NO341747B1 - DNA sekvens, vertcelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertcelle - Google Patents
DNA sekvens, vertcelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertcelle Download PDFInfo
- Publication number
- NO341747B1 NO341747B1 NO20082802A NO20082802A NO341747B1 NO 341747 B1 NO341747 B1 NO 341747B1 NO 20082802 A NO20082802 A NO 20082802A NO 20082802 A NO20082802 A NO 20082802A NO 341747 B1 NO341747 B1 NO 341747B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- enzyme
- host cell
- dna
- dna sequence
- cell
- Prior art date
Links
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 46
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims abstract description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002778 food additive Substances 0.000 claims description 5
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims description 5
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 claims description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims description 2
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 claims description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 abstract description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 abstract 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OCC1OC(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C(O)C1O AYRXSINWFIIFAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 235000021255 galacto-oligosaccharides Nutrition 0.000 description 5
- 150000003271 galactooligosaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-YGEXGZRRSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl alpha-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-YGEXGZRRSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000933531 Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 Species 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 235000015496 breakfast cereal Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001655328 Bifidobacteriales Species 0.000 description 1
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 1
- 241001213452 Bifidobacterium longum NCC2705 Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100154901 Rhizobium meliloti mepA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 101150028694 melA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
- A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/06—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7016—Disaccharides, e.g. lactose, lactulose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Foreliggende oppfinnelse angår en ny a-galaktosidase med transgalaktosylerende aktivitet, isolert fra Bifidobacterium bifidum. a-galaktosidasen har evne til å omdanne mellibiose til a-galaktobiosedisakkarider som kan innkorporeres i en rekke matvareprodukter eller dyrefôr for å forbedre tarmhelsen ved å fremme veksten av bifidobakterier i tarmen, og undertrykke veksten av den patogene mikrofloraen.
Description
Den foreliggende oppfinnelse angår DNA sekvens, vertscelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertscelle. Den angår følgelig en ny α-galaktosidase med transgalaktosylerende aktivitet i stand til å omdanne mellibiose til αgalaktobiosedisakkarider. Spesielt angår den en α-galaktosidase isolert fra en nylig oppdaget stamme av Bifidobacterium bifidum.
Oppfinnelsen angår særlig DNA-sekvenser kodende for det isolerte αgalaktosidase-enzymet, enzymet kodet for av en slik DNA-sekvens og en vertscelle omfattende en DNA-sekvens eller inneholdende en rekombinant vektor med DNA-sekvensen.
Bifidobakterier koloniserer naturlig den nedre delen av tarmsystemet, et miljø som har lite mono- og disakkarider siden slike sukkere fortrinnsvis fordøyes av verten og mikrober som er tilstede i den øvre delen av tarmsystemet. For å overleve i den nedre delen av tarmsystemet produserer bifidobakterier ulike typer ekso- og endoglykosidaser i overflatebundet og/eller ekstracellulære former, som de kan nyttigjøre diverse karbohydrater med.
Ved siden av hydrolaseaktivitet, har noen enzymer fra bifidobakterien transferaseaktivitet. Denne transglykosyleringsaktiviteten til glykosidaser er i stor grad anvendt for den enzymatiske syntesen av ulike oligosakkarider, som har vist seg å fungere som vekstfremmende faktorer for bifidobakterien.
Det er kjent at medlemmer av bifidobakterien fremstiller ß-galaktosidase-enzymer som er involvert i bakteriell metabolisme av laktose. Moller, P.L. et al i Appl & Environ. Microbial., (2001), 62, 5), 2276-2283 beskriver isoleringen og karakteriseringen av tre ßgalaktosidasegener fra en stamme av Bifidobacterium bifidum. De fant at alle tre ßgalaktosidasene var i stand til å katalysere dannelsen av beta-bundet galaktooligosakkarider ved transgalaktosylering.
DATABASE Geneseq, 19.nov.2001, beskriver Bifidobacterium longum NCC2705 ORF aminosyresekvens SEQ ID NO:919.
VAN DEN BROAK L A M ET AL, 1999, beskriver syntese av alfa-galaktooligosakkarider av en klonet alfa-galaktosidase fra Bifidobacterium adolescentis.
SCALABRINI P ET AL, 1998, beskriver karakterisering av Bifidobacteriumstammer for anvendelse i soyamelkfermentering.
Det er kjent at noen arter av bifidobakterien, men ikke B. Bifidum fremstiller αgalaktosidaser så vel som ß-galaktosidaser. α-Galaktosidaser tilhører gruppen av glykosylhydrolaser og kan klassifiseres i to grupper basert på deres substratspesifisitet, dvs. en gruppe er spesifikk for små sakkarider som p-nitrofenyl-α-D-galaktopyranosid, mellibiose og raffinose, og den andre gruppen kan frigjøre galaktose fra galktomannaner som guar gummi, i tillegg til små substrater.
En stamme av Bifidobacterium bifidum er funnet som er i stand til å fremstille en galaktosidase-enzymaktivitet som omdanner laktose til en ny blanding av galaktooligosakkarider, som uventet inneholder opptil 35 % av disakkarider inkludert galbiose (Gal (α 1-6) – Gal). Dette disakkaridet er kjent (se Paton, J.C. & Paton, A.W. (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-476; Carlson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) for å være et antiadhesiv i stand til å hindre adhesjonen av toksiner til tarmveggen, f.eks. Shigatoksin og patogener som E. coli.
