FI119695B - Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi - Google Patents

Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI119695B
FI119695B FI962444A FI962444A FI119695B FI 119695 B FI119695 B FI 119695B FI 962444 A FI962444 A FI 962444A FI 962444 A FI962444 A FI 962444A FI 119695 B FI119695 B FI 119695B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ser
gly
thr
ala
leu
Prior art date
Application number
FI962444A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI962444A (fi
FI962444A0 (fi
Inventor
Michael Ward
Kathleen A Clarkson
Edmund Larenas
Timothy Fowler
Katherine D Collier
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22617873&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI119695(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI962444A publication Critical patent/FI962444A/fi
Publication of FI962444A0 publication Critical patent/FI962444A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119695B publication Critical patent/FI119695B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi
Keksinnön ala 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää korkeiden tasojen uusia typistettyjä sellulaasiproteiineja tuottamiseksi rihmaisessa sienessä Trichoderma longibrachiatum; Trichoderma longibrachiatumista geenimanipulaatioteknii-koilla tuotettuja sienitransformantteja; ja tällaisten 10 transformanttien tuottamia uusia sellulaasiproteiineja.
Keksinnön tausta
Sellulaasit ovat entsyymejä, jotka hydrolysoivat selluloosaa (fi-l,4-D-glukaanisidoksia) ja tuottavat primaari tuotteina glukoosia, sellobioosia, sello-oligosakka-15 rideja ja muita samankaltaisia. Sellulaaseja tuottavat lukuiset mikro-organismit ja sellulaasit käsittävät useita eri entsyymiluokituksia, mukaan lukien ne, jotka identifioidaan eksosellobiohydrolaaseiksi (CBH), endogluka-naaseiksi (EG) ja β-glukosidaaseiksi (BG) [Schulein, M., 20 Methods in Enzymology 160 (1988) 235 - 242]. Lisäksi entsyymit näissä luokituksissa voidaan erottaa yksittäisiksi komponenteiksi. Esimerkiksi rihmaisen sienen, Trichoderma ·1: longibrachiatumin, tästä eteenpäin T^ longibrachiatum, ··· tuottama sellulaasi koostuu ainakin kahdesta CBH-kompo- « · · · 25 nentista, eli CBHI:stä ja CBHII:sta, ja ainakin neljästä . .·. EG-komponentista, eli EGI-, EGII-, EGIII- ja EGV- (Salo- y.\ heimo, A., et ai., "Proceedings of the second TRICEL Sym posium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases", toim. P. Suominen ja T. Reinikainen, Espoo, Suomi, 30 1993; Foundation for Biotechnical and Industrial Fermen tation Research 8 139 - 146) komponenteista, ja ainakin yhdestä β-glukosidaasista. Näitä komponentteja koodittavat • · · * geenit ovat nimittäin cbhl, cbh2, egll, eg!2, eg!3 ja vas taavasti eg!5.
• · · • · · • · · * · · • · • · φ · · • · · • 1 · · · · 2 Täydellinen sellulaasisysteemi, joka käsittää CBH-, EG- ja BG-komponentit, toimii synergistisesti kiteisen selluloosan muuttamiseksi glukoosiksi. Kaksi eksosellobio-hydrolaasia ja neljä tällä hetkellä tunnettua endogluka-5 naasia toimivat yhdessä selluloosan hydrolysoimiseksi pieniksi sello-oligosakkarideiksi. Sitten oligosakkaridit (pääasiassa sellobioosit) hydrolysoi glukoosiksi pääasiallinen β-glukosidaasi (mihin liittyy mahdollinen lisähydro-lyysi pienempien β-glukosidaasikomponenttien toimesta).
10 Sellobiohydrolaasien (CBHI ja CBHII) ja pääasial listen endoglukanaasien (EGI ja EGII) longibrachiatu-mista proteiinianalyysit ovat osoittaneet, että olemassa on bifunktionaalinen organisaatio katalyyttisen ydindomee-nin ja pienemmän, selluloosaan sitoutuvan domeenin muodos-15 sa, joita domeeneja erottaa liittäjä tai taipuisa sarana-jakso aminohappoja, joissa on runsaasti proliinia ja hyd-roksiaminohappoja. Geenit kahdelle sellobiohydrolaasille, CBHI ja CBHII [Shoemaker, S., et ai., Bio/Technology 1 (1983) 691 - 696; Teeri, T., et ai., Bio/Technology 1 20 (1983) 696 - 699; ja Teeri, T., et ai., Gene 51 (1987) 43 - 52] ja kahdelle pääasialliselle endoglukanaasille, EGI ja EGII [Penttilä, M., et al^_, Gene 45 (1986) 253 -263; Van Arsdell, J.N., et ai., Bio/Technology 5 (1987) 60 - 64; ja Saloheimo, M., et ai., Gene 63 (1988) 11 - 21] 25 on eristetty T. longibrachiatumista ja proteiinidomeenira- • · . .'· kenne on vahvistettu.
• · · • · ·
Sellulaasientsyymien samankaltainen bifunktionaali- • · · nen organisaatio tavataan bakteerisellulaaseilla. Cellu-lomonas fimin endoglukanaasi-A:n (C^ f imi Cen-A) selluloo-30 saan sitoutuvaa domeenia (CBD) ja katalyyttistä ydintä on tutkittu laajalti [Ong, E., et ai., Trends Biotechnol. 7 (1989) 239 - 243; Pilz et al^, Biochem. J. 271 (1990) * 277 - 280; ja Warren et ai., Proteins 1 (1987) 335 - 341].
• · . Geenifragmentteja, jotka koodittavat CBD:tä ja CBD:tä + .···. 35 liittäjää, on kloonattu, ilmennetty E^ colissa ja niillä • · · • · • · » • # · • · 3 on osoitettu olevan uusia aktiivisuuksia selluloosakuitu-jen suhteen [Gilkes, N.R., et ai., Microbiol. Rev. 55 (1991) 305 - 315; ja Din, N., et ai., Bio/Technology 9 (1991) 1096 - 1099], Esimerkiksi E_^ colissa geneettisesti 5 ilmennetty fimi Cen-A:sta eristetty CBD häiritsee sel- luloosakuitujen rakennetta ja vapauttaa pieniä partikkeleita, mutta sillä ei ole todettavaa hydrolyyttistä aktiivisuutta. CBD:llä on edelleen laaja käyttö proteiinien puhdistuksessa ja entsyymien immobilisoinnissa. Toisaalta 10 proteaasilla pilkotusta sellulaasista eristetyn fimi
Cen-A:n katalyyttinen domeeni ei häiritse selluloosan kui-turakennetta, vaan sen sijaan siloittaa kuidun pintaa.
Näillä uusilla aktiivisuuksilla on mahdollisia käyttöjä tekstiili-, elintarvike- ja eläinravinto-, de- 15 tergentti- sekä sellu- ja paperiteollisuudessa. Kuitenkin teolliseen käyttöön on tuotettava erittäin tehokkaita il- mentämissysteemejä, jotka tuottavat typistettyjä sellulaa- siproteiineja korkeampina saantoina kuin mitä on tällä hetkellä saatavana, jotta näillä olisi mitään kaupallista 20 arvoa. Esimerkiksi Trichoderma longibrachiatumin CBHI:n ydinalueet on erotettu proteolyyttisesti ja puhdistettu, mutta tällä biokemiallisella menettelyllä eristetään vain **. milligrammamääriä [Offord, D., et ai., Applied Biochem.
··* and Biotech. 28/29 (1991) 377 - 386]. Samankaltaisia tut- ♦ · · · .*..· 25 kimuksia suoritettiin analysoitaessa CBHI:n, CBHII:n, . .·. EGI:n ja EGII:n T^ longibrachiatumista biokemiallisen pro- _·.·. teolyysin jälkeen eristettyjä ydin- ja sitoutumisdomeene- • · ♦ ja, jolloin kuitenkin saatiin tarpeeksi proteiinia vain rakenteelliseen ja funktionaaliseen analyysiin [Tomme, P., 30 et ai., Eur. J. Biochem. 170 (1988) 575 - 581; ja Ajo, S:, FEBS 291 (1991) 45 - 49].
Kantojen saamiseksi, jotka ilmentävät typistettyjä • · · sellulaasiproteiineja korkeampitasoina kuin mihin on aiem- . .·. min päästy, hakijat valitsivat T^ longibrachiatumin edul- • · · ··*. 35 lisimmaksi mikro-organismiksi ilmennykseen, koska se tun- • « · • · ♦ * · ♦ ·· 4 netaan hyvin kyvystään erittää kokonaisia sellulaaseja suurina määrinä. Täten hakijat ryhtyivät geneettisesti manipuloimaan edeltävän rihmaisen sienen kantoja ilmentämään biomanipuloituja typistettyjä sellulaaseja korkeina tasoi-5 na.
Keksinnön hakijat eivät edeltäpäin tietäneet, voi taisiinko typistetyn sellulaasin ydindomeeniproteiineja koodittava DNA transformoida Trichodermaan siten, että uudet typistetyt sellulaasigeenit tulisivat hyvin runsaasti 10 ilmennetyiksi funktionaalisina proteiineina, ilman että nämä hajoavat isäntäsolussa. Vastikään Nakari ja Penttilä ovat osoittaneet, että on mahdollista geneettisesti manipuloida Trichoderma-isäntä ilmentämään Trichoderma EGI -sellulaasin typistetty muoto, spesifisesti katalyyttinen 15 ydindomeeni, jolloin kuitenkin EGI-ydindomeenin ilmenty- mistaso oli matala (Nakari, T., et ai., Abstract Pl/63, "1st European Conference on Fungal Genetics", Nottingham, Englanti, 20. - 23. elokuuta, 1992). Lisäksi ei tiedetty, voitaisiinko Trichoderma-sellobiohydrolaasin katalyyttistä 20 ydindomeenia tuottaa yhdistelmä-DNA-teknisillä geneettisillä menetelmillä.
Täten esillä olevan keksinnön kohteena on viedä DNA-geenifragmentteja sienikantoihin, Trichoderma longi- *:* brachiatum, trans f ormantttikantoj en tuottamiseksi, jotka « · · · ——^————— :*·.· 25 ilmentävät korkeina tasoina uusia, typistetyn proteiinin • · . (g/litra tasolla) manipuloituja sellulaaseja Trichoderma- • · · sellulaasien sitoutumis- ja ydindomeeneista. Typistetyt « · · proteiinit ovat oikein prosessoituja ja erittyvät solunul- . . koisesti aktiivisessa muodossa.
• · · \\\ 3 0 Keksinnön yhteenveto • · *···* Keksintö antaa käyttöön menetelmän rekombinantin ·;· sellulaasiproteiinin käyttöön, joka proteiini ilmentää ek- *·ι* ·**; soglukanaasiaktiivisuutta, joka menetelmä käsittää vai heet : • · ]··· 35 a) varataan Trichoderma isäntäsolu, jolta puuttuu • # · • ·* yksi tai useampi sellulaasiaktiivisuus ja joka on trans- 5 formoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää sellulaasi-proteiinia koodaavan DNA sekvenssin, jolloin mainittu sel-lulaasiproteiini käsittää CBHI:n katalyyttisen ydinprote-iinin, joka ilmentää eksoglukanaasiaktiivisuutta ja jolta 5 puuttuu selluloosaa sitova domeeni, sellaisissa olosuhteissa, joissa mainittu ekspressiovektori integroituu mainitun solun genomiin; ja b) kasvatetaan transformoitua isäntäsolua sellaisissa olosuhteissa, joissa rekombinantti sellulaasiprote-10 iini ekspressoituu.
Edullisessa suoritusmuodossa sellulaasiproteiinil-la on sekvenssi, joka koostuu sekvenssin numero 10 mukaisesta aminohapposekvenssistä.
Edelleen edullisessa suoritusmuodossa DNA-sekvens-15 si, joka koodaa CBHI:n katalyyttistä ydintä, on kuten on esitetty sekvenssissä numero 9.
Edelleen edullisessa suoritusmuodossa, sieni-isän-täsolu on Trichoderma longibrachiatum.
Menetelmä voi edelleen käsittää vaiheen, jossa 20 eristetään mainittu rekombinantti sellulaasiproteiini.
Menetelmä voi myös käsittää vaiheen, jossa isän-täsolu transformoidaan ekspressiovektorilla olosuhteissa, ..*·* joissa ekspressiovektori integroituu isäntäsolun genomiin.
*:* Piirustusten kuvaus • · · · 25 Kuviossa 1 esitetään Trichoderma longibrachiatu- • · ' • .*. mistä saadun CBHI:n genomi-DNA- ja aminohapposekvenssi.
• · ·
Signaalisekvenssi alkaa emäsparista 210 ja päättyy emäspä- • · · riin 260 (sekvenssi tunnusnro 25) . Katalyyttinen ydindo- . . meeni alkaa emäsparista 261 aina emäspariin 671 ensimmäi- • · · *.* 30 sessä eksonissa, emäsparista 739 aina emäspariin 1434 toi- • · *·;·* sessa eksonissa ja emäsparista 1498 aina emäspariin 713 *:* kolmannessa eksonissa (sekvenssi tunnusnro 9). Liittose- • · · · :***: kvenssi alkaa emäsparista 714 ja päättyy emäspariin 1785 • · · (sekvenssi tunnusnro 17). Selluloosaan sitoutuva domeeni • · 35 alkaa emäsparista 1786 ja päättyy emäspariin 1888 (sek- • · · : ·’ venssi tunnusnro 1). Sekvenssit tunnusnro 26, 10, 18 ja 2 6 edustavat CBHI:n signaalisekvenssin, katalyyttisen ydindo-raeenin, liittoalueen ja vastaavasti sitoutumisdomeenin aminohapposekvenssej ä.
Kuviossa 2 esitetään Trichoderma lonqibrachiatu-5 mistä saadun CBHII:n genomi-DNA- ja aminohapposekvenssi. Signaalisekvenssi alkaa emäsparista 614 ja päättyy emäspa-riin 685 (sekvenssi tunnusnro 27). Selluloosaan sitoutuva domeeni alkaa emäsparista 686 aina emäspariin 707 eksonis-sa 1 ja emäsparista 755 aina emäspariin 851 eksonissa 2 10 (sekvenssi tunnusnro 3). Liittosekvenssi alkaa emäsparista 852 ja päättyy emäspariin 980 (sekvenssi tunnusnro 19) . Katalyyttinen ydin alkaa emäsparista 981 aina emäspariin 1141 eksonissa kaksi, emäsparista 1199 aina emäspariin 1445 eksonissa kolme ja emäsparista 1536 aina emäspariin 15 2221 eksonissa neljä (sekvenssi tunnusnro 11) . Sekvenssit tunnusnro 28, 4, 20 ja 12 edustavat CBHII:n signaalise kvenssin, sitoutuvan domeenin, liittoalueen ja vastaavasti katalyyttisen ydindomeenin aminohapposekvenssejä.
Kuviossa 3 esitetään EGI:n genomi-DNA- ja amino-20 happosekvenssi. Signaalisekvenssi alkaa emäsparista 113 ja päättyy emäspariin 178 (sekvenssi tunnusnro 29). Katalyyt-tinen ydindomeeni alkaa emäsparista 179 aina emäspariin ..!·* 882 ensimmäisessä eksonissa ja emäsparista 963 aina emäs- *:* pariin 1379 toisessa eksonissa (sekvenssi tunnusnro 13).
» · · · :*·.· 25 Liittoalue alkaa emäsparista 1380 ja päättyy emäspariin • · . .·. 1460 (sekvenssi tunnusnro 21) . Selluloosaan sitoutuva do- • · · • · · meeni alkaa emäsparista 1461 ja päättyy emäspariin 1616 • · · (sekvenssi tunnusnro 5). Sekvenssit tunnusnrot 30, 14, 22 .. ja 6 edustavat EGI:n signaalisekvenssin, katalyyttisen • · · ’*[· 3 0 ydindomeenin, liittoalueen ja vastaavasti sitoutumisdomee- • · ’···" nin aminohapposekvenssejä.
·;· Kuviossa 4 esitetään EGII:n genomi-DNA- ja amino- • · · · happosekvenssi. Signaali sekvenssi alkaa emäsparista 262 ja • · · päättyy emäspariin 324 (sekvenssi tunnusnro 31) . Selluloo- • · ***** 35 saan sitoutuva domeeni alkaa emäsparista 325 ja päättyy • · · • ·* emäspariin 432 (sekvenssi tunnusnro 7). Liittoalue alkaa 7 emäsparista 433 ja päättyy emäspariin 534 (sekvenssi tun-nusnro 23). Katalyyttinen ydindomeeni alkaa emäsparista 535 aina emäspariin 590 eksonissa yksi ja emäsparista 765 aina emäspariin 1689 eksonissa kaksi (sekvenssi tunnusnro 5 15). Sekvenssit tunnusnro 32, 8, 24 ja 16 edustavat EGII:n signaalisekvenssin, sitoutuvan domeenin, liittoalueen ja vastaavasti katalyyttisen ydindomeenin aminohapposekvenssejä.
Kuviossa 5 esitetään EGIII:n genomi-DNA- ja amino-10 happosekvenssi. Signaalisekvenssi alkaa emäsparista 151 ja päättyy emäspariin 198 (sekvenssi tunnusnro 36). Katalyyttinen ydindomeeni alkaa emäsparista 199 aina emäspariin 557 ensimmäisessä eksonissa, emäsparista 613 aina emäspariin 833 toisessa eksonissa ja emäsparista 900 aina emäs-15 pariin 973 eksonissa kolme (sekvenssi tunnusnro 33). Sekvenssit tunnusnro 36 ja 34 edustavat EGIllm signaalise-kvenssin ja vastaavasti katalyyttisen ydindomeenin aminohapposekvenssejä.
Kuvio 6 esittää EGI:n ydindomeenin ilmentämisvek-20 torin rakentamista (sekvenssi tunnusnro 37).
Kuviossa 7 esitetään ilmentämisplasmidin pTEX ra-..!! kentaminen (sekvenssit tunnusnro 39 - 41) .
t
Kuviossa 8 esitetään CBHI:n ydindomeenin ilmentä-*:* misvektorin rakentaminen (sekvenssi tunnusnro 38) .
• · m 0 :*·.· 25 Kuviossa 9 eitetään CBHII:n selluloosaan sitoutu- • · . .*. van domeenin ilmentämisvektorin rakentaminen (sekvenssit • · · • · · tunnusnro 42 ja 43).
• · · m
Yksityiskohtainen kuvaus . . Kuten edellä mainittiin, esillä oleva keksintö t · · • · · t.* 30 koskee yleisesti uusien typistettyjen sellulaasiproteiini- • · *···’ en kloonaamista ja ilmentämistä korkeina tasoina rihmasie- •j* nessä T. longibrachiatum. Esillä olevan keksinnön muita näkökohtia käsitellään yksityiskohtaisemmin tässä käytet- • · · tyjen ilmaisujen määrittelyn jälkeen.
• · t**· 35 Ilmaisu "Trichoderma" tai "Trichoderma sp." viit- • · · : ·’ taa mihin tahansa sienikantoihin, jotka on aiemmin luoki- 8 teltu Trichodermaksi tai jotka tällä hetkellä luokitellaan Trichodermaksi. Edullisia lajeja ovat Trichoderma longi-brachiatum, Trichoderma reesei tai Trichoderma viride.
Ilmaisut "sellulolyyttiset entsyymit" tai "sellu-5 laasientsyymit" viittaavat sieniperäisiin eksoglukanaasei-hin tai eksosellobiohydrolaaseihin (CBH), endoglukanaasei-hin (EG) ja β-glukosidaaseihin (BG). Nämä sellulaasient-syymien kolme eri tyyppiä toimivat synergistisesti kiteisen selluloosan muuttamiseksi glukoosiksi. CBHI:tä, 10 CBHII:ta ja EGI:tä ja EGII:ta koodittavien geenien analyysissä ilmenee domeenirakenne, joka käsittää katalyyttisen ydinalueen (CCD), sarana- tai liittoalueen (joita käytetään tässä keskenään vaihtokelpoisesti) ja selluloosaan sitoutuvan alueen (CBH).
15 Tässä käytettynä ilmaisu "typistetyt sellulaasit" viittaa sellobiohydrolaasien, esimerkiksi CBHI:n ja CBHII:n, ydindomeeneihin.
