JPH09506514A

JPH09506514A - 新規のセルラーゼ酵素及びその発現のための系

Info

Publication number: JPH09506514A
Application number: JP7516853A
Authority: JP
Inventors: フォウラー，ティモシー; エー．クラークソン，キャスリーン; ワード，マイケル; ディー．コリアー，キャサリン; レアナス，エドモンド
Original assignee: ジェネンカーインターナショナル，インコーポレイティド
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 1997-06-30
Also published as: DE69434759T2; EP0733115A1; DE69427812D1; EP1700524B1; CA2156066C; DE69435078T2; AU685210B2; FI116965B; DE69435078D1; FI962444A0; ES2160694T3; AU1383695A; EP0733115B1; CA2178636A1; WO1995016360A1; PT684770E; ATE387104T1; HK1097163A1; ATE329039T1; CN1118131A

Abstract

(57)【要約】本発明は糸状菌類トリコデルマ・ロンジブラチアトゥムにおける新規のトランケーション型セルラーゼタンパク質又はその誘導体のタローニング及び高レベル発現に関する。本発明の更なる観点は新規のトランケーション型セルラーゼ及び誘導体を発現する菌類形質転換体、並びに遺伝子工学技術を利用してトリコデルマ・ロンジブラチアトゥムに由来するトランケーション型セルラーゼをコードするDNA遺伝子フラグメント又はその変異体を含んで成る発現ベクターに関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規のセルラーゼ酵素及びその発現のための系発明の分野本発明は糸状菌類トリコデルマ−ロンジブラチアトゥム（Trichoderma longib rachiatum ）において高レベルの新規トランケーション型セルラーゼタンパク質を生産するための方法；遺伝子工学技術によりトリコデルマ・ロンジブラチアトゥムから製造した菌類形質転換体；及びかかる形質転換体により生産された新規のセルラーゼタンパク質に関する。発明の背景セルラーゼはセルロース（β−１，４−Ｄグルカン結合）を加水分解して一次生成物グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成する酵素である。セルラーゼは様々な微生物により生産され、そしていくつかの異なる酵素分類、例えばエクソ−セロビオヒドロラーゼ(CBH)、エンドグルカナーゼ（EG）及びβ−グルコシダーゼ（BG）として同定されているものを含んで成る（Schulein，M，198 8 Methods in Enzymology 160: 235-242）。更に、これらの分類における酵素は個別の成分へと分けることができる。例えば、糸状菌類トリコデルマ・ロンジブラチアトゥム（以降Ｔ．ロンジブラチアトゥム）により生産されるセルラーゼは少なくとも２つのCBH成分、即ち、CBHＩ及びCBHII、並びに少なくとも４つのEG 成分、即ち、EGＩ，EGII，EGIII及びEGＶ(Saloheimo，A．ら1993，Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Othe r Hydrolases，Espoo，Finland，P．Suominen & T． Reinikainen編、Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation R esearch 8: 139-146)成分、並びに少なくとも１のβ−グルコシダーゼより成る。これらの遺伝子をコードする遺伝子はそれぞれcbh1，cbh2，egl1，egl2及びeg l5 と命名されている。 CBH，EG及びBG成分を含んで成る完全セルラーゼ系は結晶性セルロースをグルコースに変換するのに相乗的に働く。２つのエクソ−セロビオヒドロラーゼ及び４つの現在知られているエンドグルカナーゼはセルロースを小さなセロ−オリゴ糖へと加水分解するのに一緒に働く。これらのオリゴ糖（主としてセロビオース）は次いで主要β−グルコシダーゼによりグルコースへと加水分解される（可能としては、微量なβ−グルコシダーゼ成分に由来して更に加水分解される）。Ｔ．ロンジブラチアトゥム由来のセロビオヒドロラーゼ(CBHＩ及びCBHII)並びに主要エンドグルカナーゼ（EGＩ及びEGII）のタンパク質分析は、二価構造がリンカー又はプロリン及びヒドロキシアミノ酸に富んだアミノ酸の柔軟性ヒンジストレッチにより分断された触媒性コアドメインと小型のセルロース結合性ドメインの形態において存在していることを示した。２種類のセロビオヒドロラーゼCB HＩ及びCBHIIについての遺伝子（Shoemaker，Sら、1983 Bio／Technology 1，69 1-696，Teeri，T.ら1983，Bio／Technology 1,696-699及びTeeri，T．ら1987，G ene 51，43-52）並びに２種の主要エンドグルカナーゼEGＩ及びEGIIの遺伝子（P enttila，M.ら1986，Gene 45，253-263，Van Arsdell，J.N／ら1987，Bio／Tech nology 5，60-64及びSaloheimo，M．ら1988，Gene 63，11-21）がＴ．ロンジブラチアトゥムから単離されており、そしてそのタンパク質ドメイン構造が確認されている。セルラーゼ酵素の類似の二価構造が細菌セルラーゼにおいて見い出されている。セルロモナス−フィミ（Cellulomonas fimi）エンドグルカナーゼＡ（C．fimi Cen A）のセルロース結合性ドメイン(CBD)及び触媒性コアがかなり研究されている(Ong E.ら、1989，Trends Biotechnol．7: 239-243，Pilzら19 90，Biochem J．271: 277-280及びWarrenら1987，Proteins 1: 335-341)。CBD及びCBDとリンカーをコードする遺伝子フラグメントがクローニングされており、Ｅ．コリ（E．coli）において発現され、そしてセルロースファイバーに対する新規の活性を有することが示されている(Gilkes，N.R.ら、1991，Microbiol Rev ．55: 305-315及びDin，Nら1991，Bio／Technology 9: 1096-1099)。例えば、Ｅ．コリ中で遺伝子的に発現されたＣ．フィミCen Aから単離されたCBDはセルロースファイバーの構造を破壊し、そして小粒子を遊離させるか、しかし検出できる加水分解活性はもたない。CBDはタンパク質精製及び酵素の固定における幅広い用途を有する。他方、プロテアーゼ解裂したセルラーゼから単離したＣ．フィミ Cen Aの触媒性ドメインはセルロースのフィブリル構造を破壊せず、その代わりファイバーの表面を滑らかにする。このような新規の活性は繊維、食品及び動物飼料、洗剤並びにパルプ及び製紙産業において潜在的な用途を有する。しかしながら、工業的用途にとって、任意の商業的価値を有するとされている現状得られる量よりも高いトランケーション型セルラーゼタンパク質の収率をもたらす非常に効率的な発現系を獲得しなくてはならない。例えば、トリコデルマ・ロンジブラチアトゥムCBHＩコアドメインはタンパク質分解的に分断され、そして精製されているが、しかしながらこの生化学的手順ではmgほどの量しか単離されていない（Offord D.,ら1991，Applied Biochem．and Biotech 28／29: 377-386）。生化学的タンパク質分解を経てＴ．ロンジブラチアトゥムから単離したCBHＩ，CBHII，EGＩ及びEGIIのコア及び結合性ドメインの分析において似たような研究がされているが、しかし構造及び機能分析のために足りるタンパク質しか回収されていない（Tomme，Pら、1988，Eur．J．Biochem 170: 575-5 81及びAjo，S，1991 FEBS 291: 45-49）。従来実現されたものよりもの高レベルのトランケーション型セルラーゼタンパク質を発現する株を得るため、出願人は発現にとって最も好ましい微生物としてＴ．ロンジブラチアトゥムを選択しており、なぜならそれは完全セルラーゼを大量に分泌する能力についてよく知られているからである。即ち、出願人は高レベルの生物工学型の新規のタンパク質トランケーション型セルラーゼを発現するよう上記の糸状菌類の株の遺伝子操作を行った。本願発明まで、トランケーション型セルラーゼ結合性及びコアドメインタンパク質をコードするDNAをトリコデルマの中に、新規トランケーション型セルラーゼ遺伝子を機能タンパク質へと宿主細胞の中での劣化を伴うことなく過剰発現できるように形質転換できること、並びにその操作された生成物の同定及び精製を助長するためにその分泌を獲得できることは知られていなかった。最近になって、NakariとPenttilaはトリコデルマEGＩセルラーゼのトランケーション型、特に触媒性コアドメインを発現させるようにトリコデルマ宿主を遺伝子操作することが可能であることを示しているが、しかしながらEGＩコアドメインのレベルは低い（Nakari，Tら、Abstract P1／63 1st European Conference on Fungal Genet ics，Nottingham，England，August 20-23，1992）。更に、トリコデルマセロビオヒドロラーゼ触媒性コアドメイン又は任意のトリコデルマセロビオヒドロラーゼもしくはエンドグルカナーゼセルロース結合性ドメインが組換遺伝子法によって製造できうることは知られていなかった。従って、本発明の目的はDNA遺伝子フラグメントを菌類トリコデルマ・ロンジブラチアトゥムに導入して、トリコデルマセルラーゼの結合性及びコアドメイン由来の高レベルの新規のトランケーション型タンパク質（ｇ／Ｌのレベル）操作セルラーゼを製造することにある。このトランケーション型タンパク質は適正にプロセシングされ、そして活性形態で細胞外的に分泌される。本発明は更にこれらの形質転換体から単離した新規のトランケーション型タンパク質に関する。発明の概要糸状菌類トリコデルマ種に由来する新規のトランケーション型セルラーゼタンパク質、その誘導体又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体の製造及び単離のための組換DNA技術及び組成に係る方法を提供する。このトランケーション型セルラーゼはトリコデルマ種由来のセロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼの少なくともコア又は結合性ドメインを含んで成る。トランケーション型セルラーゼの誘導体は、この新規のトランケーション型セルラーゼのコア又は結合性ドメイン全体の様々な部位において１又は複数のアミノ酸を置換、欠失又は付加を含み、これによりそのセルロース結合活性又はセルラーゼ触媒性コア活性はいづれも保持されている。共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は、互いと更に連結し合ったトランケーション型セルラーゼもしくはその誘導体、及び／又はトリコデルマ種と異種起源又は同種起源の酵素、又はドメイン及び／もしくはタンパク質、及び／又は化学物質を含んで成る。本発明は更に、宿主細胞の中に、構造遺伝子の転写及び翻訳を可能にする調節配列に機能的に付加されている上記の新規セルラーゼをコードする DNAフラグメント又はその変異体を含んで成るDNA構築体を形質転換し、そしてその宿主細胞を増殖させて注目のトランケーション型遺伝子を発現させることによる、新規のトランケーション型セルラーゼ、誘導体及び共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体の製造を含む。本発明は更に、新規のトランケーション型セルラーゼ、誘導体及び共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体をコードするDNAフラグメント及びその変異体を含む。本発明はまた上記のDNAフラグメント又はその変異体を含んで成る発現ベクター及び上記の発現ベクターにより形質転換されたトリコデルマ宿主細胞も包括する。図面の簡単な詳細な説明図１はトリコデルマ−ロンジブラチアトゥム由来のCBHＩのゲノムDNA及びアミノ酸配列を示す。シグナル配列は塩基対210で始まり、そして塩基対260で終わる（Seq ID No.25）。