PT1974028E

PT1974028E - Produto e processo

Info

Publication number: PT1974028E
Application number: PT68205871T
Authority: PT
Inventors: Georgios Tzortzis; Athanasios K Goulas; Theodoros Goulas
Original assignee: Clasado Inc
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2013-07-09
Also published as: AU2006328108A1; IL192342A0; CA2634273C; AU2006328108B2; HK1121780A1; DK1974028T3; KR20080093102A; RU2385931C1; GB0525857D0; CY1114173T1; US20090285933A1; MY144029A; WO2007071987A3; CN101370935A; NO20082802L; GB2447003B; JP2009519725A; ZA200805361B; US8058047B2; UA97353C2

Description

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DESCRIÇÃO "PRODUTO E PROCESSO" A presente invenção refere-se a uma nova a-galactosidase com atividade de transgalactosilação capaz de converter a melibiose em dissacáridos de α-galactobiose. Em particular, ela refere-se a uma α-galactosidase isolada de uma estirpe recentemente descoberta de Bifidobacterium bifidum. A invenção refere-se particularmente a sequências de ADN que codificam a enzima α-galactosidase isolada, à enzima codificada por uma tal sequência de ADN e a uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de ADN ou contendo um vetor recombinante que incorpora a sequência de ADN. A invenção refere-se também à utilização da enzima codificada pela sequência de ADN, ou da célula hospedeira contendo uma sequência de ADN ou vetor recombinante, para produzir a-galactobiose.

As bifidobactérias colonizam naturalmente o aparelho intestinal inferior, um ambiente que é pobre em mono e dissacáridos, uma vez que tais açúcares são preferencialmente consumidos pelo hospedeiro e micróbios presentes no aparelho intestinal superior. A fim de sobreviver no aparelho intestinal inferior as bifidobactérias produzem vários tipos de exo- e endoglicosidases ligadas na superfície e/ou formas extracelulares, através das quais podem utilizar vários hidratos de carbono.

Além de atividade hidrolase, algumas enzimas das bifidobactérias exibem atividade transferase. Esta atividade de transglicosilação das glicosidases é 2 extensivamente utilizada para a síntese enzimática de vários oligossacáridos, os quais demonstraram que atuam como fatores de promoção do crescimento de bifidobactérias.

Sabe-se que os membros de bifidobactérias produzem enzimas β-galactosidase que estão envolvidas no metabolismo bacteriano da lactose. Moller, P.L. et al in Appl & Environ. Microbial., (2001), _62, (5), 2276-2283 descrevem o isolamento e caracterização de três genes de β-galactosidase a partir de uma estirpe de Bifidobacterium bifidum. Eles determinaram que todas as três β-galactosidases eram capazes de catalisar a formação de galactooligossacáridos ligados em beta por transgalactosilação.

Sabe-se que algumas espécies de bifidobactérias, mas não a B. bifidum, produzem α-galactosidases bem como β-galactosidases. As α-galactosidases fazem parte do grupo de glicosil-hidrolases e podem ser classificadas em dois grupos com base na sua especificidade para o substrato, isto é, um grupo é específico para pequenos sacáridos tal como o p-nitrofenil-a-D-galactopiranosídeo, melibiose e rafinose, e o outro grupo pode libertar galactose a partir de galactomananas tal como a goma de guar, além de pequenos substratos.

Base de dados Geneseq [em linha] 19 de novembro de 2002, "Bifidobacteria longum NCC2705 ORF amino acids sequence SEQ ID No. 919". A XP002431983 recuperada do n° de acesso EBI GSP: ABP66175, N° de acesso da base de dados ABP 66175 divulga uma sequência de aminoácidos de B. longum.

Base de dados UniProt [em linha] 1 de novembro de 1999, "Alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22)". A XP002431984 3 recuperada do N° de acesso EBI UNIPROT: Q9XCX2 N° de acesso da base de dados Q9XCX2 e van den Broek L.A.M. e tal em Biotechnoloqy Letters, 2jL(5), (1999) 441-445 divulga uma sequência de alfa-galactosidase de Bifidobacterium adolescentis.

Base de dados UniProt [em linha] 27 de Setembro de 2005, "Glycoside hydrolase, clan GH-D." A XP002431985 recuperada do N° de acesso EBI UNIPROT: Q40Z83 No de acesso da base de dados Q40Z83 divulga uma sequência de glicósido-hidrolase.

Scalabrini P. et al em J Food Microbiology, 3_9(3), (1981), 213-219 descreve a análise de estirpes de Bifidobacterium quanto à sua atividade α-galactosidase e à produção de ácidos láctico e acético para determinar o seu potencial para serem utilizadas na produção de leite de soja fermentado.

Van Laere V.M.J. et al em Applied Microbiology and Biotechnoloqy, _52(5), (1999), 681-688 divulga uma a-galactosidase de Bifidobacterium adolescentis.

Lamoureux L et al em J Dairy Science, 85(5), (2002), 1058-1069 descreve a produção de oligossacáridos em iogurte contendo bifidobactérias e culturas de iogurte.

Foi determinado que uma estirpe de Bifidobacterium bifidum é capaz de produzir uma atividade enzimática galactosidase que converte a lactose numa nova mistura de galactooligossacáridos que contém inesperadamente até 35% de dissacáridos incluindo galabiose (Gal (a 1-6) - Gal) . Sabe-se que este dissacárido (ver Paton, J.C. & Paton, A.W. (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) é um 4 antiadesivo capaz de prevenir a adesão de toxinas, por exemplo a toxina Shiga e agentes patogénicos tais como E. coli, à parede do intestino.

