JPH08510520A - セルラーゼによる綿非含有布の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 綿含有布と綿非含有セルロース系布の改良処理方法並びにこれらの方法から製造された布を開示する。特に、開示する方法は、全CBHＩ型セルラーゼ成分を実質的に含まない真菌セルラーゼ組成物を含むセルラーゼ溶液と綿含有又は綿非含有セルロース系布とを接解させることに向けられる。そのように処理された完全セルラーゼ組成物を含むセルラーゼ溶液により処理された布に比べて減少された強度損失を有している。

Description

【発明の詳細な説明】 セルラーゼによる綿非含有布の処理方法 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、セルラーゼによる綿含有布（cotton-containing fabrics）及び綿 非含有セルロース系布（non-cotton containing cellulosic fabrics）の改良処 理方法並びにこれらの方法により製造された織物に関する。特に、本発明に係る 改良された方法は、全CBHＩ型成分を実質的に含まない真菌セルラーゼ組成物を 含む水性溶液と綿含有布及び綿非含有布を接触させることに向けられる。綿含有 布及び綿非含有セルロース系布がこのような溶液により処理されるとき、得られ る布は、例えば処理前の布と比較して、感触、外観、及び／又は柔らかさ、等に ついて期待される強化を有し、そしてその布は、CBHＩ型成分を含むセルラーゼ 成分により処理された布と比較して、減少された強度の損失をも有する。綿非含 有セルロース系布が上記溶液により処理されるとき、得られる処理布は、処理前 の綿非含有布に比べて強化された感触、外観及び柔らかさを有する。 ２．技術水準 それらの製造の間又は直後、綿含有布は、その布に所望の特性を付与するため にセルラーゼにより処理されることができる。例えば、繊維産業においては、セ ルラーゼは、綿含有布の感触及び／又は外観を改善するために、綿含有編物から の表面繊維を除去するために、綿含有デニムにストーン・ウォッシュ外観を付与 する等のために使用されている。 特に、日本国特許出願第58-36217号及び第58-54032号並びにOhishi et al.， “Reformation of Cotton Fabric by Cellulase”及びJTN December 1988 journ al article“What'ｓ New -- Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric”は、それぞれ、セルラーゼによる綿含有布の処理がその布につ いて改善された感触をもたらすことについて開示している。このセルラーゼ処理 が綿の毛羽立ち（fuzzing）及び／又は表面繊維を除去して、それがその布の重 量を減少させるということが一般的に信じられている。これらの効果の組み合せ は、その布に改善された感触（feel）を付与する、すなわちその布がより絹に似 た感触になる。 さらに、本分野においてはこれまで、例えばジェットの使用により、これらの 編布に一般的な折れた繊維及び糸を除去する目的をもって、撹拌及びカスケード 条件下で、セルロース溶液により綿含有織布を処理することが知られている。そ のように処理されるとき、バッファーは一般的には使用されない。なぜなら、そ れらは、選ばれた染料による染料落ちに有害な影響を与えると信じられているか らである。 さらに本分野においてはこれまで、撹拌及びカスケード条件下でセルラーゼ溶 液により綿含有織布を処理することも知られている。そのように処理されるとき 、その綿含有織布をは、処理前の布と比較して改良された感触及び外観を有して いる。 最後に、これまで、撹拌及びカスケード条件下、すなわち回転ドラム洗濯機内 で、セルラーゼ溶液による綿含有の染色されたデニムの処理が、そのデニムに“ ストーン・ウォッシュ（stone washed）”外観を付与することも知られている。 セルラーゼ溶液によるこのような綿含有布の処理に関連する共通の問題は、処 理された布が、非処理布に比較してかなりの強度損失 を示すということである。そのセルラーゼがセルロース（β−１，４−グルカン 結合）を加水分解し、これが次にその綿ポリマーの一部の破壊をもたらすことが できるために、強度損失が生じる。綿ポリマーが破壊されればされる程、その布 の繊維強度は減少される。 綿織布に上でのセルロース溶液の撹拌及びカスケード（agitation and cascad ing）を含む方法がより短かい反応時間を必要とするために、これらの方法は、 撹拌及びカスケードを含まないセルラーゼ処理方法に比較して減少された強度損 失の綿含有織布を提供すると信じられている。しかしながら、いずれの事案にお いても、このような方法は、かなりの強度損失をもたらす。 従って、処理前の布に比較してセルラーゼによる処理から生じる処理された綿 含有布における所望の強化を未だ達成しながら、減少された強度損失を提供する ようにこのようなセルラーゼ処理を修飾することが特に望ましいであろう。 さらに、セルラーゼの真菌源がひじょうに多量のセルラーゼを分泌することが 知られており、そしてさらにこのような真菌源についての発酵手順並びにそのセ ルラーゼを単離するための単離及び精製手順が本分野においてよく知られている ために、感触及び／又は外観を付与するための方法においてこのような真菌セル ラーゼを使用することが特に有利であろう。 発明の要約 本発明は、真菌セルラーゼにより綿含有布及び綿非含有セルロース系布を処理 するためのこれまでに知られている方法が、全CBHＩ型成分を実質的に含まない 真菌セルラーゼ組成物を使用することにより改善されることができるという発見 に関する。驚ろくべきことに、EG型成分が、このようなセルラーゼ組成物による 処理前の布に 比較して、感触（feel）、外観（appearance）、柔らかさ（softuess）、着色強 化（color enhancement）、及び／又はストーン・ウォッシュ外観（stone washe d appearance）に関してその処理された綿含有及び綿非含有セルロース系布に強 化を付与することができるということが発見された。さらに、EG型成分との組合 せにおけるCBHＩ型成分がその処理された布内の強度損失のかなりの大きさの部 分についての原因であるということが発見された。 上記視点においては、その方法の態様の中の１においては、本発明は、真菌セ ルラーゼ組成物による綿含有布及び綿非含有セルロース系布の改良処理方法であ って、その改良方法が全CBHＩ型成分を実質的に含まない真菌セルラーゼ組成物 を使用することを含んで成るような方法に関する。好ましい態様においては、そ の真菌セルラーゼ組成物は、全CBHＩ型と全CBHII型成分を含まない。さらに好ま しい態様においては、本真菌セルラーゼ組成物は、そのセルラーゼ組成物中のタ ンパク質の全重量に基づき、少なくとも約10重量パーセント、そして好ましくは 少なくとも約20重量パーセントを含んで成る。 その方法の態様の中の他のものにおいては、本発明は、水性真菌セルラーゼ溶 液による綿含有布及び綿非含有セルロース系布の改良処理方法であって、その方 法がその布に対するそのセルラーゼ溶液のカスケード効果を作り出すような条件 下での撹拌を伴って行われる、その改良が全CBHＩ型成分を実質的に含まない真 菌セルラーゼ組成物の使用を含んで成るような方法に関する。好ましい態様にお いては、この真菌セルラーゼ組成物は、全CBHＩ型成分と全CBHII型成分を含まな い。さらに他の好ましい態様においては、真菌セルラーゼ組成物は、そのセルラ ーゼ組成物中のタンパク質の全重量に基づき少なくとも約10重量パーセント、そ して好ましくは少なくと も約20重量パーセントを含んで成る。 本発明に係る方法により処理された綿含有布は、CBHＩ型セルラーゼ成分を含 む真菌セルラーゼ組成物により処理された布と比較して、減少された強度損失を 示しながら処理前の布に比較して予期された強化をもつ。この減少された強度損 失は、本発明に係る方法が強度損失抵抗性であることを立証する。 その組成物の態様においては、本発明は、先に定義した本発明に係る方法にお いて処理された綿含有布に関する。 図面の簡単な説明 図１は、ｐΔCBHＩpyr4の構築の概要である。 図２は、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum ） 染色体の中のＩ上のcbh1座におけるｐΔCBHＩpyr4からの大きい方のEcoＲＩ断 片の組み込みによるトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma longibra chiatum）cbh1 遺伝子の欠失について示す。 図３は、プローブとして³²ＰラベルされたｐΔCBHＩpyr4を用いたサザン・ブ ロット分析後のEcoＲＩ消化ｐΔCBHＩpyr4により形質転換されたトリコデルマ・ ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）株GC69からのDNAのオート ラジオグラフである。 図４は、プローブとして³²ＰラベルされたpInt CBHＩを用いたサザン・ブロッ ト分析後のEcoＲＩ消化されたｐΔCBHＩpyr4により形質転換されたトリコデルマ ・ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）株GC69からのDNAのオー トラジオグラフである。 図５は、トリコデルマ・ロンジブラチアタムの野生型により及び形質転換株に より分泌されたタンパク質を示す等電点フォーカシング・ゲルである。特に図５ 中、この等電点フォーカシング・ゲルの レーンＡはトリコデルマ・ロンジブラチアタムの部分的に精製されたCBHＩを使 用し；レーンＢは、野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムからのタンパク質 を使用し；レーンＣは、cbh1遺伝子が欠失されたトリコデルマ・ロンジブラチア タム株からのタンパク質を使用し；そしてレーンＤは、cbh1とcbh2遺伝子が欠失 されたトリコデルマ・ロンジブラチアタムからのタンパク質を使用する。 図５中、図の右手側の数字は、１以上の分泌タンパク質中に見つかった単一タ ンパク質の位置を示すためにマークされている。特にBGはβ−グルコシダーゼを いい；E1はエンドグルカナーゼＩをいい；E2はエンドグルカナーゼIIをいい；E3 はエンググルカナーゼIIIをいい；C1はエクソ−セロビオヒドロラーゼＩをいい ；そしてC2はエクソ−セロビオヒドロラーゼIIをいう。 図6Aは、ゲノムDNAの4.1KB EcoＲＩ断片としてクローン化されたトリコデル マ・ロンジブラチアタムcbh2座を表したものであり、そして図6Bは、そのcbh2遺 伝子欠失ベクター、pPΔCBHIIを表したものである。 図７は、プローブとして³²ＰラベルされたpPΔCBHIIを用いたサザン・ブロッ ト分析の後のEcoＲＩ消化されたpPΔCBHIIにより形質転換されたトリコデルマ・ ロンジブラチアタム株P37ｐΔCBHＩからのDNAのオートラジオグラフである。 図８は、プラスミドpEGＩpyr4のダイアグラムである。 図９は、40℃におけるpHレンジについてのトリコデルマ・ロンジブラチアタム から誘導された酸性EG強化真菌セルラーゼ組成物（CBHＩ及びCBHII欠失）のRBB- CMC活性特性；並びに40℃におけるpHレンジについてのトリコデルマ・ロンジブ ラチアタムから誘導された強化EGIIIセルラーゼ組成物の活性特性を示す。 図10は、さまざまな量のCBH成分をもつセルラーゼ組成物により 処理された綿含有布についての洗濯メーター（launderometer）内での３回の洗 浄サイクル後の強度損失結果を示す。 図11は、さまざまなpHにおける野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムによ り分泌されたセルラーゼ（全セルラーゼ）により処理された綿含有布についての （パネル・テスト等級に基づく）繊維除去結果を示す。 図12は、野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムにより分泌されたセルラー ゼのさまざまな濃度（ppm）により処理された綿含有布についての及びCBHＩとCB HIIを分泌することができないように遺伝子操作されたトリコデルマ・ロンジブ ラチアタムの株により分泌されたセルラーゼにより処理された綿布についての（ パネル・テスト等級に基づく）繊維除去結果を示す。 図13は、CBHＩ＆IIを生産することができないように遺伝子修飾されたトリコ デルマ・ロンジブラチアタムの株から誘導されたEG強化セルラーゼ組成物のさま ざまな濃度（ppm）についての柔らかさパネル・テスト結果を示す。 図14は、CBHＩ＆IIを生産することができないように遺伝子修飾されたトリコ デルマ・ロンジブラチアタムの株から誘導されたEG強化セルラーゼ組成物により 処理された綿非含有セルロース系布についての柔らかさパネル・テスト結果を示 す。 図15は、CBHＩ＆IIを生産することができないように遺伝子修飾されたトリコ デルマ・ロンジブラチアタムの株から誘導されたEG強化セルラーゼ組成物により 処理された綿非含有セルロース系布についての外観パネル・テスト結果を示す。 好ましい態様の詳細な説明 上述のように、本発明に係る方法は、セルラーゼによる綿含有布 の従来技術の処理方法における改良である。本改良は、その布における強度損失 を最小化しながらその布に所望の強化を付与する特異的なセルラーゼ組成物を使 用することを含んで成る。しかしながら詳細に本発明を討議するに先立って、以 下の用語を最初に定義する。 用語“綿含有布（cotton-containing fabric）”とは、棒織布、綿編物、綿デ ニム、綿ヤーン、等を含む純綿又は綿ブレンドから作られた縫布又は非縫布をい う。綿ブレンドが使用されるとき、その布中の綿の量は、少なくとも約40重量パ ーセントの綿；好ましくは約60重量パーセントを上廻る綿；そして最も好ましく は約75重量パーセントを上廻る綿でなければならない。ブレンドとして使用され るとき、その布中で使用される相手の材料は、１以上の非綿繊維であって合成繊 維、例えばポリアミド繊維（例えばナイロン６及びナイロン66）、アクリル繊維 （例えばポリマクリロニトリル繊維）、及びポリエステル繊維（例えばポリエチ レン・テレフタレート）、ポリビニル・アルコール繊維（例えばビニロン）、ポ リビニル・クロライド繊維、ポリビニリデン・クロライド繊維、ポリウレタン繊 維、ポリウレア繊維及びマラミド繊維を含むものを含むことができる。再生セル ロース、例えばレーヨンが本発明に係る方法において綿のための代替物として使 用されることができるであろうことが企図される。 用語“セルロース非含有布（non-cellulosic-containing fabric）”とは、天 然セルロース（例えばジュート、フラックス、ラミー、等）、人造セルロース誘 導体、及びセルロース誘導体カード又は繊維を含む綿非含有セルロース系布又は 綿非綿含有セルロース誘導体ブレンドのいずれかをいう。