触媒性コアドメインは第１エクソンの塩基対261〜塩基対671 、第２エクソンの塩基対739〜塩基対1434、そして第３エクソンの塩基対1498〜塩基対713である（Seq ID No.９）。リンカー配列は塩基対714で始まり、そして塩基対1785で終わる（Seq ID No.17）。セルラーゼ結合性ドメインは塩基対1786 で始まり、そして塩基対1888で終わる（Seq ID No.１）。Seq ID No.26，10，18 及び２はそれぞれCBHＩシグナル配列、触媒性コアドメイン、リンカー領域及び結合性ドメインを示す。図２はトリコデルマ・ロンジブラチアトゥム由来のCBHIIのゲノムDNA及びアミノ酸配列を示す。シグナル配列は塩基614で始まり、そして塩基対685で終わる（Seq ID No.27）。セルロース結合性ドメインは第１エクソンの塩基対686〜塩基対707、そして第２エクソンの塩基対755〜塩基対8 51である（Seq ID No.３）。リンカー配列は塩基対852で始まり、そして塩基対9 80で終わる（Seq ID No.19）。触媒性コアドメインは第２エクソンの塩基対981 〜塩基対1141、第３エクソンの塩基対1199〜塩基対1445、そして第４エクソンの塩基対1536〜塩基対2221である（Seq ID No.９）。Seq ID No.28，４，20及び12 はそれぞれCBHIIシグナル配列、結合性ドメイン、リンカー領域及び触媒性コアドメインを示す。図３はEGＩのゲノムDNA及びアミノ酸配列を示す。シグナル配列は塩基113で始まり、そして塩基対178で終わる（Seq ID No.29）。触媒性コアドメインは第１エクソンの塩基対179〜塩基対882、そして第２エクソンの塩基対963〜塩基対137 9である（Seq ID No.13）。リンカー領域は塩基対1380で始まり、そして塩基対1 460で終わる（Seq ID No.21）。セルロース結合性ドメインは塩基対1461で始まり、そして塩基対1616で終わる（Seq ID No.５）。Seq ID No.30，14，22及び６はそれぞれEGＩシグナル配列、触媒性コアドメイン、リンカー領域及び結合性ドメインを示す。図４はEGIIのゲノムDNA及びアミノ酸配列を示す。シグナル配列は塩基262で始まり、そして塩基対324で終わる(Seq ID No.31)。セルロース結合性ドメインは塩基対325で始まり、そして塩基対432で終わる(Seq ID No.７)。リンカー領域は塩基対433で始まり、そして塩基対534で終わる(Seq ID No.23)。触媒性コアドメインは第１エクソンの塩基対535〜塩基対590)そして第２エクソンの塩基対765〜塩基対1689である(Seq ID No.15)。Seq ID No.32，８，24及び16はそれぞれEGII シグナル配列、結合性ドメイン、リンカー領域及び触媒性コアドメインを示す。図５はEGIIIのゲノムDNA及びアミノ酸配列を示す。シグナル配列は塩基151で始まり、そして塩基対198で終わる（Seq ID No.36）。触媒性コアドメインは第１エクソンの塩基対199〜塩基対557、第２エクソンの塩基対613〜塩基対833、そして第３エクソンの塩基対900〜塩基対973である（Seq ID No.33）。Seq ID No. 36及び34はそれぞれEGIIIシグナル配列及び触媒性コアドメインのアミノ酸配列を示す。図６はEGＩコアドメイン発現ベクターの構築体を示す（Seq ID No.37）。図７は発現プラスミドpTEXの構築体を示す（Seq ID No.39〜41）。図８はCBHＩコアドメイン発現ベクターの構築体の例である。図９はCBHIIセルラーゼ結合性ドメイン発現ベクターの構築体の例である（Seq ID No.41及び43）。詳細な説明上記の通り、本発明は新規のトランケーション型セルラーゼタンパク質の糸状菌類Ｔ．ロンジブラチアトゥムの中でのクローニング及び高レベルでの発現に一般的に関連する。本発明の更なる観点は本明細書において採用する用語の定義に従って更に詳細する。「トリコデルマ」又は「トリコデルマ種」なる語は、従来からトリコデルマに分類されている、又は現在トリコデルマに分類されている任意の菌類株をいう。好ましくは、これらの種はトリコデルマ・ロンジブラチアトゥム、トリコデルマ・リーセイ（T．reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（T．viride）である。「セルロース溶解酵素」又は「セルラーゼ酵素」なる語は菌類エクソグルカナーゼ又はエクソセロビオヒドロラーゼ(CBH)、エンドグルカナーゼ（EG）及びβ−グルコシダーゼ（BG）をいう。これら３種のセルラーゼ酵素は結晶性セルロースをグルコースに変換するのに相乗的に働く。CBHＩ， CBHII並びにEGＩ及びEGIIをコードする遺伝子の分析は、触媒性コア領域(CC D)、ヒンジ又はリンカー領域（同義語として使用）及びセルロース結合性領域(C BD)を含んで成るドメイン構造を示す。本明細書において用いる「トランケーション型セルラーゼ」なる語は、セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼのコア又は結合性ドメイン、例えばEGＩ，EGII，EGIII，EGＶ，CBHＩ及び、CBHII又はトランケーション型セルラーゼドメインのいづれかの誘導体を意味する。トランケーション型セルラーゼの「誘導体」は、セロビオヒドロラーゼのコア又は結合性ドメイン、例えばCBHＩ又はCBHII、並びにトリコデルマ種由来のエンドグルカナーゼ、例えばEGＩ，EGII，EGIII及びEGＶを包括しており、ここでこれらは、トランケーション型セルラーゼのＣ−末端及びＮ−末端の片方もしくは双方への１もしくは複数のアミノ酸の付加、トランケーション型セルラーゼが全体の１もしくは複数のアミノ酸での１もしくは複数の置換、トランケーション型セルラーゼタンパク質内の、又は片方もしくは双方での１もしくは複数のアミノ酸の欠失、又はトランケーション型セルラーゼタンパク質における１もしくは複数の部位での１もしくは複数のアミノ酸の挿入であって、エクソグルカナーゼ及びエンドグルカナーゼ活性がそのトランケーション型CBH及びEG触媒性コアトランケーション型タンパク質において保持されているもの、及び／又はセルロース結合活性が誘導型CBH及びEG結合性ドメイントランケーション型タンパク質において保持されているものであってよいまた、「トランケーション型セルラーゼの誘導体」は、リンカー領域由来の１又は複数のアミノ酸が付加されているエクソグルカナーゼ又はエンドグルカナーゼ酵素のコア又は結合性ドメインを含むことも意図している。トランケーション型セルラーゼタンパク質誘導体は更に、天然において見い出されるセルロース分解酵素を含んで成るが、改変アミノ酸配列を含むように操作されたセルラーゼコア又は結合性ドメインに対して構造及び生物活性的に実質的に類似するタンパク質を意味する。即ち、２種類のタンパク質が類似の活性を有することを条件として、それらは「誘導体」と考えられ、なぜならその用語は本明細書においては、たとえ一方のタンパク質の一次構造が他方において見い出せるのと同一のアミノ酸配列を有さないときでさえも使用しているからである。「セルラーゼ触媒コアドメイン活性」なる語は、本明細書においてはセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼのコアドメイン、例えばEGＩ，EGII，EGII I，EGＶ，CBHＩもしくはCBHII、又はそれらの誘導体であってパルプ又はリン酸膨潤セルロースの如くのセルロース系ポリマーを酵素的に切断できるものを含んで成るトランケーション型セルラーゼのアミノ酸配列を意味する。本明細書において定義するトランケーション型触媒性コアタンパク質又はその誘導体の活性は当業界公知の方法により決定できる（Wood，T.M.ら、Methods in Enzymology，Vol.160，編：Wood，W.A.及びKellogg，S.T.，Academic Press，p p.87-116，1988を参照のこと）。例えば、かかる活性はリン酸膨潤セルロース及び／又は可溶性オリゴ糖の加水分解、それに続く遊離した還元糖の定量により決定できる。この場合、CBH又はEG触媒性ドメイン又はその誘導体の作用により遊離した可溶性糖生成物は、HPLC分析、又は還元糖を測定する比色アッセイの利用により検出できる。これらの触媒性ドメイン又はその誘導体は、それぞれを類似の条件下でアッセイし、そして類似の量の触媒性ドメインのタンパク質に基づいて投与したときに、インタクト酵素により示される活性の少なくとも10％を保持するであろう。「セルロース結合性ドメイン活性体」なる語は、本明細書においてはセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼの結合性ドメイン、例えばEGＩ，EGII，CB HＩもしくはCBHII、又はその誘導体であってセルロースの如くの多糖に非共有的に結合するものを含んで成るセルラーゼのアミノ酸配列を意味する。セルロース結合性ドメイン(CBD)は、タンパク質をセルロースに付加するのにセルラーゼ酵素の触媒性コアとは独立して機能するものと信じられている。本発明において述べられているトランケーション型結合性ドメイン又はその誘導体の性能（又は活性）は、アビセル（avicel）、パルプ又は綿の如くのセルロース系基質を利用するセルロース結合性アッセイにより決定できうる。これらの新規トランケーション型結合性ドメイン又はその誘導体は、インタクト酵素により示されるものと比べ、それぞれを類似の条件下でアッセイし、そして類似の量の結合性ドメインタンパク質に基づいて投与したとき、少なくとも10％の結合性親和力を保持するであろう。未結合の結合性ドメインの量は直接タンパク質分析、クロマトグラフィー法、又は可能としては免疫学的方法により定量されうる。特定の処理基質の物理的又は化学的特性を介してセルラーゼ触媒性及び／又は結合活性を測定する当業界に公知のその他の方法も本発明において適切でありうる。例えば、処理基板の物理特性を測定する方法に関し、その基質は形状、テキスチャー、表面、もしくは構造特性の改変、又は「濡れ」能力の改変、例えば基質の吸水能力、又は膨潤性の改変について分析する。活性を決定しうるその他のパラメーターには、処理した固体基質の化学特性における変化の測定が含まれる。例えば、色素又は化学物質の拡散特性を、固体基質を本発明において述べているトランケーション型セルラーゼ結合性タンパク質又はその誘導体による処理の後に調べてよい。活性を評価するのに適当な基質には、アビセル、レーヨン、パルプファイバー、綿又はラミ−ファイバー、紙、クラフト又は顆粒木材パルプ等が含まれる。（Wood，T.M.ら、「Methods in Enzymology」，Vol．160，編：Woo d，W.A.及びKellogg，S.T.，Academic Press，pp.87-116，1988を参照のこと）。「リンカー又はヒンジ領域」なる語は、菌類セルラーゼの２つの異なる機能性ドメイン、即ち、コアドメインと結合性ドメインとを連結させ合う短いペプチド領域を意味する。Ｔ．ロンジブラチアトゥムセルラーゼにおけるこれらのドメインはSer，Thr及びProに富むペプチドにより連結されている。「シグナル配列」は、細胞外への成熟型タンパク質の分泌を助長するタンパク質のＮ−末端領域に結合したアミノ酸の任意の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能的なものである。細胞外タンパク質の成熟形態はシグナル配列を欠き、それは分泌過程中に切断されてしまう。「変異体」なる語は、CBH又はEGのコア又は結合性ドメインをコードするDNAフラグメントを意味し、それはDNAフラグメントの内部に又はその５′もしくは３ ′末端に１又は複数個のヌクレオチドの付加を、DNAフラグメントの内部に又はその５′もしくは３′末端に１又は複数個のヌクレオチドの欠失を、又はDNAフラグメントの内部に又はその５′もしくは３′末端に１又は複数個のヌクレオチドの置換を更に含んで成ってよく、ここでトランケーション型セルラーゼをコードする結合性及びコアドメインの機能活性は保持されている。コア又は結合性ドメインを含んで成る変異DNAフラグメントは更に、リンカー又はヒンジDNA配列又はその一部が５′又は３′末端のいづれかにおいてコア又は結合性ドメインDNA配列に付加されていることがあることも意図することを意味し、ここでコードされるトランケーション型結合性又はコアドメインタンパク質（誘導体）の機能活性は保持されている。「宿主細胞」なる語は、細胞、及びトリコデルマ種の細胞から作り上げたプロトプラストの双方を意味する。「DNA構築体又はベクター」（本明細書では同義語として用いられている）は上記の新規のトランケーション型セルラーゼ又は誘導体のいづれかをコードする１又は複数のDNAフラグメント又はDNA変異フラグメントを含んで成るベクターに関する。