Esta estirpe de B bifidum foi depositada sob o número de acesso NCIMB 41171 no National Collection of Industrial & Marine Bactéria, Aberdeen, Reino Unido em 31 de março de 2003. Ela é também descrita na Patente UK n° 2 412 380.

Foi determinado que esta estirpe de B. bifidum produz uma cx-galactosidase que é capaz de converter a melibiose em dissacáridos de cx-galactobiose.

De acordo com a invenção é proporcionado uma sequência de ADN que codifica uma proteína com uma sequência de aminoácidos como dada na SEQ. ID NO: 2. A sequência de ADN é dada na SEQ. ID NO: 1.

De acordo com um segundo aspeto da invenção é proporcionado uma enzima codificada por uma sequência de ADN como definida acima. Uma tal enzima pode compreender a sequência de aminoácidos dada na SEQ. ID NO: 2.

De acordo com um terceiro aspeto da invenção é proporcionado um vetor recombinante, preferencialmente um vetor de expressão, compreendendo uma sequência de ADN como definida acima. Um tal vetor pode ser incorporado numa célula hospedeira tal como uma célula bacteriana, de levedura ou fúngica. Uma célula hospedeira adequada pode ser selecionada de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, por exemplo Bacillus subtilis ou Bacillus circulans, Escherichia e Aspergillus, por exemplo Aspergillus niger. 5

Ao utilizar a melibiose como um substrato, a enzima codificada pela sequência de ADN como definida acima produz uma mistura de oligossacáridos, em particular dissacáridos de α-galactobiose. A enzima ou a célula hospedeira como descrita acima pode ser utilizada para produzir dissacáridos de cx-galactobiose, os quais podem fazer parte de um produto para melhorar a saúde do intestino. Um tal produto pode ser selecionado do grupo consistindo de produtos lácteos (por exemplo, leite liquido, leite em pó seco tal como leite em pó gordo, leite em pó magro, leite em pó fortificado com gordura, soro em pó, leites para lactentes, fórmula para lactentes, gelado, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados), bebidas tais como sumo de frutos, alimentos para lactentes, cereais, pão, biscoitos, doces, bolos, suplementos alimentares, suplementos dietéticos, produtos comestíveis probióticos, produtos comestíveis prebióticos, alimentos compostos para animais, alimentos compostos para aves domésticas ou, de facto, qualquer outro alimento ou bebida.

Alternativamente, os dissacáridos assim produzidos podem ser utilizados na preparação de um medicamento, por exemplo na forma de comprimido ou cápsula, para prevenir a adesão de agentes patogénicos ou toxinas produzidas por agentes patogénicos à parede do intestino. 0 medicamento pode ser administrado a um doente, por exemplo após um período de tratamento com antibiótico, o qual frequentemente altera ou mesmo destrói a flora intestinal saudável normal.

De acordo com ainda um outro aspeto da invenção é proporcionado um processo para a produção de uma enzima como definida acima, o qual compreende cultivar uma célula hospedeira como definida acima num meio de cultura adequado sob condições que permitem a expressão da enzima e 6 recuperar a enzima ou produtos enzimáticos resultantes da cultura. A invenção é também dirigida a um processo para a produção dos dissacáridos de galactobiose, o qual compreende pôr em contacto a enzima como definida acima ou uma célula hospedeira como definida acima com um material contendo melibiose sob condições que levam à formação dos dissacáridos. 0 material contendo melibiose adequado pode ser selecionado de melibiose, rafinose, estaquiose comercialmente disponível ou como um extrato de soja.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID NO: 1) da α-galactosidase de Bífidobacterium bifidum com os codãos de inicio e paragem indicados com letras a negrito; A Figura 2 mostra a sequência de nucleótidos da Figura 1 com a sequência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 2) da enzima; A Figura 3 mostra os primeiros 540 aminoácidos da sequência de aminoácidos (SEQ. ID NO: 2) da Figura 2; A Figura 4 é um gráfico que mostra a reação ao longo do tempo durante a sintese do α-galactooligossacárido com a a-galactosidase e melibiose a 40% (p/p) em tampão de fosfato 0,1 M a pH 6,0 como substrato; e

A Figura 5 mostra um cromatograma de troca aniónica de alta eficiência da mistura do a-galactooligossacárido sintetizada pela α-galactosidase de B.bifidum NCIMB 41171 utilizando melibiose a 40% (p/p) em tampão de fosfato 0,1 M 7 a pH 6,0 como substrato. (Glc = glucose, Gal = galactose, Mel = melibiose, DP = grau de polimerização) . As setas a tracejado denotam os produtos de galactooligossacárido. O ADN genómico foi isolado a partir da estirpe de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) utilizando o método de Lawson et al. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. O ADN foi digerido com enzimas de restrição e os fragmentos possuindo um tamanho máximo de 15 kbp foram ligados com o vetor pBluescript KS( + ) . Células de E. coli foram transformadas com um vetor contendo inserções consistindo de ADN cromossómico de B. bifidum digerido com PstI. Os clones com atividade α-galactosidase foram selecionados em placas de ágar Luria Bertani contendo p-nitrofenil-a-D-galactopiranosídeo e isopropil-β-Ό- tiogalactosídeo (IPTG). Foram identificados dois clones positivos para a a-galactosidase (pMelAl e pMelA2).

