JP3522744B2 - セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法 - Google Patents
セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法Info
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Description
【０００１】本発明は実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセル
ラーゼ成分を含有するポリエチレングリコール溶液を製
造する方法に関するものである。特に本発明の方法の一
部は、特定のポリエチレングリコールを水性混合物に添
加してＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相と
ＥＧ ＩＩＩが少ない水相とからなる２相系を調製して
ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相を分離す
ることにより、ＥＧ ＩＩＩ含有セルラーゼタンパク質
の水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離す
る方法に関するものである。本発明はまた一部は、分画
により、または上記２つの方法の組合せにより、実質的
に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を調製する方法に
関するものである。本発明はまた一部は、キシラナーゼ
をも含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物からキ
シナーゼ ポリエチレングリコール相を集積する方法に
関するものである。
ラーゼ成分を含有するポリエチレングリコール溶液を製
造する方法に関するものである。特に本発明の方法の一
部は、特定のポリエチレングリコールを水性混合物に添
加してＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相と
ＥＧ ＩＩＩが少ない水相とからなる２相系を調製して
ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール相を分離す
ることにより、ＥＧ ＩＩＩ含有セルラーゼタンパク質
の水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離す
る方法に関するものである。本発明はまた一部は、分画
により、または上記２つの方法の組合せにより、実質的
に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を調製する方法に
関するものである。本発明はまた一部は、キシラナーゼ
をも含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物からキ
シナーゼ ポリエチレングリコール相を集積する方法に
関するものである。
【０００２】セルラーゼは、セルロース（β−１、４−
グルカン結合）を加水分解し、それによって、グルコー
ス、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成させる酵素と
して従来技術において知られている。セルラーゼは、菌
類、細菌等内で産生（発現）されるけれども、セルロー
スの結晶構造を分解することのできる完全セルラーゼ系
が発酵方法により大量に容易に産生されるので、ある菌
類、特に菌類網トリコデルマ ｓｐｐ．（Trichoderma
spp.）（特にトリコデルマ リーセイ（Trichoderma re
esei））により産生されたセルラーゼは最も注目を集め
ている。
グルカン結合）を加水分解し、それによって、グルコー
ス、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成させる酵素と
して従来技術において知られている。セルラーゼは、菌
類、細菌等内で産生（発現）されるけれども、セルロー
スの結晶構造を分解することのできる完全セルラーゼ系
が発酵方法により大量に容易に産生されるので、ある菌
類、特に菌類網トリコデルマ ｓｐｐ．（Trichoderma
spp.）（特にトリコデルマ リーセイ（Trichoderma re
esei））により産生されたセルラーゼは最も注目を集め
ている。
【０００３】上記点に関して、Schulein、“Methods in
Enzymology ”、160 、25、234 頁et seq.(1988) は、
完全菌類セルラーゼ系が、エキソセロビオヒドロラーゼ
（ＥＣ ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、エンドグ
ルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、お
よびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）
（「ＢＧ」）として同定される酵素を含むいくつかの異
なる酵素分類からなることを開示している。ＣＢＨ、Ｅ
ＧおよびＢＧの菌類セルラーゼ分類をさらに発展させ
て、各々の分類内に多数の成分を含むようにできる。例
えば、多数のＣＢＨおよびＥＧが様々な菌類源から単離
されている。
Enzymology ”、160 、25、234 頁et seq.(1988) は、
完全菌類セルラーゼ系が、エキソセロビオヒドロラーゼ
（ＥＣ ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、エンドグ
ルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、お
よびβ−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）
（「ＢＧ」）として同定される酵素を含むいくつかの異
なる酵素分類からなることを開示している。ＣＢＨ、Ｅ
ＧおよびＢＧの菌類セルラーゼ分類をさらに発展させ
て、各々の分類内に多数の成分を含むようにできる。例
えば、多数のＣＢＨおよびＥＧが様々な菌類源から単離
されている。
【０００４】ＣＢＨ成分、ＥＧ成分およびＢＧ成分から
なる完全セルラーゼ系は、結晶性セルロースをグルコー
スに能率的に転化させるのに必要とされる。いやしく
も、結晶性セルロースを加水分解する際には、単離され
た成分はほとんど効果的ではない。さらに、特にセルラ
ーゼ成分が異なる分類のものである場合、セルラーゼ成
分の間で相乗関係が観察される。
なる完全セルラーゼ系は、結晶性セルロースをグルコー
スに能率的に転化させるのに必要とされる。いやしく
も、結晶性セルロースを加水分解する際には、単離され
た成分はほとんど効果的ではない。さらに、特にセルラ
ーゼ成分が異なる分類のものである場合、セルラーゼ成
分の間で相乗関係が観察される。
【０００５】一方で、単独または組合せのいずれかによ
り使用するセルラーゼおよびその成分は、洗浄剤組成物
に有用であることが従来技術において知られている。例
えば、菌類セルラーゼのエンドグルカナーゼ成分は、柔
軟剤として使用するための、そして綿織物等の感触を改
善するのに使用するための、洗浄剤組成物の洗浄力を増
強させる目的に使用されている。しかしながら、洗浄剤
組成物中にトリコデルマ ｓｐｐ．そして特にトリコデ
ルマ リーセイから由来したＥＧ Ｉ成分およびＥＧ
ＩＩ成分を使用するには問題がある。特に、そのような
成分は酸性ｐＨで最大活性を有しているが、ほとんどの
洗濯洗浄剤組成物は中性またはアルカリ性（ｐＨ＞７か
ら約１０まで）条件で使用するように配合されている。
洗浄剤組成物中にトリゴデルマ リーセイの１種類以上
の酸性エンドグルカナーゼ成分を使用すると、アルカリ
性条件下で使用した場合でさえも、綿含有織物に対する
感触、柔軟性および色の保持と復元を改良できることが
米国特許出願第07/668,640号に開示されているが、トリ
コデルマ ｓｐｐ．のＥＧ ＩＩＩ成分は、トリコデル
マ リーセイのＥＧ Ｉ成分およびＥＧ ＩＩ成分と比
較して、洗浄剤組成物において予期せぬ優れた利点を有
することが米国特許出願第07/707,647号に開示されてい
る。
り使用するセルラーゼおよびその成分は、洗浄剤組成物
に有用であることが従来技術において知られている。例
えば、菌類セルラーゼのエンドグルカナーゼ成分は、柔
軟剤として使用するための、そして綿織物等の感触を改
善するのに使用するための、洗浄剤組成物の洗浄力を増
強させる目的に使用されている。しかしながら、洗浄剤
組成物中にトリコデルマ ｓｐｐ．そして特にトリコデ
ルマ リーセイから由来したＥＧ Ｉ成分およびＥＧ
ＩＩ成分を使用するには問題がある。特に、そのような
成分は酸性ｐＨで最大活性を有しているが、ほとんどの
洗濯洗浄剤組成物は中性またはアルカリ性（ｐＨ＞７か
ら約１０まで）条件で使用するように配合されている。
洗浄剤組成物中にトリゴデルマ リーセイの１種類以上
の酸性エンドグルカナーゼ成分を使用すると、アルカリ
性条件下で使用した場合でさえも、綿含有織物に対する
感触、柔軟性および色の保持と復元を改良できることが
米国特許出願第07/668,640号に開示されているが、トリ
コデルマ ｓｐｐ．のＥＧ ＩＩＩ成分は、トリコデル
マ リーセイのＥＧ Ｉ成分およびＥＧ ＩＩ成分と比
較して、洗浄剤組成物において予期せぬ優れた利点を有
することが米国特許出願第07/707,647号に開示されてい
る。
【０００６】特に、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分は、ア
ルカリ条件下で著しい酵素活性を有することがわかって
おり、中性またはアルカリ性の洗浄剤洗濯媒質を用いた
洗濯条件に使用するのにも特に適している。
ルカリ条件下で著しい酵素活性を有することがわかって
おり、中性またはアルカリ性の洗浄剤洗濯媒質を用いた
洗濯条件に使用するのにも特に適している。
【０００７】洗濯洗浄剤に使用することに加えて、ここ
に記載する実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分
はさらに、1991年 5月30日に出願され、ここに引用する
米国特許出願第07/707,647号に記載されているように、
色の保持と復元、柔軟性および感触を望ましく改良する
十分な活性がある場合、中間のｐＨの適切な溶液中にお
いて予洗工程に使用することができる。
に記載する実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分
はさらに、1991年 5月30日に出願され、ここに引用する
米国特許出願第07/707,647号に記載されているように、
色の保持と復元、柔軟性および感触を望ましく改良する
十分な活性がある場合、中間のｐＨの適切な溶液中にお
いて予洗工程に使用することができる。
【０００８】また、ここに記載する実質的に純粋なＥＧ
ＩＩＩセルラーゼ成分は、スポットリムーバーに使用
できるだけでなく、また色褪せた織物に対して色を復元
するのに適した孤立組成物（例えば、ここに全てを引用
する、米国特許第4,738,682 号を参照のこと）としての
家庭用途に使用することもできると考えられている。
ＩＩＩセルラーゼ成分は、スポットリムーバーに使用
できるだけでなく、また色褪せた織物に対して色を復元
するのに適した孤立組成物（例えば、ここに全てを引用
する、米国特許第4,738,682 号を参照のこと）としての
家庭用途に使用することもできると考えられている。
【０００９】さらに、中性からアルカリ性の条件下でＥ
Ｇ ＩＩＩセルラーゼ成分の大きい活性は、緑蔵飼料加
工および／または堆肥化加工と同様に、綿含有織物を処
理する繊維加工（ここに全てを引用する米国特許出願第
07/677,385号および同第07/678,865号を参照のこと）に
も有益であると考えられている。
Ｇ ＩＩＩセルラーゼ成分の大きい活性は、緑蔵飼料加
工および／または堆肥化加工と同様に、綿含有織物を処
理する繊維加工（ここに全てを引用する米国特許出願第
07/677,385号および同第07/678,865号を参照のこと）に
も有益であると考えられている。
【００１０】上述した点は著しく異なって、本発明は、
水性酵素混合物から、特に完全菌類セルラーゼ組成物か
らＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離して精製する、特
に商業規模のＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の製造のため
の能率的な方法に関するものである。
水性酵素混合物から、特に完全菌類セルラーゼ組成物か
らＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離して精製する、特
に商業規模のＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の製造のため
の能率的な方法に関するものである。
【００１１】特に、本発明は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
成分を含むセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物
から、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を含
有するポリエチレングリコール溶液を製造する方法に関
するものである。したがって、その方法の一面におい
て、本発明は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼを含むセルラー
ゼタンパク質を含有する水性混合物からＥＧ ＩＩＩを
選択的に回収する方法に関し、その方法は、無機塩の存
在下において効果的な量のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）の水性混合物を添加する工程を含んでいる。その
混合物は、ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングコール相
およびＥＧ ＩＩＩが少ない水相からなる二相液体混合
物を形成している。この方法において、ＥＧ ＩＩＩが
多い相には他のセルラーゼタンパク質は実質的に含まれ
ず、ＥＧ ＩＩＩが多い相は後に分離される。
成分を含むセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物
から、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を含
有するポリエチレングリコール溶液を製造する方法に関
するものである。したがって、その方法の一面におい
て、本発明は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼを含むセルラー
ゼタンパク質を含有する水性混合物からＥＧ ＩＩＩを
選択的に回収する方法に関し、その方法は、無機塩の存
在下において効果的な量のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）の水性混合物を添加する工程を含んでいる。その
混合物は、ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングコール相
およびＥＧ ＩＩＩが少ない水相からなる二相液体混合
物を形成している。この方法において、ＥＧ ＩＩＩが
多い相には他のセルラーゼタンパク質は実質的に含まれ
ず、ＥＧ ＩＩＩが多い相は後に分離される。
【００１２】本発明の方法はまた一部には、無機塩の存
在下において効果的な量のポリエチレングリコールを水
性混合物に添加することにより、キシラナーゼも含有す
るセルラーゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋
なキシラナーゼを単離する方法に関するものである。水
性混合物がＥＧ ＩＩＩも含有する場合には、回収した
ポリエチレングリコール相はＥＧＩＩＩおよびキシラナ
ーゼの両方を含有している。
在下において効果的な量のポリエチレングリコールを水
性混合物に添加することにより、キシラナーゼも含有す
るセルラーゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋
なキシラナーゼを単離する方法に関するものである。水
性混合物がＥＧ ＩＩＩも含有する場合には、回収した
ポリエチレングリコール相はＥＧＩＩＩおよびキシラナ
ーゼの両方を含有している。
【００１３】別の方法において、本発明は、ＥＧ ＩＩ
Ｉを含有する水性セルラーゼタンパク質混合物からＥＧ
ＩＩＩセルラーゼを選択的に回収する方法に関し、そ
の方法は、その水性混合物を陰イオン交換カラムに通す
ことを含んでいる。陰イオン交換カラムに結合しなかっ
たタンパク質分画はＥＧ ＩＩＩ成分を含有している。
次いでこの分画を陽イオン交換カラムに通す。この陽イ
オン交換カラムは、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼと結合し、
後に塩溶液により樹脂から溶離せしめられる。
Ｉを含有する水性セルラーゼタンパク質混合物からＥＧ
ＩＩＩセルラーゼを選択的に回収する方法に関し、そ
の方法は、その水性混合物を陰イオン交換カラムに通す
ことを含んでいる。陰イオン交換カラムに結合しなかっ
たタンパク質分画はＥＧ ＩＩＩ成分を含有している。
次いでこの分画を陽イオン交換カラムに通す。この陽イ
オン交換カラムは、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼと結合し、
後に塩溶液により樹脂から溶離せしめられる。
【００１４】本発明の３番目の方法は、いずれかの順番
で上記した２つの方法の組合せである。
で上記した２つの方法の組合せである。
【００１５】水性セルラーゼタンパク質混合物は、全細
胞抽出物、より好ましくは、野生型トリコデルマ ｓｐ
ｐ．菌株、遺伝的に修飾されたトリコデルマ ｓｐｐ．
または本発明の方法に適合しているＥＧ ＩＩＩを含む
セルラーゼタンパク質を含有する他の水性混合物からの
全セルラーゼ組成物であり得る。
胞抽出物、より好ましくは、野生型トリコデルマ ｓｐ
ｐ．菌株、遺伝的に修飾されたトリコデルマ ｓｐｐ．
または本発明の方法に適合しているＥＧ ＩＩＩを含む
セルラーゼタンパク質を含有する他の水性混合物からの
全セルラーゼ組成物であり得る。
【００１６】第１図は、ＣＢＨ ＩおよびＣＢＨ ＩＩ
を発現できないように形質転換したトリコデルマ リー
セイの菌株由来のＥＧの多い菌類セルラーゼ組成物の40
℃での所定のｐＨ範囲におよぶＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロ
ファイル、並びに40℃での所定のｐＨ範囲におよぶトリ
コデルマ リーセイ由来のＥＧ ＩＩＩの多いセルラー
ゼ組成物の活性プロファイルを示すグラフである。
を発現できないように形質転換したトリコデルマ リー
セイの菌株由来のＥＧの多い菌類セルラーゼ組成物の40
℃での所定のｐＨ範囲におよぶＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロ
ファイル、並びに40℃での所定のｐＨ範囲におよぶトリ
コデルマ リーセイ由来のＥＧ ＩＩＩの多いセルラー
ゼ組成物の活性プロファイルを示すグラフである。
【００１７】第２図は、レーン１において、野生型トリ
コデルマ リーセイにより発現されたタンパク質を示
し、レーン２において、ＥＧ ＩおよびＥＧ ＩＩ成分
を発現できないように形質転換したトリコデルマ リー
セイの菌株により発現されたタンパク質を示し、レーン
３において、実施例１の方法により得られたタンパク質
と同一の実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ中に発
見されるタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルを示すも
のである。この図の左の余白に、ＣＢＨ Ｉ、ＣＢＨ
ＩＩ、ＥＧ Ｉ、ＥＧ ＩＩ、ＥＧ ＩＩＩおよびキシ
ラナーゼに帰するバンドを同定できるように印が付けて
ある。
コデルマ リーセイにより発現されたタンパク質を示
し、レーン２において、ＥＧ ＩおよびＥＧ ＩＩ成分
を発現できないように形質転換したトリコデルマ リー
セイの菌株により発現されたタンパク質を示し、レーン
３において、実施例１の方法により得られたタンパク質
と同一の実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ中に発
見されるタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルを示すも
のである。この図の左の余白に、ＣＢＨ Ｉ、ＣＢＨ
ＩＩ、ＥＧ Ｉ、ＥＧ ＩＩ、ＥＧ ＩＩＩおよびキシ
ラナーゼに帰するバンドを同定できるように印が付けて
ある。
【００１８】第３図は、ＥＧ ＩＩＩの２つの断片から
得られたアミノ酸配列である。
得られたアミノ酸配列である。
【００１９】第４図は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構築を
示す概略図である。
示す概略図である。
【００２０】第５図は、トリコデルマ リーセイ染色体
のうちの１つの染色体上のｃｂｈ１座にｐΔＣＢＨＩｐ
ｙｒ４からのより大きなＥｃｏＲＩ断片を組み込むこと
よるトリコデルマ リーセイ遺伝子の欠失を説明する概
略図である。
のうちの１つの染色体上のｃｂｈ１座にｐΔＣＢＨＩｐ
ｙｒ４からのより大きなＥｃｏＲＩ断片を組み込むこと
よるトリコデルマ リーセイ遺伝子の欠失を説明する概
略図である。
【００２１】第６図は、プローブとして３２Ｐで標識し
たｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分析
後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転
換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮ
Ａのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大き
さを図面の左側にキロ塩基対で示している。
たｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分析
後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転
換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮ
Ａのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大き
さを図面の左側にキロ塩基対で示している。
【００２２】第７図は、プローブとして３２Ｐで標識し
たｐＩｎｔＣＢＨＩを用いた、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢ
ＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ リーセ
イ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフであ
る。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対
で示している。
たｐＩｎｔＣＢＨＩを用いた、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢ
ＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ リーセ