Typistettyjen sellulaasien "johdannainen" käsittää sellobiohydrolaasien, esimerkiksi CBHIrn tai CBHIIm, 20 Trichoderma sp.:stä ydindomeenit, jolloin läsnä saattaa olla yhden tai useamman aminohapon additio typistetyn sei- lulaasin joko C-päähän tai N-päähän tai molempiin, yhden tai useamman aminohapon substituutio yhteen tai useampaan 4>1:· kohtaan typistetyssä sellulaasissa, yhden tai useamman :1·.· 25 aminohapon deleetio typistetyssä sellulaasiproteiinissa • · . tai sen jommassakummassa päässä tai molemmissa päissä, tai ··· yhden tai useamman aminohapon insertio yhteen tai useam- • · · paan kohtaan typistetyssä sellulaasiproteiinissa siten, . . että eksoglukanaasiaktiivisuudet ovat tallella derivati- • · 1 *.1 30 soiduissa CBH-katalyyttisen ytimen typistetyissä proteii- • · ’···1 neissa. Ilmaisun "typistetyn sellulaasin johdannainen" ·:· tarkoitetaan kattavan myös eksoglukanaasientsyymien ydin- domeenit, joihin on kiinnittynyt yksi tai useampi amino- • · · .h happo liittoalueelta.
• · • · 35 Typistetyn sellulaasiproteiinin johdannainen viit- • · · ·1 taa edelleen proteiiniin, joka on rakenteeltaan ja biolo- 9 giselta aktiivisuudeltaan oleellisesti samankaltainen sel-lulaasin ydindomeeniin nähden, jolloin tämä käsittää luonnossa tavattavat sellulolyyttiset entsyymit, joita on kuitenkin manipuloitu sisältämään modifioitu aminohappose-5 kvenssi. Täten edellyttäen, että näillä kahdella proteiinilla on samankaltainen aktiivisuus, ne katsotaan "johdannaisiksi" ilmaisun tässä käytetyssä merkityksessä vaikka yhden proteiinin primaarirakenne ei käsitä toisessa tavattavaan nähden identtistä aminohapposekvenssiä.
10 Ilmaisu "sellulaasin katalyyttisen ydindomeenin aktiivisuus" viittaa tässä typistetyn sellulaasin aminohapposekvenssiin, joka käsittää sellobiohydrolaasien, esimerkiksi CBHI tai CBHII, ydindomeenin tai sen johdannaisen, joka kykenee entsymaattisesti pilkkomaan selluloosa-15 polymeerejä, kuten sulppu tai fosforihapolla turvotettu selluloosa.
Tässä määriteltyjen typistettyjen katalyyttisen ytimen proteiinien tai niiden johdannaisten aktiivisuus voidaan määrittää alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä 20 (katso T.M. et ai. julkaisussa "Methods in Enzymology", osa 160, toim. Wood, W.A., ja Kellog, S.T., Academic Press, 1988, s. 87 - 116). Esimerkiksi tällaiset aktiivi- * 1 1 suudet voidaan määrittää fosforihapolla turvotetun sellu- ..1·1 loosan ja/tai liukoisten oligosakkaridien hydrolyysillä, • · i/.j 25 mitä seuraa vapautuneiden pelkistävien sokerien kvantifi- : ointi. Tässä tapauksessa CBH-katalyyttisten domeenien tai • · · niiden johdannaisten vaikutuksesta vapautuneet liukoiset sokerituotteet voidaan todeta HPLC-analyysillä tai käyttä-mällä kolorimetrisiä määrityksiä pelkistävien sokerien • · · I.I 30 mittaamiseksi. Odotusten mukaan näillä katalyyttisillä do-• · **’ meeneilla tai niiden johdannaisilla on tallella ainakin 10 % aktiivisuudesta, jota osoittaa ehyt entsyymi määritettä- : essä kumpikin samanlaisissa olosuhteissa käyttäen samat s'-' määrät katalyyttisen domeenin proteiinia.
• · .Γ! 35 Ilmaisu "selluloosaan sitoutuvan domeenin aktiivi- • · · • · " suus" viittaa tässä sellulaasin aminohapposekvenssiin, jo- 10 ka käsittää sellobiohydrolaasien ja endoglukanaasien, esimerkiksi EGI:n, EGII:n, CBHI:n tai CBHII:n tai niiden johdannaisen sitoutuvan domeenin, joka sitoutuu ei-kovalenttisesti polysakkaridiin, kuten selluloosaan. Usko-5 taan, että selluloosaan sitoutuvat domeenit (CBD:t) toimivat sellulaasientsyymin katalyyttisestä ytimestä riippumattomasti proteiinin kiinnittämiseksi selluloosaan.
Muutkin alalla hyvin tunnetut menetelmät, jotka mittaavat sellulaasin katalyyttistä aktiivisuutta erityis-10 ten käsiteltyjen substraattien fysikaalisista tai kemiallisista ominaisuuksista, voivat sopia esillä olevaan keksintöön. Esimerkiksi menetelmiä varten, jotka mittaavat käsitellyn substraatin fysikaalisia ominaisuuksia, substraatista analysoidaaan muodon, konsistenssin, pinnan tai 15 rakenneominaisuuksien modifikaatio, "märkä"-kyvyn modifikaatio, esim. substraatin kyky absorboida vettä, tai turpoamisen modifikaatio. Muihin parametreihin, jotka voivat määrittää aktiivisuuden, lukeutuu muutoksen mittaaminen käsiteltyjen kiinteiden substraattien kemiallisissa omi-20 naisuuksissa. Esimerkiksi värien tai kemikaalien diffuusio-ominaisuuksia voidaan tarkastella kiinteän substraatin • · · ···! käsittelyn jälkeen esillä olevassa keksinnössä kuvatun mu- kaisella typistetyllä sellulaasiin sitoutuvalla prote- ,,1·1 iinilla tai sen jollain johdannaisella. Sopivia sub- ί \j 25 straattja aktiivisuuden arvioimiseksi ovat Avicel, raion, : sulppukuidit, puuvilla- tai tammikuidut, paperi, voimapa- • · · peri tai jauhettu puusulppu esimerkiksi (ks. myös Wood, T.M., et ai. , julkaisussa "Methods in Enzymology", osa 160, toim. Wood, W.A., ja Kellog, S.T., Academic Press, 30 1988, s. 87 - 116) .
• · • · *·· Ilmaisu "liitto- tai sarana-alue" viittaa siihen lyhyeen peptidialueeseen, joka liittää yhteen sienisellu-laasien kaksi erillistä funktionaalista domeenia, eli • · · ydindomeenin ja sitoutumisdomeenin. T. longibrachiatum • · ,ΓΙ 35 -sellulaaseissa näitä domeeneja yhdistää runsaasti Serriä, • « · 1 Thr:ää ja Pro:ta sisältävä peptidi.
11 "Signaalisekvenssi" viittaa mihin tahansa aminohapposekvenssiin, joka on sitoutunut proteiinin N-pääosaan ja helpottaa proteiinin kypsän muodon erittymistä solun ulkopuolelle. Signaalisekvenssin tämä määritelmä on funk-5 tionaalinen. Solunulkoisen proteiinin kypsästä muodosta puuttuu signaalisekvenssi, joka lohkeaa pois eritysproses-sin aikana.
Ilmaisu "variantti" viittaa DNA-fragmenttiin, joka koodittaa CBH:n ydindomeenia, ja joka voi edelleen sisäl-10 tää yhden tai useamman nukleotidin addition sisäisesti tai DNA-fragmentin 5'- tai 3'-päässä, yhden tai useamman nukleotidin deleetion sisäisesti tai DNA-fragmentin 5'- tai 3'-päässä tai yhden tai useamman nukleotidin substituution sisäisesti tai DNA-fragmentin 5'- tai 3'-päässä, jolloin 15 ydindomeenin funktionaalinen aktiivisuus säilyy.
Variantti-DNA-fragmentin, joka käsittää ydindomeenin, tarkoitetaan edelleen merkitsevän, että liitto- tai sarana-DNA-sekvenssi tai osa siitä voi olla kiinnitetty ydindomeeni-DNA-sekvenssiin joko 5'- tai 3'-päässä, jol-20 loin kooditetun typistetyn ydindomeeniproteiinin funktio naalinen aktiivisuus säilyy.
• · · • Ilmaisu "isäntäsolu" tarkoittaa sekä soluja että protoplasteja, jotka on muodostettu Trichoderma sp. -so-luista.
:#*.j 25 Ilmaisu "DNA-rakenne tai -vektori" (joita käyte- : tään tässä keskenään vaihtokelpoisesta) viittaa vektoriin, • · · •*j*; joka käsittää yhden tai useamman DNA-fragmentin tai DNA- varianttifragmentin, joka koodittaa mitä tahansa edellä kuvatuista uusista typistetyistä sellulaaseista tai joh- • · · I.! 30 dannaisista.
• · • · *1* Ilmaisu " funktionaalisesta kiinnitetty johonkin" tarkoittaa, että säätelyalue, kuten promoottori, päättäjä, erityssagnaali tai tehostinalue on kiinnitetty rakennegee-niin ja kontrolloi tuon geenin ilmentymistä.
• · .1*1 35 Esillä oleva keksintö koskee typistettyjen sellu- • · * * laasien valmistusmenetelmiä varaamalla isäntäsolu, joka on 12 transformoitu DNA-rakenteella, joka käsittää ainakin fragmentin DNA:ta, joka koodittaa CBHIrn ydinaluetta, funktio-naalisesti kiinnitettynä promoottoriin, viljelemällä isän-täsolua typistetyn sellulaasin ilmentämiseksi ja sitten 5 puhdistamalla typistetty sellulaasi oleellisesti homogeeniseksi .
Transformoidut mikro-organismiviljelmät kasvatetaan tyypillisesti stationaarifaasiin, suodatetaan solujen poistamiseksi ja jäljelle jäävä supernatantti konsentroi-10 daan ultrasuodattamalla typistetyn sellulaasin tai sen johdannaisen saamiseksi.
Kasvualusta, jota käytetään transformoitujen isän-täsolujen viljelemiseksi, voi olla mikä tahansa kasvualusta, joka sopii sellulaasituotantoon Trichodermassa. Typis-15 tetyt sellulaasit tai niiden johdannaiset otetaan talteen kasvualustasta tavanomaisilla tekniikoilla mukaan lukien solujen erottamiset kasvualustasta sentrifugoimalla tai suodattamalla, saostamalla proteiinit supernatantista tai suodoksesta suolalla, esimerkiksi ammoniumsulfaatilla, 20 jolloin tätä seuraavat kromatografiset menettelyt, kuten ioninvaihtokromatografia, affiniteettikromatografia ja muut ··· ···· samankaltaiset.
Ml
Vaihtoehtoisesti proteiini lopputuote voidaan eris- ..II’ tää ja puhdistaa sitomalla polysakkaridisubstraattiin tai • · ί/·ϊ 25 vasta-ainematriisiin. Vasta-aineet (polyklonaaliset tai : monoklonaaliset) voidaan tuottaa vastaan sellulaasin ydin- • · * tai sitoutumisdomeenipeptidejä, tai voidaan valmistaa syn-teettisiä peptidejä ydindomeenin tai sitoutumisdomeenin osista ja käyttää niitä polyklonaalisten vasta-aineiden • · · I.! 3 0 tuottamiseksi.
• · • · ‘1* Tichoderma-isäntäsolusta puuttuu yksi tai useampi sellulaasiaktiivisuus. Siten Trichoderma-isäntäsolua on voitu ··· edeltäpäin manipuloida geneettisesti mahdollisten koske-,···. mattomia sellulaaseja koodittavien isäntägeenien poistami- 35 seksi.
• · · • · • · 13
Typistetty sellulaasi voidaan ottaa talteen ja erottaa mistä tahansa koskemattomista sellulaaseista, jotka ilmentyvät samanaikaisesti isäntäsoluissa, tavanomaisilla, edellä kuvatuilla menettelyillä mukaan lukien ko-5 koekskluusiokromatografia. Typistettyjen sellulaasien tai johdannaisten ilmentyminen vahvistetaan SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla ja Western blot -immuuniana-lyysillä typistettyjen proteiinien erottamiseksi koskemattomista sellulaasiproteiineista.
10 Katsotaan, että DNA-fragmenttia, joka koodittaa typistetyn sellulaasin ydindomeenia, voidaan muuttaa esimerkiksi deleetioilla, insertioilla tai substituutioilla geenissä variantti-DNA:n tuottamiseksi, joka koodittaa aktiivista typistettyä sellulaasijohdannaista.
15 Lisäksi katsotaan, että DNA-fragmentti joka koo dittaa typistettyä sellulaasia, voidaan kiinnittää funk-tionaalisesti sienipromoottorisekvenssiin, esimerkiksi cbhl- tai egll-geenin promoottoriin.
Trichoderma -isäntäsolua manipuloidaan transfor- 20 moimalla siten, että DNA-fragmentti, joka koodittaa typistettyä sellulaasia, insertoidaan genomiin. Arvellaan myös, ··· ···· että useampi kuin yksi kopio typistetystä sellulaasi-DNA- fragmentista voidaan yhdistelmä-DNA-teknisesti liittää kantaan.
• · i 25 Ensiksi on valittava valikointimerkki, jotta : transformoitu sieni voidaan todeta. Mitä tahansa valikoin- ··· .1·1. timerkkigeeniä, joka ilmentyy Trichoderma sp. -kannoissa, voidaan käyttää esillä olevassa keksinnössä siten, ettei sen läsnäolo transformanteissa sanottavasti vaikuta näiden • · · I.I 30 ominaisuuksiin. Valikointimerkki voi olla geeni, joka koo- • · *11 dittaa määritettävää tuotetta. Valikointimerkki voi olla m ..1·1 funktionaalinen kopio Trichoderma sp. -geenistä, jonka puuttuminen isäntäkannasta johtaa siihen, että isäntäkanta #·!.# osoittaa auksotrof is ta fenotyyppiä.
• · 35 Käytetyt isäntäkannat voisivat olla Trichoderma sp.
• · · ^ 1 -johdannaisia, joista puuttuu valittua valikointimerkkiä 14 vastaava geeni tai vastaavat geenit tai joissa tämä on tai nämä ovat ei-funktionaalisia. Esimerkiksi, jos valikointi-merkiksi valitaan pyr4, transformointimenettelyssä käytetään vastaanottajana spesifistä pyr-johdannaiskantaa. Mui-5 ta esimerkkejä valikointimerkeistä, joita voidaan käyttää esillä olevassa keksinnössä, ovat Trichoderma sp. -geenit, jotka ovat ekvivalenttisia Aspergillus nidulans -geeneihin arqB, trpC, niaD ja vastaaviin nähden. Vastaavan vastaan-ottajakannan on tämän vuoksi oltava johdannaiskanta, kuten 10 arqB~, trpC~, niaP~ tai muu vastaava.
Kanta saadaan lähtöisäntäkannasta, joka on mikä tahansa Trichoderma sp. -kanta. Kuitenkin edullisesti käytetään T. longibrachiatum -sellulaasia hyvin runsaasti tuottavaa kantaa, kuten RL-P37, jota kuvaavat Sheir-Neiss 15 et ai., Appi. Microbiol. Biotechnology 20 (1984) 46 - 53, koska tämä kanta erittää kohonneita määriä sellulaasient-syymejä. Tätä kantaa käytetään sitten transformointimene-telmässä käytettyjen johdannaiskantojen tuottamiseksi.
Trichoderma sp. -johdannaiskanta voidaan valmistaa 20 lukuisilla alalla tunnetuilla tekniikoilla. Esimerkki on . pyr4~-johdannaiskantojen tuottaminen käsittelemällä kanto- • · · •••j ja fluoriorotiinihapolla (FOA) . Pyr4-qeeni koodittaa oro- ···! tidiini-5'-monofosfaattidekarboksylaasia, jota entsyymiä ..!·* tarvitaan uridiinin biosynteesiin. Kannat, joissa on ehyt • i *,*·· 25 pyr4-geeni, kasvavat kasvualustassa, josta puuttuu uridii- : ni, mutta ne ovat herkkiä fluoriorotiinihapolle. On mah- • ·· :*·*: dollista valita pyr4'-johdannaiskantoja, joista puuttuu funktionaalinen orotidiinimonofosfaattidekarboksylaasient-syymi ja joiden kasvu vaatii uridiinia, valikoimalla FOA- • » · l.'.' 3 0 resistenssin suhteen. FOA-valikointi tekniikkaa käyttäen on • · Ί* myös mahdollista saada uridiinia vaativia kantoja, joista puuttuu funktionaalinen orotaattipyrofosforibosyylitrans- • · · ! · ferääsi. On mahdollista transformoida nämä solut tätä ent- • · · ,···. syymiä koodittavan geenin funktionaalisella kopiolla [Ber- • · 35 ges ja Barreau, Curr. Genet. 19 (1991) 359 - 365] . Koska • · * * johdannaiskantojen valinta esillä olevassa keksinnössä on 15 helppoa käyttäen FOA-resistenssitekniikkaa, valikointi-merkkinä käytetään edullisesti pyr4-geeniä.
Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa Trichoderma-isäntäsolukannoista on deletoitu yksi 5 tai useampi sellulaasigeeni ennen DNA-rakenteen tai plas-midin mukaan liittämistä, joka sisältää kiinnostavaa typistettyä sellulaasiproteiinia koodittavan DNA-fragmentin. Edullisesti typistetty sellulaasi, sen johdannainen tai kovalenttisesti kytketyt typistetyt sellulaasidomeenijoh-10 dannaiset ilmennetään isännässä, josta puuttuu yksi tai useampi sellulaasigeeni, identifioinnin ja myöhempien puh-distusmenettelyjen yksinkertaistamiseksi. Mikä tahansa geeni Trichoderma sp.:stä, joka on kloonattu, voidaan de-letoida, kuten cbhl, cbh2, egll, eg!3 ja muut vastaavat. 15 Plasmidi geenideleetiota varten valitaan siten, että siinä on läsnä yksittäisiä restriktioentsyymikohtia, jotta olisi mahdollista poistaa homologisen Trichoderma sp. -DNA:n fragmentti yhtenä lineaarisena palana.
Haluttu geeni, joka on määrä deletoida transfor-20 mäntistä, insertoidaan plasmidiin alalla tunnetuilla menetelmillä. Plasmidi, joka sisältää geenin, joka on määrä • · · ···' deletoida tai jota on määrä häiritä, leikataan sitten yh- ..I: destä tai useammasta sopivasta restriktioentsyymikohdasta koodausalueella, geenin koodaus sekvenssi tai osa siitä 25 voidaan poistaa plasmidista ja insertoida valikointimerk- • · ; ki. Sivuavat DNA-sekvenssit deletoitavasta tai häirittä- • · · västä geenipaikasta, edullisesti noin 0,5 - 2,0 ke, säily- vät valikointimerkkigeenin kummallakin puolella.
m·'·' Deleetiorakenteen sisältävä yksittäinen DNA-frag- • · · M 30 mentti eristetään sitten plasmidista, ja sillä transfor-• · ’·;1 moidaan tarkoituksenmukainen pyr~-Trichoderma-isäntä.
<t*·1 Trans formant it valitaan niiden kyvyn nojalla ilmentää :***: pyr4-geeni tuote ja siten täydentää isäntäkannan uri- • · · •I. diiniauksotrofia. Sitten saaduilla transformantei 11a suo- • · • · ,;** 35 ritetaan Southern blot -analyysi kaksinkertaisen crossing • · · ** over -integraatiotapahtuman identifioimiseksi ja vahvista- 16 miseksi, joka korvaa osittain tai kokonaisuudessaan dele-toitavan geenin koodausalueen pyr4-valikointimerkeillä.
Vaikka edellä kuvataan spesifisiä plasmidivektoreita, esillä oleva keksintö ei rajoitu näiden vektorien 5 tuotantoon. Erilaisia geenejä voidaan deletoida ja korvata Trichoderma sp. -kannassa edeltäviä tekniikoita käyttäen. Kuten edellä esitettiin, mitä tahansa saatavilla olevaa valikointimerkkiä voidaan käyttää. Edellä kuvattua strategiaa käyttäen on mahdollista deletoida genomista mikä ta-10 hansa Trichoderma sp. -geeni, joka on kloonattu, ja siten identifioitu. Kaikki nämä variaatiot sisältyvät esillä olevaan keksintöön.