Os dois clones positivos foram digeridos com EcroRl, PstI e BamHI e apresentaram um padrão de restrição semelhante indicando que ambos continham o mesmo fragmento de ADN inserido. A sequenciação de ADN do fragmento de ADN inserido MelAl foi realizada utilizando o método de terminação da cadeia de didesoxilo de Sanger (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) utilizando o kit de sequenciação em ciclo BigDye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems, EUA). A sequência de ADN do MelAl é mostrada na Figura 1 (SEQ. ID NO: 1) . A grelha de leitura aberta (ORF) foi localizada utilizando o descobridor de ORF da NCBI (National Center of Biotechnology Information). Utilizou-se o código genético bacteriano e determinou-se o tamanho da grelha como sendo de 300 bp. A sequência de nucleótidos da Figura 1 foi traduzida em todas as seis grelhas de leitura possíveis e foi identificada uma grelha de leitura aberta de 759 aminoácidos que codifica uma α-galactosidase putativa. A tradução é mostrada na Figura 2 (SEQ. ID NO: 2). A presente invenção será ainda descrita por referência aos exemplos que se seguem.

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Todos os produtos químicos e preparações de meio utilizados ao longo deste estudo foram obtidos de Sigma (Dorset, UK), Invitrogen (Paisley, UK) , Oxoid (Basingstoke, UK) , Qiagen (West Sussex, UK) e Promega (Southampton, UK).

Estirpes Bacterianas A estirpe de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) foi mantida em esferas criogénicas em tubos Microbank a -70°C. Nas experiências posteriores, a estirpe foi ressuscitada em ágar Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) e meio TPY (meio de extrato de levedura de tripticase phytone) e cultivada anaerobicamente (composição de CO2 e N2 a 80% e 20%, respetivamente) a 37°C durante 48 horas. A morfologia da colónia e a ausência de contaminação foram testadas por revelação de Gram.

Estirpes de E. coli

As estirpes de Escherichia coli RAllr e DH5a utilizadas neste estudo foram geralmente incubadas sob condições aeróbicas a 37°C em ágar de Luria Bertani (LB) ou caldo (Sambrook J. e Russell, W.D., (2001) Molecular Cloning: A 9

Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York) e quando necessário foi suplementado com antibióticos (10C^g/mL de ampicilina e/ou 15μρ/ηι1 de cloranfenicol) e 40μ]1 de Χ-α-galactopiranosídeo a 2% (X-a-

Gal) , 7μύ de (isopropil-p-D-tiogalactosídeo) IPTG a 20%, as quais foram aplicadas na superfície de uma placa de ágar de 90mm pré-preparada. A estirpe de E. coli deficiente em α-galactosidase RAllr (Hanatani et al, 1983, J. Biol. Chem., 259, (3), 1807-1812) (genótipo: melA~B+, recA~, lacZ~Y~) é um derivado da E. coli K12 e foi utilizada nas experiências de expressão. A estirpe de E. coli DH5a (Invitrogen, Paisley, UK) (genótipo: F” (p801acZAM Δ (lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk~, mk~) phoA supE44 thí-1 gyrA96 relAlX~) é uma estirpe positiva para α-galactosidase e foi utilizada em todas as outras manipulações genéticas. A escolha da estirpe de E. coli RAllr, para as experiências de expressão, foi feita de acordo com o seu genótipo. Esta estirpe não codifica uma oí-galactosidase ativa devido à mutação melA no seu ADN cromossómico. No entanto, esta estirpe tem um transportador de melibiose ativo que é necessário para o transporte de açúcares (melibiose) para o citoplasma e, por este motivo, para o metabolismo dos mesmos pelas α-galactosidases ativas. Não era conhecido se a α-galactosidase de Bifidobacterium bifidum era expressada intracelular ou extracelularmente. Assim, a existência de um transportador de melibiose ativo era essencial para a identificação dos clones positivos para α-gal e, por este motivo, para o isolamento de genes que codificam a cx- galactosidase . 10

Além do mais, esta estirpe é um mutante recA que minimiza a recombinação do ADN introduzido com o ADN do hospedeiro, aumentando assim a estabilidade das inserções.

Extração do ADN Genómico a partir de Bifidobacterium bifidum O ADN genómico foi isolado a partir da estirpe de

Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) utilizando o método de Lawson et al. (1989).

De acordo com este método, as células foram colhidas de placas em 0,5 mL de tampão de TES em ependorfs de 1,5 mL. Foram adicionados 10 μ]1 da mistura de lisozima/mutanolisina (4:1, lisozima 10 mg/mL; mutanolisina 1 mg/mL) e a mistura foi em seguida misturada e incubada durante 30 minutos a 37°C. As células foram em seguida tratadas com 10 μΕ de proteinase K (a 20 mg/mL) e 10 μΕ de RNase (10 mg/mL) , misturadas e incubadas durante 1 hora a 65°C. Após incubação, foram adicionados 100 μΕ de SDS a 10% e os lisados celulares foram suavemente misturados por inversão e incubados durante mais 15 minutos a 65°C, seguida de adição de 0,62 mL de fenol/clorof órmio e misturados por inversão até se formar uma emulsão. O lisado celular foi centrifugado a 6 500 rpm durante 10 minutos e a camada aquosa superior foi transferida para um ependorf limpo utilizando uma ponta de pipeta azul de orifício largo, tratada numa chama. A extração (passo de desproteinização) foi repetida até os detritos celulares serem completamente removidos. O ADN foi precipitado pela adição de 1 mL de etanol gelado, seguido de incubação durante pelo menos 30 minutos sobre gelo ou armazenagem de um dia para o outro num congelador a -20°C. O ADN genómico foi recuperado por centrifugação a 13 000 rpm durante 5 minutos e, após 11 secagem, foi ressuspenso em 50 μ]1 de Tris-Cl 10 mM, pH 8, estéril. 0 ADN extraído foi analisado por eletroforese em gel e a concentração medida a 260nm. Este foi conservado a -20°C ou -70°C durante períodos of tempo prolongadas e foram evitadas descongelações e congelações múltiplas para reduzir a possibilidade de degradação.

