确地将管温育30分钟。以30秒的间隔，将1mlNelson试剂C加入各管，并充分振摇以终止反应。将1ml样品的最终溶液加入样品空白管中，并将它们充分振摇。将管置于沸水浴(100℃)中20分钟。冷却并将1ml Nelson颜色试剂加入所有试管中，并在Vortex混合器上充分振摇。将5ml去矿质水加入各管，并在Vortex混合器上充分振摇。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在540nm读取光密度。
纤维素酶测定
在磁搅拌器上(烧杯)，在Ym缓冲液中提取Xg(+/-0.01g)样品10分钟。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在缓冲液中将该溶液稀释Z倍。移取1ml最终溶液至试管中。此时空白仍然是空的。一式两份地测定样品。移取1ml各标准溶液至相应的管中，用去矿质水作为零标准。不预热试管。以30秒的间隔，将1ml CMC底物加入各管。在Vortex混合器上充分振摇各管。将管置于50℃的水浴中。在50℃下精确地将管温育20分钟。以30秒的间隔，将1ml Nelson试剂C加入各管中，并充分振摇以终止反应。将1ml样品的最终稀释液加入样品空白管，并充分振摇。将管置于沸水浴中20分钟。冷却并将1ml Nelson颜色试剂加入所有试管中，并在Vortex混合器上充分振摇。将5ml H2O加入各管，并在Vortex混合器上充分振摇。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在540nm读取光密度。
木聚糖酶测定
在磁搅拌器上(烧杯)，在Yml缓冲液中提取Xg(+/-0.01g)样品10分钟。离心5分钟以得到澄清的酶溶液(＞1,700g在离心机上)。在缓冲液中将该溶液稀释Z倍。移取1ml最终溶液至试管中。此时空白仍然是空的。一式两份地测定样品。移取1ml各标准溶液至相应的管中，用去矿质水作为零标准。不预热试管。以30秒的间隔，将1ml 0.5％木聚糖底物加入各管。在Vortex混合器上充分振摇各管并将管重置于50℃的水浴中。在50℃下精确地将管温育15分钟。以30秒的间隔，将1ml Nelson试剂C加入各管，并充分振摇以终止反应。将1ml最终溶液加入样品空白管中，并充分振摇。将管置于沸水浴(100℃)中20分钟。冷却并将1ml Nelson颜色试剂加入所有试管，并在Vortex混合器上充分振摇。将5ml去矿质水加入各管，并在Vortex混合器上充分振摇。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在540nm读取光密度。
果胶酶测定
在磁搅拌器上，在Y ml缓冲液中提取X g(+/-0.01g)样品10分钟(NB：对于脂质包衣的酶(lipid-coated enzymes)如Ronozyme VP(CT)，加入5滴10％吐温20溶液，并搅拌5分钟。然后超声处理15分钟，然后再搅拌样品5min)。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在缓冲液中将该溶液稀释Z倍。移取1ml最终溶液至试管中。此时空白仍然是空的。一式两份地测定样品。移取1ml各标准溶液至相应的管中，用去矿质水作为零标准。在精确的37℃的水浴中预热试管5分钟。以30秒的间隔，将1ml底物溶液加入各管。在Vortex混合器上充分振摇各管，并将管重置于37℃的水浴中。在37℃下精确地将管温育15分钟。以30秒的间隔，将1mlNelson试剂C加入各管，并充分振摇以终止反应。将1ml最终溶液加入样品空白管中，并充分振摇它们。将管置于沸水浴(100℃)中20分钟。冷却并将1ml Nelson颜色试剂加入所有试管，并在Vortex混合器上充分振摇。将5ml去矿质水加入各管，并在Vortex混合器上充分振摇。离心以得到澄清的酶溶液(＞1,700g，5分钟)。在540nm读取光密度。
计算
一活性单位等于在该测定指定的条件下，每分钟释放1μg糖等价物的酶的量。基于标准样品的结果绘制标准曲线，并从该曲线确定糖等价物的量。
稀释因子应对各活性提供分别在下列范围间的反应吸光度以使其保持在该测定的线性范围内。
  酶活性   吸光度范围
  木聚糖酶   0.200-1.000
  纤维素酶   0.200-0.500
  β-葡聚糖酶   0.200-0.650
  果胶酶   0.100-0.650
果胶酶
试剂空白吸光度应小于0.02以得到准确的结果。若其大于0.02，则稀释样品并重复测定，除非样品的吸光度低于0.100。当分析Asplelase F及其结束的产物时，由于原料中还原糖的存在，第2点会不适用。