Denne stammen av B. bifidum ble innlevert under aksesjoneringsnummer NCIMB 41171 ved National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, UK den 31. mars 2003. Den er også beskrevet i UK Patent nr.2 412 380.
Det er funnet at denne stammen av B. bifidum fremstiller en α-galaktosidase som er i stand til å omdanne mellibiose til α-galaktobiosedisakkarider.
Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig DNA sekvens som koder for et protein med en aminosyresekvens som angitt SEKV. ID NR: 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre DNA sekvens ifølge krav 1, idet sekvensen er gitt i SEKV. ID NR: 1.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre enzym kodet i en DNA sekvens ifølge 1 eller krav 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre enzym omfattende en aminosyresekvens ifølge SEKV. ID NR: 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre α-galaktosidase med en sekvens som definert i SEKV. ID NR: 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre rekombinant vektor omfattende en DNA sekvens ifølge krav 1 eller krav 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre vektor ifølge krav 6, idet nevnte vektor er en ekspresjonsvektor.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre vertscelle omfattende en DNA sekvens ifølge krav 1 eller krav 2.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 6 eller 7.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av et enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5, eller en celle ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12, for produsering av α-galaktobiose disakkarider.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av et enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5, eller en celle ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12, for produsering av α-galaktobiose disakkarider for å være en del av et produkt valgt fra gruppen bestående av meieriprodukter, så som flytende melk, tørket melkepulver, barnemelk, barneformel, iskrem, yoghurt, ost, fermenterte meieriprodukter, drikker så som fruktjuice, barnemat, frokostblandinger, brød, kjeks, konditorvarer, kaker, matvaretilsetninger, kosttilskudd, probiotiske spiselige produkter, prebiotiske spiselige produkter, dyrefór, fjærfe fór og medikamenter.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12, for produsering av et produkt valgt fra gruppen bestående av meieriprodukter, så som flytende melk, tørket melkepulver, barnemelk, barneformel, iskrem, yoghurt, ost, fermenterte meieriprodukter, drikker som fruktjuice, barnemat, frokostblandinger, brød, kjeks, konditorvarer, kaker, matvaretilsetninger, kosttilskudd, probiotiske spiselige produkter, prebiotiske spiselige produkter, dyrefór fjørfe fór og medikamenter.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for fremstilling av et enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5 omfattende dyrking av en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12 i et egnet dyrkingsmedium under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte enzym og gjenvinning av det resulterte enzymet fra kulturen.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for fremstilling av et disakkarid omfattende kontakt av et enzym ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5 eller en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 12 med en løsning av melibiose.
Ifølge oppfinnelsen er det følgelig fremskaffet en DNA-sekvens som koder for et protein med en aminosyresekvens som gitt i SEKV. ID NR: 2 eller hybridiserer under stringente betingelser med DNA-sekvensen som koder for dette proteinet. DNA-sekvensen er gitt i SEKV. ID NR: 1 eller kan omfatte et fragment eller degenerasjonsprodukt derav.
Utrykket ”degenerasjonprodukt” er tolket til å bety en DNA-sekvens som minst er 50 % homolog til SEKV. ID NR: 1, fortrinnsvis fra 50 til 98 % homolog, mest foretrukket fra 75 til 95 % homolog.
En slik DNA-sekvens kan omfatte nukleotidsubstitusjoner, addisjoner eller delesjoner som resulterer i mindre enn 60 %, fortrinnsvis mindre enn 45 %, mer foretrukket mindre enn 25 % endring i aminosyresekvensen vist i SEKV. ID NR: 2.
Nukleotidsubstitusjoner kan resultere i konservative aminosyresubstitusjoner.
Ifølge et andre aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet et enzym kodet for av en DNA-sekvens som definert ovenfor. Et slikt enzym kan omfatte aminosyresekvensen gitt i SEKV. ID NR: 2 eller et fragment derav.
Ifølge et tredje aspekt er det fremskaffet en rekombinant vektor, fortrinnsvis en ekspresjonsvektor, omfattende en DNA-sekvens som definert ovenfor. En slik vektor kan inkorporeres i en vertscelle som en bakterie-, gjær- eller soppcelle. Alternativt kan DNA-sekvensen inkorporeres i en slik vertscelle. En egnet vertscelle kan selekteres fra Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, for eksempel Bacillus subtilis eller Bacillus circulans, Escherichia og Aspergillus, for eksempel Aspergillus niger.
Ved anvendelse av mellibiose som et substrat, fremstiller enzymet kodet for av DNA-sekvensen som definert ovenfor, særlig α-galaktobiosedisakkarider.
Enzymet eller vertscellen som beskrevet ovenfor kan anvendes til å fremstille αgalaktobiosedisakkarider, som kan inngå i et produkt for å forbedre tarmhelsen. Et slikt produkt kan velges fra gruppen bestående av meieriprodukter (for eksempel flytende melk, tørket melkepulver som helmelkpulver, skummetmelkpulver, fettfylt melkepulver, mysepulver, barnemelk, barneformel, iskrem, yoghurt, ost, fermenterte meieriprodukter), drikker som fruktjuice, barnemat, frokostblandinger, brød, kjeks, konditorvarer, kaker, matvaretilsetninger, kosttilskudd, probiotiske spiselige produkter, prebiotiske spiselige produkter, dyrefôr, fjærfefôr eller faktisk enhver annen matvare eller drikke.