「機能的に付加」なる語は、調節領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又はエンハンサー領域が構造遺伝子に付加されており、そしてその遺伝子の発現をコントロールしていることを意味する。本発明はトランケーション型セルラーゼ、トランケーション型セルラーゼの誘導体及び共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体に関連し、それは宿主細胞の中に、プロモーターに機能的に付加されたセロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼの結合性又はコア領域、例えばEGＩ，EGII，EGIII，E GＶ，CBHＩ又はCBHIIの一部又は全体を少なくともコードするDNAのフラグメントを含んで成るDNA構築体を形質転換し、この宿主細胞を増殖させて注目のトランケーション型セルラーゼ、誘導トランケーション型セルラーゼ又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体を発現させ、次いでこのトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体を実質的に均質となるまで精製することによって調製される。本発明によって更に考慮されるのは、例えば本発明のトランケーション型エンドグルカナーゼ又はエクソセロビオヒドロラーゼに由来するコア領域を菌類及び細菌の如くのいく種かの微生物起源由来のその他のセルラーゼ酵素に由来するセルロース結合性ドメインと結合させた、セルラーゼ酵素の新規の誘導体を作製できうることである。他方、その他のセルラーゼ酵素に由来するコア領域を、本発明のトランケーション型エンドグルカナーゼ又はエクソセロビオヒドロラーゼ由来のセルロース結合性ドメインと結合させることが可能でありうる。特定の態様において、コア領域は、天然においてはセルロース結合性ドメイン、例えばEGII I（図５、並びにSEQ ID No.33及び34）を含んで成らないセルラーゼ酵素に由来してよく、そしてそれは上記のセルロース結合性ドメインを含んで成るトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体によりＮ−又はＣ−末端が延長されている。これにより、天然のインタクトセルラーゼと比べ、改変されたセルロース結合特性を有する新規のセルラーゼ酵素を構築することが可能でありうる。本発明の更なる別の観点において、本発明のトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体は更に、互い同志と、及び／又はインタクトタンパク質と、及び／又は酵素と、及び／又はそれらの一部と、例えばヘミセルラーゼ、イムノグロブリンと、及び／又は非トリコデルマセルラーゼ由来の結合性もしくはコアドメインと、及び／又は非セルラーゼ酵素由来の結合性もしくはコアドメインと、上記の組換法を利用して付加させて、新規の共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体を形成せしめてよいことが考慮される。このようにして構築されたこれらの共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は、本発明において開示されたトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体よりも更なる利点を供しうる。その他の酵素、タンパク質又はその一部を含むこれらの共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は二価活性及び／又は二価結合能を示しうる。更なる観点において、本発明はトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体を製造する方法に関連し、その方法は上記の宿主細胞を、このトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体の生成が行われるような条件下で培養し、次いでその細胞又は培養培地からこのトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体を回収することを含んで成る。高純度のトランケーション型セルラーゼは本発明において、以下に更に詳細の通りに微生物を遺伝子的に改変することにより調製される。形質転換微生物培養物を定常期となるまで増殖させ、濾過して細胞を除去し、そして残留上清液を限外濾過により濃縮してトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体を得る。上記の方法の特定の観点において、形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地はトリコデルマにおけるセルラーゼ生産に適する任意の培地であってよい。このトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体は慣用の技術、たとえば遠心又は濾過による培地からの細胞の分離、上清又は濾過中のタンパク質の塩、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、それに続くイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の如くのクロマトグラフィー手順による沈殿により、培地から回収できる。他方、この最終タンパク質生成物は、多糖類支持体又は抗体マトリックスに結合させることによって単離精製できうる。抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）をセルラーゼコアもしくは結合性ドメインペプチドに対して生起させるか、又はコアドメインもしくは結合性ドメインの一部から合成ペプチドを調製し、そしてポリクローナル抗体を生起させるのに用いてよい。本法の一般的な態様において、１又は複数の機能的に活性なトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体を、トランケーション型セルラーゼ、その誘導体又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導タンパク質をコードする１又は複数のDNAフラグメント又は変異フラグメントを含んで成るDNAベクターで形質転換したトリコデルマ宿主細胞の中で発現させる。このトリコデルマ宿主細胞は、インタクトセルラーゼをコードする任意の宿主遺伝子を取り除く遺伝子操作に予めかけられていてもかけられていなくてもよい。特定の態様において、トランケーション型セルラーゼ、その誘導体又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体を、遺伝子が失わされていない形質転換トリコデルマ細胞の中で発現させる。上記のトランケーション型タンパク質を回収し、そしてサイズクロマトグラフィーを含む上記の慣用の手順により宿主細胞の中で同時に発現されたインタクトセルラーゼから分離する。トランケーション型セルラーゼ又は誘導体の発現の確認はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンイムノブロット分析により決定して、トランケーション型をインタクトセルラーゼタンパク質と区別する。好適な態様において、本発明はトランケーション型セルラーゼ、その誘導体又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体をコードする１又は複数のDNAフラグメントにより当業界に公知の組換DNA技術を利用して、１又は複数のセルラーゼ活性を欠くトリコデルマ種宿主細胞を形質転換せしめ、そしてこの細胞を処理する方法に関する。誘導トランケーション型セルラーゼコア又は結合性ドメインをコードするDNAフラグメントは、活性トランケーション型セルラーゼ誘導体をコードする変異DNAを製造するように、この遺伝子内を例えば欠失、挿入又は置換により改変させることができることが考慮される。本発明により更に考慮されるのは、トランケーション型セルラーゼ又は誘導体をコードするDNAフラグメント又はDNA変異フラグメントを菌類プロモーター配列、例えばcbh1又はegl1遺伝子のプロモーターに機能的に付加させれることである。本発明により更に考慮されるのは、トリコデルマ種の株を、トランケーション型セルラーゼ又はその誘導体をコードするDNAフラグメントがゲノム内に挿入されるようにする形質転換を介して操作することにある。また、トランケーション型セルラーゼDNAフラグメント又はDNA変異フラグメントの複数のコピーを株の中に組換えることができうることも考慮される。形質転換菌類の欠失ができるように選択マーカーをまず選定しなくてはならない。トリコデルマ種において発現させる任意の選択マーカー遺伝子は、形質転換体におけるその存在がその性質に実質的に影響を及ぼさないであろうように、本発明において利用できうる。この選択マーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。選択マーカーはトリコデルマ種遺伝子の機能性コピーであってよく、それは宿主株において欠失しているなら、独立栄養性表現型を示す宿主株をもたらす。使用する宿主株は、非機能性遺伝子又は選定の選択マーカーに対応する遺伝子を欠く又は有するトリコデルマ種の誘導体であってよい。例えば、pyr4の選択マーカーを選定したら、特異的なpyr誘導株を形質転換手順の受容体として使用する。本発明において利用できるその他の選択マーカーの例には、アスペルギルス・ニドウランス遺伝子argB ，trpC，niaD等に相当するトリコデルマ種の遺伝子が含まれる。従って、対応の受容株はargB ^-，trpC ^-，niaD ^-等の如くの誘導株でなくてはならない。この株は任意のトリコデルマ種株である出発宿主株に由来する。しかしながら、Ｔ．ロンジブラチアトゥムセルラーゼ過剰生産株、例えばSheir-Neissら、App l．Microbiol．Biotechnology，20（1984）pp.46-53に記載のRL-P37を利用するのが好ましく、なぜならこの株は大量のセルラーゼ酵素を分泌するからである。この株を次に形質転換工程において利用する誘導株を作るのに用いる。トリコデルマ種の誘導株は当業界に公知のいくつかの技術により調製できる。その例は、pyr4 ^-誘導株の製造であり、それは株をフルオロオロチン酸(FOA)にかけることによる。pyr4遺伝子はウリジンの生合成に必要な酵素であるオルチジン −５′−一リン酸デカルボキシラーゼをコードする。インタクトpyr4遺伝子を有する株はウリジンを欠く培地の中で増殖するが、フルオロオロチン酸に感受性である。機能性オルチジン−リン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠き、且つウリジンを必要とするpyr4 ^-誘導株はFOA耐性について選別することにより選択可能である。FOA選択技術を利用して、機能性オロチン酸ピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を獲得することも可能である。これらの細胞をこの酵素をコードする遺伝子の機能性コピーで形質転換させることが可能である（Be rges and Barreau，1991，Curr．Genet．19 pp 359-365）。本発明においてFOA 耐性技術を利用して誘導株を選定するのは簡単であるため、選択マーカーとしてpyr4 遺伝子を利用することが好ましい。本発明の好適な態様において、トリコデルマ宿主細胞株は、注目のトランケーション型セルラーゼタンパク質をコードするDNAフラグメントを含むDNA構築体又はプラスミドの導入の前に、１又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠失させておく。同定及びその後の精製手順を簡単にするため、１又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠く宿主の中で、トランケーション型セルラーゼ、その誘導体、又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体を発現させることが好ましい。クローニングしたトリコデルマ種由来の任意の遺伝子は、例えばcbh1 ，cbh2，egl1，egl3等を欠いていてよい。遺伝子欠失のためのプラスミドは、相同性トリコデルマ種DNAのフラグメントが単一断片として除去できるよう、固有制限酵素部位がその中に存在しているものを選定する。形質転換体から欠失させる所望の遺伝子を当業界公知の方法によりプラスミドの中に挿入する。