木聚糖酶活性：
将10.51g柠檬酸溶于950ml去矿质水中。用10M NaOH调至pH 5.3。使用容量瓶用去矿质水稀释至1L。当与要求的pH相比pH变化大于0.05单位时，弃去该缓冲溶液。
木聚糖底物(0.5％)
称量0.50g(+/-0.01g)桦木木聚糖(Sigma X-0502)，并加入100ml pH5.3柠檬酸缓冲溶液。在搅拌的同时，煮沸此溶液10分钟。冷却底物至50℃。建议的保存时间是1天。
D(+)-木糖储备溶液1000μg/ml
用去矿质水溶解0.1g(+/-0.001g)无水木糖，并使用100ml容量瓶加满至100ml。
木糖标准溶液
如下稀释木糖储备溶液：
Figure G2008800226284D00161
纤维素酶活性：
将7.90g三水合乙酸钠或者4.1g无水乙酸钠溶于950ml去矿质水中。用冰醋酸将pH调节至pH 4.8。使用容量瓶用去矿质水稀释至1L。当与要求的pH相比pH变化大于0.05单位时，弃去该缓冲溶液。
CMC-底物(羧甲基纤维素)
将0.40g(+/-0.001g)CMC粉末缓慢地加入100ml pH 4.8乙酸盐缓冲溶液。在室温下搅拌直至完全溶解。建议的保存时间：冰箱中2周。使用前，在90℃下加热该底物25分钟，并冷却至50℃。
葡萄糖储备溶液(1000μg/ml)
用去矿质水溶解0.1g(+/-0.001g)无水葡萄糖并使用100ml容量瓶加满至100ml。
葡萄糖标准溶液
如下稀释葡萄糖储备溶液：
Figure G2008800226284D00162
Figure G2008800226284D00171
β葡聚糖酶活性：
将2.35g磷酸二氢钾和14.72g二水合磷酸氢二钠溶于950ml去矿质水中。用1N NaOH(若pH＜7.5)或者用1N HCl(若pH＞7.5)调节pH。使用容量瓶用去矿质水稀释至1L。当与要求的pH相比pH变化大于0.05单位时，弃去该缓冲溶液。
β-葡聚糖底物(0.5％)
称量0.50g(+/-0.01g)来自大麦的β-葡聚糖，中等粘度(由Megazyme提供)。加入100ml pH 7.5缓冲溶液。在约70℃的水浴中搅拌的同时，溶解此混合物(约10至15分钟)。使底物冷却至37℃。建议的保存时间是1天。
葡萄糖储备溶液(1000μg/ml)
用去矿质水溶解0.1g(+/-0.001g)无水葡萄糖并用100ml容量瓶加满至100ml。
葡萄糖标准溶液
如下稀释葡萄糖储备溶液：
Figure G2008800226284D00172
果胶酶活性：
将10.51g柠檬酸溶于950ml去矿质水中。用10M NaOH调节至pH4.0。使用容量瓶用去矿质水稀释至1L。当与要求的pH相比pH变化大于0.05单位时，弃去该缓冲溶液。
聚半乳糖醛酸底物0.15％
称量0.15g(+/-0.01g)聚半乳糖醛酸钠盐(Sigma P-3850)。加入100mlpH 4.0缓冲溶液。搅拌并在80℃下加热此溶液15分钟。使底物冷却至37℃。建议的保存时间是1天。
D(+)-半乳糖醛酸储备溶液1000μg/ml
用去矿质水溶解0.109g(+/-0.001g)半乳糖醛酸(一水合物)并用100ml容量瓶加满至100ml。
半乳糖醛酸标准溶液
如下稀释半乳糖醛酸储备溶液：
Figure G2008800226284D00181
实施例1-对基于苜蓿的草料的影响
以1000g/吨的剂量，将代表本发明优选实施方案的酶产品KAC023-005与苜蓿底物混合。在100ml注射器中，将200毫克(200mg)该混合物与30ml用厌氧缓冲液/矿物质溶液处理的瘤胃液体一起温育。进行两轮温育，在各轮温育中，一式三份地进行。在12h和24h时记录产气量。从24h时的产气量计算底物24h时的有机物消化率(OMD24h)。结果如图1所示。使用1000g/T剂量的酶引起苜蓿的OMD-24h增长3.2％。
实施例2-对基于羊草的草料的影响
以1000g/吨的剂量，将KAC023-005与羊草底物混合。在100ml注射器中，将200毫克(200mg)该混合物与30ml用厌氧缓冲液/矿物质溶液处理的瘤胃液体一起温育。进行两轮温育，在各轮温育中，一式三份地进行。在12h和24h时记录产气量。结果如图2所示。酶的添加使羊草的Gp-24h和OMD-24h分别显著地增加10.9％和7.6％(p＜0.01)。
实施例3-对基于玉米青贮的草料的影响
