JPH07505296A - ポリエチレングリコールを用いた実質的に純粋なｅｇ ３セルラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエチレングリコールを用いた 実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼの発明の背景 １、　産業上の利用分野 本発明は実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を含有するポリエチレングリ コール溶液を製造する方法に関するものである。特に本発明の方法の一部は、特 定のポリエチレングリコールを水性混合物に添加してＥＧＩＩＩが多いポリ−エ チレングリコール相とＥＧ　ＩＩＩが少ない水相とからなる２相系を調製してＥ ＧＩＩＩが多いポリエチレングリコール相を分離することにより、ＥＧ　ＩＩｆ 含有セルラーゼタンパク質の水性混合物からＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を分離す る方法に関するものである。本発明はまた一部は、分画により、または上記２つ の方法の組合せにより、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を調製する 方法に関するものである。本発明はまた一部は、キシラナーゼをも含有するセル ラーゼタンパク質の水性混合物からキシナーゼ　ポリエチレングリコール相を集 積する方法に関するものである。

２、　従来技術 セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン結合）を加水分解し、それに よって、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成させる酵素として従 来技術において知られている。セルラーゼは、菌類、細菌等内で産生（発現）さ れるけれども、セルロースの結晶構造を分解することのできる完全セルラーゼ系 が発酵方法により大量に容易に産生されるので、ある菌類、特に菌類網トリコデ ルマ　Ｓ　１）Ｉ）　、（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐｐ、　）　（特にトリ コデルマ　リーセイ（Ｔｒｉｃｈ。

ｄｅｒ■ａ　ｒｅｅｓｅｉ）　）により産生されたセルラーゼは最も注目を集め ている。

上記点に関して、５ｃｈｕｌｅｉｎ、“蓋ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ”、１６０．２５．２３４頁ｅｔ　ｓｅｑ、　（１９８８）は、完全菌類 セルラーゼ系が、エキソセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３，２，１，９１）（ｒＣ ＢＨＪ）、ｚンドグルカナーゼ（ＥＣ３，２゜１．４）（ｒＥＧＪ）、およびβ −グルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２１）（ｒＢＧＪ）として同定される酵素 を含むいくつかの異なる酵素分類からなることを開示している。ＣＢＨ，ＥＧお よびＢＧの菌類セルラーゼ分類をさらに発展させて、各々の分類内に多数の成分 を含むようにできる。例えば、多数のＣＢＨおよびＥＧが様々な菌類源から単離 されている。

ＣＢＨ成分、ＥＧ酸成分よびＢＧ酸成分らなる完全セルラーゼ系は、結晶性セル ロースをグルコースに能率的に転化させるのに必要とされる。いやしくも、結晶 性セルロースを加水分解する際には、単離された成分はほとんど効果的ではない 。さらに、特にセルラーゼ成分が異なる分類のものである場合、セルラーゼ成分 の間で相乗関係が観察される。

一方で、単独または組合せのいずれかにより使用するセルラーゼおよびその成分 は、洗浄剤組成物に有用であることが従来技術において知られている。例えば、 菌類セルラーゼのエンドグルカナーゼ成分は、柔軟剤として使用するための、そ して綿織物等の感触を改善するのに使用するための、洗浄剤組成物の洗浄力を増 強させる目的に使用されている。しかしながら、洗浄剤組成物中にトリコデルマ ｓｐｐ、そして特にトリコデルマ　リーセイから由来したＥＧ　Ｉ成分およびＥ ＧＩＩ成分を使用するには問題がある。特に、そのような成分は酸性ｐＨで最大 活性を有しているが、はとんどの洗濯洗浄剤組成物は中性またはアルカリ性（ｐ Ｈ＞７から約１０まで）条件で使用するように配合されている。洗浄剤組成物中 にトリコデルマ　リーセイの１種類以上の酸性エンドグルカナーゼ成分を使用す ると、アルカリ性条件下で使用した場合でさえも、綿含有織物に対する感触、柔 軟性および色の保持と復元を改良できることが米国特許出願第０７／６６８．６ ４０号に開示されているが、トリコデルマ　ｓｐｐ、のＥＧＩＩＩ成分は、トリ コデルマ　リーセイのＥＧ　Ｉ成分およびＥＧＩＩ成分と比較して、洗浄剤組成 物において予期せぬ優れた利点を有することが米国特許出願第０７／７０７．６ ４７号に開示されている。

特に、ＥＧ−ＩＩＩセルラーゼ成分は、アルカリ条件下で著しい酵素活性を有す ることがわかっており、中性またはアルカリ性の洗浄剤洗濯媒質を用いた洗濯条 件に使用するのにも特に適している。

洗濯洗浄剤に使用することに加えて、ここに記載する実質的に純粋なＥＧ　ＩＩ Ｉセルラーゼ成分はさらに、１９９１年５月３０日に出願され、ここに引用する 米国特許出願第０７／７０７．６４７号に記載されているように、色の保持と復 元、柔軟性および感触を望ましく改良する十分な活性がある場合、中間のｐＨの 適切な溶液中において予洗工程に使用することができる。

また、ここに記載する実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ成分は、スポットリ ムーバーに使用できるだけでなく、また色褪せた織物に対して色を復元するのに 適した孤立組成物（例えば、ここに全てを引用する、米国特許第４．７３８．６ ８２号を参照のこと）としての家庭用途に使用することもできると考えられてい る。

さらに、中性からアルカリ性の条件下でＥＧＩＩＩセルラーゼ成分の大きい活性 は、線層飼料加工および／または堆肥化加工と同様に、綿含有織物を処理する繊 維加工（ここに全てを引用する米国特許出願第０７／６７７、３８５号および同 第０７７６７８、８６５号を参照のこと）にも有益であると考えられている。

上述した点は著しく異なって、本発明は、水性酵素混合物から、特に完全菌類セ ルラーゼ組成物からＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を分離して精製する、特に商業規 模のＥＧＩＩＩセルラーゼ成分の製造のための能率的な方法に関するものである 。

発明の概要 特に、本発明は、ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を含むセルラーゼタンパク質を含有 する水性混合物から、実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を含有するポリ エチレングリコール溶液を製造する方法に関するものである。したがって、その 方法の一面において、本発明は、ＥＧＩＩＩセルラーゼを含むセルラーゼタンパ ク質を含有する水性混合物からＥＧＩＩＩを選択的に回収する方法に関し、その 方法は、無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）の水性混合物を添加する工程を含んでいる。その混合物は、ＥＧ　ＩＩＩが多 いポリエチレングリール相およびＥＧＩＩＩが少ない水相からなる二相液体混合 物を形成している。この方法において、ＥＧ　ＩＩＩが多い相には他のセルラー ゼタンパク質は実質的に含まれず、ＥＧＩＩＩが多い相は後に分離される。

本発明の方法はまた一部には、無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレ ングリコールを水性混合物に添加することにより、キシラナーゼも含有するセル ラーゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋なキシラナーゼを単離する方法 に関するものである。水性混合物がＥＧＩＩＩも含有する場合には、回収したポ リエチレングリコール相はＥＧＩＩＩおよびキシラナーゼの両方を含有している 。

別の方法において、本発明は、ＥＧ　ＩＩＩを含有する水性セルラーゼタンパク 質混合物からＥＧＩＩＩセルラーゼを選択的に回収する方法に関し、その方法は 、その水性混合物を陰イオン交換カラムにを通すことを含んでいる。陰イオン交 換カラムに結合しなかったタンパク質分画はＥＧＩＩＩ成分を含有している。次 いでこの分画を陽イオン交換カラムに通す。この陽イオン交換カラムは、ＥＧＩ ＩＩセルラーゼと結合し、後に塩溶液により樹脂から溶離せしめられる。

本発明の３番目の方法は、いずれかの順番で上記した２つの方法の組合せである 。

水性セルラーゼタンパク質混合物は、全細胞抽出物、より好ましくは、野生型ト リコデルマ　ｓｐｐ、菌株、遺伝的に修飾されたトリコデルマ　ｓｐｐ、または 本発明の方法に適合しているＥＧＩＩＩを含むセルラーゼタンパク質を含有する 他の水性混合物からの全セルラーゼ組成物であり得る。

図面の簡単な説明 第１図は、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩを発現できないように形質転換したトリコ デルマ　リーセイの菌株由来のＥＧの多い菌類セルラーゼ組成物の４０℃での所 定のｐＨ範囲におよぶＲＢＢ−ＣＭＣ活性プロファイル、並びに４０℃での所定 のｐＨ範囲におよぶトリコデルマ　リーセイ由来のＥＧＩＩＩの多いセルラーゼ 組成物の活性プロファイルを示すグラフである。

第２図は、レーン１において、野生型トリコデルマ　リーセイにより発現された タンパク質を示し、レーン２において、ＥＧ　■およびＥＧＩＩ成分を発現でき ないように形質転換したトリコデルマ　リーセイの菌株により発現されたタンパ ク質を示し、レーン３において、実施例１の方法により得られたタンパク質と同 一の実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ中に発見されるタンパク質を示す等重 点電気泳動ゲルを示すものである。この図の左の余白に、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＴＩ 、ＥＧ　Ｉ、ＥＧ　ＩｆＳＥＧ　ＩＩＩおよびキシラナーゼに帰するバンドを同 定できるように印が付けである。

第３図は、ＥＧＩＩＩの２つの断片から得られたアミノ酸配列である。

第４図は、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４の構築を示す概略図である。

第５図は、トリコデルマ　リーセイ染色体のうちの１つの染色体上のｃｂｈｌ座 にｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４からのより大きなＥｃｏＲＩ断片を組み込むことよるト リコデルマ　リーセイ遺伝子の欠失を説明する概略図である。

第６図は、プローブとして３２ｐで標識したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、サ ザンプロット分析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨ１ｐｙｒ４により形質転換した トリコデルマ　リーセイ菌株ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである 。

分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示している。

第７図は、プローブとして３２ｐで標識したｐｌｎｔｃＢＨＩを用いた、Ｅｃ、 、。

Ｒ１切断ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４により形質転換したトリコデルマ　リーセイ菌株 ＧＣ６９からのＤＮＡのオートラジオグラフである。分子量マーカーの大きさを 図面の左側にキロ塩基対で示している。

第８図は、野生型のトリコデルマ　リーセイにより分泌されたタンパク質および トリコデルマ　リーセイの形質転換菌株により分泌されたタンパク質を示す等電 点電気泳動ゲルである。具体的には第８図において、等電点電気泳動ゲルのレー ンＡは、部分的に精製したトリコデルマ　リーセイからのＣＢＨＩが作用したも のである。レーンＢは、野生型のトリコデルマ　リーセイが作用したものである 。レーンＣは、ｃｂｈｌ遺伝子が欠失したトリコデルマ　リーセイ菌株からのタ ンパク質が作用したものである。レーンＤは、ｃｂｈｌおよびｃｂｈ２遺伝子が 欠失したトリコデルマ　リーセイ菌株からのタンパク質が作用したものである。

