JP3522272B2 - ポリエチレングリコールを用いた実質的に純粋なｅｇ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1. 産業上の利用分野 本発明は実質的に純粋なEG IIIセルラーゼ成分を含有
するポリエチレングリコール溶液を製造する方法に関す
るものである。特に本発明の方法の一部は、特定のポリ
エチレングリコールを水性混合物に添加してEG IIIが多
いポリエチレングリコール相とEG IIIが少ない水相とか
らなる２相系を調製してEG IIIが多いポリエチレングリ
コール相を分離することにより、EG III含有セルラーゼ
タンパク質の水性混合物からEG IIIセルラーゼ成分を分
離する方法に関するものである。本発明はまた一部は、
分画により、または上記２つの方法の組合せにより、実
質的に純粋なEG IIIセルラーゼ成分を調製する方法に関
するものである。本発明はまた一部は、キシラナーゼを
も含有するセルラーゼタンパク質の水性混合物からキシ
ナーゼ ポリエチレングリコール相を集積する方法に関
するものである。

2. 従来技術 セルラーゼは、セルロース（β−１、４−グリカン結
合）を加水分解し、それによって、グルコース、セロビ
オース、セロオリゴ糖等を生成させる酵素として従来技
術において知られている。セルラーゼは、菌類、細菌等
内で産生（発現）されるけれども、セルロースの結晶構
造を分解することのできる完全セルラーゼ系が発酵方法
により大量に容易に産生されるので、ある菌類、特に菌
類網トリコデルマ spp.（Trichoderma spp.）（特にト
リコデルマ リーセイ（Trichoderma reesei））により
産生されたセルラーゼは最も注目を集めている。

上記点に関して、Schulein、“Methods in Enzymolog
y"、160、25、234頁et seq.（1988）は、完全菌類セル
ラーゼ系が、エキソセロビオヒドロラーゼ（EC 3.2.1.
91）（「CBH」）、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）
（「EG」）、およびβ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.2
1）（「BG」）として同定される酵素を含むいくつかの
異なる酵素分類からなることを開示している。CBH、EG
およびBGの菌類セルラーゼ分類をさらに発展させて、各
々の分類内に多数の成分を含むようにできる。例えば、
多数のCBHおよびEGが様々な菌類源から単離されてい
る。

CBH成分、EG成分およびBG成分からなる完全セルラー
ゼ系は、結晶性セルロースをグルコースに能率的に転化
させるのに必要とされる。いやしくも、結晶性セルロー
スを加水分解する際には、単離された成分はほとんど効
果的ではない。さらに、特にセルラーゼ成分が異なる分
類のものである場合、セルラーゼ成分の間で相乗関係が
観察される。

一方で、単独または組合せのいずれかにより使用する
セルラーゼおよびその成分は、洗浄剤組成物に有用であ
ることが従来技術において知られている。例えば、菌類
セルラーゼのエンドグルカナーゼ成分は、柔軟剤として
使用するための、そして綿織物等の感触を改善するのに
使用するための、洗浄剤組成物の洗浄力を増強させる目
的に使用されている。しかしながら、洗浄剤組成物中に
トリコデルマ spp.そして特にトリコデルマ リーセイ
から由来したEG I成分およびEG II成分を使用するには
問題がある。特に、そのような成分は酸性pHで最大活性
を有しているが、ほとんどの洗濯洗浄剤組成物は中性ま
たはアルカリ性（pH＞７から約10まで）条件で使用する
ように配合されている。洗浄剤組成物中にトリゴデルマ
リーセイの１種類以上の酸性エンドグルカナーゼ成分
を使用すると、アルカリ性条件下で使用した場合でさえ
も、綿含有織物に対する感触、柔軟性および色の保持と
復元を改良できることが米国特許出願第07/668,640号に
開示されているが、トリコデルマ spp.のEG III成分
は、トリコデルマ リーセイのEG I成分およびEG II成
分と比較して、洗浄剤組成物において予期せぬ優れた利
点を有することが米国特許出願第07/707,647号に開示さ
れている。

特に、EG IIIセルラーゼ成分は、アルカリ条件下で著
しい酵素活性を有することがわかっており、中性または
アルカリ性の洗浄剤洗濯媒質を用いた洗濯条件に使用す
るのにも特に適している。

洗濯洗浄剤に使用することに加えて、ここに記載する
実質的に純粋なEG IIIセルラーゼ成分はさらに、1991年
５月30日に出願され、ここに引用する米国特許出願第07
/707,647号に記載されているように、色の保持と復元、
柔軟性および感触を望ましく改良する十分な活性がある
場合、中間のpHの適切な溶液中において予洗工程に使用
することができる。

また、ここに記載する実質的に純粋なEG IIIセルラー
ゼ成分は、スポットリムーバーに使用できるだけでな
く、また色褪せた織物に対して色を復元するのに適した
孤立組成物（例えば、ここに全てを引用する、米国特許
第4,738,682号を参照のこと）としての家庭用途に使用
することもできると考えられている。

さらに、中性からアルカリ性の条件下でEG IIIセルラ
ーゼ成分の大きい活性は、緑蔵飼料加工および／または
堆肥化加工と同様に、綿含有織物を処理する繊維加工
（ここに全てを引用する米国特許出願第07/677,385号お
よび同第07/678,865号を参照のこと）にも有益であると
考えられている。

上述した点は著しく異なって、本発明は、水性酵素混
合物から、特に完全菌類セルラーゼ組成物からEG IIIセ
ルラーゼ成分を分離して精製する、特に商業規模のEG I
IIセルラーゼ成分の製造のための能率的な方法に関する
ものである。

発明の概要 特に、本発明は、EG IIIセルラーゼ成分を含むセルラ
ーゼタンパク質を含有する水性混合物から、実質的に純
粋なEG IIIセルラーゼ成分を含有するポリエチレングリ
コール溶液を製造する方法に関するものである。したが
って、その方法の一面において、本発明は、EG IIIセル
ラーゼを含むセルラーゼタンパク質を含有する水性混合
物からEG IIIを選択的に回収する方法に関し、その方法
は、無機塩の存在下において効果的な量のポリエチレン
グリコール（PEG）の水性混合物を添加する工程を含ん
でいる。その混合物は、EG IIIが多いポリエチレングコ
ール相およびEG IIIが少ない水相からなる二相液体混合
物を形成している。この方法において、EG IIIが多い相
には他のセルラーゼタンパク質は実質的に含まれず、EG
IIIが多い相は後に分離される。

本発明の方法はまた一部には、無機塩の存在下におい
て効果的な量のポリエチレングリコールを水性混合物に
添加することにより、キシラナーゼも含有するセルラー
ゼタンパク質の水性混合物から実質的に純粋なキシラナ
ーゼを単離する方法に関するものである。水性混合物が
EG IIIも含有する場合には、回収したポリエチレングリ
コール相はEG IIIおよびキシラナーゼの両方を含有して
いる。

別の方法において、本発明は、EG IIIを含有する水性
セルラーゼタンパク質混合物からEG IIIセルラーゼを選
択的に回収する方法に関し、その方法は、その水性混合
物を陰イオン交換カラムにを通すことを含んでいる。陰
イオン交換カラムに結合しなかったタンパク質分画はEG
III成分を含有している。次いでこの分画を陽イオン交
換カラムに通す。この陽イオン交換カラムは、EG IIIセ
ルラーゼと結合し、後に塩溶液により樹脂から溶離せし
められる。

本発明の３番目の方法は、いずれかの順番で上記した
２つの方法の組合せである。

水性セルラーゼタンパク質混合物は、全細胞抽出物、
より好ましくは、野生型トリコデルマ spp.菌株、遺伝
的に修飾されたトリコデルマ spp.または本発明の方法
に適合しているEG IIIを含むセルラーゼタンパク質を含
有する他の水性混合物からの全セルラーゼ組成物であり
得る。

図面の簡単な説明 第１図は、CBH IおよびCBH IIを発現できないように
形質転換したトリコデルマ リーセイの菌株由来のEGの
多い菌類セルラーゼ組成物の40℃での所定のpH範囲にお
よぶRBB−CMC活性プロファイル、並びに40℃での所定の
pH範囲におよぶトリコデルマ リーセイ由来のEG IIIの
多いセルラーゼ組成物の活性プロファイルを示すグラフ
である。

第２図は、レーン１において、野生型トリコデルマ
リーセイにより発現されたタンパク質を示し、レーン２
において、EG IおよびEG II成分を発現できないように
形質転換したトリコデルマ リーセイの菌株により発現
されたタンパク質を示し、レーン３において、実施例１
の方法により得られたタンパク質と同一の実質的に純粋
なEG IIIセルラーゼ中に発見されるタンパク質を示す等
電点電気泳動ゲルを示すものである。この図の左の余白
に、CBH I、CBH II、EG I、EG II、EG IIIおよびキシラ
ナーゼに帰するバンドを同定できるように印が付けてあ
る。

第３図は、EG IIIの２つの断片から得られたアミノ酸
配列である。

第４図は、ｐΔCBH I pyr4の構築を示す概略図であ
る。

第５図は、トリコデルマ リーセイ染色体のうちの１
つの染色体上のcbh1座にｐΔCBH I pyr4からのより大き
なEcoR I断片を組み込むことよるトリコデルマ リーセ
イ遺伝子の欠失を説明する概略図である。

第６図は、プローブとして³²Pで標識したｐΔCBH I p
yr4を用いた、サザンブロット分析後のEcoR I切断ｐΔC
BH I pyr4により形質転換したトリコデルマ リーセイ
菌株GC69からのDNAのオートラジオグラフである。分子
量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対で示して
いる。