欠失又は破綻すべき遺伝子を含むプラスミドをコード領域の内部の適当な制限酵素部位で切断し、その遺伝子コード配列又はその一部をそれから取り出し、そして選択マーカーを挿入する。欠失又は破綻すべき遺伝子座由来の隣接DNA配列(好ましくは約0.5〜2.0kb)が選択マーカー遺伝子のいづれか側に載っている。欠失構築体を含む一本のDNAフラグメントをプラスミドから単離し、そして適当なpyr^- トリコデルマ宿主を形質転換するのに用いる。形質転換体はpyr4遺伝子生成物を発現する、それ故宿主株のウリジン独立栄養性に寄与するその能力に基づいて選定される。次いで、欠失すべき遺伝子のコード領域の一部又は全てをpyr4選択マーカーに置き換えるダブルクロスオーバー組込み現象を同定及び確認するため、得られる形質転換に基づいてサザンブロット分析を実施する。特定のプラスミドベクターを述べてきたが、本発明はこれらのベクターの製造に制約されない。上記の技術を利用して、トリコデルマ種株において様々な遺伝子を欠失させ、そして変換してよい。上記の任意の有用な選択マーカーを利用してよい。潜在的に、クローニングされ、それ故同定された任意のトリコデルマ種遺伝子を、上記の手法を利用してゲノムから欠失させてよい。これらの変異法は全て本発明に含まれる。本発明のトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体をコードする挿入されたDNAフラグメント又は変異DNAフラグメントを担持する本発明の発現ベクターは、一定の宿主生物の中で自己複製可能な任意のベクター、一般にはプラスミドであってよい。好適な態様において、遺伝子又はそのトランケーション体の発現を獲得するための２タイプの発現ベクターが考えられる。第一のタイプは、DNA配列であって、その中のプロモーター、遺伝子コード領域及びターミネーター配列が全て発現すべき遺伝子を起源とするものを含む。遺伝子トランケーション体は、不要のDNA配列（不要のドメインをコードする）を除去し、それ自体の転写及び翻訳調節配列のコントロール下で発現されるドメインを残すことによって得られる。選択マーカーもベクター上に含まれ、新規の遺伝子配列の複数のコピーの宿主の中への組込みについての選択を可能にする。例えば、ΔpEG ＩΔ３′pyrはEGＩプロモーター、ターミネーター及びシグナル配列のコントロール下にあるEGＩセルラーゼコアドメインを含む。セルロース結合性ドメインを含むEGＩコード領域上の３′末端は欠失されている。このプラスミドは選択の目的でpyr4遺伝子も含む。第２タイプの発現ベクターを予備集成し、そして高レベルの転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。遺伝子又はその一部についてのコード領域はこの一般的な目的の発現ベクターの中に、発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写コントロール下となるように、挿入できることが考慮される。例えば、pTEXが一般目的用ベクターである。遺伝子又はその一部は強力なCBH Ｉプロモーターの下流に挿入してよい。本明細書に開示の例には、セルラーゼ触媒性コア及び結合性ドメインがこの系を利用して発現されることを示す例が含まれる。このベクターにおいて、本発明のトランケーション型セルラーゼ又はその他の新規のタンパク質をコードするDNA配列は転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列と、構造遺伝子に対して解読枠内で作動連結されているべきである。このプロモーターは、宿主細胞において転写活性を示し、且つその宿主細胞に対して同種起源又は異種起源のいづれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる任意のDNA配列であってよい。このシグナルペプチドはトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体の細胞外発現を担っている。このDNAシグナル配列は好ましくは発現すべきトランケーション型遺伝子と天然に連結しているシグナル配列であるが、しかしながら任意のセロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ由来のシグナル配列が本発明において考慮されている。本発明のトランケーション型セルラーゼ、その誘導体又はその他の新規のセルラーゼをコードするDNA配列をプロモーターにライゲーションする手順、及び宿主細胞内での複製にとって必須の情報を含む適当なベクターへの挿入は当業界に公知である。上記のDNAベクター又は構築体は公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティックボンバードメント等に従って宿主細胞の中に導入してよい。好適な形質転換技術において、トリコデルマ種における細胞壁の透過性は非常に低いため、所望のDNA配列、遺伝子又は遺伝子フラグメントの取込みはよくてもわずかであることを念頭に置かねばならない。形質転換工程の前に誘導株（即ち、使用した選択マーカーに対応する機能遺伝子を欠くもの）におけるトリコデルマ種細胞壁の透過性を高める数多くの方法がある。形質転換のためにトリコデルマ種を準備する本発明における好適な方法は、菌糸からのプロトプラストの調製を含む。菌糸は発芽した植物胞子から得られうる。菌糸を細胞壁消化酵素で処理してプロトプラストを得る。このプロトプラストを懸濁培地中の浸透圧安定剤の存在により保護する。これらの安定剤にはソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等が含まれる。通常、これらの安定剤の濃度は0.8Ｍ〜1.2Ｍの間とする。懸濁培地の中で約1.2Ｍのソルビトール溶液を使用することが好ましい。宿主トリコデルマ種株へのDNAの取込みはカルシウムイオン濃度依存性である。一般に取込み溶液中で約10mMのCaCl₂〜50mMのCaCl₂を利用する。取込み溶液中でのカルシウムイオンの必要性の他に、一般に含まれるその他の品目には緩衝系、例えばTEバッファー（10mMのトリスpH7.4；１mMのEDIA）又は10mMのMOPS，pH6 .0バッファー（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール(P EG)が含まれる。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合するのに働くものと信じられており、それ故トリコデルマ種株の細胞頁に培地の含有物を運び入れ、そしてプラスミドDNAは核に移される。この融合は往々にしてプラスミドDNAの複数のコピーが宿主染色体の中に直引式に組込まれるようにする。通常、トリコデルマ種プロトプラスト又は浸透性処理された細胞を10⁸〜10⁹／ ml、好ましくは２×10⁸／mlの密度で含む懸濁物を形質転換において使用する。これらのプロトプラスト又は細胞は、所望の線形化選択マーカーであってそのマーカーのいづれか側上に実質的に相同性の隣接領域を有しているマーカーと一緒に取込み溶液に加え、形質転換混合物を形成する。一般に高濃度のPEGを取込み溶液に加える。0.1〜１容量の25％のPE G4000をプロトプラスト懸濁物に加えてよい。しかしながら、プロトプラスト懸濁物に約0.25容量を加えるのが好ましい。添加剤、例えばジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取込み溶液に加えて形質転換を補助してよい。一般に、この混合物を約０℃で10〜30分インキュベーションする。所望の遺伝子又はDNA配列の取込みを更に高めるために追加のPEGをこの混合物に加えてよい。25％のPEG4000を一般に形質転換混合物の容量の５〜15倍容量で加える。しかしながら、一層多い、又は一層少ない容量が適当でありうる。25％のPEG4000は好ましくは形質転換混合物の約10倍の容量とする。PEGを加えた後、形質転換混合物を室温でインキュベートし、それからソルビトール及びCaCl₂溶液を添加する。次いで更にプロトプラスト懸濁物を増殖培地の溶融アリコートに加える。この増殖培地は形質転換体の増殖のみを可能にする。所望の形質転換体を増殖するのに適当な任意の増殖培地を本発明において使用してよい。しかしながら、もしPyr ^± 形質転換体を選定するなら、ウリジンを含まない増殖培地を使用するのが好ましい。その結果得られるコロニーを、ウリジンを欠く増殖培地に移して精製する。この段階で、安定な形質転換体は不安定な形質転換体から、その速い増殖速度、及びウリジンを欠く固体培養培地上でのでこぼこな外形でなく滑らかな円形コロニーの形成により区別される。更に、あるケースにおいては、固体非選択培地（即ち、ウリジンを含む）上で形質転換体を増殖させ、この培養培地から胞子を回収し、そしてその後も発芽してウリジンを欠く選択培地上で増殖するであろうかかる胞子の比率で決定することにより、安定性の更なる試験を行った。上記の方法の特定の態様において、トランケーション型セルラーゼ又はその誘導体は、新規のトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体の適正な後翻訳プロセシングの結果として、宿主細胞から活性形態で回収される。本発明は更に、トランケーション型セルラーゼタンパク質又はトランケーション型セルラーゼタンパク質誘導体のそれぞれをコードするトリコデルマ種由来の DNA遺伝子フラグメント又は変異DNAフラグメントに関する。本発明のDNA遺伝子フラグメント又は変異DNAフラグメントは、トランケーション型コア又は結合性部位のそれぞれの機能活性を更に保持しているトリコデルマ種のセルラーゼ又はその誘導体のコア又は結合性ドメインをコードする。更に、コア又は結合性ドメイン領域の配列を含んで成るDNAフラグメント又はその変異体にはリンカー、又はヒンジ領域DNA配列もしくはその一部が更に付加されていてよく、ただしこのコードされるトランケーション型セルラーゼはセルラーゼコア又は結合性ドメイン活性のそれぞれを保持し続けている。更に、その他の注目のタンパク質又は酵素をコードする追加のDNA配列が、トランケーション型DNA遺伝子フラグメント又は変位DNAフラグメントに付加してよく、これにより、上記のベクターの構築及びタンパク質の発現の方法に従い、インタクト酵素又はタンパク質に融合したトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体が回収されうる。酵素又はタンパク質に融合した発現トランケーション型セルラーゼは、酵素／タンパク質と複合させるのに選定したトランケーション型セルラーゼに依存して、活性セルラーゼ結合性又はコア活性を保持しているであろう。インタクトセルラーゼ酵素の利用に対してのセルロース結合性ドメイン及びセルラーゼ触媒性コアドメイン又はその誘導体の利用は複数の用途において有利でありうる。従って、本発明の更なる観点は、インタクトセルラーゼと比べ、適用した基質に更なる利点を供する新規のトランケーション型セルラーゼ又はトランケーション型セルラーゼの誘導体を利用する方法を提供する。かかる用途には、ストーンウォッシング又はバイオポリシングが含まれ、これらでは、染料／着色料／顔料の戻り染色又は再付着は、例えばセルロース結合性ドメインを欠くように改変された又はセルロースに対して有意に低い親和力を有する結合性ドメインを有するように改変された新規のトランケーション型セルラーゼを採用することにより、低減又は失われる。更に、例えば繊維、洗剤、パルプ及び製紙、動物飼料、食品、バイオマス産業における注目の一定の基質に対する活性は有意に高めることができるか、又は結合性ドメインが除かれているとき、もしくはセルロースに対する酵素の結合親和力が低められているとき、有意に低めることができる。更に、触媒性ドメイン又は機能性触媒性ドメインを欠く機能性結合性ドメインフラグメントを含んで成る本発明に記載のトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体の利用は、セルロース基質の選定の改変のみを所望する用途において有利でありうる。改変できる特性には、例えば水和性、膨潤性、染料の拡散性及び取込み、手触り、摩擦性、柔軟性、清浄性及び／又は表面もしくは構造改善が含まれうる。更に、セルラーゼ酵素の一部の触媒性ドメインの発現及び利用は、改善された酵素の回収能力を、特により結晶性の基質に対してより低い活性を所望するとき、又はアモルファス／可溶性基質に対する高い活性を所望するときに応じて、供するであろうことが考えられる。更に、セルラーゼ酵素の触媒性ドメインは、例えばバイオマス変換、清浄、ストーンウォッシング、繊維のバイオポリシング、柔軟仕上げ、パルプ／製紙工程、動物飼料利用、植物保護及びペスト制御、デンプン処理、又は医薬品中間体、二糖類もしくはオリゴ糖類の製造において、セルロース系セルロース含有材料に対するその他のセルラーゼ成分、セルラーゼもしくは非セルラーゼドメイン、及び／又はその他の酵素もしくはその一部との相乗性を高めるのに有用でありうる。