NO314562B1 - Enzymbasert fôradditiv, samt fôr inneholdende dette - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et enzymbasert foradditiv, og spesielt et slikt additiv som kan minke foromsetningsgraden av et cerealbasert får og/eller øke dets fordøybar-het.

Det blir stadig søkt etter forbedringer i dyref6r for å gjøre det mulig for dyrene å fordøye dem mer effektivt. Et hovedanliggende er å forbedre fåromsetningsgraden (FCR) av et for uten å øke dets kostnad pr. vektenhet. FCR er mengden for som er fortært i forhold til vektøkningen hos et dyr. En lav FCR indikerer at en gitt mengde for resulterer i et voksende dyr som øker proposjonalt i vekt. Dette betyr at dyret er i stand til å utnytte fåret mer effektivt. En måte å forbedre FCR av et for på er å øke dets fordøybar-het.

Det finnes forskjellige begrensninger når det gjelder for-døybarheten av næringskomponenter av et for, så som dets stivelses-, fett-, protein- og aminosyreinnhold. Disse begrensninger innbefatter: (1) viskositeten av materialer som er til stede i dyrets tarm. Slik viskositet finnes, i det minste delvis, på grunn av oppløselige, ikke-stivelses polysakkarider så som p-glukaner og arabinoxylaner med blandede bindinger; (2) innesluttelse av næringsstoffer i celleveggene i fåret, spesielt næringsstoffene av aleuronlaget i cerealer. Slik innesluttelse er forårsaket av høye nivåer av ikke-stivelses-polysakkarider i celleveggene i cerealer som er relativt motstandsdyktige mot nedbrytning av dyrets fordøyelsessystem. Dette forhindrer næringsmidlene som er innesluttet i cellene fra å bli ernæringsmessig tilgjengelige for dyret; og (3) en mangel på endogen enzymaktivitet både hos dyret og den mikrobielle populasjon i tarmen, spesielt hos unge dyr.

De ovennevnte problemer, som innvirker på fordøybarheten, er spesielt merkbare i tilfeller med cerealbaserte matva-rer, spesielt de som har et høyt bygginnhold.

Grunnet problemet med dårlig fordøybarhet av næringsmidler fra f&ret er det normalt nødvendig at f6ret er sammensatt slik at det inneholder høyere nivåer av energigivende materialer for å tilfredsstille dyrets næringsmessige krav. Slike energigivende materialer innbefatter konvensjonelt stivelse, fett, sukkere, fiber osv. Nødvendigheten av å inkludere disse energigivende materialer eller kilder for slike materialer i et f6r legger vesentlig ekstra omkostninger på dette, noe som er en ulempe fra et økonomisk synspunkt.

I et forsøk på å løse dette problem med dårlig fordøybarhet av cereal-baserte fårtyper er det kjent å innbefatte enzymtillegg, så som p-glukanaser eller xylanaser i dyrefor. For eksempel beskriver WO 91/04673 et foradditiv for å lette mal-absorbsjonssyndromet hos fjærfe, som forårsaker redusert fordøyelse. Additivet innbefatter en cellulase og en xylanase. JP-A-60-75238 beskriver et f6r for husdyr som inneholder en enzymblanding innbefattende protease-, cellulase-, amylase- og lipaseaktiviteter. Dette dokument antyder at disse forskjellige enzymaktiviteter tillater fermen-teringsmikrober å vokse og at disse blir nyttige ernæringsmessige komponenter i fåret.

Hel cellulase er en blanding av forskjellige enzymer som samvirker for å hydrolysere cellulose (fi-1,4-D-glukan-bindinger) og/eller derivater derav (f.eks. fosforsyresvellet cellulose) og gir som primære produktforbindelser eksempelvis glukose, cellobiose og cellooligosakkarider. Hel cellulase er laget av mange forskjellige enzymklasser, innbefattende enzymer som har exo-cellobiohydrolase-aktivitet, endoglukanaseaktivitet og p-glukosidaseaktivitet.

For eksempel omfatter helcellulasen dannet av soppen Trichoderma longibrachiatum to exo-cellobiohydrolaser, CBHI og CBHII, mist tre endoglukanaser, EGI, EGII og EGIII, og minst én B-glukosidase. En representativ fermentering fra T. longibrachiatum kan danne en helcellulase innbefattende pr. proteinvekt 45-55% CBHI, 13-15% CBHII, 11-13% EGI, 8-10% EGII, 1-4% EGIII og 0,5-1% BG. Imidlertid bør det bemerkes at faktiske konsentrasjoner av en spesifikk cellu-lasekomponent vil variere i henhold til flere faktorer, innbefattende fermenteringsbetingelser, substratkonsentra-sjoner og stammetype. I en representativ fermentering danner Trichoderma longibrachiatum således en helcellulase som har fra 58-70% cellobiohydrolaser.

Hver endoglukanase fra T. longibrachiatum har sine egne distinkte karakteristika. Således er EGI i tillegg til cellulaseaktivitet kjent for å hydrolysere xylan. EGII og EGIII viser ved sammenligning ikke signifikant xylanaseaktivitet, i det minste i henhold til azo-xylan nativt PAGE overlegg. Videre er det kjent at EGI, EGII og EGV inneholder strukturelt distinkte cellulosebindende domener (CBD). På den annen side synes EGIII ikke å inneholde et strukturelt distinkt bindingsdomene og har blitt påvist å ha lavere affinitet for krystallinsk cellulose enn EGI og

EGII.

WO 92/06209 beskriver prosesser for å transformere den filamentøse sopp Trichoderma reesei (nå kalt " T. longibrachiatum") , som involverer trinnene å behandle en r. reesei-stamme med i hovedsak monologt lineært rekombinant DNA for å muliggjøre homolog transformasjon og så velge ut de resulterende T. reesei-transformanter. For eksempel er det beskrevet transformanter hvor visse målrettede gener er utelatt eller ødelagt innen genomet, og ekstra kopier av visse native gener, så som de som koder for EGI og EGII, er homologt rekombinert i stammen. Man bør merke seg i denne henvisning at cellulaseblandinger dannet fra stammer som er defisiente i CBHI- og CBHII-komponenter, er anvendelige som komponenter av en rensende detergentblanding. Slike cellulaseblandinger er selvfølgelig relativt anriket.

Når de brukes in vivo, er endoglukanaser og cellobiohydrolaser regnet for å virke synergistisk ved hydrolysen av cellulose til mindre cello-oligosakkarider (i hovedsak cellobiose), som deretter hydrolyseres til glukose ved virkningen av p-glukosidase. I tillegg til å hydrolysere S-1,4-bindinger i cellulose vil endo-1,4-S-glukonase (EC 3.2.1.4) også hydrolysere 1,4-bindinger i p-glukaner også inneholdende 1,3-bindinger. Endoglukanasene virker på interne bindinger for å danne cellobiose, glukose og cello-oligosakkarider. Cellobiohydrolasene virker på kjedeendene av cellulosepolymerer for å danne cellobiose som hovedpro-duktet .

Hel cellulase dannet fra T. longibrachiatum har blitt benyttet i kombinasjon med bygg på områder så som brygging og i animalsk ernæring i mange år. En av fordelene med å tilsette cellulaser til byggbaserte dietter for husdyrbe-setninger, er å øke fordøybarheten av forskjellige komponenter som er tilstede i dietten, innbefattende protein og aminosyrer. Resultatet er at omkostninger for for kan reduseres uten tap av virkningsgrad, og ekskresjon av nitrogen i gjødselen kan bli vesentlig redusert. Dette reduserer innvirkningen på miljøet ved intensivt husdyrhold. Endospermium-cellevegger fra bygg inneholder en høy andel høymolekylvekts vannoppløselige p-(l,3)(1,4)-glukaner med blandede bindinger. Når de oppløses, forårsaker disse polysakkarider en økning i oppløsningens viskositet. For eksempel, dersom bygg blir matet til broilerkyllinger, fører dette til et relativt høyt nivå av viskositet i om-rådet omkring deres mage-tarm-kanal, noe som resulterer i redusert fordøyelseseffektivitet og forsinket vekst.

Organismer som danner eller uttrykker cellulaseenzymkom-plekser, uttrykker ofte også xylanaseaktivitet. For eksempel har to forskjellige xylanaseenzymer dannet av T. longibrachiatum blitt identifisert. Rensing av disse to forskjellige xylanaser, én referert til som høy PI xylanase (med en PI på omkring 9,0) og den andre referert til som lav PI xylanase {med en PI på omkring 5,2), så som som kloningen og sekvenseringen av genet for hver xylanase, er beskrevet i detalj i WO 92/06209 og WO 93/24621. Figur 16 i denne søknad angir de utledede aminosyresekvenser for både lav-PI og høy-PI genproduktene. Eksempel 22 angir også hvordan T\ longiJbracM a cfum-st ammer dannes som overuttrykker lav PI og høy PI xylanasegenene.

Som nevnt ovenfor er bruken av cellulaser som et additiv til dyrefor kjent innen faget. Slike cellulaser har selv-følgelig en naturlig balanse mellom sine cellobiohydrolase-og endoglukanase-innhold. Som nevnt ovenfor, i naturlig forekommende stammer av T. longibrachiatum kan CBH omfatte 58-70 vekt% av celluloseproteinene.

Foreliggende oppfinnelse er basert på en studie for å identifisere hvilke komponenter av cellulaseproteinene som er istand til å forbedre de ernæringsmessige fortrinn ved cereal-baserte f6r, så som de innbefattende bygg. Spesiell oppmerksomhet har blitt viet effektene av de enkelte enzymer som utgjør helcellulase, og spesielt endoglukanasene, på viskositetsreduksjon av opppløselig p-(l,3)(l,4)-gluka~ ner med blandede bindinger fra bygg. Dette er fordi det er kjent at dette er en av hovedvirkningsmåtene for helcellulase. Foreliggende fremgangsmåte har blitt dannet som et reultat av denne forskning for å identifisere de komponenter av cellulaseenzymsysternet og deres relative mengder, som fordelaktig forbedrer foromsetningsgraden (FCR) av et cereal-basert f6r og/eller økning av dets fordøybarhet.

I beskrivelsen og kravene som følger blir de følgende defi-nisjoner av enkelte tekniske uttrykk benyttet.

"Fungal cellulase" betyr en enzymblanding avledet fra fungale kilder eller mikroorganismer som genetisk er modifisert til å innbefatte og uttrykke alt eller deler av cellulasegenene fremstilt fra en fungal kilde.

Uttrykket " Trichoderma" refererer til enhver soppstamme som er eller tidligere har blitt klassifisert som Trichoderma eller som for tiden klassifiseres som Trichoderma. Slike arter innbefatter Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei og Trichoderma viride.

Uttrykket "EG" refererer til enhver endoglukanase, f.eks. EGI, EGI, EGIII eller EGV, dannet av T. longibrachiatum, eller ethvert derivat av enhver slik endoglukanase som har endoglukanaseaktivitet.