イ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフであ
る。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対
で示している。
【００２３】第８図は、野生型のトリコデルマ リーセ
イにより分泌されたタンパク質およびトリコデルマ リ
ーセイの形質転換菌株により分泌されたタンパク質を示
す等電点電気泳動ゲルである。具体的には第８図におい
て、等電点電気泳動ゲルのレーンＡは、部分的に精製し
たトリコデルマ リーセイからのＣＢＨＩが作用したも
のである。レーンＢは、野生型のトリコデルマ リーセ
イが作用したものである。レーンＣは、ｃｂｈ１遺伝子
が欠失したトリコデルマ リーセイ菌株からのタンパク
質が作用したものである。レーンＤは、ｃｂｈ１および
ｃｂｈ２遺伝子が欠失したトリコデルマ リーセイ菌株
からのタンパク質が作用したものである。第８図におい
て、図面の右側には、１つ以上の分泌タンパク質に発見
された単一タンパク質の座を示すように印付けてある。
具体的には、ＢＧはβ−グルコシダーゼを意味し、Ｅ１
はエンドグルカナーゼＩを意味し、Ｅ２はエンドグルカ
ナーゼＩＩを意味し、Ｅ３はエンドグルカナーゼＩＩＩ
を意味し、Ｃ１はエキソセロビオヒドロラーゼＩを意味
し、Ｃ２はエキソセロビオヒドロラーゼＩＩを意味する
ものである。
イにより分泌されたタンパク質およびトリコデルマ リ
ーセイの形質転換菌株により分泌されたタンパク質を示
す等電点電気泳動ゲルである。具体的には第８図におい
て、等電点電気泳動ゲルのレーンＡは、部分的に精製し
たトリコデルマ リーセイからのＣＢＨＩが作用したも
のである。レーンＢは、野生型のトリコデルマ リーセ
イが作用したものである。レーンＣは、ｃｂｈ１遺伝子
が欠失したトリコデルマ リーセイ菌株からのタンパク
質が作用したものである。レーンＤは、ｃｂｈ１および
ｃｂｈ２遺伝子が欠失したトリコデルマ リーセイ菌株
からのタンパク質が作用したものである。第８図におい
て、図面の右側には、１つ以上の分泌タンパク質に発見
された単一タンパク質の座を示すように印付けてある。
具体的には、ＢＧはβ−グルコシダーゼを意味し、Ｅ１
はエンドグルカナーゼＩを意味し、Ｅ２はエンドグルカ
ナーゼＩＩを意味し、Ｅ３はエンドグルカナーゼＩＩＩ
を意味し、Ｃ１はエキソセロビオヒドロラーゼＩを意味
し、Ｃ２はエキソセロビオヒドロラーゼＩＩを意味する
ものである。
【００２４】第９Ａ図は、ゲノムＤＮＡ上の4.1 ｋｂ
ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ
リーセイｃｂｈ２座を示す概略図であり、第９Ｂ図は、
ｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを
示す概略図である。
ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ
リーセイｃｂｈ２座を示す概略図であり、第９Ｂ図は、
ｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクターｐＰΔＣＢＨＩＩを
示す概略図である。
【００２５】第１０図は、プローブとして３２Ｐで標識
したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分
析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換し
たトルコデルマ リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙ
ｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子
量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示して
いる。
したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サザンブロット分
析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換し
たトルコデルマ リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙ
ｒ２６からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子
量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示して
いる。
【００２６】第１１図は、ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３の構
成を示す概略図である。
成を示す概略図である。
【００２７】第１２図は、トリコデルマ リーセイ染色
体の１つのｅｇｌ１座にｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３からの
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を組み込むことによるｅｇｌ１遺伝
子の欠失を説明する概略図である。
体の１つのｅｇｌ１座にｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３からの
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を組み込むことによるｅｇｌ１遺伝
子の欠失を説明する概略図である。
【００２８】第１３図は、ｐＡΔＥＧＩＩ−１の構成を
示す概略図である。
示す概略図である。
【００２９】上述したように、本発明は概して、ポリエ
チレングリコール溶液中において、または回収したタン
パク質として、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
成分を産生する方法に関するものである。
チレングリコール溶液中において、または回収したタン
パク質として、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
成分を産生する方法に関するものである。
【００３０】しかしながら、本発明をさらに詳細に説明
する前に、以下の用語を最初に定義しておく。
する前に、以下の用語を最初に定義しておく。
【００３１】１． 定義
本明細書に使用する場合、以下の用語は以下の意味を有
するものである。
するものである。
【００３２】「ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ」とは、トリコ
デルマ ｓｐｐ．由来のエンドグルカナーゼ成分、また
は約5.5 から約6.0 までの範囲ｐＨ最適値、約7.2 から
約8.0 までの範囲の等電点（ｐＩ）、および約23キロダ
ルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量により
特徴付けられる、トリコデルマ ｓｐｐ．により産生さ
れるＥＧ ＩＩＩと同等のタンパク質を産生する微生物
由来のエンドグルカナーゼ成分を意味する。好ましく
は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼは、トリコデルマ リーセ
イかまたはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma virid
e）由来のものである。トリコデルマ リーセイ由来の
ＥＧ ＩＩＩセルラーゼは、約5.5 から約6.0 までの範
囲のｐＨ最適値、約7.4 の等電点（ｐＩ）および約25キ
ロダルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量を
有する。トリコデルマ ビリデ由来のＥＧ ＩＩＩセル
ラーゼは、約5.5 のｐＨ最適値、約7.7 の等電点（ｐ
Ｉ）および約23.5キロダルトンの分子量を有する。さら
に、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼのアミノ酸配列が変更され
ていてもよいと考えられる。この酵素の活性部位を変更
すると、ｐＨ最適値、最適温度または基質に対する親和
性のような様々な特性を変化させてしまうかもしれな
い。
デルマ ｓｐｐ．由来のエンドグルカナーゼ成分、また
は約5.5 から約6.0 までの範囲ｐＨ最適値、約7.2 から
約8.0 までの範囲の等電点（ｐＩ）、および約23キロダ
ルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量により
特徴付けられる、トリコデルマ ｓｐｐ．により産生さ
れるＥＧ ＩＩＩと同等のタンパク質を産生する微生物
由来のエンドグルカナーゼ成分を意味する。好ましく
は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼは、トリコデルマ リーセ
イかまたはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma virid
e）由来のものである。トリコデルマ リーセイ由来の
ＥＧ ＩＩＩセルラーゼは、約5.5 から約6.0 までの範
囲のｐＨ最適値、約7.4 の等電点（ｐＩ）および約25キ
ロダルトンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量を
有する。トリコデルマ ビリデ由来のＥＧ ＩＩＩセル
ラーゼは、約5.5 のｐＨ最適値、約7.7 の等電点（ｐ
Ｉ）および約23.5キロダルトンの分子量を有する。さら
に、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼのアミノ酸配列が変更され
ていてもよいと考えられる。この酵素の活性部位を変更
すると、ｐＨ最適値、最適温度または基質に対する親和
性のような様々な特性を変化させてしまうかもしれな
い。
【００３３】ＥＧ ＩＩＩ成分は、ｐＩが高いために、
ｐＩの高いキシラナーゼ、およびトリコデルマ ｓｐ
ｐ．により発現されるｐＩの高い他の成分が一般的に発
見される等電点電気泳動ゲルの領域に発見される。実
際、第２図にＥＧ ＩＩＩとして認識されているバンド
はＥＧ ＩまたはＥＧ ＩＩのうちいずれかの分解生成
物であると、文献に仮定されている。しかしながら、Ｅ
Ｇ ＩおよびＥＧ ＩＩが欠失したセルラーゼ（米国特
許出願第07/770,049号および同第07/668,640号の方法に
より調製された）の等電点電気泳動ゲルは、このバンド
はＥＧ ＩまたはＥＧ ＩＩのうちのいずれの分解生成
物にも起因するものではないことを示した （第２
図）。
ｐＩの高いキシラナーゼ、およびトリコデルマ ｓｐ
ｐ．により発現されるｐＩの高い他の成分が一般的に発
見される等電点電気泳動ゲルの領域に発見される。実
際、第２図にＥＧ ＩＩＩとして認識されているバンド
はＥＧ ＩまたはＥＧ ＩＩのうちいずれかの分解生成
物であると、文献に仮定されている。しかしながら、Ｅ
Ｇ ＩおよびＥＧ ＩＩが欠失したセルラーゼ（米国特
許出願第07/770,049号および同第07/668,640号の方法に
より調製された）の等電点電気泳動ゲルは、このバンド
はＥＧ ＩまたはＥＧ ＩＩのうちのいずれの分解生成
物にも起因するものではないことを示した （第２
図）。
【００３４】ＥＧ ＩＩは以前には、ある著者による専
門語の「ＥＧ ＩＩＩ」により示されていたが、現在の
専門語では、「ＥＧ ＩＩ」と称している。いずれにし
ても、ＥＧ ＩＩタンパク質は、以下に示す実施例２の
表２に証拠付けられるように、分子量、ｐＩ、およびｐ
Ｈ最適値について、ＥＧ ＩＩＩタンパク質とは実質的
に異なる。
門語の「ＥＧ ＩＩＩ」により示されていたが、現在の
専門語では、「ＥＧ ＩＩ」と称している。いずれにし
ても、ＥＧ ＩＩタンパク質は、以下に示す実施例２の
表２に証拠付けられるように、分子量、ｐＩ、およびｐ
Ｈ最適値について、ＥＧ ＩＩＩタンパク質とは実質的
に異なる。
【００３５】「実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラー
ゼ」とは、セルラーゼタンパク質の総重量に対して、少
なくとも50重量パーセント、より好ましくは少なくとも
70重量パーセント、最も好ましくは少なくとも90重量パ
ーセントのＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を含有するセル
ラーゼタンパク質の組成物（固体または液体）を意味す
る。
ゼ」とは、セルラーゼタンパク質の総重量に対して、少
なくとも50重量パーセント、より好ましくは少なくとも
70重量パーセント、最も好ましくは少なくとも90重量パ
ーセントのＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を含有するセル
ラーゼタンパク質の組成物（固体または液体）を意味す
る。
【００３６】「他の全てのセルラーゼタンパク質を実質
的に含まない」とは、ＥＧ ＩＩＩ以外のセルラーゼタ
ンパク質の少なくとも50重量パーセント、より好ましく
は60重量パーセント、そして最も好ましくは少なくとも
90重量パーセントが、元のセルラーゼ酵素の水性混合物
から除去されている組成物を意味する。
的に含まない」とは、ＥＧ ＩＩＩ以外のセルラーゼタ
ンパク質の少なくとも50重量パーセント、より好ましく
は60重量パーセント、そして最も好ましくは少なくとも
90重量パーセントが、元のセルラーゼ酵素の水性混合物
から除去されている組成物を意味する。
【００３７】「キシラナーゼが豊富」とは、少なくとも
４倍、より好ましくは10倍、本発明の方法によってキシ
ラナーゼの濃度が増大した水溶液または組成物、もしく
はポリエチレングリコール相を意味する。
４倍、より好ましくは10倍、本発明の方法によってキシ
ラナーゼの濃度が増大した水溶液または組成物、もしく
はポリエチレングリコール相を意味する。
【００３８】「セルラーゼタンパク質」とは、野生型菌
類源、または野生型菌類源から得られるセルラーゼ遺伝
子の全てまたは一部を包含し発現させるように遺伝子的
に修飾した微生物由来の、エキソセロビオヒドロラーゼ
（ＣＢＨ）タンパク質、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）タ
ンパク質およびβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）タンパク質
のいずれかまたは全てを含有するセルラーゼタンパク質
を意味する。集団的に、そのようなタンパク質（すなわ
ち、ＣＢＨ、ＥＧおよびＥＧタンパク質）の全てを「セ
ルラーゼタンパク質」と称する。これに反して、セルラ
ーゼタンパク質は、キシラナーゼ、プロテアーゼ、アミ
ラーゼ等を含む、トリコデルマ ｓｐｐ．により発現さ
れる他のタンパク質を含まない。
類源、または野生型菌類源から得られるセルラーゼ遺伝
子の全てまたは一部を包含し発現させるように遺伝子的
に修飾した微生物由来の、エキソセロビオヒドロラーゼ
（ＣＢＨ）タンパク質、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）タ
ンパク質およびβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）タンパク質
のいずれかまたは全てを含有するセルラーゼタンパク質
を意味する。集団的に、そのようなタンパク質（すなわ
ち、ＣＢＨ、ＥＧおよびＥＧタンパク質）の全てを「セ
ルラーゼタンパク質」と称する。これに反して、セルラ
ーゼタンパク質は、キシラナーゼ、プロテアーゼ、アミ
ラーゼ等を含む、トリコデルマ ｓｐｐ．により発現さ
れる他のタンパク質を含まない。
【００３９】「エンドグルカナーゼ（ＥＧ）成分」と
は、トリコデルマ リーセイのＥＧ Ｉ、ＥＧＩＩおよ
び／またはＥＧ ＩＩＩ成分を含む、トリコデルマ ｓ
ｐｐ．のＥＧ成分を意味する。単体または組合せいずれ
かのトリコデルマ ｓｐｐ．のエンドグルカナーゼ成分
（例えば、トリコデルマ リーセイのＥＧ Ｉ、ＥＧ
ＩＩ、ＥＧ ＩＩＩ）は、これらの成分を繊維処理媒質
に含有させて、綿含有織物をこの媒質中で処理する場合
には、その織物について、感触、外観、柔軟性、色、お
よび／またはストーンウォッシュの外観を改良する（処
理する前の織物と比較して）。上記した事項に加え、Ｅ
Ｇ ＩＩＩは、多くの洗浄剤組成物が使用されるアルカ
リ性のｐＨで実質的な活性を有する。
は、トリコデルマ リーセイのＥＧ Ｉ、ＥＧＩＩおよ
び／またはＥＧ ＩＩＩ成分を含む、トリコデルマ ｓ
ｐｐ．のＥＧ成分を意味する。単体または組合せいずれ
かのトリコデルマ ｓｐｐ．のエンドグルカナーゼ成分
（例えば、トリコデルマ リーセイのＥＧ Ｉ、ＥＧ
ＩＩ、ＥＧ ＩＩＩ）は、これらの成分を繊維処理媒質
に含有させて、綿含有織物をこの媒質中で処理する場合
には、その織物について、感触、外観、柔軟性、色、お
よび／またはストーンウォッシュの外観を改良する（処
理する前の織物と比較して）。上記した事項に加え、Ｅ
Ｇ ＩＩＩは、多くの洗浄剤組成物が使用されるアルカ
リ性のｐＨで実質的な活性を有する。
【００４０】「エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）
成分」とは、トリコデルマ リーセイのＣＢＨ Ｉおよ
びＣＢＨ ＩＩ成分を含む、トリコデルマ ｓｐｐ．の
ＣＢＨ成分を意味する。トリコデルマ ｓｐｐ．のＥＧ
成分を含まない状態でトリコデルマ ｓｐｐ．のＣＢＨ
成分を使用する場合、このＣＢＨ成分単体では、処理し
た綿含有織物の、色の保持／復元および感触が著しくは
改良されない。さらに、そのようなＥＧ成分と組み合わ
せてトリコデルマ リーセイのＣＢＨ Ｉ成分を用いる
場合には、綿含有織物の強度損失を高め、洗浄すること
の利点を高めることができる。
成分」とは、トリコデルマ リーセイのＣＢＨ Ｉおよ
びＣＢＨ ＩＩ成分を含む、トリコデルマ ｓｐｐ．の
ＣＢＨ成分を意味する。トリコデルマ ｓｐｐ．のＥＧ
成分を含まない状態でトリコデルマ ｓｐｐ．のＣＢＨ
成分を使用する場合、このＣＢＨ成分単体では、処理し
た綿含有織物の、色の保持／復元および感触が著しくは
改良されない。さらに、そのようなＥＧ成分と組み合わ
せてトリコデルマ リーセイのＣＢＨ Ｉ成分を用いる
場合には、綿含有織物の強度損失を高め、洗浄すること
の利点を高めることができる。
【００４１】「β−グルコシダーゼ（ＢＧ）成分」と
は、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を意味する。すなわ
ち、そのような成分は、セロビオースおよび他の溶性セ
ロオリゴ糖（「セロビオース」）の非還元末端から作用
しはじめ、唯一の生成物としてグルコースを生成させ
る。ＢＧ成分は、セロビオース重合体上には吸着され
ず、または反応しない。さらに、そのようなＢＧ成分
は、グルコースにより競合的に阻害される（Ｋｉはほぼ
１ｍＭである）。厳密に言えば、ＢＧ成分はセルロース
を分解できないので、本当はセルラーゼではないが、こ
れらの酵素は、ＣＢＨ成分およびＥＧ成分の組合せ作用
によって生成される阻害セルロース分解生成物 （特に
セロビオース）をさらに分解することによりセルロース
の全体的な分解を促進させるので、そのようなＢＧ成分
はセルラーゼ系の定義に含まれる。ＢＧ成分が存在しな
いと、結晶性セルロースの加水分解はわずかしか、また
はほとんど行なわれない。ＢＧ成分はしばしば、ｐ−ニ
トロフェノール Ｂ−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰＧ）のよ
うなアリール基質に特徴付けられる。あるアリール−グ
ルコシダーゼはセロビオースを加水分解しないという点
で、全てのアリール−グルコシダーゼがＢＧ成分である
わけではないことに注意すべきである。
は、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を意味する。すなわ
ち、そのような成分は、セロビオースおよび他の溶性セ
ロオリゴ糖（「セロビオース」）の非還元末端から作用
しはじめ、唯一の生成物としてグルコースを生成させ
る。ＢＧ成分は、セロビオース重合体上には吸着され
ず、または反応しない。さらに、そのようなＢＧ成分
は、グルコースにより競合的に阻害される（Ｋｉはほぼ
１ｍＭである）。厳密に言えば、ＢＧ成分はセルロース
を分解できないので、本当はセルラーゼではないが、こ
れらの酵素は、ＣＢＨ成分およびＥＧ成分の組合せ作用
によって生成される阻害セルロース分解生成物 （特に
セロビオース）をさらに分解することによりセルロース
の全体的な分解を促進させるので、そのようなＢＧ成分
はセルラーゼ系の定義に含まれる。ＢＧ成分が存在しな
いと、結晶性セルロースの加水分解はわずかしか、また
はほとんど行なわれない。ＢＧ成分はしばしば、ｐ−ニ
トロフェノール Ｂ−Ｄ−グルコシド（ＰＮＰＧ）のよ
うなアリール基質に特徴付けられる。あるアリール−グ
ルコシダーゼはセロビオースを加水分解しないという点
で、全てのアリール−グルコシダーゼがＢＧ成分である
わけではないことに注意すべきである。
【００４２】２． 方法論
Ａ． ポリエチレングルコールによるＥＧ ＩＩＩの回
収 本発明の一部は、特定のポリエチレングリコールを添加
することにより、ＥＧ ＩＩＩを含有するセルラーゼタ
ンパク質の水性混合物から、他のセルラーゼタンパク質
を実質的に含まないＥＧ ＩＩＩセルラーゼが得られる
という発見に関するものである。驚くべきことに、これ
らの条件下において、ＥＧ ＩＩＩ以外の実質的に全て
のセルラーゼタンパク質が水相に残存するが、ＥＧ Ｉ
ＩＩは実質的に純粋な量でポリエチレングリコール相中
に回収される。これらの条件下で、多量のキシラナーゼ
がポリエチレングリコール相中に回収されることも発見
された。
収 本発明の一部は、特定のポリエチレングリコールを添加
することにより、ＥＧ ＩＩＩを含有するセルラーゼタ
ンパク質の水性混合物から、他のセルラーゼタンパク質
を実質的に含まないＥＧ ＩＩＩセルラーゼが得られる
という発見に関するものである。驚くべきことに、これ
らの条件下において、ＥＧ ＩＩＩ以外の実質的に全て
のセルラーゼタンパク質が水相に残存するが、ＥＧ Ｉ
ＩＩは実質的に純粋な量でポリエチレングリコール相中
に回収される。これらの条件下で、多量のキシラナーゼ
がポリエチレングリコール相中に回収されることも発見
された。
【００４３】本発明を実施する好ましい方法の１つにお
いて、セルラーゼを含有する水性混合物を濾過して、細
胞ブイヨン（cell debris ）および他の固体を除去し、
セルラーゼタンパク質を含むタンパク質の混合物を含有
する濾液を作成した。より好ましくは、シトラーゼ１２
３（CYTOLASE123 ）（カリフォルニア州、サウスサンフ
ランシスコのジェネンカー インターナショナル社から
市販されている）のような細胞を含まないセルラーゼタ
ンパク質混合物を使用する。別の方法において、すでに
ＥＧ ＩＩＩが多い相溶性水性混合物を含む相溶性供給
源、より具体的には、「アルコールを用いた実質的に純
粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを産生する方法」と題し、
ここに全てを引用する代理人番号010055-107の本出願と
同時に出願された米国特許出願に記載されたＥＧ ＩＩ
Ｉ溶液から水性混合物を得ることができる。
いて、セルラーゼを含有する水性混合物を濾過して、細
胞ブイヨン（cell debris ）および他の固体を除去し、
セルラーゼタンパク質を含むタンパク質の混合物を含有
する濾液を作成した。より好ましくは、シトラーゼ１２
３（CYTOLASE123 ）（カリフォルニア州、サウスサンフ
ランシスコのジェネンカー インターナショナル社から
市販されている）のような細胞を含まないセルラーゼタ
ンパク質混合物を使用する。別の方法において、すでに
ＥＧ ＩＩＩが多い相溶性水性混合物を含む相溶性供給
