PL208254B1 - Sposób przekształcania celulozy w glukozę - Google Patents
Sposób przekształcania celulozy w glukozęInfo
- Publication number
- PL208254B1 PL208254B1 PL372388A PL37238803A PL208254B1 PL 208254 B1 PL208254 B1 PL 208254B1 PL 372388 A PL372388 A PL 372388A PL 37238803 A PL37238803 A PL 37238803A PL 208254 B1 PL208254 B1 PL 208254B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- core
- cellulose
- enzymes
- endoglucanase
- cbh
- Prior art date
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 247
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title claims description 10
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 title 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 118
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 118
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 77
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 57
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 36
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 71
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 37
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 26
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 18
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 18
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 17
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 16
- 101710126559 Endoglucanase EG-II Proteins 0.000 claims description 13
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 10
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 8
- 241000186321 Cellulomonas Species 0.000 claims description 6
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 6
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 6
- 241000605898 Fibrobacter Species 0.000 claims description 5
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 5
- 241000203640 Thermomonospora Species 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000010903 husk Substances 0.000 claims description 5
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 4
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 claims description 4
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000209082 Lolium Species 0.000 claims description 3
- 240000003433 Miscanthus floridulus Species 0.000 claims description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 claims description 3
- 241000746413 Spartina Species 0.000 claims description 3
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011122 softwood Substances 0.000 claims description 3
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 claims description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 claims description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 56
- 101001036019 Sclerotinia sclerotiorum Endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 60
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 45
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 30
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 101001035468 Fibrobacter succinogenes (strain ATCC 19169 / S85) Endoglucanase 3 Proteins 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 16
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 16
- 101150114858 cbh2 gene Proteins 0.000 description 15
- 101000955266 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 28 Proteins 0.000 description 14
- 101000906480 Sclerotinia sclerotiorum Endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 14
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 6
- 101001036171 Paenibacillus lautus Endoglucanase A Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 101000899859 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) Endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- -1 for example Substances 0.000 description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000186320 Cellulomonas fimi Species 0.000 description 3
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 3
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 3
- 101000843385 Paenibacillus lautus Endoglucanase B Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000002841 Lewis acid Substances 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241001600128 Populus tremula x Populus alba Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000203600 Thermobispora bispora Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 241000193445 [Clostridium] stercorarium Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- AOZUYISQWWJMJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.CC(O)=O AOZUYISQWWJMJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000533 capillary isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 108010092413 endoglucanase V Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000007517 lewis acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu przekształcania celulozy w glukozę. Sposób według niniejszego wynalazku może znaleźć zastosowanie w wielu procesach przemysłowych, takich jak przykładowo biokonwersja celulozy do etanolu paliwowego.
Celuloza jest jednym z najobficiej występujących w przyrodzie polimerów i składa się z jednostek glukozy połączonych ze sobą wiązaniami 1,4. Wiązania 1,4 beta, które łączą poszczególne jednostki glukozy nie ulegają łatwej degradacji i depolimeryzacji. Jednakże, istnieją różne celulazy zdolne do enzymatycznego hydrolizowania celulozy.
Celulazy są enzymami wytwarzanymi przez szereg mikroorganizmów, katalizującymi hydrolizę celulozy do produktów takich jak glukoza, celobioza i inne celooligosacharydy. Celulaza jest zazwyczaj ogólnym terminem określającym mieszaninę wielu enzymów obejmujących egzocelobiohydrolazy (CBH), endoglukanazy (EG) i β-glukozydazy. Celulazy wytwarzane przez grzyba nitkowatego Trichoderma longibrachiatum obejmują, co najmniej dwie cellobiohydrolazy nazwane CBHI i CBHII i co najmniej 4 enzymy EG.