第７図は、プローブとして³²Pで標識したpIntCBH Iを
用いた、EcoR I切断ｐΔCBH I pyr4により形質転換した
トリコデルマ リーセイ菌株GC69からのDNAのオートラ
ジオグラフである。分子量マーカーの大きさを図面の左
側にキロ塩基対で示している。

第８図は、野生型のトリコデルマ リーセイにより分
泌されたタンパク質およびトリコデルマ リーセイの形
質転換菌株により分泌されたタンパク質を示す等電点電
気泳動ゲルである。具体的には第８図において、等電点
電気泳動ゲルのレーンＡは、部分的に精製したトリコデ
ルマ リーセイからのCBH Iが作用したものである。レ
ーンＢは、野生型のトリコデルマ リーセイが作用した
ものである。レーンＣは、cbh1遺伝子が欠失したトリコ
デルマ リーセイ菌株からのタンパク質が作用したもの
である。レーンＤは、cbh1およびcbh2遺伝子が欠失した
トリコデルマ リーセイ菌株からのタンパク質が作用し
たものである。第８図において、図面の右側には、１つ
以上の分泌タンパク質に発見された単一タンパク質の座
を示すように印付けてある。具体的には、BGはβ−グル
コシダーゼを意味し、E1はエンドグルカナーゼＩを意味
し、E2はエンドグルカナーゼIIを意味し、E3はエンドグ
ルカナーゼIIIを意味し、C1はエキソセロビオヒドロラ
ーゼＩを意味し、C2はエキソセロビオヒドロラーゼIIを
意味するものである。

第9A図は、ゲノムDNA上の4.1kb EcoR I断片としてク
ローニングしたトリコデルマ リーセイcbh2座を示す概
略図であり、第9B図は、cbh2遺伝子が欠失したベクター
pPΔCBH IIを示す概略図である。

第10図は、プローとして³²Pで標識したｐΔCBH I pyr
4を用いた、サザンブロット分析後のEcoR I切断ｐΔCBH
IIにより形質転換したトルコデルマ リーセイ菌株P37
PΔCBH I Pyr26からのDNAのオートラジオグラフであ
る。分子量マーカーの大きさを図面の左側にキロ塩基対
で示している。

第11図は、ｐΔEG I pyrG−３の構成を示す概略図で
ある。

第12図は、トリコデルマ リーセイ染色体の１つのeg
l1座にｐΔEG I pyrG−３からのHind III断片を組み込
むことによるegl1遺伝子の欠失を説明する概略図であ
る。

第13図は、pAΔEG II−１の構成を示す概略図であ
る。

発明の詳細な説明 上述したように、本発明は概して、ポリエチレングリ
コール溶液中において、または回収したタンパク質とし
て、実質的に純粋なEG IIIセルラーゼ成分を産生する方
法に関するものである。

しかしながら、本発明をさらに詳細に説明する前に、
以下の用語を最初に定義しておく。

1. 定義 本明細書に使用する場合、以下の用語は以下の意味を
有するものである。

「EG IIIセルラーゼ」とは、トリコデルマ spp.由来
のエンドグルカナーゼ成分、または約5.5から約6.0まで
の範囲pH最適値、約7.2から約8.0までの範囲の等電点
（pI）、および約23キロダルトンから約28キロダルトン
までの範囲の分子量により特徴付けられる、トリコデル
マ spp.により産生されるEG IIIと同等のタンパク質を
産生する微生物由来のエンドグルカナーゼ成分を意味す
る。好ましくは、EG IIIセルラーゼは、トリコデルマ
リーセイかまたはトリコデルマ ビリデ（Trichoderma
viride）由来のものである。トリコデルマ リーセイ由
来のEG IIIセルラーゼは、約5.5から約6.0までの範囲の
pH最適値、約7.4の等電点（pI）および約25キロダルト
ンから約28キロダルトンまでの範囲の分子量を有する。
トリコデルマ ビリデ由来のEG IIIセルラーゼは、約5.
5のpH最適値、約7.7の等電点（pI）および約23.5キロダ
ルトンの分子量を有する。さらに、EG IIIセルラーゼの
アミノ酸配列が変更されていてもよいと考えられる。こ
の酵素の活性部位を変更すると、pH最適値、最適温度ま
たは基質に対する親和性のような様々な特性を変化させ
てしまうかもしれない。

EG III成分は、pIが高いために、pIの高いキシラナー
ゼ、およびトリコデルマ spp.により発現されるpIの高
い他の成分が一般的に発見される等電点電気泳動ゲルの
領域に発見される。実際、第２図にEG IIIとして認識さ
れているバンドはEG IまたはEG IIのうちいずれかの分
解生成物であると、文献に仮定されている。しかしなが
ら、EG IおよびEG IIが欠失したセルラーゼ（米国特許
出願第07/770,049号および同第07/668,640号の方法によ
り調製された）の等電点電気泳動ゲルは、このバンドは
EG IまたはEG IIのうちのいずれの分解生成物にも起因
するものではないことを示した（第２図）。

EG IIは以前には、ある著者による専門語の「EG II
I」により示されていたが、現在の専門語では、「EG I
I」と称している。いずれにしても、EG IIタンパク質
は、以下に示す実施例２の表２に証拠付けられるよう
に、分子量、pI、およびpH最適値について、EG IIIタン
パク質とは実質的に異なる。

「実質的に純粋なEG IIIセルラーゼ」とは、セルラー
ゼタンパク質の総重量に対して、少なくとも50重量パー
セント、より好ましくは少なくとも70重量パーセント、
最も好ましくは少なくとも90重量パーセントのEG IIIセ
ルラーゼ成分を含有するセルラーゼタンパク質の組成物
（固体または液体）を意味する。

「他の全てのセルラーゼタンパク質を実質的に含まな
い」とは、EG III以外のセルラーゼタンパク質の少なく
とも50重量パーセント、より好ましくは60重量パーセン
ト、そして最も好ましくは少なくとも90重量パーセント
が、元のセルラーゼ酵素の水性混合物から除去されてい
る組成物を意味する。

「キシラナーゼが豊富」とは、少なくとも４倍、より
好ましくは10倍、本発明の方法によってキシラナーゼの
濃度が増大した水溶液または組成物、もしくはポリエチ
レングリコール相を意味する。

「セルラーゼタンパク質」とは、野生型菌類源、また
は野生型菌類源から得られるセルラーゼ遺伝子の全てま
たは一部を包含し発現させるように遺伝子的に修飾した
微生物由来の、エキソセロビオヒドロラーゼ（CBH）タ
ンパク質、エンドグルカナーゼ（EG）タンパク質および
β−グルコシダーゼ（BG）タンパク質のいずれかまたは
全てを含有するセルラーゼタンパク質を意味する。集団
的に、そのようなタンパク質（すなわち、CBH、EGおよ
びEGタンパク質）の全てを「セルラーゼタンパク質」と
称する。これに反して、セルラーゼタンパク質は、キシ
ラナーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ等を含む、トリコ
デルマ spp.により発現される他のタンパク質を含まな
い。

「エンドグルカナーゼ（EG）成分」とは、トリコデル
マ リーセイのEG I、EG IIおよび／またはEG III成分
を含む、トリコデルマ spp.のEG成分を意味する。単体
または組合せいずれかのトリコデルマ spp.のエンドグ
ルカナーゼ成分（例えば、トリコデルマ リーセイのEG
I、EG II、EG III）は、これらの成分を繊維処理媒質
に含有させて、綿含有織物をこの媒質中で処理する場合
には、その織物について、感触、外観、柔軟性、色、お
よび／またはストーンウォッシュの外観を改良する（処
理する前の織物と比較して）。上記した事項に加え、EG
IIIは、多くの洗浄剤組成物が使用されるアルカリ性の
pHで実質的な活性を有する。

「エキソセロビオヒドロラーゼ（CBH）成分」とは、
トリコデルマ リーセイのCBH IおよびCBH II成分を含
む、トリコデルマ spp.のCBH成分を意味する。トリコ
デルマ spp.のEG成分を含まない状態でトリコデルマ
spp.のCBH成分を使用する場合、このCBH成分単体では、
処理した綿含有織物の、色の保持／復元および感触が著
しくは改良されない。さらに、そのようなEG成分と組み
合わせてトリコデルマ リーセイのCBH I成分を用いる
場合には、綿含有織物の強度損失を高め、洗浄すること
の利点を高めることができる。

「β−グルコシダーゼ（BG）成分」とは、BG活性を示
すセルラーゼ成分を意味する。すなわち、そのような成
分は、セロビオースおよび他の溶性セロオリゴ糖（「セ
ロビオース」）の非還元末端から作用しはじめ、唯一の
生成物としてグルコースを生成させる。BG成分は、セロ
ビオース重合体上には吸着されず、または反応しない。
さらに、そのようなBG成分は、グルコースにより競合的
に阻害される（Kiはほぼ1mMである）。厳密に言えば、B
G成分はセルロースを分解できないので、本当はセルラ
ーゼではないが、これらの酵素は、CBH成分およびEG成
分の組合せ作用によって生成される阻害セルロース分解
生成物（特にセロビオース）をさらに分解することによ
りセルロースの全体的な分解を促進させるので、そのよ
うなBG成分はセルラーゼ系の定義に含まれる。BG成分が
存在しないと、結晶性セルロースの加水分解はわずかし
か、またはほとんど行なわれない。BG成分はしばしば、
ｐ−ニトロフェノール Ｂ−Ｄ−グルコシド（PNPG）の
ようなアリール基質に特徴付けられる。あるアリール−
グルコシダーゼはセロビオースを加水分解しないという
点で、全てのアリール−グルコシダーゼがBG成分である
わけではないことに注意すべきである。