Preparação do Vetor de ADN 0 vetor utilizado ao longo deste estudo foi o pBluescript KS ( + ) (Stratagene, North Torrey Pines Road). Este veículo de clonagem foi escolhido devido ao promotor lac que o pBluescript KS ( + ) codifica, o qual é necessário para o início de transcrição de genes que não têm o seu próprio promotor. 0 vetor foi digerido com as seguintes enzimas de restrição: PstI, BamRI e EcoRI de acordo com as instruções do fabricante utilizando um excesso de dez vezes da enzima em relação ao ADN (unidades da enzima^g de ADN igual a dez unidades de enzima por um μρ de ADN de plasmídeo ou dez unidades de enzima por 0,5 pmol de ADN de plasmídeo). Após inativação térmica da enzima (20 min a 65°C) os padrões de restrição foram analisados através de análise por eletroforese em gel horizontal.

Os vetores foram ainda desfosforilados com fosfatase alcalina de intestino de vitelo CIAP (Promega, Southampton, UK) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência do tratamento foi testada por auto-ligação do vetor (com ligase de ADN de Bacteriófago T4 de acordo com as 12 instruções do fabricante) após transformação em células DH5a. A presença de um único fragmento no gel indicou a digestão total do vetor e a digestão por restrição simples do mesmo. A digestão suficiente do vetor foi também testada transformando moléculas não ligadas em células de E. coli DH5a competentes. 0 número de colónias formadas nas placas de ágar LB suplementado com ampicilina (10C^g/mL) foi um indicador das moléculas não digeridas e o fundo esperado durante as experiências posteriores.

Construção da Biblioteca de ADN Genómico 0 ADN genómico foi parcialmente digerido com três enzimas de restrição que reconhecem sequências de hexa-nucleótidos de ocorrência frequente em ADN procariótico. As EcoRI, BamHI e PstI são endonucleases de restrição de tipo II que reconhecem especificamente as sequências 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3 e 5'CTGCA/G'3 respetivamente, e produzem quebras de cadeia dupla dentro destas sequências gerando saliências 5' de quatro nucleótidos, AATT e GATC, para as EcoRI e BamHI respetivamente, e saliências 3', ACGT, para a PstI.

Todas estas enzimas foram ativas e capazes de dissociar o ADN apenas na presença de iões magnésio bivalentes. Estes iões foram o único cofator necessário.

Digestão de Restrição de ADN.

Todas as digestões de restrição das amostras de ADN genómico foram incubadas durante 2 horas a 37 °C e finalmente inativadas termicamente a O 0 LO hO durante 20 13 minutos. As reações foram em seguida arrefecidas até à temperatura ambiente e foi adicionada a quantidade apropriada de tampão de carga, seguida de mistura suave com um capilar de vidro selado. As soluções foram em seguida transferidas para os poços de um gel de agarose a 0,8% (fonte de alimentação, 4-5volt/cm durante 14-16 horas) e o tamanho do ADN digerido foi estimado utilizando padrões de ADN com lkbp (Promega, UK) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).

Purificação dos fragmentos gerados após digestão de restrição. A purificação do fragmento a partir das misturas reacionais e dos geles de agarose foi efetuada utilizando o quite de extração de gel QIAEX da Qiagen (West Sussex, UK) . Os protocolos são descritos em mais pormenor no manual do fabricante.

Ligação e Transformação do ADN

Após purificação dos fragmentos de ADN com o kit de extração de gel Qiaex, aqueles foram ligados ao vetor pBluescript KS(+) tratado com CIAP. Para ligação, quantidades apropriadas de ADN foram transferidas para tubos de centrífuga de 0,5 mL estéreis como se mostra no Quadro 1.

Tubo ADN A Vetor (15 fmoles [-29,7 ng]) B Vetor (15 fmoles ~29,7ng de ADN) mais inserção (externo 15 fmoles ~69,3ng ) C controlo de pUC (0,056 fmoles [-100 pg]) A proporção molar do vetor de ADN de plasmídeo relativamente ao fragmento de ADN inserção deve ser ~1:1 na 14 reação de ligação. A concentração final de ADN deve ser -lOng/^L.

Quadro 1: Misturas de ligação. 0 tubo A mostra o número de vetores de ADN auto-ligados que têm de ser subtraídos do número total de transformantes após transformação. 0 tubo B mostra a ligação do vetor com os fragmentos de ADN e o tubo C mostra o controlo de modo a poder-se calcular a eficiência de transformação.

Antes de cada ligação, os fragmentos de ADN foram aquecidos a 45°C durante 5 minutos para fundir quaisquer extremidades coesivas que re-emparelharam durante a preparação do fragmento. Foi escolhida uma proporção molar de vetor: inserção de ADN de 1:1 para todas as reações de ligação e a montagem de reação foi feita de acordo com as instruções da Promega.

Aos tubos A e B foram adicionados 1,0 μύ de tampão de ligação lOx e 0,5 unidades de Weiss de ligase de ADN de T4 (Promega, UK) e o volume de ligação foi ajustado a 10 μύ com água de pureza para biologia molecular. Aos tubos C foram adicionados 1,0 μύ de tampão de ligação 10x e o volume de ligação foi ajustado a 10 μύ com água de pureza para biologia molecular.