源、より具体的には、「アルコールを用いた実質的に純
粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを産生する方法」と題し、
ここに全てを引用する代理人番号010055-107の本出願と
同時に出願された米国特許出願に記載されたＥＧ ＩＩ
Ｉ溶液から水性混合物を得ることができる。
【００４４】濾液を濾過段階にて得た後、その濾液をポ
リエチレングルコール（ＰＥＧ）と接触させる前に、濾
液に無機塩を加えてもよい。ある場合には、無機塩を添
加すると、水相からポリエチレングリコール相中へのＥ
Ｇ ＩＩＩセルラーゼ成分の分割を高めることができ
る。
リエチレングルコール（ＰＥＧ）と接触させる前に、濾
液に無機塩を加えてもよい。ある場合には、無機塩を添
加すると、水相からポリエチレングリコール相中へのＥ
Ｇ ＩＩＩセルラーゼ成分の分割を高めることができ
る。
【００４５】次いで、有為な量のＥＧ ＩＩＩをポリエ
チレングリコール相に運搬するのに十分な期間に亘りポ
リエチレングリコールと水性混合物を混合する。そのよ
うな特定の期間は、添加するポリエチレングリコールの
量、添加する塩の量等により変化する。そのような要件
は当業者により容易に確かめられる。しかしながら、好
ましい実施態様においては、少なくとも約２時間、より
好ましくは約４時間、そして最も好ましくは約18時間に
亘りポリエチレングリコールを水性混合物と混合する。
相が分離するのに十分な期間、好ましくは少なくとも約
４時間、より好ましくは８時間、最も好ましくは約18時
間に亘り、混合後にポリエチレングリコール水性混合物
を放置する。２相混合液が形成される。ＥＧ ＩＩＩセ
ルラーゼ成分はポリエチレングリコール相に存在してい
る。次いでＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール
相を水性相から分離する。回収したＥＧ ＩＩＩが多い
溶液は、これらのタンパク質のうち約50重量パーセント
から約90重量パーセントをこえるまでの量がＥＧ ＩＩ
Ｉであるセルラーゼタンパク質の混合物を含有してい
る。
チレングリコール相に運搬するのに十分な期間に亘りポ
リエチレングリコールと水性混合物を混合する。そのよ
うな特定の期間は、添加するポリエチレングリコールの
量、添加する塩の量等により変化する。そのような要件
は当業者により容易に確かめられる。しかしながら、好
ましい実施態様においては、少なくとも約２時間、より
好ましくは約４時間、そして最も好ましくは約18時間に
亘りポリエチレングリコールを水性混合物と混合する。
相が分離するのに十分な期間、好ましくは少なくとも約
４時間、より好ましくは８時間、最も好ましくは約18時
間に亘り、混合後にポリエチレングリコール水性混合物
を放置する。２相混合液が形成される。ＥＧ ＩＩＩセ
ルラーゼ成分はポリエチレングリコール相に存在してい
る。次いでＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール
相を水性相から分離する。回収したＥＧ ＩＩＩが多い
溶液は、これらのタンパク質のうち約50重量パーセント
から約90重量パーセントをこえるまでの量がＥＧ ＩＩ
Ｉであるセルラーゼタンパク質の混合物を含有してい
る。
【００４６】様々な方法によりポリエチレングリコール
相からＥＧ ＩＩＩ成分を精製することができる。好ま
しい実施態様において、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を
冷たいエタノールにより沈殿させ、所望の水溶液中に再
懸濁させる。適切な緩衝液は、ｐＨ５の50ｍＭの酢酸ナ
トリウム、またはｐＨ５の10ｍＭのクエン酸リン酸のよ
うな、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない従来技
術で知られている緩衝液である。
相からＥＧ ＩＩＩ成分を精製することができる。好ま
しい実施態様において、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を
冷たいエタノールにより沈殿させ、所望の水溶液中に再
懸濁させる。適切な緩衝液は、ｐＨ５の50ｍＭの酢酸ナ
トリウム、またはｐＨ５の10ｍＭのクエン酸リン酸のよ
うな、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない従来技
術で知られている緩衝液である。
【００４７】本発明の本質的な特徴の１つは、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）を使用することである。ＰＥ
Ｇは固有に活性であり、他のセルラーゼタンパク質を含
有する水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼを回収す
るのに選択性を有することが分かった。この点に関し
て、「効果的な量のポリエチレングリコール」とは、有
為な量のＥＧ ＩＩＩ成分を他のセルラーゼタンパク質
から分割するのに必要な、水性混合物の添加される量を
意味する。添加するポリエチレングリコールの量は、好
ましくは0.5 ％（ｗ／ｖ）から10％（ｗ／ｖ）までの範
囲にあり、より好ましくは４％（ｗ／ｖ）である。本発
明の方法に使用するＰＥＧの平均分子量は、約5,000 か
ら約10,000までの範囲に亘り、好ましくは約7,000 から
約9,000 までの範囲に亘り、そして最も好ましくは約8,
000 である。
レングリコール（ＰＥＧ）を使用することである。ＰＥ
Ｇは固有に活性であり、他のセルラーゼタンパク質を含
有する水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼを回収す
るのに選択性を有することが分かった。この点に関し
て、「効果的な量のポリエチレングリコール」とは、有
為な量のＥＧ ＩＩＩ成分を他のセルラーゼタンパク質
から分割するのに必要な、水性混合物の添加される量を
意味する。添加するポリエチレングリコールの量は、好
ましくは0.5 ％（ｗ／ｖ）から10％（ｗ／ｖ）までの範
囲にあり、より好ましくは４％（ｗ／ｖ）である。本発
明の方法に使用するＰＥＧの平均分子量は、約5,000 か
ら約10,000までの範囲に亘り、好ましくは約7,000 から
約9,000 までの範囲に亘り、そして最も好ましくは約8,
000 である。
【００４８】上述した方法に関して、実質的に約5,000
未満の分子量を有するポリエチレングリコールを使用す
ると、他のセルラーゼ酵素からの分離が好ましくなくな
ってしまう。一方約10,000より実質的に大きい分子量を
有するポリエチレングリコールを使用すると、ＰＥＧ相
から捕獲するＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の量が減少し
てしまう。好ましい実施態様において、ポリエチレング
リコールの分子量は約8,000 である。
未満の分子量を有するポリエチレングリコールを使用す
ると、他のセルラーゼ酵素からの分離が好ましくなくな
ってしまう。一方約10,000より実質的に大きい分子量を
有するポリエチレングリコールを使用すると、ＰＥＧ相
から捕獲するＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の量が減少し
てしまう。好ましい実施態様において、ポリエチレング
リコールの分子量は約8,000 である。
【００４９】セルラーゼタンパク質の水性混合物は、Ｅ
Ｇ ＩＩＩの百分率と比較して高い百分率の他のセルラ
ーゼタンパク質を含有しているので、そのような水性混
合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離するのにポ
リエチレングリコールが特に有用であることが分かっ
た。シトラーゼ１２３セルラーゼ系中のセルラーゼタン
パク質の標準分布を以下に示す： ＣＢＨ Ｉ 45−55重量パーセント ＣＢＨ ＩＩ 13−15重量パーセント ＥＧ Ｉ 11−13重量パーセント ＥＧ ＩＩ ８−10重量パーセント ＥＧ ＩＩＩ １−４重量パーセント ＢＧ 0.5−１重量パーセント 本発明の方法により、有用な量のＥＧ ＩＩＩ成分が得
られる。他の方法と比較した本発明のＰＥＧ抽出方法に
よるＥＧ ＩＩＩ成分の回収の損失は、ＥＧ ＩＩＩ成
分の回収速度により補償される。この方法には精製のた
めの大規模な分画工程は必要ないが、所望であれば、さ
らなる精製のためにそのような工程を続いて行なうこと
もできる。
Ｇ ＩＩＩの百分率と比較して高い百分率の他のセルラ
ーゼタンパク質を含有しているので、そのような水性混
合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を分離するのにポ
リエチレングリコールが特に有用であることが分かっ
た。シトラーゼ１２３セルラーゼ系中のセルラーゼタン
パク質の標準分布を以下に示す： ＣＢＨ Ｉ 45−55重量パーセント ＣＢＨ ＩＩ 13−15重量パーセント ＥＧ Ｉ 11−13重量パーセント ＥＧ ＩＩ ８−10重量パーセント ＥＧ ＩＩＩ １−４重量パーセント ＢＧ 0.5−１重量パーセント 本発明の方法により、有用な量のＥＧ ＩＩＩ成分が得
られる。他の方法と比較した本発明のＰＥＧ抽出方法に
よるＥＧ ＩＩＩ成分の回収の損失は、ＥＧ ＩＩＩ成
分の回収速度により補償される。この方法には精製のた
めの大規模な分画工程は必要ないが、所望であれば、さ
らなる精製のためにそのような工程を続いて行なうこと
もできる。
【００５０】「無機塩」とは、ポリエチレングリコール
とともに使用する場合に、タンパク質を変性させること
なくＥＧ ＩＩＩの精製を促進させる硫酸イオンまたは
リン酸イオンを有する相溶性無機塩を意味する。そのよ
うな無機塩の例としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸
カリウム等が挙げられる。「効果的な量の無機塩」と
は、ポリエチレングリコールを含有する水性混合物に添
加するときに、ＥＧ ＩＩＩ成分をポリエチレングリコ
ール相中に優先的に分離し、水相中にＥＧ ＩＩＩ以外
のセルラーゼタンパク質を保持する量を意味する。
とともに使用する場合に、タンパク質を変性させること
なくＥＧ ＩＩＩの精製を促進させる硫酸イオンまたは
リン酸イオンを有する相溶性無機塩を意味する。そのよ
うな無機塩の例としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸
カリウム等が挙げられる。「効果的な量の無機塩」と
は、ポリエチレングリコールを含有する水性混合物に添
加するときに、ＥＧ ＩＩＩ成分をポリエチレングリコ
ール相中に優先的に分離し、水相中にＥＧ ＩＩＩ以外
のセルラーゼタンパク質を保持する量を意味する。
【００５１】無機塩の濃度を変更させて、所望の結果を
得ることができる。約４％（ｗ／ｖ）から約20％（ｗ／
ｖ）の濃縮塩溶液、より好ましくは約10％（ｗ／ｖ）か
ら約14％（ｗ／ｖ）の濃縮塩溶液の存在下で、ＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼ成分がＰＥＧ相中で最良に金属イオン封
鎖されることが分かった。塩のレベルが約20％（ｗ／
ｖ）より実質的に多い場合には、沈殿を生じてしまい、
塩のレベルが約４％（ｗ／ｖ）より実質的に少ない場合
には、分離が望ましくなくなるか、または溶液が１つの
相のままとなってしまう。
得ることができる。約４％（ｗ／ｖ）から約20％（ｗ／
ｖ）の濃縮塩溶液、より好ましくは約10％（ｗ／ｖ）か
ら約14％（ｗ／ｖ）の濃縮塩溶液の存在下で、ＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼ成分がＰＥＧ相中で最良に金属イオン封
鎖されることが分かった。塩のレベルが約20％（ｗ／
ｖ）より実質的に多い場合には、沈殿を生じてしまい、
塩のレベルが約４％（ｗ／ｖ）より実質的に少ない場合
には、分離が望ましくなくなるか、または溶液が１つの
相のままとなってしまう。
【００５２】Ｂ． 分画によるＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
の回収 本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、分
画によりシトラーゼ１２３のような、セルラーゼタンパ
ク質を含有する濾過した水性混合物からＥＧ ＩＩＩを
回収する。適切な脱塩樹脂を用いて適切な段階で水性混
合物を脱塩し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹
脂を用いてＥＧ ＩＩＩを分離することにより、そのよ
うな分画を行なうことができる。具体的には、ｐＨ6.8
の10ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてセファデッ
クスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムにより水性混合物を最初
に脱塩することによりＥＧ ＩＩＩを回収した。次いで
脱塩した溶液をＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂
カラムに充填する。このカラム上に結合しなかった分画
はＥＧ ＩＩＩを含有している。この分画を、ｐＨ4.5
の10ｍＭのクエン酸ナトリウムで平衡状態にしたセファ
デックスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムを用いて脱塩する。
この溶液をＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂カラ
ムに充填する。200 ｍＭの塩化ナトリウムの水溶液によ
りＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を溶離させる。
の回収 本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、分
画によりシトラーゼ１２３のような、セルラーゼタンパ
ク質を含有する濾過した水性混合物からＥＧ ＩＩＩを
回収する。適切な脱塩樹脂を用いて適切な段階で水性混
合物を脱塩し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹
脂を用いてＥＧ ＩＩＩを分離することにより、そのよ
うな分画を行なうことができる。具体的には、ｐＨ6.8
の10ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてセファデッ
クスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムにより水性混合物を最初
に脱塩することによりＥＧ ＩＩＩを回収した。次いで
脱塩した溶液をＱＡトリスアクリルＭ陰イオン交換樹脂
カラムに充填する。このカラム上に結合しなかった分画
はＥＧ ＩＩＩを含有している。この分画を、ｐＨ4.5
の10ｍＭのクエン酸ナトリウムで平衡状態にしたセファ
デックスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムを用いて脱塩する。
この溶液をＳＰトリスアクリルＭ陽イオン交換樹脂カラ
ムに充填する。200 ｍＭの塩化ナトリウムの水溶液によ
りＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を溶離させる。
【００５３】本発明の方法を実施する別の好ましい方法
において、陽イオン交換カラムから得たＥＧＩＩＩ試料
をさらに分画することができる。事前にｐＨ４の10ｍＭ
のクエン酸ナトリウムにより平衡状態にしたセファデッ
クスＧ−25カラムによりＥＧ ＩＩＩ試料を脱塩する。
モノ−Ｓ−ＨＲ５／５カラム（ニュージャージー州、ピ
スキャタウェイのファーマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ーから得られる）を用いて、その溶液をＦＰＬＣシステ
ムに供した。次いで、0.5 ｍｌ／分の速度で塩化ナトリ
ウム水溶液の０−200 ｍＭの勾配によりそのカラムを溶
離させる。ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を回収した。ゲ
ル電気泳動によってこのＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の
純度は90％よりも大きいことが分かった。ＥＧ ＩＩＩ
のこの純度は、既知の技術によりＮ末端アミノ酸配列を
求めるのに適している。
において、陽イオン交換カラムから得たＥＧＩＩＩ試料
をさらに分画することができる。事前にｐＨ４の10ｍＭ
のクエン酸ナトリウムにより平衡状態にしたセファデッ
クスＧ−25カラムによりＥＧ ＩＩＩ試料を脱塩する。
モノ−Ｓ−ＨＲ５／５カラム（ニュージャージー州、ピ
スキャタウェイのファーマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ーから得られる）を用いて、その溶液をＦＰＬＣシステ
ムに供した。次いで、0.5 ｍｌ／分の速度で塩化ナトリ
ウム水溶液の０−200 ｍＭの勾配によりそのカラムを溶
離させる。ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を回収した。ゲ
ル電気泳動によってこのＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分の
純度は90％よりも大きいことが分かった。ＥＧ ＩＩＩ
のこの純度は、既知の技術によりＮ末端アミノ酸配列を
求めるのに適している。
【００５４】セファロース樹脂はよく知られた種類の樹
脂である。ここに使用している「セファロース」とは、
塩を保持するがＥＧ ＩＩＩを排除するのに十分な排除
サイズ（exclusion size）を有する任意のセファロース
樹脂を意味する。ここに使用している「陰イオン交換樹
脂」とは、ＥＧ ＩＩＩのｐＨより低いｐＨにおいて、
ＥＧ ＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質の少なくとも
いくらかと結合するのに十分な電荷密度を供する陽イオ
ン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な陰イオ
ン樹脂は、アミノエチル（ＡＥ）官能基、ジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）官能基および第４アミノエチル
（ＱＡＥ）官能基を有する。ここに使用している「陽イ
オン交換樹脂」とは、ＥＧ ＩＩＩのｐＩより低いｐＨ
でＥＧ ＩＩＩと結合するのに十分な電荷密度を供する
陰イオン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な
陽イオン樹脂は、スルホプロピル（ＳＰ）官能基、ホス
ホ（Ｐ）官能基およびカルボキシメチル（ＣＭ）官能基
を有する。
脂である。ここに使用している「セファロース」とは、
塩を保持するがＥＧ ＩＩＩを排除するのに十分な排除
サイズ（exclusion size）を有する任意のセファロース
樹脂を意味する。ここに使用している「陰イオン交換樹
脂」とは、ＥＧ ＩＩＩのｐＨより低いｐＨにおいて、
ＥＧ ＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質の少なくとも
いくらかと結合するのに十分な電荷密度を供する陽イオ
ン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な陰イオ
ン樹脂は、アミノエチル（ＡＥ）官能基、ジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）官能基および第４アミノエチル
（ＱＡＥ）官能基を有する。ここに使用している「陽イ
オン交換樹脂」とは、ＥＧ ＩＩＩのｐＩより低いｐＨ
でＥＧ ＩＩＩと結合するのに十分な電荷密度を供する
陰イオン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な
陽イオン樹脂は、スルホプロピル（ＳＰ）官能基、ホス
ホ（Ｐ）官能基およびカルボキシメチル（ＣＭ）官能基
を有する。
【００５５】上述したＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分をさ
らに精製することが望ましい場合もある。例えば、最初
のＰＥＧ抽出方法から得た物質を２番目の分画方法に用
いることにより、またその逆に２番目の分画方法から得
た物質を最初のＰＥＧ抽出方法に用いることにより、上
述した方法において単離したＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成
分をさらに精製することもできる。
らに精製することが望ましい場合もある。例えば、最初
のＰＥＧ抽出方法から得た物質を２番目の分画方法に用
いることにより、またその逆に２番目の分画方法から得
た物質を最初のＰＥＧ抽出方法に用いることにより、上
述した方法において単離したＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成
分をさらに精製することもできる。
【００５６】代理人番号010055-107として本出願ととも
に出願し、ここに全てを引用する、「アルコールを用い
た、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを産生する
方法」と題する米国特許出願に記載されている方法によ
り、ここに回収したＥＧ ＩＩＩをさらに精製すること
もできる。
に出願し、ここに全てを引用する、「アルコールを用い
た、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを産生する
方法」と題する米国特許出願に記載されている方法によ
り、ここに回収したＥＧ ＩＩＩをさらに精製すること
もできる。
【００５７】上述した記載は本発明の方法を実施する好
ましい方法に関するものであり、本発明の教示により上
述した方法を様々に変更できることが分かるであろう。
様々な方法の条件を変更することができ、使用する試薬
を変更して、ＥＧ ＩＩＩ成分を含有する任意の適した
酵素の水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を回
収する様々な所望のまたは最適な操作条件を供すること
ができる。
ましい方法に関するものであり、本発明の教示により上
述した方法を様々に変更できることが分かるであろう。
様々な方法の条件を変更することができ、使用する試薬
を変更して、ＥＧ ＩＩＩ成分を含有する任意の適した
酵素の水性混合物からＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を回
収する様々な所望のまたは最適な操作条件を供すること
ができる。
【００５８】当業者には理解されるように、本発明の方
法の記載において上述した酸、塩基および塩を変更でき
るか、または本発明の操作を妨害せずに所望のｐＨまた
は所望の塩含有量を供するが、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
成分を変性しない等価の酸、塩基または塩と置換でき
る。
法の記載において上述した酸、塩基および塩を変更でき
るか、または本発明の操作を妨害せずに所望のｐＨまた
は所望の塩含有量を供するが、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
成分を変性しない等価の酸、塩基または塩と置換でき
る。
【００５９】さらに、本発明の分画方法の前に本発明の
抽出方法を行なうこともできるが、その逆でもよい。本
発明の分画方法によってさらに精製して実質的に純粋な
ＥＧ ＩＩＩセルラーゼを含有する水溶液を供すること