2. 方法論 A. ポリエチレングルコールによるEG IIIの回収 本発明は一部は、特定のポリエチレングリコールを添
加することにより、EG IIIを含有するセルラーゼタンパ
ク質の水性混合物から、他のセルラーゼタンパク質を実
質的に含まないEG IIIセルラーゼが得られるという発見
に関するものである。驚くべきことに、これらの条件下
において、EG III以外の実質的に全てのセルラーゼタン
パク質が水相に残存するが、EG IIIは実質的に純粋な量
でポリエチレングリコール相中に回収される。これらの
条件下で、多量のキシラナーゼがポリエチレングリコー
ル相中に回収されることも発見された。

本発明を実施する好ましい方法の１つにおいて、セル
ラーゼを含有する水性混合物を濾過して、細胞ブイヨン
（cell debris）および他の固体を除去し、セルラーゼ
タンパク質を含むタンパク質の混合物を含有する濾液を
作成した。より好ましくは、シトラーゼ123（CYTOLASE1
23）（カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジ
ェネンカー インターナショナル社から市販されてい
る）のような細胞を含まないセルラーゼタンパク質混合
物を使用する。別の方法において、すでにEG IIIが多い
相溶性水性混合物を含む相溶性供給源、より具体的に
は、「アルコールを用いた実質的に純粋なEG IIIセルラ
ーゼを産生する方法」と題し、ここに全てを引用する代
理人番号010055−107の本出願と同時に出願された米国
特許出願に記載されたEG III溶液から水性混合物を得る
ことができる。

濾液を濾過段階にて得た後、その濾液をポリエチレン
グルコール（PEG）と接触させる前に、濾液に無機塩を
加えてもよい。ある場合には、無機塩を添加すると、水
相からポリエチレングリコール相中へのEG IIIセルラー
ゼ成分の分割を高めることができる。

次いで、有為な量のEG IIIをポリエチレングリコール
相に運搬するのに十分な期間に亘りポリエチレングリコ
ールと水性混合物を混合する。そのような特定の期間
は、添加するポリエチレングリコールの量、添加する塩
の量等により変化する。そのような要件は当業者により
容易に確かめられる。しかしながら、好ましい実施態様
においては、少なくとも約２時間、より好ましくは約４
時間、そして最も好ましくは約18時間に亘りポリエチレ
ングリコールを水性混合物と混合する。相が分離するの
に十分な期間、好ましくは少なくとも約４時間、より好
ましくは８時間、最も好ましくは約18時間に亘り、混合
後にポリエチレングリコール水性混合物を放置する。２
相混合液が形成される。EG IIIセルラーゼ成分はポリエ
チレングリコール相に存在している。次いでEG IIIが多
いポリエチレングリコール相を水性相から分離する。回
収したEG IIIが多い溶液は、これらのタンパク質のうち
約50重量パーセントから約90重量パーセントをこえるま
での量がEG IIIであるセルラーゼタンパク質の混合物を
含有している。

様々な方法によりポリエチレングリコール相からEG I
II成分を精製することができる。好ましい実施態様にお
いて、EG IIIセルラーゼ成分を冷たいエタノールにより
沈殿させ、所望の水溶液中に再懸濁させる。適切な緩衝
液は、pH5の50mMの酢酸ナトリウム、またはpH5の10mMの
クエン酸リン酸のような、EG IIIセルラーゼ成分を変性
しない従来技術で知られている緩衝液である。

本発明の本質的な特徴の１つは、ポリエチレングリコ
ール（PEG）を使用することである。PEGは固有に活性で
あり、他のセルラーゼタンパク質を含有する水性混合物
からEG IIIセルラーゼを回収するのに選択性を有するこ
とが分かった。この点に関して、「効果的な量のポリエ
チレングリコール」とは、有為な量のEG III成分を他の
セルラーゼタンパク質から分割するのに必要な、水性混
合物の添加される量を意味する。添加するポリエチレン
グリコールの量は、好ましくは0.5％（w/v）から10％
（w/v）までの範囲にあり、より好ましくは４％（w/v）
である。本発明の方法に使用するPEGの平均分子量は、
約5,000から約10,000までの範囲に亘り、好ましくは約
7,000から約9,000までの範囲に亘り、そして最も好まし
くは約8,000である。

上述した方法に関して、実質的に約5,000未満の分子
量を有するポリエチレングリコールを使用すると、他の
セルラーゼ酵素から分離が好ましくなくなってしまう。
一方約10,000より実質的に大きい分子量を有するポリエ
チレングリコールを使用すると、PEG相から捕獲するEG
IIIセリラーゼ成分の量が減少してしまう。好ましい実
施態様において、ポリエチレングリコールの分子量は約
8,000である。

セルラーゼタンパク質の水性混合物は、EG IIIの百分
率と比較して高い百分率の他のセルラーゼタンパク質を
含有しているので、そのような水性混合物からEG IIIセ
ルラーゼ成分を分離するのにポリエチレングリコールが
特に有用であることが分かった。シトラーゼ123セルラ
ーゼ系中のセルラーゼタンパク質の標準分布を以下に示
す： CBH I 45−55重量パーセント CBH II 13−15重量パーセント EG I 11−13重量パーセント EG II ８−10重量パーセント EG III １−４重量パーセント BG 0.5−１重量パーセント 本発明の方法により、有用な量のEG III成分が得られ
る。他の方法と比較した本発明のPEG抽出方法によるEG
III成分の回収の損失は、EG III成分の回収速度により
補償される。この方法には精製のための大規模な分画工
程は必要ないが、所望であれば、さらなる精製のために
そのような工程を続いて行なうこともできる。

「無機塩」とは、ポリエチレングリコールとともに使
用する場合に、タンパク質を変性させることなくEG III
の精製を促進させる硫酸イオンまたはリン酸イオンを有
する相溶性無機塩を意味する。そのような無機塩の例と
しては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アン
モニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が挙げ
られる。「効果的な量の無機塩」とは、ポリエチレング
リコールを含有する水性混合物に添加するときに、EG I
II成分をポリエチレングリコール相中に優先的に分離
し、水相中にEG III以外のセルラーゼタンパク質を保持
する量を意味する。

無機塩の濃度を変更させて、所望の結果を得ることが
できる。約４％（w/v）から約20％（w/v）の濃縮塩溶
液、より好ましくは約10％（w/v）から約14％（w/v）の
濃縮塩溶液の存在下で、EG IIIセルラーゼ成分がPEG相
中で最良に金属イオン封鎖されることが分かった。塩の
レベルが約20％（w/v）より実質的に多い場合には、沈
殿を生じてしまい、塩のレベルが約４％（w/v）より実
質的に少ない場合には、分離が望ましくなくなるか、ま
たは溶液が１つの相のままとなってしまう。

B. 分画によるEG IIIセルラーゼの回収 本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、
分画によりシトラーゼ123のような、セルラーゼタンパ
ク質を含有する濾過した水性混合物からEG IIIを回収す
る。適切な脱塩樹脂を用いて適切な段階で水性混合物を
脱塩し、陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂を用
いてEG IIIを分離することにより、そのような分画を行
なうことができる。具体的には、pH6.8の10mMのリン酸
ナトリウム緩衝液を用いてセファデックスＧ−25ゲル濾
過樹脂カラムにより水性混合物を最初に脱塩することに
よりEG IIIを回収した。次いで脱塩した溶液をQAトリス
アクリルＭ陰イオン交換樹脂カラムに充填する。このカ
ラム上に結合しなかった分画はEG IIIを含有している。
この分画を、pH4.5の10mMのクエン酸ナトリウムで平衡
状態にしたセファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂カラムを
用いて脱塩する。この溶液をSPトリスアクリルＭ陽イオ
ン交換樹脂カラムに充填する。200mMの塩化ナトリウム
の水溶液によりEG IIIセルラーゼ成分を溶離させる。

本発明の方法を実施する別の好ましい方法において、
陽イオン交換カラムから得たEG III試料をさらに分画す
ることができる。事前にpH4の10mMのクエン酸ナトリウ
ムにより平衡状態にしたセファデックスＧ−25カラムに
よりEG III試料を脱塩する。モノ−Ｓ−HR5/5カラム
（ニュージャージー州、ピスキャタウェイのファーマシ
アLKBバイオテクノロジーから得られる）を用いて、そ
の溶液をFPLCシステムに供した。次いで、0.5ml/分の速
度で塩化ナトリウム水溶液の０−200mMの勾配によりそ
のカラムを溶離させる。EG IIIセルラーゼ成分を回収し
た。ゲル電気泳動によってこのEG IIIセルラーゼ成分の
純度は90％よりも大きいことが分かった。EG IIIのこの
純度は、既知の技術によりＮ末端アミノ酸配列を求める
のに適している。

セファロース樹脂はよく知られた種類の樹脂である。
ここに使用している「セファロース」とは、塩を保持す
るがEG IIIを排除するのに十分な排除サイズ（exclusio
n size）を有する任意のセファロース樹脂を意味する。
ここに使用している「陰イオン交換樹脂」とは、EG III
のpHより低いpHにおいて、EG III以外のセルラーゼタン
パク質の少なくともいくらかと結合するのに十分な電荷
密度を供する陽イオン官能基を有する任意の樹脂を意味
する。適切な陰イオン樹脂は、アミノエチル（AE）官能
基、ジエチルアミノエチル（DEAE）官能基および第４ア
ミノエチル（QAE）官能基を有する。ここに使用してい
る「陽イオン交換樹脂」とは、EG IIIのpIより低いpHで
EG IIIと結合するのに十分な電荷密度を供する陰イオ
ン官能基を有する任意の樹脂を意味する。適切な陽イオ
ン樹脂は、スルホプロピル（SP）官能基、ホスホ（Ｐ）
官能基およびカルボキシメチル（CM）官能基を有する。