Esillä olevan keksinnön mukainen ilmentämisvekto-ri, joka käsittää insertoidun DNA-fragmentin tai variant-15 ti-DNA-fragmentin, joka koodittaa esillä olevan keksinnön mukaista typistettyä sellulaasia tai sen johdannaista, voi olla mikä tahansa vektori, joka kykenee replikoitumaan autonomisesti tietyssä isäntäorganismissa, tyypillisesti plasmidi. Edullisissa suoritusmuodoissa harkitaan kahden 20 tyyppisiä ilmentämisvektoreita geenien tai niiden typis- telmien ilmentymisen saamiseksi. Ensimmäinen sisältää DNA-sekvenssejä, joissa promoottori, geenikoodausalue ja päät- 9 .,*·* täjäsekvenssi kaikki ovat peräisin ilmennettävästä geenis- •Γ tä. Geenitypistelmä saadaan deletoimalla pois epätoivotta- 25 vat DNA-sekvenssit (jotka koodattavat ei-toivottuja do- • · . meeneja) , jolloin jäljelle jää ilmennettävä domeeni omien • · · transkriptionaalisten ja translationaalisten säätelyse- • · · kvenssiensä kontrollissa. Vektoriin sisältyy myös vali- . . kointimerkki, joka tekee mahdolliseksi valikoinnin isän- • · · • · · 30 tään integroituneiden uusien geenisekvenssien monikopioi- t · *·;·' den suhteen.
#>··· Toisentyyppinen ilmentämisvektori esikootaan ja se sisältää transkriptiolle korkeana tasona vaadittavat sek- • · · •I. venssit ja valikointimerkin. Arvellaan, että koodausalue 9 9 35 geenille tai sen osalle voidaan insertoida tähän yleis- • · · • · ‘ * käyttöilmentämisvektoriin siten, että se on ilmentämis- 17 kasetin promoottori- ja päättäjäsekvenssien transkriptio-naalisessa kontrollissa.
Esimerkiksi pTEX on tällainen yleiskäyttöilmentä-misvektori. Geenejä tai niiden osia voidaan insertoida 5 alavirtaan voimakkaasta CBHI-promoottorista. Tässä julkistettuihin esimerkkeihin on sisällytetty esimerkki, jossa sellulaasin katalyyttisen ytimen ja sitoutumisdomeenien osoitetaan ilmentyvän tätä systeemiä käytettäessä.
Vektorissa DNA-sekvenssin, joka koodittaa esillä 10 olevan keksinnön mukaisia typistettyjä sellulaaseja tai muita uusia proteiineja, tulisi olla operatiivisesti kytketty transkriptionaalisiin ja translationaalisiin sek-vensseihin, eli sopivaan promoottorisekvenssiin ja signaa-lisekvenssiin lukualueella rakennegeeniin nähden. Promoot-15 tori voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, joka osoittaa transkriptionaalista aktiivisuutta isäntäsolussa ja voidaan saada geeneistä, jotka koodittavat isäntäsolulle joko homologisia tai heterologisia proteiineja. Signaalipeptidi tuottaa typistetyn sellulaasin tai sen johdannaisten so-20 lunulkoisen ilmentymisen. DNA-signaalisekvenssi on edullisesti ilmennettävään typistettyyn geeniin luonnollisesti ··· •••ί liittyvä signaali sekvenssi, jolloin kuitenkin esillä ole- vassa keksinnössä harkitaan signaalisekvenssiä mistä ta-hansa sellobiohydrolaasista tai endoglukanaasista.
ϊ^.ϊ 25 Menettelyt esillä olevan keksinnön mukaisia typis- • ;1· tettyjä sellulaaseja, niiden johdannaisia tai muita uusia ··· .;1· sellulaaseja koodittavien DNA-sekvenssi en ligatoimiseksi promoottoriin ja insertoimiseksi sopiviin vektoreihin, jotka sisältävät tarvittavan informaation replikaatiolle « · · !.! 30 isäntäsolussa, ovat alalla hyvin tunnettuja.
• · **· Edellä kuvattu DNA-vektori tai -rakenne voidaan viedä isäntäsoluun tunnettujen tekniikoiden, kuten trans- ··· • t formaatio, transfektomti, mikroruiskutus, mikroporaatio, biolistinen pommitus ja muut vastaavat, mukaan.
• · .!1! 35 Edullisessa transformointitekniikassa on otettava • · · 1 huomioon, että koska soluseinän läpäisevyys Trichoderma 18 sp.:ssä on hyvin alhainen, halutun DNA-sekvenssin, geenin tai geenifragmentin otto on parhaimmillaankin minimaalinen. Löytyy lukuisia menetelmiä Trichoderma sp. -solu-seinän läpäisevyyden nostamiseksi johdannaiskannassa (eli 5 kannassa, josta puuttuu käytettyä valikointimerkkiä vastaava funktionaalinen geeni) ennen transformointimenette-lyä.
Edullinen menetelmä esillä olevassa keksinnössä Trichoderma sp.:n valmistelemiseksi transformointiin kä-10 sittää protoplastien valmistuksen sienimyseelistä. Myseeli voidaan saada itäneistä vegetatiivisista itiöistä. Mysee-liä käsitellään entsyymillä, joka pilkkoo soluseinän, jolloin saadaan protoplasteja. Sitten protoplastit suojataan osmoottisen stabiloijän läsnäololla suspendoimisväliai-15 neessa. Näitä stabiloijia ovat sorbitoli, mannitoli, ka- liumkloridi, magnesiumsulfaatti ja muut vastaavat. Tavallisesti näiden stabiloijien pitoisuus on 0,8 M - 1,2 M. Edullisesti suspensioväliaineessa käytetään noin 1,2 M sorbitoliliuosta.
20 DNA:n otto Trichoderma sp. -isäntäkantaan riippuu
. kalsiumionipitoisuudesta. Yleensä pitoisuuksia noin 10 mM
• · · •••j CaCl2 - 50 mM CaCl2 käytetään ottoliuoksessa. Kalsium- • · φ ···! ionitarpeen ottoliuoksessa lisäksi muita yleensä mukaan sisällytettyjä ovat puskurisysteemi, kuten TE-puskuri (10 • · ·.**: 25 mM Tris, oH 7,4, 1 mM EDTA) tai 10 mM MOPS-puskuri, pH 6,0 ί^ί (morfoliinipropaanisulfonihappo) , ja polyetyleeniglykoli (PEG) . Uskotaan, että polyetyleeniglykoli vaikuttaa solu- membraaneja fuusioivasti, jolloin väliaineen sisällön on mahdollista tulla kuljetetuksi Trichoderma sp. -kannan sy-• · · " .··*. 3 0 toplasmaan ja plasmidi-DNA:n tulla viedyksi tumaan. Tästä • · *1* fuusiosta saadaan monasti useita plasmidi-DNA-kopioita ..li* tandemissa integroituneina isäntäkromosomiin.
• · · :...Σ Tavallisesti transformaatiossa käytetään suspen- .···. siota, joka sisältää Trichoderma sp. :n protoplasteja tai 35 soluja, joihin on kohdistettu läpäisevyyskäsittely, tihey tenä 108 - 109/ml, edullisesti 2 x 108/ml. Nämä protoplas- 19 tit tai solut lisätään ottoliuokseen halutun linearisoidun valikointimerkin ohella, jossa on oleellisesti homologiset sivuavat alueet mainitun merkin kummallakin puolella, transformaatioseoksen muodostamiseksi. Yleensä ottoliuok-5 seen lisätään korkea pitoisuus PEG:tä. Protoplastisuspen-sioon voidaan lisätä 0,1 - 1 tilavuus 25-%:ista PEG 4000 -liuosta. Kuitenkin edullisesti protoplastisuspensioon lisätään noin 0,25 tilavuutta. Ottoliuokseen voidaan myös lisätä lisäaineita, kuten dimetyylisulfoksidi, hepariini, 10 spermidiini, kaliumkloridi ja muut vastaavat, avustamaan transformoinnissa.
Yleensä seosta inkuboidaan sitten noin 0 °C:ssa 10 -30 minuutin ajan. Sitten seokseen lisätään lisää PEG:tä halutun geenin tai DNA-sekvenssin oton edelleen te- 15 hostamiseksi. 25-%:ista PEG 4000 -liuosta lisätään yleensä tilavuuksina 5-15 kertaa transformointiseoksen tilavuus; kuitenkin suuremmat tai pienemmät tilavuudet voivat olla sopivia. 25-%:ista PEG 4000 -liuosta on edullisesti läsnä noin 10 kertaa transformointiseoksen tilavuus. Sen jälkeen 20 kun PEG on lisätty, transformointiseosta inkuboidaan huo- . neenlämpötilassa ennen sorbitoli- ja CaCl2-liuoksen lisä- • · · •**j ystä. Sitten protoplastisuspensio lisätään edelleen sula- • · · tettuihin kasvualustaeriin. Tämä kasvualusta sallii vain transformanttien kasvun. Esillä olevassa keksinnössä voi- • · 25 daan käyttää mitä tahansa kasvualustaa, joka sopii halut- ϊ^ί tujen transformanttien kasvatukseen. Kuitenkin, jos on määrä valikoida Pyr+-transformantit, käytetään edullisesti kasvualustaa, joka ei sisällä uridiinia. Saadut pesäkkeet siirretään ja niitä puhdistetaan uridiinia vailla olevalla • · · .···. 30 kasvualustalla.
♦ · Tässä vaiheessa stabiilit trans f ormantit erotet- ...Y tiin epästabiileista transformanteista niiden suuremman • · · kasvunopeuden perusteella ja siitä, että muodostui ympyrän .···. muotoisia pesäkkeitä, joissa oli tasainen paremminkin kuin • · 35 rosoinen reuna kiinteällä kasvualustalla, josta puuttui • · uridiini. Lisäksi joissakin tapauksisa tehtiin stabiili- 20 suuden lisätesti kasvattamalla transformantteja kiinteällä ei-selektiivisellä kasvualustalla (eli kasvualustalla, joka sisälsi uridiinia), ottamalla talteen itiöt tältä kasvualustalta ja määrittämällä niiden itiöiden prosentuaali-5 nen osuus, jotka sittemmin itävät ja kasvavat selektiivisellä kasvualustalla, josta puuttuu uridiini.
Edeltävän menetelmän erityisessä suoritusmuodossa typistetyt sellulaasit otetaan talteen aktiivisessa muodossa isäntäsolusta tuloksena typistetyn sellulaasin tar-10 koituksenmukaisesta translaation jälkeisestä prosessoin nista .
Eristetyn sellulaasin katalyyttisten ydindomeenien käytöstä ehyen sellulaasientsyymin käyttöön verrattuna saattaa olla hyötyä monissa käyttösovellutuksissa. Tällai-15 siä käyttösovellutuksia ovat kivipesu tai biokiillotus, joissa arvellaan, että värin/väriaineen/pigmentin takai-sinsuodattumista tai redepositiota voidaan vähentää tai se voidaan eliminoida käyttämällä uusia typistettyjä sellu-laasientsyymejä, joita on modifioitu siten, että niistä 20 puuttuu selluloosaan sitoutuva domeeni. Lisäksi arvellaan, . että aktiivisuutta tiettyjen kiinnostavien substraattien ··« •••j suhteen tekstiili-, detergentti-, puuhioke- ja paperi-, • · · ···! eläinravinne-, elintarvike-, biomassateollisuudessa esi- merkiksi voidaan merkittävästi tehostaa tai vähentää, jos • · !.*·· 25 sitoutuva domeeni poistetaan siten, että entsyymin sitou- : tumisaffiniteetti selluloosan suhteen laskee.
• · · :*·*: Edelleen arvellaan, että sellulaasientsyymien joi- denkin katalyyttisten domeenien ilmentäminen ja käyttö tarjoaisi entsyymin aiempaa paremman talteenotettavuuden, • · · 30 selektiivisyyden, silloin kun matalampaa aktiivisuutta ki- • · *!* teisempien substraattien suhteen toivotaan, tai selektii- visyyden, silloin kun halutaan korkea aktiivisuus amorfi- • · · : : sen/liukoisen substraatin suhteen.
• · · .···. Lisäksi sellulaasientsyymien katalyyttiset domee- • · 35 nit saattavat olla käyttökelpoisia synergian muiden sellu- • · * * laasikomponenttien, sellulaasi- tai ei-sellulaasidomeenien 21 ja/tai muiden entsyymien tai niiden osien kanssa tehostamiseksi selluloosaa sisältävien materiaalien suhteen käyttösovellutuksissa, kuten biomassan konversio, puhdistaminen, kivipesu, tekstiilien biokiillotus, pehmitys, puu-5 hioke/paperi-prosessointi, eläinravinteiden käyttö, kasvien suojaaminen ja tuholaiskontrolli, tärkkelyksen prosessointi tai farmaseuttisten välituotteiden, disakkaridien tai oligosakkaridien tuotanto.
Lisäksi sellulaasin katalyyttinen ydindomeenien 10 tai niiden johdannaisten käytöt voivat vähentää joitakin tuhoisia ominaisuuksia, jotka liittyvät ehyen entsyymin vaikutukseen selluloosapitoisiin materiaaleihin, kuten sulput, puuvilla- tai muut kuidut, tai paperi. Kiinnostavia ominaisuuksia ovat kuidun/kankaan lujuuden menetys, 15 kuidun/kankaan painon menetys, nöyhdän muodostuminen ja fibrillaatiovauriot.
Edelleen arvellaan, että sellulaasin katalyyttiset ydindomeenit voivat osoittaa vähemmän kuidun karhenemista tai vähentää väriaineen redepositiota/takaisinvalumista. 20 Lisäksi nämä typistetyt katalyyttiset ydinsellulaasit tai niiden johdannaiset voivat suoda mahdollisuuden näiden uu- • · 1 ···'· sien sellulaasien aiempaa parempaan talteenottoon/uudel- leenkierrätykseen.
..1·1 Lisäksi arvellaan, että sellulaasin katalyyttiset : 25 ydindomeenit voivat tarjota selektiivisiä aktiivisuusetuja : ;1: haluttaessa substraatin liukoisten tai amorfisempien sei- • · · luloosapitoisten alueiden hydrolyysiä, mutta kiteisemmän alueen hydrolyysiä ei. Tällä saattaa olla merkitystä bio- • · konversion kaltaisissa sovellutuksissa, joissa kiinnosta- • · · ' • · · 30 vaa on jyvä/kuitu/kasvimateriaalien selektiivinen modifi- • · ’1:** ointi.
ttj·’ Edelleen seuraava sovellus sellulaasin katalyytti- sille ydindomeeneille tai johdannaisille on mikrokiteisen • · · selluloosan (MCC) muodostaminen. Lisäksi arvellaan, että • · .Π 35 MCC sisältää vähemmän sitoutunutta entsyymiä tai että si- • · · 1’ toutunut entsyymi voi olla helpommin poistettavissa.
22
Jotkut seuraavista esimerkeistä kuvaavat keksintöä. Toiset antavat hyödyllistä taustaa.
Esimerkkejä EGl-ydindomeenin kloonaus ja ilmentäminen käyttäen 5 sen omaa promoottori-, päättäjä- ja signaalisekvenssiä
Osa 1. Kloonaus Täydellinen egll-geeni, jota käytettiin EGl-ydin-domeeni-ilmentämisplasmidin, PEGlh3'pyr, rakentamiseksi, saatiin plasmidista PUC218::EG1 (katso kuvio 6). Egll:n 10 3'-pääalue ligatoitiin PUC218:aan [Korman, D., et ai.,
Curr. Genet. 17 (1990) 203 - 212] 300 ep:n Bsml-EcoRI- fragmenttina synteettisen liittäjän ohella, joka oli suunniteltu korvaamaan 3'-introni ja selluloosaan sitoutuva domeeni lopetuskodonilla ja jatkamaan egll-päättä-15 jäsekvensseillä. Saatua plasmidia, PEGlT, pilkottiin
Hindlll:11a ja BsmI:llä ja vektorifragmentti eristettiin pilkkomistuotteesta agaroosigeelielektroforeesilla, jota seurasi elektroeluutio. egll-geenipromoottorisekvenssi ja egll:n ydindomeeni eristettiin PUC218::EG1:stä 2,3 ke:n 20 Hindlll-Sstl-fragmenttina ja ligatoitiin samaan synteetti- . seen liittofragmenttiin ja Hindlll-BsmI-pilkottuun • · · ···· PEGlT:hen PEGlA3':n muodostamiseksi.
• · · ···· Lopullinen tulos näistä operaatioista on korvata ..'S egll :n 3'-introni ja selluloosaan sitoutuva domeeni 53 ja • · 25 55 ep:n synteettisillä oligonukleotideillä. Nämä sijoitta- ::: vat TAG-lopetuskodonin seriinin 415 perään, minkä jälkeen sekvenssi jatkuu egll-päättäjällä aina BsmI-kohtaan.
9
Seuraavaksi T. longibrachiatum -valikointimerkki, pyr4, saatiin varhemmasta kloonista p219M (Smith et ai., « · · ,*··. 30 1991) eristettynä 1,6 ke:n EcoRI-HindIII-f ragmenttina.
• · ’** Tämä sisällytettiin lopulliseen ilmentämisplasmidiin, PEGlÄ3'pyr, kolmenkeskisenä ligatointina EcoRI: 11a pilkot- « · ♦ ί,,.ί tuun ja vasikan alkalisella fosfataasilla defosforyloituun ♦ .···. PUCl8-plasmidiin ja Hindlll-EcoRI-fragmenttiin, joka si- • · 35 sälsi egll-ydindomeenin PEGlA3':sta.
• · · - - • · • · 23
Osa 2. Transformointi ja ilmentäminen DNA:ta valmistettiin suuressa mittakaavassa ΡΕΘ1Δ3'pyr:istä ja tästä EcoRI-fragmentti, joka sisälsi egl1-ydindomeenin ja pyr4-geenin, eristettiin preparatii-5 visella geelielektroforeesilla. Eristetty fragmentti transformoitiin nelideletoidun kannan, 1A52 pyrl3 (jota kuvataan US-patenttihakemuksissa sarjanro 07/770 049, 08/048 728 ja 08/048 881, jotka sisällytetään kokonaisuudessaan tähän viitteiksi) uridiiniauksotrofiseen versioon ja iden-10 tifioitiin stabiilit transformantit.
Egl1-ydindomeenin ilmentävien transformanttien valikoimiseksi transformantteja kasvatettiin ravistelukol-veissa olosuhteissa, jotka suosivat sellulaasigeenien in-dusointia (Vogels + 1 % laktoosia).4-5 päivän kasvatuk-15 sen jälkeen proteiini supernatanteista konsentroitiin ja joko 1) ajettiin SDS-polyakryyliamidigeeleissä ennen eqll-ydindomeenin detektiota Western-analyysillä EGI-poly-klonaalisia vasta-aineita käyttäen, tai 2) konsentroidut supernatantit määritettiin suoraan käyttäen RBB-karbok-20 simetyyliselluloosaa endoglukanaasispesifisenä substraat tina, ja tuloksia verrattiin lA52-isäntäkantaan verrokki- • · · na. Transf ormanttiehdokkaat identifioitiin mahdollisesti • · « typistetyn EGI-ydindomeeniproteiinin tuottavina. Genomi-DNA ja kokonais-mRNA eristettiin näistä kannoista kasva- • · :/.j 25 tuksen jälkeen Vogels + 1 % laktoosi -kasvualustassa, ja : suoritettiin Southern ja Northern blot -kokeet käyttäen • · · eristettyä, vain egl 1 -ydindomeenin sisältävää DNA-frag-menttia. Nämä kokeet osoittivat, että voitiin eristää trans formant te ja, joissa oli kopio egl 1-ydindomeeni-i Imen- « « · 30 tämiskasetista integroituneena lA52:n genomiin, ja että • · nämä samat transformantit tuottivat egl1-ydindomeeni-mRNA: ta.