第８図において、図面の右側には、１つ以上の分泌タンパク質に発見された単一 タンパク質の座を示すように印付けである。具体的には、ＢＧはβ−グルコシダ −ゼを意味し、ＥｌはエンドグルカナーゼＩを意味し、Ｅ２はエンドグルカナー ゼＩＩを意味し、Ｅ３はエンドグルカナーゼＩＩＩを意味し、ｃｌはエキソセロ ビオヒドロラーゼＩを意味し、Ｃ２はエキソセロビオヒドロラーゼＩＩを意味す るものである。

第９Ａ図は、ゲノムＤＮＡ上の４．１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片としてクローニング したトリコデルマ　リーセイｃ　ｂ　ｈ　２座を示す概略図であり、第９Ｂ図は 、ｃｂｈ２遺伝子が欠失したベクターｐｐΔＣＢＨＩＩを示す概略図である。

第１０図は、プローブとして３２ｐで標識したｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を用いた、 サザンプロット分析後のＥｃｏＲＩ切断ｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換したトリ コデルマ　リーセイ菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ２６からのＤＮＡのオートラ ジオグラフである。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示して いる。

第１１図は、ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３の構成を示す概略図である。

第１２図は、トリコデルマ　リーセイ染色体の１つのｅｇｌｌ座にｐΔＥＧＩｐ ｙｒＧ−３からのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片を組み込むことによるｅｇｌｌ遺伝子 の欠失を説明する概略図である。

第１３図は、ｐＡΔＥＧＩＩ−１の構成を示す概略図である。

発明の詳細な説明 上述したように、本発明は概して、ポリエチレングリコール溶液中において、ま たは回収したタンパク質として、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を 産生ずる方法に関するものである。

しかしながら、本発明をさらに詳細に説明する前に、以下の用語を最初に定義本 明細書に使用する場合、以下の用語は以下の意味を有するものである。

ｒＥＧＩＩＩセルラーゼ」とは、トリコデルマ　ｓｐｐ、由来のエンドグルカナ ーゼ成分、または約５．５から約６．０までの範囲ｐＨ最適値、約７．２から約 ８゜０までの範囲の等電点（ｐ　Ｉ）　、および約２３キロダルトンから約２８ キロダルトンまでの範囲の分子量により特徴付けられる、トリコデルマ　ｓｐｐ 、により産生されるＥＧＩＩＩと同等のタンパク質を産生ずる微生物由来のエン ドグルカナーゼ成分を意味する。好ましくは、ＥＧＩＩＩセルラーゼは、トリコ デルマリーセイかまたはトリコデルマ　ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉ ｒｆｄｅ）由来のものである。トリコデルマ　リーセイ由来のＥＧＩＩＩセルラ ーゼは、約５．５から約６゜０までの範囲のｐＨ最適値、約７．４の等電点（ｐ ｌ）および約２５キロダルトンから約２８キロダルトンまでの範囲の分子量を有 する。トリコデルマ　ビリデ由来のＥＧＩＩＩセルラーゼは、約５．５のｐＨ最 適値、約７．７の等電点（ｐｉ）および約２３．５キロダルトンの分子量を有す る。さらに、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼのアミノ酸配列が変更されていてもよいと 考えられる。この酵素の活性部位を変更すると、ｐＨ最適値、最適温度または基 質に対する親和性のような様々な特性を変化させてしまうかもしれない。

ＥＧＩＩＩ成分は、ｐＩが高いために、ｐＩの高いキシラナーゼ、およびトリコ デルマ　ｓｐｐ、により発現されるｐＩの高い他の成分が一般的に発見される等 電点電気泳動ゲルの領域に発見される。実際、第２図にＥＧＩＩＩとして認識さ れているバンドはＥＧ　ＩまたはＥＧＩＩのうちいずれかの分解生成物であると 、文献に仮定されている。しかしながら、ＥＧＩおよびＥＧＩＩが欠失したセル ラーゼ（米国特許出願第０７／７７０．０４９号および同第０７／６６８．６４ ０号の方法により調製された）の等電点電気泳動ゲルは、このバンドはＥＧ　Ｉ またはＥＧ　ＩＩのうちのいずれの分解生成物にも起因するものではないことを 示した（第２図）。

ＥＧＩＩは以前には、ある著者による専門語のｒＥＧ　ＩＩＩＪにより示されて いたが、現在の専門語では、ｒＥＧ　ＩＩＪと称している。いずれにしても、Ｅ ＧＩＩタンパク質は、以下に示す実施例２の表２に証拠付けられるように、分子 量、ｐｌｌおよびｐＨ最適値について、ＥＧＩＩＩタンパク質とは実質的に異な る。

「実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼ」とは、セルラーゼタンパク質の総重量 に対して、少なくとも５０重量パーセント、より好ましくは少なくとも７０重量 パーセント、最も好ましくは少な（とも９０重量パーセントのＥＧＩＩＩセルラ ーゼ成分を含有するセルラーゼタンパク質の組成物（固体または液体）を意味す 「他の全てのセルラーゼタンパク質を実質的に含まない」とは、ＥＧＩＩＩ以外 のセルラーゼタンパク質の少なくとも５０重量パーセント、より好ましくは６０ 重量パーセント、そして最も好ましくは少なくとも９０重量パーセントが、元の セルラーゼ酵素の水性混合物から除去されている組成物を意味する。

「キシラナーゼが豊富」とは、少なくとも４倍、より好ましくは１０倍、本発明 の方法によってキシラナーゼの濃度が増大した水溶液または組成物、もしくはポ リエチレングリコール相を意味する。

「セルラーゼタンパク質」とは、野生型菌類源、または野生型菌類源から得られ るセルラーゼ遺伝子の全てまたは一部を包含し発現させるように遺伝子的に修飾 した微生物由来の、エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）タンパク質、エンド グルカナーゼ（ＥＧ）タンパク質およびβ−グルコシダーゼ（ＢＧ）タンパク質 のいずれかまたは全てを含有するセルラーゼタンパク質を意味する。集団的に、 そのようなタンパク質（すなわち、ＣＢＨ，ＥＧおよびＥＧタンパク質）の全て を「セルラーゼタンパク質」と称する。これに反して、セルラーゼタンパク質は 、キシラナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ、 により発現される他のタンパク質を含まない。

［エンドグルカナーゼ（ＥＧ）成分」とは、トリコデルマ　リーセイのＥＧｌ、 ＥＧＩＩおよび／またはＥＧ　ＩＩＩ成分を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ。

のＥＧ酸成分意味する。単体または組合せいずれかのトリコデルマ　ｓｐｐ、の エンドグルカナーゼ成分（例えば、トリコデルマ　リーセイのＥＧ　Ｉ、ＥＧＩ 　Ｌ　ＥＧ　Ｉ　Ｉ　Ｉ）は、これらの成分を繊維処理媒質に含有させて、綿含 有織物をこの媒質中で処理する場合には、その織物について、感触、外観、柔軟 性、色、および／またはストーンウォッシュの外観を改良する（処理する前の織 物と比較して）。上記した事項に加え、ＥＧ　ＩＩＩは、多くの洗浄剤組成物が 使用されるアルカリ性のｐＨで実質的な活性を有する。

「エキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢ　Ｈ）成分」とは、トリコデルマ　リーセ イのＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ成分を含む、トリコデルマ　ｓｐｐ、のＣＢＨ成 分を意味する。トリコデルマ　ｓｐｐ、のＥＧ酸成分含まない状態でトリコデル マ　ｓｐｐ、のＣＢＨ成分を使用する場合、このＣＢＨ成分単体では、処理した 綿含有織物の、色の保持／復元および感触が著しくは改良されない。さらに、そ のようなＥＧ酸成分組み合わせてトリコデルマ　リーセイのＣＢＨＩ成分を用い る場合には、綿含有織物の強度損失を高め、洗浄することの利点を高めることが できる。

［β−グルコシダーゼ（Ｂ　Ｇ）成分ｊとは、ＢＧ活性を示すセルラーゼ成分を 意味する。すなわち、そのような成分は、セロビオースおよび他の溶性セロオリ ゴ糖（「セロビオース」）の非還元末端から作用しはじめ、唯一の生成物として グルコースを生成させる。ＢＧ酸成分、セロビオース重合体上には吸着されず、 または反応しない。さらに、そのようなりＧ成分は、グルコースにより競合的に 阻害される（Ｋｉはほぼ１ｍＭである）。厳密に言えば、ＢＧ酸成分セルロース を分解できないので、本当はセルラーゼではないが、これらの酵素は、ＣＢＨ成 分およびＥＧ酸成分組合せ作用によって生成される阻害セルロース分解生成物（ 特にセロビオース）をさらに分解することによりセルロースの全体的な分解を促 進させるので、そのようなりＧ成分はセルラーゼ系の定義に含まれる。ＢＧ酸成 分存在しないと、結晶性セルロースの加水分解はわずかじか、またはほとんど行 なわれない。ＢＧ酸成分しばしば、ｐ−ニトロフェノール　Ｂ−Ｄ−グルコシ） ’（ＰＮＰＧ）のようなアリール基質に特徴付けられる。あるアリール−グルコ シダーゼはセロビオースを加水分解しないという点で、全てのアリール−グルコ シダーゼがＢＧ酸成分あるわけではないことに注意すべきである。

２、　置床！ Ａ、ポリエチレンゲルコールによるＥＧＩＩＩの回収本発明は一部は、特定のポ リエチレングリコールを添加することにより、ＥＧＩＩＩを含有するセルラーゼ タンパク質の水性混合物から、他のセルラーゼタンパク質を実質的に含まないＥ ＧＩＩＩセルラーゼが得られるという発見に関するものである。驚くべきことに 、これらの条件下において、ＥＧＩＩＩ以外の実質的に全てのセルラーゼタンパ ク質が水相に残存するが、ＥＧＩＩＩは実質的に純粋な量でポリエチレングリコ ール相中に回収される。これらの条件下で、多量のキシラナーゼがポリエチレン グリコール相中に回収されることも発見され本発明を実施する好ましい方法の１ つにおいて、セルラーゼを含有する水性混合物を濾過して、細胞ブイヨン（ｃｅ ｌｌ　ｄｅｂｒｉｓ　）および他の固体を除去し、セルラーゼタンパク質を含む タンパク質の混合物を含有する濾液を作成した。より好ましくは、シトラーゼ１ ２３　（ＣＹＴＯＬＡＳＥ１２３　）（カリフォルニア州、サウスサンフランシ スコのジェネンカー　インターナショナル社から市販されている）のような細胞 を含まないセルラーゼタンパク質混合物を使用する。別の方法において、すでに ＥＧ　ＩＩＩが多い相溶性水性混合物を含む相溶性供給源、より具体的には、「 アルコールを用いた実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを産生ずる方法」と 題し、ここに全てを引用する代理人番号０１００５５−１０７の本出願と同時に 出願された米国特許出願に記載されたＥＧＩＩＩ溶液から水性混合物を得ること ができる。

濾液を濾過段階にて得た後、その濾液をポリエチレンゲルコール（ＰＥＧ）と接 触させる前に、濾液に無機塩を加えてもよい。ある場合には、無機塩を添加する と、水相からポリエチレングリコール相中へのＥＧＩＩＩセルラーゼ成分の分割 を高めることができる。