上述したEG IIIセルラーゼ成分をさらに精製すること
が望ましい場合もある。例えば、最初のPEG抽出方法か
ら得た物質を２番目の分画方法に用いることにより、ま
たその逆に２番目の分画方法から得た物質を最初のPEG
抽出方法に用いることにより、上述した方法において単
離したEG IIIセルラーゼ成分をさらに精製することもで
きる。

代理人番号010055−107として本出願とともに出願
し、ここに全てを引用する、「アルコールを用いた、実
質的に純粋なEG IIIセルラーゼを産生する方法」と題す
る米国特許出願に記載されている方法により、ここに回
収したEG IIIをさらに精製することもできる。

上述した記載は本発明の方法を実施する好ましい方法
に関するものであり、本発明の教示により上述した方法
を様々に変更できることが分かるであろう。様々な方法
の条件を変更することができ、使用する試薬を変更し
て、EG III成分を含有する任意の適した酵素の水性混合
物からEG IIIセルラーゼ成分を回収する様々な所望のま
たは最適な操作条件を供することができる。

当業者には理解されるように、本発明の方法の記載に
おいて上述した酸、塩基および塩を変更できるか、また
は本発明の操作を妨害せずに所望のpHまたは所望の塩含
有量を供するが、EG IIIセルラーゼ成分を変性しない等
価の酸、塩基または塩と置換できる。

さらに、本発明の分画方法の前に本発明の抽出方法を
行なうこともできるが、その逆でもよい。本発明の分画
方法によってさらに精製して実質的に純粋なEG IIIセル
ラーゼを含有する水溶液を供することができる、EG III
が多いポリエチレングリコールの最初の相を提供するよ
うに、水性混合物をポリエチレングリコールにより抽出
することができる。

適切な発酵条件下でEG IIIを産生するトリゴテルマ
spp.の菌株を含む任意の供給源からEG IIIセルラーゼを
精製できる。EG IIIの特定の供給源は重要ではないが、
好ましい供給源は、トリコデルマ リーセイおよびトリ
コデルマ ビリデである。トリコデルマ リーセイから
のEG IIIの特に好ましい供給源は、ジェネンカー イン
ターナショナル社（94080、カリフォルニア州、サウス
サンフランシスコ、180キンボールウェイ）から市販さ
れてるシトラーゼ123である。トリコデルマ spp.由来
の完全セルラーゼ系（「全セルラーゼ」）から実質的に
純粋なEG IIIセルラーゼを得る適切な方法としては、以
下に述べる実施例に記載された方法が挙げられる。これ
らの実施例は、全セルラーゼにPEG抽出および／または
異なる分画物質（カラム）を用いた繰返しの分画工程を
行なうことにより、実質的に純粋なEG IIIセルラーゼが
容易に得られることを示している。

EG IIIの単離効率を高めるために、EG IIIを過剰発現
（overexpress）するように、および／またはEG I成
分、EG II成分、CBH I成分および／またはCBH II成分の
うちの１つ以上を産生できないように、遺伝子的に修飾
した微生物（例えば、トリコデルマ リーセイ）を用い
ることが望ましいと思われる。このようにすることによ
り必ず、例えば、上述したような分画および／またはPE
G抽出によってEG IIIをより能率的に単離することがで
きる。トリコデルマ リーセイのこれらの菌株のうちの
いくつかの産生が、1991年３月13日に出願された米国特
許出願第07/668,640号および下記の実施例に開示されて
いる。

さらに、実質的に純粋なEG IIIセルラーゼを産生する
ように微生物を遺伝子的に修飾することにより、実質的
に純粋なEG IIIセルラーゼを調製できると考えられる。
例えば、下記の実施例に述べる分画方法により調製した
実質的に純粋なEG IIIを使用して、既知の塩基配列決定
法を用いてタンパク質の一部のアミノ酸配列を決定した
（実施例４）。EG IIIセルラーゼ成分をコード化する遺
伝子をクローニングするために、この情報を用いて合成
DNAプローブを調製することができる。一度EG III遺伝
子をクローニングしたら、既知の技術によりEG III遺伝
子を操作し、最終的には様々なトリコデルマ spp.菌株
中かまたは他の微生物中に挿入できる。例えば、1990年
10月５日に出願された米国特許出願第07/593,919号の一
部継続出願である、1991年10月４日に出願された米国特
許出願第07/770,049号、および1991年３月13日に出願さ
れた米国特許出願第07/668,640号を参照のこと。それら
の特許出願には、修飾した微生物が１つ以上のセルラー
ゼ遺伝子を発現できず、実際に別のセルラーゼ遺伝子を
過剰産生し得るように、トリコデルマ リーセイを遺伝
子操作する方法が開示されている。1991年10月４日に出
願された米国特許出願第07/770,049号、1990年10月５日
に出願された米国特許出願第07/593,919号、および1991
年３月13日に出願された米国特許出願第07/668,640号の
開示の全てを引用する。

これらの特許出願に記載された方法を用いて、他のセ
ルラーゼタンパク質とともに、またはそれを除いてEG I
IIを産生するようにトリコデルマ リーセイを遺伝子操
作することができる。さらに、これらの出願に記載され
た方法では、どのような異種タンパク質をも産生しない
トリコデルマ リーセイ菌株を調製している。

さらに、他の微生物中にEG IIIコード化遺伝子を発現
することが可能である。そのような微生物の例として
は、以下に限定されるものではないが、サッカロミセス
セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア
パストリス（Pichia pastoris）、ハンセニューラ
ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミ
セス ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア
リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、シャンニオミ
セス オクシデンタリス（Schanniomyces occidentali
s）等のような酵母種が挙げられる。例えば、PCT特許出
願第wo 85/04672号を参照のこと。非トリコデルマ宿主
であるこれらの代替物において発現を行なうためには、
EG IIIコード化DNA配列をその特定の宿主からの遺伝子
より得られたプロモーター配列およびターミネーター配
列に機能的に結合させる必要があることもある。また、
EG III分泌信号配列をコード化するDNA配列の代わり
に、代替宿主からの分泌信号配列をコード化するDNA配
列を用いる必要があると思われる。他の生物内でEG III
を産生および分泌することにより、実質的に純粋な形態
でEG IIIを得ることができる。

上述した実質的に純粋なEG IIIセルラーゼをさらに、
液体希釈物、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等に
加工することもできる。そのような形態は当業者によく
知られている。固体の洗浄剤組成物が望ましい場合、セ
ルラーゼ組成物を好ましくは顆粒として調合する。好ま
しくは、セルラーゼ保護剤を含有するように顆粒を調合
することができる。例えば、代理人番号第010055−073
号として1991年１月17日に出願された、「酵素および酵
素保護剤の両方を含有する顆粒並びにそのような顆粒を
含有する洗浄剤組成物」と題する米国特許出願第07/64
2,669号を参照のこと。この出願の全てを引用する。同
様に、顆粒の洗浄媒質中への溶解速度を遅くする物質を
含有するようにその顆粒を調合することもできる。その
ような物質と顆粒が、代理人番号第GCS−171−US1番と
して1991年１月17日に出願された、「顆粒組成物」と題
する米国特許出願第07/642,596号に開示されており、そ
の出願の全てをここに引用する。次いでEG IIIを含有す
る顆粒または他の洗浄剤配合物を織物の洗浄に用いて、
柔軟特性を織物等に与えることができる。

以下の実施例は本発明を説明することを意図したもの
であり、本発明の範囲を制限するものとして考えるべき
ではない。

実施例 実施例１ EG IIIセルラーゼ酵素の大規模な抽出 A. 細胞を含まないセルラーゼの濾液100リットルを約3
0℃に加熱した。加熱した物質を、約４％（w/v）カーボ
ワックス（登録商標）PEG8000（ポリエチレングリコー
ル、約8000の平均分子量）（コネチカット州、ダンバリ
ー、ユニオンカーバイド）および約10％（w/v）無水硫
酸ナトリウムとして調製した。混合物を２相の液体混合
物を形成した。SA−１ディスク スタック遠心分離機を
用いて相を分離した。銀染色（silver staining）等電
点電気泳動ゲルを用いて相を分析した。EG IIIおよびキ
シラナーゼについて分画と集積を行なった。回収した組
成物は約20重量パーセントから約50重量パーセントまで
の範囲のEG IIIを含有していた。ポリエチレングリコー
ル相中に回収されたキシラナーゼの量は、少なくとも４
倍キシラナーゼが豊富であった。

B. 細胞を含まないセルラーゼ濾液100リットルを、円
錐形の底および底の中心に排出口を有する130リットル
の容器に加えた。出発物質は、EG III以外のセルラーゼ
が欠失したおよび／またはEG IIIが過剰発現された菌株
からのセルラーゼまたは全セルラーゼであってもよい。
限外濾過は必要条件ではないけれども、タンパク質の濃
度を約10g/lから約50g/lまでの範囲に保持すべきであ
る。

次に、平均分子量8000のポリエチレングリコール4kg
と硫酸アンモニウム10kgをセルラーゼ濾液に加えた。混
合物を18時間に亘りオーバーヘッドミキサー中で混合し
た。混合後、18時間におよび相を分離させた。相を分離
したままにするように底の排出口から底の相を除去し
た。PEG相を採集し、30分間に亘り5,000xgで遠心分離し
て不溶性物質を除去した。EG III活性はポリエチレング
リコール溶液中において安定である。

ポリエチレングリコールからのタンパク質の除去は、
ポリエチレングリコールはエタノールに溶性であり、タ
ンパク質は溶性ではないという事実を利用するものであ
る。この段階において、ある塩も除去し、タンパク質を
濃縮させている。PEG相のアリコート200mlおよび冷たい
（−20℃）エタノール800mlを１リットルの遠心分離ボ
トル中でよく混合し、−20℃で約18時間に亘り放置し
た。混合物を30分間に亘り5,000xgで遠心分離し、溶液
にデカンテーションを行ない、沈殿物を脱イオン水で濯
いだ。