Celulazy działają synergistycznie przeprowadzając hydrolizę celulozy do glukozy. CBHI i CBHII zasadniczo działają na końce polimerów glukozy w mikrowłóknach celulozowych uwalniając celobiozę (Teeri i Koivula, 1995), podczas gdy endoglukanazy działają na losowe miejsca w celulozie. Razem enzymy te hydrolizują celulozę do mniejszych celooligosacharydów takich jak celobioza. Celobioza jest hydrolizowana do glukozy przez β-glukozydazę. Zarówno egzocelobiohydrolazy jak i endoglukanazy są glikozylohydrolazami, które hydrolizują wiązanie glikozylowe pomiędzy dwoma lub większą liczbą węglowodanów lub pomiędzy węglowodanem i cząstką nie będącą węglowodanem.
Geny kodujące CBHI, CBHII(Shoemaker i wsp., 1983; Teeri i wsp., 1987), EGI i EGII (Penttila i wsp., 1986; Saloheimo i wsp., 1988) zostały sklonowane i wyizolowane z grzybów nitkowatych takich jak T. reesei i T. longibrachiatum. Białka CBHI, CBHII i EG składają się z katalitycznej domeny rdzeniowej i domeny wiążącej celulozę (CBD), oddzielonych giętkim regionem łącznikowym. Domena wiążąca celulozę (CBD) przyczynia się do wiązania enzymu z regionami substratu celulozowego (Tomme i wsp., 1988; Gilkes i wsp., 1992), podczas gdy domena rdzeniowa jest odpowiedzialna za katalizowanie cięcia celulozy. Region łącznikowy może zapewniać optymalną odległość pomiędzy domeną rdzeniową i domeną wiążącą celulozę (Teeri i wsp., 1992).
Główne endoglukanazy EGI, EG2 i EG3 występują w ilości około 8 do 21% w Trichoderma, w stosunku do całkowitej mieszaniny celulaz składającej się z CBH1, CBH2, EG1, EG2 i EG3 (Bisset, 1979; Hui i wsp., 2001). Hui i wsp. określili obecność EG1, EG2 i EG3 w Trichoderma na od 8 do 18% w stosunku do całkowitej mieszaniny celulaz, z EG3 stanowiącym od 0 do 6% całkowitej mieszaniny celulaz. Wówczas, gdy EG3 z Trichoderma nie posiada domeny wiążącej celulozę (sekwencja DNA ujawniona w opisie patentowym USA nr 5475101), naturalna ilość białka rdzeniowego endoglukanazy w stosunku do całkowitej mieszaniny endoglukanaz w Trichoderma wynosi powyżej 33% (wagowo) w mieszaninie enzymatycznej. W Humicola insolens, ilość endoglukanazy w stosunku do całkowitej mieszaniny celulaz wynosi powyżej 50% (Schulein i wsp.).
Szereg badań wskazuje na to, że holobiałka endoglukanazy są lepsze w hydrolizowaniu celulozy niż białka rdzeniowe endoglukanazy. Białko rdzeniowe EG2 z Trichoderma reesei nie wiąże tak silnie celulozy jak EG2 (Macarron i wsp., 1995; Nidetzky i wsp, 1994). Białko rdzeniowe EG2 jest w pełni aktywne wobec małych rozpuszczalnych substratów takich jak glikozydy chromoforowe pochodzące z celodekstryn i laktoza. Jednakże, jego aktywność wobec nierozpuszczalnych substratów celulozowych takich jak Avicel (rodzaj krystalicznej celulozy) jest znacznie zredukowana w porównaniu z EG2 (Stahlberg i wsp., 1988; Nidetzky i wsp., 1994). Stahlberg pokazał, że EG2 ma siedmiokrotnie wyższą aktywność od rdzenia EG2. Przypisywano to faktowi, że celulozę absorbuje 79% EG2, a tylko 13% białka rdzeniowego EG2. Nidetzky egzaminował absorpcję i aktywności EG2 i rdzenia EG2 na filtrze. Ujawniono, że na filtrze EG2 posiadał cztery razy więcej dostępnych miejsc niż rdzeń EG2. Ustalono, że aktywność zależała od stopnia wiązania do substratu. Kotiranta obserwował podobne wiązanie EG2 i rdzenia EG2 do lignocelulozowego substratu będącego wstępnie przygotowaną za pomocą pary wierzbą. Chociaż stopień przekształcania celulozy przy użyciu pojedynczych EG2 lub rdzenia EG2 był wyjątkowo niski; przy użyciu samego rdzenia EG2 stopień przekształcenia celulozy wynosił połowę stopnia przekształcenia obserwowanego dla EG2 (Kotiranta i wsp., 1999).