• · ·
Sitten kasvatettiin yhtä transformanttia käyttäen .···. alalla hyvin tunnettua kasvualustaa, joka sopii sellu- • · .1”. 35 laasituotantoon Trichodermassa ja jota täydennettiin lak- • · ’ * toosilla (Warzymoda, M. , et ai. , FR-patenttijulkaisu nro 24 2 555 603, 1984), 14 litran fermentorissa. Saatu liemi konsentroitiin ja sen sisältämät proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja Egll-ydindomee-niproteiini identifioitiin Western-analyysilla (ks. esi-5 merkki 3 jäljempänä). Sittemmin arvioitiin, että fermen-tointisupernatantin proteiinipitoisuus oli noin 5-6 g/litra, josta noin 1,7 - 4,4 g/litra oli EGI-ydindomeenia CMC-aasi-aktiivisuuden perusteella. Tämä arvo perustuu keskiarvoon useista suoritetuista EGI-ydinfermentoinneista.
10 Samalla tavalla mikä tahansa muu sellulaasidomeeni tai sen johdannainen voidaan tuottaa edellä käsiteltyihin nähden samankaltaisilla menettelyillä.
Esimerkki 2 EGI- ja EGII-katalyyttiSten ytimien puhdistaminen 15 Osa 1. EGI:n katalyyttinen ydin EGI-ydin puhdistettiin seuraavalla tavalla. Konsentroitu (ultrasuodatus) liemi suodatettiin käyttäen pii-maata, ja ammoniumsulfaattia lisättiin liemeen loppupitoi-suuteen 1 M (NH4)2S04. Tämä panostettiin sitten hydrofobi-20 seen kolonniin (Phenyl Sepharose Fast Flow, Pharmacia, ka-taloginro 17-0965-02) ja eluoitiin käyttäen suolagradient-···· tia 1 M - 0 M (NH4)2S04. EGI-ydintä sisältävät fraktiot yhdistettiin sitten pooliksi ja siirrettiin 10 mM TES-puskuriin, pH 7,5. Tämä liuos panostettiin sitten anionin- • · ϊ/·· 25 vaihtokolonniin (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia katalo- : ginro 17-0510-01) ja eluoitiin käyttäen gradienttia 0-1 • · · M NaCl 10 mM TES-puskurissa, pH 7,5. Puhtaimmista frakti-öistä poistettiin suolat 10 mM TES-puskuriin, pH 7,5, ja ne panostettiin Mono Q -kolonniin. EGI-ytimen eluointi • · · 3 0 suoritettiin käyttäen gradienttia 0 - 1 M NaCl. Saatujen • · *11 fraktioiden puhtausaste oli yli 85 %. Puhtaimman fraktion ..1·1 sekvenssi vahvistettiin EGI-ytimeksi.
··· ί,,.ί Osa 2. EGII:n katalyyttinen ydin .···. Arvellaan, että EGII:n katalyyttisen ytimen puh- • · .1” 35 distaminen on samankaltainen kuin EGII-sellulaasin puhdis- • · · ** • · ' taminen, koska sen biokemialliset ominaisuudet ovat saman- 25 kaltaiset. EGII-ytimen teoreettinen pl on alle V2 pH-yksikköä alhaisempi kuin EGII:n vastaava. Samoin EGII:n molekyylipaino on noin 80 % EGII:n molekyylipainosta. Tämän vuoksi seuraava puhdistusprotokolla perustuu EGII:n 5 puhdistukseen. Menetelmään saattaa liittyä ultrasuodatta-malla konsentroidun liemen suodattaminen piimään läpi ja (NH4)2S04:n lisääminen liuoksen säätämiseksi pitoisuuteen 1 M (NH4)2S04. Tämä liuos voidaan sitten panostaa hdrofo-biseen kolonniin (Phenyl-Sepharose Fast Flow, Pharmacia 10 kataloginro 17-0965-02) ja EGII voidaan vaihe-eluoida 0,15 M (NH4)2S04-liuoksella. EGII-ydintä sisältävät fraktiot voidaan sitten vaihtaa sitraatti-fosfaattipuskuriin, pH 7, 0,18 mOhm. Tämä materiaali voidaan sitten panostaa anioninvaihtokolonniin (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia 15 kataloginro 17-0510-01), jota on tasapainoitettu edellä mainitulla sitraatti-fosfaattipuskurilla. Odotusten mukaan EGII-ydin ei sitoudu kolonniin, vaan voidaan siten kerätä läpivirtauksesta.
Esimerkki 3 20 CBHII-ydindomeenin kloonaus ja ilmentäminen käyt täen CBHI:n promoottoria, päättäjää ja signaalisekvenssiä • · · CBHIIiSta • · ·
Osa 1. Tj. lonaibrachiatum -yleistarkoitusilmentä-misplasmidin PTEX rakentaminen 25 Plasmidi, PTEX, rakennettiin noudattaen Sambrookin : et ai. menetelmiä (supra, 1989) ja rakentamista havainnoi- • · · .·1; listetaan kuviossa 7. Tämä plasmidi on suunniteltu ja ra- kennettu monikäyttöilmentämisplasmidiksi käytettäväksi rihmasienessä Trichoderma lonqibrachiatum. Ilmentämis- • · · 30 kasetilla on useita ainutkertaisia ominaispiirteitä, jotka • · • · *;1 tekevät siitä käyttökelpoisen tähän tarkoitukseen. Tran- « ,.11’ skriptiota säädellään käyttäen voimakkaita CBHI-geenin promoottori- ja päättäjäsekvenssejä T_;_ longibrachiatumil- .···. le. CBHI-promoottorin ja -päätäjän välissä on yksittäisiä • · .!'! 35 Pmel- ja Sstl-restriktiokohtia, joita käytetään ilmennet- • · 1 1 tävän geenin insertoimiseksi. Ί\_ longibrachiatum -pyr4- 26 valikointimerkkigeeni on insertoitu CBHI-päättäjään ja il-mentämiskasetti kokonaisuudessaan (CBHI-promoottori-inser-tiokohdat-CBHI-päättäj ä-pyr4-geeni-CBHI-päättäj ä) voidaan leikata irti käyttäen yksittäistä Notl-restriktiokohtaa 5 tai yksittäisiä NotI- ja Nhel-restriktiokohtia.
Tämä vektori perustuu bakteerivektoriin, pSLll80 (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), joka on PUC-tyy-pin vektori, jossa on laajennettu monikloonauskohta. Alan ammattilainen kykenisi rakentamaan tämän vektorin kuviossa 10 7 esitetyn virtauskaavion nojalla (katso myös US-patentti- hakemus 07/954 113 PTEX-ilmentämisplasmidin rakentamiseksi) .
Olisi mahdollista rakentaa plasmideja, jotka ovat samankaltaisia kuin esillä olevassa keksinnössä kuvatut 15 PTEX-typistetyt sellulaasit tai niiden johdannaiset, ja jotka sisältävät minkä tahansa muun DNA-sekvenssipalan, joka korvaa typistetyn sellulaasigeenin.
Osa 2. Kloonaus Täydellinen cbh2-geeni, jota käytettiin CBHII-20 ydindomeeni-ilmentämisplasmidin, PTEX CBHII-ydin, rakenta miseksi, saatiin plasmidista PUC219::CBHII [Korman, D., et ai., Curr. Genet. 17 (1990) 203 - 212], Selluloosaan si- ..1·1 toutuva domeeni, joka sijaitsee cbh2 -geenin 5'-päässä, si- *f jaitsee kätevästi Xbal- ja SnaBI-restriktiokohtien välis- ···· - 25 sä. Xbal-kohdan hyödyntämiseksi ylimääräinen Xbal-kohta ; polyliittäjässä tuhottiin. PUC219::CBHII pilkottiin osit- • · · tain Xbal:llä siten, että valtaosa tuotteesta oli lineaa- • · · rinen. Xbal-ylijäämäpäät täytettiin käyttäen T4-DNA-poly- . . meraasia ja ligatoitiin toisiinsa olosuhteissa, jotka suo- • · · ** • · · 30 sivat plasmidin itseligatoitumista. Tämän vaikutuksesta • · *···’ tuhoutuu tasattu kohta, joka 50 %:ssa plasmideista oli /l· Xbal-kohta polyliittäjässä. Tällainen plasmidi identifioi- tiin ja pilkottiin Xbal:llä ja SnaBI:llä selluloosaan si- ·· · .1. toutuvan domeenin vapauttamiseksi. Vektori-CBHII-ydindo- • · .**; 35 meeni eristettiin ja ligatoitiin seuraaviin synteettisiin • · · ·’ oligonukleotideihin, jotka oli suunniteltu ja rakennettu 27 liittämään XbaI-kohdan SnaBI-kohtaan signaalipeptidaasi-pilkkomiskohdassa ja papaiinipilkkomiskohdassa liittodo-meenissa.
Xbal SnaBI
5' CTA GAG CGG TCG GGA ACC GCT AC 3' (sekv. tunnusnto 44) 3' TC CTC GCC AGC CCT TGG CGA TG 5'
Leu Glu Glu Arg Ser Gly Thr Ala Thr (sekv. tunnusnro 45) 5 Saatu plasmidi, pUCCBD CBHII, pilkottiin Nhel: llä, ja päät tasattiin inkuboimalla T4-DNA-polymeraasin ja dNTPreiden kanssa. Tämän jälkeen lineaarinen plasmidi-DNA, jonka päät oli tasattu, pilkottiin Bglllrlla, ja Nhel-(tasapää)-Bglll-fragmentti, joka sisälsi CBHII-signaali-10 sekvenssin ja ydindomeenin, eristettiin.
Lopullinen ilmentämisplasmidi rakennettiin pilkkomalla yleistarkoitusilmentämisplasmidi, pTEX (joka julkistettiin julkaisussa 07/954 113, ja sisällytetään kokonaisuudessaan tähän viitteeksi ja jota kuvataan jäljempänä 15 osassa 3) Sstll:11a ja Pmel:llä ja ligatoimalla CBHII Nhel(tasapää)-BglII-fragmentti alavirtaa cbhl-promoot- torista käyttäen synteettistä oligonukleotidiä, jonka sek-.·. venssi oli CGCTAG, Bgl 11 - yl i j äämäpään täyttämiseksi Sstll- ’**J yli jäämäpäällä.
**’* 20 pTEX-CBHI-ydinilmentämisplasmidi valmistettiin sa- ··· maila tavalla kuin edeltävässä esimerkissä kuvattu pTEX- • · · ’· *! CBHII-ydin. Sen rakentamista havainnollistetaan kuvios- sa 8.
• · · : Osa 3. Transformointi ja ilmentäminen
25 DNA:ta valmistettiin suuressa mittakaavassa pTEX
CBHII-ytimestä ja tästä Notl-f ragmentti, joka sisälsi • · .***. CBHII-ydindomeenin cbhl: n transkriptionaalisten elementti- • · » ·. en kontrollissa sekä pyr4-geenin, eristettiin preparatii- ··· ···· visella geelielektroforeesilla. Eristetty fragmentti • · *...* 30 transformoitiiin nelideletoidun kannan, 1A52 pyrl3, uri- :***: diiniauksotrof iseen versioon ja identifioitiin stabiilit ··· transf ormantit.
• · • · 28
Cbh2-ydindomeenin ilmentävien transformanttien valitsemiseksi genomi-DNA eristettiin kannoista kasvatuksen jälkeen Vogels + 1 % glukoosi -kasvualustalla ja suoritettiin Southern blot -kokeet käyttäen eristettyä DNA-5 fragmenttia, joka sisälsi vain cbh2-ydindomeenin. Eristettiin transformantit, joissa oli kopio cbh2-ydindomeeni-ilmentämiskasetista integroituneena lA52:n genomiin. Ko-konais-mENA eristettiin näistä kahdesta kannasta 1 päivän kasvatuksen Vogels + 1 % laktoosia -kasvualustalla jäl- 10 keen. mENA:11a suoritettiin Northern-analyysi käyttäen cbh2-koodausaluetta koettimena. Identifioitiin cbh2-ydin-domeeni-mENA:n ilmentävät transformantit.
Kahta transformanttia kasvatettiin samoissa olosuhteissa kuin kuvattiin aiemmin esimerkissä 1 14 litran 15 fermentoreissa. Saatu liemi konsentroitiin ja sen sisältä mät proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielek-troforeesilla ja CBHII-ydindomeeniproteiini identifioitiin Western-analyysillä. Yksi transformantti, nro 15, tuotti proteiinia, joka oli oikean kokoinen ja jonka reaktiivi-20 suus polyklonaalisten CBHII-vasta-aineiden kanssa oli oikeanlainen.
··· ...! Sittemmin arvioitiin, että fermentointisupernatan- ..li1 tin proteiinipitoisuus puhdistuksen jälkeen oli 10 g/litra, josta 30 - 50 % oli CBHII-ydindomeenia (ks. esi-25 merkki 4) .
• · : Mikä tahansa muu uusi typistetty sellulaasiydindo- • · · meeniproteiini tai sen johdannainen voidaan saada käyttä-mällä edellä kuvattuja menetelmiä.
• · Esimerkki 4 • · · • · · 30 CBHI- ja CBHII-katalyyttisten ytimien puhdistaminen • · *·· Osa 1. CBHI:n katalyyttinen ydin #>1j1 CBHI-ydin puhdistettiin liemestä, joka saatiin :1’1: pTEX-CBHI-ydinilmentämisvektorin käsittävästä T. longi- ··· -- - brachiatumista seuraavalla tavalla. CBHI-vtimen uit- • · ~ ..II— ' - -4 • · 35 rasuodatettu (UF) liemi suodatettiin piimaata käyttäen ja • · · ·1 laimennettiin 10 mM TES-puskuriin, pH 6,8, siten että joh- 29 tokyvyksi tuli 1,5 mOhm. Laimennettu CBHI-ydin panostettiin sitten anioninvaihtokolonniin (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia kataloginro 17-051001), jota oli tasapainoitettu 10 mM TES-puskurissa, pH 6,8. CBHI-ydin erotettiin valta-5 osasta muita proteiineja liemessä käyttäen gradienttieluu-tiota 10 mM TES:issä, pH 6,8, 0 - 1 M NaCl. CBHI-ydintä sisältävät fraktiot konsentroitiin sitten Amiconin sekoitetulla solukonsentroijalla käyttäen PM 10 -membraania (Diaflo-ultrasuodatusmembraanit, Amicon kataloginro 10 13132MEM 5468A) . Tämä vaihe konsentroi ytimen sekä erotti sen proteiineista, joiden molekyylipaino oli alhaisempi. Saaduissa fraktioissa oli enemmän kuin 85 % puhdasta CBHI-ydintä. Puhtaimman fraktion sekvenssi vahvistettiin CBHI-ytimeksi.
15 Osa 2. CBHIIm katalyyttinen ydin
Ennustetaan, että CBHIIm katalyyttinen ydin voidaan puhdistaa samalla tavalla kuin CBHlI-sellulaasin sen samankaltaisten biokemiallisten ominaisuuksien johdosta. CBHII-ytimen teoreettinen pl on alle Vz pH-yksikköä alhai-20 sempi kuin CBHII:n. Lisäksi CBHIIm katalyyttisen ytimen molekyylipaino on noin 80 % CBHIIm molekyylipainosta. Tä- ··· ···! män vuoksi seuraava ehdotettu puhdistusprotokolla perustuu CBHII:lle käytettyyn puhdistusmenetelmään. Piimaalla käsi- ..*·* telty, ultrasuodatettu (UF) CBHII-ydinliemi laimennetaan 25 10 mM TES-puskuriin, pH 6,8, siten, että johtokyvyksi tu- : lee < 0,7 mOhm. Sitten laimennettu CBHII-ydin panostetaan • · · anioninvaihtokolonniin (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia kataloginro 17-0510-01), jota oli tasapainoitettu 10 mM TES-puskurissa, pH 6,8. CBHII-ytimen eluoimiseksi kolon- • · ·
30 nista käytetään suolagradienttia 0 - 1 M NaCl 10 mM
• · *··* TESrissä, pH 6,8. CBHII-ydintä sisältävät fraktiot siirre- yjl* tään sitten 2 mM natriumsukkinaattipuskuriin, ja panoste- :***: taan kationinvaihtokolonniin (SP-Sephadex C-50) . Sitten ··«
CBHII-ydin eluoidaan kolonnista suolagradientilla 0 - 100 mM
!:*:* 35 NaCl.
• · · • · • · 30
Esimerkki 5 CBHII:n selluloosaan sitoutuvan domeenin kloonaus ja ilmentäminen CBHI-promoottoria käyttäen Osa 1. Kloonaus 5 Täydellinen cbh2-geeni, jota käytettiin CBHII- ydindomeeni-ilmentämisplasmidin, PTEX CBHII-ydin, rakentamisessa, saatiin plasmidista PUC219::CBHII. Selluloosaan sitoutuva domeeni, joka sijaitsee cbh2-geenin 5'-päässä, saatiin pilkkomalla PUC219::CBHIIta Bglll:11a ja Nsil:llä 10 ja eristämällä 450 ep:n Bqlll-Nsil-restriktiofraqmentti. Lopullinen ilmentämisplasmidi, PTEX CBHII CBD, rakennettiin pilkkomalla yleiskäyttöilmentämisplasmidi, PTEX (kuvataan julkaisussa 07/954 113, joka sisällytetään kokonaisuudessaan tähän viitteeksi) Sstll:11a ja Pmel:llä ja li-15 gatoimalla CBHII CBD Bglll-Nsil-fragmentti alavirtaan cbhl-promoottorista käyttäen synteettistä oligonukleoti-dia, jonka sekvenssi on 3' CGCTAG 5', Bglll-ylijäämäpään täyttämiseksi Sstll-ylijäämäpäällä ja seuraavaa synteettistä liittäjää Nsil-kohdan kytkemiseksi pTEX:in tasaiseen 20 Pmel-kohtaan (katso kuvio 9).
. 5' TAT TAC TAA 3' • · · 3' ACGT ATA ATG ATT 5'
Nsil *** *** lopetuskodonit • · « ···*
.·. : Sekventoitaessa lopullinen ilmentämisplasmidi, pTEX
• · · CBHII CBD, liitoskohtien yli havaittiin, että tahmea Nsil- • · · kohta oli ligatoitunut suoraan tasaiseen Pmel-kohtaan • · · * 25 pTEX:issä. Tämä merkitsee, että CBHII CBD:n lukualue ulot tuu kautta Pmel-liittäjän ja aina cbhl-päättäjään vielä 12 • · :.V aminohappoa seuraavasti: • · · • · • · • · · 5' AAA CCC CGG GTG ATT TAT TTT TTT TGT ATC TAC TTC TGA 3' *·** 3'TTT GGG GCC CAC TAA ATA AAA AAA ACA TAG ATG AAG ACT 5' • · *..·* (sekvenssi tunnusnro 4 6)
Lye Pro Arg Vai Ile Tyr Phe Phe Cye Ile Tyr Phe *** • · - .·** (sekvenssi tunnusnro 47) • · · • · • · 31
Kuitenkaan näiden ylimääräisten aminohappojen lisäyksen ei arvella merkittävästi muuttavan selluloosaan sitoutuvan domeenin ominaisuuksia.
Samalla tavalla arvellaan, että mikä tahansa muu 5 tunnettu sitoutumisdomeeni voidaan substituoida edeltävään pTEX-rakenteeseen substituoitujen sitoutumisdomeenien ilmentymisen saamiseksi noudattaen edellä julkistettua yleistä formaattia.
Osa 2. Transformointi ja ilmentäminen 10 DNA:ta valmistettiin suuressa mittakaavassa pTEX
CBHII CBD:stä, ja tästä eristettiin preparatiivisella gee-lielektroforeesilla NotI-fragmentti, joka sisälsi CBHII-ydindomeenin cbhl:n transkriptionaalisten elementtien kontrollissa sekä pyr4-geenin. Eristetty fragmentti trans-15 formoitiin nelideletoidun kannan, 1A52 pyrl3, uridiiniauk-sotrofiseen versioon ja identifioitiin stabiilit transformant it .
Cbh2:n selluloosaan sitoutuvan domeenin ilmentävien transformanttien valitsemiseksi eristettiin genomi-DNA 20 kaikista stabiilisti transformoiduista kannoista kasvatuksen Vogels + 1 % glukoosia -kasvualustalla jälkeen, ja suo- ··· ···· ritettiin Southern blot -kokeet käyttäen eristettyä DNA- fragmenttia, joka sisälsi cbhl-geenin, CBHII CBD PTEX - ..1·1 ilmentämisvektorin sisältävien transformanttien identifi- • · : 25 oimiseksi.
