JP5248324B2

JP5248324B2 - 製品及び方法

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Publication number: JP5248324B2
Application number: JP2008546601A
Authority: JP
Inventors: ツォーツィス、ジョージオス; グーラス、アタナシオス、ケー．; グーラス、テオドロス
Original assignee: クラサドインコーポレイテッド
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2026-12-19
Also published as: AU2006328108A1; GB2447003A; US8058047B2; CN101370935A; CA2634273A1; ZA200805361B; CN101370935B; RU2008129712A; JP2009519725A; PT1974028E; EP1974028A2; WO2007071987A3; NO341747B1; NO20082802L; KR20080093102A; GB0525857D0; US20090285933A1; MY144029A; GB2447003B; AU2006328108B2

Description

製品及び方法
本発明は、メリビオースをα−ガラクトビオース二糖類に変換可能なガラクトース転移活性を有する新規なα−ガラクトシダーゼに関する。特に、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）の最近発見された系統株から単離されたα−ガラクトシダーゼに関する。

本発明は特に、単離されたα−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列にコードされる酵素、及び前記ＤＮＡ配列又は前記ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを含む宿主細胞に関する。また、本発明は、α−ガラクトビオースを生産するための、ＤＮＡ配列にコードされた酵素、またはＤＮＡ配列もしくは組換えベクターを含む宿主細胞の使用に関する。

ビフィズス菌は、天然状態では下部消化管にコロニーを形成し、そこは、宿主及び上部消化管に存在する微生物が単糖及び二糖を優先的に消費するため、単糖及び二糖が少ない環境である。下部腸管で生存するために、ビフィズス菌は、細胞表面結合型、及び／又は細胞外型の種々のエキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼを生産し、これによって、多様な炭水化物を利用することができる。

加水分解酵素活性に加え、ビフィズス菌由来のいくつかの酵素は、トランスフェラーゼ活性も示す。グリコシダーゼのこの糖鎖転移活性は、種々のオリゴ糖の酵素合成に広範囲に使用されており、該オリゴ糖がビフィズス菌増殖促進因子として作用することが証明されている。

ビフィズス菌は、ラクトースの細菌代謝に関与するβ−ガラクトシダーゼ酵素を作り出すことが知られている。Ｍφｌｌｅｒ、Ｐ．Ｌ．らは、Ａｐｐｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、（２００１）、６２、（５）、２２７６〜２２８３において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株由来の３種類のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離と特性について記載している。彼らは、これら３種類のβ−ガラクトシダーゼ全てが、ガラクトース転移によって、β結合したガラクトオリゴ糖の形成を触媒できることを見出した。

Ｂ．ビフィダム以外のビフィズス菌のいくつかの種は、β−ガラクトシダーゼに加えて、α−ガラクトシダーゼを産生することが知られている。α−ガラクトシダーゼは、グリコシル加水分解酵素グループに属し、その基質特異性に基づいて２つのグループに分類することができる。すなわち、一方のグループは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、メリビオース、ラフィノース等の低分子糖類に特異的で、もう一方のグループは、低分子基質に加えて、グァーガム等のガラクトマンナンからガラクトースを遊離することができる。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの一系統株は、ラクトースをガラクトオリゴ糖の新規混合物へと変換するガラクトシダーゼ酵素活性を産生するものとして発見され、該混合物は、予期せぬことに、ガラビオース（Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ）を含む二糖類を最大３５％まで含む。該二糖は、志賀毒素のような毒素や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの病原体が腸壁へ接着することを防ぎ得る、接着防止剤として知られている（Ｐａｔｏｎ、ＪＣａｎｄＰａｔｏｎ、ＡＷ (１９９８)、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０〜４７９；Ｃａｒｌｓｓｏｎ、ＫＡ（１９８９)、Ａｎｎ．ＲｅｖｉｅｗｓＢｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９〜３５０を参照）。

前記Ｂ．ビフィダム株は、２００３年３月３１日に、受託番号ＮＣＩＭＢ４１１７１として、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ（アバディーン、英国）に寄託されている。該株については、英国特許第２４１２３８０号にも記載されている。