次いで、有為な量のＥＧＩＩＩをポリエチレングリコール相に運搬するのに十分 な期間に亘すポリエチレングリコールと水性混合物を混合する。そのような特定 の期間は、添加するポリエチレングリコールの量、添加する塩の量等により変化 する。そのような要件は当業者により容易に確かめられる。しかしながら、好ま しい実施態様においては、少なくとも約２時間、より好ましくは約４時間、そし て最も好ましくは約１８時間に亘りポリエチレングリコールを水性混合物と混合 する。相が分離するのに十分な期間、好ましくは少なくとも約４時間、より好ま しくは８時間、最も好ましくは約１８時間に亘り、混合後にポリエチレングリコ ール水性混合物を放置する。２相混合液が形成される。ＥＧＩＩＩセルラーゼ成 分はポリエチレングリコール相に存在している。次いでＥＧＩＩＩが多いポリエ チレングリコール相を水性相から分離する。回収したＥＧＩＩＩが多い溶液は、 これらのタンパク質のうち約５０重量パーセントから約９０重量パーセントをこ えるまでの量がＥＧＩＩＩであるセルラーゼタンパク質の混合物を含有している 。

様々な方法によりポリエチレングリコール相からＥＧＩＩＩ成分を精製すること ができる。好ましい実施態様において、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を冷たいエ タノールにより沈殿させ、所望の水溶液中に再懸濁さらられる。適切な緩衝液は 、ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸ナトリウム、またはｐＨ５の１０ｍＭのクエン酸リン 酸のような、ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない従来技術で知られている緩 衝液である。

本発明の本質的な特徴の１・つば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用す ることである。ＰＥＧは固有に活性であり、他のセルラーゼタンパク質を含有す る水性混合物からＥＧＩＩＩセルラーゼを回収するのに選択性を有することが分 かった。この点に関して、「効果的な量のポリエチレングリコール」とは、有為 な量のＥＧＩＩＩ成分を他のセルラーゼタンパク質から分割するのに必要な、水 性混合物の添加される量を意味する。添加するポリエチレングリコールの量は、 好ましくは０．５％（Ｗ／　Ｖ　）から１０％（Ｗ／Ｖ）までの範囲にあり、よ り好ましくは４％（ｗ／ｖ）である。本発明の方法に使用するＰＥＧの平均分子 量は、約５、０００から約１０．０００までの範囲に亘り、好ましくは約７．０ ００から約９．０００までの範囲に亘り、そして最も好ましくは約ｇ、　ｏｏｏ である。

上述した方法に関して、実質的に約５．０００未満の分子量を有するポリエチレ ングリコールを使用すると、他のセルラーゼ酵素からの分離が好ましくなくなっ てしまう。一方約１０．０００より実質的に大きい分子量を有するポリエチレン グリコールを使用すると、ＰＥＧ相から捕獲するＥＧＩＩＩセルラーゼ成分の量 が減少してしまう。好ましい実施態様において、ポリエチレングリコールの分子 量は約ｓ、　ｏｏｏである。

セルラーゼタンパク質の水性混合物は、ＥＧ　ＩＩＩの百分率と比較して高い百 分率の他のセルラーゼタンパク質を含有しているので、そのような水性混合物か らＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を分離するのにポリエチレングリコールが特に有 用であることが分かった。シトラーゼ１２３セルラーゼ系中のセルラーゼタンパ ク質の標準分布を以下に示す： ＣＢＨｌ　４５−５５重量パーセント ＣＢＨＩＩ　１３−１５重量パーセントＥＧ　Ｉ　１１−１３重量パーセント ＥＧ　ＩＩ　８−１０重量パーセント ＥＧ　ＩＩＩ　１−４重量パーセント ＢＧ　Ｏ，５−１重量パーセント 本発明の方法により、有用な量のＥＧＩＩＩ成分が得られる。他の方法と比較し た本発明のＰＥＧ抽出方法によるＥＧＩＩＩ成分の回収の損失は、ＥＧ　ＩＩＩ 成分の回収速度により補償される。この方法には精製のための大規模な分画工程 は必要ないが、所望であれば、さらなる精製のためにそのような工程を続いて行 なうこともできる。

「無機塩」とは、ポリエチレングリコールとともに使用する場合に、タンパク質 を変性させることなくＥＧ　ＩＩＩの精製を促進させる硫酸イオンまたはリン酸 イオンを有する相溶性無機塩を意味する。そのような無機塩の例としては、硫酸 ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸 カリウム等が挙げられる。「効果的な量の無機塩」とは、ポリエチレングリコー ルを含有する水性混合物に添加するときに、ＥＧＩＩＩ成分をポリエチレングリ コール相中に優先的に分離し、水相中にＥＧＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質 を保持する量を意味する。

無機塩の濃度を変更させて、所望の結果を得ることができる。約４％（Ｗ／Ｖ） から約２０％（ｗ／ｖ）の濃縮塩溶液、より好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）から 約１４％（Ｗ／　Ｖ　）の濃縮塩溶液の存在下で、ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分が ＰＥＧ相中で最良に金属イオン封鎖されることが分かった。塩のレベルが約２０ ％（Ｗ／Ｖ）より実質的に多い場合には、沈殿を生じてしまい、塩のレベルが約 ４％（Ｗ／　Ｖ　）より実質的に少ない場合には、分離が望ましくなくなるか、 または溶液が１つの相のままとなってしまう。

Ｂ、　分画によるＥＧＩＩＩセルラーゼの回収本発明の方法を実施する別の好ま しい方法において、分画によりシトラーゼ１２３のような、セルラーゼタンパク 質を含有する濾過した水性混合物からＥＧＩＩＩを回収する。適切な脱塩樹脂を 用いて適切な段階で水性混合物を脱塩し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換 樹脂を用いてＥＧＩＩＩを分離することにより、そのような分画を行なうことが できる。具体的には、ｐＨ６，ｇの１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いて セファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂カラムにより水性混合物を最初に脱塩する ことによりＥＧＩＩＩを回収した。次いで脱塩した溶液をＱＡＩ−リスアクリル Ｍ陰イオン交換樹脂カラムに充填する。このカラム上に結合しなかった分画はＥ ＧＩＩＩを含有している。この分画を、ｐＨ４，５の１０ｍＭのクエン酸ナトリ ウムで平衡状態にしたセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂カラムを用いて脱塩 する。この溶液をＳＰ）リスアクリルＭ陽イオン交換樹脂カラムに充填する。２ ００　ｍＭの塩化ナトリウムの水溶液によりＥＧＩＩ■セルラーゼ成分を溶離さ せる。

本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、陽イオン交換カラムから得 たＥＧＩＩＩ試料をさらに分画することができる。事前にｐＨ４の１０ｍＭのク エン酸ナトリウムにより平衡状態にしたセファデックスＧ−２５カラムによりＥ Ｇ　ＩＩＩ試料を脱塩する。モノ−３−ＨＲ５１５カラムにュージャージー州、 ピスキャタウェイのファーマシアＬＫＢバイオテクノロジーから得られる）を用 いて、その溶液をＦＰＬＣシステムに供した。次いで、０．５ｍｌ／分の速度で 塩化ナトリウム水溶液の０−２００ｍＭの勾配によりそのカラムを溶離させる。

ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を回収した。ゲル電気泳動によってこのＥＧＩＩＩセ ルラーゼ成分の純度は９０％よりも大きいことが分かった。ＥＧＩＩＩのこの純 度は、既知の技術によりＮ末端アミノ酸配列をめるのに適している。

セファロース樹脂はよく知られた種類の樹脂である。ここに使用している「セフ ァロース」とは、塩を保持するがＥＧＩＩＩを排除するのに十分な排除サイズ（ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　５ｉｚｅ）を有する任意のセファロース樹脂を意味する。

ここに使用している「陰イオン交換樹脂」とは、ＥＧＩＩＩのｐＨより低いｐＨ において、ＥＧＩＩＩ以外のセルラーゼタンパク質の少なくともいくらかと結合 するのに十分な電荷密度を供する陽イオン官能基を有する任意の樹脂を意味する 。適切な陰イオン樹脂は、アミノエチル（Ａ　Ｅ）官能基、ジエチルアミノエチ ル（ＤＥＡＥ）官能基および第４アミノエチル（ＱＡＥ）官能基を有する。ここ に使用している「陽イオン交換樹脂」とは、ＥＧ　ＩＩＩのｐｌより低いｐＨで ＥＧＩＩ■と結合するのに十分な電荷密度を供する陰イオン官能基を有する任意 の樹脂を意味する。適切な陽イオン樹脂は、スルホプロピル（ｓ　ｐ）官能基、 ホスホ（Ｐ）官能基およびカルボキシメチル（ＣＭ）官能基を有する。

上述したＥＧＩＩＩセルラーゼ成分をさらに精製することが望ましいと尾燃せれ る場合もある。例えば、最初のＰＥＧ抽出方法から得た物質を２番目の分画方法 に用いることにより、またその逆に２番目の分画方法から得た物質を最初のＰＥ Ｇ抽出方法に用いることにより、上述した方法において単離したＥＧＩＩＩセル ラーゼ成分をさらに精製することもぐきる。

代理人番号０１００５５−１０７として本出願とともに出願し、ここに全てを引 用する、「アルコールを用いた、実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを産生ず る方法」と題する米国特許出願に記載されている方法により、ここに回収したＥ ＧＩＩＫをさらに精製することもできる。

上述した記載は本発明の方法を実施する好ましい方法に関するものであり、本発 明の教示により上述した方法を様々に変更できることが分がるであろう。様々な 方法の条件を変更することができ、使用する試薬を変更して、ＥＧ　ＩＩＩ成分 を含有する任意の適した酵素の水性混合物からＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を回収 する様々な所望のまたは最適な操作条件を供することができる。

当業者には理解されるように、本発明の方法の記載において上述した酸、塩基お よび塩を変更できるか、または本発明の操作を妨害せずに所望のｐＨまたは所望 の塩含有量を供するが、ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分を変性しない等価の酸、塩基 または塩と置換できる。

さらに、本発明の分画方法の前に本発明の抽出方法を行なうこともできるが、そ の逆でもよい。本発明の分画方法によってさらに精製して実質的に純粋なＥＧＩ ＩＩセルラーゼを含有する水溶液を供することができる、ＥＧＩＩＩが多いポリ エチレングリコールの最初の相を提供するように、水性混合物をポリエチレング リコールにより抽出することができる。

適切な発酵条件下でＥＧＩＩＩを産生するトリコデルマ　ｓｐｐ、の菌株を含む 任意の供給源からＥＧＩＩＩセルラーゼを精製できる。ＥＧＩＩＩの特定の供給 源は重要ではないが、好ましい供給源は、トリコデルマ　リーセイおよびトリコ デルマ　ビリデである。トリコデルマ　リーセイからのＥＧＩＩＩの特に好まし い供給源は、ジエネンヵー　インターナショナル社（９４０８０、カリフォルニ ア州、サウスサンフランシスコ、１８ｏキンボールウエイ）から市販されてるシ トラーゼ１２３である。トリコデルマ　ｓｐｐ、由来の完全セルラーゼ系（「全 セルラーゼ」）から実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを得る適切な方法とし ては、以下に述べる実施例に記載された方法が挙げられる。これらの実施例は、 全セルラーゼにＰＥＧ抽出および／または異なる分画物質（カラム）を用いた繰 返しの分画工程を行なうことにより１、実質的に純粋なＥＧ！ＩＮセルラーゼが 容易に得られることを示している。