沈殿したタンパク質を溶解させる緩衝液の選択は、そ
れに続くクロマトグラフィー工程か、または最終工程の
場合にはEG IIIが多い溶液を調製する工程に依存する。
一般的に、緩衝液は、陽イオン交換クロマトグラフィー
の調製において、pH5の50mM酢酸塩、またはpH4の10mMク
エン酸リン酸のいずれかである。

PEG抽出物の回収は、RBB−CMC活性に基づいて測定で
き、合計容量を以下に示す。RBB−CMC活性を測定する方
法を実施例３に記載する。

表 １ 試 料 希釈 OD590 OD/ml 容量ml 合計OD％ 回収 ブイヨン 40 .299 12.0 4000 47840 100 PEG 100 .193 19.3 510 9843 21 抽残液 40 .234 9.36 3490 32666 68 活性の回収はPEG相中への15パーセントから30パーセン
トまでの範囲におよぶ。この工程は、出発物質がEG Iお
よびIIの欠失したセルラーゼである場合、合計のエンド
グルカナーゼ活性の百分率としての最高損失を示してい
る。各々のクロマトグラフィーの工程による損失は、各
々の工程について比較により約20％以下、小さくなる傾
向にある。

クロマトグラフィー 10mM、pH5のクエン酸／リン酸緩衝液に対してオメガ
シリーズ接線流動8,000限外濾過膜（omega series tang
ential flow 8,000 ultra filtration membrane）（マ
サチューセッツ州、ノースボロー、フィルトン テクノ
ロジー社）を用いて、実施例Ｉから得たEG IIIが多い溶
液であるパート（ｂ）を完全に濾過した（diafiltere
d）。溶液を、平衡状態にある（pH5、10mM クエン酸／
リン酸）SPトリスアクリルカラムに装填し、通過した溶
液（flow−through）を集積し、0.5Mのクエン酸によりp
Hを４に調節した。通過した溶液を平衡状態にある（pH
4、10mM クエン酸／リン酸）SPトリスアクリルカナム
に装填した。EG III成分を250mMの塩化ナトリウムによ
り溶離させた。

実施例２ 分画によるEG IIIの精製 野生型トリコデルマ リーセイにより産生される完全
菌類セルラーゼ組成物（シトラーゼ123、カリフォルニ
ア州、サウスサンフランシスコ、ジェネンカー インタ
ーナショナル社から得られる）を分画することにより、
EG IIIの精製を行なう。具体的には、以下の樹脂：シグ
マケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）から得られ
るセファデックスＧ−25濾過樹脂、IBFバイオテクニク
ス社（メリーランド州、サベージ）から得られるQAトリ
スアクリル陰イオン交換樹脂およびSPトリスアクリル陽
イオン交換樹脂を含有するカラムを用いて分画を行な
う。10mM リン酸ナトリウム緩衝液によりpH6.8に緩衝
された３リットルのセファデックスＧ−25ゲル濾過樹脂
のカラムを用いて0.5gのシトラーゼ123セルラーゼを脱
塩させる。次いで脱塩した溶液を、10mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液によりpH6.8に緩衝された20mlのQAトリスア
クリルＭ陰イオン交換樹脂のカラムに装填する。このカ
ラムに結合した分画はCBH IおよびEG Iを含有してい
た。このカラムに結合しなかった分画はCBH II、EG II
およびEG IIIを含有している。10mM クエン酸ナトリウ
ムによりpH4.5に緩衝したセファデックスＧ−25ゲル濾
過樹脂のカラムを用いて、これらの分画を脱塩する。こ
の溶液200mlを、20mlのSPトリスアクリルＭ陽イオン交
換樹脂のカラムに装填する。200mM 塩化ナトリウムの
水溶液100mlによりEG IIIを溶離させた。

EG IIIをさらに精製する方法の１つは、この実施例２
により得られたEG III試料をさらに分画することにより
行なわれる。Mono−Ｓ−HR 5/5カラム（ニュージャー
ジー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア LKBバイオ
テクノロジー社から得られる）を用いてFPLCシステムに
より分画を行なった。FPLCシステムは、液体クロマトグ
ラフィーコントローラ、２つのポンプ、二重通路モニタ
ー、分画コントローラおよびチャートレコーダ（全てニ
ュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシア
LKBバイオテクノロジー社から得られる）からなる。事
前に10mM クエン酸ナトリウムによりpH4に緩衝してお
いた20mlのセファデックスＧ−25カラムを用いてこの実
施例２で調製した5mlのEG III試料を脱塩することによ
り分画を行なった。事前に10mM クエン酸ナトリウムで
pH4.0に緩衝しておいたMono−Ｓ−HR 5/5カラムにその
溶液を装填し、0.5ml/分の速度で０−200mMのNaClの水
溶液勾配により溶離させ、1mlの分画に試料を集積し
た。分画10および11においてEG IIIを回収した。ゲル電
気泳動によりこのEG IIIは90％より大きく純粋であるこ
とが測定された。この純度のEG IIIは既知の技術による
Ｎ末端アミノ酸配列を決定するのに適している。

実質的に純粋なEG IIIは、トリコデルマ リーセイか
ら単離した他のエンドグルカナーゼと匹敵する以下の特
性を有している。

表 ２ 分 子 量 pI pH最適値^１ EG I 〜47−49 kD 4.7 〜５ EG II 〜35 kD 5.5 〜５ EG III 〜25−28 kD 7.4 〜5.5−6.0 1.下記の実施例３によるRBB−CMC活性により求められた
pH最適値 上記表から分かるように、トリコデルマ リーセイの
他のエンドグルカナーゼ成分と比較して、EG IIIは大き
いpH最適値および大きいpIの両方を有する。下記の実施
例３において、EG IIIはアルカリpHの条件下で相当なRB
B−CMC活性を保持することが分かる。

同様に、他の菌株を含む他の供給源から得たEG IIIセ
ルラーゼも上記方法により精製することができる。トリ
コデルマ ビリデ由来のEG IIIセルラーゼが、Voragen
等のMethods in Enzymology、160:243−249に記載され
ている。この参考文献は、約23.5キロダルトンの分子
量、5.5のpH最適値、および7.7のpIを有するEG IIIセル
ラーゼを記載している。

EG IIIの単離効率を高めるために、EG IIIを過剰発現
するようにおよび／または１つ以上のEG I成分、EG II
成分、CBH I成分および／またはCBH II成分を産生でき
ないように、遺伝子的に修飾したトリコデルマ リーセ
イを用いることが望ましいと思われる。

同様に、上述したEG III組成物をさらに精製すること
が望ましいと思われる。例えば、実施例１において単離
したEG IIIタンパク質を、上述した方法によりさらに精
製することもでき、またはその逆を行なうこともでき
る。

実施例３ あるpH範囲に亘るセルラーゼ組成物の活性 以下の方法を用いて、２つの異なるセルラーゼ組成物
のpHプロファイルを求めた。最初のセルラーゼ組成物
は、CBH I成分およびCBH II成分を産生できないよう
に、以下に記載する方法と同様な方法で遺伝子的に修飾
したトリコデルマ リーセイから調製したCBH IおよびI
Iの欠失したセルラーゼ組成物であった。約58パーセン
トから約70パーセントまでの範囲のトリコデルマ リー
セイ由来のセルラーゼ組成物から一般的になるこのセル
ラーゼ組成物は、CBH IおよびCBH IIを含有しないかぎ
り、このセルラーゼ組成物は必然的にEG成分を多く含ん
でいる。EG IIIはトリコデルマ リーセイのエンドグル
カナーゼ成分の最も少ない成分であるので、この組成物
においてはEG I成分およびEG II成分が優位を占めてい
る。

第２のセルラーゼ組成物は、実施例２と同様な精製方
法によりトリコデルマ リーセイ由来のセルラーゼ組成
物から単離したEG IIIの約20−40％の純粋な分画であっ
た。

これらのセルラーゼ組成物の活性を40℃で測定した。
この測定は以下の方法を用いて行なったものである。

必須の量の酵素を提供するのに十分な濃度の、５μｌ
から20μｌまでの範囲の適切な酵素溶液を最終溶液に加
える。pH4、５、5.5、６、6.5、７、7.5および８で0.05
M クエン酸／リン酸緩衝液中に、２重量パーセントの2
50μｌのRBB−CMC（レマゾル ブリリアント ブルー
Ｒ−カルボキシメチルセルロース；オーストラリア国、
2151、N.S.W.、ノースロック、６アルトナプレース、メ
ガザイムから市販されている）を加える。

ボルテックス混合（vortex）し、30分間に亘り40℃で
定温放置する。氷浴中で５分間から10分間までの期間に
亘り冷却する。0.3Mの酢酸ナトリウムおよび0.02Mの酢
酸亜鉛を含有する1000μｌのメチルセロソルブを加え
る。ボルテックス混合し、５分間から10分間までの期間
に亘り放置する。遠心分離し、キュベット中に上澄を注
ぎ入れる。

各々のキュベット中において溶液の光学密度（OD）を
590nmで測定することにより、相対酵素活性を求めた。
光学濃度が高いほど、酵素活性が高い。

この分析の結果を第１図に示す。この図面は、EG III
セルラーゼ組成物と比較したCBH IおよびIIが欠失した
セルラーゼ組成物の相対活性を示すものである。この図
面より、CBH IおよびCBH IIの欠失したセルラーゼ組成
物は、pH5.5付近でRBB−CMCに対して最適セルロース分
解活性を有し、アルカリ性のpH、すなわち、７を越えて
８までのpHにおいてある程度活性を有することが分か
る。一方で、EG IIIの多いセルラーゼ組成物はほぼpH5.
5−６において最適セルロース分解活性を有し、アルカ
リ性のpHでも相当な活性を有している。