前記Ｂ.ビフィダム株は、メリビオースをα−ガラクトビオース二糖類に変換可能なα−ガラクトシダーゼを産生することが知られている。
英国特許第２４１２３８０号Ｍφｌｌｅｒ、Ｐ．Ｌ．他、Ａｐｐｌ＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．、（２００１)、６２、（５）、２２７６〜２２８３Ｐａｔｏｎ、ＪＣａｎｄＰａｔｏｎ、ＡＷ（１９９８）、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１１、４５０〜４７９Ｃａｒｌｓｓｏｎ、ＫＡ (１９８９)、Ａｎｎ．ＲｅｖｉｅｗｓＢｉｏｃｈｅｍ．、５８、３０９〜３５０

本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、または該タンパク質をコードする該ＤＮＡ配列に厳しい条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を提供する。該ＤＮＡ配列は、配列番号１に示される配列であるか、その断片もしくは縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）を含み得る。

「縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）」という用語は、配列番号１に対して少なくとも５０％の相同性、好ましくは、５０〜９８％の相同性、最も好ましくは７５〜９５％の相同性を示すＤＮＡ配列を意味するものとして解釈される。

このようなＤＮＡ配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に、６０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは２５％未満の変化を生じさせるような、ヌクレオチドの置換、付加または欠失を含んでいてもよい。

本発明の第２の態様によれば、上記ＤＮＡ配列によりコードされる酵素が提供される。該酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片を含んでいてもよい。

本発明の第３の態様によれば、上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。該ベクターは、細菌、酵母または真菌細胞等の宿主細胞内に取り込まれてもよい。もしくは、該ＤＮＡ配列が、このような宿主細胞内に取り込まれてもよい。適切な宿主細胞は、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｕｓ）又はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）等のバチルス属、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属から選択され得る。

上記に定義されるＤＮＡ配列によりコードされる酵素は、メリビオースを基質として用いて、オリゴ糖の混合物、特にα−ガラクトビオース二糖類の混合物を作り出す。

上記の酵素または宿主細胞は、腸内の健康を向上するための製品の一部を構成しうる、α−ガラクトビオース二糖類の産生に用いることができる。このような製品は、乳製品（例えば、液乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、脂肪補充粉乳（ｆａｔｆｉｌｌｅｄｍｉｌｋｐｏｗｄｅｒ）、ホエイパウダー等の乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等）、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅｐｒｏｄｕｃｔ）、プレバイオティック食品（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅｐｒｏｄｕｃｔ）、動物飼料、家禽飼料または他のあらゆる食料もしくは飲料から選択され得る。

もしくは、産生された二糖類を、病原体または病原体によって生産される毒素の腸壁への接着を防ぐための錠剤またはカプセルの形態を有する薬剤の調製に用いることもできる。このような薬剤は、例えば、しばしば通常の健康な腸内細菌叢を変化もしくは破壊してしまう場合がある一連の抗生物質療法に続いて、患者に投与される。

本発明の更なる態様によれば、上記酵素を発現させる条件下で、上記宿主細胞を適切な培養培地中で培養すること、および、該培養で産生された酵素を該培養物から回収することを含む、該酵素の製造方法が提供される。

また、本発明は、上記酵素または上記宿主細胞を、二糖類を形成させる条件下でメリビオース含有物質と接触させることを含む、ガラクトビオース二糖類の製造方法にも関する。

適切なメリビオース含有物質は、市販のメリビオース、ラフィノース、スタキオース、または大豆抽出物から選択され得る。

ゲノムＤＮＡは、Ｌａｗｓｏｎｅｔａｌ．（１９８９）ＦｅｍｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔｅｒｒｓ、６５、（１−２）、４１〜４５に記載の方法を用いて前記ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ４１１７１）から単離した。ＤＮＡを制限酵素で処理し、最長で１５ｋｂｐのサイズを有する断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターにライゲーションした。Ｐｓｔｌで処理したＢ．ビフィダム由来の染色体ＤＮＡから成るインサートを含むベクターを用いて、大腸菌細胞を形質転換した。α−ガラクトシダーゼ活性を有するクローンは、ｐ−ニトロフェニル、α−Ｄガラクトピラノシド及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉアガープレート上で、セレクションされた。２つのα−ガラクトシダーゼ陽性クローン（ｐＭｅｌＡ１及びｐＭｅｌＡ２）が同定された。