ができる、ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール
の最初の相を提供するように、水性混合物をポリエチレ
ングリコールにより抽出することができる。
抽出方法を行なうこともできるが、その逆でもよい。本
発明の分画方法によってさらに精製して実質的に純粋な
ＥＧ ＩＩＩセルラーゼを含有する水溶液を供すること
ができる、ＥＧ ＩＩＩが多いポリエチレングリコール
の最初の相を提供するように、水性混合物をポリエチレ
ングリコールにより抽出することができる。
【００６０】適切な発酵条件下でＥＧ ＩＩＩを産生す
るトリゴテルマ ｓｐｐ．の菌株を含む任意の供給源か
らＥＧ ＩＩＩセルラーゼを精製できる。ＥＧ ＩＩＩ
の特定の供給源は重要ではないが、好ましい供給源は、
トリコデルマ リーセイおよびトリコデルマ ビリデで
ある。トリコデルマ リーセイからのＥＧ ＩＩＩの特
に好ましい供給源は、ジェネンカー インターナショナ
ル社（94080 、カリフォルニア州、サウスサンフランシ
スコ、180 キンボールウェイ）から市販されているシト
ラーゼ１２３である。トリコデルマ ｓｐｐ．由来の完
全セルラーゼ系 （「全セルラーゼ」）から実質的に純
粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを得る適切な方法として
は、以下に述べる実施例に記載された方法が挙げられ
る。これらの実施例は、全セルラーゼにＰＥＧ抽出およ
び／または異なる分画物質（カラム）を用いた繰返しの
分画工程を行なうことにより、実質的に純粋なＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼが容易に得られることを示している。
るトリゴテルマ ｓｐｐ．の菌株を含む任意の供給源か
らＥＧ ＩＩＩセルラーゼを精製できる。ＥＧ ＩＩＩ
の特定の供給源は重要ではないが、好ましい供給源は、
トリコデルマ リーセイおよびトリコデルマ ビリデで
ある。トリコデルマ リーセイからのＥＧ ＩＩＩの特
に好ましい供給源は、ジェネンカー インターナショナ
ル社（94080 、カリフォルニア州、サウスサンフランシ
スコ、180 キンボールウェイ）から市販されているシト
ラーゼ１２３である。トリコデルマ ｓｐｐ．由来の完
全セルラーゼ系 （「全セルラーゼ」）から実質的に純
粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを得る適切な方法として
は、以下に述べる実施例に記載された方法が挙げられ
る。これらの実施例は、全セルラーゼにＰＥＧ抽出およ
び／または異なる分画物質（カラム）を用いた繰返しの
分画工程を行なうことにより、実質的に純粋なＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼが容易に得られることを示している。
【００６１】ＥＧ ＩＩＩの単離効率を高めるために、
ＥＧ ＩＩＩを過剰発現（overexpress ）するように、
および／またはＥＧ Ｉ成分、ＥＧ ＩＩ成分、ＣＢＨ
Ｉ成分および／またはＣＢＨ ＩＩ成分のうちの１つ
以上を産生できないように、遺伝子的に修飾した微生物
（例えば、トリコデルマ リーセイ）を用いることが望
ましいと思われる。このようにすることにより必ず、例
えば、上述したような分画および／またはＰＥＧ抽出に
よってＥＧＩＩＩをより能率的に単離することができ
る。トリコデルマ リーセイのこれらの菌株のうちのい
くつかの産生が、1991年 3月13日に出願された米国特許
出願第07/668,640号および下記の実施例に開示されてい
る。
ＥＧ ＩＩＩを過剰発現（overexpress ）するように、
および／またはＥＧ Ｉ成分、ＥＧ ＩＩ成分、ＣＢＨ
Ｉ成分および／またはＣＢＨ ＩＩ成分のうちの１つ
以上を産生できないように、遺伝子的に修飾した微生物
（例えば、トリコデルマ リーセイ）を用いることが望
ましいと思われる。このようにすることにより必ず、例
えば、上述したような分画および／またはＰＥＧ抽出に
よってＥＧＩＩＩをより能率的に単離することができ
る。トリコデルマ リーセイのこれらの菌株のうちのい
くつかの産生が、1991年 3月13日に出願された米国特許
出願第07/668,640号および下記の実施例に開示されてい
る。
【００６２】さらに、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセル
ラーゼを産生するように微生物を遺伝子的に修飾するこ
とにより、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを調
製できると考えられる。例えば、下記の実施例に述べる
分画方法により調製した実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩを
使用して、既知の塩基配列決定法を用いてタンパク質の
一部のアミノ酸配列を決定した（実施例４）。ＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼ成分をコード化する遺伝子をクローニン
グするために、この情報を用いて合成ＤＮＡプローブを
調製することができる。一度ＥＧ ＩＩＩ遺伝子をクロ
ーニングしたら、既知の技術によりＥＧ ＩＩＩ遺伝子
を操作し、最終的には様々なトリコデルマ ｓｐｐ．菌
株中かまたは他の微生物中に挿入できる。例えば、1990
年10月 5日に出願された米国特許出願第07/593,919号の
一部継続出願である、1991年10月4日に出願された米国
特許出願第07/770,049号、および1991年 3月13日に出願
された米国特許出願第07/668,640号を参照のこと。それ
らの特許出願には、修飾した微生物が１つ以上のセルラ
ーゼ遺伝子を発現できず、実際に別のセルラーゼ遺伝子
を過剰産生し得るように、トリコデルマ リーセイを遺
伝子操作する方法が開示されている。1991年10月 4日に
出願された米国特許出願第07/770,049号、1990年10月 5
日に出願された米国特許出願第07/593,919号、および19
91年 3月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号
の開示の全てを引用する。
ラーゼを産生するように微生物を遺伝子的に修飾するこ
とにより、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼを調
製できると考えられる。例えば、下記の実施例に述べる
分画方法により調製した実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩを
使用して、既知の塩基配列決定法を用いてタンパク質の
一部のアミノ酸配列を決定した（実施例４）。ＥＧ Ｉ
ＩＩセルラーゼ成分をコード化する遺伝子をクローニン
グするために、この情報を用いて合成ＤＮＡプローブを
調製することができる。一度ＥＧ ＩＩＩ遺伝子をクロ
ーニングしたら、既知の技術によりＥＧ ＩＩＩ遺伝子
を操作し、最終的には様々なトリコデルマ ｓｐｐ．菌
株中かまたは他の微生物中に挿入できる。例えば、1990
年10月 5日に出願された米国特許出願第07/593,919号の
一部継続出願である、1991年10月4日に出願された米国
特許出願第07/770,049号、および1991年 3月13日に出願
された米国特許出願第07/668,640号を参照のこと。それ
らの特許出願には、修飾した微生物が１つ以上のセルラ
ーゼ遺伝子を発現できず、実際に別のセルラーゼ遺伝子
を過剰産生し得るように、トリコデルマ リーセイを遺
伝子操作する方法が開示されている。1991年10月 4日に
出願された米国特許出願第07/770,049号、1990年10月 5
日に出願された米国特許出願第07/593,919号、および19
91年 3月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号
の開示の全てを引用する。
【００６３】これらの特許出願に記載された方法を用い
て、他のセルラーゼタンパク質とともに、またはそれを
除いてＥＧ ＩＩＩを産生するようにトリコデルマ リ
ーセイを遺伝子操作することができる。さらに、これら
の出願に記載された方法では、どのような異種タンパク
質をも産生しないトリコデルマ リーセイ菌株を調製し
ている。
て、他のセルラーゼタンパク質とともに、またはそれを
除いてＥＧ ＩＩＩを産生するようにトリコデルマ リ
ーセイを遺伝子操作することができる。さらに、これら
の出願に記載された方法では、どのような異種タンパク
質をも産生しないトリコデルマ リーセイ菌株を調製し
ている。
【００６４】さらに、他の微生物中にＥＧ ＩＩＩコー
ド化遺伝子を発現することが可能である。そのような微
生物の例としては、以下に限定されるものではないが、
サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）、ピチア パストリス（Pichia pastoris ）、ハ
ンセニューラ ポリモルファ（Hansenula polymorph
a）、クルイベロミセス ラクチス（Kluyveromyces lac
tis）、ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia lipolytica
）、シャンニオミセス オクシデンタリス（Schanniom
yces occidentalis）等のような酵母種が挙げられる。
例えば、ＰＣＴ特許出願第wo 85/04672 号を参照のこ
と。非トリコデルマ宿主であるこれらの代替物において
発現を行なうためには、ＥＧ ＩＩＩコード化ＤＮＡ配
列をその特定の宿主からの遺伝子より得られたプロモー
ター配列およびターミネーター配列に機能的に結合させ
る必要があることもある。また、ＥＧ ＩＩＩ分泌信号
配列をコード化するＤＮＡ配列の代わりに、代替宿主か
らの分泌信号配列をコード化するＤＮＡ配列を用いる必
要があると思われる。他の生物内でＥＧ ＩＩＩを産生
および分泌することにより、実質的に純粋な形態でＥＧ
ＩＩＩを得ることができる。 上述した実質的に純粋
なＥＧＩＩＩセルラーゼをさらに、液体希釈物、顆粒、
エマルジョン、ゲル、ペースト等に加工することもでき
る。そのような形態は当業者によく知られている。固体
の洗浄剤組成物が望ましい場合、セルラーゼ組成物を好
ましくは顆粒として調合する。好ましくは、セルラーゼ
保護剤を含有するように顆粒を調合することができる。
例えば、代理人番号第010055-073号として1991年 1月17
日に出願された、「酵素および酵素保護剤の両方を含有
する顆粒並びにそのような顆粒を含有する洗浄剤組成
物」と題する米国特許出願第07/642,669号を参照のこ
と。この出願の全てを引用する。同様に、顆粒の洗浄媒
質中への溶解速度を遅くする物質を含有するようにその
顆粒を調合することもできる。そのような物質と顆粒
が、代理人番号第GCS-171-US1 番として1991年 1月17日
に出願された、「顆粒組成物」と題する米国特許出願第
07/642,596号に開示されており、その出願の全てをここ
に引用する。次いでＥＧ ＩＩＩを含有する顆粒または
他の洗浄剤配合物を織物の洗浄に用いて、柔軟特性を織
物等に与えることができる。
ド化遺伝子を発現することが可能である。そのような微
生物の例としては、以下に限定されるものではないが、
サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）、ピチア パストリス（Pichia pastoris ）、ハ
ンセニューラ ポリモルファ（Hansenula polymorph
a）、クルイベロミセス ラクチス（Kluyveromyces lac
tis）、ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia lipolytica
）、シャンニオミセス オクシデンタリス（Schanniom
yces occidentalis）等のような酵母種が挙げられる。
例えば、ＰＣＴ特許出願第wo 85/04672 号を参照のこ
と。非トリコデルマ宿主であるこれらの代替物において
発現を行なうためには、ＥＧ ＩＩＩコード化ＤＮＡ配
列をその特定の宿主からの遺伝子より得られたプロモー
ター配列およびターミネーター配列に機能的に結合させ
る必要があることもある。また、ＥＧ ＩＩＩ分泌信号
配列をコード化するＤＮＡ配列の代わりに、代替宿主か
らの分泌信号配列をコード化するＤＮＡ配列を用いる必
要があると思われる。他の生物内でＥＧ ＩＩＩを産生
および分泌することにより、実質的に純粋な形態でＥＧ
ＩＩＩを得ることができる。 上述した実質的に純粋
なＥＧＩＩＩセルラーゼをさらに、液体希釈物、顆粒、
エマルジョン、ゲル、ペースト等に加工することもでき
る。そのような形態は当業者によく知られている。固体
の洗浄剤組成物が望ましい場合、セルラーゼ組成物を好
ましくは顆粒として調合する。好ましくは、セルラーゼ
保護剤を含有するように顆粒を調合することができる。
例えば、代理人番号第010055-073号として1991年 1月17
日に出願された、「酵素および酵素保護剤の両方を含有
する顆粒並びにそのような顆粒を含有する洗浄剤組成
物」と題する米国特許出願第07/642,669号を参照のこ
と。この出願の全てを引用する。同様に、顆粒の洗浄媒
質中への溶解速度を遅くする物質を含有するようにその
顆粒を調合することもできる。そのような物質と顆粒
が、代理人番号第GCS-171-US1 番として1991年 1月17日
に出願された、「顆粒組成物」と題する米国特許出願第
07/642,596号に開示されており、その出願の全てをここ
に引用する。次いでＥＧ ＩＩＩを含有する顆粒または
他の洗浄剤配合物を織物の洗浄に用いて、柔軟特性を織
物等に与えることができる。
【００６５】以下の実施例は本発明を説明することを意
図したものであり、本発明の範囲を制限するものとして
考えるべきではない。
図したものであり、本発明の範囲を制限するものとして
考えるべきではない。
【実施例１】
【００６６】ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ酵素の大規模な抽
出 Ａ． 細胞を含まないセルラーゼの濾液100 リットルを
約30℃に加熱した。加熱した物質を、約４％（ｗ／ｖ）
カーボワックス（登録商標）ＰＥＧ８０００ （ポリエ
チレングリコール、約8000の平均分子量）（コネチカッ
ト州、ダンバリー、ユニオンカーバイド）および約10％
（ｗ／ｖ）無水硫酸ナトリウムとして調製した。混合物
を２相の液体混合物を形成した。ＳＡ−１ディスク ス
タック遠心分離機を用いて相を分離した。銀染色（silv
er staining ）等電点電気泳動ゲルを用いて相を分析し
た。ＥＧ ＩＩＩおよびキシラナーゼについて分画と集
積を行なった。回収した組成物は約20重量パーセントか
ら約50重量パーセントまでの範囲のＥＧ ＩＩＩを含有
していた。ポリエチレングリコール相中に回収されたキ
シラナーゼの量は、少なくとも４倍キシラナーゼが豊富
であった。
出 Ａ． 細胞を含まないセルラーゼの濾液100 リットルを
約30℃に加熱した。加熱した物質を、約４％（ｗ／ｖ）
カーボワックス（登録商標）ＰＥＧ８０００ （ポリエ
チレングリコール、約8000の平均分子量）（コネチカッ
ト州、ダンバリー、ユニオンカーバイド）および約10％
（ｗ／ｖ）無水硫酸ナトリウムとして調製した。混合物
を２相の液体混合物を形成した。ＳＡ−１ディスク ス
タック遠心分離機を用いて相を分離した。銀染色（silv
er staining ）等電点電気泳動ゲルを用いて相を分析し
た。ＥＧ ＩＩＩおよびキシラナーゼについて分画と集
積を行なった。回収した組成物は約20重量パーセントか
ら約50重量パーセントまでの範囲のＥＧ ＩＩＩを含有
していた。ポリエチレングリコール相中に回収されたキ
シラナーゼの量は、少なくとも４倍キシラナーゼが豊富
であった。
【００６７】Ｂ． 細胞を含まないセルラーゼ濾液100
リットルを、円錐形の底および底の中心に排出口を有す
る130 リットルの容器に加えた。出発物質は、ＥＧ Ｉ
ＩＩ以外のセルラーゼが欠失したおよび／またはＥＧ
ＩＩＩが過剰発現された菌株からのセルラーゼまたは全
セルラーゼであってもよい。限外濾過は必要条件ではな
いけれども、タンパク質の濃度を約10ｇ／ｌから約50ｇ
／ｌまでの範囲に保持すべきである。
リットルを、円錐形の底および底の中心に排出口を有す
る130 リットルの容器に加えた。出発物質は、ＥＧ Ｉ
ＩＩ以外のセルラーゼが欠失したおよび／またはＥＧ
ＩＩＩが過剰発現された菌株からのセルラーゼまたは全
セルラーゼであってもよい。限外濾過は必要条件ではな
いけれども、タンパク質の濃度を約10ｇ／ｌから約50ｇ
／ｌまでの範囲に保持すべきである。
【００６８】次に、平均分子量8000のポリエチレングリ
コール４ｋｇと硫酸アンモニウム10ｋｇをセルラーゼ濾
液に加えた。混合物を18時間に亘りオーバーヘッドミキ
サー中で混合した。混合後、18時間におよび相を分離さ
せた。相を分離したままにするように底の排出口から底
の相を除去した。ＰＥＧ相を採集し、30分間に亘り5,00
0 ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。ＥＧ Ｉ
ＩＩ活性はポリエチレングリコール溶液中において安定
である。
コール４ｋｇと硫酸アンモニウム10ｋｇをセルラーゼ濾
液に加えた。混合物を18時間に亘りオーバーヘッドミキ
サー中で混合した。混合後、18時間におよび相を分離さ
せた。相を分離したままにするように底の排出口から底
の相を除去した。ＰＥＧ相を採集し、30分間に亘り5,00
0 ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。ＥＧ Ｉ
ＩＩ活性はポリエチレングリコール溶液中において安定
である。
【００６９】ポリエチレングリコールからのタンパク質
の除去は、ポリエチレングリコールはエタノールに溶性
であり、タンパク質は溶性ではないという事実を利用す
るものである。この段階において、ある塩も除去し、タ
ンパク質を濃縮させている。ＰＥＧ相のアリコート200
ｍｌおよび冷たい（−20℃）エタノール800 ｍｌを１リ
ットルの遠心分離ボトル中でよく混合し、−20℃で約18
時間に亘り放置した。混合物を30分間に亘り5,000 ｘｇ
で遠心分離し、溶液にデカンテーションを行ない、沈殿
物を脱イオン水で濯いだ。
の除去は、ポリエチレングリコールはエタノールに溶性
であり、タンパク質は溶性ではないという事実を利用す
るものである。この段階において、ある塩も除去し、タ
ンパク質を濃縮させている。ＰＥＧ相のアリコート200
ｍｌおよび冷たい（−20℃）エタノール800 ｍｌを１リ
ットルの遠心分離ボトル中でよく混合し、−20℃で約18
時間に亘り放置した。混合物を30分間に亘り5,000 ｘｇ
で遠心分離し、溶液にデカンテーションを行ない、沈殿
物を脱イオン水で濯いだ。
【００７０】沈殿したタンパク質を溶解させる緩衝液の
選択は、それに続くクロマトグラフィー工程か、または
最終工程の場合にはＥＧ ＩＩＩが多い溶液を調製する
工程に依存する。一般的に、緩衝液は、陽イオン交換ク
ロマトグラフィーの調製において、ｐＨ５の50ｍＭ酢酸
塩、またはｐＨ４の10ｍＭクエン酸リン酸のいずれかで
ある。
選択は、それに続くクロマトグラフィー工程か、または
最終工程の場合にはＥＧ ＩＩＩが多い溶液を調製する
工程に依存する。一般的に、緩衝液は、陽イオン交換ク
ロマトグラフィーの調製において、ｐＨ５の50ｍＭ酢酸
塩、またはｐＨ４の10ｍＭクエン酸リン酸のいずれかで
ある。
【００７１】ＰＥＧ抽出物の回収は、ＲＢＢ−ＣＭＣ活
性に基づいて測定でき、合計容量を以下に示す。ＲＢＢ
−ＣＭＣ活性を測定する方法を実施例３に記載する。
性に基づいて測定でき、合計容量を以下に示す。ＲＢＢ
−ＣＭＣ活性を測定する方法を実施例３に記載する。
【表１】
【００７２】活性の回収はＰＥＧ相中への15パーセント
から30パーセントまでの範囲におよぶ。この工程は、出
発物質がＥＧ ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼであ
る場合、合計のエンドグルカナーゼ活性の百分率として
の最高損失を示している。各々のクロマトグラフィーの
工程による損失は、各々の工程について比較により約20
％以下、小さくなる傾向にある。
から30パーセントまでの範囲におよぶ。この工程は、出
発物質がＥＧ ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼであ
る場合、合計のエンドグルカナーゼ活性の百分率として
の最高損失を示している。各々のクロマトグラフィーの
工程による損失は、各々の工程について比較により約20
％以下、小さくなる傾向にある。
【００７３】クロマトグラフィー10ｍＭ、ｐＨ５のクエ
ン酸／リン酸緩衝液に対してオメガシリーズ接線流動8,
000 限外濾過膜（omega series tangential flow 8,000
ultra filtration membrane）（マサチューセッツ州、
ノースボロー、フィルトン テクノロジー社）を用い
て、実施例Ｉから得たＥＧ ＩＩＩが多い溶液であるパ
ート（ｂ）を完全に濾過した（diafiltered ）。溶液
を、平衡状態にある（ｐＨ５、10ｍＭ クエン酸／リン
酸）ＳＰトリスアクリルカラムに装填し、通過した溶液
（flow-through）を集積し、0.5 Ｍのクエン酸によりｐ
Ｈを４に調節した。通過した溶液を平衡状態にある（ｐ
Ｈ４、10ｍＭ クエン酸／リン酸）ＳＰトリスアクリル
カナムに装填した。ＥＧ ＩＩＩ成分を250 ｍＭの塩化
ナトリウムにより溶離させた。
ン酸／リン酸緩衝液に対してオメガシリーズ接線流動8,
000 限外濾過膜（omega series tangential flow 8,000
ultra filtration membrane）（マサチューセッツ州、
ノースボロー、フィルトン テクノロジー社）を用い
て、実施例Ｉから得たＥＧ ＩＩＩが多い溶液であるパ
ート（ｂ）を完全に濾過した（diafiltered ）。溶液
を、平衡状態にある（ｐＨ５、10ｍＭ クエン酸／リン
酸）ＳＰトリスアクリルカラムに装填し、通過した溶液
（flow-through）を集積し、0.5 Ｍのクエン酸によりｐ
Ｈを４に調節した。通過した溶液を平衡状態にある（ｐ
Ｈ４、10ｍＭ クエン酸／リン酸）ＳＰトリスアクリル
カナムに装填した。ＥＧ ＩＩＩ成分を250 ｍＭの塩化
ナトリウムにより溶離させた。
【実施例２】
【００７４】分画によるＥＧ ＩＩＩの精製
野生型トリコデルマ リーセイにより産生される完全菌
類セルラーゼ組成物 （シトラーゼ１２３、カリフォル
ニア州、サウスサンフランシスコ、ジェネンカー イン
ターナショナル社から得られる）を分画することによ
り、ＥＧ ＩＩＩの精製を行なう。具体的には、以下の
樹脂：シグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）
から得られるセファデックスＧ−２５濾過樹脂、ＩＢＦ
バイオテクニクス社（メリーランド州、サベージ）から
得られるＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂およびＳ
Ｐトリスアクリル陽イオン交換樹脂を含有するカラムを
用いて分画を行なう。10ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
によりｐＨ6.8 に緩衝された３リットルのセファデック
スＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて0.5 ｇのシト
ラーゼ１２３セルラーゼを脱塩させる。次いで脱塩した
溶液を、10ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ6.