更に、セルラーゼ触媒性コアドメイン又はその誘導体の利用はパルプ、綿又はその他のファイバーもしくは紙の如くのセルロース類に及ぼすインタクト酵素に係る有害な特性の一部を軽減しうる。注目の特性には、ファイバー／布帛強度損失、ファイバー／布帛重量損失、糸くずの発生、及びフィブリル化損傷が含まれる。セルラーゼ触媒性コアドメインはより少ないファイバー起伏形成又は低まった着色料の再付着／戻り染料を示しうる。更に、これらのトランケーション型触媒性コアセルラーゼ又はその誘導体はこのような新規のセルラーゼの改善された回収／リサイクルについての選択を供しうる。更に、本発明におけるセルラーゼ触媒性コアドメイン又はその誘導体は、基質の可溶性又はよりアモルファスなセルロース領域の加水分解が所望されるが、より結晶性の領域の加水分解は所望されない場合に選定の活性利点を含みうる。これは殻粒／ファイバー／植物材料の選択改変が注目されるバイオ変換の如くの用途において重要でありうる。新規のセルラーゼ触媒性コアドメイン又は誘導体を適用する更なる別の観点は微結晶性セルロース(MCC)の作製にある。更に、MCCは少ない結合酵素しか含まないか、又は結合酵素はより簡単に除去できるであろうことが考えられる。更に、上記の新規の共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は基質に対する酵素又は改変酵素のアクセスをコントロールする用途を有しうることが考えられる。これはプロテアーゼ基質を含むウールもしくはその他の材料に対するプロテアーゼのアクセスをコントロールすること、又はセルロース類へのセルロースのアクセスをコントロールすることを含みうる。最後に、この新規のトランケーション型セルラーゼ又はその誘導体は固有のモノ−、デュアル−又はマルチ酵素系に適用してよい。その例として、これにはセルラーゼドメインを互いに、及び／又は１もしくは複数のプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ及び／もしくはアミラーゼ酵素と連結することが含まれうる。これらの酵素又はセルラーゼドメインはその間のリンカー領域により融合され合ってよい。このリンカー領域は機能的な利点のないペプチドであるか、又はセルロース結合性ドメインペプチド又はその他の基質もしくは物質、例えばウール、キシラン、マンナン、樹脂、リグニン、染料、着色料、顔料、ワックス、プラスチック、炭水化物ポリマー、脂質、アミノ酸ポリマー、合成ポリマーに対する高親和力を有するペプチドを含みうる。本発明の新規のセルラーゼドメイン又はその誘導体はインタクト酵素に類似の又はそれより優れたいくつかの性能特性を供しうる。この新規のトランケーション型セルラーゼはこれらの特性のみを供しうるか、又はセルラーゼもしくはセルラーゼコア、その他の酵素（例えばリパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リダクターゼ、エステラーゼ）、その他のタンパク質又は化学物質との相乗的な利点を示しうる。これらの特性には、セルロース系表面のでこぼこ形成又は滑らか仕上げ、清浄もしくはパルプ加工の如くにおけるその他の酵素に対する改善された応答についてのセルロース類の改変、動物飼料の利用、又はセルロース類（植物細胞壁を含む）による改善された生化学／化学取込みが含まれうる。更に、本発明におけるトランケーション型セルラーゼ結合性ドメイン、その誘導体又はトランケーション型の共有結合したセルラーゼドメイン誘導体は、エンドグルカナーゼ及び／又はエクソセロビオヒドロラーゼ、改変セルラーゼ又は完全セルラーゼ系と共に、セルロース類に対する高められた又は相乗性の活性を供しうることが考えられる。これはセルロース材料を連結するうえで接着特性も供しうる。更に、新規のトランケーション型セルラーゼ結合性ドメインもしくはその誘導体又は共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は、精製目的のための新規のリガンドとして、セルロース類又はその他のポリマーの改変のための試薬もしくはリガンドとしての用途、例えば着色料、染料、インク、仕上げ剤、樹脂、化学物質、生化学物質又はタンパク質をセルロース類に連結する用途に有用でありうることが考えられる。これらの材料は、所望するならば、プロテアーゼ又はその他の化学的方法によって任意の段階において除去できる。更に、この新規のトランケーション型セルラーゼ結合性ドメイン又は共有結合したトランケーション型セルロースドメイン誘導体を微量なレベルの物質の検出及び分析において利用できることが考えられ、例えばこのトランケーション型ドメイン及び誘導体並びに共有結合したトランケーション型セルラーゼドメイン誘導体は、識別できるようにする物質、例えば染料と反応又は結合するタンパク質又は化学物質を含みうる。最後に、新規のトランケーション型結合性もしくはコアドメインセルラーゼ又はそれらの誘導体を、インタクトセルラーゼ、その他のセルラーゼコアもしくは結合性ドメイン、又はその他の酵素／タンパク質と複合もしくは融合して、安定性、又はその他の性能特性、例えばpHもしくは温度活性プロフィールの改変を改善せしめることが考えられる。本明細書に記載の公開物及び特許出願は全て引用することで本明細書に組入れる。本発明及びその利点を更に説明するため、以下の特定の実施例を提供し、それらは本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。実施例実施例１ EGＩコアドメイン自体のプロモーター、ターミネーター及びシグナル配列を利用してそのクローニング及び発現パート１．クローニング EGＩコアドメイン発現プラスミドPEG1Δ３′pyrの構築において利用する完全e gl1 遺伝子をプラスミドPUC218::EGＩから得た（図６参照のこと）。egl1の３′ ターミネーター領域をPUC218（korman，D.らCurr Genet 17: 203-212，1990）の中に、300bpのBsmＩ−EcoRＩフラグメントとして３′イントロン及びセルロース結合性ドメインを停止コドンに置き換え、そしてegl1ターミネーター配列が続くようにデザインした合成リンカーと一緒にライゲーションした。得られるプラスミドPEG 1TをHindIII及びBsm Ｉで消化し、そしてベクターフラグメントをその消化物からアガロースゲル電気泳動、それに続く電気溶離により単離した。egl1 遺伝子プロモーター配列及びegl1のコアドメインをPUC218::EGＩから2.3kbのHin d III−Sst Ｉフラグメントとして単離し、そして同じ合成リンカーフラグメント及びHindIII −Bsm Ｉ消化PEG 1TとライゲーションしてPBG1Δ３′を形成した。これらの操作の正味の結果は、egl1の３′イントロン及びセルロース結合性ドメインを53及び55bpの合成オリゴヌクレオチドと交換することにある。これらは TAG停止コドンをセリン415の後方に設置し、その後にegl1ターミネーターがBsm Ｉ部位に至るまで続く。次に、Ｔ．ロンジブラチアトゥム選択マーカーpyr4を従来のクローンp219M(Sm ithら、1991)から、単離された1.6kbのEcoRＩ−HindIIIフラグメントとして得た。これを最終発現プラスミドPEG1Δ３′pyrの中に、EcoRＩで消化し、そして仔牛アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化したPUC18プラスミド、及びPEG1 Δ３′由来のegl1コアドメイン含有のHindIII−EcoRＩフラグメントとの三方向ライゲーションにおいて組込んだ。パート２．形質転換及び発現大量スケールのDNAプレプはΔPEG1Δ３′pyrより成り、そしてこれよりegl1コアドメイン及びpyr4遺伝子を含むEcoRＩフラグメントを調製ゲル電気泳動により単離した。単離したフラグメントをウリジン独立栄養性バージョンquad欠失型株 1A52 pyr13（米国特許出願第07／770,049号、08／048,728号及び08／048,881号に記載；その全内容を引用することで本明細書に組入れる）に形質転換し、そして安定な形質転換体を同定した。どの形質転換体がegl1コアドメインを発現するかを選定するため、形質転換性をセルラーゼ遺伝子の誘導を好む条件下（Vogels＋１％のラクトース）で振盪フラスコの中で増殖させた。４〜５日間の増殖の後、上清液由来のタンパク質を濃縮し、そして１）SDSポリアクリルアミドゲルで泳動させてからEGＩポリクローナル抗体を用いウェスタン分析によりegl1コアドメインの検定を行うか、又は２）濃縮上清液をエンドグルカナーゼ特異的基質としてRBBカルボキシメチルセルロースを用いて直接アッセイし、そしてその結果をコントロールとしての親株1A52と比較するかのいづれかを行った。形質転換体の候補は、トランケーション型EGＩコアドメインタンパク質を生産する可能性に従って同定した。ゲノムDNA及び全mRNAを、V ogels＋１′のラクトース上での増殖を経たこれらの株から単離し、そしてegl1 コアドメインのみを含む単離したDNAフラグメントを用いてサザン及びノーザンブロット実験を行った。これらの実験は、1A52のゲノムに組込まれたgel1コアドメイン発現カセットのコピーを有する形質転換体が単離できること、及びこれらの形質転換体がegl1コアドメインmRNAを生成することを示した。一の形質転換体、14Ｌの発酵槽中のラクトースの添加された当業界に公知のトリコデルマにおけるセルラーゼ生産に適する培地（Warzymoda，M．ら、1984フランス国特許2,555,603号）を用いて増殖させた。得られる培養液を濃縮し、そしてその中に含まれているタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分け、そしてEgl1コアドメインタンパク質をウェスタン分析により同定した（以下の実施例３参照のこと）。その結果、発酵上清液のタンパク質濃度は約５〜６ｇ／Ｌであり、その約1.7〜4.4ｇ／ＬがCMCase活性に基づきEGＩコアドメインであった。この値は実施したいくつかのEGＩコア発酵の平均に基づく。同様にして、任意のその他のセルラーゼドメイン又はその誘導体が上記と似た手順により製造できうる。実施例２ EGＩ及びEGII触媒性コアの精製パート１．EGＩ触媒性コア EGＩコアを以下の方法で精製した。濃縮（UF）培養液を珪藻土を用いて濾過し、そしてその培養液に硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍの(NH₄)₂SO₄となるまで加えた。これを疎水性カラム（フェニル−セファロース・ファストフロー、Phar macia，Cat # 17-0695-02）に載せ、そして１Ｍ〜０Ｍの(NH₄)₂SO₄に至る塩勾配により溶離させた。EGＩコアを含む画分をプールし、そして10mMのTES pH7.5と交換した。この溶液を陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロース・ファストフロー、Pharmacia Cat # 17-0510-01）に載せ、そして10mMのTES pH7.5中の０〜１ＭのNaClに至る勾配で溶離させた。最も純度の高い画分を10mMのTES pH7.5で脱塩し、そしてMONO Ｑカラムに載せた。EGＩコア溶出は０から１ＭのNaClに至る勾配で実施した。得られる画分は純度85％より高かった。最も高純度な画分がEGＩコアと配列決定された。パート２．EGII触媒性コア EGII触媒性コアの精製は、EGIIセルラーゼのそれと類似する考えられ、その理由はその類似の生化学的特性にある。EGIIコアの理論的pIは、EGIIのそれよりも１／２PH単位低い。また、EGIIコアはEGIIの分子量の約80％である。従って、以下の精製プロトコールはEGIIの精製に基づく。この方法は、UF濃縮培養液を珪藻土で濾過し、そして(NH₄)₂SO₄を加えてその溶液を１Ｍの(NH₄)₂SO₄にすることを含む。この溶液を次に疎水性カラム（フェニル−セファロース・ファストフロー、Pharmacia，Cat # 17-0965-02）に載せ、そしてEGIIを0.15Ｍの(NH₄)₂SO₄で段階溶出させてよい。EGIIコアを含む画分を次にクエン酸塩−リン酸塩、pH７，0. 18mOhmにバッファー交換してよい。その材料を上記のクエン酸−リン酸バッファーで平衡にした陰イオン交換カラム(Ｑ−セファロース・ファストフロー、Pharm acia，Cat # 17-0510-01)に載せてよい。EGIIコアはこのカラムに結合しなく、それ故す通り画分中で回収できるものと予測される。実施例３ CBHII由来のCBHＩプロモーター、ターミネーター及びシグナル配列を利用してのCBHIIコアドメインのクローニング及び発現パート１．