Alternativt, kan disakkaridene fremstilt slik anvendes for fremstillingen av et medikament, for eksempel i tablett- eller kapselform for å hindre adhesjon av patogener eller toksiner produsert av patogener i tarmveggen. Medikamentet kan administreres til en pasient, for eksempel etter en antibiotikakur, som ofte endrer eller til og med ødelegger den normale sunne tarmfloraen.
Ifølge ennå et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte for å fremstille et enzym som definert ovenfor, som omfatter dyrking av en vertscelle som definert ovenfor i et egnet dyrkingsmedium under forhold som tillater ekspresjon av enzymet, og gjenvinne det resulterende enzym eller enzymproduktene fra kulturen.
Oppfinnelsen er også rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av galaktobiosedisakkaridene som omfatter kontakt med enzymet som definert ovenfor, eller en vertscelle som definert ovenfor med et mellibiose-inneholdende materiale under forhold som fører til dannelsen av disakkaridene.
Egnede mellibiose-inneholdende materialer kan velges fra kommersielt tilgjengelig mellibiose, raffinose, stachyose eller som et ekstrakt av soyabønner.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser nukleotidsekvensen (SEKV. ID NR: 1) av Bifidobacterium bifidum αgalaktosidase med start- og stoppkodon angitt i fet skrift;
Figur 2 viser nukleotidsekvensen ifølge figur 1 med aminosyresekvensen (SEKV. ID NR: 2) til enzymet;
Figur 3 viser de første 540 aminosyrene av aminosyresekvensen (SEKV. ID NR: 2) ifølge figur 2;
Figur 4 er en graf som viser tidløpsreaksjonen under α-galaktooligosakkaridsyntesen med α-galaktosidasen og 40 % (v/v) mellibiose i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,0 som substrat; og
Figur 5 viser et høykapasitet anionbytter kromatogram av αgalaktooligosakkaridblandingen fremstilt av α-galktosidasen fra B. bifidum NCIMB 41171 ved anvendelse av 40 % (v/v) mellibiose i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,0 som substrat. (Glc = glukose, Gal = galaktose, Mel = mellibiose, DP = polymeriseringsgrad). De strekede pilene betegner galaktooligosakkaridproduktene.
Genomisk DNA ble isolert fra Bifidobacterium bifidum-stammen (NCIMB 41171) ved anvendelse av fremgangsmåten til Lawson et al. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. DNA ble kuttet med restriksjonsenzymer og fragmenter med maksimumsstørrelse på 15 kbp ble ligert i pBluescript KS(+) vektor. E. coli celler ble transformert med en vektor inneholdende innskudd bestående av PstI-kuttet kromosomalt DNA fra B. bifidum. Kloner med α-galaktosidaseaktivitet ble selektert på Luria Bertani agarplater inneholdende p-nitrofenyl-α-D-galaktopyranosid og isopropyl-ß-D-thiogalaktosid (IPTG). To α-galaktosidase-positive kloner (pMelA1 og pMelA2) ble identifisert.
De to positive klonene ble kuttet med EcroRI, PstI og BamHI og viste et lignende restriksjonsmønster, som indikerer at begge inneholdt det samme innsatte DNA-fragmentet. DNA-sekvensering av det innsatte DNA-fragmentet MelA1 ble utført ved anvendelse av dideoksy-kjedetermineringsmetoden av Sanger (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) ved anvendelse av BigDye Terminator V.3.O cycle sequencing kit (Applied Biosystems, USA). DNA-sekvensen til MelA1 er vist i figur 1 (SEKV. ID NR: 1).
Den åpne leserammen (ORF) ble lokalisert ved anvendelse av ORF finder fra NCBI (National Center of Biotechnology Information). Den bakterielle genetiske koden ble anvendt og fragmentlengden ble bestemt til å være 300 bp. Nukleotidsekvensen i figur 1 ble translatert i alle seks mulige leserammer og en åpen leseramme på 759 aminosyrer kodende for en antatt α-galaktosidase ble identifisert. Translasjonen er vist i figur 2 (SEKV. ID NR: 2).
Den foreliggende oppfinnelsen vil bli nærmere beskrevet i form av referanse til følgende eksempler.
Eksempel 1
Materialer og metoder
Alle kjemikalier og mediapreparater anvendt gjennom denne studien ble skaffet fra Sigma (Dorset, UK), Invitrogen (Paisley, UK), Oxoid (Basingstoke, UK), Qiagen (West Sussex, UK) og Promega (Southampton, UK).
Bakteriestammer
Bifidobacterium bifidum-stammen (NCIMB 41171) ble oppbevart i flytendehelium-perler i Microbankrør ved -70 °C. For senere eksperimenter ble stammen gjenopplivet på Wilkinson Chalgren (WC) agar (Oxoid, UK) og TPY medium (trypticase phytone gjærekstrakt medium) og dyrket anarobt (CO2og N2-sammensetning henholdsvis 80 % og 20 %) ved 37 °C i 48t. Kolonimorfologien og fravær av forurensing ble testet ved gramfarging.
E.coli-stammer
Escherichia coli-stammer RA11r og DH5a anvendt i denne studien ble oftest inkubert under aerobe forhold ved 37 °C i Luria Bertani (LB) agar eller broth (Sambrook J. og Russel, W.D., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York) og ble når det var nødvendig supplert med antibiotika (100 µg/ml ampicillin og/eller 15 µg/ml kloramfenikol) og 40 µl av 25 % X-α-galaktopyranosid (X-α-Gal), 7 µl av 20 % (isopropyl-ß-D-thiogalaktosid) IPTG som ble tilsatt på overflaten til en prelaget 90 mm agarplate.