以1000g/吨的剂量，将酶产品KAC023-005与基于玉米青贮的底物混合。在100ml注射器中，将200毫克(200mg)该混合物与30ml经厌氧缓冲液/矿物质溶液处理的瘤胃液体一起温育。进行两轮温育，在各轮温育中，一式三份地进行。在12h和24h时记录产气量。结果如图3所示。全株玉米青贮的Gp-24h和OMD-24h分别显著地(p＜0.01)增加16.2％和12.1％。
实施例4-对全混合日粮的影响
以500g/吨、1000g/吨和2000g/吨的剂量，将酶产品KAC023-005与模拟TMR的饲料混合。在100ml注射器中，将200毫克(200mg)该混合物与30ml经厌氧缓冲液/矿物质溶液处理的瘤胃液体一起温育。进行两轮温育，在各轮温育中，一式三份地进行。在12h和24h时记录产气量。结果如图4所示。当用不同剂量的酶处理时，Gp-24h和OMD-24h极大地增加(p＜0.01)。Gp-24h的增加值随着剂量的增加而升高。但是，数据表明：当以1000g/T的剂量加入酶时，产气量可以达到稳定状态(p＞0.05)。换言之，用1000g/T底物的剂量，酶的作用达到饱和。
实施例5-对黑麦草中性洗涤纤维的影响
以1000g/吨的剂量，将酶产品KAC023-005与提取自黑麦草的中性洗涤纤维(NDF)底物混合。在100ml注射器中，将200毫克(200mg)该混合物与30ml经厌氧缓冲液/矿物质溶液处理的瘤胃液体一起温育。进行两轮温育，在各轮温育中，一式三份地进行。在24h时记录产气量。结果如图5所示。当在体外温育时，酶使黑麦草NDF的OMD-24h增长18.3％(p＜0.01)。此结果表明酶产品能够提高纤维的消化率。
实施例6-附加的TMR测试
对模拟TMR进行第二次测试。24h时产气量的结果如图6所示。配方KAC023-002、KAC023-003和KAC023-4均有效地改善了产气量。在使用的三种剂量即0.5g/kg、1g/kg和2g/kg下，还观察到剂量效应。配方KAC023-001在低剂量下未表现出影响，但是在高剂量下表现出一定的改善。配方KAC023-003和KAC023-004随着剂量的增加显示出产气量增加。配方KAC023-002在1g/kg下达到饱和。
按照Menke的方法，在24小时温育中，在产气量和消化率间存在紧密的相关性。图7所示为模拟TMR饲料中的有机物消化率(OMD)。从底物的粗蛋白含量和Gp24h计算OMD。因为对于所有四种酶配方，底物均相同，酶对OMD的影响显示出与Gp24h相似的模式。综合产气量和消化率的结果，当在体外温育时，所有的四种酶配方均可以提高模拟TMR的消化率。在这四种配方中，KAC023-001的有效性最低。它仅在高剂量(2g/Kg)下表现出影响。KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004均在统计学上优于KAC023-001。在KAC023-002和KAC023-003间无统计学差异。在所有的四种样品中，KAC023-004是最好的。因此，在接下来的实验中根据KAC023-004设计新的配方。
在乳业养殖中，纤维素酶和木聚糖酶被认为是最重要的外源性酶(Beauchemin等，2003a，Beauchemin等，2003b，Beauchemin等，2003c，)。KAC023-001仅包含纤维素酶和木聚糖酶。以上数据表明当纤维素酶和木聚糖酶的水平低时，对TMR的体外消化率无影响。在高剂量(2g/kg)下，KAC023-001表现出统计学上的影响。这表明这两种酶的水平需要通过进一步优化来增加。
除了纤维素酶和木聚糖酶之外，其它酶也发挥重要作用。所有四种配方均包含相同水平的纤维素酶和木聚糖酶。与KAC023-001相比，KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004另外还分别包含β-葡聚糖酶、果胶酶和此二者。这表明添加β-葡聚糖酶和/或果胶酶对于有效性是必不可少的。瘤胃中这两种酶的缺乏可能是有机物消化率的限制因素。β-葡聚糖是草糠中的主要成分。它由连接的β-(1，3)-和β-(1，4)-D-吡喃葡萄糖单元的线性无支链多糖组成。果胶是在水果皮和蔬菜皮中发现的酸性结构多糖的异质群体。其结构的大部分由同聚物的部分甲基化的聚-α-(1，4)-D-半乳糖醛酸残基组成。β-葡聚糖和果胶均构成饲料中营养素释放的空间位阻。因此，如果β-葡聚糖和果胶未被有效地分解，可以影响到有机物消化率。我们的数据明显地表明添加β-葡聚糖酶或果胶酶显著地改善了添加酶的有效性。两种酶都添加发挥最好的有效性。
实施例7-附加的NDF测试