Ｔ．ロンジブラチアトゥム一般目的用発現プラスミド−PTEXの構築プラスミドPTEXをSambrookら（1989）前掲及び図７に示す方法に従って構築した。このプラスミドは糸状菌類トリコデルマ・ロンジブラチアトゥムにおいて利用するための多目的発現ベクターとしてデザインされている。この発現カセットはこの機能にとって有用なものとするいくつかの独特の特徴を有する。転写を強力なCBHＩ遺伝子プロモーター及びＴ．ロンジブラチアトゥム用ターミネーター配列を用いて制御する。CBHＩプロモーターとターミネーターとの間には、発現させる遺伝子を挿入するのに用いる固有のPme Ｉ及びSst Ｉ制御部位がある。Ｔ．ロンジブラチアトゥムpyr4 選択マーカー遺伝子をCBHＩターミネーターの中に挿入し、そして完全発現カセット（CBHＩプロモーター−挿入部位−CBHＩターミネーター−pyr4遺伝子−CBHＩターミネーター）は、固有Not Ｉ制限部位又は固有Not Ｉ及びNhe Ｉ制御部位を利用して切り出すことができる。このベクターは細菌ベクターpSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，New Jers ey)を基礎とし、これは広がった多重クローニング部位を有するPUCタイプベクターである。当業者は図７に示すフローダイアグラムに基づいてこのベクターを構築できるであろう（PTEX発現プラスミドの構築については米国特許出願第07／95 4,113号も参照のこと）。トランケーション型セルラーゼ遺伝子に置き代わるDNA配列の任意のその他の断片を含む本発明に記載のPTEX−トランケーション型セルラーゼ又はその誘導体に類似してプラスミドを構築することが可能であろう。パート２．クローニング CBHIIコアドメイン発現プラスミドPTEX CBHIIコアの構築において用いた完全c bh2 遺伝子はプラスミドPUC 219::CBHIIから得られる（Korman，D.ら、1990，Cur r Genet 17: 203-212）。cbh2遺伝子の５′末端に位置するセルロース結合性ドメインは好都合にはXba ＩとSnaBＩ制限部位の間に位置する。Xba Ｉ部位を利用するため、ポリリンカー中の別のXba Ｉ部位を破壊した。PUC 219::CBHIIをXba Ｉで部分消化して、生成物の大半が線状となるようにした。Xba Ｉ突出したT4 D NAポリメラーゼを用いてフィル・インし、そしてプラスミドの自己ライゲーションが優先される条件下で互いとライゲーションさせた。これは平滑部位を破壊する効果であり、その部位はプラスミドの50％において、ポリリンカー中のXba Ｉ部位であった。かかるプラスミドを同定し、そしてXba Ｉ及びSnaBＩで消化してセルロース結合性ドメインを遊離させた。ベクター−CBHIIコアドメインを単離し、そしてXba Ｉ部位を、SnaBＩ部位に、シグナルペプチダーゼ切断部位において及びリンカードメインのパパイン切断点において連結するようにデザインされた以下の合成オリゴヌクレオチドとライゲーションさせた。得られるプラスミドpUCΔCBD CBH IIをNhe Ｉにより消化し、そしてその末端を、T4 DNAポリメラーゼ及びdNTPとのインキュベーションにより平滑にした。その後、線状平滑プラスミドDNAをBgl IIで消化し、そしてCBHIIシグナル配列及びコアドメインを含むNheＩ（平滑）−Bgl IIフラグメントを単離した。最終発現プラスミドは、一般目的用発現プラスミドpTEX（第07／954,113号に開示；その全体は引用することで本明細書に組入れ、そして以下パート３で説明する）をSst II及びPme Ｉで消化し、そしてCBHII Nbe Ｉ（平滑）−Bgl IIフラグメントをcbh1プロモーターの下流に、Bgl II突出しをSst II突出しでフィル・インする配列CGCTAGを有する合成オリゴヌクレオチドを用いてライゲーションすることにより操作した。 pTEX-CBHIIコア発現プラスミドを上記実施例に記載のpTEX-CBHIIと似た方法で調製した。その構築を図８に例示する。パート３大量スケールのDNAプレプはpTEX CBHIIコアより成り、そしてこれより、cbh1 転写因子のコントロール下にあるCBHIIコアドメインを含むNotＩフラグメント及びpyr4遺伝子を調製ゲル電気泳動により単離した。単離したフラグメントをウリジン独立栄養性バージョンのquad欠失株1A52 pyr13に形質転換し、そして安定な形質転換体が同定された。どの形質転換体がcbh2コアドメインを発現するかを選定するため、Vogels＋１％のグルコースでの増幅を経た株からゲノムDNAを単離し、そしてcbh2コアドメインのみを含む単離したDNAフラグメントを用いてサザンブロット分析を行った。1A52のゲノムの中に組込まれたcbh2コアドメイン発現カセットのコピーを有する形質転換体を単離した。Vogels＋１％のラクトースで１日の増殖を経て、全RN Aを単離した。mRNAをプローブとしてcbh2コード領域を用いてノーザン分析にかけた。cbh2コアドメインmRNAで発現する形質転換体を同定した。２種の形質転換体を14Ｌの発酵槽の中で実施例１に先に記載と同じ条件で増殖させた。得られる培養液を濃縮し、そしてその中に含まれているタンパク質をSD Sポリアクリルアミドゲル電気泳動により分け、そしてCBHIIコアドメインのタンパク質をウェスタン分析により同定した。１の形質転換体＃15は適正なサイズのタンパク質を形成し、そしてCBHIIポリクローナル抗体と反応した。精製を経た発酵上清液のタンパク質濃度は10ｇ／Ｌと評価され、その30〜50％はCBHIIコアドメインであった（実施例４参照）。上記の方法を利用して、任意のその他の新規のセルラーゼコアドメインタンパク質又はその誘導体を獲得し得る。実施例４ CBHＩ及びCBHII触媒性コアの精製パート１．CBHＩ触媒性コア CBHＩコアを以下の方法で、pTEX-CBHＩコア発現ベクターを有するＴ．ロンジブラチアトゥムから獲得した培養液から精製した。CBHＩコア限外濾過（UF）培養液を珪藻土を用いて濾過し、そして10mMのTES pH6.8で1.5m Ohmの導電度となるまで希釈した。希釈したCBH Ｉコアを次いで10mMのTES pH6.8で平衡にした陰イオン変換カラム（Ｑ−セファロース・ファストフロー、Pharmacia Cat # 17-0 510-01）に載せた。CBH Ｉコアは、10mMのTES pH6.8の中で０から１ＭのNaClに至る勾配溶出を利用し、培養液中の大半のその他のタンパク質から分けた。CBH Ｉコアを含む画分をPM10膜（ダイアフロ・限外濾過膜、Amicon Cat # 13132 MEM 5468A）の付いたAmicon撹拌式セル濃縮器で濃縮した。この工程はコアを濃縮し、しかもそれを低分子量タンパク質から分離せしめる。得られる画分は純度85％以上のCBH Ｉコアであった。最も高純度な画分をCBH Ｉコアについて配列確認した。パート２．CBH II触媒性コア CBH II触媒性コアはCBH IIのそれと同じようにして精製できると予測され、その理由はそれらの類似の生化学的特性にある。CBH IIコアの理論pIはCBH IIのそれより１／２pH単位低い。更に、CBH II触媒性コアはCBH IIの分離量の約80％ある。従って、以下の提唱の精製プロトコールはCBH IIについて利用した精製方法を基礎とする。珪藻土処理した限外濾過(UF)CBHIIコア培養液を10mMのTES pH6.8 に＜0.7mOhmの導電度となるまで希釈した。この希釈したCBH IIコアを10mMのTES pH6.8で平衡にした陰イオン変換カラム（Ｑ−セファロース・ファストフロー、 Pharmacia Cat # 17-0510-01）に載せた。10mMのTES pH6.8の中で０から１ＭのN aClに至る塩勾配を、このカラムからCBH IIコアを溶出するのに用いた。CBH II コアを含む画分を２mMのコハク酸ナトリウムバッファーにバッファー変換し、そして陽イオン交換カラム（SP−セファデックスＣ−50）に載せた。CBH IIコアを次に０から100mMのNaClに至る塩勾配によりカラムから溶出した。実施例５ CBH Ｉプロモーターを利用するCBH IIセルロース接合性ドメインのクローニング及び発現パート１．クローニング CBH IIコアドメイン発現プラスミドpTEX CBH IIコアの構築において用いた完全cbh2遺伝子をプラスミドpUC219::CBH IIから獲得した。cbh2遺伝子の５′末端に位置するセルロース結合性ドメインをBgl II及びNsi ＩによるPUC219::CBH II の消化、そして450bpのBgl II及びNsi Ｉ制限フラグメントの単離により得た。最終発現プラスミドPTEX CBHII CBDは、一般目的用発現プラスミドPTEX CBHII C BDは、一般目的用発現プラスミドPETX（第07／954,113号に記載され、そしてその内容を引用することで本明細書に組入れる）をSst II及びPme Ｉで消化し、そしてCBH II CBD Bgl II−Nsi Ｉフラグメントをcbh1プロモーターの下流に、Bgl II突出しをSst II突出でフィル・インする配列３′CGCTAG５′を有する合成オリゴヌクレオチド及びNsi Ｉ部位をpTEXの平滑Pme Ｉ部位に連結する以下の合成リンカーを用いてライゲーションさせることにより操作した（図９参照）。最終発現プラスミドpTEX CBHII CBDをリンカー接点にわたって配列決定したとき、接着末端Nsi Ｉ部位はpTEXの中で平滑Pme Ｉに直接ライゲーションされたことがわかった。このことは、CBH II CBDの解読枠がPme Ｉリンカーに続いており、そして以下の更なる12個のアミノ酸についてのcbh1ターミネーターに至ることを意味している。しかしながら、これらの追加のアミノ酸の付加はセルロース結合性ドメインの特性を有意に変化させるものではないと考えられる。似たような状況で、その他の任意の既知の結合性ドメインを上記のpTEX構築体に置換せしめ、上記に開示の一般方式に従い、置換化結合性ドメインの発現を供することができると考えられる。パート２．形質転換及び発現大量スケールDNAプレプをpTEX CBHII CBDより作り、そしてこれからcbh1転写因子のコントロール下にあるCBH IIコアドメイン及びpyr4遺伝子を含むNot Ｉフラグメントを調製電気泳動により単離した。単離したフラグメントをウリジン独立栄養性バージョンのquad欠失株1A52 pyr 13に形質転換し、そして安定な形質転換体が同定された。どの形質転換体がcbh1セルロース接合性ドメインを発現するかを選定するため、ゲノムDNAをVogels＋１％のグルコース上での増殖を経て全ての安定な形質転換株から単離し、そしてcbh1遺伝子を含む単離DNAフラグメントを用いてサザンブロット実験を行い、CBH II CBD PTEX発現ベクターを含む形質転換体を同定した。全mRNAをVogels＋１％のラクトース上での１日の増殖を経た形質転換株から単離した。プローブとしてcbh2コード領域を用いてノーザン分析にmRNAをかけた。ほとんどの形質転換体がcbh2 CBD mRNAを高レベルで発現した。一の形質転換体を選び、そして14Ｌの発酵槽の中で先に記載の条件下で増殖させた。得られる培養液を濃縮し、そしてその中に含まれているタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分け、そしてCBH II CBDタンパク質をウェスタン分析にかけた。予測のサイズのタンパク質は、次の配列を有する合成CBH II CBDペプチドに対して生起したCBH II CBDポリクローナル抗体に対して反応性であった；実施例６セルロース結合性ドメインの精製結合性ドメインは論文(Ong，E.,ら1989 Bio／Technology 7: 604-607)に記載されているのと類似の方法により精製できる。アフィニティークロマトグラフィーの場合、濾過した結合性ドメイン培養液はセルロース系物質、例えばアビセル又はパルプ／紙と接触させてよい。セルロース系固体は遠心又は濾過により分離できる。他方、濾過培養液をセルロース系カラムに通してよい。結合した結合性ドメインを蒸留水、グアニジニウムHCl／その他の変性剤、界面活性剤又はその他の適当な溶出化学物質によって溶出させることできる。温度変化の利用も任意的でありうる。CBD又はCBD誘導体に対して生起させた抗体を利用するアフィニティークロマトグラフィーを利用してもよい。特定の精製手順は、サンプルマトリックス、並びに本発明の接合性ドメイン及び改変ドメインの化学特性に依存して複数の分画工程を必要としうる。あるケースにおいては、改変ドメインは、イオン変換の如くのその他の方法の利用を可能にしうる追加の帯電官能基を含みうる。本発明を様々な好適な態様で説明してきたか、当業者は本発明の範囲を逸脱することなく様々な改良を本発明に施すことができうることを認識しているであろう。従って、本発明は請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者クラークソン，キャスリーンエー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94110, サンフランシスコ，トゥエンティーエイトスストリート 53 (72)発明者ワード，マイケルアメリカ合衆国，カリフォルニア 94114, サンフランシスコ，トゥエンティフォースストリート 4372 (72)発明者コリアー，キャサリンディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94062, レッドウッドシティ，オークパークウェイ 658 (72)発明者レアナス，エドモンドアメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サンカルロス，カプリノウェイ 352