ＥＧＩＩＩの単離効率を高めるために、ＥＧＩＩＩを過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐ ｒｅｓｓ　）するように、および／またはＥＧ　Ｉ成分、ＥＧＩＩ成分、ＣＢＨ １成分および／またはＣＢＨＩＩ酸成分うちの１つ以上を産生できないように、 遺伝子的に修飾した微生物（例えば、トリコデルマ　リーセイ）を用いることが 望ましいと思われる。このようにすることにより必ず、例えば、上述したような 分画および／またはＰＥＧ抽出によってＥＧＩＩＩをより能率的に単離すること ができる。トリコデルマ　リーセイのこれらの菌株のうちのいくつかの産生が、 １９９１年３月１３日に出願された米国特許出願第０７／６６８．６４０号およ び下記の実施例に開示されている。

さらに、実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを産生ずるように微生物を遺伝子 的に修飾することにより、実質的に純粋なＥＧ　ＩＩＩセルラーゼを調製できる と考えられる。例えば、下記の実施例に述べる分画方法により調製した実質的に 純粋なＥＧＩＩＩを使用して、既知の塩基配列決定法を用いてタンパク質の一部 のアミノ酸配列を決定した（実施例４）。ＥＧＩＩＩセルラーゼ成分をコード化 する遺伝子をクローニングするために、この情報を用いて合成りＮＡプローブを 調製することができる。一度ＥＧＩＩＩ遺伝子をクローニングしたら、既知の技 術によりＥＧＩＩＩ遺伝子を操作し、最終的には様々なトリコデルマｓｐｐ、菌 株中かまたは他の微生物中に挿入できる。例えば、１９９０年１０月５日に出願 された米国特許出願第０７１５９３．９１９号の一部継続出願である、１９９１ 年１０月４日に出願された米国特許出願第０７／７７０．０４９号、および１９ ９１年３月１３日に出願された米国特許出願第０７／６６８．６４０号を参照の こと。それらの特許出願には、修飾した微生物が１つ以上のセルラーゼ遺伝子を 発現できず、実際に別のセルラーゼ遺伝子を過剰産生じ得るように、トリコデル マ　リーセイを遺伝子操作する方法が開示されている。１９９１年１０月４日に 出願された米国特許出願第０７／７７０．０４９号、１９９０年１０月５日に出 願された米国特許出願第０７１５９３．９１９号、および１９９１年３月１３日 に出願された米国特許出願第０７／６６８．６４０号の開示の全てを引用する。

これらの特許出願に記載された方法を用いて、他のセルラーゼタンパク質ととも に、またはそれを除いてＥＧＩＩＩを産生するようにトリコデルマ　リーセイを 遺伝子操作することができる。さらに、これらの出願に記載された方法では、ど のような異種タンパク質をも産生じないトリコデルマ　リーセイ菌株を調製して いる。

さらに、他の微生物中にＥＧＩＩＩコード化遺伝子を発現することが可能である 。そのような微生物の例としては、以下に限定されるものではないが、サツカロ ミセス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 　、ピチア　バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　）　、ハンセニュ ーラ　ポリモルフｙ　（Ｅｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クル イベロミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　、ヤ ロウィア　リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ　）　、シャ ンニオミセス　オクシデンタリス（Ｓｃｈａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅ ｎｔａｌｉｓ）等のような酵母種が挙げられる。例えば、ＰＣＴ特許出願第ｔｏ 　８５１０４６７２号を参照のこと。非トリコデルマ宿主であるこれらの代替物 において発現を行なうためには、ＥＧＩＩＩコード化ＤＮＡ配列をその特定の宿 主からの遺伝子より得られたプロモーター配列およびターミネータ−配列に機能 的に結合させる必要があることもある。また、ＥＧＩＩＩ分泌信号配列をコード 化するＤＮＡ配列の代わりに、代替宿主からの分泌信号配列をコード化するＤＮ Ａ配列を用いる必要があると思われる。他の生物内でＥＧＩＩＩを産生および分 泌することにより、実質的に純粋な形態でＥＧＩＩＩを得ることができる。

上述した実質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼをさらに、液体希釈物、顆粒、エ マルジョン、ゲル、ペースト等に加工することもできる。そのような形態は当業 者によく知られている。固体の洗浄剤組成物が望ましい場合、セルラーゼ組成物 を好ましくは顆粒として調合する。好ましくは、セルラーゼ保護剤を含有するよ うに顆粒を調合することができる。例えば、代理人番号第０１００５５−０７３ 号として１９９１年１月１７日に出願された、「酵素および酵素保護剤の両方を 含有する顆粒並びにそのような顆粒を含有する洗浄剤組成物」と題する米国特許 出願第０７／６４２．６６９号を参照のこと。この出願の全てを引用する。同様 に、顆粒の洗浄媒質中への溶解速度を遅くする物質を含有するようにその顆粒を 調合することもできる。そのような物質と顆粒が、代理人番号第ＧＣ３−１７１ −ＵＳ１番として１９９１年１月１７日に出願された、「顆粒組成物」と題する 米国特許出願第０７／６４２．５９６号に開示されており、その出願の全てをこ こに引用する。次いでＥＧＩＩＩを含有する顆粒または他の洗浄剤配合物を織物 の洗浄に用いて、柔軟特性を織物等に与えることができる。

以下の実施例は本発明を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を制 限するものとして考えるべきではない。

実　施　例 Ａ、　細胞を含まないセルラーゼの濾液１００リツトルを約３０℃に加熱した。

加熱した物質を、約４％（Ｗ／Ｖ）カーボワックス（登録商標）ＰＥＧ８０００ （ポリエチレングリコール、約８０００の平均分子量）（コネチカット州、ダン バリー、ユニオンカーバイド）および約１０％（Ｗ／　Ｖ　）無水硫酸ナトリウ ムとして調製した。混合物を２相の液体混合物を形成した。５Ａ−１デイスク　 スタック遠心分離機を用いて相を分離した。銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎ ｉｎｇ　）等電点電気泳動ゲルを用いて相を分析した。ＥＧＩＩＩおよびキシラ ナーゼについて分画と集積を行なった。回収した組成物は約２０重量パーセント から約５０重量パーセントまでの範囲のＥＧＩＩｒを含有していた。ポリエチレ ングリコール相中に回収されたキシラナーゼの量は、少なくとも４倍キシラナー ゼが豊富であった。

Ｂ、　細胞を含まないセルラーゼ濾液１００リツトルを、円錐形の底および底の 中心に排出口を有する１３０　リットルの容器に加えた。出発物質は、ＥＧＩＩ Ｉ以外のセルラーゼが欠失したおよび／またはＥＧＩＩＩが過剰発現された菌株 からのセルラーゼまたは全セルラーゼであってもよい。限外濾過は必要条件では ないけれども、タンパク質の濃度を約Ｌｏｇ／Ｉから約５０ｇ／ｌまでの範囲に 保持すべきである。

次に、平均分子量８０００のポリエチレングリコール４ｋｇと硫酸アンモニウム １０ｋｇをセルラーゼ濾液に加えた。混合物を１８時間に亘すオーバーヘッドミ キサー中で混合した。混合後、１８時間におよび相を分離させた。相を分離した ままにするように底の排出口から底の相を除去した。ＰＥＧ相を採集し、３０分 間に亘り５゜０００ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。ＥＧＩＩＩ活性 はポリエチレングリコール溶液中において安定である。

ポリエチレングリコールからのタンパク質の除去は、ポリエチレングリコールは エタノールに溶性であり、タンパク質は溶性ではないという事実を利用するもの である。この段階において、ある塩も除去し、タンパク質を濃縮させている。

ＰＥＧ相のアリコート２００　ｍ　ｌおよび冷たい（−２０℃）エタノール８０ ０　ｍ　ｌを１リツトルの遠心分離ボトル中でよく混合し、−２０℃で約１８時 間に亘り放置した。

混合物を３０分間に亘り５．０００ｘｇで遠心分離し、溶液にデカンテーション を行ない、沈殿物を脱イオン水で濯いだ。

沈殿したタンパク質を溶解させる緩衝液の選択は、それに続くクロマトグラフィ 一工程か、または最終工程の場合にはＥＧＩＩＩが多い溶液を調製する工程に依 存する。一般的に、緩衝液は、陽イオン交換クロマトグラフィーの調製において 、ｐＨ５の５０ｍＭ酢酸塩、またはｐＨ４の１０ｍＭクエン酸リン酸のいずれか である。

ＰＥＧ抽出物の回収は、ＲＢＢ−ＣＭＣ活性に基づいて測定でき、合計容量を以 下に示す。ＲＢＢ−ＣＭＣ活性を測定する方法を実施例３に記載する。

表　１ 試　料　希釈　０Ｄ５９０　０Ｄ、／＋１　容量ｍｌ　合計ＯＤ％　回収ブイヨ ン　４０　．２９９　１２．０　４０００　４７８４０　１００ＰＥＧ　１００ 　．１９３　１９．３　５１０　９８４３　２１抽残液　４０　．２３４　９． ３６　３４９０　３２６６６　６８活性の回収はＰＥＧ相中への１５パーセント から３０パーセントまでの範囲におよぶ。

この工程は、出発物質がＥＧ　ＩおよびＩＩの欠失したセルラーゼである場合、 合計のエンドグルカナーゼ活性の百分率としての最高損失を示している。各々の クロマトグラフィーの工程による損失は、各々の工程について比較により約２０ ％以下、小さくなる傾向にある。

クロマトグラフィー １０ｍＭ５ｐＨ５のクエン酸／リン酸緩衝液に対してオメガシリーズ接線流動８ ゜０００限外濾過膜（ｏｍｅｇａ　５ｅｒｉｅｓ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌ ｏｗ　８．０００　ｕｌｔｒａ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅ高■ ｒａｎｅ）　（マサチューセッツ州、ノースボロー、フィルトン　テクノロジー 社）を用いて、実施例Ｉから得たＥＧＩＩＩが多い溶液であるパート（ｂ）を完 全に濾過した（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ　）　ｏ溶液を、平衡状態にある（ｐＨ ５，１０ｍＭ　クエン酸／リン酸）ＳＰトリスアクリルカラムに装填し、通過し た溶液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を集積し、０．５Ｍのクエン酸によりｐＨ を４に調節した。通過した溶液を平衡状態にある（ｐＨ４，１０ｍＭ　クエン酸 ／リン酸）ＳＰ）リスアクリルカナムに装填した。ＥＧ’ｌｌｌ成分を２５０　 ｍＭの塩化ナトリウムにより溶離させた。