8 に緩衝された20ｍｌのＱＡトリスアクリルＭ陰イオン
交換樹脂のカラムに装填する。このカラムに結合した分
画はＣＢＨ ＩおよびＥＧ Ｉを含有していた。このカ
ラムに結合しなかった分画はＣＢＨ ＩＩ、ＥＧ ＩＩ
およびＥＧＩＩＩを含有している。10ｍＭ クエン酸ナ
トリウムによりｐＨ4.5 に緩衝したセファデックスＧ−
２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて、これらの分画を脱
塩する。この溶液200 ｍｌを、20ｍｌのＳＰトリスアク
リルＭ陽イオン交換樹脂のカラムに装填する。200 ｍＭ
塩化ナトリウムの水溶液100 ｍｌによりＥＧ ＩＩＩ
を溶離させた。
類セルラーゼ組成物 （シトラーゼ１２３、カリフォル
ニア州、サウスサンフランシスコ、ジェネンカー イン
ターナショナル社から得られる）を分画することによ
り、ＥＧ ＩＩＩの精製を行なう。具体的には、以下の
樹脂：シグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）
から得られるセファデックスＧ−２５濾過樹脂、ＩＢＦ
バイオテクニクス社（メリーランド州、サベージ）から
得られるＱＡトリスアクリル陰イオン交換樹脂およびＳ
Ｐトリスアクリル陽イオン交換樹脂を含有するカラムを
用いて分画を行なう。10ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
によりｐＨ6.8 に緩衝された３リットルのセファデック
スＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて0.5 ｇのシト
ラーゼ１２３セルラーゼを脱塩させる。次いで脱塩した
溶液を、10ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ6.
8 に緩衝された20ｍｌのＱＡトリスアクリルＭ陰イオン
交換樹脂のカラムに装填する。このカラムに結合した分
画はＣＢＨ ＩおよびＥＧ Ｉを含有していた。このカ
ラムに結合しなかった分画はＣＢＨ ＩＩ、ＥＧ ＩＩ
およびＥＧＩＩＩを含有している。10ｍＭ クエン酸ナ
トリウムによりｐＨ4.5 に緩衝したセファデックスＧ−
２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて、これらの分画を脱
塩する。この溶液200 ｍｌを、20ｍｌのＳＰトリスアク
リルＭ陽イオン交換樹脂のカラムに装填する。200 ｍＭ
塩化ナトリウムの水溶液100 ｍｌによりＥＧ ＩＩＩ
を溶離させた。
【００７５】ＥＧ ＩＩＩをさらに精製する方法の１つ
は、この実施例２により得られたＥＧ ＩＩＩ試料をさ
らに分画することにより行なわれる。Ｍｏｎｏ−Ｓ−Ｈ
Ｒ ５／５カラム（ニュージャージー州、ピスキャタウ
ェイ、ファーマシア ＬＫＢバイオテクノロジー社から
得られる）を用いてＦＰＬＣシステムにより分画を行な
った。ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコ
ントローラ、２つのポンプ、二重通路モニター、分画コ
ントローラおよびチャートレコーダ（全てニュージャー
ジー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア ＬＫＢバイ
オテクノロジー社から得られる）からなる。事前に10ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウムによりｐＨ４に緩衝しておいた
20ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムを用いてこの実
施例２で調製した５ｍｌのＥＧ ＩＩＩ試料を脱塩する
ことにより分画を行なった。事前に10ｍＭ クエン酸ナ
トリウムでｐＨ4.0 に緩衝しておいたＭｏｎｏ−Ｓ−Ｈ
Ｒ ５／５カラムにその溶液を装填し、0.5 ｍｌ／分の
速度で０−200 ｍＭのＮａＣｌの水溶液勾配により溶離
させ、１ｍｌの分画に試料を集積した。分画１０および
１１においてＥＧ ＩＩＩを回収した。ゲル電気泳動に
よりこのＥＧ ＩＩＩは90％より大きく純粋であること
が測定された。この純度のＥＧ ＩＩＩは既知の技術に
よるＮ末端アミノ酸配列を決定するのに適している。
は、この実施例２により得られたＥＧ ＩＩＩ試料をさ
らに分画することにより行なわれる。Ｍｏｎｏ−Ｓ−Ｈ
Ｒ ５／５カラム（ニュージャージー州、ピスキャタウ
ェイ、ファーマシア ＬＫＢバイオテクノロジー社から
得られる）を用いてＦＰＬＣシステムにより分画を行な
った。ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコ
ントローラ、２つのポンプ、二重通路モニター、分画コ
ントローラおよびチャートレコーダ（全てニュージャー
ジー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア ＬＫＢバイ
オテクノロジー社から得られる）からなる。事前に10ｍ
Ｍ クエン酸ナトリウムによりｐＨ４に緩衝しておいた
20ｍｌのセファデックスＧ−２５カラムを用いてこの実
施例２で調製した５ｍｌのＥＧ ＩＩＩ試料を脱塩する
ことにより分画を行なった。事前に10ｍＭ クエン酸ナ
トリウムでｐＨ4.0 に緩衝しておいたＭｏｎｏ−Ｓ−Ｈ
Ｒ ５／５カラムにその溶液を装填し、0.5 ｍｌ／分の
速度で０−200 ｍＭのＮａＣｌの水溶液勾配により溶離
させ、１ｍｌの分画に試料を集積した。分画１０および
１１においてＥＧ ＩＩＩを回収した。ゲル電気泳動に
よりこのＥＧ ＩＩＩは90％より大きく純粋であること
が測定された。この純度のＥＧ ＩＩＩは既知の技術に
よるＮ末端アミノ酸配列を決定するのに適している。
【００７６】実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩは、トリコデ
ルマ リーセイから単離した他のエンドグルカナーゼと
匹敵する以下の特性を有している。
ルマ リーセイから単離した他のエンドグルカナーゼと
匹敵する以下の特性を有している。
【表２】
【００７７】上記表から分かるように、トリコデルマ
リーセイの他のエンドグルカナーゼ成分と比較して、Ｅ
Ｇ ＩＩＩは大きいｐＨ最適値および大きいｐＩの両方
を有する。下記の実施例３において、ＥＧ ＩＩＩはア
ルカリｐＨの条件下で相当なＲＢＢ−ＣＭＣ活性を保持
することが分かる。
リーセイの他のエンドグルカナーゼ成分と比較して、Ｅ
Ｇ ＩＩＩは大きいｐＨ最適値および大きいｐＩの両方
を有する。下記の実施例３において、ＥＧ ＩＩＩはア
ルカリｐＨの条件下で相当なＲＢＢ−ＣＭＣ活性を保持
することが分かる。
【００７８】同様に、他の菌株を含む他の供給源から得
たＥＧ ＩＩＩセルラーゼも上記方法により精製するこ
とができる。トリコデルマ ビリデ由来のＥＧ ＩＩＩ
セルラーゼが、Voragen 等のMethods in Enzymology 、
160:243-249 に記載されている。この参考文献は、約2
3.5キロダルトンの分子量、5.5 のｐＨ最適値、および
7.7 のｐＩを有するＥＧ ＩＩＩセルラーゼを記載して
いる。
たＥＧ ＩＩＩセルラーゼも上記方法により精製するこ
とができる。トリコデルマ ビリデ由来のＥＧ ＩＩＩ
セルラーゼが、Voragen 等のMethods in Enzymology 、
160:243-249 に記載されている。この参考文献は、約2
3.5キロダルトンの分子量、5.5 のｐＨ最適値、および
7.7 のｐＩを有するＥＧ ＩＩＩセルラーゼを記載して
いる。
【００７９】ＥＧ ＩＩＩの単離効率を高めるために、
ＥＧ ＩＩＩを過剰発現するようにおよび／または１つ
以上のＥＧ Ｉ成分、ＥＧ ＩＩ成分、ＣＢＨ Ｉ成分
および／またはＣＢＨＩＩ成分を産生できないように、
遺伝子的に修飾したトリコデルマ リーセイを用いるこ
とが望ましいと思われる。
ＥＧ ＩＩＩを過剰発現するようにおよび／または１つ
以上のＥＧ Ｉ成分、ＥＧ ＩＩ成分、ＣＢＨ Ｉ成分
および／またはＣＢＨＩＩ成分を産生できないように、
遺伝子的に修飾したトリコデルマ リーセイを用いるこ
とが望ましいと思われる。
【００８０】同様に、上述したＥＧ ＩＩＩ組成物をさ
らに精製することが望ましいと思われる。例えば、実施
例１において単離したＥＧ ＩＩＩタンパク質を、上述
した方法によりさらに精製することもでき、またはその
逆を行なうこともできる。
らに精製することが望ましいと思われる。例えば、実施
例１において単離したＥＧ ＩＩＩタンパク質を、上述
した方法によりさらに精製することもでき、またはその
逆を行なうこともできる。
【実施例３】
【００８１】あるｐＨ範囲に亘るセルラーゼ組成物の活
性 以下の方法を用いて、２つの異なるセルラーゼ組成物の
ｐＨプロファイルを求めた。最初のセルラーゼ組成物
は、ＣＢＨ Ｉ成分およびＣＢＨ ＩＩ成分を産生でき
ないように、以下に記載する方法と同様な方法で遺伝子
的に修飾したトリコデルマ リーセイから調製したＣＢ
Ｈ ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼ組成物であっ
た。約58パーセントから約70パーセントまでの範囲のト
リコデルマ リーセイ由来のセルラーゼ組成物から一般
的になるこのセルラーゼ組成物は、ＣＢＨ ＩおよびＣ
ＢＨ ＩＩを含有しないかぎり、このセルラーゼ組成物
は必然的にＥＧ成分を多く含んでいる。ＥＧ ＩＩＩは
トリコデルマリーセイのエンドグルカナーゼ成分の最も
少ない成分であるので、この組成物においてはＥＧ Ｉ
成分およびＥＧ ＩＩ成分が優位を占めている。
性 以下の方法を用いて、２つの異なるセルラーゼ組成物の
ｐＨプロファイルを求めた。最初のセルラーゼ組成物
は、ＣＢＨ Ｉ成分およびＣＢＨ ＩＩ成分を産生でき
ないように、以下に記載する方法と同様な方法で遺伝子
的に修飾したトリコデルマ リーセイから調製したＣＢ
Ｈ ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼ組成物であっ
た。約58パーセントから約70パーセントまでの範囲のト
リコデルマ リーセイ由来のセルラーゼ組成物から一般
的になるこのセルラーゼ組成物は、ＣＢＨ ＩおよびＣ
ＢＨ ＩＩを含有しないかぎり、このセルラーゼ組成物
は必然的にＥＧ成分を多く含んでいる。ＥＧ ＩＩＩは
トリコデルマリーセイのエンドグルカナーゼ成分の最も
少ない成分であるので、この組成物においてはＥＧ Ｉ
成分およびＥＧ ＩＩ成分が優位を占めている。
【００８２】第２のセルラーゼ組成物は、実施例２と同
様な精製方法によりトリコデルマ リーセイ由来のセル
ラーゼ組成物から単離したＥＧ ＩＩＩの約20−40％の
純粋な分画であった。
様な精製方法によりトリコデルマ リーセイ由来のセル
ラーゼ組成物から単離したＥＧ ＩＩＩの約20−40％の
純粋な分画であった。
【００８３】これらのセルラーゼ組成物の活性を40℃で
測定した。この測定は以下の方法を用いて行なったもの
である。
測定した。この測定は以下の方法を用いて行なったもの
である。
【００８４】必須の量の酵素を提供するのに十分な濃度
の、５μｌから20μｌまでの範囲の適切な酵素溶液を最
終溶液に加える。ｐＨ４、５、５.５、６、６.５、７、
７.５および８で0.05Ｍ クエン酸／リン酸緩衝液中
に、２重量パーセントの250 μｌのＲＢＢ−ＣＭＣ（レ
マゾル ブリリアント ブルー Ｒ−カルボキシメチル
セルロース；オーストラリア国、２１５１、Ｎ．Ｓ．
Ｗ．、ノースロック、６アルトナプレース、メガザイム
から市販されている）を加える。
の、５μｌから20μｌまでの範囲の適切な酵素溶液を最
終溶液に加える。ｐＨ４、５、５.５、６、６.５、７、
７.５および８で0.05Ｍ クエン酸／リン酸緩衝液中
に、２重量パーセントの250 μｌのＲＢＢ−ＣＭＣ（レ
マゾル ブリリアント ブルー Ｒ−カルボキシメチル
セルロース；オーストラリア国、２１５１、Ｎ．Ｓ．
Ｗ．、ノースロック、６アルトナプレース、メガザイム
から市販されている）を加える。
【００８５】ボルテックス混合（vortex）し、30分間に
亘り40℃で定温放置する。氷浴中で５分間から10分間ま
での期間に亘り冷却する。0.3 Ｍの酢酸ナトリウムおよ
び0.02Ｍの酢酸亜鉛を含有する1000μｌのメチルセロソ
ルブを加える。ボルテックス混合し、５分間から10分間
までの期間に亘り放置する。遠心分離し、キュベット中
に上澄を注ぎ入れる。
亘り40℃で定温放置する。氷浴中で５分間から10分間ま
での期間に亘り冷却する。0.3 Ｍの酢酸ナトリウムおよ
び0.02Ｍの酢酸亜鉛を含有する1000μｌのメチルセロソ
ルブを加える。ボルテックス混合し、５分間から10分間
までの期間に亘り放置する。遠心分離し、キュベット中
に上澄を注ぎ入れる。
【００８６】各々のキュベット中において溶液の光学密
度（ＯＤ）を590 ｎｍで測定することにより、相対酵素
活性を求めた。光学濃度が高いほど、酵素活性が高い。
度（ＯＤ）を590 ｎｍで測定することにより、相対酵素
活性を求めた。光学濃度が高いほど、酵素活性が高い。
【００８７】この分析の結果を第１図に示す。この図面
は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ組成物と比較したＣＢＨ
ＩおよびＩＩが欠失したセルラーゼ組成物の相対活性を
示すものである。この図面より、ＣＢＨ ＩおよびＣＢ
Ｈ ＩＩの欠失したセルラーゼ組成物は、ｐＨ５.５付
近でＲＢＢ−ＣＭＣに対して最適セルロース分解活性を
有し、アルカリ性のｐＨ、すなわち、７を越えて８まで
のｐＨにおいてある程度活性を有することが分かる。一
方で、ＥＧＩＩＩの多いセルラーゼ組成物はほぼｐＨ
５.５−６において最適セルロース分解活性を有し、ア
ルカリ性のｐＨでも相当な活性を有している。
は、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ組成物と比較したＣＢＨ
ＩおよびＩＩが欠失したセルラーゼ組成物の相対活性を
示すものである。この図面より、ＣＢＨ ＩおよびＣＢ
Ｈ ＩＩの欠失したセルラーゼ組成物は、ｐＨ５.５付
近でＲＢＢ−ＣＭＣに対して最適セルロース分解活性を
有し、アルカリ性のｐＨ、すなわち、７を越えて８まで
のｐＨにおいてある程度活性を有することが分かる。一
方で、ＥＧＩＩＩの多いセルラーゼ組成物はほぼｐＨ
５.５−６において最適セルロース分解活性を有し、ア
ルカリ性のｐＨでも相当な活性を有している。
【実施例４】
【００８８】等電点電気泳動ゲル
この実施例の目的は、異なるＥＧ ＩＩＩセルラーゼ組
成物の等電点電気泳動ゲルを説明することにある。具体
的には、野生型トリコデルマ リーセイにより産生され
たセルラーゼ；ＥＧ ＩおよびＥＧ ＩＩのセルラーゼ
タンパク質を発現できないように実施例１６および１７
の方法により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株
由来のセルラーゼ；および実施例１の方法と同様な方法
により産生した実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
を等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。
成物の等電点電気泳動ゲルを説明することにある。具体
的には、野生型トリコデルマ リーセイにより産生され
たセルラーゼ；ＥＧ ＩおよびＥＧ ＩＩのセルラーゼ
タンパク質を発現できないように実施例１６および１７
の方法により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株
由来のセルラーゼ；および実施例１の方法と同様な方法
により産生した実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセルラーゼ
を等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。
【００８９】製造者の説明にしたがって、ファーマシア
ＩＥＦシステム（ニュージャージー州、ピスキャタウェ
イ、ファーマシア社、ＦＢＥ−３０００）およびｐＨ３
−１０プレキャストゲル（ドイツ、カールベルグ、サー
バから得られるサーバリト プレコテ）を用いて、これ
らのセルラーゼ試料を等電点電気泳動により分析した。
ゲルをエフォルテック（登録商標）染料（11590 ニュー
ヨーク州、ウエストバリー、サーバ ファイン バイオ
ケミカルス社から得られるサーバブルーＷ）により染色
し、タンパク質のバンドを視覚化した。得られたゲルを
第２図に示す。第２図のレーン１は、野生型トリコデル
マ リーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲ
ルを示している。レーン２は、ＥＧ ＩおよびＩＩを発
現できないように遺伝子的に修飾したトリコデルマ リ
ーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示
している。レーン３は、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセ
ルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。この図面
において、レーン１に隣接する縁に、タンパク質を同定
するようにセルラーゼタンパク質に対応するバンドを記
載している。
ＩＥＦシステム（ニュージャージー州、ピスキャタウェ
イ、ファーマシア社、ＦＢＥ−３０００）およびｐＨ３
−１０プレキャストゲル（ドイツ、カールベルグ、サー
バから得られるサーバリト プレコテ）を用いて、これ
らのセルラーゼ試料を等電点電気泳動により分析した。
ゲルをエフォルテック（登録商標）染料（11590 ニュー
ヨーク州、ウエストバリー、サーバ ファイン バイオ
ケミカルス社から得られるサーバブルーＷ）により染色
し、タンパク質のバンドを視覚化した。得られたゲルを
第２図に示す。第２図のレーン１は、野生型トリコデル
マ リーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲ
ルを示している。レーン２は、ＥＧ ＩおよびＩＩを発
現できないように遺伝子的に修飾したトリコデルマ リ
ーセイ菌株由来のセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示
している。レーン３は、実質的に純粋なＥＧ ＩＩＩセ
ルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。この図面
において、レーン１に隣接する縁に、タンパク質を同定
するようにセルラーゼタンパク質に対応するバンドを記
載している。
【００９０】この図面から、ＥＧ ＩＩＩのｐＩが大き
いので、このタンパク質は、ｐＩの大きいキシラナー
ゼ、ｐＩの大きいβ−グルコシダーゼのような他のｐＩ
の大きい成分と通常関連する領域に見られるのが分か
る。さらに、この図面のレーン２には、ＥＧ Ｉおよび
ＩＩのタンパク質は存在しないがＥＧ ＩＩＩタンパク
質は存在するので、ＥＧ ＩＩＩはＥＧ ＩまたはＥＧ
ＩＩのタンパク質のいずれの分解生成物ではないこと
がこの図面から分かる。
いので、このタンパク質は、ｐＩの大きいキシラナー
ゼ、ｐＩの大きいβ−グルコシダーゼのような他のｐＩ
の大きい成分と通常関連する領域に見られるのが分か
る。さらに、この図面のレーン２には、ＥＧ Ｉおよび
ＩＩのタンパク質は存在しないがＥＧ ＩＩＩタンパク
質は存在するので、ＥＧ ＩＩＩはＥＧ ＩまたはＥＧ
ＩＩのタンパク質のいずれの分解生成物ではないこと
がこの図面から分かる。
【実施例５】
【００９１】ＥＧ ＩＩＩのペプチド配列決定
0.9 ｍｌのアセトンを0.1 ｍｌのタンパク質溶液（１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で）に加えることによりＥＧ ＩＩＩ成
分を沈殿させ、−20℃で10分間に亘り定温放置した。遠
心分離によりタンパク質を集積し、集積物を乾燥させて
ペレット化し、88％のぎ酸中に溶解させた８Ｍ 尿素溶
液0.01ｍｌおよび88％のぎ酸中に溶解させた臭化シアン
（200 ｍｇ／ｍｌ）溶液0.01ｍｌ中に再懸濁させた。混
合物を４時間に亘り室温で定温放置した。
ｇ／ｍｌの濃度で）に加えることによりＥＧ ＩＩＩ成
分を沈殿させ、−20℃で10分間に亘り定温放置した。遠
心分離によりタンパク質を集積し、集積物を乾燥させて
ペレット化し、88％のぎ酸中に溶解させた８Ｍ 尿素溶
液0.01ｍｌおよび88％のぎ酸中に溶解させた臭化シアン
（200 ｍｇ／ｍｌ）溶液0.01ｍｌ中に再懸濁させた。混
合物を４時間に亘り室温で定温放置した。
【００９２】個々のペプチドをＨＰＬＣ（高圧液体クロ
マトグラフィー）カラムを用いて精製した。シンクロパ
ックＲＰ−４カラムを、脱イオンしたミリＱ水（milli
Q）中で0.05％のＴＥＡ（トリエチルアミノ）および0.0
5％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により平衡状態させ
た。試料をＨＰＬＣカラムに装填し、100 ％のアセトニ
トリルおよび0.05％のＴＥＡ並びに0.05％のＴＦＡによ
り、１分当たり１％の勾配で溶離を行なった。単離した
ペプチドのアミノ末端領域を、全自動装置を用いたエド
マンの方法により配列分析した。ＥＧ ＩＩＩ成分の２
つの断片から得られたアミノ酸配列を第３図に示す。
マトグラフィー）カラムを用いて精製した。シンクロパ
ックＲＰ−４カラムを、脱イオンしたミリＱ水（milli
Q）中で0.05％のＴＥＡ（トリエチルアミノ）および0.0
5％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により平衡状態させ
た。試料をＨＰＬＣカラムに装填し、100 ％のアセトニ
トリルおよび0.05％のＴＥＡ並びに0.05％のＴＦＡによ
り、１分当たり１％の勾配で溶離を行なった。単離した
ペプチドのアミノ末端領域を、全自動装置を用いたエド
マンの方法により配列分析した。ＥＧ ＩＩＩ成分の２
つの断片から得られたアミノ酸配列を第３図に示す。
【実施例６】
【００９３】トリコデルマ リーセイのｐｙｒ４−誘導
体の選択 ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素であ
るオロチジン−５′−モノホスフェートデカルボキシラ
ーゼをコード化する。毒性阻害因子５−フルオロオロチ
ン酸（ＦＯＡ）を野生型細胞によりウリジン中に取り込
み、細胞を被毒させる。しかしながら、ｐｙｒ４遺伝子
が欠けた細胞は、この阻害因子に対して抵抗性を有する
が、成長のめたにウリジンを必要としている。したがっ
て、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４誘導体菌株を選択すること
が可能である。実際、トリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ
−３７の芽胞（Sheir-Neiss,G.およびMontenecourt,B.