Et EG "derivat" innbefatter f.eks. EGI, EGII, EGIII og EGV fra Trichoderma, hvor det finnes et tillegg av en eller flere aminosyrer til en eller begge av de C- og N-terminale ender av EG, en substitusjon av en eller flere aminosyrer ved ett eller flere områder gjennom hele EG, en fjerning av en eller flere aminosyrer innen eller ved en eller begge ender av EG, eller en innsetning av en eller flere aminosyrer ved et eller flere områder i EG, slik at endoglukanaseaktivitet blir opprettholdt i det derivatiserte EG. Uttrykket EG-"derivat" innbefatter også kjernedomenene av endo-glukanaseenzymene som har festet til seg en eller flere aminosyrer fra linkerområdene.

Uttrykket "avkortet cellulase" som anvendt heri refererer til et protein omfattende en avkortet cellulasekjerne av exo-cellobiohydrolase endoglukanase, f.eks. EGI, EGII, EGV, CBHI og CBHIII, eller derivater av hvilket som helst av disse. EGV er beskrevet i Molecular Microbiology, vol. 13, nr. 2 (1994) på side 219-228. Som angitt ovenfor, er mange cellulaseenzymer, så som EGI, EGII og EGV, antatt å være bifunksjonelle ved at de inneholder områder eller domener som er rettet mot både katalytisk eller hydrolytisk aktivitet når de gjelder cellulosesubstratet, og også mot ikke-katalytisk cellulosebindende aktivitet. Således er en avkortet cellulase en cellulase som mangler bindingsdomene cellulosebindende aktivitet.

Det er antatt at den katalytiske kjerne og det cellulosebindende domene av et celluloseenzym virker sammen på synergistisk måte for å utføre effektiv hydrolyse av cellu-losefibre i et celluloseinneholdende f6r. Det er videre antatt katalytisk cellulaseaktivitet, og cellulosebindende aktivitet identifiseres som spesifikk for distinkte strukturelle områder eller kan være tilstede i det samme strukturelle område. Som angitt ovenfor, er f.eks. mange cellulaseenzymer, innbefattende dem fra T. longibrachiatum kjent for å inkorporere en katalytisk kjernedomene-subenhet som via et linkerområde er festet til en cellulosebindende domene subenhet. Imidlertid er andre cellulaseenzymer antatt å ha et katalytisk kjernedomene som strukturelt er integralt med et cellulosebindende domene, eksempelvis er de to områder ikke adskilt med en linker og representerer ikke distinkte strukturerelle enheter. Det er antatt at i et slikt cellulaseenzym kan et spesifikt peptid eller en gruppe av relaterte aminosyre-residuer være ansvarlige for den cellulosebindende aktivitet. Følgelig er det innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse at et slikt bindende domene kan bli endret til å redusere den cellulosebindende aktivitet av cellulasen ved f.eks. genetisk manipulering eller kjemisk modifikasjon.

Et "avkortet cellulasederivat" omfatter en avkortet cellulasekjerne som definert heri, hvor det kan være en addisjon eller delesjon av en eller flere aminosyrer til den ene eller til både den C-terminale og den N-terminale ende av den avkortede cellulase, eller en substitusjon, en innsetning eller en delesjon av en eller flere aminosyrer ved et eller flere områder gjennom hele den avkortede cellulase.

Derivater er tolket til å innbefatte mutanter som opprett-holder sin karakter som avkortet cellulasekjerne, som definert nedenfor. Det er også ment at uttrykket "derivat av en avkortet cellulase" innbefatter kjernedomener av exo-glukanase- eller endoglukanase-enzymene som har festet til seg en eller flere aminosyrer fra linkerområdene.

Et avkortet cellulasederivat refererer videre til et protein som i hovedsak er likt i struktur og biologisk aktivitet med et avkortet cellulase-kjernedomeneprotein, men som har blitt genetisk manipulert til å inneholde en modifisert aminosyresekvens. Således, forutsatt at de to proteiner har lik aktivitet, er de betraktet som "derivater" slik som uttrykket er benyttet heri, selv om primærstrukturen av ett protein ikke har identisk aminosyresekvens med den funnet i det andre.

Det er antatt at et avkortet cellulasederivat kan være avledet fra et DNA-fragment som koder for et avkortet katalytisk kjernedomene og som ytterligere inneholder et tillegg på én eller flere nukleotider internt eller ved den 5' eller 3' ende av DNA-fragmentet, en delesjon av én eller flere nukleotider internt eller ved 5' eller 3<1> ende av DNA-fragmentet, eller en substitusjon av én eller flere nukleotider internt eller ved 5' eller 3' ende av DNA-fragmentent hvor den funksjonelle aktivitet av det katalytiske kjernedomene (avkortet cellulasederivat) er opprettholdt. Et slikt DNA-fragment ("variant DNA-fragment") omfattende en cellulase katalytisk kjerne kan ytterligere innbefatte en linker- eller hengsel-DNA-sekvens eller del derav som er festet til kjernen eller den bindende kjeme-DNA-sekvens ved enten den 5' eller 3' ende hvor den funksjonelle aktivitet av det kodede avkortede cellulasedomene (avkortet cellulasederivat) er opprettholdt.

Uttrykket "avkortet cellulasekjerne" eller "avkortet cellulase-område" refererer heri til et peptid omfattende det katalytiske kjernedomene eller område av exo-cellobiohydrolase eller endoglukaner, f.eks. EGI, EGII eller EGIII, eller et derivat derav som er i stand til enzymatisk å spalte cellulosepolymerer, innbefattende, men ikke begrenset til, tremasse eller fosforsyresvellet cellulose. Imidlertid vil en avkortet cellulasekjerne ikke ha cellulosebindende aktiviteter som kan tilskrives et cellulosebindende domene eller område. En avkortet cellulasekjerne er forskjellig fra en ikke-avkortet cellulase, som i intakt form ikke har noe cellulsebindende domene eller område. En avkortet cellulase-kjerne kan innbefatte andre enheter som ikke inkluderer cellulosebindende aktivitet som kan tilskrives et cellulosebindende domene eller område. F.eks. er tilstedeværelsen av en linker eller hengsel spesielt påtenkt. På lignende måte er kovalent binding av en annen enzymatisk enhet til den avkortede cellulasekjerne også spesielt påtenkt.

Effekten (eller aktiviteten) av et protein inneholdende en avkortet katalytisk kjerne eller et derivat derav kan bestemmes ved metoder som er velkjente innen faget. (Se Wood, T.M. et al. i Methods in Enzymology, vol. 160, Red: Wood, W.A. og Kellogg, S.T., Academic Press, s. 87-116, 1988). For eksempel kan slike aktiviteter bli bestemt ved hydrolyse av forsforsyresvellet cellulose og/eller oppløse-lige oligosakkarider, fulgt av mengdebestemmelse av de fri-gjorte reduserende sukkere. I dette tilfelle kan de opplø-selige sukkerprodukter frigjort ved virkningen av cellobiohydrolase eller endoglukanase cellulasekjernedomener eller derivater derav bli bestemt ved HPLC-analyse eller ved å bruke kolorimetriske assays for å måle reduserende sukkere. Det er ventet at disse katalytiske domener eller derivater derav vil opprettholde minst 10% av aktiviteten oppvist av det intakte enzym når hvert av dem blir undersøkt under like betingelser og basert på like mengder av katalytisk domene-protein.

Uttrykket "cellulosebindende domene" refererer heri til en aminosyresekvens av endoglukanasen omfattende det bindende domene av en endoglukanase, f.eks. EGI elller EGII, som binder ikke-kovalent til et polysakkarid, så som cellulose. Det er antatt at cellulosebindende domener (CBD) virker uavhengig av den katalytiske kjerne av endoglukanaseenzymet til å feste proteinet til cellulosen. Avkortede endoglukanaser benyttet i foreliggende oppfinnelse mangler CBD, men innbefatter minst kjernen eller det katalytiske domene.

Uttrykket "linkerområde" eller "hengselområde" refererer til det korte peptidområde som binder sammen de to distinkte funksjonelle områder av de fungale endoglukanaser, dvs. kjérnedomenet og det bindende domene. Disse domener i T. longibrachiatum er bundet med et peptid som er rikt på Ser, Thr og Pro.

En "signalsekvens" refererer til enhver sekvens av aminosyrer som er bundet til den N-terminale del av et protein som letter utskillelsen av den ferdigutviklede form av proteinet utenfor cellen. Denne definisjon av en signalsekvens er funksjonell. Den ferdigutviklede form av det ekstracellu-lære protein mangler signalsekvensen, som blir spaltet fra i løpet av sekresjonsprosessen.

Uttrykket "vertscelle" betyr både cellene og protoplastene dannet fra cellene av Trichoderma.

Uttrykket "DNA-konstrukt eller vektor" (benyttet om hveran-dre heri) refererer til en vektor som omfatter ett eller flere DNA-fragmenter eller DNA-variante fragmenter som koder for enhver av de avkortede endoglukanaser eller derivater beskrevet ovenfor.

Uttrykket "funsjonelt bundet til" betyr at et regulatorisk område, så som en promoter, terminator, sekresjonssignal eller forsterkerområde, er festet til et strukturelt gen og kontrollererer ekspresjonen av dette gen.

Uttrykket "hel cellulase" betyr det fullstendige cellulase-system som dannet av en naturlig forekommende mikroorganisme .

Basert på de ovennevnte betraktninger er det et mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe enzymbaserte f6raddi-tiver som forbedrer FCR og/eller øker fordøybarheten av cereal-baserte for.

I henhold til et aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse anvendelse av en blanding så som et foradditiv som omfatter en eller flere endoglukanaser, som angitt i krav l's karakteriserende del og 0,20 vekt%, basert på innholdet av cellulaseproteiner i blandingen, av en cellobiohydrolase.

Som nevnt ovenfor, inneholder helcellulase fra T. longibrachiatum, (dvs. stammer som opptrer naturlig), typisk 58-70 vekt% cellobiohydrolaser eller mer, basert på den totale vekt av enzymer som har cellulaseaktivitet. Blandingen for bruk som et f6radditiv, fremskaffet ved foreliggende oppfinnelse, kan dannes ved å anrike innholdet av endoglukanaser dannet av en egnet mikroorganisme via opprensning, tillegg av renset endoglukanase eller ved å tilsette ytterligere gener for å overprodusere endoglukanase. I tillegg, eller alternativt, kan det relative innhold av cellobiohydrolaser dannet av bioorganismen minskes sammenlignet med helcellulasen, via opprensingsprosedyrer eller ved å modifisere eller fjerne de gener som koder for cellobiohydrolase. Det er spesielt foretrukket at foradditivet må være fritt for cellobiohydrolaser, slik at deres innhold i additivet er 0 vekt%.