为了更好地评价纤维消化中的酶性能，我们使用纯化的黑麦草NDF作为底物。在纯NDF中，没有蛋白质或淀粉，因此可以消除这两种因素的干扰。我们还根据第一轮的结果更改了我们的酶配方。KAC023-005和KAC023-006均含有更高水平的纤维素酶和木聚糖酶。此外，两种配方均包含β-葡聚糖酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶。使用的剂量是1g/kg。黑麦草NDF的Gp和OMD的结果如图8所示。当在体外温育时，两种配方均显著地(p＜0.01)提高了纤维的Gp和消化率。这表明二种酶配方均可以提高纤维的消化率。
KAC023-005比KAC023-006更有效。将1.0g/Kg样品1加入黑麦草NDF引起消化率提高18.3％。除了纤维素酶之外，在这两种配方中，所有其它酶的活性均相同。KAC023-005中纤维素酶的活性低于KAC023-006中，但是KAC023-005的总有效性更好。这表明更高的酶活性不一定意味着更好的有效性。反而是不同酶的最佳组合更加促进总消化率的提高。此结果与之前由Eun和Beauchemin(出版中)进行的研究矛盾。Eun和Beauchemin使用若干商品化的酶产品来研究纤维素酶活性和体外产气量，并且发现这两种参数间的线性相关性(r＝0.71；p＜0.01)。一种解释是Eun的论文中纤维素酶活性实际上是指内切葡聚糖酶活性而不是总纤维素酶活性，而在我们的研究中，我们测定总纤维素酶活性。因此，内切葡聚糖酶和产气量间的线性相关性可能不等于总纤维素酶活性和产气量间的线性相关性。另一种可能的解释是在这两项研究中，测定纤维素酶活性的条件和方法非常不同。第三种可能性是在Eun的论文中报道的线性相关性是底物特异性的。在Eun的论文中，使用苜蓿作为底物，而在我们的研究中，使用TMR。
实施例8-瘤胃中酶的稳定性
在瘤胃中使用酶添加剂的主要担心之一是这些酶的稳定性。瘤胃微生物分泌可以快速降解外源性酶的蛋白酶。在此研究中，在体外测定两种配方中纤维素酶和木聚糖酶的稳定性。为了使来自纤维素酶和木聚糖酶的内源性活性的噪音最小化，我们使用高剂量(100kg/T)，以使得与外源性酶相比，这两种酶的内源性活性可忽略。因此，在我们的研究中，我们不需要担心来自内源性酶的干扰。我们的纤维素酶和木聚糖酶的稳定性如图9所示。温育12h后，KAC023-005中的纤维素酶活性保持在72.9％，并且两种样品中的所有其它酶的活性均保持在超过90％。
实施例10-使用各种酶产品的产气量
进行了一系列实验，以更好地理解各酶的作用、各酶的量和酶的比例对酶产品有效性的影响。
最初，制备了基于KAC023-5的四种不同的酶产品，并在瘤胃条件下使用产气量方法进行评价。使用的剂量是1.0g/Kg。
表5-酶产品
表6-表9的酶产品的产气量
Figure G2008800226284D00231
a，b，c柱内的不同字母表示存在差异(p＜0.05)
表5中的这些配方全都无效，表明除了酶分布的组成之外，不同酶的比例也是重要的。
在瘤胃条件下，相互对照地评价了先前的配方之一；使用的剂量为1.0g/Kg。
表7-酶产品
表8-表7的酶产品的产气量
Figure G2008800226284D00233
Figure G2008800226284D00241
a，b柱内的不同字母表示存在差异(p＜0.05)
结果表明纤维素酶和木聚糖酶的比例是重要的。如果木聚糖酶过高(KAC23-11和KAC023-12)，或者如果纤维素酶过高(KAC023-13、KAC023-14和KAC023-15)，则酶产品失去有效性。通过对比KAC023-17和KAC023-18，α-半乳糖苷酶似乎对玉米青贮有一定的改善。通过对比KAC023-05和KAC023-19，KAC023-05中的酶活性已达到饱和。进一步增加纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶不进一步提高有效性。
接下来在瘤胃条件下评价了果胶酶和α-半乳糖苷酶的重要性；使用的剂量为1.0g/Kg。
表9-酶产品
表10-表9的产品的产气量结果
Figure G2008800226284D00251
a，b，c，d柱内的不同字母表示存在差异(p＜0.05)
通过对比KAC023-18和KAC023-22、KAC023-20和KAC023-21，显然，α-半乳糖苷酶是需要的。通过对比KAC023-18和KAC023-20、KAC023-22和KAC023-21，显然，果胶酶是需要的。
通过对比瘤胃条件下KAC023-20和每种移除各成分酶的酶产品进行实验来进一步地证实各成分酶的重要性；剂量为1.0g/Kg。
表11-酶产品
Figure G2008800226284D00252