野生型トリコデルマ　リーセイにより産生される完全菌類セルラーゼ組成物（シ トラーゼ１２３、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ、ジェネンカー　 インターナショナル社から得られる）を分画することにより、ＥＧ　ＩＩＩの精 製を行なう。具体的には、以下の樹脂：シグマケミカル社（ミズーリ州、セント ルイス）から得られるセファデックスＧ−２５濾過樹脂、ＩＢＦバイオテクニク ス社（メリーランド州、サベージ）から得られるＱＡトリスアクリル陰イオン交 換樹脂およびＳＰトリスアクリル陽イオン交換樹脂を含有するカラムを用いて分 画を行なう。１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨ６，８に緩衝された ３リツトルのセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラムを用いて０．５ｇの シトラーゼ１２３セルラーゼを脱塩させる。次いで脱塩した溶液を、１０ｍＭ　 リン酸ナトリウム緩衝液によりｐＨｅ、ｓに緩衝された２０ｍ１のＱＡトリスア クリルＭ陰イオン交換樹脂のカラムに装填する。このカラムに結合した分画はＣ ＢＨ１およびＥＧ　Ｉを含有していた。このカラムに結合しなかった分画はＣＢ Ｈ１１、ＥＧＩＩおよびＥＧＩＩＩを含有している。１０ｍＭ　クエン酸ナトリ ウムによりｐＨ４，５に緩衝したセファデックスＧ−２５ゲル濾過樹脂のカラム を用いて、これらの分画を脱塩する。この溶液２００　ｍ　ｌを、２０ｍ１のＳ Ｐ）リスアクリルＭ陽イオン交換樹脂のカラムに装填する。２００ｍＭ　塩化ナ トリウムの水溶液１００　ｍ　ｌによりＥＧＩＩＩを溶離させた。

ＥＧＩＩＩをさらに精製する方法の１つは、この実施例２により得られたＥＧ　 ＩＩＩ試料をさらに分画することにより行なわれる。Ｍｏｎｏ−８−ＨＲ５１５ カラムにュージャージー州、ピスキャタウエイ、ファーマシア　ＬＫＢバイオテ クノロジー社から得られる）を用いてＦＰＬＣシステムにより分画を行なった。

ＦＰＬＣシステムは、液体クロマトグラフィーコントローラ、２つのポンプ、二 重通路モニター、分画コントローラおよびチャートレコーダ（全てニューシャー シー州、ピスキャタウエイ、ファーマシア　ＬＫＢバイオテクノロジー社から得 られる）からなる。事前に１０ｍＭ　クエン酸ナトリウムによりｐＨ４に緩衝し ておいた２０ｍ１のセファデックスＧ−２５カラムを用いてこの実施例２で調製 した５ｍｌのＥＧＩＩＩ試料を脱塩することにより分画を行なった。事前に１０ ｍＭ　クエン酸ナトリウムでｐＨ４，０に緩衝しておいたＭｏｎｏ−３−ＨＲ５ １５カラムにその溶液を装填し、０．５ｍｌ／分の速度で０−２００ｍＭのＮａ Ｃ１の水溶液勾配により溶離させ、１ｍｌの分画に試料を集積した。分画１０お よび１１においてＥＧ　ＩＩＩを回収した。ゲル電気泳動によりこのＥＧＩＩＩ は９０％より大きく純粋であることが測定された。この純度のＥＧＩＩＩは既知 の技術によるＮ末端アミノ酸配列を決定するのに適している。

実質的に純粋なＥＧＩＩＩは、トリコデルマ　リーセイから単離した他のエンド グルカナーゼと匹敵する以下の特性を有している。

表　２ 分　子　量　ｐＩ　Ｈ最適値Ｉ ＥＧ　Ｉ　〜４７−４９　ｋＤ　４．７　〜５ＥＧＩＩ　〜３５ｋＤ５．５　〜 ５ ＥＧＩＩＩ　〜２５−２８　ｋＤ　７．４　〜５．５−６．０１、下記の実施例 ３によるＲＢＢ−ＣＭＣ活性によりめられたｐＨ最適値上記表から分かるように 、トリコデルマ　リーセイの他のエンドグルカナーゼ成分と比較して、ＥＧＩＩ Ｉは大きいｐＨ最適値および大きいｐｒの両方を有する。下記の実施例３におい て、ＥＧＩＩＩはアルカリｐＨの条件下で相当なＲＢＢ−ＣＭＣ活性を保持する ことが分かる。

同様に、他の菌株を含む他の供給源から得たＥＧＩＩＩセルラーゼも上記方法に より精製することができる。トリコデルマ　ビリデ由来のＥＧＩＩＩセルラーゼ が、Ｖｏｒａｇｅｎ等のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｓ　１ ６０：２４３−２４９に記載されている。この参考文献は、約２３．５キロダル トンの分子量、５．５のｐＨ最適値、および７．７のｐｌを有するＥＧ　ＩＩＩ セルラーゼを記載している。

ＥＧＩＩＩの単離効率を高めるために、ＥＧＩＩＩを過剰発現するようにおよび ／または１つ以上のＥＧ　Ｉ成分、ＥＧＩＩ成分、ＣＢＨＩ成分および／または ＣＢＨ−１１成分を産生できないように、遺伝子的に修飾したトリコデルマ　リ ーセイを用いることが望ましいと思われる。

同様に、上述したＥＧＩＩＩ組成物をさらに精製するすることが望ましいと思わ れる。例えば、実施例１において単離したＥＧＩＩＴタンパク質を、上述した方 法によりさらに精製することもでき、またはその逆を行なうこともできる。

めた。最初のセルラーゼ組成物は、ＣＢＨＩ成分およびＣＢＨＩＩ成分を産生で きないように、以下に記載する方法と同様な方法で遺伝子的に修飾したトリコデ ルマ　リーセイから調製したＣＢＨＩおよび！■の欠失したセルラーゼ組成物で あった。約５８パーセントから約７０パーセントまでの範囲のトリコデルマリー セイ由来のセルラーゼ組成物から一般的になるこのセルラーゼ組成物は、ＣＢＨ ＩおよびＣＢＨＩＩを含有しないかぎり、このセルラーゼ組成物は必然的にＥＧ 酸成分多く含んでいる。ＥＧＩＩＩはトリコデルマ　リーセイのエンドグルカナ ーゼ成分の最も少ない成分であるので、この組成物においてはＥＧＩ成分および ＥＧＩＩ成分が優位を占めている。

第２のセルラーゼ組成物は、実施例２と同様な精製方法によりトリコデルマリー セイ由来のセルラーゼ組成物から単離したＥＧＩＩＩの約２０−４０％の純粋な 分画であった。

これらのセルラーゼ組成物の活性を４０℃で測定した。この測定は以下の方法を 用いて行なったものである。

必須の量の酵素を提供するのに十分な濃度の、５μｌから２０μｌまでの範囲の 適切な酵素溶液を最終溶液に加える。ｐＨ４，５，５，５，６，６，５，７，７ ，５および８で０．０５Ｍ　クエン酸／リン酸緩衝液中に、２重量パーセントの ２５０μｍのＲＢＢ−ＣＭＣ（レマゾル　ブリリアント　ブルー　Ｒ−カルボキ シメチルセルロース；オーストラリア国、２１５１、Ｎ、Ｓ、　Ｗ、　、ノース ロック、６アルトナプレース、メガザイムから市販されている）を加える。

ポルテックス混合（ｖｏｒｔｅｘ）　Ｌ、３０分間に亘り４０℃で定温放置する 。水浴中で５分間から１０分間までの期間に亘り冷却する。０．３Ｍの酢酸ナト リウムおよび０゜０２Ｍの酢酸亜鉛を含有する１０００μｍのメチルセロソルブ を加える。ポルテックス混合し、５分間から１０分間までの期間に亘り放置する 。遠心分離し、キュベツト中に上澄を注ぎ入れる。

各々のキュベツト中において溶液の光学密度（ＯＤ）を５９０ｎｍで測定するこ とにより、相対酵素活性をめた。光学濃度が高いほど、酵素活性が高い。

この分析の結果を第１図に示す。この図面は、ＥＧＩＩＩセルラーゼ組成物と比 較したＣＢＨ１およびＩＩが欠失したセルラーゼ組成物の相対活性を示すもので ある。この図面より、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩの欠失したセルラーゼ組成物は 、ｐＨ５，５付近でＲＢＢ−ＣＭＣに対して最適セルロース分解活性を有し、ア ルカリ性のＭＬすなわち、７を越えて８までのｐＨにおいである程度活性を有す ることが分かる。一方で、ＥＧ　ＩＩＩの多いセルラーゼ組成物はほぼｐＨ５， ５−６において最適セルロース分解活性を有し、アルカリ性のｐＨでも相当な活 性を有している。

この実施例の目的は、異なるＥＧＩＩＩセルラーゼ組成物の等電点電気泳動ゲル を説明することにある。具体的には、野生型トリコデルマ　リーセイにより産生 されたセルラーゼ、ＥＧ　ＩおよびＥＧＩＩのセルラーゼタンパク質を発現でき ないように実施例１６および１７の方法により形質転換したトリコデルマリーセ イ菌株由来のセルラーゼ；および実施例１の方法と同様な方法により産生じた実 質的に純粋なＥＧＩＩＩセルラーゼを等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。

製造者の説明にしたがって、ファーマシアＩＥＦシステムにュージャージー州、 ピスキャタウエイ、ファーマシア社、ＦＢＥ−３０００）およびｐＨ３−１０プ レキヤストゲル（ドイツ、カールベルブ、サーバから得られるサーバリド　プレ コテ）を用いて、これらのセルラーゼ試料を等電点電気泳動により分析した。

ゲルをエフオルチック（登録商標）染料（１１５９０ニユーヨーク州、ウェスト バリー、サーバ　ファイン　バイオケミカルス社から得られるサーバブルーＷ） により染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。得られたゲルを第２図に示す 。第２図のレーン１は、野生型トリコデルマ　リーセイ菌株由来のセルラーゼの 等電点電気泳動ゲルを示している。レーン２は、ＥＧ　ＩおよびＩＩを発現でき ないように遺伝子的に修飾したトリコデルマ　リーセイ菌株由来のセルラーゼの 等電点電気泳動ゲルを示している。レーン３は、実質的に純粋なＥＧＩＩＩセル ラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。この図面において、レーン１に隣接 する縁に、タンパク質を同定するようにセルラーゼタンパク質に対応するバンド を記載している。

この図面から、ＥＧ　ＩＩＩのｐｌが大きいので、このタンパク質は、ｐｌの大 きいキシラナーゼ、ｐＩの大きいβ−グルコシダーゼのような他のｐＩの大きい 成分と通常関連する領域に見られるのが分かる。さらに、この図面のレーン２に は、ＥＧＩおよびＩＩのタンパク質は存在しないがＥＧＩＩＩタンパク質は存在 するので、ＥＧＩＩＩはＥＧ　ＩまたはＥＧＩＩのタンパク質のいずれの分解生 成物ではないことがこの図面から分かる。