２つの陽性クローンを、ＥｃｒｏＲｌ、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで処理したところ、これら両クローンは、同一のインサートＤＮＡ断片を含むことを示唆する、類似した制限酵素処理パターンを示した。挿入したＤＮＡ断片ＭｅｌＡ１のＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶ．３．０ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法（ＲｕｓｓｅｌＰ．、２００２ｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＰｅａｒｓｏｎＥｄｕｃａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、１８７〜１８９）により行った。ＭｅｌＡ１のＤＮＡ配列を図１に示す（配列番号１）。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＯＲＦｆｉｎｄｅｒを用いて位置を特定した。細菌の遺伝暗号を用いて、フレームの長さを３００ｂｐと定めた。図１に示されるヌクレオチド配列を、６種類の全てのリーディングフレーム候補について翻訳し、α−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする７５９残基のアミノ酸からなる１種類のオープンリーディングフレームを同定した。翻訳配列を図２に示す（配列番号２）。

以下の実施例を参照し、本発明を更に説明する。

実施例１
材料及び方法
本試験において使用した全ての試薬および培地はＳｉｇｍａ（ドーセット、英国）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ペーズリー、英国）、Ｏｘｏｉｄ（ベージングストーク、英国）、Ｑｉａｇｅｎ（ウェストサセックス、英国）及びＰｒｏｍｅｇａ（サウサンプトン、英国）から入手した。

菌株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ４１１７１）は、Ｍｉｃｒｏｂａｎｋチューブ中の低温ビーズ上で−７０℃にて維持した。後の実験のため、該株を、ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＣｈａｌｇｒｅｎ（ＷＣ）アガー（Ｏｘｏｉｄ、英国）及びＴＰＹ培地（トリプチケースファイトン酵母エキス培地）上で回復させ、嫌気的条件下（ＣＯ₂およびＮ₂がそれぞれ８０％および２０％）にて３７℃で４８時間増殖させた。グラム染色によりコロニーの形態およびコンタミネーションがないことを確認した。

大腸菌株
本試験で用いた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＲＡ１１ｒ株及びＤＨ５ａ株は、常法に従い、ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アガーまたはＬＢブロス中で３７℃の好気的条件下でインキュベートし（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．ａｎｄＲｕｓｓｅｌｌＷ．Ｄ．（２００１）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）、必要な場合には、抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／または１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）及び４０μｌの２％Ｘ−α−ガラクトピラノシド（Ｘ−α−Ｇａｌ）、７μｌの２０％ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を、事前に作製した９０ｍｍアガープレート表面に塗付することにより補充した。

α−ガラクトシダーゼ欠損系統大腸菌ＲＡ１１ｒ株（Ｈａｎａｔｉｎｉｅｔａｌ、１９８３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、（３）、１８０７〜１８１２）（遺伝子型：ｍｅｌＡ^-Ｂ⁺，ｒｅｃＡ^-，ｌａｃＺ^-Ｙ^-）は、大腸菌Ｋ１２株の派生株であり、発現実験に用いた。大腸菌ＤＨ５ａ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペイズリー、英国）（遺伝子型：Ｆー φ８０ｌａｃＺΔＭ Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-、ｍ_k ^-）ｐｈｏＡｓｕｐＥ４４ｔｈｉ−１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１λ^-）は、α−ガラクトシダーゼ陽性株であり、全ての他の遺伝子操作に用いた。

発現実験に大腸菌ＲＡ１１ｒ株が選択されたのは、その遺伝子型によるものである。該株は、染色体ＤＮＡ上のｍｅｌＡ突然変異により、活性型のα−ガラクトシダーゼをコードしていない。しかし、該株は細胞質内へ糖（メリビオース）を輸送するのに必要な、つまり活性型のα−ガラクトシダーゼによる該糖の代謝に必要となる、活性型メリビオーストランスポーターを有している。ビフィドバクテリウム・ビフィダムのα−ガラクトシダーゼが細胞内で発現しているのか細胞外で発現しているのかは知られていない。従って、活性型メリビオーストランスポーターの存在は、α−ｇａｌ陽性クローンの同定、ひいてはα−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の単離に必須である。