実施例４ 等電点電気泳動ゲル この実施例の目的は、異なるEG IIIセルラーゼ組成物
の等電点電気泳動ゲルを説明することにある。具体的に
は、野生型トリコデルマ リーセイにより産生されたセ
ルラーゼ;EG IおよびEG IIのセルラーゼタンパク質を発
現できないように実施例16および17の方法により形質転
換したトリコデルマ リーセイ菌株由来のセルラーゼ；
および実施例１の方法と同様な方法により産生した実質
的に純粋なEG IIIセルラーゼを等電点電気泳動ゲルを用
いて分析した。

製造者の説明にしたがって、ファーマシアIEFシステ
ム（ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマ
シア社、FBE−3000）およびpH3−10プレキャストゲル
（ドイツ、カールベルグ、サーバから得られるサーバリ
ト プレコテ）を用いて、これらのセルラーゼ試料を等
電点電気泳動により分析した。ゲルをエフォルテック
（登録商標）染料（11590ニューヨーク州、ウエストバ
リー、サーバ ファイン バイオケミカルス社から得ら
れるサーバブルーＷ）により染色し、タンパク質のバン
ドを視覚化した。得られたゲルを第２図に示す。第２図
のレーン１は、野生型トリコデルマ リーセイ菌株由来
のセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示している。レー
ン２は、EG IおよびIIを発現できないように遺伝子的に
修飾したトリコデルマ リーセイ菌株由来のセルラーゼ
の等電点電気泳動ゲルを示している。レーン３は、実質
的に純粋なEG IIIセルラーゼの等電点電気泳動ゲルを示
している。この図面において、レーン１に隣接する縁
に、タンパク質を同定するようにセルラーゼタンパク質
に対応するバンドを記載している。

この図面から、EG IIIのpIが大きいので、このタンパ
ク質は、pIの大きいキシラナーゼ、pIの大きいβ−グル
コシダーゼのような他のpIの大きい成分と通常関連する
領域に見られるのが分かる。さらに、この図面のレーン
２には、EG IおよびIIのタンパク質は存在しないがEG I
IIタンパク質は存在するので、EG IIIはEG IまたはEG I
Iのタンパク質のいずれの分解生成物ではないことがこ
の図面から分かる。

実施例５ EG IIIのペプチド配列決定 0.9mlのアセトンを0.1mlのタンパク質溶液（1mg/mlの
濃度で）に加えることによりEG III成分を沈殿させ、−
20℃で10分間に亘り定温放置した。遠心分離によりタン
パク質を集積し、集積物を乾燥させてペレット化し、88
％のぎ酸中に溶解させた8M 尿素溶液0.01mlおよび88％
のぎ酸中に溶解させた臭化シアン（200mg/ml）溶液0.01
ml中に再懸濁させた。混合物を４時間に亘り室温で定温
放置した。

個々のペプチドをHPLC（高圧液体クロマトグラフィ
ー）カラムを用いて精製した。シンクロパックRP−４カ
ラムを、脱イオンしたミリＱ水（milliQ）中で0.05％の
TEA（トリエチルアミノ）および0.05％のTFA（トリフル
オロ酢酸）により平衡状態させた。試料をHPLCカラムに
装填し、100％のアセトニトリルおよび0.05％のTEA並び
に0.05％のTFAにより、１分当たり１％の勾配で溶離を
行なった。単離したペプチドのアミノ末端領域を、全自
動装置を用いたエドマンの方法により配列分析した。EG
III成分の２つの断片から得られたアミノ酸配列を第３
図に示す。

実施例６ トリコデルマ リーセイのpyr4^-誘導体の選択 pyr4遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素である
オロチジン−５′−モノホスフェートデカルボキシラー
ゼをコード化する。毒性阻害因子５−フルオロオロチン
酸（FOA）を野生型細胞によりウリジン中に取り込み、
細胞を被毒させる。しかしながら、pyr4遺伝子が欠けた
細胞は、この阻害因子に対して抵抗性を有するが、成長
のめたにウリジンを必要としている。したがって、FOA
を用いてpyr4誘導体菌株を選択することが可能である。
実際、トリコデルマ リーセイ菌株RL−37の芽胞（Shei
r−Neiss,G.およびMontenecourt,B.S.、Appl.Microbio
l.Biotechnol.20、46−53頁（1984））を、2mg/mlのウ
リジンおよび1.2mg/mlのFOAを含有する凝固培地の表面
に広げた。任意のFOA抵抗性コロニーが３日から４日以
内に現れ、成長のためにウリジンを必要としたそれらの
FOA抵抗性誘導体を続いて同定することが可能であっ
た。欠損pyr4遺伝子を有するそれらの誘導体を同定する
ために、プロトプラストを産生し、野生型pyr4遺伝子を
含有するプラスミドにより形質転換した（実施例８およ
び９を参照のこと）。形質転換後、ウリジンを欠いた培
地上にプロトプラストを平板固定（plate）した。形質
転換したコロニーの成長は、プラスミドボーン（plasmi
d−borne）pyr4遺伝子により欠損pry4遺伝子の相補性を
示した。このようにして、菌株GC69を菌株RL−P37のpyr
4^-誘導体として同定した。

実施例７ CBH I欠失ベクターの調製 CBH Iタンパク質をコード化するcbh1遺伝子を、既知
のプローブ合成方法（Shoemaker等、1983b）を用いてこ
の遺伝子の公表されている配列に基づいて設計したオリ
ゴヌクレオチドプローブによる雑種形成により、トリコ
デルマ リーセイ菌株RL−P37のゲノムDNAからクローニ
ングした。cbh1遺伝子は6.5kbのPst I断片上にあり、Ps
t Iにより切断したpUC4K（ニュージャージー州、ピスキ
ャタウェイ、ファーマシア社から購入した）中に挿入
し、従来技術で知られている技術を用いてこのベクター
のKan^Γを置換した。この技術は、Maniatis等（1989）
に述べられており、ここに引用する。得られたプラスミ
ドpUC4K::cbh1をHind IIIにより切断し、約6kbの大きな
断片を単離し、再度連結してpUC4K::cbh1ΔH/Hを得た
（第４図を参照のこと）。この方法により、全縁cbh1暗
号配列および上流の約1.2kbのフランキング配列（flank
ing sequence）ならびに下流の約1.5kbのフランキング
配列を除去した。元のPst I断片のいずれかの末端から
ほぼ1kbのフランキングDNAが残っている。

Maniatis等（前出）の方法にしたがって、pUC18中の
ゲノムDNAの6.5kb Hind III断片としてトリコデルマ
リーセイpyr4遺伝子をクローニングしてpTpyr2（Smith
等、1991）を形成した。プラスミドpUC4K::cbh IΔH/H
をHind IIIにより切断し、末端をウシ腸アルカリ性ホス
ファターゼにより脱リンした。この末端脱リンDNAを、
トリコデルマ リーセイpyr4遺伝子を含有する6.5kbのH
ind III断片と連結し、ｐΔCBH I pyr4を得た。第４図
はこのプラスミドの構築を示している。

実施例８ プロトプラストの単離 約５×10⁷のトリコデルマ リーセイGC69芽胞（pyr4^-
誘導体菌株）を有する500mlのフラスコ中の100mlのYEG
（0.5％の酵母抽出物、２％のグルコース）を接種する
ことにより、菌糸を得た。約16時間に亘り振とうさせな
がらフラスコを37℃で定温放置した。2,750xgでの遠心
分離により菌糸を収穫した。収穫した菌糸をさらに1.2M
のソルビトール溶液中で洗浄し、5mg/mlのノボザイム
（登録商標）234溶液（コネチカット州、ダンバリー、
ノボ バイオラボ社から得られる、1,3−アルファ−グ
ルカナーゼ、1,3−ベータ−グルカナーゼ、ラミナリナ
ーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを
含有する多成分酵素系の商標名である）;5mg/mlのMgSO₄
・7H₂O;0.5mg/mlのウシ血清アルブミン;1.2Mのソルビト
ールを含有する40mlの溶液中に再懸濁させた。ミラクロ
ス（カリフォルニア州、ラジョラ、カルバイオケム社）
を通過させる濾過により、細胞ブイヨン（cellular deb
ris）からプロトプラストを除去し、2,000xgでの遠心分
離により採集した。プロトプラストを1.2Mのソルビトー
ル中で３回洗浄し、さらにもう一度1.2Mのソルビトー
ル、50mMのCaCl₂中で洗浄し、遠心分離し、1.2Mのソル
ビトール、50mMのCaCl₂の1ml当たり約２×10⁸のプロト
プラストの密度で再懸濁させた。

実施例９ 菌類プロトプラストのｐΔCBH I pyr4による形質転換 実施例８において調製した200μｌのプロトプラスト
懸濁液を、TE緩衝液（10mMのトリス、pH7.4;1mMのEDT
A）中のEcoR I切断ｐΔCBH I pyr4（実施例７で調製し
た）20μｌおよび25％のPEG4000と、0.6MのKClと、50mM
のCaCl₂とを含有するポリエチレングリコール（PEG）溶
液50μｌに加えた。この混合物を20分間に亘り氷上で定
温放置した。この定温放置の後、2.0mlの上述したPEG溶
液をそこに加え、得られた溶液をさらに混合し、５分間
に亘り室温で定温放置した。この第２の定温放置後、1.
2Mのソルビトールおよび50mMのCaCl₂を含有する溶液4.0
mlをその溶液に加え、これにより得られた溶液をさらに
混合した。そのプロトプラスト溶液を、１％のグルコー
ス、1.2Mのソルビトールおよび１％のアガロースを含有
するボゲルの培地Ｎの溶融アリコート（１リットル当た
り、3gのクエン酸ナトリウム、5gのKH₂PO₄、2gのNH₄N
O₃、0.2gのMgSO₄・7H₂O、0.1gのCaCl₂・7H₂O、５μｇの
α−ビオチン、5mgのクエン酸、5mgのZnSO₄・7H₂O、1mg
のFe（NH₄）_２・6H₂O、0.25gのCuSO₄・5H₂O、50μｇのM
nSO₄・4H₂O）にただちに加えた。プロトプラストと培地
の混合物を、上述したボゲルの培地を含有する固体培地
上に注いだ。ウリジンは培地中には存在せず、したがっ
て、ｐΔCBH I pyr4中の野生型pyr4遺伝子挿入物による
菌株GC69のpyr4突然変異の補完の結果として形質転換コ
ロニーのみが成長できた。これらのコロニーを続いて形
質転換し、添加剤として１％のグルコースを含有する固
体のボゲルの培地Ｎ上で精製し、安定な形質転換体をさ
らなる分析のために選択した。

この段階では、より速い成長速度およびウリジンを欠
如した固体培養物上のでこぼこの外形よりもむしろ滑ら
かな円形コロニーの形成により不安定な形質転換体とは
区別される。ある場合には、固体の非選択性培地（すな
わち、ウリジンを含有している）上で形質転換体を成長
させ、続いて発芽してウリジンの欠如した選択的な培地
上に成長するこれらの芽胞の百分率を求めた。

実施例10 形質転換体の分析 実施例９で得られた形質転換体を、１％のグルコース
を含有するボゲルの培地Ｎの液体中で成長させた後、DN
Aをその形質転換体から単離した。これら形質転換体のD
NA試料をさらにPst I制限酵素により切断し、これにア
ガロースゲルの電気泳動を行なった。そのゲルをニトラ
ン膜フィルター上にブロットし、³²P標識ｐΔCBH I pyr
4プローブにより雑種形成させた。プローブを選択し
て、6.5kbのPst I断片としての天然cbh1遺伝子、天然py
r4遺伝子および形質転換DNA断片由来の任意のDNA配列を
同定した。

雑種形成からの放射性バンドをオートラジオグラフィ
ーにより視覚化した。オートラジオグラフを第６図に示
す。５つの試料（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）
について上述したように実験した。レーンＥは非形質転
換菌株GC69であり、この分析においては対照として用い
た。レーンＡ−Ｄは、上述した方法により得られた形質
転換体を示すものである。オートラジオグラフの左側の
数字は、分子量マーカーの大きさを示すものである。こ
のオートラジオグラフから分かるように、レーンＤは6.
5kbのCBH Iバンドを有しておらず、cbh1遺伝子でのDNA
断片の組込みによりこの遺伝子が形質転換体中で全体的
に欠失されたことを示している。cbh1欠失菌株をP37PΔ
CBH Iと称する。第５図は、トリコデルマ リーセイ染
色体のうちの１つのcbh1座でｐΔCBH I pyr4からの大き
なEcoR I断片を二重に交差させて組み込んだことによる
トリコデルマ リーセイcbh1遺伝子の欠失について概略
を説明したものである。分析した他の形質転換体は、非
形質転換対照菌株と同一であるように思われる。

実施例11 pIntCBH Iによる形質転換体の分析 使用したプローブを³²P標識pIntCBH Iプローブに変え
たことを除いては、実施例10と同様に方法をこの実施例
に用いた。このプローブは、pUC4K::cbh1ΔH/Hが欠失し
た領域内のcbh1座からの2kbのBgl II断片を含有するpUC
型のプラスミドである。非形質転換菌株GC69である対照
の試料Ａおよび形質転換体P37PΔCBH Iの試料Ｂの２つ
の試料をこの実施例で分析した。第７図から分かるよう
に、6.5kbでのバンドにより示したとおり、試料Ａはcbh
1遺伝子を有した。しかしながら、形質転換体である試
料Ｂはこの6.5kbのバンドを有しておらず、したがっ
て、cbh1遺伝子を有しておらず、pUCプラスミド由来の
配列をなにも有していない。

実施例12 菌株P37PΔCBH Iによるタンパク質分泌 １％のグルコース、0.14％の（NH₄）₂SO₄、0.2％のKH
₂PO₄、0.03％のMgSO₄、0.03％の尿素、0.75％のバクト
トリプトン（bactotryptone）、0.05％のTween80、0.00
0016％のCuSO₄・5H₂O、0.001％のFeSO₄・7H₂O、0.00012
8％のZnSO₄・7H₂O、0.0000054％のNa₂MoO₄・2H₂O、0.00
00007％のMnCl・4H₂Oを含有するトリコデルマ基本培地5
0ml中に産生したP37PΔCBH I菌株からの芽胞を接種し
た。約48時間に亘り250mlのフラスコ中で振とうさせな
がら培地を37℃で定温放置した。ミラクロス（カルバイ
オケム社）を通過させる濾過により、得られた菌糸を採
集し、17mMのリン酸カリウムにより２、３回洗浄した。
菌糸を最終的に1mMのソホロース（sophorose）を含む17
mMのリン酸カリウムの溶液中に懸濁させ、さらに振とう
させながら30℃で24時間に亘り定温放置した。これらの
培養液から上澄を採集し、菌糸を捨てた。製造者の説明
にしたがって、ファーマシア ファストゲル システム
およびpH3−９プレキャスト ゲルを用いた等電点電気
泳動により培養液の上澄の試料を分析した。ゲルを銀染
料で染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。第８図
に示すように、cbh1タンパク質に対応するバンドは、菌
株P37PΔCBH I由来の試料には存在しなかった。この等
電点電気泳動ゲルは、トリコデルマ リーセイの異なる
上澄培養液中に様々なタンパク質が存在することを示し
ている。レーンＡは部分的に精製したCBH Iである。レ
ーンＢは非形質転換トリコデルマ リーセイの培養液か
らの上澄である。レーンＣは、本発明の方法により産生
した菌株P37PΔCBH Iからの上澄である。様々なセルラ
ーゼ成分の位置を、CBH I、CBH II、EG I、EG II、およ
びEG IIIと印付けた。CBH Iは全体の細胞外タンパク質
の50％を構成するので、CBH Iは主要な分泌タンパク質
であり、ゲル上で最も暗いバンドである。この等電点電
気泳動ゲルは、P37PΔCBH I菌株においてはCBH Iタンパ
ク質が除去されているのを示している。

実施例13 pPΔCBH IIの調製 CBH IIタンパク質をコード化するトリコデルマ リー
セイのcbh2遺伝子を、第9A図に示すゲノムDNAの4.1kbの
EcoR I断片としてクローニングした（Chen等、1987、Bi
otechnology、5:274−278）。この4.1kbの断片をpUC4XL
のEcoR I部位の間に挿入した。後者のプラスミドはpUC
誘導体である（ジェネンカー インターナショナル社の
R.M.Berkaにより構築された）。このpUC誘導体は、EcoR
I、BamH I、Sac I、Sma I、Hind III、Xho I、Bgl I
I、Cla I、Bgl II、Xho I、Hind III、Sma I、Sac I、B
amH I、EcoR Iの順番で並んだ左右対称の制限エンドヌ
クレアーゼ部位を有する多数のクローニング部位を含ん
でいる。従来技術で知られている方法を用いて、Hind I
II部位（CBH II翻訳開始部位の74bpの３′）とCla I部
位（CBH IIの最後のコドンの265bpの３′）との間のこ
の遺伝子の1.7kbの中央領域が除去され、トリコデルマ
リーセイpyr4遺伝子を含有する1.6kbのHind III−Cla
I DNA断片により置換されたプラスミドpPΔCBH II
（第9B図）を構築した。

トリコデルマ リーセイpyr4遺伝子を1.6kbのNhe I−
Sph I断片上のpTpyr2（実施例７参照）から切除し、pUC
219のSph I部位とXba I部位との間に挿入し、p219Mを産
生した（Smith等、1991、Curr.Genet、19 27−33頁）。
pUC219の多重クローニング部位由来の一方の末端で7bp
のDNAおよび他方の末端で6bpのDNAを有するHind III−C
la I断片としてpyr4遺伝子を除去し、cbh2遺伝子のHind
III部位とCla I部位に挿入してプラスミドpPΔCBH II
を形成した（第9B図参照）。

このプラスミドをEcoR Iにより切断することによっ
て、一方の末端においてcbh2座からの0.7kbのフランキ
ングDNA、他方の末端においてcbh2座からの1.7kbのフラ
ンキングDNAおよび中間においてトリコデルマ リーセ
イpyr4遺伝子を有する断片が解放される。

実施例14 P37PΔCBH Iのpyr4^-誘導体の産生 cbh1遺伝子が欠失した形質転換体（P37PΔCBH I）の
芽胞を、FOAを含有する培地上に広げた。その後実施例
６の方法を用いて、この形質転換体のpyr4^-誘導体を得
た。このpyr4^-菌株をP37PΔCBH I Pyr^-26と称した。

実施例15 事前にcbh1が欠失されている菌株中のcbh2遺伝子の欠失 実施例８および９において概説した方法にしたがっ
て、菌株P37PΔCBH I Pyr4^-26のプロトプラストを産生
し、EcoR I切断pPΔCBH IIにより形質転換した。

精製した安定な形質転換体を実施例12のように振とう
フラスコ中で培養し、等電点電気泳動により培養上澄中
のタンパク質を調べた。CBH IIタンパク質をまったく産
生しない１つの形質転換体（P37PΔΔCBH67と称する）
を同定した。第８図のレーンＤは、本発明の方法にした
がって産生されたcbh1遺伝子およびcbh2遺伝子の両方が
欠失した形質転換体からの上澄を示している。