０．９ｍｌのアセトンを０．１ｍｌのタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌの濃度で） に加えることによりＥＧ　ＩＩＩ成分を沈殿させ、−２０℃で１０分間に亘り定 温放置した。遠心分離によりタンパク質を集積し、集積物を乾燥させてペレット 化し、８８％のぎ酸中に溶解させた８Ｍ　尿素溶液０．０１ｍ１および８８％の ぎ酸中に溶解させた臭化シアン（２００ｍ　ｇ／ｍ　１　）溶液０．０１ｍ１中 に再懸濁させた。混合物を４時間に亘り室温で定温放置した。

個々のペプチドをＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）カラムを用いて精製 した。シンクロバックＲＰ−４カラムを、脱イオンしたミリＱ水（＋ｏｉｌｌｉ Ｑ）中で０．０５％のＴＥＡ　（）リエチルアミノ）および０．０５％のＴＦＡ 　（）リフルオロ酢酸）により平衡状態させた。試料をＨＰＬＣカラムに装填し 、１００％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＥＡ並びに０．０５％のＴＦ Ａにより、１分当たり１％の勾配で溶離を行なった。単離したペプチドのアミノ 末端領域を、全自動装置を用いたエドマンの方法により配列分析した。ＥＧＩＩ Ｉ成分の２つの断片から得られたアミノ酸配列を第３図に示す。

実施例６ トリコデルマ　リーセイのｐ）’　ｒ４−誘導体の選択ｐＹｒ４遺伝子は、ウリ ジンの生合成に必要な酵素であるオロチジン−５′−モノホスフェートデカルボ キシラーゼをコード化する。毒性阻害因子５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）を 野生型細胞によりウリジン中に取り込み、細胞を被毒させる。しかしながら、ｐ ｙｒ４遺伝子が欠けた細胞は、この阻害因子に対して抵抗性を有するが、成長の めたにウリジンを必要としている。したがって、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４誘導体 菌株を選択することが可能である。実際、トリコデルマ　リーセイ菌株ＲＬ−３ ７の芽胞（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、　Ｇ、およびＭｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ、 　Ｂ、　Ｓ、、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　 ２０．４６−５３頁（１９８４）　）を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．２ ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含有する凝固培地の表面に広げた。任意のＦＯＡ抵抗性コ ロニーが３日から４日以内に現れ、成長のためにウリジンを必要としたそれらの ＦＯＡ抵抗性誘導体を続いて同定することが可能であった。欠損ｐｙｒ４遺伝子 を有するそれらの誘導体を同定するために、プロトプラストを産生じ、野生型ｐ ｙｒ４遺伝子を含有するプラスミドにより形質転換した（実施例８および９を参 照のこと）。形質転換後、ウリジンを欠いた培地上にプロトプラストを平板固定 （ｐｌａｔｅ　）　した。形質転換したコロニーの成長は、プラスミドボーン（ ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ　）　ｐ　ｙ　ｒ　４遺伝子により欠損ｐｒｙ４遺 伝子の相補性を示した。このようにして、菌株ＧＣ６９を菌株ＲＬ−Ｐ３７のｐ ｙｒ４−誘導体として同定した。

実施例７ ＣＢＨＩ欠失ベクターの調製 ＣＢＨＩタンパク質をコード化するｃｂｈｌ遺伝子を、既知のプローブ合成方法 （Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ等、１９８３ｂ　）を用いてこの遺伝子の公表されている 配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプローブによる雑種形成により、ト リコデルマリーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３７のゲノムＤＮＡからクローニングした。ｃ ｂｈｌ遺伝子は６．５ｋｂのＰｓｔｌ断片上にあり、Ｐｓｔｌにより切断したｐ Ｕｃ４Ｋにュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア社から購入した ）中に挿入し、従来技術で知られている技術を用いてこのベクターのＫａｎ’を 置換した。この技術は、）［ａｎｉａｔｉｓ等（１９８９）に述べられており、 ここに引用する。得られたプラスミドｐＵＣ４に：　：　ｃｂｈｌをＨｉｎｄＩ 　Ｉ　Ｉにより切断し、約６ｋｂの大きな断片を単離し、再度連結してｐＵＣ４ に：　：　ｃｂｈｌΔＨ／Ｈを得た（第４図を参照のこと）。この方法により、 金縁ｃｂｈｌ暗号配列および上流の約１．２ｋｂのフランキング配列（ｆｌａｎ ｋｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）ならびに下流の約１．５ｋｂのフランキング配 列を除去した。元のＰｓｔ、Ｉ断片のいずれかの末端からほぼｌｋｂのフランキ ングＤＮＡが残っている。

１１ａｎｉａｔｉｓ等（前出）の方法にしたがって、ｐＵｃ１８中のゲノムＤＮ Ａの６，５ｋｂ　Ｈ４ｎｄｌｌｌ断片としてトリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺 伝子をクローニングしてＩ）Ｔｐｙｒ２　（Ｓｍｉｔｈ等、１９９１）を形成し た。プラスミドｐＵＣ４に：：ｃｂｈｌΔＨ／ＨをＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉにより切 断し、末端をウシ腸アルカリ性ホスファターゼにより脱リンした。この末端脱リ ンＤＮＡを、トリコデルマリーセイｐｙｒ４遺伝子を含有する６、５ｋｂのＨｉ ｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４を得た。第４図はこのプラスミ ドの構築を示している。

約５Ｘ１０’のトリコデルマ　リーセイＧＣ６９芽胞（ｐｙｒ４−誘導体菌株） を有する５００　ｍ　ｌのフラスコ中の１００　ｍ　ｌのＹＥＧ（０，５％の酵 母抽出物、２％のグルコース）を接種することにより、菌糸を得た。約１６時間 に亘り振とうさせながらフラスコを３７℃で定温放置した。２．７５０ｘｇでの 遠心分離により菌糸を収穫した。収穫した菌糸をさらに１．２Ｍのソルビトール 溶液中で洗浄し、５ｍｇ／ｍｌのノボザイム（登録商標）２３４溶液（コネチカ ット州、ダンバリー、ノボバイオラボ社から得られる、１．３−アルファーグル カナーゼ、１．３−ベーターグルカナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キ チナーゼおよびプロテアーゼを含有する多成分酵素系の商標名である）；５ｒｒ Ｂｇ／ｍｌのＭｇ５Ｏ＜　パｌＨ２Ｏ；０．５　ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ ン、１．２Ｍのソルビトールを含有する４０ｍ１の溶液中に再懸濁させた。ミラ クロス（カリフォルニア州、ラジョラ、カルバイオケム社）を通過させる濾過に より、細胞ブイヨン（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｂｒｉｓ　）からプロトプラスト を除去し、２，０００ｘｇでの遠心分離により採集した。プロトプラストを１． ２Ｍのソルビトール中で３回洗浄し、さらにもう一度１．２Ｍのソルビトール、 ５０ｍＭのＣａＣｌ２中で洗浄し、遠心分離し、１．２Ｍのソルビトール、５０ ｍＭのＣａＣｌ２の１ｍｌ当たり約２Ｘ１０’のプロトプラストの密度で再懸濁 実施例８において調製した２００μｍのプロトプラスト懸濁液を、ＴＥ緩衝液（ １０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４；　１ｍＭのＥＤＴＡ）中のＥｃｏＲＩ切断ｐΔ ＣＢＨＩｐｙｒ４　（実施例７で調製した）２０μｌおよび２５％のＰＥＧ４０ ００と、０゜６ＭのＫＣｌと、５０ｍＭのＣａＣｌ２とを含有するポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）溶液５０μＩに加えた。この混合物を２０分間に亘り氷上 で定温放置した。この定温放置の後、２．０ｍｌの上述したＰＥＧ溶液をそこに 加え、得られた溶液をさらに混合し、５分間に亘り室温で定温放置した。この第 ２の定温放置後、１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａ　Ｃ１２を含有 する溶液４．０ｍｌをその溶液に加え、これにより得られた溶液をさらに混合し た。そのプロトプラスト溶液を、１％のグルコース、１．２Ｍのソルビトールお よび１％のアガロースを含有するボゲルの培地Ｎの溶融アリコート（１リツトル 当たり、３ｇのクエン酸ナトリウム、５ｇのＫＨ２ＰＯ，＋　、２ｇのＮＨ４Ｎ Ｏ３，０，２ｇのＭｇ　ＳＯ４＠７Ｈ２０，０゜１ｇのＣａＣｌ２　”７Ｈ２０ ，５μｇのα−ビオチン、５ｍｇのクエン酸、５ｍｇのＺｎＳＯ４”　７Ｈ２０ ，１ｍｇのＦ　ｅ　ＣＮＨ４）　２　・６　Ｈ２０，０，２５ｇのＣｕ５ｏ、” 　５Ｈ２０，５０％ｇのＭｎＳＯ４−４Ｈ２０）にただちに加えた。プロトプラ ストと培地の混合物を、上述したボゲルの培地を含有する固体培地上に注いだ。

ウリジンは培地中には存在せず、したがって、ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４中の野生型 ｐｙｒ４遺伝子挿入物による菌株ＧＣ６９のｐｙｒ４突然変異の補完の結果とし て形質転換コロニーのみが成長できた。これらのコロニーを続いて形質転換し、 添加剤として１％のグルコースを含有する固体のボゲルの培地Ｎ上で精製し、安 定な形質転換体をさらなる分析のために選択した。

この段階では、より速い成長速度およびウリジンを欠如した固体培養物上のでこ ぼこの外形よりもむしろ滑らかな円形コロニーの形成により不安定な形質転換体 とは区別される。ある場合には、固体の非選択性培地（すなわち、ウリジンを含 有している）上で形質転換体を成長させ、続いて発芽してウリジンの欠如した選 択的な培地上に成長するこれらの芽胞の百分率をめた。

実施例９で得られた形質転換体を、１％のグルコースを含有するボゲルの培地Ｎ の液体中で成長させた後、ＤＮＡをその形質転換体から単離した。これら形質転 換体のＤＮＡ試料をさらにＰｓｔＩ制限酵素により切断し、これにアガロースゲ ルの電気泳動を行なった。そのゲルをニドラン膜フィルター上にプロットし、３ ２ｐ標識ｐΔＣＢＨＩｐｙｒ４プローブにより雑種形成させた。プローブを選択 して、６．５ｋｂのＰｓｔｌ断片としての天然ｃｂｈｌ遺伝子、天然ｐｙｒ４遺 伝子および形質転換ＤＮＡ断片由来の任意のＤＮＡ配列を同定した。

雑種形成からの放射性バンドをオートラジオグラフィーにより視覚化した。オー トラジオグラフを第６図に示す。５つの試料（すなわち、ＡＳＢＳＣ％Ｄおよび Ｅ）について上述したように実験した。レーンＥは非形質転換菌株ＧＣ６９であ り、この分析においては対照として用いた。レーンＡ−Ｄは、上述した方法によ り得られた形質転換体を示すものである。オートラジオグラフの左側の数字は、 分子量マーカーの大きさを示すものである。このオートラジオグラフから分かる ように、レーンＤは６．５ｋｂのＣＢＨＩバンドを有しておらず、ｃ　ｂ　ｈ　 １遺伝子でのＤＮＡ断片の組込みによりこの遺伝子が形質転換体中で全体的に欠 失されたことを示している。ｃｂｈｌ欠失菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩと称する。