さらに、該株は、インサートの安定性を増加する導入されたＤＮＡと宿主ＤＮＡとの組み換えを最小限にする、ｒｅｃＡ突然変異体である。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムからのゲノムＤＮＡ抽出
Ｌａｗｓｏｎｅｔａｌ．（１９８９）の方法を用いて、ビフィドバクテリウム・ビフィダム株（ＮＣＩＭＢ４１１７１）からゲノムＤＮＡを単離した。

当該方法において、プレートから、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中の０．５ｍｌＴＥＳバッファー中に細胞を回収した。１０μｌのリゾチーム／ムタノリシン混合液（４：１、リゾチーム１０ｍｇ／ｍｌ、ムタノリシン１ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合し、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、該細胞を１０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）および１０μｌＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）で処理し、混合し、６５℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの１０％ＳＤＳを加え、該細胞溶解液を穏やかに転倒混合し、さらに６５℃にて１５分間インキュベートして、０．６２ｍｌのフェノール／クロロフォルムを加えて乳濁液が形成されるまで転倒混合した。この細胞溶解物を６、５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上部水層を火炎滅菌した広径ブルーピペットチップを用いてエッペンドルフチューブに移した。抽出（除タンパク工程）は細胞残渣が完全に除かれるまで繰り返した。ＤＮＡは、１ｍｌの氷冷エタノールを加え、少なくとも３０分間の氷上でのインキュベーション、または−２０℃の冷凍庫に１晩保存することによって沈殿させた。ゲノムＤＮＡは１３、０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、乾燥後、５０μｌの滅菌１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中へ再懸濁した。

抽出されたＤＮＡはゲル電気泳動、及び２６０ｎｍにおける濃度測定によって解析した。該ＤＮＡは−２０℃で保存、もしくは−７０℃において長期保存され、分解の可能性を減らすために多数回の凍結融解を避けた。

ベクターＤＮＡの調製
本試験においては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ）を使用した。該クローニングベクターは、自身のプロモーターを欠く遺伝子の転写開始に必要なｌａｃプロモーターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）がコードすることから選択された。

上記ベクターは、以下の制限酵素を用いて処理した：ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、及びＥｃｏＲＩ。製造元の説明書に従い、ＤＮＡに対して１０倍過剰量の酵素を用いた（酵素のユニット数：ＤＮＡのμｇは、プラスミドＤＮＡ１μｇあたり酵素１０ユニット、または、プラスミドＤＮＡ０．５ｐｍｏｌあたり酵素１０ユニットである）。酵素を熱で不活性化（６５℃で２０分間）した後に、水平ゲル電気泳動解析により制限酵素処理パターンを解析した。

更に、仔牛腸管由来アルカリホスファターゼＣＩＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、サウザンプトン、英国）を製造元の説明書に従って用いてベクターを脱リン酸化した。脱リン酸化処理の効率は、該ベクターをセルフライゲーション（バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼを製造元の説明書に従って用いた）後に、ＤＨ５ａ細胞を形質転換することにより試験した。

ゲル中の単一の断片の存在は、ベクターの完全消化、及びベクターの制限消化が一箇所で起こったことを示す。ベクターの制限酵素処理が十分であることは、ライゲーションを行っていない分子で大腸菌ＤＨ５ａのコンピテント細胞を形質転換することによってもテストした。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレート上に形成されたコロニー数は、未消化分子及び後の実験において予想されるバックグラウンドの指標である。

ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
原核細胞ＤＮＡ内に高頻度に現れる６個のヌクレオチドから成る配列を認識する３種類の制限酵素を用いて、ゲノムＤＮＡを部分的に消化した。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩは、それぞれ５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ’３、５’Ｇ／ＧＡＴＣＣ’３、及び５’ＣＴＧＣＡ／Ｇ’３の配列を特異的に認識するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、これらの配列内で２本鎖を切断し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩについては、それぞれ、４個のヌクレオチドＡＡＴＴ、ＧＡＴＣから成る５’突出を生じさせ、ＰｓｔＩはＡＣＧＴから成る３’突出を生じさせる。