I et annet aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse et enzymbasert foradditiv som omfatter minst enten EGIII, EGI som mangler cellulosebindende domene og EGII som mangler cellolosebindende domene, og 0-20 vekt% av en cellobiohydrolase, basert på innholdet av cellulaseproteiner i additivet.

Produksjonen av slike strukturelt modifiserte endoglukanaser ved genetiske manipuleringsteknikker er beskrevet i detalj nedenfor.

I et tredje aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse et enzymbasert f6radditiv omfattende et cereal-basert bæremateriale, en eller flere endoglukanaser og 0-2 0 vekt% av en cellobiohydrolase, basert på innholdet av cellulaseproteiner i additivet. I et slikt additiv kan det cereal-baserte bæremateriale være oppmalt hvete, mais eller oppmalt soya. Videre kan bærematerialet være et biprodukt av ethvert av disse materialer.

Endoglukanaser som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse innbefatter dem avledet fra bakterielle kilder, f.eks. Bacillus sp., innbefattende Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Clostridium sp., innbefattende Clostri- d-ium thermocellum og Clostridium cellulovorans. Alternativt er fungale kilder for cellulase hensiktsmessige. Passende fungale kilder innbefatter Trichoderma sp., Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Myceliophthora sp., Phanerochaete sp,. Schizophyllum sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Geotricum sp., Fusarium sp., Fusarium oxysporum, Humicola sp., Humicola insolens, og Mucor sp., innbefattende Mucor miehei.

Endoglukanasetype-komponenter behøver ikke innbefatte komponenter som tradisjonelt er klassifisert som endoglukanaser ved å bruke aktivitetstester, så som komponentens evne til å (a) hydrolysere oppløselige cellulosederivater, så som karboksymetylcellulose (CMC) for derved å redusere viskositeten av CMS-inneholdende oppløsninger, (b) til lett å hydrolysere hydrerte former av cellulose, så som fosforsyresvellet cellulose (f.eks. Walseth-cellulose) og mindre lett å hydrolysere de mer krystallinske former av cellulose (f.eks. Avicel, Solkafloc osv.). På den annen side er det antatt at ikke alle endoglukanasekomponenter som definert ved slike aktivitetstester vil øke næringsverdien i f6ret. Følgelig er det mer nøyaktig for formålet heri å definere endoglukanasetype-komponenter som de enzymer som forøker forets næringsmessige egenskaper, sammenlignet med dem som innehas av endoglukanasekomponentene hos Trichoderma longibrachiatum.

Fungale cellulaser kan inneholde mer enn én endoglukanasetype-komponent. De forskjellige komponenter har generelt forskjellige isoelektriske punkter, forskjellige molekyl-vekter, forskjellige grader av glykosylering, forskjellige substratspesifisiteter, forskjellige enzymatiske virknings-mønstre osv. De forskjellige isoelektriske punkter av kom-ponentene tillater deres separasjon via ionebytterkroma-tografi og lignende. Faktisk er isolering av komponenter fra de forskjellige kilder kjent innen faget. Se f.eks. Bjork et al., U.S. patent 5.120.463; Schulein et al., internasjonal søknad WO 89/09259; Wood et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, s. 31-52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research, vol. 190, s. 279-297

(1989) og Schulein, Methods in Enzymology, vol. 160, s. 234-242 (1988). Hele beskrivelsen av hver av disse referan-ser er innbefattet heri pr. referanse.

Uttrykket "EGI cellulase" refererer til endoglukanasekomponenten avledet fra Trichoderma longibrachiatum spp. og som er særpreget ved et pH-optimum på omkring 4,0 til 6,0, et isoelektrisk punkt (pl) på fra omkring 4,5 til 4,7 og en molekylvekt på omkring 47 til 49 Kdalton. Fortrinnsvis er EGI cellulase avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum

eller fra Trichoderma viride. EGI cellulase avledet fra Trichoderma longibrachiatum har et pH-optimum på 5,0, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 4,7 og en molekylvekt på omkring 47 til 4 9 Kdalton. EGI cellulase avledet fra Trichoderma viride har et pH-optimum på omkring 5,0, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 5,3 og en molekylvekt på omkring 50 Kdalton.

Det skal bemerkes at EGII tidligere har blitt referert til som "EGIII" av enkelte forfattere, men nåværende nomenkla-tur benytter uttrykket EGII. I alle fall er EGII-proteinet vesentlig forskjellig fra EGIII-proteinet i sin molekylvekt, sitt pl og sitt pH-optimum. Uttryket "EGII cellulase" refererer til endoglukanasekomponenten avledet fra Trichoderma spp. særpreget ved et pH-optimum på omkring 4,0 til 6,0, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 5,5 og en mole-kyl vekt på omkring 35 Kdalton. Fortrinnsvis er EGII cellulase avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum eller fra Trichoderma viride.

Uttrykket "EGIII cellulase" refererer til endoglukanasekomponenten avledet fra Trichoderma spp. og som er særpreget ved et pH-optimum på omkring 5,0 til 7,0, et isoelektrisk punkt (pl) fra omkring 7,2 til 8,0 og en molekylvekt omkring 25 til 28 Kdalton. Fortrinnsvis er EGIII cellulase avledet fra enten Trichoderma longibrachiatum eller fra Trichoderma viride EGIII cellulase avledet fra Trichoderma longibrachiatum har et pH-optimum på omkring 5,5 til 6,0, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 7,4 og en molekylvekt på omkring 25 til 28 Kdalton. EGIII cellulase avledet fra Trichoderma viride har et pH-optimum på omkring 5,5, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 7,7 og en molekylvekt på omkring 23,5 Kdalton.

"Exo-cellobiohydrolasetype-komponenter" ("CBH-type-komponenter") refererer til alle de cellulasekomponenter som oppviser lignende foraktivitets-egenskaper som CBHI og CBHII av Trichoderma longibrachiatum. I dette henseende, når de benyttes i kombinasjon med EG-type komponenter, reduserer CBHI- og CBHII-type komponenter (som definert ovenfor) effektiviteten av et cellulasesupplement for animalsk f6r med hensyn til f6romsetningsgrad og/eller forfor-døyelighet.

Slike exo-cellobiohydrolasetype-komponenter behøver ikke innbefatte komponenter som tradisjonelt klassifiseres som exo-cellobiohydrolaser vinder anvendelse av aktivitetstester som dem benyttet for å karakterisere CBHI og CBHII fra Trichoderma longibrachiatum. For eksempel er slike komponenter (a) kompetitivt inhibert av cellobiose (K. omkring ImM) ,* (b) ute av stand til å hydrolysere substituerte celluloser, så som karboksymetylcellulose osv. i noen vesentlig grad, og (c) hydrolysere fosforsyresvellet cellulose og i mindre grad krystallinsk cellulose. På den annen side er det antatt at enkelte cellulasekomponenter som er karakterisert som CBH-komponenter i slike aktivitetstester vil øke næringsverdien av slike formaterialer. Følgelig er det antatt å være mer nøyaktig for formålene heri å definere exo-cellobiohydrolaser som EG-type komponenter, fordi disse komponenter har lignende funksjonelle egenskaper ved animalsk bruk sammenlignet med egenskapene for endoglukanasekomponentene fra Trichoderma longibrachiatum.

"P-glukosidase (BG)-komponenter" refererer til de komponenter av cellulase som oppviser BG-aktivitet; dvs. at slike komponenter vil virke fra den ikke-reduserende ende av cellobiose og andre oppløselige cellooligosakkarider ("cellobiose") for å gi glukose som eneste produkt. BG-komponenter adsorberer ikke på og reagerer ikke med cellulosepolymerer. Ytterligere blir slike BG-komponenter kompetitivt hemmet av glukose (Kx omtrent ImM) . Selv om begge komponenter strengt tatt ikke bokstavelig talt er cellulaser fordi de ikke kan bryte ned cellulose, er slike BG-komponenter inkludert i definisjonen av cellulasesystemet fordi disse enzymer letter total nedbrytning av cellulose ved ytterligere å bryte ned de inhibitoriske cellulosened-brytningsprodukter (spesielt cellobiose dannet ved den kombinerte virkning av CBH-komponenter og EG-komponenter). Uten tilstedeværelse av BG-komponenter vil moderat eller

liten hydrolyse av krystallinsk cellulose inntreffe. BG-komponenter blir ofte karakterisert under anvendelse av arylsubstrater så som p-nitrofenol-B-D-glukosid (PBPG), og blir således ofte kalt arylglukosidaser. Det bør bemerkes at ikke alle arylglukosidaser er BG-komponenter, da enkelte ikke hydrolyserer cellobiose.

Det er påtenkt at nærvær eller fravær av BG-komponenter i cellulaseblandingen kan brukes for å regulere aktiviteten av alle CBH-komponenter i blandingen. Spesielt, fordi cellobiose blir dannet under cellulosenedbrytning av CBH-komponenter og fordi høye konsentrasjoner av cellobiose er kjent for å inhibere CBH-aktivitet, og ytterligere fordi slik cellobiose hydrolyseres til glukose av BG-komponenter, vil fravær av BG-komponenter i cellulaseblandingen "slå av" CBH-aktivitet når konsentrasjonen av cellobiose når inhibitoriske nivåer. Det er også påtenkt at ett eller flere additiver (f.eks. cellobiose, glukose osv.) kan bli tilsatt til cellulaseblandingen for effektivt å "slå av", direkte eller indirekte, noe eller hele CBHI-aktiviteten så som som annen CBH-aktivitet. Når slike additiver blir anvendt, blir den resulterende blanding betraktet som å være en blanding egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse dersom mengden av additiv er tilstrekkelig til å senke CBH-type aktiviteten til nivåer som er lik eller mindre enn CBH-type aktivitets-nivåene oppnådd ved å bruke cellulaseblandingene beskrevet heri.

På den annen side kan en cellulaseblanding inneholdende tilsatte mengder BG-komponenter øke total hydrolyse av cellulose dersom nivået av cellobiose dannet av CBH-kompo-nentene blir restriktivt for slik total hydrolyse i fravær av tilsatte BG-komponenter.

Metoder for enten å øke eller senke mengden av BG-komponenter i cellulaseblandignen er beskrevet i U.S. serienummer 07/807.028 innlevert 10. desember 1991, som er en del-fortsettelse av U.S. serienummer 07/625.140, innlevert 10. desember 1990 (tilsvarende EP-A-0 562 003), hvorav alle er innbefattet heri pr. referanse i sin helhet.

Fungale cellulaser kan inneholde mer enn én BG-komponent. De forskjellige komponenter har generelt forskjellige isoelektriske punkter, noe som gjør det mulig å separere dem ved hjelp av ionebytterkrornatografi og lignende. Enten en enkelt BG-komponent eller en kombinasjon av BG-komponenter kan anvendes.