• · : Kokonais-mRNA eristettiin transformoiduista kan- • · · noista 1 päivän kasvatuksen Vogels + 1 % laktoosia -kasvu-alustalla jälkeen. mRNA:lla suoritettiin Northern-analyysi käyttäen cbh2-koodausaluetta koettimena. Useimmat trans- • · · 30 formantit ilmensivät cbh2 CBD -mRNA:n korkeina tasoina.
• · - • · *t1 Valittiin yksi transformantti, jota kasvatettiin aiemmin ..1·1 kuvatuissa olosuhteissa 14 litran f ermentorissa. Saatu Γ1[: liemi konsentroitiin ja sen sisältämät proteiinit erotet-
.···. tiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja CBHII
.!1! 35 CBD -proteiinilla suoritettiin Western-analyysi. Odotetun • · · • ♦ 1 kokoinen proteiini identifioitiin reaktiivisuudesta poly- 32 klonaalisten CBHII CBD -vasta-aineiden kanssa, jotka oli tuotettu vastaan synteettistä CBHII CBD -peptidiä, jonka sekvenssi oli:
NH2 C-G-G-Q-N-V-S-G-P-T-C-C-A-S-G-S-T-C-COOH
(sekvenssi tunnusnro 48) 5
Esimerkki 6
Selluloosaan sitoutuvien domeenien puhdistus
Sitoutumisdomeeni voidaan puhdistaa menetelmillä, 10 jotka ovat samankaltaisia kirjallisuudessa raportoituihin nähden [Ong, E., et ai., Bio/Technology 7 (1989) 604 - 607], Af finiteettikromatografiän ollessa kyseessä suodatettu si-toutumisdomeeniliemi voidaan saattaa kosketuksiin sellu-loosapitoiseen materiaaliin, kuten Avicel tai puu-15 hioke/paperi. Selluloosapitoinen kiinteä materiaali voidaan erottaa sentrifugoimalla tai suodattamalla. Vaihtoehtoisesti suodatettu liemi voidaan käyttää selluloosatyypin kolonnissa. Sitoutuneet sitoutumisdomeenit voidaan sitten eluoida käsittelemällä tislatulla vedellä, guanidinium-,·. 20 HC1:llä/muilla denaturoivilla aineilla, pinta-aktiivisilla ***I aineilla tai muilla sopivilla eluutiokemikaaleilla. Lämpö- '*** tilamodifioinnin käyttö saattaa myös olla yksi mahdolli- ··· suus . Voidaan käyttää niinikään af f initeettikromatograf iaa • · · *· 1· vasta-aineilla, jotka on muodostettu vastaan CBDrtä tai ^ · 25 CBD-johdannaista. Jokin nimenomainen puhdistusmenettely ··· V 2 voi vaatia useita fraktiointivaiheita riippuen näytemat- riisista ja esillä olevan keksinnön mukaisten sitoutumis- domeenien ja modifioitujen domeenien kemiallisista ominai- ·***· suuksista. Joissakin tapauksissa modifioidut domeenit voi- • · · *. 30 vat sisältää ylimääräisiä varattuja funktionaalisia ryh- • ·· ···· miä, jotka saattavat mahdollistaa muiden menetelmien, ku- ··· ' ♦ · *···1 ten ioninvaihdon, käyttämisen.
··« • · • « ··· « · • · 2 • · 33
Vaikka keksintöä on kuvattu erilaisilla edullisilla suoritusmuodoilla, alan taitaja huomaa, että erilaisia modifikaatioita, substituutioita, poisjättöjä ja muutoksia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön suojapiiristä ja hen-5 gestä. Täten tarkoitus on, että esillä olevan keksinnön suojapiiriä rajoittaa yksinomaan seuraavien patenttivaatimusten mukaan lukien niiden ekvivalenttien suojapiiri.
• · · • · · · • · · • · · · • · · • · · · • · • · · • · · • · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · « · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · t · · 1 · · • · · • · • ·
SEQUENCE LISTING
34 (I) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Fowler, Timothy Ward, Michael Clarkson, Kathleen Collier, Katherine Larenas, Edmund (ii) TITLE OF INVENTION: Novel Cellulaee Enzymes and Systems For Their Expression (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 48 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Genencor International (B) STREET: 180 Kimball Way (C) CITY: South San Francisco
(D) STATE: CA
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 08/189,948 (B) FILING DATE: DEC 17 1993 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Horn, Margaret A.
(B) REGISTRATION NUMBER: 33,401 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: GC226 • ..it1 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: . (A) TELEPHONE: (415) 742-7536 ..il' (B} TELEFAX: (415)742-7217 • • · · *i1’. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: • · · • · · • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ::: (A) LENGTH: 93 base pairs *** (B) TYPE: nucleic acid (c> strandedness: single • (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · • · · • · · • · .·1·. (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
*. (B) LOCATION: 1..93 • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · • · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: 35 GGC CAG TGC GGC GGT ATT GGC TAC AGC GGC CCC ACG GTC TGC GCC AGC 48
Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val eye Ala Ser 15 10 15 GGC ACA ACT TGC CAG GTC CTG AAC CCT TAC TAC TCT CAG TGC CTG 93
Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Aan Pro Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu 20 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser 15 10 15
Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu 20 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 166 base pairB {B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(1..20, 70..166) • ”· (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: • · · · ·«· CAA GCT TGC TCA AGC GTC TG GTAATTATGT GAACCCTCTC AAGAGACCCA 50 ···· Gin Ala Cys Ser Ser Val Trp • 1 5 • · · ** ’!**. AATACTGAGA TATGTCAAG G GGC CAA TGT GGT GGC CAG AAT TGG TCG GGT 100 I Gly Gin Cys Gly Gly Gin Asn Trp Ser Gly • · 10 15 • · · CCG ACT TGC TGT GCT TCC GGA AGC ACA TGC GTC TAC TCC AAC GAC TAT 148 ... Pro Thr cyB Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys val Tyr Ser Asn Asp Tyr ::: 20 25 30 TAC TCC CAG TGT CTT CCC 166
Tyr Ser Gin Cys Leu Pro • · 35 • · · • · :***: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: ♦ · · *# (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • · · ···# • · · • · « · ··» ♦ · · • · • · «·· «φ · ♦ · · • · • · 36 (A) LENGTH: 39 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
Gin Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly Gin Cys Gly Gly Gin Asn Trp Ser 15 10 15
Gly Pro Thr Cys Cys Ala ser Gly Ser Thr CyB Val Tyr Ser Asn Asp 20 25 30
Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu Pro 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 156 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: Bingle (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(l..82, 140..156) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: CAC TGG GGG CAG TGC GGT GGC ATT GGG TAC AGC GGG TGC AAG ACG TGC 46
His Trp Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys 15 10 15 ACG TCG GGC ACT ACG TGC CAG TAT AGC AAC GAC T GTTCGTATCC 92
Thr Ser Gly Thr Thr Cye Gin Tyr Ser Asn Asp 20 25 . CCATGCCTGA CGGGAGTGAT TTTGAGATGC TAACCGCTAA AATACAG AC TAC TCG 147 *1' Tyr Tyr Ser ··1: so • · · •••ί CAA TGC CTT 156
Gin Cys Leu ·· · · • · • · · • · · • · e • · · • · · • · · ·»· • · · ♦ ♦ ♦ • · • · · • · · ♦ ♦ ♦ ♦♦ • · • · ··· ··· • · · · « « · # · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · • · 37 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NOi6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION! SEQ ID NO: 6:
Hie Trp Gly Gin CyB Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly CyB Lys Thr Cys 15 10 15
Thr Ser Gly Thr Thr CyB Gin Tyr Ser Asn Aep Tyr Tyr Ser Gin Cye 20 25 30
Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 108 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STHANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..108 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: CAG CAG ACT GTC TGG GGC CAG TGT GGA GGT ATT GGT TGG AGC GGA CCT 48
Gin Gin Thr Vai Trp Gly Gin Cye Gly Gly He Gly Trp Ser Gly Pro 15 10 15 .I. ACG AAT TGT GCT CCT GGC TCA GCT TGT TCG ACC CTC AAT CCT TAT TAT 96 ...: Thr Asn Cye Ala Pro Gly Ser Ala Cye Ser Thr Leu Aen Pro Tyr Tyr . 20 25 30 • · · '1" GCG CAA TGT ATT 108 ·:1 Ala Gin CyB He **·· 35 • · • · · • · · • · . (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: • · ·
• »I
.1:·. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ·.· · (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein • · • 1 · • · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · • · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: 38
Gin Gin Thr Val Trp Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Trp Ser Gly Pro 15 10 15
Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cye Ser Thr Leu ABn Pro Tyr Tyr 20 25 30
Ala Gin Cye He 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1453 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(1..410, 478..1174, 1238..1453) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: CAG TCG GCC TGC ACT CTC CAA TCG GAG ACT CAC CCG CCT CTG ACA TGG 48
Gin Ser Ala Cys Thr Leu Gin Ser Glu Thr Hie Pro Pro Leu Thr Trp IS 10 15 CAG AAA TGC TCG TCT GGT GGC ACT TGC ACT CAA CAG ACA GGC TCC GTG 96
Gin Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gin Gin Thr Gly Ser Val 20 25 30 CTC ATC GAC GCC AAC TGG CGC TGG ACT CAC GCT ACG AAC AGC AGC ACG 144
Val He Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr 35 40 45 AAC TGC TAC GAT GGC AAC ACT TGG AGC TCG ACC CTA TGT CCT GAC AAC 192 ·;· Asn Cys Tyr Asp Gly Aan Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn ···· 50 55 60 GAG ACC TGC GCG AAG AAC TGC TGT CTG GAC GGT GCC GCC TAC GCG TCC 240 • Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser 65 70 7s 80 : ·.· ACG TAC GGA GTT ACC ACG AGC GGT AAC AGC CTC TCC ATT GGC TTT GTC 288 * · Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser He Gly Phe Val . 85 90 95 • · · ··· t»j· ACC CAG TCT GCG CAG AAG AAC GTT GGC GCT CGC CTT TAC CTT ATG GCG 336 ·.· · Thr Gin Ser Ala Gin Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Ala
100 105 HO
AGC GAC ACG ACC TAC CAG GAA. TTC ACC CTG CTT GGC AAC GAG TTC TCT 384 j
·1·1. Ser Asp Thr Thr Tyr Gin Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser I
'·1.1 Π5 120 125 • · · ! · TTC GAT GTT GAT GTT TCG CAG CTO CC GTAAGTGACT TACCATGAAC 430 ** Phe Asp Val Asp Val Ser Gin Leu Pro . 130 135 ··· ··2 CCCTGACGTA TCTTCTTGTG GGCTCCCAGC TGACTGGCCA ATTTAAG G TGC GGC 484 cys Gly • · · • ·· • · • · • · · · 1 2 • « · • e • · 39 XTG AAC GGA GCT CTC TAC TTC GTG TCC ATG GAC GCG GAT GGT GGC GTG 532
Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val 140 145 150 155 AGC AAG TAT CCC ACC AAC ACC GCT GGC GCC AAG TAC GGC ACG GGG TAC 580
Ser Lys Tyr Pro Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr 160 165 170 TGT GAC AGC CAG TGT CCC CGC GAT CTG AAG TTC ATC AAT GGC CAG GCC 628
Cys Aap Ser Gin Cys Pro Arg Asp Leu Lye Phe lie Asn Gly Gin Ala 175 180 185 AAC GTT GAG GGC TGG GAG CCG TCA TCC AAC AAC GCA AAC ACG GGC ATT 676
Asn Val Glu Gly Trp Glu Pro Ser Ser Αβπ Asn Ala Asn Thr Gly lie 190 195 200 GGA GGA CAC GGA AGC TGC TGC TCT GAG ATG GAT ATC TGG GAG GCC AAC 724
Gly Gly His Gly Ser Cys Cys Ser Glu Met ABp lie Trp Glu Ala Asn 205 210 215 TCC ATC TCC GAG GCT CTT ACC CCC CAC CCT TGC ACG ACT GTC GGC CAG 772
Ser He Ser Glu Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gin 220 225 230 235 GAG ATC TGC GAG GGT GAT GGG TGC GGC GGA ACT TAC TCC GAT AAC AGA 820
Glu He Cys Glu Gly Asp Gly CyB Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg 240 245 250 TAT GGC GGC ACT TGC GAT CCC GAT GGC TGC GAC TGG AAC CCA TAC CGC 868
Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg 255 260 265 CTG GGC AAC ACC AGC TTC TAC GGC CCT GGC TCA AGC TTT ACC CTC GAT 916
Leu Gly Asn Thr Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp 270 275 280 ACC ACC AAG AAA TTG ACC GTT GTC ACC CAG TTC GAG ACG TCG GGT GCC 964
Thr Thr Lys Lys Leu Thr Val Val Thr Gin Phe Glu Thr Ser Gly Ala 285 290 295 . ATC AAC CGA TAC TAT GTC CAG AAT GGC GTC ACT TTC CAG CAG CCC AAC 1012 *:* He Asn Arg Tyr Tyr Val Gin Asn Gly Val Thr Phe Gin Gin Pro Aen **·· 300 305 310 315 • · ···· GCC GAG CTT GGT AGT TAC TCT GGC AAC GAG CTC AAC GAT GAT TAC TGC 1060
Ala Glu Leu Gly Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys ...: 320 325 330 • · ·.*·· ACA GCT GAG GAG GCA GAA TTC GGC GGA TCC TCT TTC TCA GAC AAG GGC 1108 . Thr Ala Glu Glu Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly ::: 335 340 345 • · · ggc ctg act cag ttc aag aag gct acc tct ggc ggc atg gtt ctg gtc ii56 * Gly Leu Thr Gin Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val 350 355 360 ,·.·. ATG AGT CTG TGG GAT GAT GTGAGTTTGA TGGACAAACA TGCGCGTTGA 1204 *.*.* Met Ser Leu Trp Asp Asp ... 365 • · • · CAAAGAGTCA AGCAGCTGAC TGAGATGTTA CAG TAC TAC GCC AAC ATG CTG TGG 1258 .:. Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp ...: 370 375 • · · CTG GAC TCC ACC TAC CCG ACA AAC GAG ACC TCC TCC ACA CCC GGT GCC 1306 • · · • · • · • · · 1 · • · · • · • · 40
Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala 380 385 390 GTG CGC GGA AGC TGC TCC ACC AGC TCC GGT GTC CCT GCT CAG GTC GAA 1354
Vai Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Val Pro Ala Gin Val Glu 395 400 405 TCT CAG TCT CCC AAC GCC AAG GTC ACC TTC TCC AAC ATC AAG TTC GGA 1402
Ser Gin Ser Pro Asn Ala Lys Val Thr Phe Ser Aen lie Lys Phe Gly 410 415 420 CCC ATT GGC AGC ACC GGC AAC CCT AGC GGC GGC AAC CCT CCC GGC GGA 14S0
Pro He Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly 425 430 435 440 AAC 1453
Asn (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 441 amino acids (B) ΤΥΡΕ I amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
Gin Ser Ala Cye Thr Leu Gin Ser Glu Thr Hie Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15
Gin Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gin Gin Thr Gly Ser Val 20 25 30
Val lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Aen Ser Ser Thr 35 40 45
Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Aep Asn 50 55 60 #·· •••ϊ Glu Thr Cye Ala Lys Aen Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser .:. 65 70 75 80 9 ··«· • Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser He Gly Phe Val •f 85 90 95 «··· ♦*·.· Thr Gin Ser Ala Gin Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Ket Ala • * 100 105 110 9 see Φ · · • · · • · · Φ · · Φ · 9 9 9 9 0 9 9 0 9 9 9 9 999 0 9 Φ 9 999 9 9 999 9 Φ999 9 99 Φ 9 Φ 9 9 99 9 999 Φ 9 0 9 999 99 9 Φ 9 9 Φ 9 0 9 41
Ser ÄBp Thr Thr Tyr Gin Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser 115 120 125
Phe Asp Vai Asp Val Ser Gin Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu 130 135 140
Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro Thr 145 150 155 160
Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin Cys 165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe lie Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly Trp 180 185 190
Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly lie Gly Gly His Gly Ser 195 200 205
Cye Cys Ser Glu Met Asp lie Trp Glu Ala Asn Ser lie Ser Glu Ala 210 215 220
Leu Thr Pro His Pro cys Thr Thr Val Gly Gin Glu lie Cys Glu Gly 225 230 235 240
Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cye 245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Aep Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser 260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu 275 280 285
Thr Val Val Thr Gin Phe Glu Thr Ser Gly Ala lie Asn Arg Tyr Tyr 290 295 300
Val Gin Asn Gly Val Thr Phe Gin Gin Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser 305 310 315 320 * Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala *:* 325 330 335 ···· 9 *.* Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lye Gly Gly Leu Thr Gin Phe ·1; 340 345 350 «·· ·2 Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp ;*·.· 355 360 365 • · . 1. ABp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Ann 370 375 380 9 9· 9 9· * Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser 385 390 395 400 • · Ser Gly Val Pro Ala Gin Val Glu Ser Gin Ser Pro Asn Ala Lys Val V.: 405 410 415 • 9 9 ! · Thr Phe Ser Asn He Lys Phe Gly Pro He Gly Ser Thr Gly Asn Pro V 420 425 430 ··· ,,.: Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn #···# 435 440 • · • · · • · • · • · • · · · • 99 9 · 2 9 · 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1241 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (0} TOPOLOGY: linear <ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAHE/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(1..161, 218..465, 556..1241) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: TCG GGA ACC GCT ACG TAT TCA GGC AAC CCT TTT GTT GGG GTC ACT CCT 48
Ser Gly Thr Ala Thr Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Vai Gly Val Thr Pro 15 10 15 TGG GCC AAT GCA TAT TAC GCC TCT GAA GTT AGC AGC CTC GCT ATT CCT 96
Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala lie Pro 20 25 30 AGC TTG ACT GGA GCC ATG GCC ACT GCT GCA GCA GCT GTC GCA AAG GTT 144
Ser Leu Thr Gly Ala Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val 35 40 45 CCC TCT TTT ATG TGG CT GTAGGTCCTC CCGGAACCAA GGCAATCTGT 191
Pro Ser Phe Met Trp Leu 50 TACTGAAGGC TCATCATTCA CTGCAG A GAT ACT CTT GAC AAG ACC CCT CTC 242
Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu 55 60 ATG GAG CAA ACC TTG GCC GAC ATC CGC ACC GCC AAC AAG AAT GGC GGT 290
Met Glu Gin Thr Leu Ala Asp lie Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly 65 70 75 AAC TAT GCC GGA CAG TTT GTG GTG ATA GAC TTG CCG GAT CGC GAT TGC 338 .:. Asn Tyr Ala Gly Gin Phe Val Val lie Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys ...I 80 85 90 GCT GCC CTT GCC TCG AAT GGC GAA TAC TCT ATT GCC GAT GGT GGC GTC 3B6 . Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser lie Ala Asp Gly Gly Val •I* 95 100 105 110 ···· ;*· | GCC AAA TAT AAG AAC TAT ATC GAC ACC ATT CGT CAA ATT GTC GTG GAA 434 *· ’! Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr lie Asp Thr lie Arg Gin lie Val Val Glu . 115 120 125 • · · ... TAT TCC GAT ATC CGG ACC CTC CTG GTT ATT G GTATGAGTTT AAACACCTGC 485 ::: Tyr Ser Asp lie Arg Thr Leu Leu Val lie * 130 135 CTCCCCCCCC CCTTCCCTTC CTTTCCCGCC GGCATCTTGT CGTTGTGCTA ACTATTGTTC 545 • · • · · • · · • · ··· • · • ♦ • · · • · · ···· • · · • · • · ··· ··· • · • · ··· 1 · • · · • · • · 43 CCTCTTCCAG AG CCT GAC TCT CTT GCC AAC CTG GXG ACC AAC CXC GGT 593
Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly 140 145 ACI CCA AAG TGT GCC AAT GCI CAG ICA GCC TAC CTT GAG TGC ATC AAC 641
Thr Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gin Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Aan 150 155 160 165 TAC GCC GTC ACA CAG CTG AAC CTT CCA AAT GTT GCG ATG TAT TTG GAC 689
Tyr Ala Val Thr Gin Leu Αβπ Leu Pro Aan Vai Ala Het Tyr Leu Asp 170 175 180 GCT GGC CAT GCA GGA TGG CTT GGC TGG CCG GCA AAC CAA GAC CCG GCC 737