これらの酵素は、全て、２価のマグネシウムイオンの存在下でのみ活性を有しており、ＤＮＡを切断することができる。これらのイオンは、唯一必要とされる補因子であった。

ＤＮＡの制限酵素処理
ゲノムＤＮＡサンプルの制限酵素処理物の全てを３７℃で２時間インキュベートし、最後に６５℃で２０分間インキュベートして熱により不活性化させた。次いで、反応物を室温にて冷まし、適当量のローディングバッファーを加え、密封ガラスキャピラリーを用いて穏やかに混和した。次いで、この溶液を０．８％アガロースゲルのウェルにローディングし（４〜５ボルト／ｃｍの電力供給で１４〜１６時間）、消化したＤＮＡのサイズを、１ｋｂｐのＤＮＡスタンダード（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）のサイズを用いて推計した（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ. ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２００２））。

制限酵素処理後に生じた断片の精製
前記反応混合物及びアガロースゲルからの断片の精製は、Ｑｉａｇｅｎ製（ウェストサセックス、英国）のＱＩＡＥＸｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いて行った。プロトコルは、製造元のマニュアルに詳細に記載されている。

ＤＮＡのライゲーション及び形質転換
Ｑｉａｅｘｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した後、これらの断片をＣＩＡＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）ベクターにライゲーションした。ライゲーションの際には、表１に示すように、適切量のＤＮＡを滅菌した０.５ｍｌマイクロチューブに移した。

表１：ライゲーション混合物。チューブＡは、セルフライゲーションを起こしたベクターＤＮＡの数を表し、この数を、形質転換後の形質転換体の総数から引かなければならない。チューブＢは、ＤＮＡ断片とのベクターのライゲーションを表し、チューブＣは、形質転換効率を計算するための対照区を表す。

各ライゲーションの前に、断片精製過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。全てのライゲーション反応において、ベクター：インサートＤＮＡモル比を１：１とし、反応液は、Ｐｒｏｍｅｇａの説明書に従って調製した。

チューブＡおよびＢに、１．０μｌの１０倍濃度ライゲーションバッファーと０．５ＷｅｉｓｓユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国）を添加し、分子生物学用グレード水でライゲーション体積を１０μｌに調節した。チューブＣには１．０μｌの１０倍濃度ライゲーションバッファーを添加し、分子生物学グレードの水でライゲーション体積を１０μｌに調節した。

水と共にＤＮＡ断片をチューブに加え、次いで、調製過程で再アニーリングした粘着末端を融解するために、ＤＮＡ断片を４５℃で５分間温めた。残りのライゲーション試薬を添加する前に、該ＤＮＡを０℃に冷却し、その後、反応混合液を１６℃で一晩インキュベートした（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）。

（形質転換効率を低下させる原因となるライゲーション混合物を取り除くため）ライゲーションした断片のエタノール沈殿および精製を行った後、Ｈａｎａｈａｎの説明書に従って形質転換を行った。５μｌ中に約５０ｎｇのラーゲーションされたＤＮＡを含む溶液を１００μｌの大腸菌ＤＨ５ａコンピテント細胞に加えた。熱処理およびアンピシリン耐性遺伝子を発現させた後に、細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｘ−α−Ｇａｌ（４０μｌの２％Ｘ−α−Ｇａｌ）及びＩＰＴＧ（７μｌの２０％ＩＰＴＧ）を含むＬＢプレート表面に播種した。

各ライゲーション反応系による形質転換体の数を測定した。チューブＣから通常得られる形質転換体の数は、２×１０⁵〜１×１０⁶ｃｆｕ／μｇであり、一方でチューブＡから通常得られる形質転換体の数は、５００〜６００ｃｆｕ／μｇであった。チューブＡにおける形質転換体の数は、ベクターＤＮＡの効率的な処理を示すものであった。チューブＢでの形質転換体の数は、２〜４×１０⁴ｃｆｕ／μｇの範囲内にあった。