S. 、Appl. Microbiol. Biotechnol. 20 、46-53 頁（1
984））を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび1.2 ｍｇ／
ｍｌのＦＯＡを含有する凝固培地の表面に広げた。任意
のＦＯＡ抵抗性コロニーが３日から４日以内に現れ、成
長のためにウリジンを必要としたそれらのＦＯＡ抵抗性
誘導体を続いて同定することが可能であった。欠損ｐｙ
ｒ４遺伝子を有するそれらの誘導体を同定するために、
プロトプラストを産生し、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含有
するプラスミドにより形質転換した（実施例８および９
を参照のこと）。形質転換後、ウリジンを欠いた培地上
にプロトプラストを平板固定（plate ）した。形質転換
したコロニーの成長は、プラスミドボーン（plasmid-bo
rne ）ｐｙｒ４遺伝子により欠損ｐｒｙ４遺伝子の相補
性を示した。このようにして、菌株ＧＣ６９を菌株ＲＬ
−Ｐ３７のｐｙｒ４−誘導体として同定した。
体の選択 ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素であ
るオロチジン−５′−モノホスフェートデカルボキシラ
ーゼをコード化する。毒性阻害因子５−フルオロオロチ
ン酸（ＦＯＡ）を野生型細胞によりウリジン中に取り込
み、細胞を被毒させる。しかしながら、ｐｙｒ４遺伝子
が欠けた細胞は、この阻害因子に対して抵抗性を有する
が、成長のめたにウリジンを必要としている。したがっ
て、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４誘導体菌株を選択すること
が可能である。実際、トリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ
−３７の芽胞（Sheir-Neiss,G.およびMontenecourt,B.
S. 、Appl. Microbiol. Biotechnol. 20 、46-53 頁（1
984））を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび1.2 ｍｇ／
ｍｌのＦＯＡを含有する凝固培地の表面に広げた。任意
のＦＯＡ抵抗性コロニーが３日から４日以内に現れ、成
長のためにウリジンを必要としたそれらのＦＯＡ抵抗性
誘導体を続いて同定することが可能であった。欠損ｐｙ
ｒ４遺伝子を有するそれらの誘導体を同定するために、
プロトプラストを産生し、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含有
するプラスミドにより形質転換した（実施例８および９
を参照のこと）。形質転換後、ウリジンを欠いた培地上
にプロトプラストを平板固定（plate ）した。形質転換
したコロニーの成長は、プラスミドボーン（plasmid-bo
rne ）ｐｙｒ４遺伝子により欠損ｐｒｙ４遺伝子の相補
性を示した。このようにして、菌株ＧＣ６９を菌株ＲＬ
−Ｐ３７のｐｙｒ４−誘導体として同定した。
【実施例７】
【００９４】ＣＢＨ Ｉ欠失ベクターの調製
ＣＢＨ Ｉタンパク質をコード化するｃｂｈ１遺伝子
を、既知のプローブ合成方法（Shoemaker 等、1983b ）
を用いてこの遺伝子の公表されている配列に基づいて設
計したオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイ
ゼーションにより、トリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ−
Ｐ３７のゲノムＤＮＡからクローニングした。ｃｂｈ１
遺伝子は6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片上にあり、ＰｓｔＩに
より切断したｐＵＣ４Ｋ （ニュージャージー州、ピス
キャタウェイ、ファーマシア社から購入した）中に挿入
し、従来技術で知られている技術を用いてこのベクター
のＫａｎΓ を置換した。この技術は、Maniatis等（19
89）に述べられており、ここに引用する。得られたプラ
スミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１をＨｉｎｄＩＩＩにより
切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、再度連結して
ｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈを得た（第４図を参照
のこと）。この方法により、全縁ｃｂｈ１コード配列お
よび上流の約1.2 ｋｂのフランキング配列（flanking s
equence ）ならびに下流の約1.5 ｋｂのフランキング配
列を除去した。元のＰｓｔＩ断片のいずれかの末端から
ほぼ１ｋｂのフランキングＤＮＡが残っている。
を、既知のプローブ合成方法（Shoemaker 等、1983b ）
を用いてこの遺伝子の公表されている配列に基づいて設
計したオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイ
ゼーションにより、トリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ−
Ｐ３７のゲノムＤＮＡからクローニングした。ｃｂｈ１
遺伝子は6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片上にあり、ＰｓｔＩに
より切断したｐＵＣ４Ｋ （ニュージャージー州、ピス
キャタウェイ、ファーマシア社から購入した）中に挿入
し、従来技術で知られている技術を用いてこのベクター
のＫａｎΓ を置換した。この技術は、Maniatis等（19
89）に述べられており、ここに引用する。得られたプラ
スミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１をＨｉｎｄＩＩＩにより
切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、再度連結して
ｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈを得た（第４図を参照
のこと）。この方法により、全縁ｃｂｈ１コード配列お
よび上流の約1.2 ｋｂのフランキング配列（flanking s
equence ）ならびに下流の約1.5 ｋｂのフランキング配
列を除去した。元のＰｓｔＩ断片のいずれかの末端から
ほぼ１ｋｂのフランキングＤＮＡが残っている。
【００９５】Maniatis等（前出）の方法にしたがって、
ｐＵＣ１８中のゲノムＤＮＡの6.5 ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片としてトリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を
クローニングしてｐＴｐｙｒ２（Smith 等、1991）を形
成した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈＩΔＨ／Ｈを
ＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、末端をウシ腸アルカリ性
ホスファターゼにより脱リンした。この末端脱リンＤＮ
Ａを、トリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有す
る6.5 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨ
Ｉｐｙｒ４を得た。第４図はこのプラスミドの構築を示
している。
ｐＵＣ１８中のゲノムＤＮＡの6.5 ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片としてトリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を
クローニングしてｐＴｐｙｒ２（Smith 等、1991）を形
成した。プラスミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈＩΔＨ／Ｈを
ＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、末端をウシ腸アルカリ性
ホスファターゼにより脱リンした。この末端脱リンＤＮ
Ａを、トリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有す
る6.5 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨ
Ｉｐｙｒ４を得た。第４図はこのプラスミドの構築を示
している。
【実施例８】
【００９６】プロトプラストの単離
約５×10７ のトリコデルマ リーセイＧＣ６９芽胞
（ｐｙｒ４−誘導体菌株）を有する500 ｍｌのフラスコ
中の100 ｍｌのＹＥＧ（0.5 ％の酵母抽出物、２％のグ
ルコース）を接種することにより、菌糸を得た。約16時
間に亘り振とうさせながらフラスコを37℃で定温放置し
た。2,750 ｘｇでの遠心分離により菌糸を収穫した。収
穫した菌糸をさらに1.2 Ｍのソルビトール溶液中で洗浄
し、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム（登録商標）２３４溶液
（コネチカット州、ダンバリー、ノボ バイオラボ社か
ら得られる、１，３−アルファ−グルカナーゼ、１，３
−ベータ−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナー
ゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵
素系の商標名である）；５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ４・７
Ｈ２ Ｏ；0.5 ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；1.2
Ｍのソルビトールを含有する40ｍｌの溶液中に再懸濁さ
せた。ミラクロス（カリフォルニア州、ラジョラ、カル
バイオケム社）を通過させる濾過により、細胞ブイヨン
（cellular debris ）からプロトプラストを除去し、2,
000 ｘｇでの遠心分離により採集した。プロトプラスト
を1.2 Ｍのソルビトール中で３回洗浄し、さらにもう一
度1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ２ 中で洗
浄し、遠心分離し、1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣ
ａＣｌ２ の１ｍｌ当たり約２×10８のプロトプラスト
の密度で再懸濁させた。
（ｐｙｒ４−誘導体菌株）を有する500 ｍｌのフラスコ
中の100 ｍｌのＹＥＧ（0.5 ％の酵母抽出物、２％のグ
ルコース）を接種することにより、菌糸を得た。約16時
間に亘り振とうさせながらフラスコを37℃で定温放置し
た。2,750 ｘｇでの遠心分離により菌糸を収穫した。収
穫した菌糸をさらに1.2 Ｍのソルビトール溶液中で洗浄
し、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム（登録商標）２３４溶液
（コネチカット州、ダンバリー、ノボ バイオラボ社か
ら得られる、１，３−アルファ−グルカナーゼ、１，３
−ベータ−グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナー
ゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵
素系の商標名である）；５ｍｇ／ｍｌのＭｇＳＯ４・７
Ｈ２ Ｏ；0.5 ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；1.2
Ｍのソルビトールを含有する40ｍｌの溶液中に再懸濁さ
せた。ミラクロス（カリフォルニア州、ラジョラ、カル
バイオケム社）を通過させる濾過により、細胞ブイヨン
（cellular debris ）からプロトプラストを除去し、2,
000 ｘｇでの遠心分離により採集した。プロトプラスト
を1.2 Ｍのソルビトール中で３回洗浄し、さらにもう一
度1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣａＣｌ２ 中で洗
浄し、遠心分離し、1.2 Ｍのソルビトール、50ｍＭのＣ
ａＣｌ２ の１ｍｌ当たり約２×10８のプロトプラスト
の密度で再懸濁させた。
【実施例９】
【００９７】菌類プロトプラストのｐΔＣＢＨＩｐｙｒ
４による形質転換 実施例８において調製した200 μｌのプロトプラスト懸
濁液を、ＴＥ緩衝液 （10ｍＭのトリス、ｐＨ７.４；
１ｍＭのＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐ
ｙｒ４（実施例７で調製した）20μｌおよび25％のＰＥ
Ｇ４０００と、0.6 ＭのＫＣｌと、50ｍＭのＣａＣｌ２
とを含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液
50μｌに加えた。この混合物を20分間に亘り氷上で定温
放置した。この定温放置の後、2.0 ｍｌの上述したＰＥ
Ｇ溶液をそこに加え、得られた溶液をさらに混合し、５
分間に亘り室温で定温放置した。この第２の定温放置
後、1.2 Ｍのソルビトールおよび50ｍＭのＣａＣｌ２
を含有する溶液4.0 ｍｌをその溶液に加え、これにより
得られた溶液をさらに混合した。そのプロトプラスト溶
液を、１％のグルコース、1.2 Ｍのソルビトールおよび
１％のアガロースを含有するボゲルの培地Ｎの溶融アリ
コート（１リットル当たり、３ｇのクエン酸ナトリウ
ム、５ｇのＫＨ２ＰＯ４ 、２ｇのＮＨ４ＮＯ３、0.2
ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.1 ｇのＣａＣｌ２・７Ｈ
２Ｏ、５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍ
ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＦｅ(ＮＨ４)２・
６Ｈ２Ｏ、0.25ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、50μｇのＭ
ｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ）にただちに加えた。プロトプラス
トと培地の混合物を、上述したボゲルの培地を含有する
固体培地上に注いだ。ウリジンは培地中には存在せず、
したがって、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４中の野生型ｐｙｒ４
遺伝子挿入物による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の
補完の結果として形質転換コロニーのみが成長できた。
これらのコロニーを続いて形質転換し、添加剤として１
％のグルコースを含有する固体のボゲルの培地Ｎ上で精
製し、安定な形質転換体をさらなる分析のために選択し
た。
４による形質転換 実施例８において調製した200 μｌのプロトプラスト懸
濁液を、ＴＥ緩衝液 （10ｍＭのトリス、ｐＨ７.４；
１ｍＭのＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐ
ｙｒ４（実施例７で調製した）20μｌおよび25％のＰＥ
Ｇ４０００と、0.6 ＭのＫＣｌと、50ｍＭのＣａＣｌ２
とを含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液
50μｌに加えた。この混合物を20分間に亘り氷上で定温
放置した。この定温放置の後、2.0 ｍｌの上述したＰＥ
Ｇ溶液をそこに加え、得られた溶液をさらに混合し、５
分間に亘り室温で定温放置した。この第２の定温放置
後、1.2 Ｍのソルビトールおよび50ｍＭのＣａＣｌ２
を含有する溶液4.0 ｍｌをその溶液に加え、これにより
得られた溶液をさらに混合した。そのプロトプラスト溶
液を、１％のグルコース、1.2 Ｍのソルビトールおよび
１％のアガロースを含有するボゲルの培地Ｎの溶融アリ
コート（１リットル当たり、３ｇのクエン酸ナトリウ
ム、５ｇのＫＨ２ＰＯ４ 、２ｇのＮＨ４ＮＯ３、0.2
ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.1 ｇのＣａＣｌ２・７Ｈ
２Ｏ、５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍ
ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＦｅ(ＮＨ４)２・
６Ｈ２Ｏ、0.25ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、50μｇのＭ
ｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ）にただちに加えた。プロトプラス
トと培地の混合物を、上述したボゲルの培地を含有する
固体培地上に注いだ。ウリジンは培地中には存在せず、
したがって、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４中の野生型ｐｙｒ４
遺伝子挿入物による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の
補完の結果として形質転換コロニーのみが成長できた。
これらのコロニーを続いて形質転換し、添加剤として１
％のグルコースを含有する固体のボゲルの培地Ｎ上で精
製し、安定な形質転換体をさらなる分析のために選択し
た。
【００９８】この段階では、より速い成長速度およびウ
リジンを欠如した固体培養物上のでこぼこの外形よりも
むしろ滑らかな円形コロニーの形成により不安定な形質
転換体とは区別される。ある場合には、固体の非選択性
培地（すなわち、ウリジンを含有している）上で形質転
換体を成長させ、続いて発芽してウリジンの欠如した選
択的な培地上に成長するこれらの芽胞の百分率を求め
た。
リジンを欠如した固体培養物上のでこぼこの外形よりも
むしろ滑らかな円形コロニーの形成により不安定な形質
転換体とは区別される。ある場合には、固体の非選択性
培地（すなわち、ウリジンを含有している）上で形質転
換体を成長させ、続いて発芽してウリジンの欠如した選
択的な培地上に成長するこれらの芽胞の百分率を求め
た。
【実施例１０】
【００９９】形質転換体の分析
実施例９で得られた形質転換体を、１％のグルコースを
含有するボゲルの培地Ｎの液体中で成長させた後、ＤＮ
Ａをその形質転換体から単離した。これら形質転換体の
ＤＮＡ試料をさらにＰｓｔＩ制限酵素により切断し、こ
れにアガロースゲルの電気泳動を行なった。そのゲルを
ニトラン膜フィルター上にブロットし、３２Ｐ標識ｐΔ
ＣＢＨＩｐｙｒ４プローブを用いてハイブリダイズさせ
た。プローブを選択して、6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片とし
ての天然ｃｂｈ１遺伝子、天然ｐｙｒ４遺伝子および形
質転換ＤＮＡ断片由来の任意のＤＮＡ配列を同定した。
含有するボゲルの培地Ｎの液体中で成長させた後、ＤＮ
Ａをその形質転換体から単離した。これら形質転換体の
ＤＮＡ試料をさらにＰｓｔＩ制限酵素により切断し、こ
れにアガロースゲルの電気泳動を行なった。そのゲルを
ニトラン膜フィルター上にブロットし、３２Ｐ標識ｐΔ
ＣＢＨＩｐｙｒ４プローブを用いてハイブリダイズさせ
た。プローブを選択して、6.5 ｋｂのＰｓｔＩ断片とし
ての天然ｃｂｈ１遺伝子、天然ｐｙｒ４遺伝子および形
質転換ＤＮＡ断片由来の任意のＤＮＡ配列を同定した。
【０１００】ハイブリダイゼーションからの放射性バン
ドをオートラジオグラフィーにより視覚化した。オート
ラジオグラフを第６図に示す。５つの試料（すなわち、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）について上述したように実験
した。レーンＥは非形質転換菌株ＧＣ６９であり、この
分析においては対照として用いた。レーンＡ−Ｄは、上
述した方法により得られた形質転換体を示すものであ
る。オートラジオグラフの左側の数字は、分子量マーカ
ーの大きさを示すものである。このオートラジオグラフ
から分かるように、レーンＤは6.5 ｋｂのＣＢＨＩバン
ドを有しておらず、ｃｂｈ１遺伝子でのＤＮＡ断片の組
込みによりこの遺伝子が形質転換体中で全体的に欠失さ
れたことを示している。ｃｂｈ１欠失菌株をＰ３７ＰΔ
ＣＢＨＩと称する。第５図は、トリコデルマ リーセイ
染色体のうちの１つのｃｂｈ１座でｐΔＣＢＨＩｐｙｒ
４からの大きなＥｃｏＲＩ断片を二重に交差させて組み
込んだことによるトリコデルマ リーセイｃｂｈ１遺伝
子の欠失について概略を説明したものである。分析した
他の形質転換体は、非形質転換対照菌株と同一であるよ
うに思われる。
ドをオートラジオグラフィーにより視覚化した。オート
ラジオグラフを第６図に示す。５つの試料（すなわち、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）について上述したように実験
した。レーンＥは非形質転換菌株ＧＣ６９であり、この
分析においては対照として用いた。レーンＡ−Ｄは、上
述した方法により得られた形質転換体を示すものであ
る。オートラジオグラフの左側の数字は、分子量マーカ
ーの大きさを示すものである。このオートラジオグラフ
から分かるように、レーンＤは6.5 ｋｂのＣＢＨＩバン
ドを有しておらず、ｃｂｈ１遺伝子でのＤＮＡ断片の組
込みによりこの遺伝子が形質転換体中で全体的に欠失さ
れたことを示している。ｃｂｈ１欠失菌株をＰ３７ＰΔ
ＣＢＨＩと称する。第５図は、トリコデルマ リーセイ
染色体のうちの１つのｃｂｈ１座でｐΔＣＢＨＩｐｙｒ
４からの大きなＥｃｏＲＩ断片を二重に交差させて組み
込んだことによるトリコデルマ リーセイｃｂｈ１遺伝
子の欠失について概略を説明したものである。分析した
他の形質転換体は、非形質転換対照菌株と同一であるよ
うに思われる。
【実施例１１】
【０１０１】ｐＩｎｔＣＢＨＩによる形質転換体の分析
使用したプローブを３２Ｐ標識ｐＩｎｔＣＢＨＩプロー
ブに変えたことを除いては、実施例１０と同様に方法を
この実施例に用いた。このプローブは、ｐＵＣ４Ｋ：：
ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈが欠失した領域内のｃｂｈ１座からの
２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を含有するｐＵＣ型のプラスミ