E. coli-stammen RA11r som mangler α-galaktosidase (Hanatani et al, 1983, J. Biol. Chem, 259, (3), 1807-1812) (genotype: melA-B<+>, recA-, lacZ-Y-) er et derivat av E. coli K12 og ble anvendt i ekspresjonsforsøk. E. coli DH5a-stammen (Invitrogen, Paisley, UK) (genotype: F<->φ80lacZΔM(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk-)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ-) er en α-galaktosidase-positiv stamme og ble anvendt for alle andre genetiske manipulasjoner.
Valget av E. coli-stammen RA11r for ekspresjonsforsøk, ble utført ifølge dets genotype. Denne stammen koder ikke for en aktiv α-galaktosidase på grunn av melA-mutasjon i dets kromosomale DNA. Imidlertid har denne stammen en aktiv mellibiosetransportør som er nødvendig for transport av sukkere (mellibiose) i cytoplasma og derav metabolismen av dem ved aktive α-galaktosidaser. Det var ikke kjent om Bifidobacterium bifidum α-galaktosidase ble uttrykt intracellulært eller ekstracellulært. Så tilstedeværelsen av en aktiv mellibiose-transportør var essensiell for identifiseringen av α-gal-positive kloner og derav isoleringen av α-galaktosidase-kodende gener.
Dessuten er denne stammen en recA-mutant som minimaliserer rekombinasjon av det introduserte DNA med verts-DNA, dermed øker stabiliteten av innskuddene.
Genomisk DNA-ekstraksjon fra Bifidobacterium bifidum
Genomisk DNA ble isolert fra Bifidobacterium bifidum-stammen (NCIMB 41171) ved anvendelse av fremgangsmåten til Lawson et al. (1989).
Ifølge denne fremgangsmåten, ble cellene høstet fra plater i 0,5 ml TES-buffer i 1,5 ml eppendorfrør.10 µl lysozyme/mutanolysin-blanding (4:1, lysozym 10 mg/ml; mutanolysin 1 mg/ml) ble tilsatt og blandingen ble så blandet og inkubert i 30 minutter ved 37 °C. Cellene ble så behandlet med 10 µl proteinase K (ved 20 mg/ml) og 10 µl Rnase (10 mg/ml), blandet og inkubert i 1 time ved 65 °C. Etter inkubering, ble 100 µl 10 % SDS tilsatt og cellelysatene ble forsiktig blandet ved inversjon og inkubert videre i 15 minutter ved 65 °C, fulgt av tilsetting av 0,62 ml fenol/kloroform og blandet ved inversjon inntil en emulsjon ble dannet. Cellelysatet ble sentrifugert ved 6,500 rpm i 10 minutter og den øvre væskefasen ble overført til et rent eppendorfrør ved anvendelse av en flambert, bredhullet blå pipettespiss. Ekstraksjonen (deproteiniseringstrinnet) ble gjentatt inntil cellerester fullstendig var fjernet. DNA ble presipitert ved tilsetning av 1 ml iskald etanol fulgt av inkubering i minst 30 minutter på is eller lagret over natt i en -20 °C fryser. Genomisk DNA ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 13,000 rpm i 5 minutter og etter tørking ble det resuspendert i 50 µl steril 10 mM Tris-Cl pH 8.
Ekstrahert DNA ble analysert ved gelelektroforese og konsentrasjonen målt ved 260 nm. Det ble lagret ved -20 °C eller -70 °C for lengre perioder av gangen og flere tininger og frysinger ble ungått for å redusere muligheten for degradering.
Fremstilling av vektor DNA
Vektoren anvendt gjennom denne studien var pBluescript KS(+) (Stratagene, North Torrey Pines Road). Dette kloningsverktøyet ble valgt på grunn av lac-promoteren som pBluescript KS(+) koder for, som er nødvendig for transkripsjonsinitiering av gener som mangler sin egen promoter.
Vektoren ble kuttet med de følgende restriksjonsenzymene: PstI, BamHI og EcoRI ifølge produsentens instruksjoner ved anvendelse av et tifold overskudd av enzym i forhold til DNA (enzymenheter:µgr DNA lik ti enheter av enzym per ett µgr plasmid DNA eller ti enzymenheter per 0,5 pmol plasmid DNA). Etter varmeinaktivering av enzymet (20 min ved 65 °C) ble restriksjonsmønsteret analysert ved horisontal gelelektroforeseanalyse.
Vektorene ble videre defosforylert med kalvetarm alkalisk fosfatase, CIAP (Promega, Southampton, UK) ifølge produsentens instruksjoner. Effekten av behandlingen ble testet ved selvligering av vektoren (med Bakteriofag T4 DNA ligase ifølge produsentens instruksjoner) fulgt av transformering i DH5a celler.
Tilstedeværelsen av ett enkelt fragment i gelen indikerer fullstendig vektorkutting og den ene restriksjonskuttingen av det. Tilstrekkelig kutting av vektoren ble også testet ved å transformere uligerte molekyler i kompetente E. coli DH5a celler. Antall dannede kolonier på LB-agarplater tilsatt ampicillin (100 µgr/ml) var en indikator på ukuttede molekyler og forventet bakgrunn under de etterfølgende forsøk.