形質転換体の数
ＰｓｔＩ処理した染色体ＤＮＡのライゲーション混合液からは、スクリーニングを行った約２５００個の形質転換体の中から２個のα−ガラクトシダーゼ陽性クローン（ｐＭｅｌＡ１とｐＭｅｌＡ２）が得られた。一方ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した染色体ＤＮＡの場合では、スクリーニングを行った合計約４０００個の形質転換体の中から、陽性クローンを得ることはできなかった。

陽性クローンの制限酵素処理
２つのＰｓｔＩ陽性クローンをＥｃｒｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、及びＫｐｎＩ制限酵素で処理した。制限酵素ＥｃｒｏＲＩ、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩによる消化は、類似する制限酵素処理パターンを示し、１つの約５ｋｂｐの断片（目的の遺伝子）および１つの約３ｋｂｐの断片（プラスミドＤＮＡ）は、これらの酵素が同じ場所で切断したことを示す。ＨｉｎｄＩＩＩでは、６．５ｋｂｐの断片と、１．５ｋｂｐの断片を生じたが、ＳｍａＩとＫｐｎＩでは、約８ｋｂｐのサイズを有する１つの断片が生じたことから、これらは、ただ一箇所でのみ切断したことが示された。両プラスミドが類似する制限酵素パターンを有することは、これらが同一のインサートＤＮＡ断片を含むことを示していた。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶ．３．０ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシチェーンターミネーション法により行い、キャピラリー電気泳動が組み込まれた、蛍光に基づくＤＮＡ解析システムであるＡＢＩＰｒｉｓｍ３１００を用いて解析を行った。

インサートされたＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端は、ベクターに特異的なプライマーを用いて配列決定された。インサートは、ＧｅｎｏｍｅＰｒｉｍｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＧＰＳ−１）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、英国）を用いて更に配列決定された。ＧＰＳ−１は、ＴＮ７トランスポゾンに基づくｉｎｖｉｔｒｏシステムであり、ＴｎｓＡＢＣトランスポゼースを用いて、ＤＮＡ標的内にランダムにトランスポゾンを挿入する。製造元の説明書に従い、ドナー：標的ＤＮＡを１：４の質量比で用いた。標的プラスミドにトランスプライマーを挿入した後に配列決定用に単離されたプラスミドの数は、２５個であった。この数は、製造元の説明書に従って計算したものであり、５倍のカバー率であると推測される。

トランスプライマーエレメントの両末端の特異プライミング部位により、挿入部位における標的ＤＮＡの両鎖の配列決定が可能になる。

配列決定反応混合液は、約４００〜６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、３．２ｐｍｏｌのプライマー溶液及び４μｌのＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液を含む。

オープンリーディングフレームの同定
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置は、ＮＣＢＩのＯＲＦｆｉｎｄｅｒを用いて特定された。細菌の遺伝暗号を用い、フレームの長さを３００ｂｐと定めた。ヌクレオチド配列は、６種類の全てのフレーム候補を翻訳し、α−ガラクトシダーゼと推定される配列をコードする７５９個のアミノ酸から成るオープンリーディングフレームを同定した（翻訳結果を図２に示す）。開始コドン及び終止コドンが確認された。

プラスミドｐＭｅｌＡ１上のビフィドバクテリウムα−ガラクトシダーゼ遺伝子を、クローニングベクターの隣接領域に位置する誘導性の大腸菌ｌａｃＺプロモーターからの発現を通常抑制する増殖条件下で、大腸菌内で発現させた。この観察により、α−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流の内在性ビフィズス菌配列が、大腸菌内で転写開始シグナルとして機能しうることが示された。

転写開始点は太字のイタリック体文字で示される。上記の結果は、前記遺伝子が、自身の転写プロモーターにより調節されることを示す。

実施例２
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１から単離してクローニングしたα−ガラクトシダーゼ酵素を用いた、大腸菌宿主（ＲＡ１１株）内における合成
他に記載のない限り、以下に記載する合成は、細胞透過性を増加させ、その細胞膜を破壊することにより細胞を増殖不能にするために、大腸菌試料（１０、０００ｇの遠心により回収）を２０００ｐｐｍの濃度のトルエンで処理した大腸菌ＲＡ１１宿主細胞を用いて行った。該大腸菌試料は、実施例１「大腸菌株」に記載の通りに調製した。