ドである。非形質転換菌株ＧＣ６９である対照の試料Ａ
および形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの試料Ｂの２つの
試料をこの実施例で分析した。第７図から分かるよう
に、6.5 ｋｂでのバンドにより示したとおり、試料Ａは
ｃｂｈ１遺伝子を有した。しかしながら、形質転換体で
ある試料Ｂはこの6.5 ｋｂのバンドを有しておらず、し
たがって、ｃｂｈ１遺伝子を有しておらず、ｐＵＣプラ
スミド由来の配列をなにも有していない。
ブに変えたことを除いては、実施例１０と同様に方法を
この実施例に用いた。このプローブは、ｐＵＣ４Ｋ：：
ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈが欠失した領域内のｃｂｈ１座からの
２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を含有するｐＵＣ型のプラスミ
ドである。非形質転換菌株ＧＣ６９である対照の試料Ａ
および形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの試料Ｂの２つの
試料をこの実施例で分析した。第７図から分かるよう
に、6.5 ｋｂでのバンドにより示したとおり、試料Ａは
ｃｂｈ１遺伝子を有した。しかしながら、形質転換体で
ある試料Ｂはこの6.5 ｋｂのバンドを有しておらず、し
たがって、ｃｂｈ１遺伝子を有しておらず、ｐＵＣプラ
スミド由来の配列をなにも有していない。
【実施例１２】
【０１０２】菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩによるタンパク質
分泌 １％のグルコース、0.14％の(ＮＨ４)２ＳＯ４ 、0.2
％のＫＨ２ＰＯ４、0.03％のＭｇＳＯ４、0.03％の尿
素、0.75％のバクトトリプトン（bactotryptone ）、0.
05％のＴｗｅｅｎ８０、0.000016％のＣｕＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ、0.001 ％のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.000128％の
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.0000054 ％のＮａ２ＭｏＯ４
・２Ｈ２Ｏ、0.0000007 ％のＭｎＣｌ・４Ｈ２Ｏを含有
するトリコデルマ基本培地50ｍｌ中に産生したＰ３７Ｐ
ΔＣＢＨＩ菌株からの芽胞を接種した。約48時間に亘り
250 ｍｌのフラスコ中で振とうさせながら培地を37℃で
定温放置した。ミラクロス（カルバイオケム社）を通過
させる濾過により、得られた菌糸を採集し、17ｍＭのリ
ン酸カリウムにより２、３回洗浄した。菌糸を最終的に
１ｍＭのソホロース（sophorose ）を含む17ｍＭのリン
酸カリウムの溶液中に懸濁させ、さらに振とうさせなが
ら30℃で24時間に亘り定温放置した。これらの培養液か
ら上澄を採集し、菌糸を捨てた。製造者の説明にしたが
って、ファーマシア ファストゲル システムおよびｐ
Ｈ３−９プレキャスト ゲルを用いた等電点電気泳動に
より培養液の上澄の試料を分析した。ゲルを銀染料で染
色し、タンパク質のバンドを視覚化した。第８図に示す
ように、ｃｂｈ１タンパク質に対応するバンドは、菌株
Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ由来の試料には存在しなかった。こ
の等電点電気泳動ゲルは、トリコデルマ リーセイの異
なる上澄培養液中に様々なタンパク質が存在することを
示している。レーンＡは部分的に精製したＣＢＨＩであ
る。レーンＢは非形質転換トリコデルマ リーセイの培
養液からの上澄である。レーンＣは、本発明の方法によ
り産生した菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄である。
様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ
Ｉ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、およびＥＧＩＩＩと印付けた。
ＣＢＨＩは全体の細胞外タンパク質の50％を構成するの
で、ＣＢＨＩは主要な分泌タンパク質であり、ゲル上で
最も暗いバンドである。この等電点電気泳動ゲルは、Ｐ
３７ＰΔＣＢＨＩ菌株においてはＣＢＨＩタンパク質が
除去されているのを示している。
分泌 １％のグルコース、0.14％の(ＮＨ４)２ＳＯ４ 、0.2
％のＫＨ２ＰＯ４、0.03％のＭｇＳＯ４、0.03％の尿
素、0.75％のバクトトリプトン（bactotryptone ）、0.
05％のＴｗｅｅｎ８０、0.000016％のＣｕＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ、0.001 ％のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.000128％の
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、0.0000054 ％のＮａ２ＭｏＯ４
・２Ｈ２Ｏ、0.0000007 ％のＭｎＣｌ・４Ｈ２Ｏを含有
するトリコデルマ基本培地50ｍｌ中に産生したＰ３７Ｐ
ΔＣＢＨＩ菌株からの芽胞を接種した。約48時間に亘り
250 ｍｌのフラスコ中で振とうさせながら培地を37℃で
定温放置した。ミラクロス（カルバイオケム社）を通過
させる濾過により、得られた菌糸を採集し、17ｍＭのリ
ン酸カリウムにより２、３回洗浄した。菌糸を最終的に
１ｍＭのソホロース（sophorose ）を含む17ｍＭのリン
酸カリウムの溶液中に懸濁させ、さらに振とうさせなが
ら30℃で24時間に亘り定温放置した。これらの培養液か
ら上澄を採集し、菌糸を捨てた。製造者の説明にしたが
って、ファーマシア ファストゲル システムおよびｐ
Ｈ３−９プレキャスト ゲルを用いた等電点電気泳動に
より培養液の上澄の試料を分析した。ゲルを銀染料で染
色し、タンパク質のバンドを視覚化した。第８図に示す
ように、ｃｂｈ１タンパク質に対応するバンドは、菌株
Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ由来の試料には存在しなかった。こ
の等電点電気泳動ゲルは、トリコデルマ リーセイの異
なる上澄培養液中に様々なタンパク質が存在することを
示している。レーンＡは部分的に精製したＣＢＨＩであ
る。レーンＢは非形質転換トリコデルマ リーセイの培
養液からの上澄である。レーンＣは、本発明の方法によ
り産生した菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄である。
様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩ
Ｉ、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、およびＥＧＩＩＩと印付けた。
ＣＢＨＩは全体の細胞外タンパク質の50％を構成するの
で、ＣＢＨＩは主要な分泌タンパク質であり、ゲル上で
最も暗いバンドである。この等電点電気泳動ゲルは、Ｐ
３７ＰΔＣＢＨＩ菌株においてはＣＢＨＩタンパク質が
除去されているのを示している。
【実施例１３】
【０１０３】ｐＰΔＣＢＨＩＩの調製
ＣＢＨＩＩタンパク質をコード化するトリコデルマ リ
ーセイのｃｂｈ２遺伝子を、第９Ａ図に示すゲノムＤＮ
Ａの4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした
（Chen等、1987、Biotechnology 、5:274-278 ）。この
4.1 ｋｂの断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位の間に
挿入した。後者のプラスミドはｐＵＣ誘導体である（ジ
ェネンカー インターナショナル社のR. M. Berka によ
り構築された）。このｐＵＣ誘導体は、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩの順番で並んだ左右対称の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を有する多数のクローニング部位を含んでい
る。従来技術で知られている方法を用いて、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位（ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の74ｂｐの３′）と
ＣｌａＩ部位（ＣＢＨＩＩの最後のコドンの265 ｂｐの
３′）との間のこの遺伝子の1.7 ｋｂの中央領域が除去
され、トリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有す
る1.6 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡ断片に
より置換されたプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩ（第９Ｂ
図）を構築した。
ーセイのｃｂｈ２遺伝子を、第９Ａ図に示すゲノムＤＮ
Ａの4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローニングした
（Chen等、1987、Biotechnology 、5:274-278 ）。この
4.1 ｋｂの断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲＩ部位の間に
挿入した。後者のプラスミドはｐＵＣ誘導体である（ジ
ェネンカー インターナショナル社のR. M. Berka によ
り構築された）。このｐＵＣ誘導体は、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩの順番で並んだ左右対称の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を有する多数のクローニング部位を含んでい
る。従来技術で知られている方法を用いて、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位（ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の74ｂｐの３′）と
ＣｌａＩ部位（ＣＢＨＩＩの最後のコドンの265 ｂｐの
３′）との間のこの遺伝子の1.7 ｋｂの中央領域が除去
され、トリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有す
る1.6 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡ断片に
より置換されたプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩ（第９Ｂ
図）を構築した。
【０１０４】トリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を
1.6 ｋｂのＮｈｅＩ−ＳｐｈＩ断片上のｐＴｐｙｒ２
（実施例７参照）から切除し、ｐＵＣ２１９のＳｐｈＩ
部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐ２１９Ｍを産生
した（Smith 等、1991、Curr. Genet 、19 27-33頁）。
ｐＵＣ２１９の多重クローニング部位由来の一方の末端
で７ｂｐのＤＮＡおよび他方の末端で６ｂｐのＤＮＡを
有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片としてｐｙｒ４遺
伝子を除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ部位と
ＣｌａＩ部位に挿入してプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを
形成した（第９Ｂ図参照）。
1.6 ｋｂのＮｈｅＩ−ＳｐｈＩ断片上のｐＴｐｙｒ２
（実施例７参照）から切除し、ｐＵＣ２１９のＳｐｈＩ
部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐ２１９Ｍを産生
した（Smith 等、1991、Curr. Genet 、19 27-33頁）。
ｐＵＣ２１９の多重クローニング部位由来の一方の末端
で７ｂｐのＤＮＡおよび他方の末端で６ｂｐのＤＮＡを
有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片としてｐｙｒ４遺
伝子を除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ部位と
ＣｌａＩ部位に挿入してプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを
形成した（第９Ｂ図参照）。
【０１０５】このプラスミドをＥｃｏＲＩにより切断す
ることによって、一方の末端においてｃｂｈ２座からの
0.7 ｋｂのフランキングＤＮＡ、他方の末端においてｃ
ｂｈ２座からの1.7 ｋｂのフランキングＤＮＡおよび中
間においてトリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を有
する断片が解放される。
ることによって、一方の末端においてｃｂｈ２座からの
0.7 ｋｂのフランキングＤＮＡ、他方の末端においてｃ
ｂｈ２座からの1.7 ｋｂのフランキングＤＮＡおよび中
間においてトリコデルマ リーセイｐｙｒ４遺伝子を有
する断片が解放される。
【実施例１４】
【０１０６】Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４−誘導体の
産生 ｃｂｈ１遺伝子が欠失した形質転換体（Ｐ３７ＰΔＣＢ
ＨＩ）の芽胞を、ＦＯＡを含有する培地上に広げた。そ
の後実施例６の方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ
４−誘導体を得た。このｐｙｒ４−菌株をＰ３７ＰΔＣ
ＢＨＩＰｙｒ−２６と称した。
産生 ｃｂｈ１遺伝子が欠失した形質転換体（Ｐ３７ＰΔＣＢ
ＨＩ）の芽胞を、ＦＯＡを含有する培地上に広げた。そ
の後実施例６の方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ
４−誘導体を得た。このｐｙｒ４−菌株をＰ３７ＰΔＣ
ＢＨＩＰｙｒ−２６と称した。
【実施例１５】
【０１０７】事前にｃｂｈ１が欠失されている菌株中の
ｃｂｈ２遺伝子の欠失 実施例８および９において概説した方法にしたがって、
菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ４−２６のプロトプラス
トを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩにより形
質転換した。
ｃｂｈ２遺伝子の欠失 実施例８および９において概説した方法にしたがって、
菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ４−２６のプロトプラス
トを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＰΔＣＢＨＩＩにより形
質転換した。
【０１０８】精製した安定な形質転換体を実施例１２の
ように振とうフラスコ中で培養し、等電点電気泳動によ
り培養上澄中のタンパク質を調べた。ＣＢＨＩＩタンパ
ク質をまったく産生しない１つの形質転換体（Ｐ３７Ｐ
ΔΔＣＢＨ６７と称する）を同定した。第８図のレーン
Ｄは、本発明の方法にしたがって産生されたｃｂｈ１遺
伝子およびｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失した形質転換体
からの上澄を示している。
ように振とうフラスコ中で培養し、等電点電気泳動によ
り培養上澄中のタンパク質を調べた。ＣＢＨＩＩタンパ
ク質をまったく産生しない１つの形質転換体（Ｐ３７Ｐ
ΔΔＣＢＨ６７と称する）を同定した。第８図のレーン
Ｄは、本発明の方法にしたがって産生されたｃｂｈ１遺
伝子およびｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失した形質転換体
からの上澄を示している。
【０１０９】ＤＮＡを菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７から
抽出し、抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１
８により切断し、この切断されたＤＮＡについてアガロ
ースゲル電気泳動を行なった。このゲルからのＤＮＡを
メンブレンフィルターにブロットし、３２Ｐ標識ｐＰΔ
ＣＢＨＩＩを用いてハイブリダイズさせた（第１０
図）。第１０図のレーンＡは、非形質転換トリコデルマ
リーセイ菌株からのＤＮＡについて観察されたハイブ
リダイゼーションパターンを示している。野生型ｃｂｈ
２遺伝子を含有する4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が観察さ
れた。レーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７につい
て観察されたハイブリダイゼーションパターンを示して
いる。単一の4.1 ｋｂバンドがなくなり、約0.9 ｋｂお
よび約3.1 ｋｂの２つのバンドに置き換えられている。
これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一
のコピーがｃｂｈ２座で正確に組み込まれた場合に予期
されるパターンである。
抽出し、抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１
８により切断し、この切断されたＤＮＡについてアガロ
ースゲル電気泳動を行なった。このゲルからのＤＮＡを
メンブレンフィルターにブロットし、３２Ｐ標識ｐＰΔ
ＣＢＨＩＩを用いてハイブリダイズさせた（第１０
図）。第１０図のレーンＡは、非形質転換トリコデルマ
リーセイ菌株からのＤＮＡについて観察されたハイブ
リダイゼーションパターンを示している。野生型ｃｂｈ
２遺伝子を含有する4.1 ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が観察さ
れた。レーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７につい
て観察されたハイブリダイゼーションパターンを示して
いる。単一の4.1 ｋｂバンドがなくなり、約0.9 ｋｂお
よび約3.1 ｋｂの２つのバンドに置き換えられている。
これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一
のコピーがｃｂｈ２座で正確に組み込まれた場合に予期
されるパターンである。
【０１１０】同一のＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩにより切断
し、サザンブロット分析を上述したように行なった。こ
の実施例においては、プローブには３２Ｐ標識ｐＩｎｔ
ＣＢＨＩＩを用いた。このプラスミドは、プラスミドｐ
ＰΔＣＢＨＩＩにおいて欠失されたｃｂｈ２遺伝子のセ
グメント内からのｃｂｈ２遺伝子コード配列の部分を含
有している。菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡ
についてはハイブリダイゼーションは見られず、このこ
とは、ｃｂｈ２遺伝子は欠失され、ｐＵＣプラスミド由
来の配列はこの菌株内には存在しなかったことを示して
いる。
し、サザンブロット分析を上述したように行なった。こ
の実施例においては、プローブには３２Ｐ標識ｐＩｎｔ
ＣＢＨＩＩを用いた。このプラスミドは、プラスミドｐ
ＰΔＣＢＨＩＩにおいて欠失されたｃｂｈ２遺伝子のセ
グメント内からのｃｂｈ２遺伝子コード配列の部分を含
有している。菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡ
についてはハイブリダイゼーションは見られず、このこ
とは、ｃｂｈ２遺伝子は欠失され、ｐＵＣプラスミド由
来の配列はこの菌株内には存在しなかったことを示して
いる。
【実施例１６】
【０１１１】トリコデルマ リーセイのｐｙｒ４欠失菌
株の形質転換体 およびｐΔＥＧＩｐｙｒ−３の構築 ＥＧＩをコード化するトリコデルマ リーセイｅｇｌ１
遺伝子を、公表されている配列にしたがって合成したオ
リゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによ
り、菌株ＲＬ−Ｐ３７からのゲノムＤＮＡの4.2 ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングした（Pentilla
等、1986、Gene、45:253-263；van Arsdell 等、1987、
Bio/Technology、5:60-64 ）。
株の形質転換体 およびｐΔＥＧＩｐｙｒ−３の構築 ＥＧＩをコード化するトリコデルマ リーセイｅｇｌ１
遺伝子を、公表されている配列にしたがって合成したオ
リゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによ
り、菌株ＲＬ−Ｐ３７からのゲノムＤＮＡの4.2 ｋｂの
ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローニングした（Pentilla
等、1986、Gene、45:253-263；van Arsdell 等、1987、
Bio/Technology、5:60-64 ）。
【０１１２】このＤＮＡ断片をｐＵＣ１００のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位で挿入した。ＥＧＩコード配列の中間に近い
位置からコード配列の３′末端を越えた位置まで延長し
た内部の１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を酵素切断により除去
し、クローニングされた黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺
伝子を含有する2.2 ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片による連結によって置き換えて（Wilson等、1988、
Nucl. Acids Res. 16 2339頁）ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３
を得た（第１１図）。実施例８および９に述べた方法に