第５図は、トリコデルマ　リーセイ染色体のうちの１つのｃｂｈｌ座でｐΔＣＢ ＨＩｐｙｒ４からの大きなＥｃｏＲＩ断片を二重に交差させて組み込んだことに よるトリコデルマ　リーセイｃｂｈｌ遺伝子の欠失について概略を説明したもの である。分析した他の形質転換体は、非形質転換対照菌株と同一であるように思 われる。

使用したプローブを３２ｐ標識ｐｌｎｔ、ｃＢＨＩプローブに変えたことを除い ては、実施例１０と同様に方法をこの実施例に用いた。このプローブは、ｐＵＣ ４に：　：ｃｂｈｌΔＨ／Ｈが欠失した領域内のｃｂｈｌ座からの２ｋｂのＢｇ ｌｌ■断片を含有するｐＵＣ型のプラスミドである。非形質転換菌株ＧＣ６９で ある対照の試料Ａおよび形質転換体Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの試料Ｂの２つの試料を この実施例で分析した。第７図から分かるように、６．５ｋｂでのバンドにより 示したとおり、試料Ａはｃｂｈｌ遺伝子を有した。しかしながら、形質転換体で ある試料Ｂはこの６．５ｋｂのバンドを有しておらず、したがって、Ｃｂｈ１遺 伝子を有しておらず、ｐＵＣプラスミド由来の配列をなにも有していない。

１％のグルコース、０．１４％の（ＮＨ４）２　ＳＯ４，０，２％のＫＨ２ＰＯ ４，０゜０３％のＭｇＳＯ４，０，０３％の尿素、０，７５％のバクトドリプト ン（ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ　）、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０．０．００ ００１６％のＣｕ５Ｏａ　＠５Ｈ２０，０，００１％のＦｅＳＯ４・７Ｈ２０， ０，０００１２８％のＺｎ５Ｏａ　’　７Ｈ２０，０，０００００５４％のＮａ ２　ＭｏＱ、−２Ｈ２０，０，００００００７％のＭｎＣ１・４Ｈ２０を含有す るトリコデルマ基本培地５０ｍ１中に産生したＰ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株からの芽 胞を接種した。

約４８時間に亘り２５０　ｍ　ｌのフラスコ中で振とうさせながら培地を３７℃ で定温放置した。ミラクロス（カルバイオケム社）を通過させる濾過により、得 られた菌糸を採集し、１．７ｍＭのリン酸カリウムにより２．３回洗浄した。菌 糸を最終的に１ｍＭのソホロース（ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ　）を含む１７ｍＭのリ ン酸カリウムの溶液中に懸濁させ、さらに振とうさせながら３０℃で２４時間に 亘り定温放置した。これらの培養液から上澄を採集し、菌糸を捨てた。製造者の 説明にしたがって、ファーマシアファストゲル　システムおよびｐＨ３−９プレ キヤスト　ゲルを用いた等電点電気泳動により培養液の上澄の試料を分析した。

ゲルを銀染料で染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。第８図に示すように 、ｃｂｈｌタンパク質に対応するバンドは、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ由来の試料 には存在しなかった。この等電点電気泳動ゲルは、トリコデルマ　リーセイの異 なる上澄培養液中に様々なタンパク質が存在することを示している。レーンＡは 部分的に精製したＣＢＨＩである。レーンＢは非形質転換トリコデルマ　リーセ イの培養液からの上澄である。

レーンＣは、本発明の方法により産生じた菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩからの上澄で ある。様々なセルラーゼ成分の位置を、ＣＢＨＩ、ＣＢＩ−１１Ｉ、ＥＧＩ、Ｅ ＧＩ■、およびＥＧＩＩＩと印付けた。ＣＢＨＩは全体の細胞外タンパク質の５ ０％を構成するので、ＣＢＨＩは主要な分泌タンパク質であり、ゲル上で最も暗 いバンドである。この等電点電気泳動ゲルは、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ菌株において はＣＢＨＩタンパク質が除去されているのを示している。

ＣＢＨＩＩタンパク質をコード化するトリコデルマ　リーセイのｃｂｈ２遺伝子 を、第９Ａ図に示すゲノムＤＮＡの４．１ｋｂのＥＣ０ＲＩ断片としてクローニ ングした（Ｃｈｅｎ等、１９８７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｓ　５：２７ ４−２７８　）　ｏこの４．１．ｋｂの断片をｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲ１部位の 間に挿入した。後者のプラスミドはｐＵＣ誘導体である（ジエネンカー　インタ ーナショナル社のＲ，Ｍ、　Ｂｅｒｋａにより構築された）。このｐＵＣ誘導体 は、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、５ａｃｌ、Ｓｍａｌ。

Ｈｉｎｄｌ　１１、ＸｈｏＩ、Ｂｇｌｌｌ、Ｃ１ａｌ、ＢｇｌＩ　Ｌ　ＸｈｏＬ 　Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、ＳｍａＩ、５ａｃｌ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩの順番で 並んだ左右対称の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する多数のクローニング部位 を含んでいる。従来技術で知られている方法を用いて、Ｈｉｎｄｌ　１１部位（ ＣＢＨＩＩ翻訳開始部位の７４ｂｐの３′）とＣｌａｌ部位（ＣＢＨＩＩの最後 のコドンの２６５ｂｐの３′）との間のこの遺伝子の１．７ｋｂの中央領域が除 去され、トリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を含有する１、６ｋｂのＨｉｎ ｄｌｌｌ−ＣＩａＩＤＮＡ断片により置換されたプラスミドｐＰΔＣＢＨＩ　Ｉ 　（第９Ｂ図）を構築した。

トリコデルマ　リーセイｐｙｒ４遺伝子を１．６ｋｂのＮｈｅ　ｌ−３ｐｈ　Ｉ 断片上のｐＴｐｙｒ２　（実施例７参照）から切除し、ｐＵｃ２１９の５ｐｈ１ 部位とＸｂａ１部位との間に挿入し、ｐ２１９Ｍを産生じた（Ｓ＋＋＋ｉｔｈ等 、１９９１、Ｃｕｒｒ。

Ｇｅｎｅｔ　、　１９２７−３３頁）ｏ　ｐＵｃ２１９の多重クローニング部位 由来の一方の末端で７ｂｐのＤＮＡおよび他方の末端で６ｂｐのＤＮＡを有する Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｃｌａｌ断片としてｐｙｒ４遺伝子を除去し、ｃｂｈ２遺伝子 のＨｉｎｄｌ　Ｉ　１部位とＣｌａｌ部位に挿入してプラスミドｐｐΔＣＢＨＩ Ｉを形成した（第９Ｂ図参照）。

このプラスミドをＥｃｏＲＩにより切断することによって、一方の末端において ｃｂｈ２座からの０．７ｋｂのフランキングＤＮＡ、他方の末端においてｃｂｈ ２座からの１．７ｋｂのフランキングＤＮＡおよび中間においてトリコデルマ　 リーセイｐｙｒ４遺伝子を有する断片が解放される。

実施例１４ Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩの　「４−誘導体の産生ｃｂｈｌ遺伝子が欠失した形質転換 体（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）の芽胞を、ＦＯＡを含有する培地上に広げた。その後 実施例６の方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４−誘導体を得た。このｐＹ ｒ４−菌株をＰ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ−２６と称した。

実施例１５ 事前にｃｂｈｌが欠失されている菌株中のｃｂｈ２遺伝子の欠失実施例８および ９において概説した方法にしたがって、菌株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ４−２６ のプロトプラストを産生し、ＥｃｏＲＩ切断ｐｐΔＣＢＨＩＩにより形質転換し た。

精製した安定な形質転換体を実施例１２のように振とうフラスコ中で培養し、等 電点電気泳動により培養上澄中のタンパク質を調べた。ＣＢＨＩＩタンパク質を まったく産生じない１つの形質転換体（Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７と称する）を同 定した。第８図のレーンＤは、本発明の方法にしたがって産生されたｃｂｈｌ遺 伝子およびｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失した形質転換体からの上澄を示している 。

ＤＮＡを菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７から抽出し、抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩ およびＡｓｐ７１８により切断し、この切断されたＤＮＡについてアガロースゲ ル電気泳動を行なった。このゲルからのＤＮＡをメンブレンフィルターにプロッ トし、３２ｐ標識ｐＰΔＣＢＨＩＩにより雑種形成させた（第１０図）。第１０ 図のレーンＡは、非形質転換トリコデルマ　リーセイ菌株からのＤＮＡについて 観察された雑種形成模様を示している。野生型ｃｂｈ２遺伝子を含有する４、１ ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が観察された。レーンＢは、菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７ について観察された雑種形成模様を示している。単一の４．１ｋｂバンドがなく なり、約０．９ｋｂおよび約３．１ｋｂの２つのバンドに置き換えられている。

これは、ｐＰΔＣＢＨＩＩからのＥｃｏＲＩ断片の単一のコピーがｃｂｈ２座で 正確に組み込まれた場合に予期される模様である。

同一のＤＮＡ試料をＥｃｏＲＩにより切断し、サザーンプロット分析を上述した ように行なった。この実施例においては、プローブには１２ｐ［識ｐｌｎｔｃＢ ＨＩＩを用いた。このプラスミドは、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩにおいて欠失 されたｃｂｈ２遺伝子のセグメント内からのｃｂｈ２遺伝子暗号配列の部分を含 有している。菌株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からのＤＮＡについては８Ｍ形成は見 られず、このことは、ｃｂｈ２遺伝子は欠失され、ｐＵＣプラスミド由来の配列 はこの菌株内には存在しなかったことを示してる。

実施例１６ トリコデルマ　リーセイの　ｒ４欠失菌株の形質転換体およびｐΔＥＧＩｐｒ− ３の構築 ＥＧＩをコード化するトリコデルマ　リーセイｅｇｌ　１遺伝子を、公表されて いる配列にしたがって合成したオリゴヌクレオチドによる雑種形成により、菌株 ＲＬ−Ｐ３７からのゲノムＤＮＡの４．２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片として クローニングした（Ｐｅｎｔｉｌｌａ等、１９８６、Ｇｅｎｅｓ　４５：２５３ −２６３　；　ｖａｎ　Ａｒ５ｄｅｌ１等、１９８７、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙｓ　５：６０−６４　）。

