ES2681692T3 - Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante - Google Patents

Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante Download PDF

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ES2681692T3 ES11713215.9T ES11713215T ES2681692T3 ES 2681692 T3 ES2681692 T3 ES 2681692T3 ES 11713215 T ES11713215 T ES 11713215T ES 2681692 T3 ES2681692 T3 ES 2681692T3
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Abstract

Un polipéptido aislado que tiene actividad transgalactosilante y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido tiene una longitud entre 900 y 1180 aminoácidos.

Description

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DESCRIPCION
Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos, específicamente polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante y a los ácidos nucleicos que los codifican, y sus usos en, p. ej. productos lácteos.
Antecedentes de la invención
Los galactooligosacáridos (GOS) son hidratos de carbono que no son digeribles en seres humanos y animales que comprenden dos o más moléculas de galactosa, típicamente hasta nueve, unidas mediante enlaces glucosídicos. Los GOS también pueden incluir una o más moléculas de glucosa. Uno de los efectos beneficiosos de GOS es su capacidad de actuar como compuestos prebióticos estimulando selectivamente la proliferación de microorganismos colónicos beneficiosos, tales como bacterias, para proporcionar beneficios fisiológicos al consumidor. Los efectos sobre la salud contrastados han dado lugar a un creciente interés en los GOS como ingredientes alimentarios para diversos tipos de alimentos.
La enzima p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) generalmente hidroliza la lactosa a los monosacáridos D-glucosa y D- galactosa. En la reacción enzimática normal de las p-galactosidasas, la enzima hidroliza lactosa y une transitoriamente el monosacárido galactosa en un complejo galactosa-enzima que transfiere galactosa al grupo hidroxilo del agua, que da como resultado la liberación de D-galactosa y D-glucosa. Sin embargo, a altas concentraciones de lactosa, algunas p-galactosidasas son capaces de transferir galactosa a los grupos hidroxilo de D-galactosa o D-glucosa en un proceso llamado transgalactosilación mediante el cual se producen galactooligosacáridos.
El género Bifidobacterium es uno de los tipos de cultivos de bacterias más comúnmente utilizados en la industria láctea para la fermentación de una variedad de productos lácteos. La ingestión de productos que contienen Bifidobacterium tiene además un efecto promotor de la salud. Este efecto no solo se logra por un pH reducido de los contenidos intestinales sino también por la capacidad de Bifidobacterium para repoblar la flora intestinal en individuos a los que se les ha alterado la flora intestinal por ejemplo por la ingesta de antibióticos. Además, Bifidobacterium tiene el potencial de desplazar los microorganismos intestinales potencialmente nocivos.
Los galactooligosacáridos son conocidos por potenciar el crecimiento de Bifidobacterium. Este efecto probablemente se logra a través de la capacidad única de Bifidobacterium para aprovechar los galactooligosacáridos como fuente de carbono. También se cree que el suplemento dietético de galactooligosacáridos tiene una serie de efectos de protección de enfermedades a largo plazo. Por ejemplo, la ingesta de galactooligosacáridos ha demostrado ser altamente protectora contra el desarrollo de cáncer colorrectal en ratas. Por lo tanto, existe un gran interés en desarrollar métodos económicos y eficientes para producir galactooligosacáridos para uso en la industria para mejorar los suplementos dietéticos y los productos lácteos.
Se conoce un polipéptido beta-galactosidasa de Ruminococcus/Blautia hansenii que tiene 1807 aminoácidos (con SEQ ID NO: 12) de la base de datos UniProt, 24 de noviembre de 2009, "Subname: Full=Beta-galactosidase" XP002591904 obtenido del no. de acceso EBI UNIPROT: C9LAL1.
Se conoce una glicosidasa que tiene 1768 aminoácidos (con SEQ ID NO: 13) de la base de datos UniProt, 14 de octubre de 2008, "Subname: Full=Putative no caracterised protein" XP002610554 obtenido del no. de acceso EBI UN-IPROT: B5CQV4.
Se ha descrito una lactasa extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215 truncada con aproximadamente 580 aminoácidos (BIF3) como una enzima transgalactosilante en una solución que contiene lactosa solubilizada en agua (J0rgensen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 647 - 652). En el documento WO 2009/071539 se describe un fragmento truncado diferente comparado con BIF3 que da como resultado una hidrólisis eficiente y una producción muy baja de GOS cuando se ensaya en leche.
El documento WO 01/90317 describe un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante de Bifidobacterium bifidum (OLGA5) y su uso para producir productos lácteos.