人造セルロースのブレ ンドの標題の下に含まれるのは、本分野においてよく知られた再生セルロース、 例えばレーヨンがある。他の人造セルロースは、セルロース繊維の化学修飾物（ 例えばアセテート等により誘導体化されたセルロース）及び溶媒紡糸セルロース 繊維（例えばリオセル（lyocell））を含む。 上記の綿非含有セルロースは、リオセル−レーヨン、リオセル−リネン、ビス コース・レーヨン・アセテート、レーヨン・ウール、シルク−アセテート、等を 含むブレンドとして使用されることもできる。 用語“仕上げ（finishing）”は、本明細書中に使用するとき、布に対するセ ルラーゼのセルロース分解活性を実質的に防止するのに十分な量の仕上げ剤を綿 含有布又は綿非含有セルロース布に適用することを意味する。仕上げ剤は一般的 に、その布の特性、例えば柔らかさ、ドラパビリティー（drapability）等を強 化する目的をもってその布の製造工程の終りに又は終了付近に適用され、それは 、セルラーゼとの反応からその布をさらに保護する。綿含有布の仕上げに有用な 仕上げ剤は、本分野においてよく知られており、そして樹脂状材料、例えばメラ ミン、グリオキサル、又はウレアホルムアルデヒド、並びにワックス、シリコー ン、フルオロケミカル類及び第４類を含む。そのように仕上げられるとき、その 綿含有布は、セルラーゼに対して実質的ほとんど反応性でない。 用語“真菌セルラーゼ（fungal cellulase）”とは、真菌源から得られたセル ラーゼ遺伝子の全部又は一部を取り込み、かつ、発現するように遺伝子修飾され た真菌源又は微生物から誘導された酵素組成物をいう。真菌セルラーゼは、セル ロース及びその誘導体に対して働いて、セルロースを加水分解し、そして主生成 物、グルコース及びセロビオースを与える。真菌セルラーゼは、微生物、例えば 放線菌類、粘菌バクラリア（ミクソバクテリア）及び真のバクテリ アを含む非真菌源から生産されたセルラーゼからは区別される。本明細書中に記 載するセルラーゼ組成物の製造に有用なセルラーゼを生産することができる真菌 は、英国特許第2 094 826Ａ号（この開示を引用により本明細書中に取り込む。 ）中に開示されている。 ほとんどの真菌セルラーゼは一般的に、酸性又は中性pHレンジ内にそれらの最 適活性をもつ。但し、いくつかの真菌セルラーゼは、中性及び僅かにアルカリ性 の条件下でかなりの活性を有していることが知られている。すなわち、例えばフ ミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）から誘導されるセルラーゼは、 中性〜僅かにアルカリ性の条件下で活性を有することが知られている。 真菌セルラーゼは、異なる基質特異性、酵素作用パターン、等をもついくつか の酵素分類を占めることが知られている。さらに、それぞれの分類内の酵素成分 は、異なる分子量、異なる程度の糖添加、異なる等電点、異なる基質特異性、等 を示すことができる。例えば、真菌セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（endogl ucanases）（EG_s））、エクソセロビオヒドロラーゼ（exocellobiohydrolases（ CBH_s））、β−グルコシダーゼ（β−glucosidases（BG_s））、等を含むセルラ ーゼ分離を含むことができる。他方において、バクテリアのセルラーゼはCBH成 分をほとんど又は全く含まないものとして上記分献中に報告されているけれども 、バクテリアのセルラーゼから誘導されたCBH様成分がエクソセロビオヒドロラ ーゼ活性を有していることが報告されたいくつかのケースが存在する。 天然真菌源により生産され、かつ、１以上のCBH及びEG成分を含んで成り、そ れらの成分のそれぞれがその真菌源により生産された比において見られる真菌セ ルラーゼ組成物を、ときどき本明細書中に、“完全真菌セルラーゼ系（complete fungal cellulase system）”又は“完全真菌セルラーゼ組成物（complete fun gal cellulas e composition）”といって、それらを、それから単離されたセルラーゼの分類 及び成分から、バクテリア及びいくつかの真菌により生産された不完全セルラー ゼ組成物から、又は、セルラーゼの１以上のCBH及び／又はEG成分を過剰生産し 、過小生産し、又は生産しないように遺伝子修飾された微生物から得られたセル ラーゼ組成物から区別する。 セルラーゼの生産のために真菌を培養するための発酵手順は、本分野において それ自体公知である。例えば、セルラーゼ系は、バッチ、供給−バッチ及び連続 フロー工程を含む固体又は浸漬培養のいずれかにより生産されることができる。 発酵ブロスからのセルラーゼ系の採取及び精製も、本分野においてそれ自体知ら れた手順により行われることができる。 “エンドグルカナーゼ（“EG”）型成分”とは、トリコデルマ・ロンジブラチ アタム（Trichoderma Longibrachiatum）のエンドグルカナーゼ成分と同様の繊 維活性特性を示すような真菌セルラーゼ成分の全て又はそれらの成分の組合せを いう。これに関して、トリコデルマ・ロンジブラチアタムのエンドグルカナーゼ 成分（特に、単独又は組合せのいずれかにむけるEGＩ，EGII，EGIII等、）は、 それらの成分が繊維処理媒質中に取り込まれ、そしてその布がこの媒質により処 理されるとき（処理前の布に比較して）綿含有布に、改善された感触、改善され た外観、柔らかさ、着色強化、及び／又はストーン・ウォッシュ外観を付与する 。さらに、トリコデルマ・ロンジブラチアタムのエンドグルカナーゼ成分による 綿含有布の処理は、類似の組成物であるがさらにCBHＩ型成分を含むによる処理 から生じる強度損失に比較してより小さな強度損失をもたらす。 さらに、（単独又は組合せにおける）トリコデルマ・ロンジブラチアタムのエ ンドグルカナーゼ成分は、これらのエンドグルカナー ゼ成分が繊維処理媒質中に取り込まれ、そして綿非含有セルロース誘導体がこの 成分を含む媒質中で処理されるとき、処理前の布に比べて、綿非含有セルロース 系布に改善された柔らかさ、感触、手ざわり、外観及び表面光沢（色強化）を付 与する。EG型成分（単独又は組合せのいずれか）は、綿含有布と同程度又はより 大きな程度に綿非含有セルロース系布に改善されたストーン・ウォッシュ外観を 付与するであろうことが企図される。EG成分による綿非含有セルロース系布の処 理が、類似の組成物であるがさらにCBHＩ型成分を含むものによる処理から生じ る強度損失と比べて減少された強度損失をもたらすであろうことが企図される。 従って、エンドグルカナーゼ型成分は、これらの成分がその布を処理するため に使用される媒質に取り込まれるとき（処理前の布と比較して）綿含有布に改善 された感触、改善された外観、柔らかさ、着色強化、及び／又はストーン・ウォ ッシュ外観を付与し、そして類似のセルラーゼ組成物であるがさらにCBHＩ型成 分を含むものによる処理から生じる強度損失に比較して綿含有布に減少された強 度損失を付与するような真菌セルラーゼ成分である。 このようなエンドグルカナーゼ型成分は、活性テスト、例えば、それらの成分 が（ａ）可溶性セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース（CMC） を加水分解し、それによりCMC含有溶液の粘度を減少される能力、それらの成分 が（ｂ）セルロースの水和形態例えばリン酸膨潤セルロース（例えばWalsethセ ルロース）を容易に加水分解し、そしてセルロースのより高い結晶形態（例えば Avicel，Solkafloc、等）をほとんど容易に加水分解しない能力、を使用してエ ンドグルカナーゼとして伝統的に分類される成分を含むことができない。他方に おいて、このような活性テストにより定義されるようなすべてのエンドグルカナ ーゼ成分が、綿含有布に１以 上の強化並びに綿含有布に減少された強度損失を付与しないであろうと信じられ ている。従って、本発明における目的にとって、トリコデルマ・ロンジブラチア タムのエンドグルカナーゼ成分により所有されるものと同様な繊維活性特性を有 するような真菌セルラーゼの成分としてエンドグルカナーゼ型成分を定義するこ とが、より正確である。 真菌セルラーゼは、１以上のEG型成分を含むことができる。異なる成分は一般 的に異なる等電点、異なる分子量、異なる程度の糖添加、異なる基質特異性異な る酵素作用パターン、等をもつ。異なる等電点の成分は、イオン交換クロマトグ ラフィー等を介してそれらを分離することができる。実際に、異なる真菌源から の成分の単離が本分野において公知である。例えばBjork et al.，米国逐次番号 第07/422，814号、Schulein et al.,国際出願WO89/09259，Wood et al.，Bioche mistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp．31 to 52（1988）；Wood et al.，Carbohydrate Research，Vol．190，pp．279 to 297（1989）；Schule in，Uethods in Enzymology，vol．160，pp-234 to 242（1988）；等を参照のこ と。これらの文献のそれぞれの開示全体を引用により本明細書中に取り込む。 一般的に、EG型成分の組合せが単一EG成分に比較して綿含有布への強化の付与 並びに減少された強度損失の付与において協力的応答を与えることができること が企図される。 他方において、単一EG型成分は、より安定であり、又はpH_sのレンジについて より広い活性スペクトルをもつことができる。従って、本発明において使用され るEG型成分は、単一EG型成分又は２以上のEG型成分の組合せのいずれかであるこ とができる。成分の組合せが使用されるとき、そのEG型成分は、同一又は異なる 真菌源から誘導されることができる。 単一EG型成分又はEG型成分の組合せが、完全真菌セルラーゼ系により処理され た布に比べて綿非含有セルロース系布に強化を付与し並びに減少された強度損失 を付与することができることが企図される。 EG型成分がバクテリアにより誘導されたセルラーゼから誘導されることができ ることも企図される。 “エクソ−セロビオヒドロラーゼ型（“CBH型”）成分（Exo-cellobiohydrola se type（“CBH type”）components）”とは、トリコデルマ・ロンジブラチア タムのCBHＩ及び／又はCBHIIセルラーゼ成分と同様の繊維活性特性を示すような 真菌セルラーゼ成分をいう。これに関して、（先に定めたような）EG型セルラー ゼ成分の非存在中で使用されるとき、トリコデルマ・ロンジブラチアタム単独の CBHＩ及びCBHII成分は、そのように処理された綿含有布及び綿非含有セルロース 布に、感触、外観、着色強化、及び／又はストーン・ウォッシュ外観における有 意な強化のいずれをもを付与しない。従って、EG型成分との組合せにおいて使用 されるとき、トリコデルマ・ロンジブラチアタムのCBHＩ成分は、綿含有布に強 化された強度損失を付与する。 従って、CBHＩ型成分とCBHII型成分とは、それぞれ、トリコデルマ・ロンジブ ラチアタムのCBHＩとCBHII成分と同様の繊維活性特性を示すような真菌セルラー ゼ成分をいう。 上述のように、CBHＩ型成分については、これは、EG型成分の存在中で使用さ れるとき、綿含有布の強度損失を強化する特性を含む。好ましい態様においては 、そしてEG型成分との組合せにおいて使用されるとき、トリコデルマ・ロンジブ ラチアタムのCBHＩ型成分は、増分のクリーニング利益を付与することができる 。さらに、トリコデルマ・ロンジブラチアタムのCBHＩ成分は、単独において又 はEG型成分との組合せにおいて使用されるとき、増分の柔らかさ利益を付与する ことができる。 このようなエクソ−セロビオヒドロラーゼ型成分は、活性テスト、例えばトリ コデルマ・ロンジブラチアタムからのCBHＩとCBHIIを特徴付けるために使用され るようなものを使用して、エクソセロビオヒドロラーゼとして伝統的に分離され る成分を、たぶん含むことができないであろう。例えば、このような成分（ａ） は、セロビオースにより競合的に阻害され（Ki約１mM）；（ｂ）は、いずれかの 有意な程度まで置換セルロース、例えばカルボキシメチルセルロース、等を加水 分解することができず；そして（ｃ）は、リン酸膨潤セルロースを加水分解し、 そしてより小さな程度に高結晶性セルロースを加水分解する。他方において、こ のような活性テストによるCBH成分として特徴付けられるいくつかの真菌セルラ ーゼ成分が、そのセルラーゼ組成物単独で使用されるとき最小の強度損失をもつ 綿含有布に、改善された感触、外観、柔らかさ、着色強化、及び／又はストーン ・ウォッシュ外観を付与するであろうと信じられている。従って、本発明におけ る目的をのために、EG型成分としてこのようなエクソ−セロビオヒドロラーゼを 定義することがより正確であると信じられる。なぜなら、これらの成分が、トリ コデルマ・ロンジブラチアタムのエンドヌクレアーゼ成分により所有されるよう に繊維用途において同様の機能的特性を有するからである。 全CBHＩ型成分を実質的に含まない真菌セルラーゼ組成物を、精製技術により 得ることができる。特に、その完全セルラーゼ系を、好適なpHにおけるイオン交 換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、サイズ排除、等 を含む上記文献においてよく頒布されたよく認識された分離技術により実質的に 純粋な成分に精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（ 普通にはアニオン交換クロマトグラフィー）においては、pHグラジエント、又は 塩グラジエント、又はpHと塩の両方のグラジエントによる溶出により上記セルラ ーゼ成分を分離することができる。 本明細書中で使用するとき、用語“全CBHＩ型セルラーゼ成分を実質的に含ま ないセルラーゼ組成物は、そのセルラーゼ組成物が、タンパク質重量に基づき、 少なくとも１重量パーセントのCBHＩ型セルラーゼ成分を含むであろうことを意 味する。 全CBHＩ型成分を実質的に含まないセルラーゼ組成物はそれらの成分の単離及 び組換え以外の手段により製造されることができることも企図される。例えば、 組換え技術がCBHＩ型成分のいずれをも生産することができない、又はCBH型成分 のいずれをも生産することができない微生物を作出するために使用されることが できることも企図される。 上記に関して、CBHＩ型成分を実質的に含まないセルラーゼ組成物の好ましい 製造方法は、CBHＩ型成分を発現することができないように微生物を遺伝子修飾 することによるものであっていずれの外因性タンパク質を発現しないものである 。同様に、１以上のCBH型成分を生産することができないように微生物を遺伝子 修飾することもできる。 