Fremstilling av genomisk DNA-bibliotek
Genomisk DNA ble partielt kuttet med tre restriksjonsenzymer som gjenkjenner hyppig forekommende heksanukleotidsekvenser i prokaryotisk DNA. EcoRI, BamHI og PstI er type II restriksjonsendonukleaser som spesifikt gjenkjenner henholdsvis sekvensene 5 ́G/AATTC ́3, 5 ́G/GATCC ́3 og 5 ́CTGCA/G ́3, og lager dobbelttrådkutt i disse sekvensene, og genererer 5 ́overheng på fire nukleotider, AATT, GATC for henholdsvis EcoRI og BamHI, og 3 ́overheng, ACGT for PstI.
Alle disse enzymene var aktive og i stand til å kutte DNA kun ved tilstedeværelse av divalente magnesiumioner. Disse ionene var den eneste nødvendige kofaktor.
Restriksjonskutting av DNA
Alle restriksjonskuttinger av genomiske DNA-prøver ble inkubert i 2 timer ved 37 °C og til slutt varmeinaktivert ved 65 °C i 20 minutter. Reaksjonene ble så avkjølt ved romtemperatur og egnet mengde av appliseringsbuffer ble tilsatt, fulgt av forsiktig blanding med et forseglet glasskapillær. Løsningen ble så applisert i brønner i en 0,8% agarosegel (strømforsyning 4-5 volt/cm i 14-16 timer) og størrelsen av kuttet DNA ble estimert sammenlignet med 1 kb DNA-standard (Promega, UK) (Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).
Rensing av fragmentene generert etter restriksjonskutting
Fragmentrensing fra reaksjonsblandingene og agarosegelene ble utført ved anvendelse av QIAEX gel extraction kit fra Qiagen (West Sussex, UK). Detaljerte protokoller er beskrevet i produsentens manual.
DNA ligering og transformasjon
Etter rensing av DNA-fragmentene med Qiaex gel extraction kit, ble de ligert med CIAP-behandlet pBluescript KS(+) vektor. For ligering, ble egnede mengder DNA overført til sterile 0,5 ml microfugerør som vist i tabell 1.
Rør DNA
A Vektor (15 fmol [~29,7 ng])
B Vektor (15 fmol ~29,7 ng DNA) pluss innskudd
(fremmed 15 fmol ~69,3 ng)
C pUC kontroll (0,056 fmol [~100 pg])
Molart forhold av plasmid DNA-vektor til insatt DNA-fragment bør være ~1:1 i
ligeringsreaksjonen. Den endelige DNA-konsentrasjonen bør være ~10ng/µl.
Tabell 1: Ligeringsblandinger. Rør A viser antall selvligert vektor-DNA som må trekkes fra det totale antall transformanter etter tranformasjonen. Rør B viser ligeringen av vektoren med DNA-fragmentene og rør C viser kontrollen for at transformasjonseffekten kan beregnes.
Før hver ligering ble DNA-fragmentene varmet ved 45 °C i 5 minutter for å smelte eventuelle kohesive termini som rebandt under fragmentfremstillingen. Et molart forhold vektor:innskudd-DNA på 1:1 ble benyttet for alle ligeringsreaksjoner og reaksjonssammensetningen ble gjort i henhold til Promega ́s instruksjoner.
Rørene A og B ble tilsatt 1,0 µl 10x ligeringsbuffer og 0,5 Weiss enheter av T4 DNA ligase (Promega, UK) og ligeringsvolumet ble justert til 10 µl med vann med molekylærbiologikvalitet. 10 µl 10x ligeringsbuffer ble tilsatt rør C og ligeringsvolumet ble justert til 10 µl med vann med molekylærbiologikvalitet.
DNA-fragmenter ble tilsatt rørene sammen med vannet og så varmet til 45 °C i 5 minutter for å smelte eventuelle kohesive termini som var rebundet under fremstillingen. DNA-et ble avkjølt til 0 °C før resten av ligeringsreagensene ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert over natt ved 16 °C (Sambrook og Russel, 2001).
Etter etanolfelling og rensing av de ligerte fragmentene (for å fjerne ligeringsblandingen som gir redusert transformasjonseffektivitet) ble transformasjoner utført ifølge Hanahan instruksjoner. ~50 ng ligert DNA i 5 µl løsning ble tilsatt 100 µl kompetente E. coli RA11r celler. Etter varmebehandling og ekspresjon av det ampicillinresistente genet ble cellene spredt utover overflaten til LB-plater inneholdende ampicillin (100 µgr/ml), X-α-Gal (40 µl av 2 % X-α-Gal) og IPTG (7 µl av 20 % IPTG).
Antall transformanter fra hver ligeringsreaksjon ble telt. Vanlig antall transformanter oppnådd fra rør C var 2x10<5>-10<6>cfu/µg mens det fra rør A var 500-600 cfu/µg. Antall tranformanter i rør B var i området 2-4x10<4>cfu/µg.
Antall transformanter
Ligeringsblandinger med PstI-kromosomalt DNA gav opphav til to αgalaktosidase-postive kloner (pMelA1 og pMelA2) av omtrent 2500 screenete transformanter, mens EcoRI- og BamHI-behandlet kromosomalt DNA gav ingen positive kloner ut av omtrent 4000 totalt screenete transformanter.