クローニングした酵素を用いた合成
α−ガラクトシダーゼを用いた合成は、初期のメリビオース濃度を４０％（ｗ/ｗ）とした基質濃度で行った。合成溶液は、ｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸バッファー中に調整した。合成は、１５０ｒｐｍの振とう水浴中で４０℃にて行った。特定の酵素試料の異なるｐＨ値での活性測定（基質としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用）に基づいて、特定の酵素の最適ｐＨを選択した。

α−ガラクトシダーゼ合成に際しては、２ｍｌの大腸菌ＲＡ１１細胞懸濁液（０．３Ｕ／ｍｌの活性を有する）を遠心（１０、０００ｇ）して、大腸菌試料を回収し、上清を捨てた。合成を行うため、該大腸菌試料を１ｇの４０％（ｗ／ｗ）メリビオース基質溶液に再懸濁した。

合成において、混合物中に存在した種々の糖の濃度を図４に示す。Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１からクローニングしたα−ガラクトシダーゼにより合成されたガラクトオリゴ糖混合物の、パルスアンペロメトリック検出器と連結した高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）のクロマトグラムを図５に示す。最適な合成時点におけるガラクトオリゴ糖混合物の糖濃度を表１に示す。

表１．４０％（ｗ/ｗ）の初期メリビオース濃度でのα−ガラクトオリゴ糖合成における、最高のオリゴ糖濃度が観察された時点における炭水化物組成。

Ｍｅｌ：メリビオース、Ｇｌｃ：グルコース、Ｇａｌ：ガラクトース、ＤＰ：重合度

図１は、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダム由来α−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。開始コドンと終止コドンは太字で表わされる。図２は、図１のヌクレオチド配列と酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図３は、図２のアミノ酸配列（配列番号２）の最初の５４０アミノ酸を示す。図４は、α−ガラクトシダーゼおよび基質として０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）の中の４０％（ｗ／ｗ）のメリビオース用いたα−ガラクトオリゴ糖合成における経時的反応を示すグラフである。図５は、基質として０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中の４０％（ｗ／ｗ）のメリビオースを用いて、Ｂ．ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１由来のα−ガラクトシダーゼによって合成したα−ガラクトオリゴ糖混合物の高速陰イオン交換クロマトグラムである。（ＧＩｃ＝グルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｍｅｌ＝メリビオース、ＤＰ＝重合度）。破線の矢印は、ガラクトオリゴ糖産物を示す。

Claims

配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
前記ＤＮＡが、配列番号１に示されるＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡにコードされる酵素。
配列番号２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２に示されるアミノ酸配列の断片であって、メリビオースをα−ガラクトビオース二糖類に変換するα−ガラクトース転移酵素活性を有する断片を含む酵素。
配列番号２に定められるアミノ酸配列を有するα−ガラクトシダーゼ。
請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項６に記載の組換えベクター。
請求項１または請求項２に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
請求項６または請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞または真菌細胞である、請求項８または請求項９に記載の宿主細胞。
前記細胞が、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、エシェリキア属、バチルス属、及びアスペルギルス属から成る群より選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
前記細胞が、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、バチルス・スブチリス、バチルス・サーキュランス及びアスペルギルス・ニガーから成る群から選択される、請求項１１に記載の宿主細胞。
α−ガラクトビオース二糖類の製造のための、請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素または請求項８〜１２のいずれか１項に記載の細胞の使用。
液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等の乳製品、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬物から成る群より選択される製品の一部となるα−ガラクトビオース二糖類の製造のための、請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素または請求項８〜１２のいずれか１項に記載の細胞の使用。
液乳、乾燥粉乳、乳幼児用ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品等の乳製品、フルーツジュース等の飲料、乳児食、シリアル、パン、ビスケット、菓子類、ケーキ、食品サプリメント、栄養サプリメント、プロバイオティック食品、プレバイオティック食品、動物飼料、家禽飼料及び薬物から成る群より選択される製品の製造のための、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素を発現させる条件下で、適切な培養培地中で培養すること、および、前記培養物から生じた酵素を前記培養物から回収することを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素の製造方法。
二糖の製造方法であって、請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素または請求項８〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を、メリビオース溶液と接触させることを含む該方法。