例えば、1990年10年５日に出願された米国逐次番号第07/593,919号であって全 体として引用により本明細書に取り込むものは、１以上のCBH成分を生産するこ とができず、そして／又は１以上のEG成分を過剰生産することができないように トリコデルマ・ロンジブラチアタムを遺伝子操作する方法について開示している 。その上、その出願の方法は、外因性タンパク質のいずれをも生産しないトリコ デルマ・ロンジブラチアタムを作り出した。同様に、Miller et al.,“Direct a nd Indirect Gene Replacement in Aspergillus nidu lans ”，Molecular and Cellular Biology，p．1714-1721（1985）は、相同DNA の線状断片を用いたDNA仲介形質転換によりアスペルギルス・ニジュランス（Asp ergillus nidulans ）内での遺伝子の欠失方法について開示している。Miller et al.,の方法は、外因性タンパク質のいずれをも生産せずに遺伝子欠失を達成す るであろう。 上記の視点において、CBHＩ型及び／又はCBHII型セルラーゼ成分の生産に責任 を負う遺伝子の欠失は、そのセルラーゼ組成物中に存在するEG成分の量を強化す る効果をもつであろう。 同様に、CBHＩとII型成分を生産することに責任を負う遺伝子の欠失は、CBH型 成分を含まないセルラーゼ組成物をもたらすであろう。 真菌セルラーゼ組成物が不完全真菌セルラーゼ組成物を生産する真菌源から本 発明において使用されることができることもさらに企図される。例えば、特定の 真菌がCBH成分を含まないセルラーゼ組成物を生産することが公知である。例え ば、Coughlan et al.，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation ，Aubert et al．Editors，pp．11-30（Academic Press，1988）は、破壊腐朽菌 は明らかにCBH成分を生産するがこれらの成分の１以上がCBHＩ型成分であること ができるかもしれないということを開示している。 “β−グルコシダーゼ（BG）成分”とは、BG活性を示すようなセルラーゼの成 分をいい；すなわちこのような成分がセロビオース及び他の可溶性セロオリゴ糖 （“セロビオース（cellobiose）”）の非還元末端から作用し、そして唯一の生 成物としてグルコースを与えるであろうということをいう。BG成分は、セルロー スポリマー上に吸着せず又はそれと反応しない。さらに、このようなBG成分は、 グルコースにより競合的に阻害される（Ki約１mM）。厳密に言えば、BG成分は文 言上セルラーゼではない。なぜなら、それらがセルロ ースを分解することができないからである。しかしながら、このようなBG成分は 上記セルラーゼ系の定義内に含まれる。なぜならこれら酵素が、CBH成分とEG成 分の併合作用により作り出される阻害性セルロース分解生成物（特にセロビオー ス）をさらに分解することによりセルロースの全体としての分解を容易にするか らである。BG成分の存在を伴わずに、結晶性セルロースの中程度又は僅かな加水 分解が生じるであろう。BG成分は、アリール基質、例えばｐ−ニトロフェノール β−Ｄ−グルコシド（PNPG）についてしばしば特徴付けられ、そしてこれ故、し ばしばアリール−グルコシダーゼといわれる。 すべてのグルコシダーゼがBG成分ではなく、その中のいくつかはセロビオース を加水分解しないということに注意しなければならない。 本セルラーゼ組成物中のBG成分の存在又は非存在がその組成物中のいずれかの CBH成分（すなわち、非CBHＩ型成分）の活性を調節するために使用されることが できることが企図される。特に、セロビオースはCBH成分によりセルラーゼ分解 の間に作られるので、そして高濃度のセロビオースがCBH活性を阻害することが 知られているので、そしてさらにこのようなセロビオースがBG成分によりグルコ ースに加水分解されるので、セルラーゼ組成物中のBG成分の非存在は、セロビオ ースの濃度が阻害レベルに達するときにCBH活性を“停止（Turn-off）される” であろう。１以上の添加物（例えばセロビオース、グルコース、等）をそのセル ラーゼ組成物に添加して、CBHＩ型活性並びに他のCBH活性を、直接的又は間接的 に、有効に“停止させる”ことができることも企図される。このような添加物が 使用されるとき、得られる組成物は、添加物の量が、有効にCBHＩ型活性を全く もたらさないのに十分である場合に、全CBHＩ型 成分を含まない組成物と考えられる。 他方において、BG成分の添加量を含むセルラーゼ組成物は、そのCBH成分によ り生成されたセロビオースのレベルが添加されたBG成分の非存在中上記のような 全体的な加水分解を制限するようになる場合に、セルロースの全体的な加水分解 を増加させることができる。 セルラーゼ組成物中のBG成分の量を増加させるか又は減少させるかのいずれか の方法は、アトーニ−書類番号第010055-056号として1990年12月10日に出願され 、“SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β −GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI”と名称を付けられた米国逐次番号 第07/625,140号中に開示されている（この出願を全体として引用により本明細書 中に取り込む）。 真菌セルラーゼは１を上廻るBG成分を含むことができる。異なる成分は一般的 に、イオン交換クロマトグラフィー等を介してそれらの分離を許容する異なる等 電点をもつ。単一BG成分又はEG成分の組合せのいずれかを使用することができる 。 繊維処理溶液中で使用されるとき、BG成分は、一般的に、そのセルラーゼ組成 物中にあるいずれかのCBH及びEG成分のセロビオースによる阻害を妨ぐのに十分 な量において添加される。添加されるBG成分の量は、当業者により容易に測定さ れることができる繊維組成物中で生産されたセロビオースの量に依存する。しか しながら、使用されるとき、セルラーゼ組成物中に存在するいずれかのCBH型成 分に対するBG成分の重量パーセントは、好ましくは約0.2〜約10重量パーセント 、そしてより好ましくは約0.5〜約５重量パーセントである。 本発明において使用される真菌セルラーゼ組成物を製造するため の使用に好ましい真菌セルラーゼは、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（Tric hoderma longibrachiatum） 、トリコデルマ・コニンジ（Trichoderma koningii ）、ペンシラム種（Pencillum sp.）、フミコーラ・インソレンス（Humicola in solens） 、等から得られるものである。特定の真菌セルラーゼは商業的に入手可 能であり、すなわち、CELLUCAST（Novo Industry，Copenhagen，Denmarkから入 手可能）、RAPIDASE（Gist Brocades，N．V.，Delft，Hollandから入手可能）、 CYTOLASE 123（Genencor International，South San Framcisco，Californiaか ら入手可能）、等である。他の真菌セルラーゼ本分野において認知された発酵及 び単離手順により容易に単離されることができる。 用語“バッファー”とは、綿含有布のセルラーゼ処理の間の不所望のpHシフト に付してそのセルラーゼ溶液を安定化させる本分野において認知された酸／塩基 試薬をいう。これに関して、セルラーゼ活性がpH依存性であることは本分野にお いて認識されている。すなわち、特定のセルラーゼ組成物は所定のpHレンジ内に セルロース分解活性を示すであろうし、最適セルロース分解活性はこの定められ たレンジの小部分内に一般的に見られる。セルロース分解活性について特定のpH レンジはそれぞれのセルラーゼ組成物に従って変化するであろう。上述のように 、ほとんどのセルラーゼは、酸性〜中性pH特性内にセルロース分解活性を示すで あろうけれども、アルカリ性pH特性内でセルロース分解活性を示すいくつかのセ ルラーゼ組成物がある。 綿含有布のセルラーゼ処理の間、最初のセルラーゼ溶液のpHは、セルラーゼ活 性に必要なレンジの外側にあることができる。さらに、そのpHが、例えばその溶 液のpHを変化させる反応生成物の生成により、その綿含有布の処理の間に変化す ることもできる。いずれの 事件においても、非緩衝化セルラーゼ溶液のpHは、セルロース分解活性に必要な レンジの外側にあることができるであろう。例えば、酸性活性特定をもつセルラ ーゼが中性の非緩衝化水性溶液中で使用される場合、その溶液のpHは、より低い セルロース分解活性をもたらすであろうし、そしてたぶんセルロース分解活性の 中止をもたらすであろう。他方において、中性非緩衝化水性溶液中の中性又はア ルカリ性pH特定をもつセルラーゼの使用は、最初に有意なセルロース分解活性を 提供しなければならない。 上記の視点においては、セルラーゼ溶液のpHは、セルロース分解活性に必要な レンジ内で維持されなければならない。これを達成する１の手段は、その系のpH を単に維持し、そして酸又は塩基のいずれかの添加により適宜そのpHを調整する ことによる。しかしながら、好ましい態様においては、その系のpHは好ましくは 、そのセルラーゼ溶液中のバッファーの使用により所望のpHレンジ内に維持され る。一般的に、その中で使用されるセルラーゼが活性を示すレンジ内にその溶液 のpHを維持するのに十分な量のバッファーが使用される。異なるセルラーゼ組成 物がセルラーゼ活性を示すための異なるpHレンジをもつ限り、使用される特定の バッファーは、その使用される特定のセルラーゼ組成物との関係において選定さ れる。使用されるセルラーゼ組成物との使用のために選ばれたバッファーは、使 用されるセルラーゼ組成物のためのpHレンジ及び最適pH並びにそのセルラーゼ溶 液のpHを考慮して当業者により容易に決定されることができる。好ましくは、使 用されるバッファーは、セルラーゼ組成物と相溶性であり、かつ、最適活性のた めに必要なpHレンジ内でそのセルラーゼ溶液のpHを維持するであろうものである 。好適なバッファーは、クエン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウ ム、リン酸２ナトリウム、及びいずれかの他の本分野において認知 されたバッファーを含む。 綿含有布の引っ張り強さは、互いに直角にあるたて糸とよこ糸の方向において 計測されることができる。従って、用語“たて糸引っ張り強さ（warp tensile s trength）”とは、本明細書中に使用するとき、綿含有布の長さに沿って計測さ れるときの綿含有布の引っ張り強さをいい、一方、用語“よこ糸引っ張り強さ（ fill tensile strength）”とは、綿含有布の幅を横切って計測されるときの綿 含有布の引っ張り強さをいう。得られるセルラーゼ溶液により処理された綿含有 布の引っ張り強さは、その処理の強度減少効果を測定するためにセルラーゼ溶液 による処理に先立つその引っ張り強さと比較される。引っ張り強さがかなり減少 される場合、得られる綿含有布は容易に裂け、そして／又は穴を形成するであろ う。従って、処理前の引っ張り強さの少なくとも約50％である処理後の（たて糸 とよこ糸の両方の）引っ張り強さを維持することが望ましい。 綿含有布の引っ張り強さは、ASTM D1682テスト方法論に従って容易に行われる 。このような布の引っ張り強さをテストするのに好適な装置は、scottテスター 又はInstronテスターを含み、この両方が商業的に入手可能である。セルラーゼ 溶液により処理された綿含有布の引っ張り強さのテストにおいては、処理後及び テスト前の布の縮みを妨ぐことに注意しなければならない。このような縮みは、 誤った引っ張り強さのデータをもたらすであろう。 綿含有布及び綿非含有セルロース系布に対する強化は、これまでに使用された ような方法により達成される。例えば、改善された感触をもつ綿含有布は、日本 国特許出願第58-36217号及び第58-54032号並びにOhishi et al.,“Reformation of Cotton Fabric by Cellulase”及びJTN 1988年12月ジャーナル記事“What's New -- Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric”に従 って達成されることができる。これらの文献のそれぞれの技術を引用により本明 細書中に取り込む。 同様に、綿含有布と綿非含有セルロース系布の感触と外観の両方を改善するた めの方法は、その溶液が撹拌され、そして綿含有布に対するセルラーゼ溶液のカ スケード効果が達成されるような条件下でセルラーゼを含む水性溶液とその布を 接触させることを含む。このような方法は、そのように処理された綿含有布と綿 非含有セルロース系布の改善された感触と外観をもたらし、そして1990年10月16 日に出願された米国逐次番号第07/598,506号中に記載されており、そしてこれを 全体として引用により本明細書中に取り込む。 綿含有編物の強化方法は、International Textile Bulletin，Dyeing/Printin g/Finishing，page ５ et seq.，２^nd Quarter，1990（これを引用により本明細 書中に取り込む。）中に記載されている。 同様に、綿含有デニムにストーン・ウォッシュ外観を付与する方法は、米国特 許第 4,832,864号（これを全体として引用により本明細書中に取り込む。）中に 記載されている。 セルラーゼ組成物による処理により綿含有布を強化する他の方法は本分野に公 知である。好ましくは、このような方法においては、セルラーゼによる綿含有布 の処理は、その綿含有布を仕上げする前に行われる。 上述のように、本発明は、本発明が、その処理された布において強度損失を最 小化する特定のセルラーゼ組成物を使用する限り、従事技術を上廻る、綿含有布 の改良方法である。本発明において使用されるセルラーゼ組成物は、CBHＩ型成 分を実質的に含まない、そして好ましくは全CBH型成分を実質的に含まない真菌 セルラーゼ組成物である。 さらに、本明細書中に記載するセルラーゼ組成物の使用は、応力を加えられた 綿含有布と綿非含有セルロース系布の布／色の強化をももたらす。特に、綿含有 布と綿非含有セルロース系布の製造の間、その布は、応力を加えられるようにな ることができ、そしてそのように応力が加えられるとき、それは破壊され、かつ 、無秩序な繊維を含むであろう。このような繊維は、その布にすりきれた、かつ 、曇った外観を有害に付与する。しかしながら、本発明に係る方法において処理 されるとき、そのように応力の加えられた布は布／色の強化を受ける。これは、 応力を加えられるようになる前の布の外観を回復させる効果をもつ破壊され、か つ、無秩序な繊維のいくつかを除去することにより生じると信じられている。 