Positiv klonekutting
De to PstI-positive klonene ble kuttet med EcroRI, PstI, BamHI, HindIII, SmaI og KpnI restriksjonsenzymer. Restriksjonsenzymene EcroRI, PstI og BamHI gav lignende restriksjonsmønster, ett fragment på ~5 kbp (genet av interesse) og ett ~3 kbp (plasmid DNA) som indikerte at disse enzymene ble kuttet i de samme posisjonene. HindIII gav et fragment på 6,5 kbp og ett fragment på 1,5 kbp, mens enzymene SmaI og KpnI gav ett fragment med størrelse ~8 kbp, som indikerer at de kun ble kuttet i en posisjon. Lignende restriksjonsmønster for begge plasmidene var en indikasjon om at begge inneholdt det samme DNA-fragmentinnskuddet.
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering ble utført med dideoksy-kjedetermineringsmetoden til Sanger med anvendelse av BigDye Terminator v.3.0 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, USA) og analysert med ABI Prism 3100, et fluorescensebasert DNA-analysesystem som inkorporerer kapillær-elektroforese.
5 ́- og 3 ́-endene av de innsatte DNA-fragmentene ble sekvensert med vektorspesifikke primere. Innskuddene ble videre sekvensert ved anvendelse av Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs, UK). GPS-1 er et TN7 transposonbasert in vitro system som anvender TnsABC transposase for å sette inn transposon tilfeldig i mål-DNA. Donor : mål-DNA masseforholdet 1:4 ble anvendt ifølge produsentens instruksjoner. Antall isolerte plasmider til sekvensering etter innsetting av transprimeren i mål-plasmidet var 25. Dette antallet ble beregnet ifølge produsentens instruksjoner og det antyder en 5-fold dybdedekning.
Unike primerseter i begge ender av transprimerelementet tillot sekvensering av begge tråder av mål-DNA i området for innsettingen.
Sekvenseringsreaksjonsblandingen inneholdt omtrent 400-600 ng plasmid DNA, 3,2 pmol primer-løsning og 4 µl BigDye Terminator-løsning.
Identifisering av åpen leseramme
Den åpne leserammen (ORF) ble lokalisert ved anvendelse av ORF finder fra NCBI. Den bakterielle genetiske koden ble anvendt og rammelengden ble bestemt til å være 300 bp. Nukleotidsekvensen ble translatert i alle seks mulige leserammer og en åpen leseramme på 759 aminosyrer kodende for en antatt α-galaktosidase ble identifisert (translasjonen er vist i figur 2). Start- og stoppkodon ble bekreftet.
Bifidobacterium α-galaktosidase genet i plasmid pMelA1 ble uttrykt i E. coli under vekstbetingelser som normalt ville undertrykke ekspresjonen fra den induserbare E. coli lacZ-promotoren lokalisert i det flankerende området av kloningsvektoren. Denne observasjonen indikerer at endogene, interne bifidobakteriesekvenser oppstrøms for αgalaktosidase-genet kan fungere som et transkripsjonsintieringssignal i E. coli.
Transkripsjonsstarten er indikert med fet kursiv skrift. Resultatene ovenfor indikerer at genet kontrolleres av sin egen transkripsjonspromoter.
Eksempel 2
Syntese med det α-galaktosidase klonede enzymet isolert fra Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 i E. coli vert (stamme RA11)
Den følgende beskrevne syntesen, med mindre annet er oppgitt, ble utført med alle E. coli RA11 vertscellene etter behandling av E. coli-biomassen (samlet ved sentrifugering ved 10,000 g) med toulen ved en konsentrasjon på 2000 ppm for å øke cellepermeabiliteten og også gjøre cellene ikke-levedyktige ved å ødelegge deres cytoplasmamembran. E. colibiomassen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1 under ”E. coli stammer”.
Syntese med klonet enzym
Syntese med α-galaktosidase ble utført ved en substratkonsentrasjon på 40 % (v/v) initiell mellibiosekonsentrasjon. Synteseløsningen ble preparert i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 6,0. Syntese ble utført ved 40 °C i ristende vannbad ved 150 rpm. pH-optimumet for det spesifikke enzymet ble valgt basert på aktivitetsmålinger (ved anvendelse av pnitrofenyl-α-D-galaktopyranosid som substrat) av en spesifikk enzymforbindelse ved ulike pH-verdier.
For α-galaktosidasesyntese ble 2 ml av en E. coli RA11 cellesuspensjon (med en aktivitet på 0,3 U/ml) sentrifugert (ved 10,000 g) for å samle biomassen og supernatanten ble kastet. Biomassen ble resuspendert med 1 g av 40% (v/v) mellibiose-substratløsning for å utføre syntesen.
Konsentrasjonen av de ulike sukkere presentert i blandingen under syntese er vist i figur 4. Høykapasitet anionbytter kromatografi koblet med pulsert amperometerdeteksjons-(HPAEC-PAD) kromatogrammer av galaktooligosakkarid-blandinger syntetisert av αgalaktosidasen klonet fra B. bifidum NCIMB 41171 er vist i figur 5.
Sukkerkonsentrasjonene i galaktooligosakkaridblandingene ved optimal syntesetid er vist i tabell 1.
Tabell 1. Karbohydratsammensetning av α-galaktooligosakkaridsyntese ved 40 % (v/v) initiell mellibiose-konsentrasjon på tidspunktet da maksimal oligosakkaridkonsentrasjon ble observert.