I en foretrukket utførelsesform er endoglukanasekomponentene som er egnet for bruk i foreliggende oppfinnelse, slike som oppviser egenskaper lignende dem som kan frem-skaffes fra Trichoderma longibrachiatum, dvs. EGI, EGII og EGIII. Således refererer uttrykket "EG-type komponenter" til alle disse cellulasekomponenter eller kombinasjoner av komponenter som gir forbedrede egenskaper til forprodukter på en måte som er lik endoglukanasekomponentene fra Trichoderma longibrachiatum. I dette henseeende gir endoglukanasekomponentene fra Trichoderma longibrachiatum (spesielt EGI, EGII, EGIII og lignende, enten alene eller i kombinasjon) karakteristika så som forbedret foromsetningsgrad, redusert tarmviskositet og forbedret animalsk vektøkning av dyr matet med korn behandlet med slike, sammenlignet med ubehandlet for eller for behandlet med hel cellulase. Metoder for fremstilling av EGI, EGII og EGIII er beskrevet i detalj i WO 92/06209.

Det er mulig at andre komponenter enn CBH-type komponenter som er tilstede i helcellulaseblandingen kan forårsake uønsket tarmviskositet, økning i foromsetningsgrad og minket vektøkning hos dyret. Følgelig er det påtenkt at bruken av anrikede endoglukanaser, så som EGI, EGII eller EGIII, kan eliminere enkelte eller alle problemer som oppstår når helcellulase blir brukt.

Det er blitt funnet at innbefattelsen av et endoglukanase-anriket foradditiv i en cereal-basert diett for et dyr gjør det mulig at dyret fordøyer dietten mer effektivt. Dette er spesielt tilfelle i cereal-baserte formaterialer, innbefattende bygg, hvor tilstedeværelsen av ovennevnte foradditiv forbedret foromsetningsgraden og/eller øker fordøybarheten av det cereal-baserte for. Cereal-baserte formaterialer innbefatter vanligvis minst 25 vekt% cerealer og fortrinnsvis minst 35 vekt%. I tillegg til eller i stedet for bygg cerealet innbefatte en eller flere av hvete, triticale, rug og mais.

De endoglukanaseanrikede foradditiver fremskaffet ved foreliggende oppfinnelse gjør det også mulig å modifisere et konvensjonelt cereal-basert f6r ved å redusere dets energi-og/eller protein- og/eller aminosyreinnhold mens samtidig næringsnivået av energi, protein og aminosyrer tilgjengelige for dyret blir opprettholdt. Dette betyr at mengdene av kostbare energi- og proteinsupplementer som konvensjonelt inneholdes i et dyrefår, kan reduseres sammenlignet med konvensjonelle får. Energitilskudd innbefatter fett. Proteintilskudd innbefatter fiskemel, hvetemel, soyabønne, rapsfrø eller canola. Dette resulterer i en signifikant reduksjon i kostnad pr. vektenhet av dyrefåret uten å minske dets ernæringsmessige verdi. Alternativt eller også i tillegg, kan mengden av tilsatte aminosyrer bli redusert, sammenlignet med konvensjonelle formaterialer, noe som også kan resultere i vesentlige kostnadsbesparelser. Enzymforadditivet i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en mengde måter. For eksempel kan det bli fremstilt ved ganske enkelt å blande enzymer som har de passende aktiviteter for å danne en enzymblanding. Denne enzymblanding kan enten bli blandet direkte med et fårmate-riale eller mer konvensjonelt impregneres på et cerealbasert bæremateriale, så som kvernet hvete, mais eller soya-mel. Et biprodukt av ethvert av disse produkter kan også brukes. Et slikt impregnert bæremateriale utgjør et enzym-foradditiv i henhold til det tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse.

Som et alternativ kan et cereal-basert bæremateriale av f.eks. kvernet hvete eller mais bli impregnert enten samtidig eller sekvensielt med enzymer som har de passende aktiviteter. For eksempel kan et kvernet hvete-bæremateriale sprayes med en eller flere av endonukleasene. Andre enzymer kan også bli innbefattet etter behov. Bærematerialet impregnert med disse enzymer utgjør også et enzymfor-additiv i samsvar med det tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse.

F6radditivet fremstilt i foreliggende oppfinnelse kan bli blandet direkte med dyref6ret, så som ett omfattende bygg,

for å fremstille det endelige formateriale. Alternativt kan foradditivet bli blandet med ett eller flere andre foradditiver, så som et vitaminforadditiv, et mineralforadditiv og et aminosyreforadditiv. De resulterende foradditiver inneholdende flere forskjellige typer komponenter kan så bli blandet med foret i en passende mengde.

Det resulterende cereal-baserte for omfatter fortrinnsvis 0,000001-0,1 g/kg av totale endoglukanaser, mer foretrukket 0,00001-0,01 g/kg og mest foretrukket 0,0001-0,001 g/kg. Endoglukanasene for bruk i foradditivet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dannet ved å dyrke en sopp, så som en naturlig forekommende stamme av Trichoderma. Således kan soppen bli dyrket, hvoretter den blir fjernet fra mediet. Cellulaseenzymkomplekset kan så bli isolert fra mediet og oppdelt i sine enkelte komponeneter, hvorfra endoglukanasene i sin tur blir isolert. Denne teknikk er imidlertid ikke svært foretrukket, på grunn av opprensningstrinnene som er nødvendige.

En mer foretrukket metode for å fremstille enzymf6raddi-ti-ver ifølge foreliggende oppfinnelse er å konstruere ved genetisk manipulasjon av en vertsorganisme, så som soppen Trichoderma, som danner de ønskede enzymer i de passende relative mengder. Dette kan foretas f.eks. ved å øke kopi-antallet av genet som koder for endoglukanaser {f.eks. EGI, EGII og/eller EGIII) og/eller ved å bruke en passende sterk promoter foran enhver av de ovennevnte endoglukanasegener. alternativt eller i tillegg kan vertsstammen få fjernet visse cellulasegener (f.eks. de som koder for CBHI og/eller CBHII). Slike fremgangmåter er fullstendig forklart i beskrivelsen av WO 92/06209 i tlfellet med transformering av T. reesei.

Enzymforadditivet fremskaffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan også innbefatte andre enzymer, så som xylanase, protease, a-amylase, glukoamylase, lipase, pektinase, mannanase, a-galaktosidase, a-arabinofuranosidase eller fytase. Enzymer som har de ønskede aktiviteter kan f.eks. bli blandet med endoglukanasene benyttet i foreliggende oppfinnelse, enten før impregnering av disse på et cereal-basert bæremateriale eller alternativt kan slike enzymer bli impregnert samtidig eller sekvensielt på et slikt creal-basert bæremateriale. Bærematerialet blir så i sin tur blandet med et cereal-basert for for å fremstille det endelige f6rprodukt. Det er også mulig å formulere enzym-fdradditivet som en oppløsning av de individuelle enzymaktiviteter og så blande denne oppløsning med et formateriale på forhånd dannet som pelleter eller som en mos.

Det er også mulig å innbefatte enzymf6radditivet i dyrets diett ved å innlemme dette i et andre (og forskjellig) f6r eller i drikkevann som dyret også har tilgang til. Følgelig er det ikke nødvendig at enzymblandingen blandet ifølge foreliggende oppfinnelse blir inkorporert i det cereal-baserte f6r i seg selv, selv om et slik inkorporering ut-gjør et spesielt foretrukket aspekt av foreliggende oppfinnelse .

I en foretrukket utførelsesform er xylanasen som er tilsatt som et tilleggsenzym xylanasen med høy pl og/eller xylanasen med lav pl som kan erholdes fra T. longibrachiatum, som kan dannes ved metoden ifølge eksempel 22 fra WO 92/06209. Det er spesielt foretrukket at xylanasen er xylanasen med høy pl.

I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform er proteinasen som tilsettes som et ytterligere enzym, et subtilisin eller en mutant derav avledet fra slekten Bacillus. Passende stammer av Bacillus innbefatter, men er ikke begrenset til, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. lichen-iformis, B. subtilis, eller B. alcalophilus.

Subtilisinet kan også være et mutant-subtilisin med en aminosyresekvens som ikke finnes i naturen, men som er avledet fra et precursorsubtilisin ved å sette inn, fjerne eller erstatte ett eller flere aminosyreresiduer i precur-sor-subtilisinet. Passende mutantsubtilisiner er beskrevet i EP-A-0 130 756, tilsvarene US-Re-34686 (innbefattende mutasjoner ved posisjonene +155, +104, +222, +166, +133, +169, +189, +217, +156, +152); EP-A-0 251 446; WO 91/06637 osv. Det mest foretrukne subtilisin er et mutantsubtilisin som omfatter en substitusjon ved aminosyreresiduumposisjon ekvivalent til tyr+217 av B. amyloliquefaciens-subtilisin med leucin.

Metoder for å fremstille slike mutantsubtilisiner er beskrevet i detalj i publikasjonene US-Re-34606 og EP-A-0 251 446 .

De cereal-baserte dyref6r innbefattende additivet ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for dyr som griser, drøv-tyggere som sauer og kyr, fjærkre så som kyllinger, kalkuner, gjess og ender. Forproduktene er imidlertid spesielt egnet for fjærkre og griser, og spesielt broilerkyllinger.

Som tidligere nevnt, blir enzymforadditivet i henhold til foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis dannet ved å dyrke en genetisk modifisert stamme av soppen Trichoderma. Dette er på grunn av dens velkjente egenskap å skille ut helcellu-laser i store mengder. Denne modifiserte stamme kan være avledet fra T. longibrachiatum, T. reesei eller T. viride. Genomet hos slike stammer kan bli modifisert til å overut-trykke eller fjerne én eller flere av enzymkomponentene som utgjør cellulasen.

Mikroorganismekulturer dyrkes til en stasjonær fase, fil-treres for å fjerne cellene, og den gjenværende supernatant konsentreres ved ultrafiltrering for å danne endoglukanasen eller derivatet derav.

I et spesielt aspekt av den ovenfor nevnte metode kan mediet som brukes for å dyrke de transformerte vertsceller være ethvert medium som er egnet for endoglukanaseproduk-sjon i Trichoderma. Endoglukanasen eller glukanatet derav blir gjenvunnet fra mediet ved konvensjonelle teknikker, innbefattende separasjon av cellene fra mediet ved sentrifugering, utfelling av proteinene i supernatanten eller filtrat med salt, for eksempel ammoniumsulfat, fulgt av kromatografiprosedyrer, så som ionebyttekromatografi, affi-nitetskromatografi og lignende.

Alternativt kan sluttproteinproduktet bli isolert og renset ved binding til et polysakkaridsubstrat eller en antistoff-matrise, Antistoffene (polyklonale eller monoklonale) kan dannes mot endoglukanasekjernedomenepeptider eller synte-tiske peptider kan bli fremstilt fra deler av kjerne-domenet og benyttet til å danne polyklonale antistoffer.