DNAを菌株P37PΔΔCBH67から抽出し、抽出したDNAをE
coR IおよびAsp718により切断し、この切断されたDNAに
ついてアガロースゲル電気泳動を行なった。このゲルか
らのDNAをメンブレンフィルターにブロットし、³²P標識
pPΔCBH IIにより雑種形成させた（第10図）。第10図の
レーンＡは、非形質転換トリコデルマ リーセイ菌株か
らのDNAについて観察された雑種形成模様を示してい
る。野生型cbh2遺伝子を含有する4.1kbのEcoR I断片が
観察された。レーンＢは、菌株P37PΔΔCBH67について
観察された雑種形成模様を示している。単一の4.1kbバ
ンドがなくなり、約0.9kbおよび約3.1kbの２つのバンド
に置き換えられている。これは、pPΔCBH IIからのEcoR
I断片の単一のコピーがcbh2座で正確に組み込まれた場
合に予期される模様である。

同一のDNA試料をEcoR Iにより切断し、サザーンブロ
ット分析を上述したように行なった。この実施例におい
ては、プローブには³²P標識pIntCBH IIを用いた。この
プラスミドは、プラスミドpPΔCBH IIにおいて欠失され
たcbh2遺伝子のセグメント内からのcbh2遺伝子暗号配列
の部分を含有している。菌株P37PΔΔCBH67からのDNAに
ついては雑種形成は見られず、このことは、chh2遺伝子
は欠失され、pUCプラスミド由来の配列はこの菌株内に
は存在しなかったことを示してる。

実施例16 トリコデルマ リーセイのpyr4欠失菌株の形質転換体お
よびｐΔEG I pyr−３の構築 EG Iをコード化するトリコデルマ リーセイegl1遺伝
子を、公表されている配列にしたがって合成したオリゴ
ヌクレオチドによる雑種形成により、菌株RL−P37から
のゲノムDNAの4.2kbのHind III断片としてクローニング
した（Pentilla等、1986、Gene、45:253−263;van Arsd
ell等、1987、Bio/Technology、5:60−64）。

このDNA断片をpUC100のHind III部位で挿入した。EG
I暗号配列の中間に近い位置から暗号配列の３′末端を
越えた位置まで延長した内部の1kbのEcoR V断片を酵素
切断により除去し、クローニングされた黒色アスペルギ
ルスpyrG遺伝子を含有する2.2kbのBamH I−Hind III断
片による連結によって置き換えて（Wilson等、1988、Nu
cl.Acids Res.16 2339頁）ｐΔEG I pyrG−３を得た
（第11図）。実施例８および９に述べた方法によるトリ
コデルマ リーセイのpyr4欠失菌株（菌株GC69）をHind
IIIにより切断し、いずれかの末端でegl1からのフラン
キング領域を備えたpyrG遺伝子を含有する断片を解放し
た後、その菌株をｐΔEG I pyr−３により形質転換し
て、第12図に概説した機構によりゲノムegl1遺伝子が分
断された形質転換体が得られた。DNAを形質転換体から
抽出し、抽出したDNAをHind IIIにより切断し、この切
断したDNAについてアガロースゲル電気泳動を行ない、
メンブレンフィルター上にブロットした。そのフィルタ
ーを放射線標識ｐΔEG I pyr−３により雑種形成した。
トリコデルマ リーセイの非形質転換菌株において、eg
l1遺伝子がDNAの4.2kbのHind III断片上に存在した。し
かしながら、ｐΔEG I pyr−３からの所望の断片の取込
みによるegl1遺伝子の欠失後、この4.2kbのHind III断
片は消失し、約1.2kb大きなHind III断片により置き換
えられた。この模様は１つの形質転換体について観察さ
れた。この形質転換体をΔEG I−３と称した。

実施例17 PAΔEG II−１の構築およびEG II遺伝子の欠失 公表された配列にしたがって合成したオリゴヌクレオ
チドによる雑種形成によって、EG II（文献には、EG II
Iとも称されている）をコード化するegl3遺伝子を、4kb
のPst IゲノムDNA断片としてトリコデルマ リーセイ菌
株RL−P37からクローニングした（Saloheimo等、1988、
Gene 63:11−21）。このDNA断片をpUC18のPst I部位に
挿入した。このプラスミドpEG IIをEcoR Vにより切断
し、EG II暗号領域の５′末端の約180bpの位置から暗号
領域の末端を数百塩基対越えた位置まで延長した約2kb
のセグメント上の全縁EG II暗号領域を除去した。この
セグメントを、amdS遺伝子を含有するアスペルギルス
ニジュランス（Aspergillus nidulans）ゲノムDNAのSsp
I断片により置き換え（Corrick等、1987、Gene 53:63
−71）、プラスミドPAΔEG II−１を産生した（第13図
参照）。

トリコデルマ リーセイの野生型菌株は、唯一のニト
ロゲン供給源としてのアセトアミド上では成長できな
い。amdS遺伝子により形質転換を行なうと、このアセト
アミド上で成長する能力が与えられ、このことがこの遺
伝子を含有する形質転換体の選択システムの基礎となっ
ている。

実施例10および11において記載した方法により、菌株
ΔEG I−３のプロトプラストを、Hind IIIとEcoR Iによ
り切断したpAΔEG II−１により形質転換し、アセトア
ミド上で成長できる形質転換体を選択した。その後、DN
Aを安定な形質転換体から抽出し、抽出したDNAをPst I
により切断し、切断したDNAについてアガロースゲル電
気泳動を行ないメンブレンフィルター上にブロットし
た。そのフィルターを放射線標識pAΔEG II−１により
雑種形成した。egl3フランキング領域およびamdSを含有
した、pAΔEG II−１からのHind III−EcoR I断片の、
形質転換体中のゲノムegl3座で同種組込みを行なうと、
egl3遺伝子を含有する4kbのゲノムPst I断片が、長さで
約1.0kbおよび約2.8kbである２つの遺伝子を含有する小
さなPst1断片により置き換えられることになる。雑種形
成のこの模様は、菌株ΔΔEG−１と称する１つの形質転
換体に観察された。この菌株は、EG IおよびEG IIコー
ド化遺伝子の両方が欠失しており、結果としてこれらの
タンパク質のいずれも産生できない。

実施例７−17および1991年10月４日に出願された米国
特許第07/770,049号（ここに全てを引用する）に記載さ
れた方法を用いて、以下のセルラーゼ成分（すなわち、
EG I、EG II、CBH IおよびCBH II）およびキシナラーゼ
成分のいくつかまたは全てを産生できないトリコデルマ
リーセイの形質転換体を得てもよい。さらに、それら
の記載された方法を用いて、EG IIIセルラーゼ成分を過
剰に産生するトリコデルマ リーセイ形質転換体を得て
もよい。

本発明を様々な好ましい実施態様に関して記載した
が、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、様々な変更、
置換等を行ってもよいことが当業者に理解されよう。し
たがって、本発明の範囲は以下の請求の範囲のみにより
制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラークソン，キャスリーン エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94110 サン フランシスコ トウェン ティエイス ストリート 53 (72)発明者 レアナス，エドマンド エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94038 モス ビーチ ネヴァダ 301 (72)発明者 バウアー，ベンジャミン エス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94118 サン フランシスコ ナンバー ５レイク ストリート 830 (72)発明者 ワイス，ジェフリー エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94117 サン フランシスコ ブエナ ヴィスタ 457 (56)参考文献 米国特許4728613（ＵＳ，Ａ) 国際公開90／015866（ＷＯ，Ａ１) Ｇｅｎｅ，1988年，Ｖｏｌ．63，ｐ. 11−21 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ，1988年，Ｖｏｌ．160，ｐ. 243−251 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/42 C07K 1/14 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セルラーゼタンパク質を含有する水性混合
   物から、実質的に純粋なEG IIIセルラーゼ成分を得る方
   法であって： （ａ）EG IIIセルラーゼ成分以外の実質的に全てのセル
   ラーゼタンパク質がEG IIIセルラーゼ成分の少ない水相
   に保持され、かつEG IIIセルラーゼ成分がEG IIIセルラ
   ーゼ成分の多いポリエチレングリコール相に保持される
   ように、セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物
   に、無機塩、および0.5から10％（w/v）の約5,000から1
   0,000までの分子量を有するポリエチレングリコールを
   添加する工程；および （ｂ）前記EG IIIセルラーゼ成分の少ない水相から前記
   EG IIIセルラーゼ成分の多いポリエチレングリコール相
   を分離して、前記水性混合物中の他のセルラーゼタンパ
   ク質を実質的に含まない前記EG IIIセルラーゼ成分の多
   いポリエチレングリコール相を集める工程を含むことを
   特徴とする方法。
2. 【請求項２】前記EG IIIセルラーゼ成分の多いポリエチ
   レングリコール相からEG IIIセルラーゼ成分を分離し
   て、該EG IIIセルラーゼ成分を集める工程をさらに含む
   ことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】沈殿によって、前記EG IIIセルラーゼ成分
   の多いポリエチレングリコール相からEG IIIセルラーゼ
   成分を分離することを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】低分子量のアルコールを前記EG IIIセルラ
   ーゼ成分の多いポリエチレングリコール相に添加して前
   記EG IIIセルラーゼ成分を沈殿させることを特徴とする
   請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】前記低分子量のアルコールがエタノールで
   あることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】前記無機塩が、前記ポリエチレングリコー
   ルを添加する前に、前記水性混合物に添加されることを
   特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】添加される前記無機塩が、硫酸ナトリウ
   ム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナト
   リウムおよびリン酸カリウムからなる群より選択される
   ことを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】出発物質である前記水性混合物が、濾過さ
   れた全細胞抽出物であることを特徴とする請求項１から
   ７いずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】出発物質である前記水性混合物が、細胞を
   含まないセルラーゼ混合物であることを特徴とする請求
   項１から７いずれか１項記載の方法。