さらに、顔料型染色布（例えば、デニム）と共に本明細書中に記載するセルラ ーゼ組成物を使用することにより、これらのセルラーゼ組成物は、綿含有布と綿 非含有セルロース系布上への染料のより少ない再付着を引き起こすであろうとい うことが企図される。これらの再付着特定が他の成分に比較して１以上の特定の EG型成分について強化されることができることも企図される。 先に記載された真菌セルラーゼ組成物は、セルラーゼ及び、例えばバッファー 、界面活性剤、精練剤（scouring agent）、等を含む他の任意的成分を含む水性 溶液中で使用される。本溶液中で使用されるセルラーゼ組成物の濃度は、一般的 にその意図された目的に十分な濃度である。すなわち、セルラーゼ組成物の量は 、綿含有布に所望の強化を提供するために使用される。使用されるセルラーゼ組 成物の量は、使用される装置、使用される工程パラメーター（そのセルラーゼ溶 液の温度、そのセルラーゼ溶液への暴露時間）、セルラーゼ活性（例えば、セル ラーゼ溶液はより小さな活性のセルラーゼ組成物に比較してより大きい活性のセ ルラーゼ組成物のより低濃 度を必要とするであろう。）、等にも依存する。セルラーゼ組成物の正確な濃度 は、上記の要因並びに所望の効果に基づいて当業者により容易に決定されること ができる。好ましくは、本発明において使用されるセルラーゼ溶液中のセルラー ゼ組成物の濃度は、約0.01グラム／セルラーゼ溶液１リッター〜約10.0グラム／ セルラーゼ溶液１リッター；そしてより好ましくは、約0.05グラム／セルラーゼ 溶液１リッター〜約２グラム／セルラーゼ溶液１リッターである（先に掲げたセ ルラーゼ濃度は、全タンパク質の重量についてのものである。） バッファーをセルラーゼ溶液中に使用するとき、水性セルラーゼ溶液中のバッ ファーの濃度は、その中で使用されるセルラーゼが活性を示すレンジ内の溶液の pHを維持するのに十分なものであり、それは、次に、使用されるセルラーゼの性 質に依存する。使用されるバッファーの正確な濃度は、当業者が容易に考慮に入 れることができるいくつかの要因に依存するであろう。例えば、好ましい態様に おいては、そのバッファー並びにバッファー濃度は、最適なセルラーゼ活性に必 要なpHレンジ内にそのセルラーゼ溶液のpHを維持するように選ばれる。一般的に 、セルラーゼ溶液中のバッファー濃度は、約0.005Ｎ以上である。好ましくはセ ルラーゼ溶液中のバッファーの濃度は、約0.01〜約0.5Ｎ、そしてより好ましく は、約0.05〜約0.15Ｎである。セルラーゼ溶液中の増加したバッファー濃度が処 理された布の引っ張り強さの損失の割合を強化することができることが可能であ る。 セルラーゼとバッファーに加えて、セルラーゼ溶液は場合により、少量の界面 活性剤、すなわち、約２重量パーセント未満、そして好ましくは約0.01〜約２重 量パーセントの界面活性剤を含むことができる。好適な界面活性剤は、例えば、 アニオン性、非イオン性及 び両性界面活性剤を含む、セルラーゼとその布と適合性のいずれかの界面活性剤 を含む。 本発明における使用に好適にアニオン性界面活性剤は、線状又は分枝アルキル ベンゼンスルホネート；線状又は分枝アルキル基又はアルケニル基をもつアルキ ル又はアルケニル・エーテル界面活性剤；アルキル又はアルケニル・スルフェー ト；オレフィンスルホネート；アルカンスルホネート、等を含む。アニオン界面 活性剤に好適な相手イオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウムとカリウ ム；アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウムとマグネシウム；アンモニウム ・イオン；及び炭素数２又は３の、１〜３のアルカノール基をもつアルカノール アミンを含む。 両性界面活性剤（Ampholytic surtactants）は、スルホン酸第４アンモニウム 塩、ベタイン型（betaine-type）両性界面活性剤、等を含む。このような両性界 面活性剤は、同一分子内に正と負の両方の電荷をもつ。 非イオン界面活性剤は、一般的に、ポリオキシアルキレン・エーテル、並びに その高級脂肪酸アルカノールアミド又はアルキレン・オキシド付加物、脂肪酸グ リセリン・モノエステル、等を含んで成る。界面活性剤の混合物を使用すること もできる。 本発明において使用する、液化、すなわち、セルラーゼ溶液の重量対の重量の 比は、一般的に、綿含有布において所望の強化を達成するのに十分な量であり、 そして使用される方法及び達成されるべき強化に依存する。好ましくは、この液 化は一般的に約0.1：１以上、そしてより好ましくは約１：１以上、そしてさら により好ましくは約10：１以上である。約50：１以上の液化の使用は経済的な視 点から通常好ましくない。 セルラーゼ処理のための反応温度は、２つの競合要因に支配され る。第一に、より高い温度は、一般的に強化された反応速度に対応し、すなわち より速い反応は、低温において必要とされる反応時聞に比較して減少された反応 時間を許容する。従って、反応温度は一般的に少なくとも約30℃以上である。第 二に、セルラーゼは、使用されるセルラーゼの性質に依存する所定の反応温度を 超えて活性を失うタンパク質である。従って、その反応温度があまりに高くされ る場合、そのセルロース分解活性は、そのセルラーゼの変性の結果として失われ る。結果として、本発明において使用される最大反応温度は一般的に約65℃であ る。上記の視点において、反応温度は一般的に約30℃〜約65℃；好ましくは約35 ℃〜約60℃；そしてより好ましくは約35℃〜約50℃である。 反応時間は一般的に、約0.1時間〜約24時間、そして好ましくは約0.25時間〜 約５時間である。 このようなセルラーゼ組成物を用いて先に記載した方法において処理された綿 含有布は、完全真菌セルラーゼ組成物により同一のやり方で処理された同一の綿 含有布に比較して減少された強度損失を有する。 好ましい態様においては、濃縮物を、本明細書中に記載する方法において使用 のために製造することができる。このような濃縮物は、好ましくは、水性溶液中 、先に記載したセルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤の濃縮量を含むで あろう。そのように配合されるとき、濃縮物は、これらの添加物の必要な濃度を もつセルラーゼ溶液を迅速且つ正確に製造するように容易に水により希釈される ことができる。好ましくは、このような濃縮物は、約0.1〜約20重量パーセント の先に記載したセルラーゼ組成物（タンパク質）；約10〜約50重量パーセントの バッファー；約10〜約50重量パーセントの界面活性剤；及び約０〜80重量パーセ ントの水を含んで成るであ ろう。水性濃縮物が配合されるとき、これらの濃縮物は、そのセルラーゼ溶液中 その成分の必要な濃度に達するように約２〜約200の係数により希釈されること ができる。自明であろうが、このような濃縮物は、そのセルラーゼ溶液の容易な 配合を許容し、並びにそれが使用されるであろう位置へのその濃縮物の実行可能 な移送を許容する。上記のセルラーゼ組成物は、液体希釈物、粒状物、エマルジ ョン、ゲル、ペースト、等のいずれかにおける濃縮物に添加されることができる 。このような形態は当業者によく知られている。 固体セルラーゼ濃縮物が使用されるとき、このセルラーゼ組成物は一般的に粒 状物、粉末、凝集物、等である。粒状物が使用されるとき、これらの粒状物は好 ましくは、セルラーゼ保護剤を含むように配合される。例えば、アトーニ−書類 番号第010055-073号として、“GRANULES CONTAINING BOTH AN ENZYME AND AN EN ZYME PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING SUCH GRANULE S”と名称付けされた、1991年１月17日に出願された米国逐次番号第07/642,669 号（この出願を全体として引用により本明細書中に取り込まれた。）を参照のこ と。同様に、粒状物は、洗浄媒質中への粒状物の溶解速度を減少させるための材 料を含むように配合されることができる。このような材料と粒状物は、アトーニ −書類番号GCS-171-US1として、そして“GRANULAR COMP0OITIONS”と名称付けさ れた1991年１月17日に出願された米国逐次番号第07/642,596号（この出願を引用 により全体として本明細書中に取り込む。）中に開示されている。 本明細書中に記載するセルラーゼ組成物が、液体又はスプレーのいずれかとし て前洗浄において、そして前浸漬においてさらに使用されることができることが 企図される。さらに、本明細書中に記載するセルラーゼ組成物が、布の色及び外 観の強化に好適な独立組成 物として家庭において使用されることもできることが企図される。例えば米国特 許第4,738,682号（これを全体として引用により本明細書中に取り込む。）を参 照のこと。 以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、そしていずれの方法によ るかを問わず本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。 実施例 実施例１〜12は、１以上のセルラーゼ成分を生産することができないように又 は特定のセルラーゼ成分を過剰生産するように遺伝子操作されたトリコデルマ・ ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）の作出について実証する 。実施例１ トリコデルマ・ロンジブラチアタムのpyr4突然変異体についての選択 上記pyr4遺伝子は、オロチジン−５′−モノホスフェート・デカルボキシラー ゼ、ウリジンの生合成に必要な酵素をコードする。毒性阻害剤５−フルオロオロ チン酸（FOA）は、野生型細胞によりウリジンに取り込まれ、そしてそれ故それ らの細胞に毒性である。しかしながら、pyr4遺伝子内に欠陥がある細胞は、この 阻害剤に抵抗性であるが、成長のためにウリジンが必要である。それ故、FOAを 用いてpyr4突然変異体株について選択することができる。実際に、トリコデルマ ・ロンジブラチアタム株RL-P37（Sheir-Neiss G-and Montenecourt，B．S.，198 4，Appl．Microbiol．Biｏtechnol．20：46-53）の胞子を、２mg／mlのウリジン と1.2mg／mlのFOAを含む固化培地の表面上に拡げた。自生FOA-耐性コロニーが３ 〜４日以内に現れ、そしてその後に、成長のためにウリジンを必要とするような FOA-耐性突然変異体を同定することができた。欠陥pyr4遺伝子を特 別にもっていた突然変異体を同定するために、プロトプラストを作り、そして野 生型pvr4遺伝子を含むプラスミドにより形質転換させた（実施例３と４を参照の こと。）。形質転換後、プロトプラストをウリジンを欠いた培地上にプレートし た。形質転換されたコロニーのその後の成長は、プラスミド担持pyr4遺伝子によ る欠陥pyr4遺伝子の相補を立証した。実施例２ CBHＩ欠失ベクターの調製 CBHＩタンパク質をコードするcbh1遺伝子を、公知のプローブ合成法（Shoemak er et al.,”Molecular Cloning of Exo-cellobiohydrolase I Derived from Tr ichoderma longibrachitatum strain L27”，Bio/Technology １，p．691（198 3））を用いてこの遺伝子のための公開された配列に基づいてデザインされたオ リゴヌクレオチド・プローブによるハイブリダイゼーションにより株RL-P37を使 用してゲノムDNAからクローン化した。このcbh1遺伝子は6.5kb PstＩ断片上にあ り、そして（Pharmacia Inc.，Piscataway，NJから購入した） pstＩ切断pUC4K 内に挿入してこのベクターのKan^r遺伝子を置換した。得られたプラスミド、pUC4 K :: cbhＩを次にHindIIIにより切断し、そして約６kbのより大きな断片を単離 し、そしてライゲートしてpUC4K :: cbhＩΔＨ／Ｈを得た。この手順は、cbh1コ ード配列の全体及びその元のPstＩ断片のいずれかの側からのフランキングDNAの 約1.2kb上流及び1.5kb下流を除去する。 トリコデルマ・ロンジブラチアタムpyr4遺伝子を、Sambrook et al.，1989,“ Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，２^ndEd.，Cold Spring Harbor La boratory Pressの方法に従ってpUC18内のゲノムDNAの6.5kb断片としてクローン 化した。プラスミドpUC4K :: cbhＩΔＨ／ＨをHindIIIにより切断し、そしてそ の両端をウ シ腸アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化した。この末端が脱リン酸化さ れたDNAをトリコデルマ・ロンジブラチアタムpyr4遺伝子を含む6.5kbのHindIII 断片とライゲートしてｐΔCBHＩpvr4を得た。図１を参照のこと。実施例３ プロトプラストの単離 菌糸体を、500mlフラスコ内の100mlのYEG（0.5％酵母エキス、２％グルコース ）を約５×10⁷のトリコデルマ・ロンジブラチアタムGC胞子（pyr4突然変異体株 ）により接種することにより得た。次にこのフラスコを37℃において振とうしな がら約16時間インキュベートした。菌糸体を2,750xgにおける遠心分離により収 穫した。収穫された菌糸体をさらに1.2Ｍソルビトール溶液中で洗浄し、そして ５mg／ml Novozym^R234；５mg/ml MgSO₄・７H₂O；0.5mg／mlウシ血清アルブミン ；1.2Ｍソルビトールを含む40mlのNovozym^R234溶液（これは、Novo Biolabs，Da nbury ct．からの、１，３−アルファーグルカナーゼ、１，３−ベーターグルカ ナーゼ、ラミナリナーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ及びプロテアーゼを含む多 成分酵素系のための商品名である。）中に再懸濁させた。プロトプラストを、Mi racloth（Calbiochem．Corp）を通しての濾過により細胞死骸から取り出し、そ して2,000xgにおける遠心分離により採取した。このプロトプラストを1.2Ｍソル ビトール中で３回、そして1.2Ｍソルビトール、50mM CaCl₂中で１回洗浄し、遠 心分離し、そして再懸濁させた。プロトプラストを最終的に、1.2Ｍソルビトー ル、50mM CaCl₂の１ml当り２×10⁸プロトプラストの密度において再懸濁させた 。実施例４ 真菌プロトプラストの形質転換 実施例３において調製した200μｌのプロトプラスト懸濁液を、TEバッファー （10mM Tris，pH7.4；１mM EDTA）中の（実施例２において調製した）EcoＲＩ消 化ｐΔCBHＩpyr4の20μｌ、及び25％PEG 4000，0.6Ｍ KCl及び50mM CaCl₂を含む ポリエチレン・グリコール（PEG）溶液50μｌに添加した。この混合物を氷上で2 0分間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、20mlの上記同定P EG溶液をそれに添加し、その溶液をさらに混合し、そして室温において５分間イ ンキュベートした。この第二のインキュベーションの後、1.2Ｍソルビトールと5 0mM CaCl₂を含む4.0mlの溶液をそれに添加し、そしてこの溶液をさらに混合した 。このプロトプラスト溶液を次に追加の１％グルコース、1.2Ｍソルビトール及 び１％アガロースを含むVogel's Medium N（リッター当り、３グラムのクエン酸 ナトリウム、５グラムのKH₂PO₄、２グラムのNH₄NO₃，0.2グラムのMgSO₄・７H₂O ，0.1グラムのCaCl₂・２H₂O，５μｇのα−ビオチン、５mgのクエン酸、５mgのZ nSO₄・７H₂O，１mgのFe(NH₄)₂・６H₂O，0.25mgのCnSO₄・５H₂O，50μｇのMnSO₄ ・４H₂O）の溶けたアリコートに直ちに添加した。プロトプラスト／培地混合物 を次に上記と同一のVogel's培地を含む固体培地上に注いだ。ウリジンはその培 地中に全く存在せず、そしてそれ故、形質転換されたコロニーだけが、ｐΔCBH Ｉpyr4中に存在する野生型pyr4遣伝子による株GC69のpyr4突然変異体の相補の結 果として成長することができた。これらのコロニーはその後、添加物として１％ グルコースを含む固体Vogel's培地Ｎ上に、移され、そして安定した形質転換体 が精製された。実施例５ 形質転換体の分析 DNAを、実施例３において得られた形質転換体からそれらが１％ グルコースを含む液体Vogel's培地Ｎ中で増殖された後に単離した。これらの形 質転換体DNAサンプルをさらにPstＩ制限酵素により切断し、そしてアガロース・ ゲル電気泳動に供した。このゲルを次にさらにNytran膜フィルター上にブロット し、そして³²ＰラベルされたｐΔCBHＩpyr4プローブとハイブリダイズさせた。 このプローブは、6.5kb PstＩ断片としての生来のcbh1遺伝子、生来のpyr4遺伝 子、及び形質転換性DNA断片から誘導されたいずれかのDNA配列を同定するように 選ばれた。図２は、トリコデルマ・ロンジブラチアタム染色体の中の１上のcbh1 座におけるｐΔCBHＩpyr4からのより大きなEcoＲＩ断片の組み込みによるトリコ デルマ・ロンジブラチアタムcbh1遺伝子の欠失を概説する。 上記ハイブリダイゼーションからのバンドをオートラジオグラフィーを介して 可視化した。オートラジオグラフの結果を図３中に示す。５つのサンプルを上記 のように走らせた、よってサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ、及びＥ。レーンＥは、非形 質転換株GC69であり、そして本分析において対照として使用した。レーンＡ−Ｄ は、上記の方法から得られた形質転換体を表す。オートラジオグラフの側上の数 は、分子量マーカーのサイズを表す。このオートラジオグラフから分かるように 、レーンＤは6.5kb CBHＩバンドを含まず、このことは、この遣伝子がその形質 転換体内で完全に欠失していたことを示している。このcbh1欠失株を、p37PΔCB HＩという。分析された他の形質転換体は、非形質転換対照株と同じようである 。ｐΔCBHＩpyr4からの線状断片が生来のpyr4座における２重交差により組み込 まれて遣伝子置換事件を与えたために、これが生じたと推定される。実施例６ 実施例５におけるものと同一の手順を本実施例において使用した 。但し、使用したプローブを、³²ＰラベルされたpInt CBHＩプローブに変更した 。このプローブは、pUC4 :: cbh1ΔＨ／Ｈ内で欠失された領域内にcbh1座からの ２kb BglII断片を含むpUC-型プラスミドである。対照サンプルＡであって非形質 転換株GC69であるもの及び形質転換体P37PΔCBHＩ、サンプルＢを含む２つのサ ンプルを本実施例において走らせた。図４から分かるように、6.5kbにおけるバ ンドにより示されるように、サンプルＡはcbh1遺伝子を含むが；形質転換体、サ ンプルＢはこの6.5kbバンドを含まず、そしてそれ故cbh1遺伝子を含まない。実施例７ 株P37PΔ CBHＩによるタンパク質分泌 作出されたP37PΔ CBHＩ株からの胞子を、１％グルコース、0.14％（NH₄）₂SO₄ ，0.2％KH₂PO₄，0.03％MgSO₄，0.03％尿素、0.75％バクトトリプトン、0.05％ Tween 80，0.000016％ CuSO₄・５H₂O，0.001％ FeSO₄・７H₂O，0.000128％ ZnSO₄ ・７H₂O，0.0000054％ Na₂MoO₄・２H₂O，0.0000007％ MnCl・４H₂Oを含むトリ コデルマ（Trichoderma）基本培地50mlに接種した。この培地を振とうしながら3 7℃において48時間250mlフラスコ内でインキュベートした。得られた菌糸体をMi racloth（Calbio chem Corp.）を通しての濾過により採取し、そして17mMリン酸 カリウムにより２又は３回洗浄した。この菌糸体を、１mMソフォロースを含む17 mMリン酸カリウム中に最終的に懸濁させ、そしてさらに振とうしながら30℃にお いて24時間インキュベートした。次にこの上清をこれらの培養物から集め、そし てその菌糸体を廃棄した。この培養上清のサンプルを、製造者の指示に従って、 Pharmacia Phastgelシステム及びpH３〜９プレキャスト・ゲルを使用して等電点 フォーカシングにより分析した。このゲルを銀ステインにより着色して、そのタ ンパク質バンドを可 視化した。cbh1タンパク質に対応するバンドは図５に示されるように、株P37PΔ CBHＩから誘導されたサンプルからは非存在であった。この等電点フォーカシン グ・ゲルは、トリコデルマ・ロンジブラチアタムの異なる上清カルチャー中にさ まざまなタンパク質を示している。レーンＡは、部分的に精製されたCBHＩであ り；レーンＢは非形質転換トリコデルマ・ロンジブラチアタムからの上清であり ；レーンＣは本本発に係る方法に従って作出されたcbh1遺伝子について欠失され た株からの上清である。さまざまなセルラーゼ成分の位置が標識付けされている 。CBHＩは全細胞外タンパク質の約50％を構成するので、それは主要な分泌タン パク質であり、そしてそれ故そのゲル上の最も暗いバンドである。この等電点フ ォーカシング・ゲルは、cbh1について欠失された株内のCBHＩタンパク質の消失 をはっきりと示している。実施例８ pPΔ CBH IIの調製 CBH IIタンパク質をコードするT．longibrachiatumのcbh2遺伝子はゲノムDNA の4.1kb EcoＲＩとしてクローン化されており、これを図６中にダイアグラムと して示す（Chen et al.，1987 Biotechnology，５：274-278）。本分野において 公知の方法を使用して、プラスミド、pPΔCBH II（図6B）が構築されており、こ の内で、（ＣBH II翻訳開始部位の74bp３′における）HindIII部位と（CBH IIの 最終コドンの265bp３′における）ClaＩ部位との間のこのクローンの3.2kbの中 央領域がトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）p yr4 遺伝子により除去され、そして置換されている。 EcoＲＩによるこのプラスミドの消化は、１端におけるcbh2座から0.7kbのフラ ンキングDNAをもつ断片、その他端においてcbh2座 から1.7kbのフランキングDNA、そしてその中央においてトリコデルマ・ロンジブ ラチアタムpyr4遣伝子を解放するであろう。実施例９ P37PΔCBHＩのpyr4^-突然変異体の生成 cbh1遺伝子について欠失された形質転換体（P37PΔCBHＩ）の胞子をFOAを含む 培地上に拡げた。この形質転換体のpyr4 ^-誘導体をその後実施例１の方法を使用 して得た。このpyr4 ^-株をP37PΔ CBHＩ Pyr^-26と命名した。実施例10 cbh1について先に欠失された株内のcbh2遣伝子の欠失 株P37PΔ CBHＩPyr^-26のプロトプラストを、実施例３と４に概説した方法に従 って生成し、そしてEcoＲＩ消化pPΔCBH IIにより形質転換した。 精製され安定した形質転換体を実施例７におけるように振とうフラスコ内で培 養し、そしてその培養上清中のタンパク質を等電点フォーカシングにより検査し た。１の形質転換体（P37PΔΔ CBH67と命名されたもの）であっていずれのCBH IIタンパク質を生産しなかったものを同定した。図５のレーンＤは、本発明に係 る方法に従って作出されたcbh1とcbh2遣伝子の両方について欠失された株からの 上清を示す。 DNAを、株P37PΔΔ CBH67から抽出し、EcoＲＩとAsp718により消化し、そして アガロース・ゲル電気泳動に供した。このゲルからのDNAを、膜フィルターにブ ロットし、そして³²ＰラベルされたpPΔ CBHIIとハイブリダイズした（図７）。 図７のレーンＡは、非形質転換トリコデルマ・ロンジブラチアタム株からのDNA について観察されたハイブリダイゼーション・パターンを示す。野生型cbh2遺伝 子を含む4.1kbのEcoＲＩ断片を観察した。レーンＢは、株P3 7PΔΔ CBH67について観察されたハイブリダイゼーション・パターンを示す。単 一の4.1kbバンドが取り除かれ、そして約0.9と3.1kbの２つのバンドにより置換 された。これは、pPΔ CBHIIからのEcoＲＩ断片の単一コピーがcbh2座に正確に 組み込まれている場合に予想されるパターンである。 同−DNAサンプルをEcoＲＩによっても消化し、そしてサザン分析を上述のよう に行った。本実施例においては、プローブは³²Ｐラベルされたplnt CBH IIであ った。このプラスミドは、プラスミドpPΔCBH II内で欠失されたcbh2 DNAのセグ メント内からのcbh2遺伝子コード配列の一部を含む。株P37PΔΔ CBH67からのDN Aとのハイブリダイゼーションは全く見られず、これは、このcbh2遣伝子が欠失 されており、そして上記pUCプラスミドから誘導された配列はこの株内に全く存 在しなかったことを示している。実施例11 pEGＩpyr4の構築 EGＩをコードするトリコデルマ・ロンジブラチアタムeglＩ遣伝子は、公開さ れた配列に従って合成されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに より株RL-P37からのゲノムDNAの4.2kb Hind III断片としてクローン化されてい る（Penttila et al.，1986，Gene 45：253-263）。3.6kbのHind III−BamＨＩ 断片をこのクローンから取り出し、そしてトリコデルマ・ロンジブラチアタムpy r4 遺伝子を含む1.6kbのHind III−BamＨＩとHind IIIにより切断されたpUC-ベー スのプラスミドとライゲートしてプラスミドpEGＩpyr4を得た（図８）。Hind II IによるpEGＩpyr4の消化は、トリコデルマ・ロンジブラチアタムのゲノムDNA（e gl1 とpyr4遣伝子）だけを含むDNAの断片を解放するであろう。但し、これらの２ つの遣伝子間の24塩基対の配列決定された合成DNA及び１端における６塩基対の 配 列決定された合成DNAを除く（図８参照）。実施例12 pEGＩpyr4を含むトリコデルマ・ロンジブラチアタムの形質転換体 トリコデルマ・ロンジブラチアタム株RutC30（Sheir-Neiss and Montenecourt ，1984，Appl．Microbiol．Biotechnol．20：46-53）のpyr4欠陥突然変異体を実 施例１に概説した方法により得た。この株のプロトプラストを非消化pEGＩpyr4 により形質転換し、そして安定した形質転換体を精製した。（EP２，EP４，EP５ ，EP６，EP11と命名された）これらの形質転換体の中の５、ならびに非形質転換 Rutc30を、250ml振とうフラスコ内の50mlとのEG培地（酵母エキス、５ｇ／ｌ； グルコース、20ｇ／ｌ）中に接種し、そして振とうしながら28℃において２日間 培養した。得られた菌糸体を滅菌水により洗浄し、そして50mlのTSF培地（0.05 Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファー、pH5.0：Avicel微晶性セルロース、10ｇ／ ｌ；KH₂PO₄，2.0ｇ／ｌ；（NH₄）₂SO₄，1.4ｇ／ｌ；プロテロース・ペプトン、1 .0ｇ／ｌ；尿素、0.3ｇ／ｌ；MgSO₄・７H₂O，0.3ｇ／ｌ；CaCl₂，0.3ｇ／ｌ；Fe SO₄・７H₂O，5.0mg／ｌ；MnSO₄・H₂O，1.6mg／ｌ；ZnSO₄，1.4mg／ｌ；CoCl₂，2 .0mg／ｌ；0.1％Tween 80）に添加した。これらのカルチャーを28℃においてさ らに４日間振とうしながらインキュベートした。上清のサンプルをこれらのカル チャーから採取し、そしてタンパク質の全量及びエンドグルカナーゼの全量を計 測するためにデザインされた検定を以下に記載するように行った。 このエンドグルカナーゼ検定は、Remazol Brilliant Blue−カルボキシメチル セルラーゼ（Mega Zyme，North Rocks，NSW，Australiaから得られたRBB-CMC） からの可溶性の、染色されたオリゴ糖の放 出に依るものであった。基質を、激しく撹拌しながら２ｇの乾燥RBB-CMCを80ml の沸騰したての脱イオン水に添加することにより調製した。室温まで冷却したと き、５mlの２Ｍ酢酸ナトリウム・バッファー（pH4.8）を添加し、そしてそのpH を4.5に調整した。その容量を最終的に脱イオン水により100mlに調整し、そして アジ化ナトリウムを0.02％の最終濃度に添加した。トリコデルマ・ロンジブラチ アタムの培養上清のアリコート又はブランクとしての0.1Ｍ酢酸ナトリウム（10 〜20μｌ）を管内に入れ、250μｌの基質を添加し、そしてそれらの管を37℃に おいて30分間インキュベートした。これらの管を氷上に10分間置き、そして１ml の冷沈澱剤（3.3％酢酸ナトリウム、0.4％酢酸亜鉛、HClによるpH５，76％エタ ノール）を次に添加した。これらの管を撹拌し、そして約13,000xgにおいて３分 間の遠心分離前５分間静置さした。吸光度を590-600nmの波長において分光光度 計により測定した。 使用したタンパク質検定はPierce，Rockford，Illinois，USAから得た試薬を 用いたBCA（ビシンコニン酸）検定であった。標準はウシ血清アルブミン（BSA） であった。BCA試薬を、１部の試薬Ｂと50部の試薬Ａとを混合することにより調 製した。１mlのBCA試薬を、50μｌの、適当に希釈されたBSA又はトリコデルマ・ ロンジブラチアタム培養上清と混合した。インキュベーションは37℃30分間であ り、そして吸光度を最終的に、562nmの波長において分光光度計により測定した 。 上記の検定の結果を表１中に示す。形質転換体のいくつかは、非形質転換株Ru tC30に比べて増加量のエンドグルカナーゼ活性を作り出したことは明らかである 。非形質転換トリコデルマ・ロンジブラチアタムにより生産されたエンドグルカ ナーゼ又はエクソ−セロビオヒドロラーゼは、分泌されたタンパク質の全量のそ れぞれ約20％ と70％を占める。それ故、形質転換体、例えばEP５であって、株RutC30よりも約 ４倍多くのエンドグルカナーゼを生産するものは、ほとんど等量のエンドグルカ ナーゼ型とエクソ−セロビオヒドロラーゼ型タンパク質を分泌すると予想される であろう。 本実施例中に記載する形質転換体は、悪傷のpEGＩpyr4を使用して得られ、そ してpUCプラスミドから誘導されたゲノム内に組み込まれたDNA配列を含むであろ う。形質転換に先立って、HindIIIによりpEGＩpyr4を消化し、そしてトリコデル マ・ロンジブラチアタムDNAだけを含むより大きなDNA断片を単離することができ るであろう。この単離されたDNA断片によるトリコデルマ・ロンジブラチアタム の形質転換は、図８中に示す合成DNAの２つの短い片を除き外因性DNA配列を全く 含まず、そしてEGＩを過剰生産する形質転換体の単離を許容するであろう。cbh1 遺伝子又はcbh2遣伝子のいずれか、あるいは両方の遺伝子について欠失された株 を形質転換するためにpEGＩpyr4を使用することもできるであろう。この方法で 、EGＩを過剰生産し、そしてエクソ−セロビオヒドロラーゼの限定されたレンジ を生産するか又は全く生産するかのいずれかであろう株を構築することができた 。 実施例12の方法は、トリコデルマ・ロンジブラチアタム（T．longibrachiatum ）により正常に生産される他のエンドグルカナーゼのいずれかを過剰生産するで あろうトリコデルマ・ロンジブラチアタムを作出するために使用されることがで きた。 上記結果は、EGＩ成分の過剰生産を立証する目的をもって、そして過剰生産の 程度の目的をもたずに、提示される。これに関して、過剰生産の程度は、各実験 により変動すると予想される。 実施例13は、精製手順を介してのCytolase 123セルラーゼ（リコデルマ・ロン ジブラチアタム（richoderma longibrachiatum）から得られ、そしてGenencor I nternational，Inc.，South San Francisco，CAから入手可能な完全真菌セルラ ーゼ組成物）の成分の単離について立証する。実施例13 Cytolase 123 Cellulaseの、セルラーゼ成分への精製 CYTOLASE 123セルラーゼを以下のやり方で分画した。このセルラーゼ系におけ るセルラーゼ成分の正常分布は以下のようなものである： CBHＩ 45−55重量パーセント CBH II 13−15重量パーセント EG Ｉ 11−13重量パーセント EG II 8−10重量パーセン卜 EG III 1−4 重量パーセント BG 0.5−1 重量パーセント 分画を以下の樹脂を含むカラムを使用して行った：Sigma Chemical Company C st．Louis，Mo）からのSephadex G-25ゲル濾過樹脂、IBF Bio technics（Savage ，Md）からのQA Trisacryl Mアニオン交換樹脂及びSP Triacryl Mカチオン交換 樹脂。CYTOLASE 123セルラーゼ、0.5ｇを、pH6.8における10mMリン酸ナトリウム ・バッファーにより３リッターのSephadex G-25ゲル濾過樹脂のカラムを使用し て脱塩した。この脱塩溶液を次に20mlのQA Trisacryl Mアニオン交換樹脂のカラ ム上にロードした。このカラムに結合された画分はCBHＩとEGＩを含んでいた。 これらの成分を０〜約500mMの塩化ナトリウムを含む水性グラジエントを用いた グラジエント溶出により分離した。このカラムに結合されなかった画分はCBH II とEG IIを含んでいた。これらの画分を、10mMクエン酸ナトリウム、pH3.3により 平衡化したSephadex G-25ゲル濾過樹脂のカラムを用いて脱塩した。この溶液200 mlを次に20mlのSP Trisacryl Mカチオン交換樹脂上にロードした。CBH IIとEG I Iを、０〜約200mM塩化ナトリウムを含む水性グラジエントを用いて別々に溶出し た。 先の実施例13の手順と同様の手順に従えば、それらの成分に分離されることが できる他のセルラーゼ系は、（Novo Industry，Copenhagen，Demmarkから入手可 能な）CELLVCAST，（Gist Brocades，N．V.，Delft，Hollandから入手可能な）P APIDASE、及びトリコデルマ・コニンジ（Trichoderma koningii）、ペニシラム ・エスピー（Pe nicillum sp. ）、等から誘導されたセルラーゼ系を含む。実施例14 Cytolase 123 CellulaseからのEG IIIの精製 上記実施例13は、Cytolase 123 Cellulaseからのいくつかの成分の単離につい て立証する。しかしながら、EG IIIは、Cytolase 123 Cellulase中、ひじょうに 少量で存在するので、以下の手順を、この成分を単離するために使用した。Ａ．EG IIIセルラーゼ酵素の大規模抽出 100ｌの無細胞セルラーゼ濾液を約30℃に加熱した。加熱材料を約４wt／vol％ のPEG 8000（ポリエチレン・グリコール、約8000の分子量）と約10wt／vol％の 無水硫酸ナトリウムにより調製した。この混合物は２相液体混合物を形成した。 これらの相を銀染等電点フォーカシング・ゲルを用いて分析した。分離物を、EG IIIとキシラナーゼについて得た。回収された組成物は、約20〜50重量パーセン トのEG IIIを含んでいた。 上記手順に関して、約8000末端の分子量をもつポリエチレン・グリコールの使 用は適当な分離を与える；一方、約8000を超える分子量をもつポリエチレン・グ リコールの使用は、その回収された組成物中の所望の酵素の排除をもたらした。 硫酸ナトリウムの量に関しては、約10wt／vol％を超える硫酸ナトリウムのレベ ルは沈澱問題を引き起こし；一方、約10wt／vol％未満の硫酸ナトリウム・レベ ルは貧弱な分離又は単一相において残る溶液を与えた。Ｂ．分画を介してのEG IIIの精製 EG IIIの精製を、野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムにより生産された 完全真菌セルラーゼ組成物（Genencor Internatponal，South San Francisco，C Aから商業的に入手可能なCYTOLASE 123セルラーゼ）からの分画により行った。 特に、この分画を、以下の樹 脂を含むカラムを使用して行う：Sigma Chemical Company（St．Louis，Mo）か らのSephadex G-25ゲル濾過樹脂、IBF Biotechnics（Savage，Md）からのQA Tri sacryl Mアニオン交換樹脂及びSP Trisacryl Mカチオン交換樹脂。CYTOLASE 123 セルラーゼ、0.5ｇを、pH6.8における10mMリン酸ナトリウム・バッファーにより ３リッターのSephadex G-25 ゲル濾過樹脂のカラムを使用して脱塩した。この脱 塩溶液を次に20mlのQA Trisacryl Mアニオン交換樹脂のカラム上にロードした。 このカラムに結合された画分はCBHＩとEGＩを含んでいた。このカラムに結合さ れなかった画分はCBH II，EG II及びEG IIIを含む。これらの画分を、10mMクエ ン酸ナトリウム、pH4.5により平衡化したSephadex G-25ゲル濾過樹脂のカラムを 用いて脱塩した。この溶液200mlを次に20mlのSP Trisacryl Mカチオン交換樹脂 上にロードした。EG IIIを、200mM塩化ナトリウムの水性溶液100mLにより溶出し た。 EG IIIの単離の効率を強化するために、１以上のEGＩ，EG II，CBHＩ及び／又 はCBH IIを生産することができないように遣伝子修飾されたトリコデルマ・ロン ジブラチアタムを使用することが望ましくあることができる。１以上のこのよう な成分の非存在は、EG IIIのより効率的な単離を必ず導くであろう。 同様に、上記のEG III組成物がさらに精製されて実質的に純粋なEG III組成物 、すなわち約80重量パーセントのタンパク質を上廻るEG IIIを含む組成物、を提 供することが望ましくあることができる。例えば、このように実質的に純粋なEG IIIタンパク質は、手順Ｂにおいて手順Ａから得られた材料を使用して、又はこ れと逆の操作により、得られることができる。EG IIIをさらに精製するためのＩ の特定の方法は、本実施例14のパートｂ）において得られたEG IIIサンプルのさ らなる分画による。このさらなる分画は、（Pharmacia LKB Biotec hnology，Piscataway，NJから入手可能な）Mono-S-HR５／５カラムを用いてFPLC システム上で行われた。このFPLCシステムは、液体クロマトグラフィー・コント ローラー、２つのポンプ、２経路モニター、分画コレクター、及びチャート・レ コーダー（これらの全ては、Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJか ら入手可能である。）から成る。この分画を、10mMクエン酸ナトリウムpH４によ り先に平衡化された20ml Sephadex G-25カラムによる本実施例14のパートｂ）に おいて調製された５mlのEG IIIを脱塩することにより行った。このカラムを、次 に、0.5ml／分の速度でNaClの０〜200mMの水性グラジエントにより溶出し、サン プルを１ml画分において集めた。EG IIIは画分10と11内に回収され、そしてSDS ゲル電気泳動により90％よりも高い純度であると測定された。この純度のEG III は、公知技術によるＮ−末端アミノ酸配列の決定に好適である。 実質的に純粋なEG III並びに先の実施例13において精製されたEGＩとEG II成 分を、本発明に係る方法において単独で又は混合において使用することができる 。これらのEG成分は、以下の特徴をもつ： 本発明の実施におけるこれらの成分の混合物の使用は、単一成分に比較して、 柔らかさ、感触、外観等の改善において協力的な応答を与えることができる。他 方において、本発明の実施における単一成分の使用は、pH_sのレンジにわたるよ り広い活性スペクトルをもち又はより安定であることができる。例えば、以下の 実施例15は、 EG IIIはアルカリ性条件下でRBB-CMCに対してかなりの活性をもつことを示して いる。実施例15 pHレンジにわたるセルラーゼ組成物の活性 以下の手順を２つの異なるセルラーゼ組成物のpH特性を測定するために使用し た。第一のセルラーゼ組成物は、CBHＩとCBH II成分を生産することができない ように先に記載したものと同様のやり方で遺伝子修飾されたトリコデルマ・ロン ジブラチアタムから調製されたCBHＩとII欠失セルラーゼ組成物であった。この セルラーゼ組成物が、トリコデルマ・ロンジブラチアタムから誘導されたセルラ ーゼ組成物の約58〜70パーセントを一般的に占めるCBHＩとCBH IIを含まない限 り、このセルラーゼ組成物は、必ずCBHＩ型とCBH II型セルラーゼ成分を実質的 に含まず、そしてそれ故EG成分、すなわちEGＩ，EG II，EG III、等に富む。 第二セルラーゼ組成物は、実施例14のパートｂ）と同様の精製方法を介してト リコデルマ・ロンジブラチアタムから誘導されたセルラーゼ組成物から単離され たEG IIIの約20〜40％純度の画分であった。 これらのセルラーゼ組成物の活性を40℃において測定し、そしてそれらの測定 を以下の手順を使用して行った。 最終溶液中の必要量の酵素を提供するのに十分な濃度において５〜20μｌの適 当な酵素溶液を添加する。pH４，５，5.5，６，6.5，７，7.5及び８において0.0 5Ｍクエン酸塩／リン酸塩バッファー中２重量パーセントのRBB-CMC（Mega Zyme ，６ Altona Place，North Rocks，N．S．W．2151，Australiaから商業的に入手 可能なRemazol Brilliant Blue R-Carboxymethyl cellulose）250μｌを添加す る。 撹拌し、そして40℃において30分間インキュベートする。0.3Ｍ酢酸ナトリウ ムと0.02Ｍ酢酸亜鉛を含むメチル・セロソルブ1000μｌを添加する。遠心分離し 、そしてキュベットに上清を注ぐ。590nmにおいて各キュベット内の溶液の吸光 度（OD）を測定する。より高いレベルの吸光度はより高いレベルの酵素活性に対 応する。 この分析の結果を図９中に記す。図９は、EG IIIセルラーゼ組成物に比較した CBHＩとII欠失セルラーゼ組成物の比活性を示している。この図から、CBHＩとCB H IIにおいて欠失されたセルラーゼ組成物がpH5.5付近にRBB-CMCに対する最適セ ルロース分解活性を有し、そしてアルカリ性pH、すなわち７超〜８のpHにおいて いくらかの活性をもつことが分かる。他方において、EG IIIに富んだセルラーゼ 組成物は、pH5.5〜６において最適セルロース分解活性を有し、そしてアルカリ 性pHにおいてかなりの活性を有している。 上記の例から、当業者は、そのセルラーゼ組成物が活性であり、そして好まし くは最適活性を有するように、その水性繊維組成物のpHを調節し、そして維持す るであろう。上述のように、このような調節及び維持は、好適なバッファーの使 用を含むことができる。実施例16 セルラーゼ組成物の洗濯計強度損失検定 本実施例は、綿含有布の強度を減少させる、さまざまなセルラーゼ組成物の能 力について検査する。本実施例は、pH５に維持された水性セルラーゼ溶液を使用 する。なぜならトリコデルマ・ロンジブラチアタムから誘導されたセルラーゼ成 分のほとんどの活性がpH５において又はその付近で最大であり、そしてそれ故強 度損失結果が、本検定がこのpH付近で行われるときに、最も明確であるであろう からである。 特に、本実施例においては、分析された第一セルラーゼ組成物は 、野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムにより生産された完全真菌セルラー ゼ系（Genencor Iuternational，South San Francisco，CAから商業的に入手可 能なCYTOLASE 123セルラーゼ）であり、そしてGC 010と同定される。 分析された第二セルラーゼ組成物は、CBH IIを発現することができないように 先の実施例１〜12と同様のやり方で遺伝子修飾されたトリコデルマ・ロンジブラ チアタムから生産されたCBH II欠失セルラーゼ組成物であり、そしてCBH IIｄと 同定される。CBH IIがそのセルラーゼ組成物の約15パーセントまでを占める限り 、この成分の欠失は、CBHＩ、及びEG成分の全てのの強化されたレベルをもたら す。 分析された第三のセルラーゼ組成物は、CBHＩとCBH IIを発現することができ ないように先に記載したものと同様のやり方で遺伝子修飾されたトリコデルマ・ ロンジブラチアタムから生産されたCBHＩとCBH II欠失セルラーゼ組成物であり 、CBHＩ／IIｄと同定される。CBHＩとCBH IIがこの修飾された微生物により生産 されない限り、セルラーゼは、必ず、CBHＩ型成分の全て並びにCBH成分の全てを 含まない。 分析された最後のセルラーゼ組成物は、CBHＩを発現することができないよう に先に記載したものと同様のやり方で遺伝子修飾されたトリコデルマ・ロンジブ ラチアタムから生産されたCBHＩ欠失セルラーゼ組成物であり、そしてCBHＩｄと 同定される。この修飾された微生物がCBHＩを発現することができない限り、こ のセルラーゼ組成物は、必然的にCBHＩ型セルラーゼ成分の全てを含まない。 上記のセルラーゼ組成物を洗濯計（launderometer）内で綿含有布強度損失に 対するそれらの効果についてテストした。これらの組成物を、最初に、等量のEG 成分が使用されるように規定した。各セル ラーゼ組成物を次に、pH５に滴定された20mMクエン酸塩／リン酸塩バッファーの 400mlの別々の溶液に添加し、そしてこれは0.5mlの非イオン界面活性剤を含んで いる。得られた溶液のそれぞれを、次に別個の洗濯計キャニスターに添加した。 これらのキャニスター内に、強度損失を容易にするための多量の小石（narbles ）並びに16インチ×20インチの綿布（Test Fabrics，Inc.，200 Blackford Ave. ，Middlesex，NJ 08846からStyle No．467として入手可能な、100％識綿）を添 加した。このキャニスターに次に蓋をし、そしてこのキャニスターを、43℃にお いて維持された洗濯計浴内に降下させた。次にこのキャニスターを、約１時間、 少なくとも約40の１分間当りの回転数（rpms）の速度においてその浴内で回転さ せた。その後、布を取り出し、十分に濯ぎ、そして標準的なドライヤー内で乾燥 させた。 強度損失結果を最大化するために、上記の手順を２回以上繰り返し、そして３ 回目の処理後、その綿布を取り出し、そして強度損失について分析した。強度損 失を、Instron Testerを使用してよこ糸方向における引っ張り強さ（“FTS”） を測定することにより計測し、そしてその結果を、セルラーゼが添加されていな いことを除き同一溶液により処理された布のFTSと比較した。この分析の結果を 以下のように決定されるパーセント強度損失として報告する： この分析の結果を図10に記す、この図は、CBHＩを含む組成物、すなわち全セ ルラーゼ（GC 010）とCBH II欠失セルラーゼは最高の強度損失を有し、一方、CB HＩを全く含まない組成物は、全セルラーゼとCBH II欠失セルラーゼと比べて有 意に減少された強度損失を有していたことを示している。これらの結果から、セ ルラーゼ組成 物中のCBHＩ型成分の存在が、CBHＩ型成分を含まない類似組成物に比較してその 組成物に増加された強度損失を付与することが分かる。 同様に、これらの結果は、CBH IIが強度損失においていくらかの役割を演じて いることを示している。 従って、これらの結果の視点において、強度損失抵抗性セルラーゼ組成物は、 CBHＩ型セルラーゼ成分の全て、そして好ましくは、CBH 型セルラーゼ成分の全 てを含まないような組成物である。これに関して、このようなセルラーゼ組成物 は、図10中に示すpH５において観察されるような結果よりもpH≧７においてより 低い強度損失をもたらすであろうことが企図される。 綿含有布の製造の間、布は応力を加えられることができ、そしてそのように応 力が加えられたとき、それは破壊され、が、無秩序な繊維を含むであろう。この ような繊維は、その布に、すりきれて曇った外観（worn and dull appearance） を劇的に付与する。しかしながら、本発明に係る方法は、布／色 強化をもたら すであろうことが発見されている。これは、応力を加えられるようになる前の布 の外観を回復する効果をもつ破壊され無秩序な繊維のいくつかの除去により生じ ると信じられている。 以下の実施例17と18は、本発明のこの利点について説明する。これらの実施例 はすりきれた綿Ｔ−シャツ（編物）並びに新たな綿編物を使用したことに注意の こと。このすりきれた綿含有布の色あせた外観は、一定時間にわたる、ゆるみ、 そして壊れた表面繊維の布の蓄積から生じる。これらの繊維は、その布について の色あせ、そしてつやの消された（matted）外観を生じさせ、そしてそれ故、こ れらの繊維の除去は、その布に元のきれいな色を回復させるのに必要な先行条件 である。従って、新たな綿編物上の破壊された表面繊 維の蓄積はこのような布に曇った外観を付与する。従って、これらの実験は、必 然的に、応力の加わった綿含有布の色強化に利用可能である。なぜなら、両方が 布からの表面繊維の除去に関係するからである。実施例17 色強化 綿含有布において色を強化する、EG成分の能力を、以下の実験において分析し た。特に第一の実験は、さまざまなpHにわたり綿含有布から表面繊維を除去する ために野生型トリコデルマ・ロンジブラチアタムにより生産された完全セルラー ゼ系（Genencor Iuternational，South San Francisco，CAから商業的に入手可 能なCYTOLASE 123セルラーゼ）の能力を測定する。このセルラーゼを、洗濯計内 で表面繊維を除去するその能力についてテストした。最終組成物中25ppm又は100 ppmのいずれかのセルラーゼを提供するのに適当な量のセルラーゼを、0.5mlの非 イオン界面活性剤を含む20mMのクエン酸塩／リン酸塩バッファー400mlの別々の 溶液に添加した。pH５，pH６，pH７及びpH7.5においてサンプルを提供するよう にサンプルを調製し、そして滴定した。得られた溶液のそれぞれを次に別々の洗 濯計キャニスターに添加した。これらのキャニスター内に、繊維除去を容易にす るための多量の小石並びに７インチ×５インチの綿布（Test Fabrics,Inc.，200 Blackford Ave，Middlesex，NJ 08846からStyle No．439 Wとして入手可能な10 0％織綿）を添加した。次にこのキャニスターに蓋をし、そしてこのキャニスタ ーを43℃に維持された洗濯計内に降下させた。次に、このキャニスターを、約１ 時間少なくとも約40回転／分（rpms）の速度においてその浴内で回転させた。そ の後、布を取り出し、十分に濯ぎ、そして標準的なドライヤー内で乾燥させた。 そのように処理された布を次に、パネル・テストにおける評価により繊維除去 （fiber removal）について分析した。特に、これらの布（マークせず）を、６ 人の個体により繊維のレベルについて等級付けした。これらの布を、表面繊維に ついて肉眼観察により評価し、そして０〜６等級に等級付けした。等級は、意義 のある比較を可能にするために６つの標準をもつ。これらの標準は以下のような ものである。 等級付けされるべき布は、上記標準の中の１に最も密に適合する等級を提供さ れた。上記布の完全な分析の後、個体のすべてにより各布に指定された値を加算 し、そして平均値を得た。 これらの分析の結果を図11中に記す。特に、図11は、同一のpHにおいて、投与 量依存性応答が除去された繊維の量において見られたことを示す。すなわち、同 一のpHにおいては、より多くのセルラー ゼにより処理された布は、より少ないセルラーゼにより処理された布に比べてよ り高いレベルの繊維除去を提供した。その上、この図の結果は、より高いpHにお いて、繊維除去が、未だ、より高濃度のセルラーゼを単に使用することにより行 われることができるということを立証している。 第二の実験において、２つの異なるセルラーゼ組成物を、繊維を除去する能力 について比較した。特に、分析された第一セルラーゼ組成物は、野生型トリコデ ルマ・ロンジブラチアタムにより生産された完全セルラーゼ系（Genencor Iuter national，South San Francisco，CAから商業的に入手可能な、CYTOLASE 123セ ルラーゼ）であり、そしてGC 010と同定された。 分析された第二のセルラーゼ組成物は、CBHＩとCBH IIを発現することができ ないように先に記載されたものと同様なやり方で遺伝子修飾されたトリコデルマ ・ロンジブラチアタムから生産され、（CBHＩ型成分を含む）CBH型成分のすべて を実質的に含まないセルラーゼ組成物であり、そしてCBHＩ／II欠失として同定 される。CBHＩとCBH IIがそのセルラーゼ組成物の約70パーセントまでを占める 限り、この成分の欠失は、EG成分のすべての強化されたレベルをもたらす。この 組成物を、洗濯計内で表面繊維を除去するそれらの能力についてテストした。最 終組成物中必要濃度のEG成分を提供するのに適当な量のセルラーゼを、0.5mlの 非イオン界面活性剤を含む20mMのクエン酸塩／リン酸塩バッファー400mlの別々 の溶液に添加した。サンプルを調製し、そして滴定pH５にした。得られた溶液の それぞれを次に別々の洗濯計キャニスターに添加した。これらのキャニスター内 に、繊維除去を容易にするための多量の小石並びに７インチ×５インチの綿布（ Test Fabrics，Inc.，200 Blackford Ave，Middlesex，NJ 08846からStyle No． 439 Wとして入手可能な1 00％織綿）を添加した。次にこのキャニスターに蓋をし、そしてこのキャニスタ ーを43℃に維持された洗濯計内に降下させた。次に、このキャニスターを、約１ 時間少なくとも約40回転／分（rpms）の速度においてその浴内で回転させた。そ の後、布を取り出し、十分に濯ぎ、そして標準的なドライヤー内で乾燥させた。 そのように処理された布を次に、先に記載したパネル・テストにおける評価に より繊維除去（fiber removal）について分析した。この分析の結果を、推定EG 濃度上にプロットされる図12中に記載する。特に、図12は、GC 010とCBHＩ／II 欠失セルラーゼ組成物の両方が、実質的に等しいエンドグルカナーゼ濃度におい て、実質的に同一の繊維除去結果を与えたことを示している。この図の結果は、 繊維除去を提供するのがEG成分であることを示唆している。図11の結果と併せて これらの結果は、EG成分が表面繊維を除去することを立証する。実施例18 Tergotometer色強化 本実施例は実施例17に後続し、そしてCBH型成分が色強化に必要ではないこと を実証し、そして本実施例の目的が、綿含有布に対して色を強化する、CBH型成 分に欠陥のあるセルラーゼ組成物の能力を検査することである。 特に、本実施例において使用されるセルラーゼ組成物は、CBHＩとCBH IIを発 現することができないように先に記載したものと同様のやり方で遺伝子修飾され たトリコデルマ・ロンジブラチアタムからこの組成物が生産される限り、（CBH Ｉ型成分を含む）CBH型成分のすべてを実質的に含まない。CBHＩとCBH IIがこの セルラーゼ組成物の約70パーセントまでを占める限り、この成分の欠失は、EG成 分のすべての強化されたレベルをもたらす。 検定を、500ppmのセルラーゼを提供するのに十分な濃度のこのセルラーゼ組成 物を50mMクエン酸塩／リン酸塩バッファーに添加することにより行った。この溶 液はpH５に滴定され、そして0.1重量パーセントの非イオン界面活性剤（Gresco Mfg.，Thomasville，N．C．27360から商業的に入手可能な、Grescoterg GL 100 ）を含んでいた。10インチ×10インチの色あせた綿含有布並びに10インチ×10イ ンチの新たな編布であってゆるんで破壊された表面繊維をもつものを次に１ｌの 上記バッファー中に入れ、そして30分間110°Ｆにおいて静置し、そして次に30 分間100rpmsにおいて撹拌した。これらの布を次にそのバッファーから取り出し 、洗浄し、そして乾燥させた。次に得られた布を処理前の布と比較した。この分 析の結果は以下のようである： 用語“利益が見られる（benefit seen）”は、処理された布が、tergotometer を用いた結果として生じた破壊された表面繊維を含む破壊された表面繊維の除去 を含む非処理布と比べて色回復を示す（すなわち、より色あせしない）というこ とを意味する。これらの結果は、CBH型成分の存在が色あせた綿含有布の色回復 を行うために必要でないという実施例17の結果を実証する。 このような組成物がその布に対して有害な強度損失を伴わずに加工の間に生じ た破壊／ゆるみ繊維を除去するであろうので、このようなセルラーゼ組成物が布 加工の間に有益であるであろうことが企図される。実施例19 柔らかさ 本実施例は、CBH型成分の存在が綿含有布への改善された柔らかさの付与に不 可欠ではないということを立証する。特に、本実施例は、CBHＩとII成分を生産 することができないように先に記載したやり方で遣伝子操作されたトリコデルマ ・ロンジブラチアタムから誘導される、CBH型成分のすべてを含まないセルラー ゼ組成物を使用する。 このセルラーゼ組成物を、テリー・ウォッシュ・クロス（terry wash cloth） を柔らかくするその能力についてテストした。特に、（Test Fabrics，Inc.，20 0 Blackford Ave，Middlesex，NJ 08846からStyle No．420 NSとして入手可能な ）14インチ×15インチの非柔軟化8.5オンスの綿テリー・クロスを７インチ×7.5 インチの布きれに切断した。 上記のセルラーゼ組成物を、洗濯計内でこれらの布きれを柔らかくするその能 力についてテストした。特に、最終セルラーゼ溶液中、500ppm，250ppm，100ppm ，50ppm、及び10ppmのセルラーゼを提供するのに適当な量のセルラーゼを、0.02 5重量パーセントの非イオン界面活性剤（Triton×114）を含む20mMクエン酸塩／ リン酸塩バッファー400mlの別々の溶液に添加した。さらに、同一溶液を含むが セルラーゼが全く添加されていないブランクを走らせた。サンプルをpH５に滴定 した。得られた溶液のそれぞれを次に、別々の洗濯計キャニスターに添加した。 これらのキャニスター内に、柔らかさを容易にするための多量の小石並びに先に 記載した綿の布きれを添加した。すべての条件は、キャニスター当り２つの布き れ（swatches）をもって３連で走らせた。次に、各キャニスターに蓋をし、そし てそのキャニスターを、37℃において維持させた洗濯計内に降下させた。次に、 このキャニスターを約１時間、少なくとも40rpmsの速度でその浴内で回転させた 。その後、上記布きれを取り出し、十 分に濯ぎ、そして標準的なドライナー内で乾燥させた。 次に、布きれを嗜好テストにおける評価により柔らかさについて分析した。特 に、６人のパネリストに彼ら自身のセットの布を与え、そして柔らかさの基準、 例えば布全体の柔軟性に基づく柔らかさに閏してそれらを等級付けするように依 頼した。