Schulein i wsp. ujawniają, że dzięki kombinacji egzocelobiohydrolazy CBH1 z Humicola insolens i endoglukanazy V z Humicola insolens w stosunku molarnym 90:5, można osiągnąć 55% przePL 208 254 B1 kształcenia w trzydzieści godzin. Podstawienie endoglukanazy V rdzeniową endoglukanazą V prowadzi do prawie 60% obniżenia szybkości hydrolizy i to samo przekształcenie można osiągnąć tylko w 48 godz.
Przekształcenie celulozy z materiału celulozowego w glukozę jest ważne w wielu procesach przemysłowych, takich jak biokonwersja celulozy do etanolu paliwowego. Niestety, celuloza zawarta w większości materii roś linnej nie podlega łatwemu przekształceniu do glukozy i etap ten stanowi główną przeszkodę w komercjalizacji takiego procesu. Początkowo sądzono, że wydajne przekształcanie celulozy z materiału celulozowego w glukozę wymaga uwolnienia celulozy i hemicelulozy z ich kompleksu z ligniną. Jednakże, ostatnio rozwój procesów skupia się na zwiększeniu dostępności do celulozy w biomasie lignocelulozowej, a następnie depolimeryzacji polimerów węglowodanów celulozowych do glukozy. Zwiększenie dostępności do celulozy najczęściej osiąga się przez wstępne przygotowanie substratu celulozowego.
Celem większości metod wstępnej obróbki jest dostarczenie skutecznej kombinacji czynników mechanicznego i chemicznego umożliwiających rozerwanie włóknistej struktury i polepszenie dostępności podstawowego materiału dla celulaz. Działanie mechaniczne zazwyczaj obejmuje zastosowanie ciśnienia, rozcierania, mielenia, mieszania, rozdrabniania, prasowania/rozprężania oraz inne typy działania mechanicznego. Działanie chemiczne obejmuje zastosowanie ciepła (często pary), kwasu i rozpuszczalników. Przykładowo, jednym z wiodących podejść wstępnej obróbki jest wybuch pary z zastosowaniem warunków procesu opisanych w opisie patentowym USA nr 4461648, a także u Foody i wsp, 1980, oba włączone na drodze odniesienia. W procesie tym, biomasa lignocelulozowa jest ładowana do armatki parowej i fakultatywnie do biomasy w armatce parowej jest dodawany kwas do 5% lub jest ona w nim zamaczana przed załadowaniem do armatki parowej. Armatka parowa jest następnie bardzo szybko wypełniana parą i utrzymywana pod wysokim ciśnieniem przez zadaną długość czasu warzenia. Po upływie czasu warzenia pojemnik jest poddawany gwałtownemu rozhermetyzowaniu w celu usunięcia wstępnie obrobionej biomasy.
Inne podejście, opisane w opisie patentowym USA 4237226, ujawnia wstępną obróbkę dębu, papieru gazetowego, topoli i słomy z wymłóconej kukurydzy za pomocą reaktora z ciągłym przepływem tłokowym, urządzeniem przypominającym prasę do wyciskania. Śruby obrotowe przenoszą zawiesinę podstawowego materiału przez mały otwór, gdzie działanie mechaniczne i chemiczne niszczy włókna.
Sugerowano, że wstępna obróbka wzmacnia delignifikację substratu celulozowego (Fan i wsp., 1981), tworzy mikropory przez usunięcie hemicelulozy, zmienia krystaliczność substratu, redukuje stopień polimeryzacji celulozy (Knappert i wsp., 1980) i zwiększa obszar powierzchni substratu celulozowego (Grethlein i Converse, 1991; Grohman i wsp., 1985).
Niestety, do tej pory nie było możliwe zastosowanie wstępnej obróbki sprzężonej z hydrolizą enzymatyczną do produkcji glukozy po dostatecznie niskich kosztach oraz przekształcenie celulozy do etanolu, które byłoby atrakcyjne handlowo. Nawet z najwydajniejszymi aktualnie dostępnymi sposobami wstępnej obróbki, ilość celulazy wymaganej do przekształcenia celulozy w glukozę jest wysoka i stanowi znaczą cy koszt w produkcji etanolu. Opcja dodania mniejszej iloś ci celulazy do systemu zazwyczaj obniżała ilość produkowanej glukozy do poziomu niemożliwego do zaakceptowania. Podejście z obniżeniem ilości wymaganego enzymu poprzez zwiększenie długości czasu działania enzymu na celulozę prowadzi do nieekonomicznego procesu produkcyjnego, wynikającego z wysokich kosztów połączonych z zatrzymaniem mieszanin enzymatycznych w zbiornikach do hydrolizy.
Stąd istnieje w dziedzinie zapotrzebowanie na zidentyfikowanie nowych sposobów wzmacniających przekształcanie celulozy z substratu celulozowego w glukozę. Ponadto, istnieje w dziedzinie zapotrzebowanie na zidentyfikowanie enzymów lub mieszanin enzymów, które wzmacniają przekształcanie celulozy w glukozę i nadają się do odzyskania, recyklingu i ponownego użycia.
Celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wad dotychczasowego stanu techniki i dostarczenie nowego sposobu umożliwiającego przekształcanie celulozy z substratu celulozowego w glukozę z wykorzystaniem nowych zidentyfikowanych obecnie enzymów lub ich mieszanin.
Niniejszy wynalazek dotyczy enzymatycznego przekształcania celulozy w glukozę, w którym to sposobie poddany wstępnej obróbce substrat lignocelulozowy poddaje się działaniu mieszaniny enzymatycznej obejmującej celobiohydrolazę (CBH), β-glukozydazę i endoglukanazy (EG), przez okres czasu wystarczający do przekształcenia od 60% do 100% cellulozy w glukozę, przy czym wspomniane enzymy EG stanowią od 2% (wagowo) do 50% (wagowo) enzymów CBH i EG, i gdzie wspomniane
PL 208 254 B1 enzymy EG zawierają od 35% (wagowo) do 100% (wagowo) białka rdzeniowego endoglukanazy (ECP).
Korzystnie, enzymy EG stanowią 7% (wagowo) do 30% (wagowo) enzymów CBH i EG natomiast ECP stanowi od 50% (wagowo) do 90% (wagowo) enzymu EG, korzystniej od 60% (wagowo) do 80% (wagowo) enzymu EG.
Ponadto, zgodnie z równie korzystnym wykonaniem sposobu według wynalazku ECP jest wybrane z grupy składającej się z rdzenia EGI, rdzenia EGII, EGI z nieaktywną domeną wiążącą celulozę, EGII z nieaktywną domeną wiążącą celulozę, rdzenia EGI z łącznikiem, rdzenia EGII z łącznikiem i ich kombinacji.
W korzystnej postaci realizacji sposobu według wynalazku CBH, β-glukozydaza i enzymy EG uzyskuje się z Trichoderma, Hypocrea, Thermomonospora, Aspergillus, Streptomyces, Cellulomonas, Humicola, Fusarium, Fibrobacter, Clostridium, Bacil-lus i ich kombinacji, szczególnie korzystnie z Trichoderma, a β-glukozydazę uzyskuje się z Aspergillus lub Trichoderma, zwłaszcza z Trichoderma reesei.
W korzystnej postaci realizacji sposobu według wynalazku dodatkowo po tym jak poddany wstępnej obróbce substrat lignocelulozowy poddaje się działaniu mieszaniny enzymatycznej obejmuje odzyskiwanie ECP, przy czym jeszcze korzystniej etap odzyskiwania obejmuje strącanie ECP lub zastosowanie do odzyskania ECP z roztworu filtra do ultrafiltracji a odzyskiwany ECP jest ponownie używany po etapie odzyskiwania jak również.
Korzystnie wstępnie obrobiony substrat lignocelulozowy wybiera się z grupy składającej się z odpadów rolnych, odpadów po usunięciu skrobi lub cukru, przeznaczonych do tego produktów etanolowych, produktów leśnych oraz masy celulozowej i produktów papierniczych lub ich kombinacji, przy czym szczególnie korzystnie odpady rolne są wybrane z grupy składającej się ze słomy z wymłóconej kukurydzy, słomy z pszenicy, słomy z jęczmienia, słomy z wymłóconej soi odpady po usunięciu skrobi lub cukru są wybrane z grupy składającej się z łusek z owsa, łusek z ryżu, wytłoków trzciny cukrowej i włókna zbożowego;
przeznaczone do tego produkty etanolowe są wybrane z grupy składającej się z prosa rózgowego, traw olbrzymich z rodzaju Miscanthus, spartiny i życicy; oraz produkty leśne są wybrane z grupy składającej się z drewna twardego, drewna miękkiego, rodzaju Eucalyptus i trocin.
Zgodnie z korzystnym wykonaniem sposobu według wynalazku wstępnie obrobiony substrat celulozowy poddany działaniu mieszaniny enzymatycznej jest obecny w stężeniu od 1% (wagowo) do 25% (wagowo), korzystniej w stężeniu od 10% (wagowo) do 16% (wagowo).
Korzystnie wstępną obróbkę substratu celulozowego prowadzi się poprzez gotowanie w kwaśnej parze.
Równie korzystnie stosowane w sposobie enzymy CBH obejmują celobiohydrolazę I (CBHI) i celobiohydrolazę II (CBHII), przy czym jeszcze korzystniej CBHI stanowi od 25% (wagowo) do 95% (wagowo) enzymów CBH oraz CBHI pochodzi z Trichoderma. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu również i CBHII pochodzi z Trichoderma.
Te i inne cechy niniejszego wynalazku staną się bardziej zrozumiałe dzięki następującemu opisowi, odnoszącemu się do rysunku, na którym:
Figura 1 pokazuje graficzne przedstawienie wpływu zwiększenia udziału % (wagowo) rdzenia EG w stosunku do całkowitego EG w mieszaninie celulaz.
Figura 2 pokazuje graficzne przedstawienie ilości EG2, EG2:rdzenia EG2 (50:50) pozostających w roztworze po hydrolizie. Figura 2A pokazuje, że dla wstępnie obrobionego całego owsa po 24, 48 i 72 godzinach hydrolizy rdzeń EG2 jest bardziej rozpuszczony niż EG2 po reakcji hydrolizy. W przybliżeniu po hydrolizie w roztworze pozostaje 30 do 85% więcej rdzenia EG2 niż EG2. Figura 2B pokazuje, że przy użyciu jako substratu Sigmacell™, w tych samych warunkach, w roztworze pozostaje więcej rdzenia EG2 niż EG2.
Figura 3 pokazuje graficzne przedstawienie stabilności w roztworze EG2 i rdzenia EG2, w buforze cytrynianowym o pH 4,8 i 50°C. Stabilność jest szacowana poprzez monitorowanie % pozostającej aktywności enzymów wobec CMC. Ustalono, że EG2 i rdzeń EG2 są w równym stopniu stabilne przez 15 do 20 dni.
Jak wskazano powyżej niniejszy wynalazek dotyczy enzymatycznego przekształcania celulozy w glukozę. Konkretniej niniejszy wynalazek dostarcza sposobu przekształcania wstępnie przygotowaPL 208 254 B1 nych substratów lignocelulozowych przy użyciu białka rdzeniowego endoglukanazy i odzyskania oraz ponownego użycia białka rdzeniowego endoglukanazy.
Zamieszczony poniżej opis stanowi jedynie w ilustrację niniejszego wynalazku i przedstawia jego korzystne wykonanie wynalazku nieograniczając jego zakresu.
Specjalistom w dziedzinie dobrze wiadomo, że celuloza w wielu materiałach lignocelulozowych może nie być z łatwością hydrolizowana przez enzymy. Zatem, pożądanym jest, aby substrat celulozowy do hydrolizy enzymatycznej jak tu opisano był wstępnie obrobiony przed działaniem enzymów.
Istnieje wiele znanych specjalistom w dziedzinie sposobów wstępnej obróbki, które to sposoby wykorzystują metody termiczne, mechaniczne, chemiczne lub kombinacje tych metod do rozrywania struktury włókien substratów celulozowych i które wzmacniają następującą hydrolizę enzymatyczną substratu celulozowego. Można wykorzystać dowolny sposób wstępnej obróbki, który wzmacnia hydrolizę enzymatyczną w połączeniu ze sposobem według niniejszego wynalazku. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, można zastosować sposób wstępnej obróbki ujawniony w opisie patentowym USA 4461648 lub patencie USA 4237226 (oba włączone tu poprzez odniesienie) lub dowolny ze znanych w dziedzinie procesów wytwarzania masy celulozowej (np. Rydholm S.A., 1985, Pulping Processes, Kreiger Pub. Co., włączony tu poprzez odniesienie), włączając wytwarzanie masy celulozowej z siarczanem, z siarczynem, termiczne i chemiczno-termiczno-mechaniczne. Alternatywnie, sposoby wstępnej obróbki mogą także wymagać dodania rozpuszczalników organicznych w celu oddzielenia ligniny, celulozy i hemicelulozy od surowców lignocelulozowych. Te sposoby wstępnej obróbki mogą obejmować, lecz nie wyłącznie, te ujawnione w opisie patentowym USA 3932307, który mówi o nasycaniu surowca lignoceluzowego roztworem substratu rozpuszczającym ligninę w rozpuszczalniku organicznym, a następnie zanurzenie nasyconego materiału w rozpuszczalniku, który nie jest rozpuszczalny ani wzajemnie rozpuszczalny z roztworem zawierającym substrat, którym nasycono materiał lignocelulozowy; patencie USA 4826566, który wykorzystuje mieszaniny rozpuszczalników, takich jak glikol trietylenowy z kwasem arylosulfonowym lub innymi kwasami; patencie USA 5859236, który mówi o nasycaniu materiału lignocelulozowego roztworem ekstrakcyjnym zawierającym glikol i kwas Lewis'a i patencie USA 5730837, który mówi o działaniu na materiał lignocelulozowy kombinacją alkoholu, wody i rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą, przykładowo, ketonu.
Użytecznym sposobem wstępnej obróbki jest gotowanie w kwaśnej parze, jak ujawniono w opisie patentowym USA 4461648, gdzie do substratu lignocelulozowego dodawany jest kwas, przykładowo, kwas siarkowy od około 0% do około 5% i zakwaszona mieszanina jest gotowana przez od około 5 sek. do około 2 min. w temp około 180 do około 250°C.
Bez konieczności wiązania z jakąkolwiek teorią, uważa się, że proces wstępnej obróbki wzmacnia zachodzącą później hydrolizę enzymatyczną celulozy poprzez zwiększenie delignifikacji, tworzenie mikropor w celulozie, zmianę formy krystalicznej celulozy, redukcję polimeryzacji celulozy i zwiększenie obszaru powierzchni celulozy lub ich kombinacje. Ponieważ duża porcja celulozy w wielu typach substratu celulozowego jest normalnie niedostępna dla enzymatycznego przekształcenia w glukozę bez wstępnej obróbki, wydajność fazy wstępnej obróbki może wpływać na wydajność i komercyjne zastosowanie enzymatycznego przekształcenia celulozy w glukozę.
Termin „substrat celulozowy oznacza dowolny materiał obejmujący celulozę, która może być przekształcona w glukozę poprzez hydrolizę enzymatyczną. Substrat celulozowy jest korzystnie wstępnie obrobionym substratem lignocelulozowym, obejmującym co najmniej około 10% ligniny. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, substrat celulozowy odpowiedni do wstępnej obróbki może obejmować: e e
i) odpady rolne (zawartość ligniny około 15%) takie jak słoma z wymłóconej kukurydzy, słoma z pszenicy, słoma z jęczmienia, słoma z wymłóconej soi;
ii) odpady po usunięciu skrobi lub cukru, przykładowo, lecz nie wyłącznie, łuski z owsa, łuski z ryż u, wytł oki trzciny cukrowej i masa z trzciny cukrowej;
iii) przeznaczone do tego produkty etanolowe, takie jak, lecz nie wyłącznie, proso rózgowe, trawy olbrzymie z rodzaju Miscanthus, spartina i życica;
iv) produkty leśne, przykładowo, lecz nie wyłącznie, drewno twarde (np. topola, zawartość ligniny około 25%), drewno miękkie (zawartość ligniny około 35%), rodzaj Eucalyptus i odpady leśne, trociny; oraz
v) inne wstępnie obrobione substraty ligninowe obejmujące masę celulozową i produkty papiernicze, przykładowo, lecz nie wyłącznie, jak Solka flock.
PL 208 254 B1
Użytecznymi substratami lignocelulozowymi są wstępnie przygotowane drewno twarde lub odpady rolne, obejmujące słomę z wymłóconej kukurydzy, łuski z owsa, słomę z jęczmienia, lub słomę z pszenicy za pomocą sposobu ujawnionego w opisie patentowym USA 4461648 (który jest tu włączony na drodze odniesienia).
Hydroliza enzymatyczna celulozy może następować bezpośrednio po wstępnej obróbce lub, alternatywnie, po wstępnej obróbce może następować i poprzedzać hydrolizę enzymatyczną celulozy szereg etapów. Przykładowo, lecz nie wyłącznie, wstępnie obrobiony substrat celulozowy można dla usunięcia związków chemicznych, zanieczyszczeń lub ich kombinacji, które mogłyby przeszkadzać w enzymatycznym przekształceniu celulozy w glukozę opłukiwać wodą.
„Egzo-celobiohydrolaza oznacza białko obejmujące domenę wiążącą celulozę, region łącznikowy i region rdzenia celobiohydrolazy (CBH), który działa na końce celulozy uwalniając celobiozę. Domena wiążąca celulozę może być połączona z regionem rdzenia celobiohydrolazy albo na końcu N albo końcu C z końca regionu rdzenia celobiohydrolazy. CBH można uzyskać z dowolnego stosownego organizmu. Jest pożądanym by CBH był uzyskiwany z jednego lub większej liczby następujących organizmów: Trichoderma, Hypocrea, Thermomonospora, Aspergillus, Streptomyces, Cellulomonas, Humicola, Fusarium, Fibrobacter, Clostridium, Bacillus, a zwłaszcza z Trichoderma reesei.
„Endoglukanaza lub „EG oznacza białko obejmujące domenę wiążącą celulozę, region łącznikowy i region rdzenia endoglukanazy, które losowo nacina polimery celulozowe tworząc zredukowane lub niezredukowane końce dla trawienia przez egzocelobiohydrolazę. Należy rozumieć, że domena wiążąca celulozę może być połączona z regionem rdzenia endoglukanazy albo na końcu N albo końcu C z końca regionu rdzenia endoglukanazy. Endoglukanazy zostały zaklasyfikowane do wielu rodzin (Tab. 1) na podstawie podobieństw aminokwasowych, analizy struktury trójwymiarowej i analizy skupisk hydrofobowych (Henrissat i wsp., 1997 i 1998 oraz pozycje piśmiennictwa tam zawarte). Zatem endoglukanazy obejmują szeroką grupę enzymów, różniących się masą cząsteczkową, sekwencją aminokwasową oraz strukturą 3D. Przykładowo, białko EG2 z Trichoderma reesei (zaklasyfikowane do rodziny 5 enzymów) posiadające w przybliżeniu 50 kDa, obejmuje N końcową domenę wiążącą celulozę, region łącznikowy i region rdzenia EG2 i losowo nacina polimery celulozowe tworząc zredukowane lub niezredukowane końce dla trawienia przez egzocelobiohydrolazę. Białko EG3 z Trichoderma reesei (rodzina 12 enzymów) posiada w przybliżeniu 50 kDa i obejmuje domenę katalityczną i nie ma domeny wi ążącej celulozę .