Claims

【特許請求の範囲】１．エクソグルカナーゼ活性を示すCBH Ｉ触媒性コアタンパク質又はその誘導体を含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。２．エクソグルカナーゼ活性を示すCBH II触媒性コアタンパク質又はその誘導体を含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。３．エンドグルカナーゼ活性を示すEGＩ触媒性コアタンパク質又はその誘導体を含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。４．エンドグルカナーゼ活性を示すEGII触媒性コアタンパク質又はその誘導体を含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。５．セルロース結合性を示すCBH Ｉ又はその誘導体に由来するセルロース結合性ドメインを含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。６．セルロース結合性を示すCBH II又はその誘導体に由来するセルロース結合性ドメインを含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。７．セルロース結合性を示すEGＩ又はその誘導体に由来するセルロース結合性ドメインを含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。８．セルロース結合性を示すEGII又はその誘導体に由来するセルロース結合性ドメインを含んで成るトリコデルマに由来する実質的に純粋なトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。９．前記トリコデルマがトリコデルマ・ロンジブラチアトゥムである、請求項１〜９に記載のトランケーション型菌類セルラーゼタンパク質。 10．前記CBH Ｉ触媒性コアが、SEQ ID:NO１に記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項１記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 11．前記CBH II触媒性コアが、SEQ ID:NO２に記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項２記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 12．前記EGＩ触媒性コアが、SEQ ID:NO３に記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項３記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 13．前記EGII触媒性コアが、SEQID:NO４に記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項４記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 14．前記CBH Ｉセルロース結合性ドメインがSEQ ID NO５記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項５記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 15．前記CBH IIセルロース結合性ドメインがSEQ ID NO６記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項６記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 16．前記EGＩセルロース結合性ドメインがSEQ ID NO７記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項７記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 17．前記EGIIセルロース結合性ドメインがSEQ ID NO８記載のアミノ酸配列及びその誘導体より本質的に成る、請求項８記載のトランケーション型菌類セルラーゼ。 18．エクソグルカナーゼ活性を示すCBH Ｉ触媒性コア又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 19．CBH Ｉ触媒性コアをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項18記載のDNAフラグメント。 20．セルロース結合性を示すタンパク質をコードしないCBH Ｉ結合性ドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項19記載のDNA遺伝子フラグメント。 21．前記CBH Ｉ触媒性コアをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:９に記載の通りである、請求項18記載のDNA遺伝子フラグメント。 22．前記CBH Ｉ触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:９に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:17に記載の通りである、請求項19記載のDNA遺伝子フラグメント。 23．前記CBH Ｉ触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:９に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:17に記載の通りであり、そして前記CBH Ｉ結合性ドメインがSEQ ID N0:13に記載の通りである、請求項20記載のDNA遺伝子フラグメント。 24．エクソグルカナーゼ活性を示すCBH II触媒性コア又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 25．CBH II触媒性コアをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項24記載のDNAフラグメント。 26．セルロース結合性を示すタンパク質をコードしないCBH II結合性ドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項25記載のDNA遺伝子フラグメント。 27．前記CBH II触媒性コアをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:10に記載の通りである、請求項24記載のDNA遺伝子フラグメント。 28．前記CBH II触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID N0:10 に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID N0:18に記載の通りである、請求項25記載のDNA遺伝子フラグメント。 29．前記CBH II触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:10 に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:18に記載の通りであり、そして前記CBH II結合性ドメインがSEQ ID NO:14に記載の通りである、請求項26記載のDNA遺伝子フラグメント。 30．エンドグルカナーゼ活性を示すEGＩ触媒性コア又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 31．EGＩ触媒性コアをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域 DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項30記載のDNAフラグメント。 32．セルロース結合性を示すタンパク質をコードしないEGＩ結合性ドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項31記載のDNA遺伝子フラグメント。 33．前記EGＩ触媒性コアをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:11に記載の通りである、請求項30記載のDNA遺伝子フラグメント。 34．前記EGＩ触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:11に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列が SEQ ID N0:19に記載の通りである、請求項31記載のDNA遺伝子フラグメント。 35．前記EGＩ触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:11に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:19に記載の通りであり、そして前記EGＩ結合性ドメインがSEQ ID NO:15に記載の通りである、請求項32 記載のDNA遺伝子フラグメント。 36．エンドグルカナーゼ活性を示すEGII触媒性コア又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 37．EGII触媒性コアをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域 DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項36記載のDNAフラグメント。 38．セルロース結合性を示すタンパク質をコードしないEGII結合性ドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項37記載のDNA遺伝子フラグメント。 39．前記EGII触媒性コアをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:12に記載の通りである、請求項36記載のDNA遺伝子フラグメント。 40．前記EGII触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:12に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:20に記載の通りである、請求項37記載のDNA遺伝子フラグメント。 41．前記EGII触媒性コアをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:12に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:20に記載の通りであり、そして前記EGII結合性ドメインがSEQ ID NO:16に記載の通りである、請求項38 記載のDNA遺伝子フラグメント。 42．セルスース結合性を示すCBH Ｉ結合性ドメイン又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 43．CBH Ｉ結合性ドメインをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項42記載のDNAフラグメント。 44．