表12-表10的酶产品的产气量
Figure G2008800226284D00253
Figure G2008800226284D00261
a，b，c，d柱内的不同字母表示存在差异(p＜0.05)
结果表明对于最佳性能，六种成分酶的所有酶活性均是重要的。省略任何酶活性导致产气量在统计学上的显著降低。
实施例11
材料和方法
酶样品
在此实施例中使用的酶样品是如表13中所述的配方KAC023-20。
表13-酶产品
Figure G2008800226284D00262
试验动物
通过产奶天数(DIM)和泌乳性能在胎次内平衡，从江苏省南京的乳牛场挑选40只泌乳的中国荷斯坦牛(Chinese Holstein)，并随机分配成4组：对照和处理1-3，每组10只动物。在处理1、2和3中，分别以250g/T、500g/T和1000g/T将KAC023-20加入精饲料中。试验动物和分组的细节如表14所示。
表14.实验设计和试验动物的信息
Figure G2008800226284D00263
Figure G2008800226284D00271
精饲料的组成如表15所示。
表15.精饲料的组成
Figure G2008800226284D00272
以1∶1的比例，将精饲料与青贮饲料和草料混合来配制全价饲料作为TMR。TMR的采食量基于乳牛的泌乳期。TMR的组成和每只动物每天的采食量如表16所示。每天三次用TMR喂养试验动物。可随时无限制地供应淡水。
表16.TMR的组成和每天每只动物采食量
Figure G2008800226284D00273
Figure G2008800226284D00281
在由15d适应期和30d测试期组成的为期45天的单因素实验(one-wayexperiment)中进行研究。
测定的参数
在适应期的开始和结束时测定所有参数，包括产乳量、乳脂肪、乳蛋白质、乳糖、NFS和SCC。
在测试期内，每天记录产乳量。每2天取乳样来测定乳脂肪、乳蛋白质、乳糖和NFS的含量。每周三采集乳样品来测量SCC。
数据分析
使用统计软件SAS(v6.12，1996)，通过单因素ANOVA分析数据。当p＜0.05时，平均值存在差异，并且当p＜0.01时存在显著性差异。
结果
酶样品对产乳量的影响
整个测试期中的泌乳曲线如图10所示。随着泌乳高峰期后试验的进行，产乳量存在下降的总体模式并伴有一定程度的波动。所有3种处理的产乳量均高于对照。在最初的10天，这种趋势不是非常明显。但是，当处理被延长时，处理和对照间的差异变得愈发明显。产乳量的下降显著地放缓。
在表20中总结了对产乳量的统计分析。每6天的数据被分组为一泌乳阶段并通过统计进行分析。所得结果与图10中的曲线一致。在最初的两个阶段(00-12d)内无统计学差异(p＞0.05)。自第三阶段起，实现了KAC023-20对产乳量的积极影响，因为它显著地提高产乳量(p＜0.01)。除了第三阶段(13-18d)(p＜0.05)，在所有剂量下，KAC023-20均未显示出对产乳量的影响(p＞0.05)，表明在250g/T KAC023-20下外源性酶的活性已饱和。
在最初的两个阶段(00-12d)中KAC023-20未表现出影响，意味着乳牛可能需要长时间(超过22天)以适应外源性酶。但是，整个测试期(00-30d)的数据表现出产乳量的显著增长(p＜0.01)(表17)。KAC023-20的施用使日产乳量平均增长3.2％或者0.85Kg/头。
表17.KAC023-20对产乳量的影响，Kg/d
a，b列内带有不同字母的平均值存在显著性差异(p＜0.01)
A，B，C列内带有不同字母的平均值存在差异(p＜0.05)
KAC023-20对乳成分的影响
如图11中所示，在此研究中，KAC023-20未表现出对乳成分的影响。在3种处理中，未观察到乳脂肪的显著增长。在250g/T剂量下，与对照相比，存在数值的增长约2.7％(p＝0.3023)。
在乳蛋白质、乳糖或者NFS方面，在处理和对照间未得到显著性差异(p＞0.05)。
KAC023-20对体细胞数(SCC)的影响
由乳测定的SCC是反映乳牛健康状况的重要的并且非常广泛地被接受的标准。高水平的SCC通常是不良健康状况的指标，例如亚临床乳腺炎、酮症等。KAC023-20对SCC的影响如图12所示。
在低剂量的KAC023-20(250g/T)下未观察到积极影响。在中等施用量(500g/T)下观察到SCC的数值的降低，并且在高施用量(1000g/T)下观察到SCC显著降低(p＜0.05)。这表明KAC023-20提高泌乳乳牛的健康状况。
讨论