Foram adicionados fragmentos de ADN aos tubos juntamente com a água e, em seguida, aquecidos a 45°C durante 5 minutos para fundir quaisquer extremidades coesivas que foram re-emparelhadas durante a preparação. O ADN foi congelado a 0 °C antes de serem adicionados os restantes reagentes de ligação e as misturas reacionais foram incubadas de um dia para o outro a 16°C (Sambrook e

Russell, 2 0 01) . 15

Após precipitação com etanol e purificação dos fragmentos ligados (para remover a mistura de ligação que origina uma redução da eficiência de transformação), as transformações foram realizadas de acordo com as instruções de Hanahan. Foi adicionado ~50ng de ADN ligado em 5μ]1 de solução a ΙΟΟμύ de células de E. coli RAllr competentes. Após tratamento térmico e expressão do gene de resistência à ampicilina, as células foram aplicadas sobre a superfície de placas LB contendo ampicilina (10C^g/mL), Χ-α-Gal (40μύ de Χ-α-Gal a 2%) e IPTG (7μύ de IPTG a 20%) .

Mediu-se o número de transformantes de cada reação de ligação. O número de transformantes geralmente obtidos a partir do tubo C foi de 2xl0s-lxl06 cfu^g enquanto que a partir do tubo A foi de 500-600 cfu^g. O número de transformantes no tubo A foi uma indicação do tratamento eficiente do ADN vetor. O número de transformantes no tubo B situava-se numa gama de 2-4xl04 cfu^g. Número de Transformantes

As misturas de ligação com ADN cromossómico de PstI deram origem a dois clones positivos para a a-galactosidase (pMelAl e pMelA2) de um total de aproximadamente 2500 transformantes rastreados, enquanto que o ADN cromossómico tratado com FcoRI e BamRI não deu qualquer clone positivo de um total de aproximadamente 4000 transformantes rastreados.

Digestão do Clone Positivo 16 0 dois clones positivos com PstI foram digeridos com as enzimas de restrição UcroKI, PstI, BamRI, HindIII, Smal e Κρη I. As enzimas de restrição UcroRI, PstI e BamRI apresentaram um padrão de restrição semelhante, um fragmento de ~5kbp (gene de interesse) e um de ~3kbp (ADN de plasmideo) indicando que estas enzimas foram cortadas nas mesmas posições. A HindIII deu um fragmento a 6,5kbp e um fragmento a l,5kbp, enquanto que as enzimas Smal e Kpnl deram um fragmento com um tamanho de ~8kbp indicando que elas foram cortadas numa única posição. Os padrões de restrição semelhantes para ambos os plasmídeos foram uma indicação de que ambos contêm a mesma inserção de fragmento de ADN.

Sequenciação de ADN A sequenciação de ADN foi realizada com o método de terminação da cadeia de didesoxilo de Sanger utilizando o kit de sequenciação em ciclo BigDye Terminator v.3.0 (Applied Biosystems, EUA) e analisada com o ABI Prism 3100, um sistema de análise de ADN com base em fluorescência que incorpora eletroforese capilar.

As extremidades 5' e 3' dos fragmentos de ADN inseridos foram sequenciados com iniciadores específicos para o vetor. As inserções foram ainda sequenciadas utilizando o Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs, UK). O GPS-1 é um sistema in vitro baseado em transposão de TN7, o qual utiliza a Transposase TnsABC para inserir aleatoriamente o Transposão no ADN alvo. Foi utilizada uma relação de massa dador: ADN alvo de 1:4 de acordo com as instruções do fabricante. O número de plasmídeos isolados para sequenciação após inserção do Transiniciador no plasmideo alvo foi 25. Este número foi calculado de acordo 17 com as instruções do fabricante e assume uma profundidade de cobertura de 5 vezes.

Sitios iniciadores únicos em ambas as extremidades do elemento Transiniciador permitiu a sequenciação de ambas as cadeias do ADN alvo na posição da inserção. A mistura reacional de sequenciação continha aproximadamente 400-600ng de ADN de plasmídeo, 3,2pmol de solução de iniciador e 4μύ de solução de BigDye Terminator.

Identificação da Grelha de Leitura Aberta A grelha de leitura aberta (ORF) foi localizada utilizando o descobridor de ORF da NCBI. Foi utilizado o código genético bacteriano e determinou-se que o tamanho da grelha é de 300bp. A sequência de nucleótidos foi traduzida em todas as seis grelhas possiveis e foi identificada uma grelha de leitura aberta de 759 aminoácidos que codifica uma cx-galactosidase putativa (A tradução é mostrada na Figura 2). Foram confirmados os codãos de inicio e paragem. 0 gene da α-galactosidase de Bifidobacterium no plasmideo pMelAl foi expressado in E. coli sob condições de crescimento que normalmente reprimiriam a expressão do promotor indutivel lacZ de E. coli localizado na região flanqueadora do vetor de clonagem. Esta observação indicou que as sequências bifidobacterianas internas, endógenas a montante do gene da α-galactosidase podem servir como um sinal de iniciação da transcrição em E. coli. 0 inicio da transcrição é indicado por uma letra em itálico negrito. Os resultados acima indicam que o gene é 18 controlado a partir do seu próprio promotor para transcrição.

Exemplo 2 Síntese com a enzima g-galactosidase clonada isolada de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 no hospedeiro E. coli (estirpe RA11) A síntese descrita que se segue, salvo indicação em contrário, foi realizada com as células hospedeiras RA11 de E. coli inteiras após tratamento da biomassa de E.coli (recolhida por centrifugação a 10 000 g) com tolueno a uma concentração de 2000 ppm para aumentar a permeabilidade celular e também para tornar as células não viáveis destruindo a sua membrana citoplasmática. A biomassa de E-coli foi preparada como descrita no Exemplo 1 em "estirpes de E coli". Síntese com a enzima clonada A síntese com α-galactosidase foi realizada a uma concentração de substrato de 40% (p/p) de concentração inicial de melibiose. A solução de síntese foi preparada em tampão de fosfato 0,1 M a pH 6,0. A síntese foi realizada a 40°C num banho-maria agitado a 150 rpm. O pH ótimo para a enzima específica foi escolhido com base em medições de atividade (utilizando p-nitrofenil-a-D-galactopiranosídeo como substrato) de uma preparação enzimática específica a vários valores de pH.

Para a síntese de α-galactosidase, 2 mL de uma suspensão de células RAll de E. coli (com uma atividade de 0,3 U/mL) foram centrifugados (a 10 000 g) para recolher a biomassa e o sobrenadante foi rejeitado. Esta biomassa foi ressuspensa 19 com 1 g de solução de substrato de melibiose a 40% (p/p) para realizar a síntese.

As concentrações dos diferente açúcares presentes na mistura durante a síntese são mostradas na Figura 4. Os cromatogramas da cromatografia de troca aniónica de alta eficiência acoplada com deteção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) de misturas de galactooligossacárido sintetizadas pela α-galactosidase clonada de B. bifidum NCIMB 41171 são mostrados na Figura 5. As concentrações de açúcar da mistura de galactooligossacárido no momento de síntese ótima são mostradas no quadro 1.

Quadro 1. Composição de hidratos de carbono da síntese de α-galactooligossacárido a uma concentração inicial de melibiose de 40 % (p/p) no momento em que foi observada a concentração máxima de oligossacárido.

Subst. Início Síntese GOS DP>3 GOS DP=2 Mel Glc Gal %(p/p) Concentração (% dos açúcares totais) 40 13, 93 6,61 38,06 24,1 17,29

Mel: Melibiose, Glc: glucose, Gal: galactose, DP: grau de polimerização 20

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Lindsay, Clare L <120> Produto e Processo

<130> P/13587.WO <150> GB 0525857.9 <151> 2005-12-20 <160> 2 <170> Patentln versão 3.4

<210> 1 <211> 3129 <212> ADN <213> Bifidobacterium bifidum <220> <221> gene <222> (1)..(6) <400> 1 taaaccttca taaaaggaaa caaaagctgg aagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga 60 actagtggat cccccgggct gcagctcgtg gtgatctacg ttccgttcct caactccgcg 120 ttcggcacca cgccgctcgg accgtgggca tgggtcgagt gcatctgcct cgccgcggtc 180 gtactgatcg cctcggaaat ctacaaggcg atcatgcgcg ccatcgaccg caagcgcggc 240 atcatggcat aacaatgcca taagcctcca ccggcagtca gggctcccgc tctccacatc 300 ggaaaacggg agcccttctc ataccccgga atcgctgaat atgcggtgac atgacggaac 360 gatgtcgtag catcggaggc gaaccatata tcaatggcac gttccgaagg gattcgcaat 420 21 gtcactcatc gaacaattcc atggcgccgc cgccgatgga acggaactca ccgctattta 480 tgctgagcag ccggctgctg atgtggcgtt cgcgctggtc ttcgccggtc acggtcttcc 540 gcgcttcgtg cactggggcc gaccgctcgc ggcgccggga accgtactcg ccgcatacga 600 cgccctgcgg ccgcagcgcg tgtccggcgc gctggacgag accgcctggc caagcatcat 660 gcccacgcaa agcgagtcgt ggataggggc accgcgactg gatatccggc gcgccggcgt 720 aacgccgttc tgtgcattca cggtgaccgg catcgcaatc cgtcaggacg aacgccaagg 780 cgttgacgtg tctgacggcg tggacggtgc cgcgcatacc gtcacgcaac aggtgccggt 840 cgtcaccgtg accgcgtcgg atgccgagca gggcgtggaa ctgtcatgga cggccgaact 900 gttgcccggc ggactgatca gacagcgcac cacgctgcgt aatcttccag ccggtaatct 960 tccgaccggt gacttggaag tcggtaaagt cgaactcggc ttcccgctcc cggcacttgc 1020 cacggagata ctcaccacca ccggccatca tctgcgcgaa cgcagcccgc agcggcagcc 1080 gctgaccgaa ggacgcttcg agaaggtctc gatggcgggg cgcccaggtt ttgacgcctc 1140 tctgttgctt tccgcgggcg agcccggctt cgggttcgag catggcgagg tctattcggt 1200 gcatgtgggc tggagcggca attccgtgct gtcggcagag cgtcagccgt atacgaccgg 1260 tctgattggc ggcggcgagg tgctgctcgg cggcgaggcc acgctcgccc gcggcgaaac 1320 gtacaccacc ccgtggctgt acgggtcgta cggtgacggg ctcaacgagg tggctgcgag 1380 attccatgat tacgtacgct cctgtcaccc ggatctcgcc gtcaagccgc gtccggtgat 1440 tctcaacacg tgggaggccg tgtatttcga ccatgactac gacacgttga aggctctggc 1500 cgataaggcc ggggattccg gtgtcgaacg gttcgtggtg gatgacggct ggttcggctc 1560 ccgccgagac tccacatccg ggctcggcga ctggcaaata gcgcaggatg tgtggccgga 1620 cgggccgaag agcctcaagg cgctcgccga ttacgtgcac ggaaaaggca tggagttcgg 1680 cctgtggttc gaaccggaga tggtcaaccc ggattccgac gtggcccgcg cccaccctga 1740 ctgggtgctg cgcccgactg cgaaccgtct gccgatgcag ggacgctcgc agcaagtgct 1800 cgacctgacc aatcccgacg cctaccgata catccatgat tccatcgatg cgctggtcgg 1860 cgagttgggc atcgactaca tcaaatggga ccacaacaaa ttcgtcaccg aggcggtctc 1920 gccacgtacc ggcaggccgg cggtgcacgg gcagacgctc gccgtgtacc ggatgttccg 1980 tgacctcgaa gtcgcgcatc cgggactgga gattgagagt tgcgcatcgg gcggcggccg 2040 tatcgacctg ggcatactcg aattcgccag ccgcgtgtgg acgtccgact gcgtggaccc 2100 ggtcgagcgg gccgatattc agcggtacac gtcgctgctc gtgccgccct gcatgatggg 2160 cgagcatgtg ggggcgagtc ctgcacattc cacgcatcgc gccacgagcc aggagatgcg 2220 catggcgatg gcgttcttcg ggcacatggg cgtcgaatgg aatctgctca aggagccgga 2280 cgaggcgttg aacaagctcg gcgaatgggt cgccgaatac aagaggcacc gcgcatggtt 2340 cgcgatcgac aegtgcgtgc acgccgatat cgccgatccg gccgtccggg tcgacggcat 2400 22 ggtcaagccg gatcgttccg cggcgttcta ccggttcacg caactgacaa cgtcccagac tctccctgcg gcgccgattc gcgtgcccgg tcttgacccc gatggcacgt accgcataca gccgttgtgg ctggatctcg atctcgacgg gcttggtctt ggcagcggcc agtcgccgtt gggctggtgg accaaagacg gcgtgctgat gacgggccgg gcgctgatga cctacgggtt gcgccctcca tcgctgcatc cggcgcagtc ggtgctgttc accgccattc gccaataagc cagacggcat cgaacggagc ataacaatgt gccggcggcc cagtcatgga gtcgccggca cattgcgtca aagaacttgg gtatcggctc tagtcgttga cgtcggcctt gtagaagttc acgtaggaac ggctgggggt cgggccgcgc tggccctgat aatgggagcc ggtgcccttg gagccgtaag ggtgctcggc cggagagctg agctggaaga agcacatctg cccgatcttc atgccgggcc agagcttgac cggaagcgtc gacacgttgc tcaactccag cgtgatatgc ccctcgaaac cggggtcgat gaagccggcc gtcgaatgtg tgaggatgcc cagacggccc agcgagcttt tgccttccaa gcgtgccgcc accgtcgcgt cgagcttgac ggtactcccc acgtcgagc

<210> 2 <211> 759 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <4 0 0> 1

Met ser Leu ile Glu Gin Phe His Gly Ala Ala Ala Asp Gly Thr Glu 1 S 10 15

Leu Thr Ala He Tyr Ala Glu Gin Pro Ala Ala Asp Vai Ala Phe Ala 20 25 30

Leu Vai Phe Ala Gly His Gly Leu Pro Arg Phe vai His Trp Gly Arg 35 40 45

Pro Leu Ala Ala Pro Gly Thr vai Leu Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Arg 50 55 60

Pro Gin Arg vai Ser Gly Ala Leu Asp Glu Thr Ala Trp Pro ser ile 65 70 75 80

Met pro Thr Gin Ser Glu ser Trp ile Gly Ala Pro Arg Leu Asp xle 85 90 95

Arg Arg Ala Gly vai Thr pro Phe cys Ala Phe Thr vai Thr Gly He 100 105 110 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 30®) 3120 3129 23

Ala ile Arg- 115 Glr* ASp Glu Arg nl rs Ϊ20 Gly Val ASp val ςβ{> 125 Asp· Gly val Asp Gly Ala Ala His Thr val Thr Gin Gin val pro val val Thr val 130 135 140 Thr 145 Ala Ser ASP Ala Glu 150 Gin Gly Val Glu Leu 155 Ser Trp Thr Ala Glu 160 Leu Leu Pro Gly Gly 165 Leu Ile Arg Gin Arg 170 Thr Thr Leu Arg Asn 175 Leu pro Ala Gly Asn 180 Leu Pro Thr dy ASp 185 Leu Glu val Gly Lys 190 val Glu Leu Gly Phe Pro Leu pro Ala Leu Ala Thr Glu lie Leu Thr Thr Thr 195 200 205 Gly His His Leu Arg Glu Arg ser pro Gin Arg Gin Pro Leu Thr Glu 210 215 220 Gly 225 Arg Phe Glu Lys val 230 Ser Met Ala Gly Arg 235 Pro Gly phe Asp Ala 240 ser Leu Leu Leu Ser 245 Al a Gly Glu Pro Gly 250 Phe Gly Phe Glu His 255 Gly

Glu val Tyr ser vai His vai Gly Trp Ser Gly Asn Ser vai Leu ser 260 265 270

Ala Glu Arg Gin pro Tyr Thr Thr Gly Leu He Gly Gly Gly Glu vai 275 280 285

Leu Leu Gly Gly Glu Ala Thr Leu Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Thr Thr 290 295 300 *05 ΤΓΡ LÊU Tyr Ser Tyr Gly Asp Gly Leu Asn Glu val Ala Ala

3 3 *1S

Arg Phe His Asp Tyr val Arg ser cys His Pro Asp teu Ala val Lys 325 y 330 335 pro Arg Pro val rle Leu Asn Thr Trp Glu Ala val Tyr Phe Asp His 340 345 350

Asp Tyr Asp Thr Leu Lys Ala Leu Ala Asp Lys Ala Gly Asp Ser Gly 355 7 360 365

Val Ar0 p^e Val val Asp Asp Gly Trp phe Gly ser Arg Arg Asp 370 375 380 24 <u»r Thr ser Giv Leu Gly Asp Trp Gin lie Ala Gin Asp vai Trp pro 385 390 395 400

Asp Gly Pro Lys ser Leu Lys Ala Leu Ala Asp Tyr vai His Gly Lys 7 405 410 415

Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met vai Asn pro Asp 420 425 430 ser asp Val Ala Arg Ala His Pro Asp Trp vai Leu Arg Pro Thr Ala 435 440 445

Asn Arg Leu Pro Met Gin Gly Arg ser Gin Gin val Leu Asp Leu Thr 450 455 460

Asn pro Asp Ala Tyr Arg Tyr He His Asp ser ile Asp Ala Leu val 465 470 475 480

Gly Glu Leu Gly lie Asp Tyr He Lys Trp Asp His Asn Lys Phe val 485 490 495

Thr Glu Ala val Ser Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala val His Gly Gin 500 505 510

Thr Leu Ala val Tyr Arg Met Phe Arg Asp Leu Glu val Ala His Pro 515 520 525

Gly Leu Glu ile Glu ser cys Ala ser Gly Gly Gly Arg ile Asp Leu 530 535 540

Gly ile Leu Glu Phe Ala Ser Arg val Trp Thr Ser Asp cys val Asp 545 550 555 560

Pro val Glu Arg Ala Asp ile Gin Arg Tvr Thr ser Leu Leu val Pro 565 570 575 pro cys Met Met Gly Glu His val Gly Ala ser Pro Ala His Ser Thr 7 580 585 590

His Arg Ala Thr Ser Gin Glu Met Arg Met Ala Met Ala Phe Phe Gly 595 600 605

His Met Gly val Glu Trp Asn Leu Leu Lys Glu Pro Asp Glu Ala Leu 610 615 620

Asn Lys Leu Gly Glu Trp val Ala Glu Tyr l^s Arg His Arg Ala Trp 625 630 635

Phe Ala ile Asp Thr cys val His Ala Asp ile Ala Asp Pro Ala val 645 650 655 25

Arg Vai Asp Gly Met vai Lys Pro A.sp-Arg ser Ala Ala phe Tvr Ara 660 665 670

Phe Thr Gin Leu Thr Thr Ser Gin Thr Leu Pro Ala Ala Pro lie Aro 675 680 685

Vai Pro Gly Leu Asp Pro Asp Gly Thr Tyr Arg ile Gin Pro Leu Trp 690 695 700

Leu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Gly Leu Gly Ser Gly Gin Ser Pro 705 710 715 720

Leu Gly Trp Trp Thr Lys Asp Gly Vai Leu Met Thr Gly Arg Ala Leu 725 730 735

Met Thr Tyr Gly Leu Arg Pro Pro Ser Leu His Pro Ala Gin Ser vai 740 745 750

Leu Phe Thr Ala xle Arg Gin 755

Lisboa, 28 de Junho de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ADN que codifica uma proteína com uma sequência de aminoácidos como dada na SEQ. ID. NO: 2.

2. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência é dada na SEQ. ID NO: 1.

3. Enzima codificada por uma sequência de ADN da reivindicação 1 ou reivindicação 2.

4. Enzima compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ. ID NO: 2.

5. a-Galactosidase possuindo a sequência como definida na SEQ. ID NO: 2.

6. Vetor recombinante compreendendo uma sequência de ADN da reivindicação 1 ou reivindicação 2.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 6, em que o referido vetor é um vetor de expressão.

8. Célula hospedeira compreendendo uma sequência de ADN da reivindicação 1 ou reivindicação 2.

9. Célula hospedeira compreendendo o vetor da reivindicação 6 ou reivindicação 7.

10. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, em que a referida célula é uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula fúngica. 2

11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, em que a referida célula é selecionada do grupo consistindo de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus e Aspergillus.

12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, em que a célula é selecionada do grupo consistindo de Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans e Aspergillus niger.

13. Utilização de uma enzima de qualquer uma das reivindicações 3 a 5, ou uma célula de qualquer uma das reivindicações 8 a 12, para produzir dissacáridos de α-galactobiose.

14. Utilização de uma enzima de qualquer uma das reivindicações 3 a 5, ou uma célula de qualquer uma das reivindicações 8 a 12, para produzir dissacáridos de α-galactobiose para fazer parte de um produto selecionado do grupo consistindo de produtos lácteos, tais como leite líquido, leite em pó seco, leites para lactentes, fórmula para lactentes, gelado, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, bebidas tais como sumo de frutos, alimentos para lactentes, cereais, pão, biscoitos, doces, bolos, suplementos alimentares, suplementos dietéticos, produtos comestíveis probióticos, produtos comestíveis prebióticos, alimentos compostos para animais, alimentos compostos para aves domésticas e medicamentos.

15. Utilização de uma célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 8 a 12, para produzir um produto selecionado do grupo consistindo de produtos lácteos, 3 tais como leite liquido, leite em pó seco, leites para lactentes, fórmula para lactentes, gelado, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, bebidas tais como sumo de frutos, alimentos para lactentes, cereais, pão, biscoitos, doces, bolos, suplementos alimentares, suplemento dietético, produto comestível probiótico, produto comestível prebiótico, alimentos compostos para animais, alimentos compostos para aves domésticas e medicamentos.

16. Processo de produção de uma enzima de qualquer uma das reivindicações 3 a 5 compreendendo cultivar uma célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 8 a 12 num meio de cultura adequado sob condições que permitem a expressão da referida enzima e recuperar a enzima resultante da cultura.

17. Processo de produção de um dissacárido compreendendo pôr em contacto uma enzima de qualquer uma das reivindicações 3 a 5 ou uma célula hospedeira de qualquer uma das reivindicações 8 a 12 com uma solução de melibiose. Lisboa, 28 de Junho de 2013