Las enzimas lactasa de Bifidobacterium bifidum descritas anteriormente tienen la desventaja de que requieren altas concentraciones de lactosa para exhibir actividad transgalactosilasa o que tienen predominantemente actividad beta- galactosilasa (hidrolasa).
Todavía existe la necesidad de desarrollar enzimas que sean eficientes en la producción de GOS y que, además, puedan funcionar a bajos niveles de sustrato lactosa, tal como en leche.
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Objeto de la invención
Es un objeto de las realizaciones de la invención proporcionar polipéptidos que tengan actividad transgalactosilante. Polipéptidos que tienen una relación útil de actividad de transgalactosilación a hidrólisis y, por lo tanto, son productores eficientes de GOS cuando se incuban con lactosa incluso a bajos niveles de lactosa tal como en un producto a base de leche. Describimos un método para la producción de galactooligosacáridos (GOS) in situ en productos lácteos. También describimos un método para desarrollar un método más barato y más eficiente para la producción de galactooligosacáridos (GOS) para uso en la industria.
Compendio de la invención
La presente invención describe un polipéptido aislado que tiene actividad transgalactosilante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO 1, cuyo polipéptido tiene una longitud entre 900 y 1180 aminoácidos. Los polipéptidos descritos en la presente memoria son sorprendentemente capaces de producir galactooligosacáridos in situ cuando se incuban con lactosa tal como leche. Por lo tanto, cuando el polipéptido, como se describe en la presente memoria, o una célula anfitriona que expresa el polipéptido se incuba con lactosa bajo condiciones apropiadas, se producen galactooligosacáridos con una alta eficiencia y, por lo tanto, se reduce la lactosa. La presencia de galactooligosacáridos en productos lácteos u otros productos comestibles tiene la ventaja de potenciar el crecimiento de Bifdobacterium sp. promotora de la salud en el producto o en la flora intestinal del consumidor después de la ingesta del producto o de ambos.
También describimos un polipéptido aislado que tiene actividad transgalactosilante seleccionada del grupo que consiste en:
a. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de sEq ID NO: 1,
b. un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de sEq ID NO: 2,
c. un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de baja rigurosidad con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en la SEQ ID NO: 10 que codifica el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1; ii) la secuencia de ADNc de i) o iii) la cadena complementaria de i) o ii);
d. un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de baja rigurosidad con i) la secuencia de ácido nucleico comprendida en la SEQ ID NO: 11 que codifica el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2; ii) la secuencia de ADNc de i) o iii) la cadena complementaria de i) o ii);
e. un polipéptido que comprende una sustitución conservadora, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y
f. un polipéptido que comprende una sustitución conservadora, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos de SEQ ID NO: 2,
siempre que el polipéptido de los puntos anteriores a, c, y e tenga como máximo una longitud de 1806 aminoácidos y siempre que el polipéptido de los puntos anteriores b, d, y f tenga como máximo una longitud de 1767 aminoácidos.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un método para expresar un polipéptido, comprendiendo el método obtener una célula como se describe en la presente memoria y expresar el polipéptido en la célula, y opcionalmente purificar el polipéptido. En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria una composición que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria, preferiblemente una composición alimentaria, más preferiblemente un producto lácteo. En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un método para producir un producto alimentario tratando un sustrato que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presente memoria tal como producir un producto lácteo tratando un sustrato a base de leche que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, los polipéptidos se utilizan para tratar un sustrato con una beta-galactosidasa hidrolizante. En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un producto alimentario, preferiblemente un producto lácteo, que comprende una enzima transgalactosilante obtenida a partir de Ruminococcus hansenii o Ruminococcus lactaris, preferiblemente como se define en los puntos a-f anteriores, y más preferiblemente un polipéptido como se define adicionalmente en la presente memoria. En un aspecto adicional, se describe en la presente memoria un galactooligosacárido o composición del mismo obtenido tratando un sustrato que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, se proporciona un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene
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a. al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y/o