在乳牛养殖业，能量成为动物生产力(包括产奶量、繁殖和健康维护)的瓶颈。能量供应不足会缩短泌乳高峰期并且降低总产乳量。改善纤维消化率可以提高能量释放，并因此给动物提供更好的能量以使其发挥生产力。常规饲料中的粗纤维由连接的β-(1，3)-和β-(1，4)-D-吡喃葡萄糖单元的线性无支链的多糖组成。这些单元可以折叠和凝结成结晶和非结晶区域。瘤胃中细菌分泌的纤维水解酶可以降解纤维的非结晶区域，但是迄今尚无证据证明细菌的酶可以降解结晶区域。在瘤胃中，结晶区域仅能够被由瘤胃真菌分泌的外切葡聚糖酶和微晶纤维素酶降解。因为瘤胃的微生物区系主要由细菌占主要地位，所以纤维的水解受两种真菌酶即外切葡聚糖酶和微晶纤维素酶限制。已证明外源性酶通过直接将纤维的结晶区域降解成纤维二糖和葡萄糖或者增加瘤胃细菌种群来改善纤维消化。Nsereko等(2002)发现当在饲料中添加纤维水解酶时，能够降解纤维二糖和木聚糖的细菌的数量显著地增加(p＜0.05)。Lewis等(1996)以前已观察到外源性酶对纤维的有效水解，并证明外源性木聚糖酶和纤维素酶显著地提高DM、NDF和ADF的消化率。该研究清楚地证明通过向饲料中添加酶样品对纤维有效的水解可以显著地提高处于泌乳中期的乳牛的产乳量(p＜0.01)并且在数值上提高其乳脂肪(p＞0.05)，证实了能量利用率和产乳量之间的正相关性。
在中国，为了追求更高的产乳量，存在增加精饲料与粗饲料比例的趋势。瘤胃中高水平的精饲料的结果是乳酸的浓度较高，导致瘤胃pH较低。由于瘤胃中的纤维素分解细菌对酸性条件极为敏感，瘤胃的pH低于6.0至6.2被认为对这些细菌的生长有害(Russell和Wilson，1996)。对于瘤胃中的纤维分解细菌，偏离最佳pH 6.2肯定会导致一系列代谢疾病，即酸中毒和酮症。因此，高水平的精饲料会严重地损害纤维分解细菌的功能并且损害纤维的消化率。用外源性酶对反刍动物饲料进行添加利用了这些酶的较低最佳pH(通常在4.0和6.0之间)，并因此非常适合于高水平的精饲料酸化的瘤胃。
体细胞数被广泛地用作乳牛的健康指标，其对产乳量很关键。只有当SCC低于阈值71,000细胞/ml时，才可以达到最佳产乳量，并且在阈值之上SCC的每次翻倍都会导致1.5lb/天的额外乳损失(Shook和Saeman，1983)。在此研究中，我们发现只有通过用1000g/T的KAC023-20处理，SCC才降低(p＜0.05)，但是在其它剂量下不降低。这充分地表明本发明的酶组合和乳牛的免疫系统或健康间的剂量依赖关系。既然KAC023-20改善了饲料的能量释放，更好的能量平衡使得乳牛更健康就不足为奇了。我们的结果也与Yang等之前的报告(1999)一致，其证实了产乳量中相似的剂量依赖性增加，1000至2000g/T的外源性酶使产乳量分别从23.7增加至24.6和25.6Kg/d。
结论
总而言之，在此研究中，KAC023-20的添加提高了泌乳性能而不影响乳成分。此研究表明KAC023-20在250、500和1000g/T下显著地提高产乳量，但是在提高泌乳性能方面，250g/T的施用剂量可能是成本最低的。在1000g/T的剂量下，SCC降低，这表明当高水平地添加KAC023-20时，其改善了乳牛的健康状况。
实施例12
材料和方法
酶样品
在此试验中使用的酶样品是实施例11所述的配方KAC023-20。
试验动物
根据胎次、产奶日数(DIM)和泌乳性能，从辽宁省沈阳市的乳牛场挑选了72只泌乳的中国荷斯坦牛，配对并且分成两组，即对照和处理，各组36只动物。在处理中，以500g/吨精饲料将酶样品加入精饲料中。试验动物和分组的细节如表18所示。
表18.试验设计和试验动物的信息
Figure G2008800226284D00321
精饲料的成分如表19所示。
表19.精饲料的成分
Figure G2008800226284D00331
将精饲料与青贮饲料和草料混合成全价饲料作为全混合日粮(TMR)。TMR的采食量基于乳牛的泌乳期。TMR的成分和每只动物每天的采食量如表20所示。每天三次地喂养试验动物并且可随时无限制地供应淡水。
表20.TMR的成分和每只动物每天的采食量
Figure G2008800226284D00332
在由15d预处理期和40d测试期组成的为期55天的成对样品实验(Paired-Samples experiment)中进行研究。
测定的参数
在预处理期的开始和结束时测定所有的参数，如产乳量、乳脂肪、乳蛋白质和SCC。
在测试期内，每5天记录产乳量。每15天取乳样来测定乳脂肪、乳蛋白质的含量和SCC。
数据分析
使用统计软件SAS(v6.12，1996)通过成对样品T-检验分析数据，因此，误差条未包括在数据分析中。当p＜0.05时，平均值存在差异，并且当p＜0.01时，存在显著性差异。