Det er ytterligere påtenkt ifølge foreliggende oppfinnelse at DNA-fragmentet eller det variante DNA-fragment som koder for endoglukanasen eller derivatet kan bli fuksjonelt knyt-tet til en fungal promotersekvens, f.eks. promoteren til cbhl- eller egll-genet. Også påtenkt ifølge foreliggende oppfinnelse er manipulering av Tri choderma-stammen via transformasjon, slik at et DNA-fragment som koder for en endoglukanase eller et derivat derav blir satt inn i genomet. Det er også påtenkt at mer enn en kopi av et endglu-kanase DNA-fragment eller DNA-variantfragment kan bli rekombinert i stammen.

Det må først velges en utvelgbar markør for å muliggjøre påvisning av den transformerte sopptype. Ethvert utvelgbart markørgen som blir uttrykt i Trichoderma, kan benyttes i foreliggende oppfinnelse, slik at dets nærvær i transformerte organismer ikke i vesentlig grad vil påvirke egenskapene av disse. Den utvelgbare markør kan være et gen som koder for et påviselig produkt. Den utvelgbare markør kan være en funksjonell kopi av et trichodermagen som, dersom det mangler i vertsstammen, resulterer i at vertsstammen oppviser en auxotropisk fenotype.

Vertsstammene som benyttes bør være derivater av Trichoderma som mangler eller har et ikke-funksjonelt gen eller gener tilsvarende den valgte påviselige markør. For eksempel, dersom den utvelgbare markør av pyr4 blir valgt, blir en spesifikk pyr-derivatstamme benyttet som mottagende organisme i transformasjonsprosedyren. Andre eksempler på utvelgbare markører som kan bli benyttet i foreliggende oppfinnelse, innbefatter Trichoderma-genene som er ekviva-lente med Aspergillus nidulans-genene argB, fcrpC, niaD og lignende. Den tilsvarende mottagende stamme må derfor være en de r i vats tamme, så som argB', trpC, niaD' og lignende.

Stammen er avledet fra en utgangs-vertsstamme som er enhver Trichoder/na-stamme. Imidlertid er det foretrukket å benytte en T. longibrachiatum cellulaseoverproduserende stamme, så som RL-P37, beskrevet av Sheir-Neiss et al. i Appl. Micro-biol. Biotechnology, 20, (1984) s. 46-53, siden denne stamme skiller ut økede mengder av cellulaseenzymer. Denne stamme blir så benyttet for å danne derivatstammene benyttet i transformasjonsprosessen.

Derivatstammen av Trichoderma kan fremstilles ved et antall teknikker kjent i faget. Et eksempel er dannelsen av pyr4" derivatstammer ved å utsette stammene for fluororotinsyre (FOA) . pyr4-genet koder for orotidin-5'-monofosfat-dekar-boksylase, et enzym som er nødvendig for biosyntesen av uridin. Stammer med et intakt pyr4-gen vokser i et medium som mangler uridin, men er følsomme overfor fluororotinsyre. Det er mulig å velge ut pyr4~-derivat stammer som mangler et funksjonelt orotidinmonofosfat-dekarboksylase-enzym og krever uridin for vekst ved å velge ut for FOA-resistens. Ved å bruke FOA-utvelgelsesteknikken er det også mulig å danne uridinkrevende stammer som mangler en funksjonell orotat-pyrofosforibosyl-transferase. Det er mulig å transformere disse celler med en funksjonell kopi av genet som koder for dette enzym (Berges og Barreau, 1991, Curr. Genet. 19, s. 359-365). Siden det er lett å velge ut derivatstammer ved å bruke FOA-resistensteknikken i foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket å bruke pyr4-genet som utvelgbar markør.

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir et eller flere cellobiohydrolasegener fjernet fra Trichoderjna vertscellestammer før innføringen av en DNA-konstruksjon eller -plasmid inneholdende DNA-fragmentet som koder for endoglukanasen av interesse. Det er foretrukket å uttrykke en endoglukanase, et derivat derav eller kovalent bundet endoglukanasedomenederivat i en vertsorganisme som mangler et eller flere cellobiohydrolasegener, for å for-enkle identifiseringen og de påfølgende opprensningspro-sedyrer. Ethvert gen fra Trichoderma som har blitt klonet kan bli deletert, så som chhl eller cbh2.

Det ønskede gen som skal deleteres fra den transformerte organisme, settes inn i et plasmid ved metoder som er kjent i faget. Dette plasmid blir valgt ut slik at enestående restriksjonsenheter er tilstede deri for at fragmentet av Trichoderma-DNA kan bli fjernet som et enkelt lineært stykke. Plasmidet inneholdende genet som skal fjernes eller ødelegges, blir så spaltet ved passende restriksjonsenzym-sete{r) innvendig til det kodende område, den genkodende sekvens eller deler derav kan bli fjernet fra dette og den utvelgbare markør (f.eks. pyr4) satt inn. Flankerende DNA-sekvenser fra locus av genet som skal fjernes eller ødelegges, fortrinnsvis mellom 0,5 til 2,9 kb, forblir på hver side av det utvelgbare markørgen.

Et enkelt DNA-fragment inneholdende delesjonskonstruksjo-nene blir så isolert fra plasmidet og benyttet for å transformere den passende pyr" Trichoderma vertsorganisme. Transformanter blir utvalgt basert på sin egenskap til å uttrykke pyr4-gen-produktet og således komplementere uridin-auxotrofien av vertsstammen. Southern blot-analyse blir så utført på de resulterende transformanter for å identifisere og bekrefte en dobbelt overkrysnings-integrasjons-hen-delse som erstatter deler av eller hele det kodende område

av genet som skal fjernes med de pyr4-utvelgbare markører.

Selv om spesifikke plasmidvektorer er beskrevet ovenfor er foreliggende oppfinnelse ikke begrenset til dannelsen av disse vektorer. Forskjellige gener kan bli fjernet og erstattet i Trichoderma-stammen ved å bruke de ovennevnte teknikker. Enhver tilgjengelig utvelgbar markør kan bli brukt som omtalt ovenfor. Potensielt kan ethvert Trichoderma- gen som har blitt klonet og således identifisert, bli fjernet fra genomet ved å bruke den ovenfor beskrevne stra-tegi.

Ekspresjonsvektoren som bærer det innsatte DNA-fragment eller variante DNA-fragment som koder for endoglukanasen eller derivatet derav som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være enhver vektor som er istand til å replikere autonomt i en gitt vertsorganisme, typisk et plasmid. I foretrukne utførelsesformer er to typer ekspresjonsvektorer for å danne ekspresjon av gener eller avkortede deler derav påtenkt. Den første inneholder DNA-sekvenser hvor promoteren, det kodende genområde og terminatorsekvensen alle stammer fra genet som skal uttrykkes. Genavkortning blir om nødvendig utført for å fjerne de uønskede DNA-sekvenser (de som koder for uønskede domener) for å etterlate domenet som skal uttrykkes, under kontroll av sine egne transkripsjonene og translasjonene regula-toriske sekvenser. Et utvelgbar markør er også inneholdt på vektoren, noe som muliggjør utvelgelse av multiple kopier av de nye gensekvenser for integrering i vertsorganismen.

For eksempel inneholder en DNA-konstruksjon som kan betegnes pEGID3'pyr, EGI-cellulase-kjernedomenet under kontroll av EGI-promoteren, terminatoren og signalsekvensene. Den 3' ende av det EGI-kodende område inneholdende det cellulosebindende domene har blitt fjernet. Plasmidet inneholder også pyr4-genet for utvelgelsesformål.

Den andre type ekspresjonsvektor er satt sammen på forhånd og inneholder sekvenser som er nødvendige for høynivå-transkripsjon samt en utvelgbar markør. Det er påtenkt at det kodende område for et gen eller del derav kan bli satt inn i denne ekspresjonsvektor for generelle formål, slik at den står under transkripsjonen kontroll av ekspresjons-kasettens promoter- og terminatorsekvenser.

For eksempel er pTEX en slik generelt formålstjenlig ekspresjonsvektor. Gener eller deler derav kan bli satt inn nedstrøms for den sterke CBHI-promoter.

I vektoren kan DNA-sekvensen som koder for endoglukanasen være operativt forbundet til transkripsjonene og translasjonene sekvenser, dvs. en passende promotersekvens og signalsekvens i leseramme til det strukturelle gen. Promoteren kan være enhver DNA-sekvens som viser transkripsjonen aktivitet i vertsceller og kan være avledet fra gener som koder for proteiner som enten er homologe eller hetero-loge til vertcellen. Signalpeptidet gir ekstracellulær ekspresjon av endoglukanasen eller derivater derav. DNA-signalsekvensen er fortrinnsvis signalsekvensen som er naturlig assosiert med det avkortede gen som skal uttrykkes, men signalsekvensen fra enhver endoglukanase er påtenkt i foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåtene som benyttes for å ligere DNA-sekvensene som koder for de avkortede endoglukanaser eller derivater derav med promoteren og innsetning i passende vektorer inneholdende den nødvendige informasjon for replikasjon i vertscellen, er velkjent i faget.

DNA-vektoren eller konstruksjonene beskrevet ovenfor kan bli innført i vertscellen i samsvar med kjente teknikker, så som transformasjon, transfeksjon, mikroinjeksjon, mikro-porasjon, biolistisk bombardement og lignende.

I en foretrukket utføreslesform av foreliggende oppfinnelse er den modifiserte stamme avledet fra Trichoderma sp. inneholdende fjernede eller ødelagte gener for CBHI og/eller CBHII, for derved å være ute av stand til å danne katalytisk aktiv cellobiohydrolase. Cellulaseenzymene dannet av en slik organisme vil være anriket i endoglukanaser og innbefatte ikke mer enn 20% cellobiohydrolaser basert på den kombinerte vekt av cellulaseproteiner som den danner. Det er spesielt foretrukket at den modifiserte stamme er ute av stand til å danne katalytisk aktiv CBHI, idet dette enzym utgjør størstedelen av enhver komponent av helcellulase fra Trichoderma sp. I tilfeller hvor kun produksjon av EGIII er ønsket, er det ytterligere foretrukket at en slik modifisert stamme inneholder fjernede eller ødelagte gener for EGI og EGII for å være ute av stand til å danne katalytisk aktiv EGI og/eller EGII.

Alternativt kan den modifiserte stamme i tillegg inneholde rekombinant DNA som tillater ekspresjon og sekresjon av avkortede katalytiske kjerner av enten EGI eller EGII. Selv om man ikke ønsker å være bundet av teori, er det antatt at tilstedeværelsen av et cellulosebindende domene på en cellulase kan være ansvarlig for visse uønskede egenskaper som observeres når dyr blir matet med for som er supplementert med cellulase, f.eks. øket tarmviskositet. Ved å fjerne det cellulosebindende domene og opprettholde en intakt cellulasekjerne er det mulig å begrense eller fjerne disse egenskaper.