Mel: Mellibiose, Glc: glukose, Gal: galaktose, DP: grad av polymerisering.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0525857.9A GB0525857D0 (en) | 2005-12-20 | 2005-12-20 | Product and process |
| PCT/GB2006/004796 WO2007071987A2 (en) | 2005-12-20 | 2006-12-19 | Alpha-galactosidase from bifidobacterium bifidum and its use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20082802L NO20082802L (no) | 2008-07-03 |
| NO341747B1 true NO341747B1 (no) | 2018-01-15 |
Family
ID=35840743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20082802A NO341747B1 (no) | 2005-12-20 | 2008-06-20 | DNA sekvens, vertcelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertcelle |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8058047B2 (no) |
| EP (1) | EP1974028B1 (no) |
| JP (1) | JP5248324B2 (no) |
| KR (1) | KR101335396B1 (no) |
| CN (1) | CN101370935B (no) |
| AU (1) | AU2006328108B2 (no) |
| BR (1) | BRPI0620199A2 (no) |
| CA (1) | CA2634273C (no) |
| CY (1) | CY1114173T1 (no) |
| DK (1) | DK1974028T3 (no) |
| ES (1) | ES2420522T3 (no) |
| GB (2) | GB0525857D0 (no) |
| HK (1) | HK1121780A1 (no) |
| IL (1) | IL192342A (no) |
| MY (1) | MY144029A (no) |
| NO (1) | NO341747B1 (no) |
| NZ (1) | NZ568827A (no) |
| PL (1) | PL1974028T3 (no) |
| PT (1) | PT1974028E (no) |
| RU (1) | RU2385931C1 (no) |
| UA (1) | UA97353C2 (no) |
| WO (1) | WO2007071987A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200805361B (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2011012603A (es) | 2009-05-27 | 2012-06-01 | Clasado Inc | Metodo para prevenir la diarrea. |
| CN101993864B (zh) * | 2009-08-13 | 2012-12-26 | 中国农业大学 | 一种耐高温β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用 |
| JP2015507012A (ja) | 2012-02-14 | 2015-03-05 | ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー | 皮膚共生プレバイオティック剤及びそれを含有する組成物の局所使用 |
| CN114145418A (zh) * | 2020-09-07 | 2022-03-08 | 陈杰 | 一种氨基酸营养米粉及其制备方法 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4435389A (en) * | 1980-07-07 | 1984-03-06 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Composition for promoting growth of bifidobacteria |
| JPS6259290A (ja) | 1985-09-09 | 1987-03-14 | Riyoushiyoku Kenkyukai | イソラフイノ−ス及びその製造方法 |
| JP2711095B2 (ja) * | 1986-09-27 | 1998-02-10 | ユニチカ株式会社 | ビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤の製造法 |
| DK199887D0 (da) | 1987-04-15 | 1987-04-15 | Danisco Bioteknologi As | Gaerstamme |
| JP2518663B2 (ja) * | 1987-12-24 | 1996-07-24 | 株式会社ヤクルト本社 | ガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法 |
| US5149640A (en) * | 1988-12-22 | 1992-09-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing galactose transfer products |
| JP2819313B2 (ja) | 1989-07-18 | 1998-10-30 | 焼津水産化学工業株式会社 | Ｎ―アセチルラクトサミンの製造方法 |
| JP2819312B2 (ja) | 1989-07-18 | 1998-10-30 | 焼津水産化学工業株式会社 | Ｎ―アセチルラクトサミンの製造法 |
| CA2027835A1 (en) | 1990-01-19 | 1991-07-20 | William D. Prevatt | Strains of phaffia rhodozyma containing high levels of astaxanthin |
| JP2750767B2 (ja) | 1990-02-21 | 1998-05-13 | 雪印乳業株式会社 | 新規糖アルコール |
| JP2952439B2 (ja) | 1991-11-26 | 1999-09-27 | 株式会社ホーネンコーポレーション | 新規飲食品素材 |
| JPH05146296A (ja) | 1991-11-27 | 1993-06-15 | Yakult Honsha Co Ltd | β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド |
| JP2904687B2 (ja) | 1993-09-17 | 1999-06-14 | 雪印乳業株式会社 | 新規オリゴ糖 |
| FR2723963B1 (fr) | 1994-08-31 | 1997-01-17 | Gervais Danone Co | Preparation de produits fermentes par streptococcus thermophilus, enrichis en galacto-oligosaccharides et en beta-galactosidase |
| JP3246296B2 (ja) | 1995-11-09 | 2002-01-15 | 宇部興産株式会社 | 半溶融金属の成形方法 |
| JPH1023898A (ja) | 1996-07-10 | 1998-01-27 | Meiji Milk Prod Co Ltd | Ｎ−アセチルラクトサミン誘導体の新規な製造法 |
| KR100245383B1 (ko) | 1996-09-13 | 2000-03-02 | 정훈보 | 교차홈 형성 전열관 및 그 제조 방법 |
| JP2894293B2 (ja) | 1996-09-17 | 1999-05-24 | 不二製油株式会社 | ガラクタナーゼｓ−３９及びこれを産生するバチルスエスピーｓ−３９ |
| NL1010770C2 (nl) | 1998-12-09 | 2000-06-13 | Nutricia Nv | Preparaat dat oligosacchariden en probiotica bevat. |
| JP3049693B1 (ja) | 1998-12-10 | 2000-06-05 | ソフィアインターナショナル株式会社 | 端末ターミナル |
| FR2789086B1 (fr) | 1999-02-03 | 2003-01-31 | Alain Rambach | Procede de detection de bacteries cultivees en condition anaerobie |
| DE60126269T2 (de) * | 2000-05-26 | 2007-06-21 | Arla Foods Amba | Isolierte beta-galactosidase von bifidobacterium |