このＤＮＡ断片をｐＵｃｌｏ、０のＨｉｎｄｌ１１部位で挿入した。ＥＧＩ暗号 配列の中間に近い位置から暗号配列の３′末端を越えた位置まで延長した内部の ｌｋｂのＥｃｏＲＶ断片を酵素切断により除去し、クローニングされた黒色アス ペルギルスｐｙｒＧ遺伝子を含有する２、２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈ４ｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ断片による連結によッ装置き換えて（ｆｉｌｓｏｎ等、１９８８、Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６２３３９頁）ｐΔＥＧＩｐｙｒＧ−３を得た （第１１図）。実施例８および９に述べた方法によるトリコデルマ　リーセイの ｐｙｒ４欠失菌株（菌株ＧＣ６９）をＨｉｎｄｌｌｌにより切断し、いずれかの 末端でｅｇｌｌからのフランキング領域を備えたｐｙｒＧ遺伝子を含有する断片 を解放した後、その菌株をｐΔＥＧＩＩ）３’ｒ−３により形質転換して、第１ ２図に概説した機構によりゲノムｅｇｌｌ遺伝子が分断された形質転換体が得ら れた。ＤＮＡを形質転換体から抽出し、抽出したＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌにより 切断し、この切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ない、メンブ レンフィルター上にプロットした。そのフィルターを放射線標ｍｐΔＥＧＩｐｙ ｒ−３により雑種形成した。トリコデルマ　リーセイの非形質転換菌株において 、ｅｇ１１遺伝子がＤＮＡの４．２ｋｂのＨｉｎｄ■！■断片上に存在した。し かしながら、ｐΔＥＧＩｐｙｒ−３からの所望の断片の取込みによるｅｇｌｌ遺 伝子の欠失後、この４．２ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片は消失し、約１．２ｋ ｂ大きなり１ｎｄｌＩＩ断片により置き換えられた。この模様は１つの形質転換 体について観察された。この形質転換体をΔＥＧ　Ｉ−３と称した。

実施例１７ ＰＡΔＥＧＩＩ−１の構築およびＥＧＩＩ遺伝子の欠失公表された配列にしたが って合成したオリゴヌクレオチドによる雑種形成によって、ＥＧＩＩ（文献には 、ＥＧＩＩＩとも称されている）をコード化するｅｇｆ３遺伝子を、４ｋｂのＰ ｓｔｌゲノムＤＮＡ断片としてトリコデルマ　リーセイ菌株ＲＬ−Ｐ３７からク ローニングした（Ｓａ　ｌｏｈｅｉｍｏ等、１９８８、Ｇｅｎｅ　６３：１１− ２１　）。このＤＮＡ断片をｐＬＩＣｌＢのＰｓｔ１部位に挿入した。このプラ スミドｐＥＧ１１をＥｃｏＲＶにより切断し、ＥＧＩＩ暗号領域の５′末端の約 １８０ｂｐの位置から暗号領域の末端を数百塩基対越えた位置まで延長した約２ ｋｂのセグメント上の金縁ＥＧＩＩ暗号領域を除去した。このセグメントを、ａ ｍｄＳ遺伝子を含有するアスペルギルス　ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）ゲノムＤＮＡのＳｓｐ　Ｉ断片により置き換え（Ｃｏｒ ｒｉｃｋ等、１９８７、Ｇｅｎｅ　５３＋６３−７１）、プラスミドＰＡΔＥＧ ＩＩ−１を産生じた（第１３図参照）。

トリコデルマ　リーセイの野生型菌株は、唯一のニトロゲン供給源としてのアセ トアミド上では成長できない。ａｍｄｓ遺伝子により形質転換を行なうと、この アセトアミド上で成長する能力が与えられ、このことがこの遺伝子を含有する形 質転換体の選択システムの基礎となっている。

実施例１０および１１において記載した方法により、菌株へＥＧＩ−３のプロト プラストを、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲｌにより切断したｐＡΔＥＧＩＩ− １により形質転換し、アセトアミド上で成長できる形質転換体を選択した。その 後、ＤＮＡを安定な形質転換体から抽出し、抽出したＤＮＡをＰｓｔｌにより切 断し、切断したＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行ないメンブレンフィ ルター上にプロットした。そのフィルターを放射線標識ｐＡΔＥＧＩＩ−１によ り雑種形成した。ｅｇ１３フランキング領域およびａｍｄｓを含有した、ｐＡΔ ＥＧ１１−１からのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片の、形質転換体中のゲ ノムｅｇ１３座で同種組込みを行なうと、ｅｇ１３遺伝子を含有する４ｋｂのゲ ノムＰｓｔｌ断片が、長さで約１．０ｋｂおよび約２．８ｋｂである２つの遺伝 子を含有する小さなＰｓｔｌ断片により置き換えられることになる。雑種形成の この模様は、菌株ΔΔＥＧ−１と称する１つの形質転換体に観察された。この菌 株は、ＥＧＩおよびＥＧＩＩコード化遺伝子の両方が欠失しており、結果として これらのタンパク質のいずれも産生できない。

実施例７−１７および１９９１年１０月４日に出願された米国特許第０７／７７ ０．０４９号（ここに全てを引用する）に記載された方法を用いて、以下のセル ラーゼ成分（すなわち、ＥＧ　１、ＥＧ　ＩＩ、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ）お よびキシナラーゼ成分のいくつかまたは全てを産生できないトリコデルマ　リー セイの形質転換体を得てもよい。さらに、それらの記載された方法を用いて、Ｅ ＧＩＩＩセルラーゼ成分を過剰に産生ずるトリコデルマ　リーセイ形質転換体を 得てもよい。

本発明を様々な好ましい実施態様に関して記載したが、本発明の精神と範囲から 逸脱せずに、様々な変更、置換等を行ってもよいことが当業者に理解されよう。

したがって、本発明の範囲は以下の請求の範囲のみにより制限される。

ＯＶｌｏ　１７’）　Ｏｔｌ’）　ＯＩｆｌ　。

臂　置　９　別　輿　−−〇 ０　０　０　０　０　ｃ；　６　６ ＦＩＧ、　２ １）　ＩＷＬＧＫＹＧＤＧＰＩＧｓｓ（Ｘ；ＸＶ）ＪＶＧＧＱ２）　ＰｎＡＳＷ ＳＹＳＧＳＮＩＲＡＮＶＡＹＤＬＦＴＡＡＮＦＩＧ、　３ ｒΔε（ＩｒｙＡ−３１７１＊’に’；ｘ　（りＦＩＧ、　１１ １イｉλＹプ；ダビ須）ミ ■〒阿画Ｉコ ロＧ、１２ ｒＡ八へ’ｔｌｌ−１ｅｙ＋才％−Ｉ ＦＩＧ、　１３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ＣＩ、　’　識別記号　、庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２ １　８８２８−４８ １５１０９　ＺＮＡ （Ｃ１２Ｎ　９／４２ Ｃ１２Ｒ１：８８５） （ＣＩ　２　Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：８８５） （７２）発明者　クラークソン、キャスリーン　エイアメリカ合衆国　カリフォ ルニア州 ９４１１０　サン　フランシスコ　トウエンティエイス　ストリート５３ （７２）発明者　レアナス、ニドマント　エイアメリカ合衆国　カリフォルニア 州 ９４０３８　モス　ビーチ　ネヴアダ　３０１Ｉ （７２）発明者　バウアー、ベンジャミン　ニスアメリカ合衆国　カリフォルニ ア州 ９４１１８　サン　フランシスコ　ナンバー５レイク　ストリート８３０ （７２）発明者　ワイス、ジェフリー　エルアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４１１７　サン　フランシスコ　ブエナ　ヴイスタ　４５７

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成 分を、それ以外のセルラーゼタンパク質を実質的に含まないように単離する方法 であって、ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分以外の実質的に全てのセルラーゼタンパ ク質がＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の少ない水相に保持され、かつＥＧ　ＩＩＩ セルラーゼ成分がＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の多いポリエチレングリコール相 に保持される条件下で、セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物に効果的な 量のポリエチレングリコールを添加する工程を含むことを特徴とする方法。
2. ２．前記ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の少ない水相から前記ＥＧ　ＩＩＩセルラ ーゼ成分の多いポリエチレングリコール相を分離する工程を含むことを特徴とす る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の多いポリエチレングリコール相からＥＧ 　ＩＩＩセルラーゼ成分を沈殿させ、該ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を集める各 工程を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．低分子量のアルコールを前記ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の多いポリエチレ ングリコール相に添加して前記ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分を沈殿させることを 特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記低分子量のアルコールがエタノールであることを特徴とする請求の範囲 第４項記載の方法。
6. ６．前記ポリエチレングリコールを添加する前に、無機塩を前記水性混合物に添 加することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．添加される前記無機塩が、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモ ニウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムからなる群より選択されること を特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．出発物質である前記水性混合物が、濾過された全細胞抽出物であることを特 徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．出発物質である前記水性混合物が、細胞を含まないセルラーゼ混合物である ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物から、ＥＧ　ＩＩＩセルラー ゼ成分を含有するがそれ以外のセルラーゼタンパク質を実質的に含まない水溶液 を調製する方法であって、 （ａ）ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分は陰イオン交換カラムを通過するが他のセル ラーゼタンパク質の少なくともいくらかは前記陰イオン交換カラム上に保持され るのに十分なレベルに前記水性混合物のｐＨおよび塩の濃度を調節し、（ｂ）前 記工程（ａ）から得られた前肥水性混合物を前記陰イオン交換カラムに通し、前 記陰イオン交換カラムを通過したＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分の多い分画を集め 、 （ｃ）前記工程（ｂ）から得られた前記分画を回収し、（ｄ）前記ＥＧ　ＩＩＩ セルラーゼ成分は陽イオン交換カラムに結合するが前記他のセルラーゼタンパク 質の少なくともいくらかは陽イオン交換カラムを通過するのに十分なレベルに前 記陰イオン交換カラムを通過した分画のｐＨおよび塩の濃度を調節し、 （ｅ）前記工程（ｄ）から得られた前記陰イオン交換カラムを通過したＥＧＩＩ Ｉセルラーゼ成分の多い分画を前記陽イオン交換カラムに通し、（ｆ）前記ＥＧ 　ＩＩＩセルラーゼ成分を溶離させて集める、各工程からなることを特徴とする 方法。
11. １１．出発物質である前記水性混合物が、濾過された全細胞抽出物であることを 特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．出発物質である前記水性混合物が、細胞を含まないセルラーゼ混合物であ ることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．請求の範囲第１０項に記載の方法の各処理を含むことを特徴とする請求の 範囲第１項記載の方法。
14. １４．セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組 成物を単離する方法であって、 （ａ）ＥＧ　ＩＩＩセルラーゼ成分以外の実質的に全てのセルラーゼタンパク質 が水相中に保持され、前記キシラナーゼ成分がキシラナーゼ成分の多いポリエチ レングリコール相中に保持される条件下で、前記セルラーゼタンパク質を含有す る水性混合物に効果的な量のポリエチレングリコールを添加する工程を含むこと を特徴とする方法。
15. １５．前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコール相を前記水相から分 離する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記キシラナーゼ成分を前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコ ール相から沈殿させ、該キシラナーゼ成分を集める工程を含むことを特徴とする 請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．低分子量のアルコールを前記キシラナーゼ成分の多いポリエチレングリコ ール相に添加して前記キシラナーゼ成分を沈殿させることを特徴とする請求の範 囲第１６項記載の方法。
18. １８．前記低分子量のアルコールがエタノールであることを特徴とする請求の範 囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記ポリエチレングリコールを添加する前に、無機塩を前記水性混合物に 添加することを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。
20. ２０．添加される前記無機塩が、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アン モニウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムからなる群より選択されるこ とを特徴とする請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．出発物質である前記水性混合物が、濾過された全細胞抽出物であることを 特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。
22. ２２．出発物質である前記水性混合物が、細胞を含まないセルラーゼ混合物であ ることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。