Før beskrivelse av metoder for å fremstille slike avkortede endoglukanaser, gir det følgende en detaljert beskrivelse av tegningene, som er nødvendig for å forstå disse produk-sj onsteknikker. Figur 1 viser det genomiske DNA og aminosyresekvens for EGI. Signalsekvensen starter ved basepar 113 og slutter ved basepar 178 (Seq ID No.13). Det katalytiske kjernedomene starter ved basepar 179 til 882 av exon én, og basepar 963 til basepar 1379 av den andre exon (Seq ID No. 5). Linkerområdet starter ved basepar 1380 og slutter ved basepar 1460 (Seq ID NO. 9). Det cellulosebindende domene starter ved basepar 1461 og slutter ved basepar 1616 (Seq ID No. 14, 6, 10 og 2 representerer henholdsvis aminosyresekvensen av EGI signalsekvens, det katalytiske kjernedomene, linkerområde og det bindende domene. Figur 2 viser den genomiske DNA og aminosyresekvensen av EGII. Signalsekvensen starter ved basepar 262 og slutter ved basepar 324 (seq ID No. 15). Det cellulosebindende domene starter ved basepar 325 og slutter ved basepar 432 (Seq ID No. 3). Linkerområdet starter ved basepar 433 og slutter ved basepar 534 (Seq ID No. 11). Det katalytiske kjernedomene starter ved basepar 535 til basepar 590 i exon én, og basepar 765 til basepar 1689 i exon to (Seq ID No. 7). Seq ID No. 16,4, 12 og 8 representerer henholdsvis aminosyresekvensen av EGII signalsekvens, bindende domene, linkerområde og katalytisk kjernedomene. Figur 3 viser den genomiske DNA og aminosyresekvens av EGIII. Signalsekvensen starter ved basepar 151 og slutter ved basepar 198 (seq ID No. 19). Det katalytiske kjernedomene starter ved basepar 199 til basepar 557 i exon én, basepar 613 til basepar 833 i exon to og basepar 900 til basepar 973 i exon tre (Seq ID No. 17). Seq ID No. 20 og 18 representerer henholdsvis aminosyresekvensen av EGIII signalsekvens og katalytisk kjernedomene. Figur 4 illustrerer konstruksjonen av EGI kjernedomene ekspresjonsvektor (Seq ID No. 21). Figur 5 er en kurve som viser den initielle viskositetsreduserende aktivitet av helcellulase og forskjellige anrikede endoglukanasepreparater ved forskellige pH.

Som nevnt ovenfor kan én eller flere av glukanasene som er tilstede i enzymforadditivet ifølge foreliggende oppfinnelse være avkortede EG-derivater, så som EGI som mangler det cellulosebindende domene (som kan betegnes EGlcore) og/eller EGII som også mangler det cellulosebindende domene. Disse derivater fremstilles ved rekom-binante metoder ved å transformere i en vertscelle en DNA-konstruksjon som omfatter minst ett fragment av DNA som koder for en del av eller hele kjerneområdet av endoglukanasene, for eksempel EGI eller EGIII funksjonelt festet til en promoter, dyrkning av vertscellen for å uttrykke den avkortede endoglukanase, derivatet av avkortet endoglukanase eller kovalent bundet avkortet endoglukanasedomene-derivater av interesse. Den resulterende avkortede endoglukanase kan benyttes når den er adskilt fra mikroorganisme-cellene som et foradditiv. Som et alternativ kan den avkortede endoglukanase eller derivatet derav i tillegg bli renset til i hovedsak homogenitet før bruk.

De følgene referanseeksempler l og 2 er gitt for å illu-s-trere teknikker for å danne endoglukanaseanrikede enzymblandinger ved å transformee og dyrke genetisk modifiserte mikroorganismer.

Referanseeksempel 1

Kloning og ekspresjon av EGI kjernedomene under anvendelse av dens egen promoter, terminator og signalsekvens

Del 1. Kloning

Det fullstendige egll-gen benyttet ved konstruksjonen av EGI kjernedomene ekspresjonsplasmid pEGlD3'pyr ble dannet fra plasmidet pUC218::EGl. (se fig. 4). Det 3' terminator-område av egl ble ligert i pUC218 (Korman, D. et al, Curr. Genet. 17:203-212, 1990) som et 300 bp Bsml-EcoRI-fragment (BsjnJ-setet er ved 46 bp 3 1 for egil stoppkodonet) sammen med en syntetisk linker utarbeidet for å erstatte det cellulosebindende domene av egil med et stoppkodon og fortsette med de første 46 bp av egll-terminatorsekvensen.

Det resulterende plasmid, pEGIT, ble spaltet med Hindlll og Bsml, og vektorfragmentet med egll-terminatoren ble isolert fra det spaltede produkt ved agarosegel-elektroforese, fulgt av elektroeluering. egil genpromotersekvensen og kjernedomenet av egil ble isolert fra pUC218::EGl som et 2,3 kb Hindlll-Sstl-fragment og ligert med det samme synte-tiske linkerfragment og Hindlll- Bsml-spaltet pEGIT for å danne pEGlD3'.

Det samlede resultat av disse handlinger er å erstatte det 3' intron og det cellulosebindende domene av egil med syn-tetiske oligonukleotider på 53 og 55 nt. Disse plasserer et TAG stoppkodon etter serin 415 og fortsetter deretter med egll-terminatoren opp til Bsml-setet.

Dernest ble den T. longibrachiatum utvelgbare markør, pyr4, erholdt fra en tidligere klon p2l9M (Smith et al, 1991), som et isolert 1,6 kb EcoRI-Hindlll-fragment. Dette ble inkorporert i det endelige ekspresjonsplasmid pEGlD3'pyr, i en treveis ligering med pUCl8-plasmid spaltet med EcoRI og defosforylert ved å bruke alkalisk kalvefosfatase og et ffindlll-.EcoRI-fragment inneholdende egll-kjernedomenet fra PEG1D3'.

Del 2. Transformasjon og ekspresjon

Et DNA-preparat i stor skala ble laget av pEGlD3'pyr, og fra dette ble EcoRI-fragmentet inneholdede egll-kjernedome net og pyr4-genet isolert ved preparativ gel-elektroforese. Det isolerte fragment ble transformert i en stamme {lA52py-rl3) hvor cbhl, cbh2, egil og egl2 genene hadde blitt fjernet og som var pyr4" (beskrevet i WO 92/06209) , og stabile transformanter ble identifisert.

For å velge ut hvilke transformanter som uttrykte egil kjernedomenet, ble transformantene dyrket i risteflasker under betingelser som favoriserte induksjon av cellulasegenene (Vogels medium + 1% laktose). Etter 4-5 dagers vekst ble protein fra supernatantene konsentrert og enten l) satt på SDS polyakrylamidgeler før påvisning av EGI kjernedomenet med Western-analyse under anvendelse av anti-EGI polyklonale antistoff eller 2) de konsentrerte supernatanter ble undersøkt direkte ved å bruke Remazol Brilliant Blue (RBB)-karboksymetylcellulose som et endoglukanasespesifikt substrat, og resultatene ble sammenlignet med den parentale stamme (1A52) som kontroll. Transformante kandidater ble identifisert som muligens dannende et avkortet EGI kjernedomeneprotein. Genomisk DNA og totalt mRNA ble isolert fra disse stammer etter vekst på Vogels + 1% laktose, og Southern og Northern blot-forsøk ble utført under anvendelse av et isolert DNA-fragment inneholdende kun egil kjernedomenet. Disse forsøk viste at transformanter kunne bli isolert med en kopi av egil kjernedomene-ekspresjonskassetten inte-grert i genomet av 1A52 og at disse samme transformanter dannet egil kjernedomene mRNA.

En transformant ble så dyrket under anvendelse av media egnet for cellulaseproduksjon i Trichoderma velkjent i faget, som ble supplementert med laktose {Warzymoda, M. et al., 1984, FR patent 2555603) i et 14 liters fermentator. Det resulterende medium ble konsentrert, og proteinene inneholdt deri ble adskilt med SDS polyakrylamidgel-elektroforese, og EGI kjernedomeneproteinet ble identifisert med Western analyse. Det ble deretter beregnet at protein-konsentrasjonen av fermenteringssupernatanten var omkring 5-6 g/l, hvorav omtrent 1,7-4,4 g/l var EGI kjernedomene basert på CMCase-aktiviteten. Denne verdi er basert på et gjennomsnitt av flere EGI kjernefermenteringer som ble utført.

På lignende måte kan enhver annen endoglukanase, enten den er avkortet eller ikke, eller et derivat derav, bli dannet ved fremgangsmåer som er lik dem beskrevet ovenfor. Således kan produksjon av EGI oppnås ved å bruke lignende teknikker, bortsett fra at fjerning av det cellulosebindende domene er utelatt. Tilsvarende teknikker kan bli brukt for å danne fullstendig EGII, EGIII og EGII hvorfra det cellulosebindende domene er fjernet.

Referanseeksempel 2

Opprensnin<g> av EGI og EGII katalytiske kjerner

Del 1. EGI katalytisk kjerne

EGI-kjernen ble renset på følgende måte. Det konsentrerte (UF) medium ble fortynnet til 14 kg/ml i 23 mm Na-acetat pH 5,0. 200 g avicel cellulosegel (FWM Bioproducts, Type PH-101) ble tilsatt til det fortynnede EGI kjernemedium og blandet ved romtemperatur i 45 min. Avicelen ble fjernet fra mediet ved sentrifugering, noe som resulterte i en anriket EGI kjerneoppløsning. Denne oppløsning ble så buffer-byttet til 10 mM TES pH 7,5 ved å bruke en Amicon omrørt cellekonsentrator med en PM 10 membran {diaflo ultra filtreringsmembraner, Amicon katalognr. 13132MEM 5468A) . EGI kjerneprøven ble så satt på en anionebytter-kolonne (Q-sefarose fast flow, Pharmacia katalognr. 17-0510-01) og eluert i en saltgradient fra 0 til 0,5 M NaCl i 10 mM TES pH 7,5. Fraksjonene som inneholdt EGI-kjernen ble slått sammen og konsentrert ved å bruke den omrørte cellekonsentrator fra Amicon nevnt ovenfor.