| EP1227152A1 (en) * | 2001-01-30 | 2002-07-31 | Société des Produits Nestlé S.A. | Bacterial strain and genome of bifidobacterium |
| GB0229015D0 (en) * | 2002-12-12 | 2003-01-15 | Novartis Nutrition Ag | New Compound |
| GB0303716D0 (en) * | 2003-02-18 | 2003-03-19 | Mars Uk Ltd | Food product and process |
| GB2412380B (en) * | 2003-06-30 | 2005-11-09 | Clasado Inc | Novel galactooligosaccharide composition and the preparation thereof |
| GB0522740D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Clasado Inc | Process for the production of oligosaccharides |
| GB0601901D0 (en) * | 2006-01-31 | 2006-03-08 | Product and Process | |
| GB0606112D0 (en) * | 2006-03-28 | 2006-05-03 | Product and process | |
| GB0809921D0 (en) * | 2008-05-30 | 2008-07-09 | Clasado Inc | Product and process therefor |
-
2005
- 2005-12-20 GB GBGB0525857.9A patent/GB0525857D0/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-12-19 AU AU2006328108A patent/AU2006328108B2/en not_active Ceased
- 2006-12-19 DK DK06820587.1T patent/DK1974028T3/da active
- 2006-12-19 PT PT68205871T patent/PT1974028E/pt unknown
- 2006-12-19 BR BRPI0620199-7A patent/BRPI0620199A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-12-19 CA CA2634273A patent/CA2634273C/en active Active
- 2006-12-19 US US12/086,834 patent/US8058047B2/en active Active
- 2006-12-19 JP JP2008546601A patent/JP5248324B2/ja active Active
- 2006-12-19 ES ES06820587T patent/ES2420522T3/es active Active
- 2006-12-19 CN CN2006800481537A patent/CN101370935B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-19 NZ NZ568827A patent/NZ568827A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-12-19 PL PL06820587T patent/PL1974028T3/pl unknown
- 2006-12-19 WO PCT/GB2006/004796 patent/WO2007071987A2/en active Application Filing
- 2006-12-19 UA UAA200809397A patent/UA97353C2/uk unknown
- 2006-12-19 RU RU2008129712/13A patent/RU2385931C1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-19 KR KR1020087017584A patent/KR101335396B1/ko active IP Right Grant
- 2006-12-19 EP EP06820587.1A patent/EP1974028B1/en active Active
-
2008
- 2008-06-19 ZA ZA200805361A patent/ZA200805361B/xx unknown
- 2008-06-19 MY MYPI20082213A patent/MY144029A/en unknown
- 2008-06-19 IL IL192342A patent/IL192342A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-06-20 NO NO20082802A patent/NO341747B1/no not_active IP Right Cessation
- 2008-07-04 GB GB0812296A patent/GB2447003B/en active Active
-
2009
- 2009-02-24 HK HK09101730.4A patent/HK1121780A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-07-29 CY CY20131100647T patent/CY1114173T1/el unknown
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DATABASE Geneseq [Online](2002.11.19), "Bifidobacterium longum NCC2705 ORF aminoacid sequence SEQ ID NO:919."XP002431983 retrieved from EBI accession no. GSP:ABP66175.Database accession no. ABP66175 , Dated: 01.01.0001 * |
| SCALABRINI P ET AL, "CHARACTERIZATION OF BIFIDOBACTERIUM STRAINS FOR USE IN SOYMILK FERMENTATION", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, (1998), vol. 39, no. 3, ISSN 0168-1605, s 213 - 219, XP000952364 , Dated: 01.01.0001 * |
| VAN DEN BROEK L A M ET AL, "Synthesis of alpha-galacto-oligosaccharides by a cloned alpha-galactosidase from Bifidobacterium adolescentis", BIOTECHNOLOGY LETTERS, (199905), vol. 21, no. 5, ISSN 0141-5492, pages 441 - 445, XP009083120 [X] 1-6,8-15,18,19 * the whole document, in particular p.443, left-handed column, last paragraph *, Dated: 01.01.0001 * |
| VAN DEN BROEK L A M ET AL, "Synthesis of alpha-galacto-oligosaccharides by a cloned alpha-galactosidase from Bifidobacterium adolescentis", BIOTECHNOLOGY LETTERS, (199905), vol. 21, no. 5, ISSN 0141-5492, s. 441 - 445, XP009083120 , Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8168414B2 (en) | Beta-galactosidase with transgalactosylating activity | |
| US8030049B2 (en) | Galactosidase with α-galactosyltransferase activity | |
| NO341747B1 (no) | DNA sekvens, vertcelle, rekombinant vektor, α-galaktosidase, enzym, fremgangsmåte for fremstilling av et enzym og disakkarid samt anvendelse av enzym og vertcelle | |
| MX2008008117A (en) | Alpha-galactosidase from bifidobacterium bifidum and its use | |
| MX2008009709A (es) | Galactosidasa con actividad alfa-galactosil-transferasa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |