ES2420522T3 - alfa-Galactosidasa de Bifidobacterium bifidum y su uso - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en SEQ. ID.NO: 2.

Description

alfa-Galactosidasa de Bifidobacterium bifidum y su uso

La presente invención se refiere a una α-galactosidasa novedosa con actividad transgalactosilante capaz de convertir melibiosa en disacáridos de α-galactobiosa. En particular, se refiere a una α-galactosidasa aislada de una cepa descubierta recientemente de Bifidobacterium bifidum.

La invención se refiere en particular a secuencias de ADN que codifican la enzima α-galactosidasa aislada, a la enzima codificada por dicha secuencia de ADN y a una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN

o que contiene un vector recombinante que incorpora la secuencia de ADN. La invención se refiere también al uso de la enzima codificada por la secuencia de ADN, o al hospedador celular que contiene la secuencia de ADN o vector recombinante, para producir α-galactobiosa.

Las bifidobacterias colonizan de forma natural el tracto intestinal inferior, un entorno que es pobre en monosacáridos y disacáridos, puesto que dichos azúcares se consumen preferentemente por el hospedador y los microbios presentes en el tracto intestinal superior. Para sobrevivir en el tracto intestinal inferior, las bifidobacterias producen diversas clases de exoglucosidasas y endoglucosidasas en formas unida a superficie y/o extracelular mediante las que pueden utilizar diversos carbohidratos.

Además de la actividad hidrolasa, algunas enzimas de bifidobacterias muestran actividad transferasa. Esta actividad de transglucosilación de glucosidasas se usa extensamente para la síntesis enzimática de diversos oligosacáridos que han probado actuar como factores promotores del crecimiento de bifidobacterias.

Es conocido que miembros de bifidobacterias producen enzimas β-galactosidasas que están implicadas en el metabolismo bacteriano de la lactosa. Moller, P.L. et al en Appl & Environ. Microbial., (2001), 62, (5), 22762283 describen el aislamiento y caracterización de tres genes de β-galactosidasa de una cepa de Bifidobacterium bifidum. Encontraron que las tres β-galactosidasas eran capaces de catalizar la formación de galactooligosacáridos β-ligados mediante transgalactosilación.

Es conocido que algunas especies de bifidobacterias, pero no B. bifidum, producen α-galactosidasas así como βgalactosidasas. Las α-galactosidasas pertenecen al grupo de las glucosilo hidrolasas y pueden clasificarse en dos grupos basándose en su especificidad de sustrato, concretamente, un grupo es específico de sacáridos pequeños tales como p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido, melibiosa y rafinosa, y el otro grupo puede liberar galactosa de galactomananos tales como goma guar, además de sustratos pequeños.

"Secuencia aminoacídica de ORF de Bifidobacteria longum NCC2705 de SEQ ID No. 919" de la base de datos Geneseq [Online] de 19 de noviembre de 2002, XP002431983, recuperada del nº de acceso a EBI GSP: ABP66175, nº de acceso a la base de datos ABP 66175, da a conocer una secuencia aminoacídica de B. longum.

"Alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22)" de la base de datos UniProt [Online] de 1 de noviembre de 1999, XP002431984 recuperada del nº de acceso a EBI UNIPROT: Q9XCX2, nº de acceso a la base de datos Q9XCX2 y van den Broek

L.A.M. et al. en Biotechnology Letters, 21(5), (1999) 441-445, dan a conocer una secuencia de α-galactosidasa de Bifidobacterium adolescentis.

"Glucósido hidrolasa, clon GH-D” de la base de datos UniProt [Online] de 27 de septiembre de 2005, XP002431985 recuperada del nº de acceso a EBI UNIPROT: Q40Z83, nº de acceso a la base de datos Q40Z83, da a conocer una secuencia de glucósido hidrolasa.

Scalabrini P. et al. en J. Food Microbiology, 39(3), (1998), 213-219 describen el análisis en cepas de Bifidobacterium de su actividad α-galactosidasa y de la producción de ácidos láctico y acético para determinar su potencial para uso en la producción de leche de soja fermentada.

Van Laere V.M.J. et al. en Applied Microbiology and Biotechnology, 52(5), (1999), 681-688 describen una αgalactosidasa de Bifidobacterium adolescentis.

Lamoureux L et al. en J. Dairy Science, 85(5), (2002), 1058-1069 describen la producción de oligosacáridos en yogur que contiene bifidobacterias y cultivos de yogur.

Se ha encontrado que una cepa de Bifidobacterium bifidum es capaz de producir una actividad de enzima galactosidasa que convierte la lactosa en una mezcla novedosa de galactooligosacáridos que contiene inesperadamente un 35% de disacáridos que incluyen galabiosa (Gal (α1-6)-Gal). Este disacárido es conocido (véanse Paton, J.C. y Paton, A.W. (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser un antiadhesivo capaz de evitar la adhesión de toxinas, por ejemplo toxina Shiga y patógenos tales como E. coli, a la pared del intestino.

Esta cepa de B. bifidum se depositó con el número de acceso NCIMB 41171 en la National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, RU el 31 de marzo de 2003. Se describe también en la patente de RU nº 2.412.380.

Se ha encontrado que esta cepa de B. bifidum produce una α-galactosidasa que es capaz de convertir melibiosa en disacáridos de α-galactobiosa.

Según la invención, se proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en la in SEQ. ID NO: 2. La secuencia de ADN se da en SEQ. ID NO: 1.

5 Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una enzima codificada por una secuencia de ADN como se define anteriormente. Dicha enzima puede comprender la secuencia aminoacídica dada en SEQ. ID NO: 2.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector recombinante, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una secuencia de ADN como se define anteriormente. Dicho vector puede incorporarse a una célula hospedadora tal como una célula bacteriana, de levadura o fúngica. Como alternativa, la secuencia de

10 ADN puede incorporarse a dicha célula hospedadora. Puede seleccionarse una célula hospedadora adecuada de Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus o Bacillus, por ejemplo Bacillus subtilis o Bacillus circulans, Escherichia y Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.

Usando melibiosa como sustrato, la enzima codificada por la secuencia de ADN como se define anteriormente produce una mezcla de oligosacáridos, en particular disacáridos de α-galactobiosa.

15 La enzima o la célula hospedadora como se describe anteriormente pueden usarse para producir disacáridos de αgalactobiosa, que pueden formar parte de un producto para mejorar la salud intestinal. Dicho producto puede seleccionarse del grupo consistente en productos lácteos (por ejemplo, leche líquida, leche desecada en polvo tal como leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche en polvo enriquecida con grasas, suero en polvo, leche para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso y productos lácteos fermentados), bebidas tales como

20 zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves o incluso cualquier otro alimento o bebida.

Como alternativa, los disacáridos así producidos pueden usarse para la preparación de un medicamento, por ejemplo en forma de comprimido o cápsula, para evitar la adhesión de patógenos o toxinas producidas por

25 patógenos a la pared intestinal. El medicamento puede administrarse a un paciente, por ejemplo, después de un ciclo de tratamiento antibiótico, que a menudo altera o incluso destruye la flora intestinal sana normal.

Según un aspecto adicional más de la invención, se proporciona un proceso para producir una enzima como se define anteriormente que comprende cultivar una célula hospedadora como se define anteriormente en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de la enzima y la recuperación de la enzima o productos

30 enzimáticos resultantes del cultivo.

La invención está también dirigida a un proceso para producir disacáridos de galactobiosa que comprende poner en contacto la enzima como se define anteriormente o una célula hospedadora como se define anteriormente con un material que contiene melibiosa en condiciones que conduzcan a la formación de los disacáridos.

El material que contiene melibiosa adecuado puede seleccionarse de melibiosa, rafinosa, estaquiosa 35 comercialmente disponibles o como un extracto de soja.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica (SEQ. ID NO: 1) de α-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum con el codón de inicio y terminación indicados en letra en negrita;

la Figura 2 muestra la secuencia nucleotídica de la Figura 1 con la secuencia aminoacídica (SEQ. ID NO: 2) de la 40 enzima;

la Figura 3 muestra los 540 primeros aminoácidos de la secuencia aminoacídica (SEQ. ID NO: 2) de la Figura 2;

la Figura 4 es una gráfica que muestra el curso temporal de la reacción durante la síntesis de αgalactooligosacáridos con α-galactosidasa y 40% (p/p) de melibiosa en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0 como sustrato; y

45 la Figura 5 muestra un cromatograma de intercambio aniónico de alta resolución de la mezcla de αgalactooligosacáridos sintetizada por α-galactosidasa a partir de B. bifidum NCIMB 41171 usando 40% (p/p) de melibiosa en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0 como sustrato. (Glc = glucosa, Gal = galactosa, Mel = melibiosa, DP = grado de polimerización). Las flechas de puntos designan los productos de galactooligosacáridos.

Se aisló ADN genómico de la cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) usando el método de Lawson et al.

50 (1989) Fems. Microbiol. Letters, 65, (1-2), 41-45. Se digirió el ADN con enzimas de restricción y se ligaron los fragmentos que tenían un tamaño máximo de 15 kpb con el vector pBluescript KS(+). Se transformaron células de E. coli con un vector que contenía inserciones consistentes en ADN cromosómico digerido con PstI de B. bifidum.Se seleccionaron clones con actividad α-galactosidasa en placas de agar Luria Bertani que contenían p-nitrofenil-α-Dgalactopiranósido e isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG). Se identificaron dos clones positivos de α-galactosidasa (pMelA1 y pMelA2).

Se digirieron los dos clones positivos con EcoRI, PstI y Bam HI y mostraron un patrón de restricción similar, indicando que ambos contenían el mismo fragmento de ADN insertado. Se efectuó la secuenciación de ADN del

5 fragmento de ADN insertado MelA1 usando el método de terminación de cadena con didesoxi de Sanger (Russel P., 2002 “iGenetics”, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) usando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems, EE.UU.). La secuencia de ADN de MelA1 se muestra en la Figura 1 (SEQ. ID NO: 1).

Se localizó el marco abierto de lectura (ORF) usando el buscador de ORF de la NCBI (National Center of

10 Biotechnology Information). Se usó el código genético bacteriano y se determinó que la longitud del marco era de 300 pb. Se tradujo la secuencia nucleotídica de la Figura 1 en todos los 6 posibles marcos de lectura y se identificó un marco abierto de lectura de 759 aminoácidos que codificaba una presunta α-galactosidasa. Se muestra la traducción en la Figura 2 (SEQ. ID NO: 2).

La presente invención se describirá adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos.

15 Ejemplos 1

Materiales y métodos

Todos los productos químicos y preparaciones de medios usados a lo largo de este estudio se obtuvieron de Sigma (Dorset, RU), Invitrogen (Paisley, RU), Oxoid (Basingstoke, RU), Qiagen (West Sussex, RU) y Promega (Southampton, RU).

20 Cepas bacterianas

La cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) se mantuvo en perlas criogénicas en tubos Microbank a -70ºC. Para los experimentos posteriores, se revivió la cepa en agar Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, RU) y medio TPY (medio de tripticasa-fitona-extracto de levadura) y se cultivó anaeróbicamente (CO2 y N2 a 80 y 20% de composición, respectivamente) a 37ºC durante 48 horas. Se ensayaron la morfología de las colonias y la ausencia de

25 contaminación por tinción de Gram.

Cepas de E. coli

Se incubaron comúnmente las cepas de Escherichia coli RA11r y DH5a usadas en este estudio en condiciones aeróbicas a 37ºC en agar o caldo Luria Bertani (LB) (Sambrook J. y Russell, W.D., (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York) y, cuando fue necesario, se suplementaron

30 con antibióticos (ampicilina 100 μg/ml y/o cloranfenicol 15 μg/ml) y 40 μl de X-α-galactopiranósido al 2% (X-α-Gal) y 7 μl de (isopropil-β-D-tiogalactósido) IPTG al 20%, que se aplicaron sobre la superficie de una placa de agar de 90 mm prefabricada.

La cepa deficiente en α-galactosidasa E. coli RA11r (Hanatani et al., 1983, J. Biol. Chem., 259, (3), 1807-1812) (genotipo: melA-B+, recA-, lacZ-Y-) es un derivado de E. coli K12 y se usó en experimentos de expresión. La cepa E.

35 coli DH5a (Invitrogen, Paisley, RU) (genotipo: F φ80lacZΔM Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ-) es una cepa positiva de α-galactosidasa y se usó para todas las demás manipulaciones genéticas.

La elección de la cepa de E. coli RA11r para experimentos de expresión se realizó según su genotipo. Esta cepa no codifica una α-galactosidasa activa debido a la mutación de melA en su ADN cromosómico. Sin embargo, esta cepa

40 tiene un transportador de melibiosa activo que es necesario para el transporte de azúcares (melibiosa) al citoplasma y por tanto para el metabolismo de los mismos por α-galactosidasas activas. No se sabía si la α-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum se expresaba intracelular o extracelularmente. Así, la existencia de un transportador de melibiosa activo era esencial para la identificación de los clones positivos de α-gal y por tanto el aislamiento de genes que codifican α-galactosidasa.

45 Además, esta cepa es un mutante de recA que minimiza la recombinación de ADN introducido con ADN hospedador, aumentando por tanto la estabilidad de los insertos.

Extracción de ADN genómico de Bifidobacterium bifidum

Se aisló ADN genómico de la cepa de Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) usando el método de Lawson et al. (1989).

50 Según este método, se recogieron las células de las placas en 0,5 ml de tampón TES en viales Eppendorf de 1,5 ml. Se añadieron 10 μl de mezcla de lisozima/mutanolisina (4:1, lisozima 10 mg/ml; mutanolisina 1 mg/ml) y se mezcló entonces la mezcla y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se trataron entonces las células con 10 μl de proteinasa K (a 20 mg/ml) y 10 μl de ARNasa (10 mg/ml), se mezclaron y se incubaron durante 1 hora a 65ºC. Después de la

incubación, se añadieron 100 μl de SDS al 10%, se mezclaron suavemente los lisados celulares mediante inversión y se incubaron durante otros 15 minutos a 65ºC, seguido de la adición de 0,62 ml de fenol/cloroformo y se mezclaron mediante inversión hasta que se formó una emulsión. Se centrifugó el lisado celular a 6.500 rpm durante 10 minutos y se transfirió la capa acuosa superior a un vial Eppendorf limpio usando una punta de pipeta azul de boca ancha. Se repitió la extracción (etapa de desproteinización) hasta que se eliminó completamente el desecho celular. Se precipitó el ADN mediante la adición de 1 ml de etanol enfriado con hielo seguido de incubación durante al menos 30 minutos en hielo o se almacenó durante una noche en un congelador a -20ºC. Se recuperó el ADN genómico mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 5 minutos y, después de secar, se resuspendió en 50 μl de Tris-HCl 10 mM estéril a pH 8.

Se analizó el ADN extraído mediante electroforesis en gel y se midió la concentración a 260 nm. Se almacenó a -20 o -70ºC durante periodos prolongados de tiempo y se evitó una descongelación-congelación múltiples para reducir la posibilidad de degradación.

Preparación de ADN de vector

El vector usado a lo largo de este estudio era pBluescript KS(+) (Stratagene, North Torrey Pines Road). Se eligió este vehículo de clonación debido a que el promotor lac, que pBluescript KS (+)codifica, es necesario para la iniciación de la transcripción de genes que carecen de su propio promotor.

Se digirió el vector con las siguientes enzimas de restricción: PstI, BamHI y EcoRI según las instrucciones del fabricante, usando un exceso de 10 veces de enzima frente a ADN (unidades enzimáticas: μg de ADN iguales a 10 unidades de enzima por 1 μg de ADN de plásmido o a 10 unidades enzimáticas por 0,5 pmol de ADN de plásmido). Después de inactivación térmica de la enzima (20 min a 65ºC), se analizaron los patrones de restricción mediante análisis de electroforesis en gel horizontal.

Se desfosforilaron adicionalmente los vectores con fosfatasa alcalina intestinal de ternero CIAP (Promega, Southampton, RU) según las instrucciones del fabricante. Se ensayó la eficacia del tratamiento mediante el autoligamiento del vector (con ADN ligasa del bacteriófago T4 según las instrucciones del fabricante) después de transformación en células DH5a.

La presencia de un solo fragmento en el gel indicaba la digestión completa del vector y su única digestión de restricción. Se ensayó también la digestión suficiente del vector transformando moléculas no ligadas en células E. coli DH5a competentes. El número de colonias formadas en placas de agar LB suplementadas con ampicilina (100 μg/ml) era un indicador de las moléculas no digeridas y del fondo esperado durante los experimentos posteriores.

Construcción de una colección de ADN genómico

Se digirió parcialmente ADN genómico con tres enzimas de restricción que reconocen secuencias hexanucleotídicas de aparición frecuente en ADN procariótico. EcoRI, BamHI y PstI son endonucleasas de restricción de tipo II que reconocen específicamente las secuencias 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3 y 5'CTGCA/G'3, respectivamente, y causan roturas de la cadena doble en estas secuencias, generando salientes en 5’ de 4 nucleótidos, AATT, GATC para EcoRI y BamHI, respectivamente, y salientes en 3’, ACGT para PstI.

Todas estas enzimas eran activas y capaces de escindir ADN solo en presencia de iones de magnesio divalentes. Estos iones eran el único cofactor necesario.

Digestión de restricción de ADN

Se incubaron todas las digestiones de restricción de las muestras de ADN genómico durante 2 horas a 37ºC y finalmente se inactivaron térmicamente a 65ºC durante 20 minutos. Se enfriaron entonces las reacciones a temperatura ambiente y se añadió la cantidad apropiada de tampón de carga, seguido de una suave agitación con un capilar de vidrio sellado. Se cargaron entonces las disoluciones en pocillos de gel de agarosa al 0,8% (alimentación de 4-5 V/cm durante 14-16 horas) y se estimó el tamaño del ADN digerido con el de patrones de ADN de 1 kpb (Promega, RU) (Sambrook J. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2002)).

Purificación de los fragmentos generados después de digestión de restricción

Se realizó la purificación de fragmentos de las mezclas de reacción y los geles de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAEX de Qiagen (West Sussex, RU). Los protocolos se describen con detalle en el manual del fabricante.

Ligamiento y transformación de ADN

Después de la purificación de los fragmentos de ADN con el kit de extracción de gel Qiaex, se ligaron con vector pBluescript KS (+) tratado con CIAP. Para el ligamiento, se transfirieron cantidades apropiadas de ADN a tubos de microcentrífuga estéril de 0,5 ml como se muestra en la Tabla 1.

Tubo

ADN

A

Vector (15 fmoles [~29,7 ng])

B

Vector (15 fmoles ~29,7 ng de ADN) más inserto extraño (15 fmoles ~69,3 ng)

C

pUC de control (0,056 fmoles [~100 pg])

La relación molar del vector de ADN de plásmido a fragmento de ADN de inserto debería ser de ~1:1 en la reacción de ligamiento. La concentración de ADN final debería ser de ~10 ng/μl.

Tabla 1: Mezclas de ligamiento. El tubo A muestra el número de ADN de vector autoligados, que debe restarse del número total de transformantes después de la transformación. El tubo B muestra el ligamiento del vector con los fragmentos de ADN y el tubo C muestra el control para calcular la eficacia de transformación.

Antes de cada ligamiento, se calentaron los fragmentos de ADN a 45ºC durante 5 minutos para fundir cualquier extremo cohesivo que se reasociara durante la preparación de fragmentos. Se eligió una relación molar de vector:inserto de ADN de 1:1 para todas las reacciones de ligamiento y se realizó el montaje de la reacción según las instrucciones de Promega.

Se añadieron 1,0 μl de tampón de ligamiento 10x y 0,5 unidades Weiss de ADN ligasa T4 (Promega, RU) a los tubos A y B, y se ajustó el volumen de ligamiento a 10 μl con agua de pureza para biología molecular. Se añadió 1,0 μl de tampón de ligamiento 10x a los tubos C y se ajustó el volumen de ligamiento a 10 μl con agua de pureza para biología molecular.

Se añadieron fragmentos de ADN a los tubos junto con el agua y se calentaron entonces a 45ºC durante 5 minutos, para fundir cualquier extremo cohesivo que se reasociara durante la preparación. Se enfrió el ADN a 0ºC antes de añadir el resto de los reactivos de ligamiento y se incubaron las mezclas de reacción durante una noche a 16ºC (Sambrook y Russell, 2001).

Después de la precipitación con etanol y la purificación de los fragmentos ligados (para eliminar la mezcla de ligamiento que puede causar una reducción de la eficacia de transformación), se efectuaron transformaciones según las instrucciones de Hanahan. Se añadieron ~50 ng de ADN ligado en 5 μl de disolución a 100 μl de células E. coli RA11r competentes. Después del tratamiento térmico y la expresión del gen de resistencia a ampicilina, se distribuyeron las células por la superficie de placas LB que contenían ampicilina (100 μg/ml), X-α-Gal (40 μl de X-α-Gal al 2%) e IPTG (7 μl de IPTG al 20%).

Se midió el número de transformantes para cada reacción de ligamiento. El número de transformantes obtenido comúnmente del tubo C era de 2x105-1x106 ufc/μg, mientras que del tubo A era de 500-600 ufc/μg. El número de transformantes en el tubo A era una indicación de la eficacia de tratamiento del ADN de vector. El número de transformantes en el tubo B estaba en el intervalo de 2-4x104 ufc/μg.

Número de transformantes

Las mezclas de ligamiento con ADN cromosómico con PstI daban lugar a dos clones positivos de α-galactosidasa (pMelA1 y pMelA2) de aproximadamente 2500 transformantes examinados, mientras que el ADN cromosómico tratado con EcoRI y BamHI no daba ningún clon positivo de aproximadamente 4000 transformantes examinados totales.

Digestión de clon positivo

Se digirieron los dos clones positivos de PstI con las enzimas de restricción EcoRI, PstI, BamHI, HindIII, SmaI y KpnI. Las enzimas de restricción EcoRI, PstI y BamHI mostraron un patrón de restricción similar, un fragmento de ~5 kpb (gen de interés) y otro de -3 kpb (ADN de plásmido), indicando que estas enzimas cortaban en las mismas posiciones. HindIII daba un fragmento de 6,5 kpb y un fragmento de 1,5 kpb, mientras que las enzimas SmaI y KpnI daban un fragmento de ~8 kpb de tamaño, indicando que cortaban en solo una posición. Los patrones de restricción similares para ambos plásmidos eran indicativos de que ambos contienen el mismo inserto de fragmento de ADN.

Secuenciación de ADN

Se efectuó la secuenciación de ADN con el método de terminación de cadena con didesoxi de Sanger usando el kit secuenciador cíclico BigDye Terminator v.3.0 (Applied Biosystems, EE.UU.) y se analizó con ABI Prism 3100, un sistema de análisis de ADN basado en la fluorescencia que incorpora electroforesis capilar.

Se secuenciaron los extremos 5’ y 3' de los fragmentos de ADN insertados con cebadores específicos de vector. Se secuenciaron adicionalmente los insertos usando Genome Priming System (GPS-1) (New England Biolabs, RU). El GPS-1 es un sistema in vitro basado en el transposón TN7 que usa la transposasa TnsABC para insertar un transposón aleatoriamente en el ADN diana. Se usó una relación de masa de ADN donante:diana de 1:4 según las instrucciones del fabricante. El número de plásmidos aislados para secuenciar después de la inserción del Transprimer en el plásmido diana era de 25. El número se calculó según las instrucciones del fabricante y supone una amplitud de cobertura de 5 veces.

Los sitios de cebado únicos en ambos extremos del elemento Transprimer permitieron la secuenciación de ambas hebras del ADN diana en la posición de inserción.

La mezcla de reacción de secuenciación contenía aproximadamente 400-600 ng de ADN de plásmido, 3,2 pmol de disolución cebadora y 4 μl de disolución de BigDye Terminator.

Identificación del marco abierto de lectura

Se localizó el marco abierto de lectura (ORF) usando el buscador de ORF de NCBI. Se usó el código genético bacteriano y se determinó que la longitud del marco era de 300 pb. Se tradujo la secuencia nucleotídica en todos los 6 marcos posibles y se identificó un marco abierto de lectura de 759 aminoácidos que codifica una presunta αgalactosidasa (se muestra la traducción en la Figura 2). Se confirmaron el codón de inicio y terminación.

Se expresó el gen de α-galactosidasa de Bifidobacterium en el plásmido pMelA1 en E. coli en condiciones de crecimiento que normalmente reprimirían la expresión del promotor lacZ inducible de E. coli localizado en la región flanqueante del vector de clonación. Esta observación indicaba que las secuencias bifidobacterianas internas endógenas en dirección 5’ del gen de α-galactosidasa pueden servir como señal de iniciación de la transcripción en

E. coli.

Se indica el inicio de la transcripción en letras en negrita y cursiva. Los resultados anteriores indican que el gen se controla por su propio promotor de transcripción.

Ejemplo 2

Síntesis con la enzima clonada de α-galactosidasa aislada de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 en el hospedador de E. coli (cepa RA11)

La siguiente síntesis descrita, a menos que se afirme otra cosa, se efectuó con las células hospedadoras de E. coli RA11 completas después del tratamiento de la biomasa de E.coli (recogida mediante centrifugación a 10.000 g) con tolueno a una concentración de 2000 ppm para aumentar la permeabilidad celular y para volver también las células inviables al destruir su membrana citoplasmática. Se preparó la biomasa de E. coli como se describe en el ejemplo 1 en “Cepas de E. coli”.

Síntesis con la enzima clonada

Se efectuó la síntesis con α-galactosidasa a una concentración de sustrato de concentración inicial de melibiosa al 40% (p/p). Se preparó la disolución de síntesis en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,0. Se efectuó la síntesis a 40ºC en baño de agua agitado a 150 rpm. Se eligió el pH óptimo para la enzima específica basándose en las medidas de actividad (usando p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido como sustrato) de una preparación enzimática específica a valores de pH variables.

Para la síntesis de α-galactosidasa, se centrifugaron 2 ml de una suspensión de células E. coli RA11 (con una actividad de 0,3 U/ml) (a 10.000 g) para recoger la biomasa y se desechó el sobrenadante. Se resuspendió esta biomasa con 1 g de disolución de sustrato de melibiosa al 40% (p/p) para efectuar la síntesis.

Se muestran en la Figura 4 las concentraciones de los diferentes azúcares presentes en la mezcla durante la síntesis. Se muestran en la Figura 5 cromatogramas de cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplada con detección amperimétrica por pulsos (HPAEC-PAD) de mezclas de galactooligosacáridos sintetizadas por la α-galactosidasa clonada de B. bifidum NCIMB 41171. Se muestran en la tabla 1 las concentraciones de azúcares de la mezcla de galactooligosacáridos en el momento de síntesis óptimo.

Tabla 1. Composición de carbohidratos de una síntesis de α-galactooligosacáridos a una concentración de melibiosa inicial del 40% (p/p) en el momento en que se observaba la concentración máxima de oligosacárido.

Sustrato inicial de síntesis

GOS DP≥3 GOS DP=2 Mel Glc Gal

% (p/p)

Concentración (% de azúcares totales)

40

13,93 6,61 38,06 24,1 17,29

Mel: Melibiosa, Glc: glucosa, Gal: galactosa, DP: grado de polimerización

Listado De Secuencias

<110>

Lindsay, Clare L

5

<120> Producto y proceso

<130>

P/13587.WO

10

<150> <151> GB 0525857.9

<160>

2

15 20

<170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> PatentIn versión 3.4 1 3129 ADN Bifidobacterium bifidum gen (1)..(6)

25

<400> 1

5

<210> <211> <212> <213> 2 759 PRT Bifidobacterium bifidum

<400>

2

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una secuencia de ADN que codifica una proteína con una secuencia aminoacídica como se da en SEQ. ID. NO: 2.

   5 2. La secuencia de ADN según la reivindicación 1, en la que la secuencia se da en SEQ. ID NO: 1.

2. 3.

   Una enzima codificada por una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

3. 4.

   Una enzima que comprende una secuencia aminoacídica según SEQ. ID NO: 2.

4. 5.

   Una α-galactosidasa que tiene la secuencia definida en SEQ. ID NO: 2.

5. 6.

   Un vector recombinante que comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

   10 7. El vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de expresión.

6. 8.

   Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

7. 9.

   Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

8. 10.

   La célula hospedadora según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula fúngica.

   15 11. La célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula se selecciona del grupo consistente en Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus y Aspergillus.
9. 12. La célula hospedadora según la reivindicación 11, en la que la célula se selecciona del grupo consistente en Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans y Aspergillus niger.
10. 13. Uso de una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula de una cualquiera de 20 las reivindicaciones 8 a 12, para producir disacáridos de α-galactobiosa.
11. 14. Uso de una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o de una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para producir disacáridos de α-galactobiosa que son parte de un producto seleccionado del grupo consistente en productos lácteos tales como leche líquida, leche desecada en polvo, leche para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta,

    25 alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves y medicamentos.
12. 15. Uso de una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para producir un producto seleccionado del grupo consistente en productos lácteos tales como leche líquida, leche desecada en polvo, leche

    30 para lactantes, leche de continuación, helado, yogur, queso, productos lácteos fermentados, bebidas tales como zumo de fruta, alimentos infantiles, cereales, pan, galletas, repostería, pasteles, suplementos alimentarios, suplementos dietéticos, productos comestibles prebióticos, productos comestibles prebióticos, piensos animales, piensos para aves y medicamentos.
13. 16. Un proceso para producir una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende

    35 cultivar una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permitan la expresión de dicha enzima y recuperar la enzima resultante del cultivo.
14. 17. Un proceso para producir un disacárido que comprende poner en contacto una enzima de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o una célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, con una solución de melibiosa.