结果和讨论
酶样品对产乳量的影响
整个测试期内的泌乳曲线如图13所示。处理组的产乳量高于对照，并且经酶样品处理乳曲线的降低显著放缓。
产乳量的统计结果如图14所示。收集每5天的数据作为一个泌乳阶段，并进行统计分析。所得结果与乳曲线一致。在最初的四个阶段(00-20d)，未观察到稳定的统计学差异。从第五阶段起，得到酶样品对产乳量的统计学上的积极影响。酶样品提高产乳量(p＜0.05)。对于整个测试期，处理组的产乳量显著地高于对照(p＜0.01)。
在最初的四个阶段(00-20d)中的无影响表明乳牛可能需要长时间来适应外源性酶。从整个测试期起，利用酶样品可以提高产乳量约0.82Kg/d每头或者3.05％。
酶样品对乳成分的影响
酶样品对乳脂肪的影响如图15所示。当添加酶样品时，在测试期的不同阶段内，未观察到乳脂肪的统计学上的增长(p＞0.05)。但是，对于整个测试期，在处理中得到显著增长(p＜0.05)，这表明酶样品对乳脂肪含量具有积极影响。
在之前的在南京进行的动物试验(实施例11)中，酶样品仅显示出乳脂肪的数值的增长，但无统计学上的增长，这与此试验的结果不同。一种原因可能是在动物试验的开始，此试验中的乳脂肪含量(2.5％)低于南京农场(3.2％)。较低的乳脂肪通常更易于提高。
酶样品对乳蛋白质无显著的影响(p＞0.05)(图16)，这与之前的试验(实施例11)一致。
酶样品对SCC的影响
酶样品对SCC的影响如图17所示。
在测试期最初的15天中，未观察到统计学上的影响。但是，从第30天起，与对照相比，处理组中的SCC急剧降低(p＜0.05)。在整个测试期内，当添加酶样品时SCC显著地降低(p＜0.01)，这表明酶样品改善了泌乳乳牛的健康状况。这与之前的南京试验(实施例11)一致，其中当以1000g/T精饲料添加酶样品时，也观察到乳SCC的统计学上的降低(p＜0.05)。
结论
总而言之，在此研究中，酶样品的添加提高了泌乳性能。此研究表明酶样品在500g/吨精饲料下显著地提高产乳量(p＜0.01)和乳脂肪(p＜0.05)。对乳蛋白质无影响。SCC显著地降低(p＜0.01)表明酶样品改善了乳牛的健康状况。在此试验中，当施用酶样品时，ROI达到5.56。
实施例13
材料和方法
酶样品
在此试验中使用的酶样品是配方KAC023-19。
试验动物
根据产奶日数(DIM)和泌乳性能，从内蒙古包头市的乳牛场挑选了30只初产的泌乳的中国荷斯坦牛，平均活畜重量为520±6.44Kg，并随机地分成3组，即对照、处理1和处理2，每组10只动物。在这两个处理中，分别以500g/吨精饲料和1000g/T精饲料，将酶样品加入精饲料中。试验动物和分组的细节如表21所示。
将精饲料与青贮饲料和草料混合成全价饲料作为全混合日粮(TMR)。TMR的配料和营养素如表22所示。三组的平均饲料采食量为每头每天35Kg(新鲜的)。每天喂养两次试验动物，并且可随时无限制地供应淡水。
表21.试验设计和试验动物的信息
Figure G2008800226284D00351
表22.TMR的配料和营养素
Figure G2008800226284D00362
在由15d预处理期和30d测试期组成的为期45天的单因素实验中进行研究。
测定的参数
在整个试验期内，每天记录产乳量。每两天测定乳组成来分析脂肪、蛋白质、乳糖、非脂肪固体(NFS)。每周通过SCC计数分析器测定体细胞数(SCC)。
每天对试验动物进行目视观察，包括毛色、身体状况、发情率和采食量。
数据分析
使用统计软件SAS(v6.12，1996)通过单因素ANOVA分析数据，使用Duncan多范围检验来解析处理平均值间的差异。当p＜0.05时，平均值存在差异，并且当p＜0.01时，存在显著性差异。
结果与讨论
酶样品对产乳量的影响
整个试验期的泌乳曲线如图18所示。处理组的产乳量高于对照。
产乳量的统计结果如图19所示。与对照相比，处理1和处理2的平均产乳量分别显著地增长0.31(p＜0.01)和0.51kg/d(P＜0.05)，而在处理1和处理2之间无显著性差异(p＞0.05)。两个处理组的差异不显著。但是，与处理1相比，处理2显示出产乳量的数值的降低。这表明在500g/T的剂量下施用酶样品已达到此产品对改善产乳量的最大影响。此结论与在华东进行的试验(实施例11)一致。
酶样品对乳成分的影响
酶样品对乳脂肪的影响如图20所示。与对照相比，处理1和处理2分别在乳脂肪上表现出2.34％和4.09％的显著增长(p＜0.05)。处理2的乳脂肪高于处理1(p＜0.05)。