エクソグルカナーゼ活性を示すタンパク質をコードしないCBH Ｉ触媒性コアドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項43記載のD NA遺伝子フラグメント。 45．前記CBH Ｉ結合性ドメインをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:13に記載の通りである、請求項42記載のDNA遺伝子フラグメント。 46．前記CBH Ｉ結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO :13に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:17に記載の通りである、請求項43記載のDNA遺伝子フラグメント。 47．前記CBH Ｉ結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO :13に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:17に記載の通りであり、そして前記CBH ＩコアドメインがSEQ ID NO:9に記載の通りである、請求項44記載のDNA遺伝子フラグメント。 48．セルスース結合性を示すCBH II結合性ドメイン又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 49．CBH II結合性ドメインをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項48記載のDNAフラグメント。 50．エクソグルカナーゼ活性を示すタンパク質をコードしないCBH II触媒性コアドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項49記載のD NA遺伝子フラグメント。 51．前記CBH II結合性ドメインをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:14に記載の通りである、請求項48記載のDNA遺伝子フラグメント。 52．前記CBH II結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO :14に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:18に記載の通りである、請求項49記載のDNA遺伝子フラグメント。 53．前記CBH II結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO :14に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:18に記載の通りであり、そして前記CBH IIコアドメインがSEQ ID NO:10に記載の通りである、請求項50記載のDNA遺伝子フラグメント。 54．セルスース結合性を示すEGＩ結合性ドメイン又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 55．EGＩ結合性ドメインをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項54記載のDNAフラグメント。 56．エクソグルカナーゼ活性を示すタンパク質をコードしないEGＩ触媒性コアドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項55記載のDNA 遺伝子フラグメント。 57．前記EGＩ結合性ドメインをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:15に記載の通りである、請求項54記載のDNA遺伝子フラグメント。 58．前記EGＩ結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:1 5に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:19に記載の通りである、請求項19記載のDNA遺伝子フラグメント。 59．前記EGＩ結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:1 5に記載の通りであり、前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:19に記載の通りであり、そして前記EGＩコアドメインがSEQ ID NO:11に記載の通りである、請求項56 記載のDNA遺伝子フラグメント。 60．セルスース結合性を示すEGII結合性ドメイン又はその誘導体をコードするトリコデルマ由来のDNA遺伝子フラグメント又はその変異体。 61．EGII結合性ドメインをコードする前記フラグメントに作動連結したヒンジ領域DNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項60記載のDNAフラグメント。 62．エンドグルカナーゼ活性を示すタンパク質をコードしないEGII触媒性コアドメインに由来するDNA配列又はその一部を更に含んで成る、請求項61記載のDNA 遺伝子フラグメント。 63．前記EGII結合性ドメインをコードする前記DNA配列がSEQ ID NO:16に記載の通りである、請求項60記載のDNA遺伝子フラグメント。 64．前記EGII結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:1 6に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:20に記載の通りである、請求項61記載のDNA遺伝子フラグメント。 65．前記EGII結合性ドメインをコードする前記DNAフラグメントがSEQ ID NO:1 6に記載の通りであり、そして前記ヒンジ領域DNA配列がSEQ ID NO:20に記載の通りであり、そして前記EGIIコアドメインがSEQ ID N O:12に記載の通りである、請求項62記載のDNA遺伝子フラグメント。 66．受託番号＃を有するpTEXと呼ばれる発現ベクター。 67．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、トリコデルマセルラーゼ由来の少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体を担持し、前記DNA遺伝子フラグメントが前記ベクター中の１又は複数の調節DNA配列に作動連結している、発現ベクター。 68．トリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型 DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持しているトリコデルマから構築した発現ベクター。 69．前記１又は複数の調節DNA拝察が機能的に活性をプロモーター及びターミネーターをコードする、請求項67記載の発現ベクター。 70．前記少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体がシグナル配列を担持しており、そして前記１又は複数の調節DNA配列が機能的に活性なプロモーター及びターミネーターをコードする、請求項67記載の発現ベクター。 71．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項21 ，22又は23に由来する、発現ベクター。 72．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DN Aフラグメントが請求項27，28又は29に由来する、発現ベクター。 73．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項33 ，34又は35に由来する、発現ベクター。 74．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項39 ，40又は41に由来する、発現ベクター。 75．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項45 ，46又は47に由来する、発現ベクター。 76．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項51 ，52又は53に由来する、発現ベクター。 77．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項57 ，58又は59に由来する、発現ベクター。 78．トリコデルマから構築された発現ベクターであって、前記ベクターにおいて１又は複数の調節DNA配列に作動連結したトリコデルマセルラーゼに由来する少なくとも一種のトランケーション型DNA遺伝子フラグメント又はその変異体及び選択マーカーを担持し、前記トランケーション型DNAフラグメントが請求項63 ，64又は65に由来する、発現ベクター。 79．１又は複数の調節DNA配列及び選択マーカーに作動連結した触媒性コア活性を有するトリコデルマに由来するトランケーション型セルラーゼ酵素又はその誘導体をコードするDNAフラグメント又はその変異体を含んで成る発現ベクターを含んで成る形質転換車類細胞。 80．前記DNAフラグメントが、エンドグルカナーゼ活性を示すCBH Ｉ触媒性コア又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 81．前記DNAフラグメントが、エンドグルカナーゼ活性を示すCBH II触媒性コア又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 82．前記DNAフラグメントが、エンドグルカナーゼ活性を示すEGＩ触媒性コア又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 83．前記DNAフラグメントが、エンドグルカナーゼ活性を示すEGII触媒性コア又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 84．１又は複数の調節DNA配列及び選択マーカーに作動連結したセルロース結合特性を有するトリコデルマに由来するトランケーション型セルラーゼ酵素又はその誘導体をコードするDNAフラグメント又はその変異体を含んで成る発現ベクターを含んで成る形質転換菌類細胞。 85．前記DNAフラグメントが、セルロース結合性を示すCBH Ｉセルロース結合性ドメイン又はその誘導体をコードする、請求項84記載の形質転換菌類細胞。 86．前記DNAフラグメントが、セルロース結合性を示すCBH IIセルロース結合性ドメイン又はその誘導体をコードする、請求項84記載の形質転換菌類細胞。 87．前記DNAフラグメントが、セルロース結合性を示すEGＩセルロース結合性ドメイン又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 88．前記DNAフラグメントが、セルロース結合性を示すEGIIセルロース結合性ドメイン又はその誘導体をコードする、請求項79記載の形質転換菌類細胞。 89．トリコデルマ宿主細胞を形質転換するための方法であって、ここで前記宿主細胞は１又は複数種の機能的に活性なトランケーション型セルラーゼを発現できるものであり、ここでこの方法は：ａ）１又は複数種のセルラーゼ活性体の欠失したトリコデルマ宿主細胞を獲得する；ｂ）前記細胞を、１又は複数種のDNAベクターで、前記１又は複数種のDNA構築体が前記細胞のゲノムの中に組込まれるような条件下で処理し、形質転換細胞を得る、ここで前記DNAベクターは調節DNA配列に作動連結した１又は複数種のトランケーション型セルラーゼDNAフラグメント又はセルラーゼDNAフラグメント変異体を含んで成る；そしてｃ）前記形質転換細胞を非形質転換細胞から単離する；工程を含んで成る方法。 90．前記菌類細胞が、トリコデルマ・ロンジブラチアトゥムである、請求項89 記載の方法。 91．前記１又は複数種のDNAベクターが所定の選択マーカー遺伝子を含んで成る、請求項89記載の方法。 92．前記選択マーカーが、pyr4，argB，trpC及びamdSより成る群から選ばれる、請求項91記載の方法。 93．前記セルラーゼDNAフクパメントがエクソセロビオヒドロラーゼ活性又はエンドグルカナーゼ活性を有するトランケーション型セルラーゼをコードする、請求項89記載の方法。 94．前記トランケーション型セルラーゼDNAフラグメントがCBH Ｉ，CBH II，E GＩ，EGII，EGIII又はEGＶより成る群から選ばれる、請求項93記載の方法。 95．前記DNAフラグメントがセルロース結合性を示すEGIII触媒性コア誘導体をコードする変異DNAフラグメントである、請求項79記載の形質転換菌類細胞。