b. al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, se proporciona un polipéptido que tiene una relación entre actividad transgalactosilante y actividad p-galactosidasa de al menos 1 medida a una concentración de 6 LAU/ml en un ensayo basado en leche a 37°C y 5% p/p de lactosa después de 30 minutos de reacción que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene

a. al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y/o

b. al menos 66% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 para producir galactooligosacáridos. En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 94% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 para producir galactooligosacáridos.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso de un polipéptido que tiene actividad transgalactosilante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene

a. al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3,

b. al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

c. al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o

d. al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7,
para producir galactooligosacáridos.
En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido que tiene una relación entre actividad transgalactosilante y actividad p-galactosidasa de al menos 1 medida a una concentración de 6 LAU/ml en un ensayo basado en leche a 37°C y 5% p/p de lactosa después de 30 minutos de reacción. En un aspecto adicional, se proporciona un ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un plásmido que comprende un ácido nucleico como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se describe en la presente memoria, o capaz de expresar un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona una célula anfitriona que comprende, y preferiblemente transformada con, un plásmido como se describe en la presente memoria, o un vector de expresión como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona una célula capaz de expresar un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un método para expresar un polipéptido, comprendiendo el método obtener una célula anfitriona o una célula como se describe en la presente memoria y la expresión del polipéptido a partir de la célula o célula anfitriona, y opcionalmente la purificación del polipéptido. En un aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria y un estabilizador. En un aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria y un sustrato de hidrato de carbono. En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto lácteo mediante tratamiento de un sustrato a base de leche que comprende lactosa con un polipéptido que tiene una relación entre actividad transgalactosilante y actividad p-galactosidasa de al menos 1, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 o al menos 12, medido a una concentración de 6 LAU/ml en un ensayo basado en leche a 37°C y 5% p/p de lactosa después de 30 minutos de reacción. En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto lácteo mediante tratamiento de un sustrato a base de leche que comprende lactosa con un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un uso de una célula como se describe en la presente memoria para producir un producto seleccionado del grupo que consiste en yogur, queso, producto de leche fermentada, suplemento dietético y producto comestible probiótico. En un aspecto adicional, se proporciona un producto lácteo que comprende una célula como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un producto lácteo que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un producto lácteo que comprende un polipéptido como se describe en la presente memoria en una concentración de 0,01-1000 ppm. En un aspecto adicional, se proporciona un producto lácteo que comprende un polipéptido inactivado como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un producto lácteo que comprende GOS formado in situ mediante un polipéptido como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se proporciona un uso de un polipéptido transgalactosilante como se describe en la presente memoria o una célula como se describe en la

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    1. Un polipéptido aislado que tiene actividad transgalactosilante y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, cuyo polipéptido tiene una longitud entre 900 y 1180 aminoácidos.
  2. 2. El polipéptido según la reivindicación 1 que tiene una relación entre actividad transgalactosilante y actividad p- galactosidasa de al menos 1, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, o al menos 12.
  3. 3. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos madura de SEQ ID NO: 1.
  4. 4. El polipéptido según las reivindicaciones 1-3 que contiene el dominio catalítico de glicosil hidrolasa clase 2 (GH2), que preferiblemente contiene uno o más dominios Pfam seleccionados de: Glyco_hydro2N (PF02837), Glyco_hydro (PF00703), Glyco_hydro 2C (PF02836) y dominio similar a Ig bacteriana (grupo 4) (PF07532).
  5. 5. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
  6. 6. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es un fragmento del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 12.
  7. 7. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que se obtiene a partir de Ruminococcus hansenii o Ruminococcus lactaris.
  8. 8. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  9. 9. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8 y que expresa un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  10. 10. Una célula que expresa un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  11. 11. Un método para expresar un polipéptido, comprendiendo el método utilizar una célula según la reivindicación 10 y expresar el polipéptido en la célula, y opcionalmente purificar el polipéptido.
  12. 12. Una composición que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, preferiblemente una composición alimentaria, más preferiblemente un producto lácteo.
  13. 13. Un método para producir un producto alimentario tratando un sustrato tal como un sustrato a base de leche que comprende lactosa con un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y opcionalmente tratando además el sustrato con una beta-galactosidasa hidrolizante.
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    150
    200
    Min
    Fig. 2
    Glucosa generada
    Lactozym
    B. bifidum
    R, hansenii
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    200
    Min
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