Del 2. EGII katalytisk kjerne

Det er påtenkt at opprensningen av den EGII katalytiske kjerne er lik den for EGII cellulase på grunn av dens lignende biokjemiske egenskaper. Den teoretiske pl for EGII-kjernen er mindre enn en halv pH-enhet lavere enn den for EGII. I tillegg er EGII-kjernen omtrent 80% av molekyl-vekten av EGII. Derfor er den følgende opprensningsfremga-ngsmåte basert på opprensing av EGII. Metoden kan innbefatte filtrering av det UF-konsentrerte medium gjennom diatomatøs jord og tilsetning av (NH4)aS04 for å bringe oppløsningen til IM {NH4)2S04. Denne oppløsning kan så bli satt på en hydrofobisk kolonne (fenyl-sefarose fast flow, Pharmacia, katal. nr. 17-0965-02) og EGII kan bli støt-eluert med 0,15 M (NH4)2S04. Fraksjonene inneholdende EGII-kjernen kan så bli bufferbyttet til sitratfosfat pH 7, 0,18 mOhm. Dete materiale kan så bli satt på en anionebytter-kolonne (Q-sefarose fast flow, Pharmacia, katal.nr. 17-0510-01) ekvilibrert i den ovenfor nevnte sitratfosfat-buffer. Det er ventet at EGII-kjernen ikke vil binde til kolonnen og således bli samlet opp i det gjennomstrømmende medium.

Foreliggende oppfinnelse vil bli forklart i større detalj ved hjelp av det følgende ytterligere referanseeksempel 3 og eksempel 1. I eksempel 1 blir det referert til enheter av p-glukanaseaktivitet. Denne aktivitet blir målt ved det følgende assay.

En enhet p-glukanaseaktivitet er den mengde enzym som frigjør et umol av reduserende sukkere (uttrykt som glukose -ekvivalenter) fra substratet i et minutt under de beskrevne betingelser.

Reagenser

1. 1,0% (w/v) p-glukansubstrat

Fukt 1,0 g fl-(1,3)(1,4)-glukan inneholdende blandede bindinger (Biocon Biochemicals Ltd.) med 10 ml etanol. Tilsett omkring 80 ml destillert vann og varm opp til kokepunktet. Fortsett koking med kraftig omrøring inntil p-glukan er oppløst og en turbid oppløsning blir dannet. Avkjøl den turbide oppløsning til romtemperatur under kontinuerlig omrøring og justér p-glukankonsentrasjonen til 1,0% (w/w) ved å tilsette destillert vann. Filtrer gjennom et glass-fiber filtrerpapir.

Substratet kan bli benyttet umiddelbart. Substratet er brukbart i 2 dager dersom det lagres i et kaldt rom.

2. 0/1 M natriumacetatbuffer pH 5,0.

A. Oppløs 8,2 vannfri natriumacetat i destillert vann og fyll opp til 1000 ml med destillert vann.

B. Oppløs 6,0 g iseddiksyre i destillert vann og fyll opp til 1000 ml med destillert vann.

Juster pH av oppløsning A til 5,0 med oppløsning B.

3. Dinitrosalicylsyre (DNS) reagens

Suspender 20,0 g 3,5-dinitrosalicylsyre i omkring 800 ml destillert vann. Tilsett gradvis 300 ml natriumhydroksyd-oppløsning (32,0 NaOH i 300 ml destillert vann) under kontinuerlig omrøring. Varm opp suspensjonen i et vannbad (temperaturen må ikke overskride +48°C) under omrøring inntil oppløsningen er klar. Tilsett gradvis 600 g kalium-natriumtartrat. Varm oppløsningen (temperaturen må ikke overskride +48°C) om nødvendig til oppløsningen er klar.

Fyll opp til 2000 ml med destillert vann og filtrer gjennom et grovt sintret glassfilter.

Lagre i en mørk flaske ved romtemperatur. Reagenset er stabilt i maksimalt 6 måneder.

Fremgangsmåte 1. Bnzymprøve

Ekvilibrer 1 ml enzymfortynning (i 0,1 M natriumacetat-buf f er, pH 5,0) ved +30°C. Tilsett 1 ml p-glukansubstrat, omrør og inkuber ved +3 0°C i nøyaktig 10 min. Tilsett 3 ml DNS-reagens, omrør og kok reaksjonsblandingen i nøyaktig 5 min. Avkjøl reaksjonsblandingen i et kaldt vannbad til romtemperatur og mål absorbansen ved 540 nm mot destillert vann.

2. Enzym blindprøve

Inkuber 1 ml B-glukansubstrat ved +3 0°C i 10 min. Tilsett 3 ml DNS-oppløsning og rør om. Tilsett l ml enzymfortynning (i 0,1 M natriumacetatbuffer, pH 5,0) og rør om. Kok blandingen i nøyaktig 5 min. Avkjøl reaksjonsblandingen i kaldt vannbad til romtemperatur og mål absorbensen ved 540 nm mot destillert vann.

Absorbensforskjellen mellom enzymprøven og enzym blind-prøven bør være 0,3 til 0,5.

3. Standardkurve

Fremstill standardoppløsninger fra vannfri glukose i destillert vann. Glukosekonsentrasjonen i standardene bør være 0,1 til 0,6 mg/ml. Pipetter 1 ml glukose standard-oppløsning, 1 ml destillert vann og 3 ml DNS-reagens i et forsøksrør. Rør om og kok i nøyaktig 5 min. Avkjøl i et kaldt vannbad til romtemperatur og mål absorbensen ved 54 0 nm mot en standard blindprøve. I standard blindprøven er glukoseoppløsningen erstattet med 1 ml destillert vann. Ellers blir standard blindprøven behandlet lik glukose-standarden.

Tegn opp glukosekonsentrasjonen som en funksjon av ab-sorbens. En ny standardkurve fremstilles for hvert nye DNS-reagens .

UTREGNING

B-glukanase aktiviteten av prøven regnes ut i henhold til den følgende ligning:

Aktivitet (U/g) = <[ A( X) - A( o) 1 x k + c.) x 1000 Pf

MWglll x t

hvori:

A(X) = absorbanse av enzymprøven

A{0) = absorbanse av enzym blindprøven

k = helningen av st andar dJcurven

C. = krysningspunkt av glukose standardkurven

1000 = faktor, mmol - > pmol

Df = fortynningsfaktor (tnl/g)

MWslu= molekylvekt av glukose (180,16 mg/mmol)

t = reaksjonstid (10 min)

Referanseeksempel 3 henviser til målingen til den viskositetsreduserende aktivitet av B-glukanase. Denne aktivitet måles med det følgende assay.

Prinsipp

J3-glukanasekatalyserer hydrolysen av B-glukan, noe som resulterer i reduksjon av viskositet av p-glukanopp-løsninger. Omvendt spesifikk viskositet som en funksjon av tid er en lineær funksjon ved utgangspunket for reaksjonen. Ved å bruke helningen av den lineære kurve kan B-glukanaseaktivitet bli bestemt. Resiprok spesifkk viskositet bestemmes ved å bruke et kapillær-viskosimeter.

Apparatur

Ostwald kapillær-viskosimeter (Brand, No 11, 75-100 sek) Vannbad kontrollert ved 30°C

Magnetisk omrører

Stoppeklokke

Glassinterfiltere nr. 3 og 4

Magnetisk omrører med varmeplate

Reagenser

1. 0,5 M acetatbuffer, pH 4,0

Fortynn 30 g iseddiksyre (BDH AnalaR 10001) i 900 ml destillert vann. Juster pH til 4,0 med 2,5 g NaOH (Merck 6498) . Fyll opp med destillert vann til 1000 ml.

2. 0,05 H acetatbuffer, pH 4,0

Fortynn 100 ml 0,5 M acetatbuffer, pH 4,0 i 800 ml destillert vann. Juster pH om nødvending til 4,0 med 1 M NaOH eller iseddiksyre. Fyll opp til 1000 ml med destillert vann. Filtrer gjennom glassinterfilter nr. 4.

3. B-glukanoppløsning

Vei inn 1,0 g B-(l,3)(l,4)-glukan inneholdende blandede bindinger (Biocon Biochmicals) i et tarert beger. Tilsett omkring 6 ml metanol og bland med en metallisk blandestav inntil B-glukanet inneholdende de blandede bindinger har blitt fullstendig fuktet. Tilsett omkring 80 ml destillert vann, bland med en magnetisk rører og varm opp oppløsningen til kokepunktet. Fortsett koking inntil B-glukanet inneholdende de blandede bindinger har oppløst seg fullstendig. Vær forsikret om at det ikke finnes noe materiale på vegge-ne av begeret. Avkjøl oppløsningen til romtemperatur under kontinuerlig omrøring. Tilsett 10 ml 0,5 M acetatbuffer, pH 4,0. Om nødvendig juster pH til 4,0 med 1 M NaOH og iseddiksyre. Tilsett destillert vann inntil den totale vekt av substratoppløsningen er 100 g. Filtrer med glassinterfilter nr. 3. Lagre substratoppløsningen i maksimalt 2 dager ved +4°C.

Fremgangsmåte 1. Bestemmelse av resiprok spesifikk viskositet

Før aktivitetsbestemmelse vær sikker på at viskosimeteret er rent ved å rense med destillert vann og aceton (i denne rekkefølge). Tørk viskosimeteret ved å fjerne aceton med trykkluft eller i vakuum.

Alle prøver, substratoppløsning og viskosimeter må være ekvilibrert ved 30°C i minst 15 min før bestemmelse.

Resiprok spesifikk viskositet følger ligning l

hvor

l/u^ = resiprok spesifikk viskositet

dT0 = falletid av acetatbuffer (i sek)

dTa = falletid av prøveoppløsning (i sek)

Falletiden for oppløsninger følger likning 2

hvor

dTf = falletid for oppløsninger

Tj - T1 = tid brukt av oppløsningen til å falle mellom

øvre og nedre merker i kapillære (i sekunder) h = Hagenbach faktor

Hagenbach faktorer

Start bestemmelsen av falletiden med et rent og tørt viskosimeter ved å pumpe 7,5 ml oppløsning til kapillæret slik at overflaten av oppløsningen av overskrider øvre merke av kapillæret. Bestem med stoppeklokke tiden som er nødvendig for oppløsningen å falle mellom øvre og nedre merker i kapillæret.

2. Bestemmelse av falletid for acetatbuffer

Bestem falletiden (dT0) for 0,05 M acetatbuf f er, pH 4,0 som beskrevet ovenfor når p-glukanaseaktivitet blir bestemt.

3. Justering av p-glukanoppløsning

Den initielle resiproke spesifikke viskositet ved hydrolyse av p-glukan må være 0,13. Viskositeten i p-glukanopp-løsningen varierer fra porsjon til porsjon, og dette må bli kompensert for ved å variere forholdet mellom p-glukan-oppløsning og prøve slik at den initielle viskositet er korrekt.

Lag 5 forskjellige 8-glukan/0(05 M acetatbuffer, pH 4,0-blandinger ved å pipettere p-glukan (A) 5,0 - 6,5 ml og henholdsvis 2,5 - 1,0 ml 0,05 M acetatbuffer, pH for å gjøre det totale volum av hver blanding til 7,5 ml. Bestem viskositeten av disse oppløsninger og regn ut de resiproke spesifikke viskositeter.