Ala Gly Hie Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gin Asp Pro Ala 185 190 195 GCT CAG CTA TTT GCA AAT GTT TAC AAG AAT GCA TCG TCT CCG AGA GCT 785
Ala Gin Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala 200 205 210 CTT CGC GGA TTG GCA ACC AAT GTC GCC AAC TAC AAC GGG TCG AAC ATT 833
Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn lie 215 220 225 ACC AGC CCC CCA TCG TAC ACG CAA GGC AAC GCT GTC TAC AAC GAG AAG 881
Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gin Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lye 230 235 240 245 CTG TAC ATC CAC GCT ATT GGA CCT CTT CTT GCC AAT CAC GGC TGG TCC 929
Leu Tyr lie His Ala lie Gly Pro Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser 250 255 260 AAC GCC TTC TIC ATC ACT GAT CAA GGT CGA TCG GGA AAG CAG CCT ACC 977
Aen Ala Phs Phe lie Thr Asp Gin Gly Arg Ser Gly Lys Gin Pro Thr 265 270 275 GGA CAG CAA CAG TGG GGA GAC TGG TGC AAT GTG ATC GGC ACC GGA TTT 1025
Gly Gin Gin Gin Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val lie Gly Thr Gly Phe 280 285 290 GGT ATT CGC CCA TCC GCA AAC ACT GGG GAC TCG TTG CTG GAT TCG TTT 1073
Gly lie Arg Pro Ser Ala Aan Thr Gly Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe .:. 295 300 305 e · · · .I. GTC TGG GTC AAG CCA GGC GGC GAG TGT GAC GGC ACC AGC GAC AGC AGT 1121 ...: Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser . 310 315 320 325 • · · • GCG CCA CGA TTT GAC TCC CAC TGT GCG CTC CCA GAT GCC TTG CAA CCG 1169 ; Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu Gin Pro * * 330 335 340
• · I
·.:.· GCG CCT CAA GCT GGT GCT TGG TTC CAA GCC TAC TTT GTG CAG CTT CTC 1217 .···. Ala Pro Gin Ala Gly Ala Trp Phe Gin Ala Tyr Phe Val Gin Leu Leu ·.· * 345 350 355 ACA AAC GCA AAC CCA TCG TTC CTG 1241 , . Thr Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu ::: 36o 365 • · • · · • · • · • · · • · · ···· ··· • · • · ··· ♦ ·· • · • · ··· ·· · ♦ · · • · • · 44 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12s (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 365 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
Ser Gly Thr Ala Thr Tyr Ser Gly Asn Pro Phe Vai Gly Val Thr Pro 15 10 15
Trp Ala Aan Ala Tyr Tyr Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala lie Pro 20 25 30
Ser Leu Thr Gly Ala Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val 35 40 45
Pro Ser Phe Met Trp Leu Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu Met Glu 50 55 60
Gin Thr Leu Ala Asp lie Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly Asn Tyr 65 70 75 80
Ala Gly Gin Phe Vai Val He Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala 85 90 95
Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser He Ala Asp Gly Gly Val Ala LyB 100 105 110
Tyr Lys Asn Tyr He Asp Thr Ile Arg Gin He Val Val Glu Tyr Ser 115 120 125
Asp He Arg Thr Leu Leu Val He Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu 130 135 140
Val Thr Asn Leu Gly Thr Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gin Ser Ala Tyr . 145 150 155 160 • · · e **** Leu Glu Cys He Asn Tyr Ala Val Thr Gin Leu Asn Leu Pro Asn Val ·.* 165 170 175 M·· ··· Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala ···· 180 185 190 • · I · · *· *· Asn Gin Αβρ Pro Ala Ala Gin Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala . 195 200 205 • · · • · ·
Ser Ser Pro Arg Ala Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr ·.* * 210 215 220
Asn Gly Trp Asn lie Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gin Gly Asn Ala 225 230 235 240 • · · • · ,···. Val Tyr Asn Glu Lys Leu Tyr He His Ala He Gly Pro Leu Leu Ala ·...* 245 250 255 • ·;· Asn His Gly Trp Ser Asn Ala Phe Phe He Thr Asp Gin Gly Arg Ser ···· 260 265 270 • · · • · *···’ Gly Lys Gin Pro Thr Gly Gin Gin Gin Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val .:. 275 280 285 • · • · .I” He Gly Thr Gly Phe Gly He Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp ser : 290 295 300 45
Leu Leu Asp Ser Phe Vai Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly 305 310 315 320
Thr Ser Asp Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro 325 330 335
Asp Ala Leu Gin Pro Ala Pro Gin Ala Gly Ala Trp Phe Gin Ala Tyr 340 345 350
Phe Val Gin Leu Leu Thr Asn Ala Αβπ Pro Ser Phe Leu 355 360 365 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1201 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(l..704, 775..1201) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: CAG CAA CCG GGT ACC AGC ACC CCC GAG GTC CAT CCC AAG TTG ACA ACC 48
Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr 15 10 15 TAC AAG TGT ACA AAG TCC GGG GGG TGC GTG GCC CAG GAC ACC TCG GTG 96
Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cye Val Ala Gin Asp Thr Ser Val 20 25 30 GTC CTT GAC TGG AAC TAC CGC TGG ATG CAC GAC GCA AAC TAC AAC TCG 144
Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser 35 40 45 • TGC ACC GTC AAC GGC GGC GTC AAC ACC ACG CTC TGC CCT GAC GAG GCG 192 **** Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala ·.· 50 55 60 • ·· · .:. ACC TGT GGC AAG AAC TGC TTC ATC GAG GGC GTC GAC TAC GCC GCC TCG 240 .·.: Thr Cye Gly Lys Asn Cys Phe lie Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser ,·. : 65 70 75 80 • · ·
GGC GTC ACG ACC TCG GGC AGC AGC CTC ACC ATG AAC CAG TAC ATG CCC 28B
It! Gly val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gin Tyr Het Pro ··* 85 90 95 • · · • · · • · · • · • · · • · · • · ·«· • · • · • · · • II MM • · · • · • · • · · ··· • · • · ··· ·· · • · · • · • · 46 AGC AGC TCT GGC ' "C TAC AGC AGC GTC TCT CCT CGG CTG TAT CTC CTG 336
Ser Ser Ser Gly -. _y Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu 100 105 110 GAC TCT GAC GGT GAG TAC GTG ATG CTG AAG CTC AAC GGC CAG GAG CTG 384
Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lye Leu Αβπ Gly Gin Glu Leu 115 120 125 AGC TTC GAC GTC GAC CTC TCT GCT CTG CCG TGT GGA GAG AAC GGC TCG 432
Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser 130 135 140 CTC TAC CTG TCT CAG ATG GAC GAG AAC GGG GGC GCC AAC CAG TAT AAC 480
Leu Tyr Leu Ser Gin Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gin Tyr Asn 145 150 155 160 ACG GCC GGT GCC AAC TAC GGG AGC GGC TAC TGC GAT GCT CAG TGC CCC 528
Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gin Cys Pro 165 170 175 GTC CAG ACA TGG AGG AAC GGC ACC CTC AAC ACT AGC CAC CAG GGC TTC 576
Val Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gin Gly Phe 180 185 190 TGC TGC AAC GAG ATG GAT ATC CTG GAG GGC AAC TCG AGG GCG AAT GCC 624
Cys Cys Ken Glu Met Asp lie Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Aen Ala 195 200 205 TTG ACC CCT CAC TCT TGC ACG GCC ACG GCC TGC GAC TCT GCC GGT TGC 672
Leu Thr Pro His Ser Cye Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys 210 215 220 GGC TTC AAC CCC TAT GGC AGC GGC TAC AAA AG GTGAGCCTGA 714
Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lye Ser 225 230 235 TGCCACTACT ACCCCTTTCC TGGCGCTCTC GCGGTTTTCC ATGCTGACAT GGTTTTCCAG 774 C TAC TAC GGC CCC GGA GAT ACC GTT GAC ACC TCC AAG ACC TTC ACC 820
Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr 240 245 250 ·;· ATC ATC ACC CAG TTC AAC ACG GAC AAC GGC TCG CCC TCG GGC AAC CTT 868 ·**· lie lie Thr Gin Phe Aen Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu ·)· 255 260 265 ···· ,:. GTG AGC ATC ACC CGC AAG TAC CAG CAA AAC GGC GTC GAC ATC CCC AGC 916 ...: Vai Ser He Thr Arg Lys Tyr Gin Gin Asn Gly Val Asp He Pro Ser ,·, : 270 275 280 • · · GCC CAG CCC GGC GGC GAC ACC ATC TCG TCC TGC CCG TCC GCC TCA GCC 964 ::: Ala Gin Pro Gly Gly Asp Thr He Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala' *·* 285 290 295
• M
• 9 · ’·* * TAC GGC GGC CTC GCC ACC ATG GGC AAG GCC CTG AGC AGC GGC ATG GTG 1012
Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lye Ala Leu Ser ser Gly Met Val 300 305 310 • 9 :,V CTC GTG TTC AGC ATT TGG AAC GAC AAC AGC CAG TAC ATG AAC TGG CTC 1060 ... Leu Vai Phe Ser He Trp Asn Asp Asn Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu : : 315 320 325 330 999 *j# GAC AGC GGC AAC GCC GGC CCC TGC AGC AGC ACC GAG GGC AAC CCA TCC 1108 *:* Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser ... 335 340 345 9 9 • 9 ·** AAC ATC CTG GCC AAC AAC CCC AAC ACG CAC GTC GTC TTC TCC AAC ATC 1156 9 99 • 9 • 9 9·· 9 9 9
III
• 9 9 9 47
Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Vai Vai Phe Ser Aan Ile 350 355 360 CGC TGG GGA GAC ATT GGG TCT ACT ACG AAC TCG ACT GCG CCC CCG I201
Arg Trp Gly Asp lie Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro 365 370 375 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 377 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr 15 10 15
Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gin Asp Thr Ser Val 20 25 30
Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser 35 40 45
Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala 50 55 60
Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe lie Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser 65 70 75 80
Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gin Tyr Met Pro 85 90 95
Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu 100 105 110
Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gin Glu Leu 115 120 125 • ..1·1 Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser . 130 135 140 *’2 Leu Tyr Leu Ser Gin Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Aen Gin Tyr Asn ·;· 145 150 155 160 ···· : Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gin CyB Pro *. 1: 165 170 175 • ·.·.· Val Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gin Gly Phe ... 180 185 190 • · · • · ·
Cys Cys Asn Glu Met Asp lie Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala 195 200 205 .1.1. Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys 210 215 220 • · · ·...· Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly • 225 230 235 240 ...: Asp Thr vai Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr He He Thr Gin Phe Asn 245 250 255 • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · 2 • · 48
Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser lie Thr Arg Lys 260 265 270
Tyr Gin Gin Asn Gly Val Ahp lie Pro Ser Ala Gin Pro Gly Gly Aep 275 280 285
Thr lie Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr 290 295 300
Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser lie Trp 305 310 315 320
Aen Asp Aan Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly 325 330 335
Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn lie Leu Ala Asn Asn 340 345 350
Pro Asn Thr Hie Vai Vai Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp He Gly 355 360 365
Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro 370 375 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1155 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear <ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(1..56, 231..1155) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: • /1* GGG GTC CGA TTT GCC GGC GTT AAC ATC GCG GGT TTT GAC TTT GGC TGT 48 ’1 2 Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn He Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys ·:* 15 10 15 • · · · .:. ACC ACA GA GTGAGTACCC TTGTTTCCTG GTGTTGCTGG CTGGTTGGGC 96 .·.: Thr Thr Asp • · • · · • · · GGGTATACAG CGAAGCGGAC GCAAGAACAC CGCCGGTCCG CCACCATCAA GATGTGGGTG 156 • · · • · · *** GTAAGCGGCG GTGTTTTGTA CAACTACCTG ACAGCTCACT CAGGAAATGA GAATTAATGG 216 • · · • AAGTCTTGTT ACAG T GGC ACT TGC GTT ACC TCG AAG GTT TAT CCT CCG 264
Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro 20 - 25 30 • · V.· TIG AAG AAC TTC ACC GGC TCA AAC AAC TAC CCC GAT GGC ATC GGC CAG 312 ... Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly He Gly Gin :: 35 40 45 • · · ATG CAG CAC TTC GTC AAC GAG GAC GGG ATG ACT ATT TTC CGC TTA CCT 360 *:* Met Gin His Phe Val Aen Glu Asp Gly Met Thr He Phe Arg Leu Pro 50 55 60 t · • · • · · • · · • · • · • · · · • » · • · 2 • · 49 GTC GCA TGG CAC TAC CTC GTC AAC AAC AAT TTG GGC GGC AAT CTT GAT 408
Val Gly Trp Gin Tyr Leu Val Asn Asn Αβπ Leu Gly Gly Asn Leu Asp 65 70 75 TCC ACG AGC ATT TCC AAG TAT GAT CAG CTT GTT CAG GGG TGC CTG TCT 456
Ser Thr Ser lie Ser Lye Tyr Asp Gin Leu Val Gin Gly Cys Leu Ser 80 85 00 CTG GGC GCA TAC TGC ATC GTC GAC ATC CAC AAT TAT GCT CGA TGG AAC 504
Leu Gly Ala Tyr Cys He Val Asp lie His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn 95 100 105 110 GGT GGG ATC ATT GGT CAG GGC GGC CCT ACT AAT GCT CAA TTC ACG AGC 552
Gly Gly He lie Gly Gin Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gin Phe Thr Ser 115 120 125 CTT TGG TCG CAG TTG GCA TCA AAG TAC GCA TCT CAG TGG AGG GTG TGG 600
Leu Trp Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Val Trp 130 135 140 TTC GGC ATC ATG AAT GAG CCC CAC GAC GTG AAC ATC AAC ACC TGG GCT 648
Phe Gly He Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn He Asn Thr Trp Ala 145 150 155 GCC ACG GTC CAA GAG GTT GTA ACC GCA ATC CGC AAC GCT GGT GCT ACG 696
Ala Thr Val Gin Glu Val Val Thr Ala He Arg Asn Ala Gly Ala Thr 160 165 170 TCG CAA TTC ATC TCT TTG CCT GGA AAT GAT TGG CAA TCT GCT GGG GCT 744
Ser Gin Phe He Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gin Ser Ala Gly Ala 175 180 185 190 TTC ATA TCC GAT GGC AGT GCA GCC GCC CTG TCT CAA GTC ACG AAC CCG 792
Phe He Ser Αβρ Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Val Thr Asn Pro 195 200 205 GAT GGG TCA ACA ACG AAT CTG ATT TTT GAC GTG CAC AAA TAC TTG GAC 840
Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu He Phe Asp Val Hie Lys Tyr Leu Asp 210 215 220
TCA GAC AAC TCC GGT ACT CAC GCC GAA TGT ACT ACA AAT AAC ATT GAC B8B
Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn He Asp 225 230 235 GGC GCC TTT TCT CCG CTT GCC ACT TGG CTC CGA CAG AAC AAT CGC CAG 936 . Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Asn Αεη Arg Gin *.1 240 245 250 • · · · ··· GCT ATC CTG ACA GAA ACC GGT GGT GCC AAC GTT CAG TCC TGC ATA CAA 984 ···· Ala He Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gin Ser Cys He Gin .·. : 255 260 265 270 • · · GAC ATG TGC CAG CAA ATC CAA TAT CTC AAC CAG AAC TCA GAT GTC TAT 1032 ! t I Asp Met Cys Gin Gin He Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Val Tyr ·2 275 280 285 • · · • · · *·1 1 CTT GGC TAT GTT GGT TGG GGT GCC GGA TCA TTT GAT AGC ACG TAT GTC 1080
Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly <Ala Gly Ser ?he Asp Ser Thr Tyr Val 290 295 300 • · : : : CTG ACG GAA ACA CCG ACT AGC AGT GGT AAC TCA TGG ACG GAC ACA TCC 1128 ' 1 Leu Thr Glu Thr Pro Thr ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser : : 305 310 315 • · · *. TTG GTC AGC TCG TGT CTC GCA AGA AAG 1155 ·;· Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys ···· 320 325 • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · 2 • · {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16s 50 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 327 amino acidB
(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGITj linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
Gly Vai Arg Phe Ala Gly Val Asn lie Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys 15 10 15
Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys 20 25 30
Aen Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly He Gly Gin Met Gin 35 40 45
His Phe Val Asn Glu Asp Gly Met Thr He Phe Arg Leu Pro Val Gly 50 55 60
Trp Gin Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr 65 70 75 80
Ser He Ser Lys Tyr Asp Gin Leu Val Gin Gly Cys Leu Ser Leu Gly 85 90 95
Ala Tyr Cys He Val Asp He His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly 100 105 110
He He Gly Gin Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gin Phe Thr Ser Leu Trp 115 120 125
Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Val Trp Phe Gly 130 135 140
He Met Asn Glu Pro Hie Asp Val Asn He Asn Thr Trp Ala Ala Thr 145 150 155 160 . Val Gin Glu Val Val Thr Ala He Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gin 165 170 175 • *t1 Phe He ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gin Ser Ala Gly Ala Phe He *:**. 180 185 190 • · · ' 1 Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Val Thr Asn Pro Asp Gly : 195 200 205 «»· ·1·1· Ser Thr Thr Asn Leu He Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asn Ser Asp 210 215 220
Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn He Asp Gly Ala 225 230 235 240 • · · • · .···. Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Aan Asn Arg Gin Ala He ·...1 245 250 255 • •t. Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Vai Gin Ser Cys He Gin Asp Met ...ϊ 260 265 270 ··· • ·
Cys Gin Gin He Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly 275 280 285 • · ]···1 Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val Leu Thr • · · • · • · 51 290 295 300
Glu Thr Pro Thr ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr ser Leu Val 305 310 31S 320
Ser ser Cye Leu Ala Arg Lys 325 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..72 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: CGT GGC ACC ACC ACC ACC CGC CGC CCA GCC ACT ACC ACT GGA AGC TCT 48
Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser 15 10 15 CCC GGA CCT ACC CAG TCT CAC TAC 72
Pro Gly Pro Thr Gin Ser His Tyr 20 ··· ···· • · ♦ ··· « · · ··«· • · • · · • · · • · ♦ ♦ · • « · «·· ·♦· • · · • ♦ · « • · • » · • · · • ♦ • · · • · • · • · · • · · • · · · • · t • · • · • · · • · · • · • · • · · 1 · · • · · • · • · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18: 52 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 amino acids (B) TYPE: amino acid {D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Snr 15 10 15
Pro Gly Pro Thr Gin Ser Hie Tyr 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO! 19: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 129 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..129 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:19: GGC GCT GCA AGC TCA AGC TCG TCC ACG CGC GCC GCG TCG ACG ACT TCT 48
Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser 15 10 15 CGA GTA TCC CCC ACA ACA TCC CGG TCG AGC TCC GCG ACG CCT CCA CCT 96
Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro 20 25 30 GGT TCT ACT ACT ACC AGA GTA CCT CCA GTC GGA 129 .!· Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly ...: 35 40 • • · **** (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:20: « · · ···* (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: I (A) LENGTH: 43 amino acids ·. ‘I (B) TYPE: amino acid • (D) TOPOLOGY: linear • · · *** (ii) MOLECULE TYPE: protein ...