よるトリコデルマ リーセイのｐｙｒ４欠失菌株（菌株
ＧＣ６９）をＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、いずれかの
末端でｅｇｌ１からのフランキング領域を備えたｐｙｒ
Ｇ遺伝子を含有する断片を解放した後、その菌株をｐΔ
ＥＧＩｐｙｒ−３により形質転換して、第１２図に概説
した機構によりゲノムｅｇｌ１遺伝子が分断された形質
転換体が得られた。ＤＮＡを形質転換体から抽出し、抽
出したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、この切断
したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ない、
メンブレンフィルター上にブロットした。そのフィルタ
ーを放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を用いてハイブリ
ダイズさせた。トリコデルマ リーセイの非形質転換菌
株において、ｅｇｌ１遺伝子がＤＮＡの4.2 ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片上に存在した。しかしながら、ｐΔＥＧ
Ｉｐｙｒ−３からの所望の断片の取込みによるｅｇｌ１
遺伝子の欠失後、この4.2 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片は
消失し、約1.2 ｋｂ大きなＨｉｎｄＩＩＩ断片により置
き換えられた。このパターンは１つの形質転換体につい
て観察された。この形質転換体をΔＥＧＩ−３と称し
た。
ＩＩＩ部位で挿入した。ＥＧＩコード配列の中間に近い
位置からコード配列の３′末端を越えた位置まで延長し
た内部の１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片を酵素切断により除去
し、クローニングされた黒色アスペルギルスｐｙｒＧ遺
伝子を含有する2.2 ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片による連結によって置き換えて（Wilson等、1988、
Nucl. Acids Res. 16 2339頁）ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３
を得た（第１１図）。実施例８および９に述べた方法に
よるトリコデルマ リーセイのｐｙｒ４欠失菌株（菌株
ＧＣ６９）をＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、いずれかの
末端でｅｇｌ１からのフランキング領域を備えたｐｙｒ
Ｇ遺伝子を含有する断片を解放した後、その菌株をｐΔ
ＥＧＩｐｙｒ−３により形質転換して、第１２図に概説
した機構によりゲノムｅｇｌ１遺伝子が分断された形質
転換体が得られた。ＤＮＡを形質転換体から抽出し、抽
出したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、この切断
したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ない、
メンブレンフィルター上にブロットした。そのフィルタ
ーを放射線標識ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３を用いてハイブリ
ダイズさせた。トリコデルマ リーセイの非形質転換菌
株において、ｅｇｌ１遺伝子がＤＮＡの4.2 ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片上に存在した。しかしながら、ｐΔＥＧ
Ｉｐｙｒ−３からの所望の断片の取込みによるｅｇｌ１
遺伝子の欠失後、この4.2 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片は
消失し、約1.2 ｋｂ大きなＨｉｎｄＩＩＩ断片により置
き換えられた。このパターンは１つの形質転換体につい
て観察された。この形質転換体をΔＥＧＩ−３と称し
た。
【実施例１７】
【０１１３】ＰＡΔＥＧＩＩ−１の構築およびＥＧ Ｉ
Ｉ遺伝子の欠失 公表された配列にしたがって合成したオリゴヌクレオチ
ドを用いたハイブリダイゼーションによって、ＥＧ Ｉ
Ｉ（文献には、ＥＧ ＩＩＩとも称されている）をコー
ド化するｅｇｌ３遺伝子を、４ｋｂのＰｓｔＩゲノムＤ
ＮＡ断片としてトリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３
７からクローニングした（Saloheimo 等、1988、Gene 6
3:11-21 ）。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部
位に挿入した。このプラスミドｐＥＧＩＩをＥｃｏＲＶ
により切断し、ＥＧＩＩコード領域の５′末端の約180
ｂｐの位置からコード領域の末端を数百塩基対越えた位
置まで延長した約２ｋｂのセグメント上の全縁ＥＧ Ｉ
Ｉコード領域を除去した。このセグメントを、ａｍｄＳ
遺伝子を含有するアスペルギルス ニジュランス（Aspe
rgillus nidulans）ゲノムＤＮＡのＳｓｐＩ断片により
置き換え（Corrick 等、1987、Gene 53:63-71 ）、プラ
スミドＰＡΔＥＧＩＩ−１を産生した（第１３図参
照）。
Ｉ遺伝子の欠失 公表された配列にしたがって合成したオリゴヌクレオチ
ドを用いたハイブリダイゼーションによって、ＥＧ Ｉ
Ｉ（文献には、ＥＧ ＩＩＩとも称されている）をコー
ド化するｅｇｌ３遺伝子を、４ｋｂのＰｓｔＩゲノムＤ
ＮＡ断片としてトリコデルマ リーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３
７からクローニングした（Saloheimo 等、1988、Gene 6
3:11-21 ）。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部
位に挿入した。このプラスミドｐＥＧＩＩをＥｃｏＲＶ
により切断し、ＥＧＩＩコード領域の５′末端の約180
ｂｐの位置からコード領域の末端を数百塩基対越えた位
置まで延長した約２ｋｂのセグメント上の全縁ＥＧ Ｉ
Ｉコード領域を除去した。このセグメントを、ａｍｄＳ
遺伝子を含有するアスペルギルス ニジュランス（Aspe
rgillus nidulans）ゲノムＤＮＡのＳｓｐＩ断片により
置き換え（Corrick 等、1987、Gene 53:63-71 ）、プラ
スミドＰＡΔＥＧＩＩ−１を産生した（第１３図参
照）。
【０１１４】トリコデルマ リーセイの野生型菌株は、
唯一のニトロゲン供給源としてのアセトアミド上では成
長できない。ａｍｄＳ遺伝子により形質転換を行なう
と、このアセトアミド上で成長する能力が与えられ、こ
のことがこの遺伝子を含有する形質転換体の選択システ
ムの基礎となっている。
唯一のニトロゲン供給源としてのアセトアミド上では成
長できない。ａｍｄＳ遺伝子により形質転換を行なう
と、このアセトアミド上で成長する能力が与えられ、こ
のことがこの遺伝子を含有する形質転換体の選択システ
ムの基礎となっている。
【０１１５】実施例１０および１１において記載した方
法により、菌株ΔＥＧＩ−３のプロトプラストを、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断したｐＡΔＥＧＩＩ
−１により形質転換し、アセトアミド上で成長できる形
質転換体を選択した。その後、ＤＮＡを安定な形質転換
体から抽出し、抽出したＤＮＡをＰｓｔＩにより切断
し、切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を
行ないメンブレンフィルター上にブロットした。そのフ
ィルターを放射線標識ｐＡΔＥＧＩＩ−１を用いてハイ
ブリダイズさせた。ｅｇｌ３フランキング領域およびａ
ｍｄＳを含有した、ｐＡΔＥＧＩＩ−１からのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の、形質転換体中のゲノムｅｇ
ｌ３座で同種組込みを行なうと、ｅｇｌ３遺伝子を含有
する４ｋｂのゲノムＰｓｔＩ断片が、長さで約1.0 ｋｂ
および約2.8 ｋｂである２つの遺伝子を含有する小さな
Ｐｓｔ１断片により置き換えられることになる。ハイブ
リダイゼーションのこのパターンは、菌株ΔΔＥＧ−１
と称する１つの形質転換体に観察された。この菌株は、
ＥＧＩおよびＥＧＩＩコード化遺伝子の両方が欠失して
おり、結果としてこれらのタンパク質のいずれも産生で
きない。
法により、菌株ΔＥＧＩ−３のプロトプラストを、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断したｐＡΔＥＧＩＩ
−１により形質転換し、アセトアミド上で成長できる形
質転換体を選択した。その後、ＤＮＡを安定な形質転換
体から抽出し、抽出したＤＮＡをＰｓｔＩにより切断
し、切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を
行ないメンブレンフィルター上にブロットした。そのフ
ィルターを放射線標識ｐＡΔＥＧＩＩ−１を用いてハイ
ブリダイズさせた。ｅｇｌ３フランキング領域およびａ
ｍｄＳを含有した、ｐＡΔＥＧＩＩ−１からのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片の、形質転換体中のゲノムｅｇ
ｌ３座で同種組込みを行なうと、ｅｇｌ３遺伝子を含有
する４ｋｂのゲノムＰｓｔＩ断片が、長さで約1.0 ｋｂ
および約2.8 ｋｂである２つの遺伝子を含有する小さな
Ｐｓｔ１断片により置き換えられることになる。ハイブ
リダイゼーションのこのパターンは、菌株ΔΔＥＧ−１
と称する１つの形質転換体に観察された。この菌株は、
ＥＧＩおよびＥＧＩＩコード化遺伝子の両方が欠失して
おり、結果としてこれらのタンパク質のいずれも産生で
きない。
【０１１６】実施例７−１７および1991年10月 4日に出
願された米国特許第07/770,049号（ここに全てを引用す
る）に記載された方法を用いて、以下のセルラーゼ成分
（すなわち、ＥＧ Ｉ、ＥＧ ＩＩ、ＣＢＨＩおよびＣ
ＢＨＩＩ）およびキシナラーゼ成分のいくつかまたは全
てを産生できないトリコデルマ リーセイの形質転換体
を得てもよい。さらに、それらの記載された方法を用い
て、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を過剰に産生するトリ
コデルマ リーセイ形質転換体を得てもよい。
願された米国特許第07/770,049号（ここに全てを引用す
る）に記載された方法を用いて、以下のセルラーゼ成分
（すなわち、ＥＧ Ｉ、ＥＧ ＩＩ、ＣＢＨＩおよびＣ
ＢＨＩＩ）およびキシナラーゼ成分のいくつかまたは全
てを産生できないトリコデルマ リーセイの形質転換体
を得てもよい。さらに、それらの記載された方法を用い
て、ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分を過剰に産生するトリ
コデルマ リーセイ形質転換体を得てもよい。
【０１１７】本発明を様々な好ましい実施態様に関して
記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、様々
な変更、置換等を行ってもよいことが当業者に理解され
よう。したがって、本発明の範囲は以下の請求の範囲の
みにより制限される。
記載したが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、様々
な変更、置換等を行ってもよいことが当業者に理解され
よう。したがって、本発明の範囲は以下の請求の範囲の
みにより制限される。
【０１１８】
【図１】第１図は、ＣＢＨ ＩおよびＣＢＨ ＩＩを発
現できないように形質転換したトリコデルマ リーセイ
の菌株由来の菌類セルラーゼ組成物のプロファイルを示
すグラフである。
現できないように形質転換したトリコデルマ リーセイ
の菌株由来の菌類セルラーゼ組成物のプロファイルを示
すグラフである。
【図２】第２図は、等電点電気泳動ゲルを示す。
【図３】第３図は、ＥＧ ＩＩＩの２つの断片から得ら
れたアミノ酸配列である。
れたアミノ酸配列である。
【図４】第４図は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構築を示す
概略図である。
概略図である。
【図５】第５図は、トリコデルマ リーセイ遺伝子の欠
失を説明する概略図である。
失を説明する概略図である。
【図６】第６図は、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ
４により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ
６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
４により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ
６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図７】第７図は、ＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ
４により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ
６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
４により形質転換したトリコデルマ リーセイ菌株ＧＣ
６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図８】第８図は、野生型のトリコデルマ リーセイお
よびトリコデルマ リーセイの形質転換菌株により分泌
されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。
よびトリコデルマ リーセイの形質転換菌株により分泌
されたタンパク質を示す等電点電気泳動ゲルである。
【図９】第９図は、ゲノムＤＮＡ上の4.1 ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ リーセ
イｃｂｈ２座、およびｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクタ
ーｐＰΔＣＢＨＩＩを示す概略図である。
ＲＩ断片としてクローニングしたトリコデルマ リーセ
イｃｂｈ２座、およびｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクタ
ーｐＰΔＣＢＨＩＩを示す概略図である。
【図１０】第１０図は、サザンブロット分析後のＥｃｏ
ＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換したトルコデル
マ リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６からの
ＤＮＡのオートラジオグラフである。
ＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換したトルコデル
マ リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６からの
ＤＮＡのオートラジオグラフである。
【図１１】第１１図は、ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３の構成
を示す概略図である。
を示す概略図である。
【図１２】第１２図は、ｅｇｌ１遺伝子の欠失を説明す
る概略図である。
る概略図である。
【図１３】第１３図は、ｐＡΔＥＧＩＩ−１の構成を示
す概略図である。
す概略図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 キャスリーン エイ クラークソン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94110 サン フランシスコ トウェン
ティエイス ストリート 53
(72)発明者 エドマンド エイ レアナス
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94038 モス ビーチ ネヴァダ 301
(72)発明者 ベンジャミン エス バウアー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94118 サン フランシスコ ナンバー
５ レイク ストリート 830
(72)発明者 ジェフリー エル ワイス
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94117 サン フランシスコ ブエナ
ヴィスタ 457
(56)参考文献 米国特許4728613（ＵＳ，Ａ)
国際公開90／15866（ＷＯ，Ａ１)
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，1991年
12月，Ｖｏｌ．202， Ｎｏ．２，ｐ.
521−529
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，1991年 ９月,
Ｖｏｌ．278， Ｐｔ．２，ｐ．329−
333
Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ，1991年 ６月，Ｖｏｌ.
57， Ｎｏ．６，ｐ．1860−1862
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/42
C07K 1/14
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (9)
- 【請求項１】 セルラーゼタンパク質を含有する水性混
合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法で
あって、 （ａ）ＥＧ ＩＩＩセルラーゼ成分以外の実質的に全て
のセルラーゼタンパク質がキシラナーゼ成分の少ない水
相に保持され、かつキシラナーゼ成分がキシラナーゼ成
分の多いポリエチレングリコール相に保持されるよう
に、セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物に、無
機塩、および０.５から１０％（ｗ／ｖ）の約５,０００
から１０,０００までの分子量を有するポリエチレング
リコールを添加する工程；および （ｂ）前記キシラナーゼ成分の少ない水相から前記キシ
ラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相を分離し
て、該キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール
相を集める工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレ
ングリコール相からキシラナーゼ成分を分離して、該キ
シラナーゼ成分を集める工程をさらに含むことを特徴と
する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 沈殿によって、前記キシラナーゼ成分の
多いポリエチレングリコール相からキシラナーゼ成分を
分離することを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 低分子量のアルコールを前記キシラナー
ゼ成分の多いポリエチレングリコール相に添加して前記
キシラナーゼ成分を沈殿させることを特徴とする請求項
３記載の方法。 - 【請求項５】 前記低分子量のアルコールがエタノール
であることを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記無機塩が、前記ポリエチレングリコ
ールを添加する前に、前記水性混合物に添加されること
を特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 添加される前記無機塩が、硫酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナト
リウムおよびリン酸カリウムからなる群より選択される
ことを特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 出発物質である前記水性混合物が、濾過
された全細胞抽出物であることを特徴とする請求項１か
ら７いずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】 出発物質である前記水性混合物が、細胞
を含まないセルラーゼ混合物であることを特徴とする請
求項１から７いずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US862,846 | 1977-12-21 | ||
| US07/862,846 US5328841A (en) | 1990-10-05 | 1992-04-03 | Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1993517775A Division JP3522272B6 (ja) | 1992-04-03 | 1993-04-05 | ポリエチレングリコールを用いた実質的に純粋なｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004041205A JP2004041205A (ja) | 2004-02-12 |
| JP3522744B2 true JP3522744B2 (ja) | 2004-04-26 |
Family
ID=25339525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003271259A Expired - Lifetime JP3522744B2 (ja) | 1992-04-03 | 2003-07-07 | セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5328841A (ja) |
| EP (1) | EP0635057B1 (ja) |
| JP (1) | JP3522744B2 (ja) |
| AT (1) | ATE222292T1 (ja) |
| CA (1) | CA2133436C (ja) |
| DE (1) | DE69332200T2 (ja) |
| DK (1) | DK0635057T3 (ja) |
| ES (1) | ES2181685T3 (ja) |
| FI (1) | FI116530B (ja) |
| WO (1) | WO1993020208A1 (ja) |
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