在之前的在南京进行的动物试验中，酶样品表现出乳脂肪的数值的增长(实施例11)。并且在辽宁进行的动物试验中，当在500g/T精饲料的剂量下用酶样品处理时，乳脂肪显著地提高(p＝0.0230)(实施例12)。这些结果证明酶样品可以提高乳脂肪的含量。
酶样品对乳蛋白质无显著性影响(p＞0.05)(图21)，这与之前的试验(实施例11和12)一致。
如图22A和22B所示，在此研究中，当以500g/t和1000g/T添加酶样品时，乳中的乳糖含量均显著地增加(p＜0.01)，这表明酶样品可能提高乳糖含量。但是，这需要更多研究来证实。
与在南京进行的试验(实施例11)一致，酶样品对NFS未表现出显著的影响(p＞0.05)。
酶样品对SCC的影响
酶样品对SCC的影响如图23所示。
与对照相比，两个处理的SCC均急剧降低(p＜0.01)，并且在两个处理之间无显著性差异。数值上的评价表明随着酶样品添加剂量的增加，SCC逐渐降低，这与在南京进行的试验(实施例11)一致。在实施例11的试验中，当分别以500g/T和1000g/T的剂量添加酶样品时，观察到数值的降低和统计学上的降低(p＜0.05)。在辽宁进行的试验中，处理(500g/T)的SCC显著地低于对照(p＜0.01)(实施例12)。基于这三个试验的结果，得出结论：施用酶样品可以降低乳中的SCC，并且提高泌乳乳牛的健康状况。
目视观察
对试验乳牛的目视观察结果如表23所示。经酶样品处理后，通过目视观察，乳牛的毛色、身体状况、繁殖和采食量得到了改善。
在此研究中，试验动物是初产的并且其机体未完全成熟。首胎的身体状况对后续胎次的生产性能非常重要。良好的身体状况意味着生产性能和繁殖性能的更好的潜力。在此研究中，经由目视观察到身体状况得到了改善，并且当添加酶样品时，体况得分(BCS)显著地提高。酶样品刺激乳牛进入发情期，这表明繁殖性能得到了改善。这些表明提高了乳牛的效率并会获得更大的收益。
表23.对试验动物目视观察的结果
Figure G2008800226284D00381
结论
总而言之，在此研究中，酶样品的添加提高了泌乳性能。此研究表明在500g/T和1000g/T精饲料的剂量下，酶样品均显著地提高了产乳量(p＜0.01)、乳脂肪(p＜0.05)和乳中的乳糖含量(p＜0.01)。对乳蛋白质无影响。SCC显著地降低(p＜0.01)，表明酶样品改善了乳牛的健康状况。在此试验中，当分别以500g/T和1000g/T施用酶样品时，ROI达到2.88和1.76。经酶样品处理后，通过目视观察到身体状况和繁殖得到了改善。
前述说明书和图表包括本发明的说明性实施方案。本文所述的前述实施方案和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好发生变化。仅仅以某种顺序列出所述方法的步骤并不对所述方法步骤的顺序作出任何限制。前述说明书和图表仅仅解释和说明本发明，并且本发明并不限于它们，除非权利要求这样限定。拥有本公开的本领域的技术人员能够对其进行修改和变化而不脱离本发明范围。

Claims (5)

1.改善反刍动物的草料饲料的消化率的方法，其包括以下步骤：
(a)从苜蓿、羊草、玉米青贮、秸秆青贮、玉米秸秆、黑麦草和全混合日粮中选择草料；
(b)用酶产品处理所述草料，所述酶产品具有纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶活性；和
(c)使经处理的草料保持在所述酶产品还原草料中碳水化合物的条件下；
2.权利要求1的方法，其中所述酶产品以提供下述酶活性的量存在：约200至约800单位每克之间的纤维素酶活性，约750至约3000单位每克之间的木聚糖酶活性，约225至约890单位每克之间的β-葡聚糖酶活性，约1至约100单位每克之间的果胶酶活性，约50至约800单位每克之间的β-甘露聚糖酶活性，和约1至约100单位每克之间的α-半乳糖苷酶活性。
3.权利要求2所述的方法，其中所述酶产品以提供下述酶活性的量存在：约200至约600单位每克之间的纤维素酶活性，约750至约2250单位每克之间的木聚糖酶活性，约225至约625单位每克之间的β-葡聚糖酶活性，约1至约5单位每克之间的果胶酶活性，约100至约300单位每克之间的β-甘露聚糖酶活性，和约1至约5单位每克之间的α-半乳糖苷酶活性。
4.权利要求1所述的方法，其中所述酶产品以提供约125克至约2000克每吨草料之间的量存在。
5.改善反刍动物生产力的方法，其包括用权利要求1所述的经处理的草料喂养反刍动物的步骤。
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