*·* * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser .·.·. 15 10 15 • ♦ · • · ... Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro :...: 20 25 30 • .j. Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly ...: 35 40 ··· • · • · ··· ··♦ • · • · • · · 1 · • · · • · • ♦ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: 53 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 81 base pairs (B) TYPE: nucleie acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE.- DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..81 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: CCC CCG CCT GCG TCC AGC ACG ACG TTT TCG ACT ACA CCG AGG AGC TCG 48
Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser 15 10 15
ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG ACT SI
Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser eye Thr Gin Thr 20 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser 15 10 IS
··· Thr Thr Ser Ser Ser Pro ser cys Thr Gin Thr ···· 20 25 • · .,.: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23: • (U1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ****. (A) LENGTH: 102 base pairs ; ·.: (B) TYPE: nucleic acid • · (C) STRANDEDNESS: single • ·1. (D) TOPOLOGY: linear ··« (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · t 1 I • · • · 54 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..102 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23: CCG GGA GCC ACT ACT ATC ACC ACT TCG ACC CGG CCA CCA TCC GGT CCA 48
Pro Gly Ala Thr Thr He Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro 15 10 15 ACC ACC ACC ACC AGG GCT ACC TCA ACA AGC TCA TCA ACT CCA CCC ACG 96
Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr 20 25 30 AGC TCT 102
Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 amino acide (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
Pro Gly Ala Thr Thr He Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro 15 10 15
Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr 20 25 30
Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25: ..1·1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . (A) LENGTH: 51 base pairs *.1 (B) TYPE: nucleic acid ·2· (C) ETRANDEDNESS: single ··· (D) TOPOLOGY: linear ···· .1. : (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • ·· • · • ::: (ix) feature:
I2 (A) NAME/KEY: CDS
; ·1; (B) LOCATION: 1..51 • (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25: • · : : : ATG TAT CGG AAG TTG GCC GTC ATC TCG GCC TTC TTG GCC ACA GCT CGT 48 *.1 Met Tyr Arg Lys Leu Ala Vai He Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg :: i s io is ·«« *. GCT 51 *:1 Ala ·1·1 • · · • · • · «·» ··· • · • · ··· · · 2 • « · • · • · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26: 55 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: amino acid <D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2S:
Met Tyr Arg Lye Leu Ala Vai He Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg 15 10 15
Ala (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (AJ LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..72 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27: ATG ATT GTC GGC ATT CTC ACC ACG CTG GCT ACG CTG GCC ACA CTC GCA 48
Ket Ile Vai Gly He Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala 15 10 15 GCT AGT GTG CCT CTA GAG GAG CGG 72
Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg 20 •I1 2 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28: • · · · ·1· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ···· (A) LENGTH: 24 amino acids (B) TYPE: amino acid ...I (D) TOPOLOGY: linear • · I'.: (ii) MOLECULE TYPE: protein ; ;1· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28: • · · .·;·, Met Ile Vai Gly He Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala
·.· · 1 5 10 IS
Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg 20 • · · *·1·' (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29: • · · ·...· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • (A) LENGTH: 66 base pairs ,:, (B) TYPE: nucleic acid ,..: (C) STRANDEDNESS: single ··· • · • · • · · · · • · • · • · · 2 · • · f • · • · 56 (D) TOPOLOGY! linear (it) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..66 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29: ATG GCG CCC TCA GTT ACA CTG CCG TTG ACC ACG GCC ATC CTG GCC ATT 48
Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala lie Leu Ala He 15 10 15 GCC CGG CTC GTC GCC GCC 66
Ala Arg Leu Val Ala Ala 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30:
Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala He Leu Ala He 15 10 15
Ala Arg Leu Val Ala Ala 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 63 base pairs . (B) TYPE: nucleic acid ··· (C) STRANDEDNESS: single ···· (D) TOPOLOGY: linear ...: (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · · • *·'· (ix) FEATURE:
: ·.; (A) NAKE/KEY: CDS
• · (B) LOCATION: 1..63 Φ • » · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31: ...
...
• ATG AAC AAG TCC GTG GCT CCA TTG CTG CTT GCA GCG TCC ATA CTA TAT 4B
Met Asn Lye Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser He Leu Tyr 15 10 15 • · J J : GGC GGC GCC GTC GCA 63 • * Gly Gly Ala Val Ala .***. 20 • · ··· .J. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32: ···♦ • * • · ·♦· t·· • · • · ··· M · • · · • · • · 57 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32:
Met Aen Lye Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser lie Leu Tyr IS 10 15
Gly Gly Ala Val Ala 20 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! (A) LENGTH: 777 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33: AAACCAGCTG TGACCAGTGG GCAACCTTCA CTGGCAACGG CTACACAGTC AGCAACAACC 60 TTTGGGGAGC ATCAGCCGGC TCTGGATTTG GCTGCGTGAC GGCGGTATCG CTCAGCGGCG 120 GGGCCTCCTG GCACGCAGAC TGGCAGTGGT CCGGCGGCCA GAACAACGTC AAGTCGTACC 180 AGAACTCTCA GÄTTGCCATT CCCCAGAAGA GGACCGTCAA CAGCATCAGC AGCATGCCCA 240 CCACTGCCAG CTGGAGCTAC AGCGGGAGCA ACATCCGCGC TAATGTTGCG TATGACTTGT 300 TCACCGCAGC CAACCCGAAT CATGTCACGT ACTCGGGAGA CTACGAACTC ATGATCTGGT 360 AAGCCATAAG AAGTGACCCT CCTTGATAGT TTCGACTAAC AACATGTCTT GAGGCTTGGC 420
AAATACGGCG ATATTGGGCC GATTGGGTCC TCACAGGGAA CAGTCAACGT CGGTGGCCAG 4BO
• · Φ *··· AGCTGGACGC TCTACTATGG CTACAACGGA GCCATGCAAG TCTATTCCTT TGTGGCCCAG 540 • · · ···· ACCAACACTA CCAACTACAG CGGAGATGTC AAGAACTTCT TCAATTATCT CCGAGACAAT 600 • · *. *: AAAGGATACA ACGCTGCAGG CCAATATGTX CTTAGTAAGT CACCCTCACT GTGACTGGGC 660 Σ#·#Σ TGAGTTTGTT GCAACGTTTG CTAACAAAAC CTTCGTATAG GCTACCAATT TGGTACCGAG 720 :*·*· CCCTTCACGG GCAGTGGAAC TCTGAACGTC GCATCCTGGA CCGCATCTAT CAACTAA 777 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34: • · ·.*.· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ··· (A) LENGTH: 218 amino acids ϊ ϊ (B) TYPE: amino acid *** (C) STRANDEDNESS: Bingle (D) TOPOLOGY: linear "III {ii) MOLECULE ΤΪΡΕ: protein • · • · • · · «·· • · • · ··· ·· · t · · • · • · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34: 58
Gin Thr Ser Cys Asp Gin Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr 15 10 IS
Vai Ser Aan Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys 20 25 30
Vai Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp 35 40 45
Gin Trp Ser Gly Gly Gin Asn Asn Val Lye Ser Tyr Gin Asn Ssr Gin 50 55 60 lie Ala lie Pro Gin Lys Arg Thr Vai Aen Ser Ile Ser Ser Het Pro
65 70 75 SO
Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn lie Arg Ala Asn Val B5 90 95
Ala Tyr Aep Leu Phe Thr Ala Ala Aen Pro Asn His Val Thr Tyr Ser 100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Het Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp lie Gly 115 120 125
Pro lie Gly Ser Ser Gin Gly Thr Val Aen Val Gly Gly Gin Ser Trp 130 135 140
Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gin Val Tyr ser Phe Val 145 150 155 160
Ala Gin Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val LyB Asn Phe Phe 165 170 175
Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gin Tyr Val 180 185 190
Leu ser Tyr Gin Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu 195 200 205
Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser lie Asn 210 215 • · · • · · · • · *··· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35: • · · ...ί (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .·, ; (A) LENGTH: 4B base pairs ·. ·; (B) TYPE: nucleic acid , (C) STRANDEDNESS: single ::: (DJ TOPOLOGY: linear ··· j*j*. (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35: . . ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCC 48 t « · • · · • · .***. (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35: • · · • (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .:. (A) LENGTH: 16 amino acids ...I (B) TYPE: amino acid • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · t · · • · · • · • · 59 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3£:
Met Lys Phe Leu Gin Val Leu Pro Ala Leu He Pro Ala Ala Leu Ala 15 10 15 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 57 base paire (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37: AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGCG E7 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 4B base paire (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38: GTCACCTTCT CCAACATCAA GTTCGGACCC ATTGGCAGCA CCGGCTAA 48 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39: {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs • (B) TYPE: nucleic acid ,/·1 (C) STRANDEDNESS: double *’2 (D) TOPOLOGY: linear • · **·· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39: • · · ...: GGGGTTTAAA CCCGCGGGGA TT 22 • · !/·; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40: : (!) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ··· (A) LENGTH; 15 base paire .1:1. (B) TYPE: nucleic acid ·.· · (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear . . (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40: • · · *·1·1 TGAGCCGAGG CCTCC 15 • · · *...1 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41: .:. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ...: (A) LENGTH: 18 baBe pairs • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · 2 • · 60 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:
AGCTTGAGAT CTGAAGCT IB
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO-.42: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 6 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42: GATCGC 6 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 43: TTATTAGTAA TATGCA 16 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 baBe pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44: ··· CTAGAGGAGC GGTCGGGAAC CGCTAC 26 • · · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45: . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 9 amino acids ****. (B) TYPE: amino acid : (C) STRANDEDNESS: Bingle • · (D) TOPOLOGY: linear • (ii) MOLECULE TYPE: peptide • · · • · · • · · • (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:
Leu Glu Glu Arg Ser Gly Thr Ala Thr • · 1 5 • · · • · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 46: • · **· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *, (A) LENGTH: 39 base pair8 ·;1 (B) TYPE: nucleic acid • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · · · • · · • · • · 61 (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4S: AAACCCCGGG TGATTTATTT TTTTTGTATC TACTTCTGA 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 12 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:
Lys Pro Arg Val lie Tyr Phe Phe Cys lie Tyr Phe 15 10 • · · • · · · • · • · · · • · · • · · · • · • · · • · · • · • · · • · · • · 9 • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · * · · • · • · • · · 1 · · • · · • · • · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48: 62 <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS! {A) LENGTH: 18 amino acidB {B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D} TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:
Cys Gly Gly Gin Asn Val Ser Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser 15 10 15
Thr Cys • · · • · · · • · • · · · • · · • · · · • · • · · • · · • · • · · « · · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · • · · • · • · • · · 1 · · • · · • · • ·

Claims (6)

1. Menetelmä eksoglukanaasiaktiivisuutta ilmentävän rekombinantin sellulaasiproteiinin valmistamiseksi, 5 joka menetelmä käsittää vaiheet: a) varataan Trichoderma isäntäsolu, jolta puuttuu yksi tai useampi sellulaasiaktiivisuus ja joka on transformoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää sellulaasi-proteiinia koodaavan DNA sekvenssin, jolloin mainittu sel- 10 lulaasiproteiini käsittää CBHI:n katalyyttisen ydinprote- iinin, joka ilmentää eksoglukanaasiaktiivisuutta ja jolta puuttuu selluloosaa sitova domeeni, sellaisissa olosuhteissa, joissa mainittu ekspressiovektori integroituu mai-nitu solun genomiin; ja 15 b) kasvatetaan transformoitua isäntäsolua sellai sissa olosuhteissa, joissa rekombinatti sellulaasiproteii-ni ekspressoituu.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainitulla sellulaasiproteiinilla on sekvenssi, joka koos- 20 tuu sekvenssissä nro 10 esitetystä aminohapposekvenssistä.
. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa ·«« '1·· mainitulla CBHI:n katalyyttistä ydintä koodaavalla DNA • ♦ ···· sekvenssillä on sekvenssissä nro 9 esitetty sekvenssi. »·· •••ί
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa • · ·.1·: 25 sieni-isäntäsolu on Trichoderma longibrachiatum. J.j.i
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukai- ΓΓ: nen menetelmä, joka käsittää lisäksi rekombinantin sellu laasiproteiinin eristämisen.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-5 mukai- • · .···. 30 nen menetelmä, joka käsittää lisäksi vaiheen, jossa mai- • t *·1 nittu isäntäsolu transformoidaan mainitulla ekspressiovek- • · · torilla sellaisissa olosuhteissa, joissa mainittu ekspres- • · · :...· siovektori integroituu mainitun isäntäsolun genomiin. ··· • · • · ··· 2 2 · • · · • · • ·
FI962444A 1993-12-17 1996-06-12 Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi FI119695B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/169,948 US5861271A (en) 1993-12-17 1993-12-17 Cellulase enzymes and systems for their expressions
US16994893 1993-12-17
PCT/US1994/014163 WO1995016782A1 (en) 1993-12-17 1994-12-19 Novel cellulase enzymes and systems for their expression
US9414163 1994-12-19

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI962444A FI962444A (fi) 1996-06-12
FI962444A0 FI962444A0 (fi) 1996-06-12
FI119695B true FI119695B (fi) 2009-02-13

Family

ID=22617873

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953867A FI116965B (fi) 1993-12-17 1995-08-16 Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi
FI962444A FI119695B (fi) 1993-12-17 1996-06-12 Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953867A FI116965B (fi) 1993-12-17 1995-08-16 Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5861271A (fi)
EP (3) EP1700524B1 (fi)
JP (1) JPH09506514A (fi)
CN (1) CN1093379C (fi)
AT (3) ATE387104T1 (fi)
AU (1) AU685210B2 (fi)
CA (2) CA2178636A1 (fi)
DE (3) DE69435078T2 (fi)
DK (2) DK0684770T3 (fi)
ES (1) ES2160694T3 (fi)
FI (2) FI116965B (fi)
HK (1) HK1097163A1 (fi)
NO (1) NO314562B1 (fi)
NZ (1) NZ278373A (fi)
PT (1) PT684770E (fi)
WO (2) WO1995016782A1 (fi)

Families Citing this family (252)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
GB9424661D0 (en) * 1994-12-07 1995-02-01 Biotal Ltd Enzymes, microorganisms and their use
ATE315083T1 (de) 1995-03-17 2006-02-15 Novozymes As Neue endoglukanase
US5700686A (en) * 1995-06-06 1997-12-23 Iogen Corporation Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing
EP0850295B2 (en) 1995-09-08 2011-11-30 Novozymes A/S Prevention of back-staining in stone washing
US5958083A (en) * 1995-09-08 1999-09-28 Novo Nordisk A/A Prevention of back-staining in stone washing
US6723549B2 (en) 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6184019B1 (en) 1995-10-17 2001-02-06 Röhm Enzyme Finland OY Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6190898B1 (en) * 1995-10-23 2001-02-20 Genencor International, Inc. Crystalline cellulase and method for producing same
EP0877799A1 (en) * 1996-01-29 1998-11-18 Novo Nordisk A/S Process for desizing cellulosic fabric
AR005601A1 (es) * 1996-01-29 1999-06-23 Novozymes As Proceso para la remocion o blanqueo de suciedad o manchas presentes en telas celulosicas y proceso para el lavado de telas celulosicas manchadas o sucias y composicion detergente
US6277596B1 (en) * 1996-09-13 2001-08-21 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Regulatory sequence of cellulase cbh1 genes originating in trichoderma viride and system for mass-producing proteins or peptides therewith
US6451063B1 (en) * 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
US6017870A (en) * 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
EP0975745B1 (en) * 1996-10-28 2008-02-20 Novozymes A/S Extracellular expression of cellulose binding domains (cbd) using bacillus
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
US5866407A (en) * 1997-03-18 1999-02-02 Iogen Corporation Method and enzyme mixture for improved depilling of cotton goods
TW409035B (en) 1997-06-04 2000-10-21 Gist Brocades Bv Starch-based enzyme granulates
ES2234067T5 (es) * 1997-07-31 2009-05-01 Dsm Ip Assets B.V. Composicion para mejorar el pan.
US6294366B1 (en) * 1997-09-19 2001-09-25 Clariant Finance (Bvi) Limited Compositions and methods for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US6287839B1 (en) 1997-11-19 2001-09-11 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
GB9724629D0 (en) * 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Alpha/beta hydrolase-fold enzymes
DK1038008T3 (da) * 1997-12-16 2007-03-12 Genencor Int Fremgangsmåde til fremstilling af EGIII-lignende enzymer
CN101024826B (zh) 1998-06-10 2014-09-03 诺沃奇梅兹有限公司 新的甘露聚糖酶
US6407046B1 (en) 1998-09-03 2002-06-18 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US6268328B1 (en) * 1998-12-18 2001-07-31 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US6579841B1 (en) 1998-12-18 2003-06-17 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US7977051B2 (en) 1999-04-10 2011-07-12 Danisco Us Inc. EGIII-like enzymes, DNA encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
US7375197B2 (en) * 2002-01-14 2008-05-20 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase I gene and improved variants
US8637293B2 (en) * 1999-07-13 2014-01-28 Alliance For Sustainable Energy, Llc Cellobiohydrolase I enzymes
DE60045255D1 (de) * 1999-12-23 2010-12-30 Genencor Int Cellulase von t. reesei mit verbesserter thermostabilität
WO2001072783A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 Genencor International, Inc. Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells
GB0011439D0 (en) * 2000-05-12 2000-06-28 Novartis Res Found Cancer diagnosis and assays for screening
US6623949B1 (en) 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
JP4557108B2 (ja) * 2000-08-11 2010-10-06 ライオン株式会社 キメラ酵素及び洗浄剤組成物
ES2266265T3 (es) * 2000-09-25 2007-03-01 Iogen Energy Corporation Metodo para la produccion de glucosa con una mezcla de celulosa que comprende una celulosa modificada.
ES2521615T3 (es) 2001-06-06 2014-11-13 Novozymes A/S Endo-beta-1,4-glucanasa
DE60221266T2 (de) * 2001-10-26 2008-02-14 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung von esswaren
DK1485495T3 (da) * 2002-03-15 2010-11-22 Iogen Energy Corp Fremgangsmåde til glucosefremstilling under anvendelse af endoglucanasekerneprotein til forbedret indvinding og genbrug af enzym
GB2389584A (en) * 2002-06-14 2003-12-17 Norsk Hydro As A fusion protein
DK1578943T3 (da) 2002-08-16 2012-01-09 Danisco Us Inc Nye variant-Hypocrea jecorina-CBH1-cellulaser
SI1627050T1 (sl) * 2003-04-01 2014-01-31 Danisco Us Inc. Varianta humicola grisea cbh1.1
EP1618183B1 (en) 2003-04-29 2014-11-19 Danisco US Inc. Novel bacillus 029cel cellulase
WO2004099370A2 (en) 2003-04-30 2004-11-18 Genencor International, Inc. NOVEL BACILLUS mHKcel CELLULASE
CN101300335A (zh) 2003-04-30 2008-11-05 金克克国际有限公司 新颖的杆菌BagCel纤维素酶
ATE478140T1 (de) 2003-05-02 2010-09-15 Novozymes Inc Verfahren zur herstellung sezernierter polypeptide
WO2005001036A2 (en) 2003-05-29 2005-01-06 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
WO2004113551A1 (en) 2003-06-25 2004-12-29 Novozymes A/S Process for the hydrolysis of starch
WO2005003311A2 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Novozymes A/S Enzymes for starch processing
MXPA06004463A (es) 2003-10-28 2006-06-27 Novozymes North America Inc Enzimas hibridas.