５つの異なる酵素濃度による処理から得られた布きれとブランクをスク リーンの裏ろに置き、そして上記パネリストに、最も柔らかくないものから最も 柔らかいものまでそれらを順序付けるように依頼した。等級を、他の布きれに対 してのその順番に基づき各布きれに指定した；５が最も柔らかく、そして０が最 も柔らかくない。各パネリストからの等級を加算し、そして平均した。 この平均の結果を図13中に記す。特に、これらの結果は、より高い濃度におい て、改善された柔らかさが得られるということを立証する。この改善された柔ら かさは、セルラーゼ組成物中CBHＩ又はIIのいずれの存在をも伴わずに達成され ることに注目のこと。実施例20 感触と外観 本実施例は、CBH型成分の存在が、綿含有布に改善された感触と外観を付与す るのに不可欠でないということを立証する。特に、本実施例は、CBH型成分のい ずれをも生産することができないように（すなわち、CBHＩとII成分を生産する ことができないように）先に記載したようなやり方で遺伝子操作されたトリコデ ルマ・ロンジブラチアタムから得られたセルラーゼ組成物を使用する。 このセルラーゼ組成物を、綿含有布の外観を改善するその能力についてテスト した。特に（Test Fabrics，Inc.，200 Blackford Ave.，Middlesex，NJ 08846 からStyle No．439Wとして入手可能）適当なサイズの100％綿シート材料を、本 実施例の外観面において 使用した。 先に記載したセルラーゼ組成物を、洗濯計内でこれらのサンプルの外観を改善 するその能力についてテストした。特に、最終セルラーゼ溶液中25ppm，50ppm、 及び100ppmのセルラーゼを提供するのに適当な量のCBHＩとII欠失セルラーゼを 、0.25重量パーセントの非イオン界面活性剤（Triton×114）を含む20mMクエン 酸塩／リン酸塩バッファー400mlの別々の溶液に添加した。さらに、同一溶液を 含むがセルラーゼが全く添加されていないブランクを走らせた。そのように調製 されたサンプルをpH５に滴定した。得られた溶液のそれぞれを次に、別々の洗濯 計キャニスターに添加した。これらのキャニスター内に、外観における改善を容 易にするための多量の小石並びに先に記載した綿サンプルを添加した。各キャニ スターに次に蓋をし、そしてこのキャニスターを、約40℃において維持された洗 濯計浴内に降下させた。次にこのキャニスターを約１時間少なくとも約40rpmsの 速度においてその浴内で回転させた。その後、サンプルを取り出し、十分に濯ぎ 、そして標準乾燥機内で乾燥させた。 次にサンプルを、嗜好テストにおける評価にり改善された外観について分析し た。特に６人のパネリストに（同定されていない）４つのサンプルを与え、そし て、外観に関してそれらを等級付けるように依頼した。これらのパネリストは、 用語“外観（appearance）”とは、眼に対する綿含有布の物理的外観をいい、そ して部分的に、その布の表面上の、けば、表面繊維、等の存在又は非存在により 、並びにその布の構造（ウェーブ）を見分けることができるか又はできないかに より、決定されるということを、指示された。 それが存在する場合であってもけば及び表面繊維をほとんどもたず、そしてそ の構造（ウェーブ）が明らかに見分けられることができる布は、けば及び／又は ゆるんだ繊維及び／又は見分けることが できないウェーブをもつ布に比べて改善された外観を有する。 その後パネリストは、他のサンプルに対するその順序に基づき各サンプルに、 指定された等級を指定した；４は最良の外観をもち、そして１は最悪の外観をも つ。各パネリストからの等級を加算し、そして次に平均した。このテストの結果 は以下のようなものである： CBHＩとII欠失セルラーゼ組成物を次に、綿含有布の感触を改善するその能力 についてテストした。特に、（Test Fabrics，Inc.，200 Blackford Ave.，Midd lesex，NJ 08846からStyle No．439Wから入手可能な）適当なサイズの100％綿シ ート材料を本実施例の感触面において使用した。 先に記載したセルラーゼ組成物を洗濯計内でこれらのサンプルの感触を改善す る能力についてテストした。特に、最終セルラーゼ溶液中500ppm，1000ppm、及 び2000ppmセルラーゼを提供するのに適当な量のセルラーゼを20mMクエン酸塩／ リン酸塩バッファーの24Ｌの別々の溶液に添加した。さらに、同一溶液を含むが セルラーゼを全く添加されていないブランクを走らせた。すべてのテストをpH5. 8において行い、そして工業的洗濯機内で走らせた。この洗濯機を50℃、全容量2 4Ｌ，50：１の液対布比（重量対重量）において操作し、そしてこの洗濯機を30 分間走らせた。その後、サンプルを取り出し、そして工業的ドライヤー内で乾燥 させた。 次に、サンプルを、嗜好テストにおける評価により改善された感 触について分析した。特に、５人のパネリストに４つの（同定されていない）サ ンプルを与え、そして感触に関してそれらを等級付けするように依頼した。パネ リストは、改善された感触をもつ布が他の布よりも接触に対してよりなめらか、 かつ、絹のようであること、そして感触が品質、例えば柔らかさ（その感触より もむしろ布の柔軟性をいう）、厚さ、色、又はその布のなめらかさに関係しない 他の物理的特徴から区別されるということを指示された。 次にパネリストは、他のサンプルに対するその順番に基づいて各サンプルに等 級を指定した；４は最良の感触であり、そして１は最悪の感触をもつ。各パネリ ストからの等級を加算し、そして次に平均した。このテストの結果は以下のよう なものである： 上記の結果は、感触と外観における改善が、全CBH型成分を含まないセルラー ゼ組成物により達成されることができるということを立証する。実施例21 ストーン・ウォッシュ外観 本実施例は、CBH型成分の存在が綿含有布にストーン・ウォッシュ外観を付与 するために不可欠でないということを立証する。特に、この実施例は、CBH型成 分のいずれをも生産することができないように（すなわち、CBHＩとII成分を生 産することができないように）先に記載したやり方で遺伝子操作されたトリコデ ルマ・ロンジブラチアタムから得られた組成物並びにトリコデルマ・ロンジブラ チアタムから誘導された完全セルラーゼ組成物がGenencor Iuternational，Sout h San Francisco，CAからCytolase 123セルラーゼとして入手可能なものを使用 する。 これらのセルラーゼ組成物を、染色された綿含有デニム・パンツにストーン・ ウォッシュ外観を付与するそれらの能力についてテストした。特に、サンプルを 、以下の条件下工業的洗濯機とドライヤーを使用して調製した： 10mM クエン酸塩／リン酸塩 バッファー pH５ 40Ｌ 全容量 110°F デニム・パンツ４つ １時間の操作時間 50ppmのCBHＩとII欠失セルラーゼ又は 100ppmの全セルラーゼ（すなわち、ＥＧ濃度にほぼ等しい） サンプルを、８人のパネリストによりそれらのストーン・ウォッシュ外観につ いて評価した。８人のパネリストの全てが、より良好なストーン・ウォッシュの 見た目をもつものとして非酵素処理のパンツよりも100ppmの全セルラーゼを選ん だ。８人のパネリストの中の４人が、より良好なストーン・ウォッシュの見た目 をもつものとして全セルラーゼよりもCBHＩとII欠失セルラーゼ処理パンツを選 び；一方、他のパネリストが、より良好なストーン・ウォッシュの見た目をもつ ものとして全セルラーゼ処理パンツを選んだ。これらの結果は、CBHＩとII欠失 セルラーゼ処理パンツが全セルラーゼ処理パンツから区別されることができず、 そしてCBHＩ及び／又はＣBH IIが綿含有布にストーン・ウォッシュ外観を付与す るのに不可欠でないということを示している。 実施例16〜21に関して、CBHＩ型成分を含まず、そしてトリコデ ルマ・ロンジブラチアタム以外の微生物から誘導されるセルラーゼ組成物が、こ れらの実施例中に記載したセルラーゼ組成物の代わりに使用されることができる であろう。特に、EG型成分を含むセルラーゼ組成物の源は、本発明にとって重量 ではなく、そして１以上のEG型成分を含み、そして実質的にCBHＩ型成分のすべ てを含まないいずれかの真菌セルラーゼ組成物を本発明において使用することが できる。例えば、本発明において使用される真菌セルラーゼ組成物の調製におけ る使用のための真菌セルラーゼは、トリコデルマ・コニンジ（Trichoderma koni ngii ）、ペンシラム・エスピー（Pencillum sp.）、等から得られることができ 、又は商業的に入手可能なセルラーゼ、すなわち（Novo Industry，Copenhagen ，Deumarから入手可能な）CELLUCAST，（Gist Brocades，N．V.，Delft，Hollan dから入手可能な）RAPIDASE、等を使用することができる。実施例22 綿非含有セルロース系布の強化特性 本実施例は、綿非含有セルロース系布の外観、柔らかさ及び表面光沢を強化す るEGセルラーゼ組成物の能力を立証する。200kgのJet Dyer機を、綿非含有セル ロース系布TENCEL^TMの強化特性を評価するために使用した。約10kgの100％ TEN CEL^TM中−重量織布をロープ形態において上記機械内に装填し、そして端から端 まで縫った。この方法は未漂白未染色の（greige）又は染色された布について行 うことができる。上記ジェット・マシンを150〜200リッターの水（これは、約15 〜20：１の液対布比を表す）で満たし、そして120〜140°Ｆ（50〜60℃）に加熱 した。pHを3.6ｇ／ｌ（56％）酢酸と1.9ｇ／ｌ（50％）水酸化ナトリウムにより 4.5〜5.0に調整した。水酸化ナトリウムを、上記マシンに入れる前にゆっくりと 希釈酢酸溶液に添加した。次に、0.25〜0.5ml／ｌの非イオン性水和剤 （Triton X-100）をこの液に添加した。このpHを温度を、そのpHが4.5と5.0の間 にあり、そしてその温度が50℃と60℃の間にあることを確保するためにチェック した。次に、３〜４ｇ／ｌの強化EGセルラーゼ組成物を添加した。この強化EGセ ルラーゼ組成物は、CBH型成分のすべてを含まないセルラーゼ組成物であって、C BHＩとII成分を生産することができず、そしてEGＩを過剰生産するように先に記 載したやり方で遺伝子操作されたトリコデルマ・ロンジブラチアタムから誘導さ れるものを含んで成る。 この強化EGセルラーゼ組成物を添加した後に、このジェットを30〜60分間走ら せた。そのサイクルの終りに、0.25ｇ／ｌのソーダ灰をその液に添加し、そして 10分間走らせた。液をそのジェットから滴下し、次にそのジェットを再び水で満 たし、そしてその布をさらに１回濯いだ。この布をそのジェットから取り出し、 そして乾燥させた。最後に、シリコーン・ベース仕上げ剤をその布上に使い尽く した。 布きれを、嗜好テストにおける評価により柔らかさと表面外観について分析し た。特に、４人のパネリストに彼ら自身の布セットを与え、そして柔らかさと表 面外観に関してそれらを等級付けするように依頼した。柔らかさは、柔らかさの 基準、例えば布全体の柔軟さに基づいた。表面外観は、その布上に存在するゆる んだ繊維又はけばの量に基づいた。布きれを非酵素処理布対照と比較し、そして 柔らかさの測定においては、追加の対象すなわち、完全真菌セルラーゼ組成物に より処理された布が含まれた。等級を各布きれに指定し、そして平均等級を４人 のパネリストから作表した。柔らかさと表面外観についての最高の等級に5.0の 値を指定した。最小の柔らかさと最も多いけばについての最小の等級に０の値を 指定した。この平均化の結果を図14と15に記す。特に、これらの結果は、柔らか さと表面外観がEGセルラーゼ処理後に両方改善されたことを立証する。さらにTE NCEL^TM布の表面外観は10回の家庭での洗濯後維持され、一方、対照布の表面外観 は実質的に低下した。 EG強化セルラーゼ組成物処理されたTENCEL^TM布のさらなる比較を、全セルラー ゼ処理されたTENCEL^TM布と比較した（図14）。本実施例においては、布きれを、 嗜好テストにおける評価により柔らかさについて分析した。４人のパネリストに 彼ら自身の布セットを与え、そして柔らかさに関してそれらを等級付けるように 依頼した。柔らかさは、上述の基準及びパネル等級に基づいた。布きれを全セル ラーゼ処理布対照と比較した。等級を各布きれに指定し、そして平均等級を４人 のパネリストから作表した。この平均の結果を図14中に記す。特に、これらの結 果は、EG強化セルラーゼ処理TENCEL^TM布が全セルラーゼ処理布対照よりも平均し てより柔らかかったことを立証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラレナス，エドムンド アメリカ合衆国，カルフォルニア 94080, サウス サンフランシスコ，キンボール ウェイ 180，ジェネンカー インターナ ショナル，インコーポレイティド (72)発明者 ウェイス，ジョフリー エル. アメリカ合衆国，カルフォルニア 94080, サウス サンフランシスコ，キンボール ウェイ 180，ジェネンカー インターナ ショナル，インコーポレイティド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エクソ−セロビオヒドロラーゼ型成分とエンドグルカナーゼ型成分を含ん で成る天然完全真菌セルラーゼ組成物を含んで成る組成物による布の処理により その布の製造の間に綿非含有セルロース系布に対して感触及び／又は外観を強化 し、そして／又は色強化及び／又はストーン・ウォッシュ外観を提供するための 改良方法であって、その改良が、その真菌セルラーゼ組成物中のタンパク質の全 重量に基づき少なくとも10重量パーセントのエンドグルカナーゼ型成分を含んで 成り、かつ、全CBHＩ型セルラーゼ成分を含まないようにその完全真菌セルラー ゼ組成物を修飾することを含んで成る方法。 ２．真菌セルラーゼ組成物がエクソ−セロビオヒドロラーゼII型成分を含まな い、請求項１に記載の方法。 ３．真菌セルラーゼ組成物が、そのセルラーゼ組成物中のタンパク質の全重量 に基づき少なくとも約20重量パーセントのエンドグルカナーゼ型成分を含んで成 る、請求項１に記載の方法。 ４．水性真菌セルラーゼ溶液による綿非含有布の改良処理方法であって、その 方法が、その布に対するそのセルラーゼ溶液のカスケード効果を作り出すような 条件下で撹拌を伴って行われ、その改良が全エンド−セロビオヒドロラーゼＩ型 成分を含まない真菌セルラーゼ組成物を含んで成るような方法。 ５．真菌セルラーゼ組成物がエクソ−セロビオヒドロラーゼII型成分をも含ま ない、請求項４に記載の方法。 ６．真菌セルラーゼ組成物がそのセルラーゼ組成物のタンパク質の全重量に基 づき少なくとも20重量パーセントのエンドグルカナーゼ型成分を含んで成る、請 求項４に記載の方法。 ７．改善された感触及び／又は外観をもつ綿非含有セルロース系布であって、 請求項１において定めた方法により製造されたもの。 ８．改善された感触及び／又は外観をもつ綿非含有布であって請求項４におい て定めた方法により製造されたもの。