Tegn ned den resiproke spesifikke viskositet som en funksjon av B-glukan. Fra kurven bestem mengden av p-glukan som tilsvarer en resiprok spesifikk viskositetsverdi på 0,13. Denne p-glukanmengde vil bli benyttet senere i alle p-glukanaseaktivitets-bestemmelser med denne p-glukanoppløs-ning.

Initiell viskositet av p-glukanoppløsning må bli bestemt når p-glukanaseaktivitet blir bestemt.

4. Bestemmelse av p-glukanaseaktivitet

Pipettér p-glukanvolum (A) bestemt som beskrevet ovenfor til forsøksrøret og ekvilibrer ved 3 0°C i minst 15 min. Tilsett V ml (V=7,5 ml - A) enzymprøve fortynnet i 0,05 M acetatbuf fer, pH 4,0 og ekvilibrert ved 30°C i minst 15 min. Start stoppeklokken. Bland oppløsningen grundig og overfør den til viskosimeteret. Bestem falletid dTs 4-5 ganger under 2 0-30 min fra blandingen av oppløsningene.

Bestemmelsene må bli foretatt fra minst to foreskjellige fortynninger og med minst tre parallelle bestemmelser fra hver fortynning. Passende fortynning av prøven avhenger av enzymblandingsproduktet og sluttmaterialet som skal under-søkes. Fortynningene er angitt separat. For enzymblandinger er den totale fortynningsfaktor typisk 1/2000-1/15000 og for sluttinnmatet materiale 1/5-1/20.

Utregninger

Regn ut de resiproke spesifikke viskositeter i henhold til likning 1. Tegn ned den resiproke spesifikke viskositet som en funksjon av hydrolysetid (i sek).

B-glukanaseaktivitet bestemmes som en økning av en resiprok spesifikk viskositet (IRV) på 1 min, likning 3.

hvor

k = helning av kurven

D = total fortynningsfaktor

60 = omdannelsesfaktor, s -> min

V = prøvevolum

Litteratur

The institute of Brewing (1979) J. Inst. Brew, 85, 92-94. Analyse av p-glukanaseaktivitet ved viskosimetrisk metode, Norges Veterinærhøgskole.

Referanseeksempel 3

Det første forsøk som ble foretatt, var å sammenligne effektiviteten in vitro av flere forskjellige cellulaser med et anriket innhold av endoglukanaser sammenlignet med helcellulase. Således ble 7 forskjellige ezympreparater fremstilt, hvor det første var fra naturlig forekommende T.

longibrachiatum og det andre til syvende fra genetisk modifiserte stammer derav i samsvar med følgende tabell 1:

I den ovennevnte tabell 1 inneholder stammen som produserer anriket EGI multiple EGI-kodende gener. På lignende måte inneholder stammene som danner respektivt anrikede EGII og EGIII multiple kopier av de EGII- og EGIII-kodende gener.

De anrikede EGI-, anrikede EGII-, anrikede EGIII- og ren-sede EGIII-enzympreparater ble dannet ved å følge fremgangsmåten beskrevet i PCT WO 92/06209. Renset EGIII var det samme som anriket EGIII, bortsett fra at supernatanten inneholdene det utskilte EGIII ble underkastet PEG-opprens-ningsprosedyren beskrevet i US Patent Nr. 5328841 for å fjerne xylanaseaktivitet. Avkortet EGI-kjerne ble dannet i henhold til teknikkene beskrevet i referanseeksempel 1 og renset i samsvar med referanseeksempel 2.

Den viskositetsreduserende aktivitet på oppløselig p-glukan med blandede bindinger ble målt for hvert av de ovennevnte enzympreparater i samsvar med assayet beskrevet ovenfor.

Resultatene av dette forsøk er illustrert i kurven i fig. 5. Siden T. longibrachiatum p-glukanase er dosert som et foradditiv på basis av aktiviteten målt ved den DNS-reduserende sukkerassay-metode, ble enzymtillegg for det viskositetsreduserende assay standardisert ved denne prose-dyre .

Resultatene som er illustrert i fig. 5 viser at den viskositet sreduserende aktivitet av fullcellulase er signifikant høyere enn den til hver av de anrikede endoglukanasepreparater uavhengig av pH.

Eksempel 1

Tretten grupper broilerkyllinger, hvor hver i utgangspunk-tet inkluderer minst 49 kyllinger, ble matet med det byggbaserte for angitt i tabell 2 mellom 8 og 21 dager gamle. F6rinntak og kroppsvektøkning ble målt mellom dag 8 og 21.

Næringsverdien av det ovennevnte f6r kan bli underkastet computeranalyse ved f.eks. å bruke programmet "format" som er tilgjengelig fra Format International. Dette gir en analyse av næringsinnholdet av foret innbefattende f.eks. de ventede næringsnivå av forskjellige metabolitter. Resultatene av en slik analyse for f6ret ifølge tabell 2 er angitt i den følgende tabell 3.

De byggbaserte for matet til 12 av gruppene av kyllinger ble supplementert med forskjellige mengder av hvert av enzym-preparatene angitt i den ovennevnte tabell 1. Hvert av enzym-preparatene ble undersøkt ved en fl-glukanaseaktivitets-konsentrasjon på 120 enheter/kg av foret og 240 enheter/kg av for. B-glukanaseaktivitetene ble målt ved å bruke B-glukanaseaktivitets-assayet beskrevet ovenfor. Dietten for den trettende gruppe, kontrollgruppen, ble ikke supplementert med noen av enzympreparatene.

Resultater av disse forskjellige tester er angitt i de følgende tabeller 4 og 5. Resultatene angitt i tabell 4 er for dietter supplementert med 120 enheter B-glukanaseaktivitet pr. kg for, mens resultatene angitt i tabell 5 er for for supplementert med 240 enheter B-glukanaseaktivitet pr. kg f6r. Resultatene angitt i tabellene 4 og 5 gir kroppsvektøkning, f6romsetningsgrad og viskositet i mage-tarmområdet hos de forskjellige grupper broilerkyl1inger. Resultatene har blitt justert for mortalitet.

Fra de ovennenvte resultater kan det bli observert at kroppsvektøkningen, foromsetningsgraden og viskositen for kontrollgruppen uten enzymsupplementering var relativt dårlig. Sammenlignet med resultatene for helcellulase er anriket EGI mer effektiv med hensyn til FCR når den benyttes ved en dosering på 240 enheter/kg. Det samme er også tilfellet for anriket EGIII og renset EGIII. På den annen side gir anriket EGII overlegne resultater ved 12 0 enheter/kg f6r. Endelig gir det mest foretrukne enzympreparat, som er det anrikede EGI.Acbd, overlegne resultater ved både 120 og 240 enheter/kg får. Dette enzympreparat som er fjernet for det cellulosebindende domene gir overlegne resultater ved begge konsentrasjoner som ble undersøkt sammenlignet med anriket naturlig type EGI. Disse resultater antyder også sterkt at de forskjellige enzympreparater har forskjellige doseoptima med hensyn til sine effektiviteter på kroppsvektøkning og foromsetningsgrad.

Ved å sammenligne resultatene fra referanse eksempel 3 og eksempel 4 kan det bli observert at forskjellige resultater blir fremskaffet mellom in vitro og in vivo testing. Således, ved in vitro testingen fra referanse eksempel 3, den viskositetsreduserende aktivitet av hel cellulase høyere enn den for de anrikede preparater av EGI, EGII, EGIII og EGI.Acbd.

I motsetning til dette indikerer in vivo forsøksresultatene fra eksempel 1 at hver av enzympreparatene som er under-søkt, har minst ett fordelaktig særtrekk av forbedret kroppsvektøkning, foromsetningsgrad og/eller redusert viskositet i mage-tarmområdet sammenlignet med helcellulase ved begge undersøkte konsentrasjoner. De foretrukne enzympreparater er EGI.&cbd og EGIII.

Effektene som er vist ovenfor av reduserende foromsetningsgrad og/eller mage-tarmviskositeter kan også bli dannet når for fremstilt i samsvar med foreliggende oppfinnelse, men basert på andre cerealer så som hvete, triticale, rug og mais, blir matet til andre dyr så som kalkuner, gjess, ender, griser, sauer og kyr så som som til kyllinger.

Claims (10)

1. Enzymbasert foradditiv, karakterisert ved at det omfatter: (i) ett eller flere av (a) EGI som mangler det cellulosebindende domene, (b) EGII som mangler det cellulosebindende domene og (c) den aktive cellulasekjerne av (a) eller (b), hvor EGI refererer til endoglukanasen avledet fra Trichoderma spp. som har et pH-optimum på omkring 4,0-6,0, et isoelektrisk punkt (pl) på omkring 4,5-4,7 og en molekylvekt på omkring 47-49 kilodalton; og EGII refererer til endoglukanasen avledet fra Trichoderma spp. som har et pH-optimum på omkring 4,0-6,0, en pl på omkring 5,5 og en molekylvekt på omkring 35 kilodalton; og (ii) 0-20 vekt%, basert på innholdet av cellulase-proteiner i additivet, av en cellobiohydrolase.

2. Enzym-basert f6radditiv ifølge krav l, karakterisert ved at det er fritt for enhver cellobiohydrolase.

3. Enzym-basert foradditiv ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at additivet ytterligere omfatter ett eller flere ytterligere enzymer valgt fra xylanase, en protease, en a-amylase, en glukoamylase, en lipase, en pektinase, en mannase, en a-galaktosidase, en ot-ar ab inofuranosidase og en fytase.

4. Enzym-basert foradditiv ifølge krav 3, karakterisert ved at xylanasen er en høy-pl-xylanase og/eller en lav-pl-xylanase fra T. longibrachiatum.

5. Enzym-basert foradditiv ifølge krav 3 eller krav 4, karakterisert ved at proteasen er en subtilisin eller en mutant derav avledet fra familien Bacillus.

6. Cereal-basert dyrefor, karakterisert ved at det omfatter minst en cereal valgt fra bygg, hvete, triticale, rug og mais samt et enzymbasert f6radditiv ifølge ethvert av de foregående krav.

7. Cereal-basert dyref6r ifølge krav 6, karakterisert ved at cerealet er minst bygg.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av et enzymbasert foradditiv ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter trinnet å danne, ved genetisk manipulering, en genetisk modifisert stamme av soppen Trichoderma som danner de ønskede enzymer i de passende relative mengder, dyrke den genetisk modifiserte stamme og samle opp additivet fra kulturen.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den genetisk modifiserte stamme er avledet fra T. longibrachiatum, T. reesei eller T. viride hvis genom har blitt modifisert slik at det er anriket i sin produksjon av en eller flere av endoglukanasene og/eller er ute av stand til å danne en eller flere funksjonelt aktive cellobiohydrolaser.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at genomet av den genetisk modifiserte stamme er ute av stand til å danne funksjonelt aktive EGI og/eller EGII.