EP1682655B1 (en) 2003-10-30 2009-09-02 Novozymes A/S Carbohydrate-binding modules
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
BRPI0416797A (pt) 2003-11-19 2007-04-17 Genencor Int serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas
CN1875099B (zh) * 2003-11-21 2011-05-04 金克克国际有限公司 颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法
US20070148741A1 (en) 2003-12-19 2007-06-28 Novozymes A/S Mashing process
BRPI0509212A (pt) 2004-03-25 2007-08-28 Genencor Int proteìna de fusão de celulase e construto de fusão de celulase heterólogo codificando a mesma
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
DE602005021479D1 (de) * 2004-04-16 2010-07-08 Ab Enzymes Oy Verfahren und dna-konstrukte zur erhöhung des produktionsniveaus von kohlenhydrat abbauenden enzymen in filamentösen pilzen
US7348172B2 (en) * 2004-04-16 2008-03-25 Ab Enzymes Oy Method and DNA constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
US7037704B2 (en) * 2004-05-27 2006-05-02 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an Aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
US7332319B2 (en) * 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
WO2005117756A2 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
WO2006069289A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Novozymes North America, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
AR051863A1 (es) 2004-12-22 2007-02-14 Novozymes As Enzimas hibridas
WO2006074005A2 (en) * 2004-12-30 2006-07-13 Genencor International, Inc. Variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
JP5087407B2 (ja) 2004-12-30 2012-12-05 ジェネンコー・インターナショナル・インク 酸性真菌プロテアーゼ
EP2333045B1 (en) * 2005-04-12 2016-11-09 Danisco US Inc. Gene inactivated mutants with altered protein production
MY145870A (en) * 2005-12-15 2012-05-15 Lilly Co Eli Enzymes for reduced immunological stress
BRPI0710217A2 (pt) * 2006-03-30 2011-08-02 Novozymes Inc polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polinucleotìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo
BRPI0713389A2 (pt) 2006-06-21 2012-04-17 Novozymes North America, Inc. e Novozymes A/S processo para desengomagem e lavagem combinadas de um tecido engomado, e, composição
DK2069512T3 (da) * 2006-09-22 2010-09-20 Danisco Us Inc Genencor Div Acetolaktat-syntase fra Trichoderma reesei som selektionsmarkør
US9447397B2 (en) 2006-10-10 2016-09-20 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
US8105812B2 (en) * 2006-12-18 2012-01-31 Danisco Us Inc. Laccases, compositions and methods of use
US20080220498A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
CN101636490B (zh) 2007-03-14 2012-05-16 丹尼斯科美国公司 里氏木霉α-淀粉酶是一种生麦芽糖酶
DK2147104T3 (en) * 2007-05-21 2015-12-14 Danisco Us Inc USING A ASPARAGINPROTEASE- (NSP24) SIGNAL SEQUENCE FOR heterologous protein EXPRESSION
US8450098B2 (en) * 2007-05-21 2013-05-28 Danisco Us Inc. Method for introducing nucleic acids into fungal cells
EP2170099B1 (en) * 2007-06-29 2014-11-19 Kemin Industries (Zhuhai) Co. Ltd. Enzyme product for ruminants
PL2514818T3 (pl) 2007-10-09 2014-11-28 Danisco Us Inc Odmiany glukoamylazy
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
US7618801B2 (en) * 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
CN101842479A (zh) * 2007-11-01 2010-09-22 丹尼斯科美国公司 用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣
ES2527586T3 (es) 2007-11-20 2015-01-27 Danisco Us Inc. Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas
SG162265A1 (en) 2007-12-13 2010-07-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene
EP2546338A1 (en) 2008-01-02 2013-01-16 Danisco US Inc. A process of obtaining ethanol without glucoamylase using pseudomonas saccharophila g4-amylase and variants thereof
NO2254591T3 (fi) 2008-02-08 2017-12-23
EP2268806B1 (en) * 2008-02-11 2013-04-10 Danisco US Inc. Enzyme with microbial lysis activity from Trichoderma reesei
EP2245138A4 (en) 2008-02-19 2011-03-02 Novozymes As METHOD FOR STONE WASHING OF TISSUES USING CELLULASE
WO2009114380A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-17 Danisco Us Inc., Genencor Division Expression of catalase in trichoderma
US20090253173A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-08 Danisco Us Inc., Genencor Division Filamentous fungi with inactivated protease genes for altered protein production
EP3118309B1 (en) 2008-04-18 2020-09-16 Danisco US Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
US8173410B2 (en) 2008-04-23 2012-05-08 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
DK2288698T3 (en) 2008-06-06 2017-03-20 Danisco Us Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES INCLUDING CELLULASE-VARIABLE VARIETIES FOR CELLULOSE-FREE MATERIALS
JP5647976B2 (ja) 2008-06-06 2015-01-07 ダニスコ・ユーエス・インク 変異体微生物プロテアーゼを含む組成物及び方法
MY156256A (en) * 2008-07-02 2016-01-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene free of c5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges
WO2010031068A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
CA2737195A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 The Goodyear Tire & Rubber Company Conversion of prenyl derivatives to isoprene
SG169640A1 (en) * 2008-09-15 2011-04-29 Danisco Us Inc Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase
BRPI0918453A2 (pt) 2008-09-15 2019-12-17 Danisco Us Inc sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno
WO2010031062A1 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
BRPI0921827A2 (pt) 2008-11-11 2016-09-27 Danisco Us Inc composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
EP2647692A3 (en) 2008-11-11 2014-01-22 The Procter and Gamble Company Compositions and methods comprising serine protease variants
KR20110095260A (ko) 2008-11-11 2011-08-24 다니스코 유에스 인크. 하나 이상의 조합가능 돌연변이를 포함하는 바실러스 서브틸리신
US20100152088A1 (en) 2008-11-11 2010-06-17 Estell David A Compositions and methods comprising a subtilisin variant
EP2626421B1 (en) 2008-12-10 2014-03-19 Direvo Industrial Biotechnology GmbH Improved enzymes for biomass conversion
WO2010074999A1 (en) 2008-12-15 2010-07-01 Danisco Us Inc. Hybrid alpha-amylases
MX2011006779A (es) 2008-12-24 2011-08-03 Danisco Us Inc Lacasas y metodos de uso de las mismas a temperatura baja.
CA2748887A1 (en) 2008-12-30 2010-07-08 Danisco Us Inc. Methods of producing isoprene and a co-product
KR20110139206A (ko) 2009-03-03 2011-12-28 다니스코 유에스 인크. 효소적으로 생성된 과산을 사용한 염료의 산화 탈색 - 방법, 조성물 및 파트들의 키트
WO2010124146A2 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
DK3591046T3 (da) 2009-05-19 2021-07-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Amylasepolypeptide
CN104862293A (zh) 2009-06-03 2015-08-26 丹尼斯科美国公司 具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体,及其用途
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
TW201412988A (zh) * 2009-06-17 2014-04-01 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
TW201120213A (en) 2009-06-17 2011-06-16 Danisco Us Inc Polymerization of isoprene from renewable resources
PE20121504A1 (es) 2009-08-19 2012-11-05 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes de glucoamilasa
CN102712915B (zh) 2009-08-19 2014-12-10 丹尼斯科美国公司 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
MX2011008848A (es) 2009-08-27 2011-09-29 Danisco Us Inc Modificacion de color y desgaste textil, combinados.
WO2011072099A2 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising protease variants
US20120258900A1 (en) 2009-12-21 2012-10-11 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
MX2012007168A (es) 2009-12-21 2012-07-23 Danisco Us Inc Composiciones de detergentes que contienen lipasa thermobifida fusca y metodos de uso de esta.
WO2011084417A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing geobacillus stearothermophilus lipase and methods of use thereof
US9107440B2 (en) 2010-03-29 2015-08-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
WO2011130222A2 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising variant proteases
CN108410585A (zh) 2010-05-06 2018-08-17 宝洁公司 具有蛋白酶变体的消费品
WO2011150157A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing streptomyces griseus lipase and methods of use thereof
US8933282B2 (en) 2010-06-17 2015-01-13 Danisco Us Inc. Fuel compositions comprising isoprene derivatives
US20120034659A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. NEUTRAL pH SACCHARIFICATION AND FERMENTATION
US20120045812A1 (en) 2010-08-06 2012-02-23 Danisco Us Inc. PRODUCTION OF ISOPRENE UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
JP5810489B2 (ja) * 2010-08-20 2015-11-11 株式会社豊田中央研究所 セルラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
EP2608682B1 (en) 2010-08-24 2017-12-13 Danisco US Inc. Method of making a snack bar comprising a low temperature rice protein concentrate
JP5707494B2 (ja) * 2010-08-25 2015-04-30 ダニスコ・ユーエス・インク 粘性の表現型を変化させた糸状菌
CN103189564A (zh) 2010-10-18 2013-07-03 丹尼斯科美国公司 使用漆酶体系对染色织物进行局部颜色修改
CN103443271A (zh) 2010-10-27 2013-12-11 丹尼斯科美国公司 用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体
WO2012088462A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Danisco Us Inc. Compositions and methods for improved isoprene production using two types of ispg enzymes
US8691541B2 (en) 2010-12-22 2014-04-08 Danisco Us Inc. Biological production of pentose sugars using recombinant cells
BR112013016491A2 (pt) 2010-12-30 2018-05-22 Novozymes As método para tratamento de têxtil
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
GB201102865D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
CN103459594A (zh) 2011-04-06 2013-12-18 丹尼斯科美国公司 具有提高的表达和/或活性的漆酶变体
CN103649308A (zh) * 2011-04-28 2014-03-19 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP2702072A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Danisco US Inc. Detergent compositions containing bacillus agaradhaerens mannanase and methods of use thereof
EP2712363A1 (en) 2011-04-29 2014-04-02 Danisco US Inc. Detergent compositions containing geobacillus tepidamans mannanase and methods of use thereof
CN103732756A (zh) 2011-04-29 2014-04-16 丹尼斯科美国公司 用于高密度葡萄糖浆的淀粉液化和糖化的单pH工艺
BR112013026675A2 (pt) 2011-04-29 2016-11-29 Danisco Us Inc composições detergentes contendo mananase de bacillus sp., e métodos de uso das mesmas
CN106065381B (zh) 2011-05-05 2019-07-26 宝洁公司 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
CN103764823B (zh) 2011-05-05 2018-05-11 丹尼斯科美国公司 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
US8951764B2 (en) 2011-08-05 2015-02-10 Danisco Us Inc. Production of isoprenoids under neutral pH conditions
US20140187468A1 (en) 2011-08-31 2014-07-03 Danisco Us Inc. Compositions and Methods Comprising a Lipolytic Enzyme Variant
WO2013067026A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
US20130109055A1 (en) 2011-10-31 2013-05-02 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
CN104024407A (zh) 2011-12-22 2014-09-03 丹尼斯科美国公司 包含脂解酶变体的组合物和方法
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
DK2859098T3 (en) 2012-06-08 2017-12-11 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES WITH TRANSGALACTOSYLATION ACTIVITY
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
US10005988B2 (en) 2012-10-05 2018-06-26 Novozymes A/S Reducing adhesion of bacteria to a surface or releasing bacteria from a surface to which they adhere using endo-beta-A,4-glucanases
MX361862B (es) 2012-10-12 2018-12-18 Danisco Us Inc Composiciones y métodos que comprenden variante de enzima lipolítica.
US20160060611A1 (en) 2012-11-05 2016-03-03 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising thermolysin protease variants
CA2892786A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
US20150344858A1 (en) 2012-12-19 2015-12-03 Danisco Us Inc. Novel mannanase, compositions and methods of use thereof
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
EP3004342B1 (en) 2013-05-29 2023-01-11 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3636662B1 (en) 2013-05-29 2022-07-13 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3004341B1 (en) 2013-05-29 2017-08-30 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
WO2014194032A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
ES2956266T3 (es) 2013-07-19 2023-12-18 Danisco Us Inc Composiciones y procedimientos que comprenden una variante de enzima lipolítica
BR112016002067A2 (pt) 2013-07-29 2017-08-29 Danisco Us Inc Variantes de enzimas
BR112016005286A2 (pt) 2013-09-12 2017-09-12 Danisco Us Inc composições e métodos compreendendo variantes de protease do clado lg12
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
CN103529024B (zh) * 2013-10-16 2015-12-23 天津博菲德科技有限公司 果胶酶在饲料原料中的最适添加量配方
MX2016007636A (es) 2013-12-11 2016-10-13 Dupont Nutrition Biosci Aps Metodo para preparar un producto lacteo que tiene un contenido estable de galactooligosacarido(s).
DK3080262T3 (da) 2013-12-13 2019-05-06 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arter
DK3553173T3 (da) 2013-12-13 2021-08-23 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus gibsonii-clade
RU2546889C1 (ru) * 2013-12-16 2015-04-10 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства Россельхозакадемии Способ кормления цыплят-бройлеров и кур-несушек
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
MX2016012044A (es) 2014-03-21 2017-06-29 Danisco Us Inc Serina proteasas de especies de bacillus.
EP3207129B1 (en) 2014-10-17 2019-11-20 Danisco US Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2016069552A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
EP3224357A1 (en) 2014-10-27 2017-10-04 Danisco US Inc. Serine proteases of bacillus species
US20170335306A1 (en) 2014-10-27 2017-11-23 Danisco Us Inc. Serine proteases
EP3550017B1 (en) 2014-10-27 2021-07-14 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212783B1 (en) 2014-10-27 2024-06-26 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3214942B1 (en) 2014-11-07 2021-02-24 DuPont Nutrition Biosciences ApS Recombinant host cell expressing beta-galactosidase and/or transgalactosylating activity deficient in mannanase, cellulase and pectinase.
AU2015366380B2 (en) 2014-12-19 2021-07-22 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having xylanase activity and polypeptides having arabinofuranosidase activity
RU2580154C1 (ru) * 2014-12-30 2016-04-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства" Способ выращивания молодняка свиней и мясной птицы
EP3268471B1 (en) 2015-03-12 2019-08-28 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
WO2016183509A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Danisco Us Inc. AprL-CLADE PROTEASE VARIANTS AND USES THEREOF
US20180142228A1 (en) 2015-05-22 2018-05-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Aldc production methods
EP3298138B1 (en) 2015-05-22 2022-08-10 DuPont Nutrition Biosciences ApS Acetolactate decarboxylase
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
FI3307427T3 (fi) 2015-06-09 2023-11-09 Danisco Us Inc Osmoottiset puhkeavat kapselit
US11499146B2 (en) 2015-06-17 2022-11-15 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
EP3344282B8 (en) 2015-09-02 2020-12-23 DuPont Nutrition Biosciences ApS Glycoside hydrolases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
EP4141113A1 (en) 2015-11-05 2023-03-01 Danisco US Inc Paenibacillus sp. mannanases
WO2017079756A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Danisco Us Inc Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
EP3380628B1 (en) 2015-11-26 2022-11-02 Novozymes A/S Milling process
EP3390625B1 (en) 2015-12-18 2023-09-06 Danisco US Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
TWI553121B (zh) * 2015-12-23 2016-10-11 基酵生物科技股份有限公司 提升耐溫性的纖維素酶
JP2019518440A (ja) 2016-05-03 2019-07-04 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
WO2017192300A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
CN109477112B (zh) 2016-05-31 2024-09-06 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
JP7152319B2 (ja) 2016-06-17 2022-10-12 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
CN109642226A (zh) 2016-06-30 2019-04-16 丹尼斯科美国公司 天冬氨酸蛋白酶
CA3037083A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Dupont Nutrition Biosciences Aps Acetolactate decarboxylase variants having improved specific activity
RU2763378C2 (ru) 2016-09-23 2021-12-28 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА
EP3535365A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Danisco US Inc. Laundry detergent composition
WO2018093752A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danisco Us Inc. Filamentous fungi with improved protein production
US11180786B2 (en) 2016-11-25 2021-11-23 Novozymes A/S GH10 xylanase, GH62 arabinofuranosidase, milling process and other application
US11946081B2 (en) 2016-12-21 2024-04-02 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
US20200392477A1 (en) 2016-12-21 2020-12-17 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
BR112019018381A2 (pt) 2017-03-06 2020-04-07 Dupont Nutrition Biosci Aps fucosidases fúngicas e seu uso na prevenção e/ou no tratamento de uma infecção patogênica em um animal
CN110621778A (zh) 2017-03-15 2019-12-27 丹尼斯科美国公司 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途
US20200040283A1 (en) 2017-03-31 2020-02-06 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
EP3645696A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Danisco US Inc. Low-agglomeration, enzyme-containing particles
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
BR112020012584A2 (pt) 2017-12-21 2020-11-24 Danisco Us Inc. grânulos fundidos a quente contendo enzima que compreendem um dessecante termotolerante
BR112020016068A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-08 Danisco Us Inc. Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima
WO2019197318A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US20210363470A1 (en) 2018-06-19 2021-11-25 Danisco Us Inc Subtilisin variants
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
EP3833731A1 (en) 2018-08-30 2021-06-16 Danisco US Inc. Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
US20210189295A1 (en) 2018-08-30 2021-06-24 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
WO2020068486A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Danisco Us Inc Compositions for medical instrument cleaning
US11339516B2 (en) * 2018-09-27 2022-05-24 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic. A.S. Dyed fabric finishing process
EP3887515A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants having improved stability
EP3976776A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2020247582A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
US20230049452A1 (en) 2020-01-13 2023-02-16 Danisco Us Inc Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
US11920290B2 (en) 2020-01-14 2024-03-05 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic A.S. Process for dyeing textiles and enzymes used therein
CN116323935A (zh) 2020-08-27 2023-06-23 丹尼斯科美国公司 用于清洁的酶和酶组合物
US20240117275A1 (en) 2021-01-29 2024-04-11 Danisco Us Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
WO2023278297A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Danisco Us Inc Variant lipases and uses thereof
EP4396320A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Danisco US Inc. Laundry compositions for cleaning
EP4402258A2 (en) 2021-09-13 2024-07-24 Danisco US Inc. Bioactive-containing granules
EP4448750A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and uses thereof
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
CN118679251A (zh) 2021-12-16 2024-09-20 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024064653A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps Variant anti-viral polypeptides
WO2024102698A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024163584A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024186819A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
FR2555603B1 (fr) * 1983-11-29 1986-10-03 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US5137819A (en) * 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
US5340731A (en) * 1988-07-08 1994-08-23 University Of British Columbia Method of preparing a B-1,4 glycan matrix containing a bound fusion protein
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU638695B2 (en) * 1989-02-16 1993-07-08 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr A thermostable (1,3-1,4)-beta-glucanase
US5536655A (en) * 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK494089D0 (fi) * 1989-10-06 1989-10-06 Novo Nordisk As
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5650322A (en) * 1990-10-05 1997-07-22 Genencor International, Inc. Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
DK0551386T3 (da) * 1990-10-05 2004-05-10 Genencor Int Fremgangsmåde til behandling af bomuldsholdige stoffer med cellulase
WO1993005226A1 (en) * 1991-08-29 1993-03-18 University Of British Columbia Method for modification of polysaccharide fibres
ES2131518T3 (es) * 1991-12-23 1999-08-01 Dsm Nv Sistema de expresion eucariota.
LT3208B (en) * 1992-04-10 1995-03-27 Ssv Dev Oy Enzyme products for use in the improvement of feed value and conservation of fibrous crops
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions

Also Published As

Publication number Publication date
ATE329039T1 (de) 2006-06-15
ATE387104T1 (de) 2008-03-15
US5874276A (en) 1999-02-23
ES2160694T3 (es) 2001-11-16
DE69427812D1 (de) 2001-08-30
EP1700524B1 (en) 2008-02-27
FI962444A (fi) 1996-06-12
HK1097163A1 (en) 2007-06-22
DE69435078T2 (de) 2009-03-26
EP0684770A1 (en) 1995-12-06
DE69434759D1 (de) 2006-07-20
CN1093379C (zh) 2002-10-30
DK0733115T3 (da) 2006-10-09
WO1995016360A1 (en) 1995-06-22
EP0733115A1 (en) 1996-09-25
FI953867A (fi) 1995-10-03
US6562340B1 (en) 2003-05-13
NO953218L (no) 1995-10-16
DK0684770T3 (da) 2001-09-17
NO953218D0 (no) 1995-08-16
DE69435078D1 (de) 2008-04-10
DE69427812T2 (de) 2002-06-06
CA2178636A1 (en) 1995-06-22
JPH09506514A (ja) 1997-06-30
US5861271A (en) 1999-01-19
EP1700524A1 (en) 2006-09-13
ATE203373T1 (de) 2001-08-15
AU1383695A (en) 1995-07-03
FI953867A0 (fi) 1995-08-16
PT684770E (pt) 2001-11-30
EP0684770B1 (en) 2001-07-25
FI116965B (fi) 2006-04-28
NO314562B1 (no) 2003-04-14
CA2156066C (en) 2005-07-12
EP0733115B1 (en) 2006-06-07
NZ278373A (en) 1997-10-24
FI962444A0 (fi) 1996-06-12
DE69434759T2 (de) 2007-05-16
CA2156066A1 (en) 1995-06-22
AU685210B2 (en) 1998-01-15
WO1995016782A1 (en) 1995-06-22
CN1118131A (zh) 1996-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119695B (fi) Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi
EP0807193B1 (en) Method for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
CA2417857C (en) Mutant egiii cellulase, dna encoding such egiii compositions and methods for obtaining same
FI108358B (fi) Trichoderman transformointi
US6458928B1 (en) Microbial swollenin protein, DNA sequences encoding such swollenins and method of producing such swollenins
KR20140018890A (ko) 탈필링을 위한 셀룰라제 효소 혼합물 및 그것의 이용
JP3522744B2 (ja) セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法
EP1305430B1 (en) Mutant trichoderma reesei egiii cellulases, dna encoding such egiii compositions and methods for obtaining same
US6407046B1 (en) Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
FI116529B (fi) Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen
CA2517781C (en) Novel cellulase enzymes and systems for their expression
US5472864A (en) Method of preparing solution enriched in EG III using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119695

Country of ref document: FI

MA Patent expired