Jak wskazano powyżej w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku EG jest uzyskiwany z jednego lub większej liczby następujących organizmów: Trichoderma, Hypocrea, Thermomonospora, Aspergillus, Streptomyces, Cellulomonas, Humicola, Fu-sarium, Fibrobacter, Clostridium, Bacillus, a zwłaszcza z Trichoderma reesei. Jednakże, powinno być oczywistym, że białko EG można także uzyskać z innych źródeł, w tym, lecz nie wyłącznie, z tych wymienionych w Tab. 1.
T a b e l a 1
Klasyfikacja znanych endoglukanaz
| Rodzina | Enzym | Źródło |
| 1 | 2 | 3 |
| 5 | EG A | Bacillus sp. Szczep N-4 |
| EG B | Bacillus sp. Szczep N-4 | |
| EG | Bacillus lautus | |
| EG | Bacillus subtilis | |
| EG | Clostridium acetobutylicum | |
| EG A | Clostridium celluloyticum | |
| EG B | Clostridium thermocellum | |
| EGII | Trichoderma reesei | |
| EG5 | Thermomonospora fusca | |
| EG | Xanthomonas campestris |
PL 208 254 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 |
| 6 | EG A | Cellulomonas fimi |
| EG A | Microbispora bispora | |
| EG A | Streptomyces sp. (KSM-9) | |
| EG2 | Thermomonospora fusca | |
| 7 | EGI | Trichoderma reesei |
| 8 | EG | Cellulomonas uda |
| EG A | Clostridium thermocellum | |
| 9 | EG B | Cellulomonas fimi |
| EG C | Cellulomonas fimi | |
| EG Z | Clostridium stercorarium | |
| EG4 | Thermomonospora fusca | |
| 12 | EG | Aspergillus aculeatus |
| EG III | Trichoderma reesei | |
| EG3 | Humicola insolens | |
| 45 | EG5 | Humicola insolens |
| EG5 | Trichoderma reesei |
„Rdzeń endoglukanazy oznacza część endoglukanazy obejmującą domenę katalityczną endoglukanazy i która posiada aktywność endoglukanazy jak tu zdefiniowano. Przykładem rdzenia endoglukanazy, który nie jest rozpatrywany jako ograniczający w żaden sposób, jest rdzeń EG2 z Trichoderma, który posiada w przybliżeniu 38 kDa. Rdzeń EG2 można wyizolować z przesączów hodowli przy użyciu metod chromatograficznych (Bhikhabhai i wsp.; Stahlberg i wsp.). Rdzeń EG2 można wytworzyć poprzez proteolityczne cięcie białka EG2 przy użyciu stosownej proteazy, przykładowo lecz nie wyłącznie, papainy. W celu wytworzenia rdzenia EG w mieszaninie do mieszaniny surowego enzymu można także dodać jedną lub większą liczbę proteaz, przykładowo, lecz nie wyłącznie, papainę. W tym wykonaniu, w zależności od dodanej proteazy można także wytworzyć rdzenie innych enzymów. Rdzeń EG2 można także wytworzyć stosując technologię rekombinowania. W ten sposób można współwytwarzać EG2 i rdzeń EG2 w tym samym organizmie gospodarza lub można ogólnie zmodyfikować gospodarza tak, że wytwarzanie natywnego EG2 jest zredukowane lub wyeliminowane, lub uzupełnione czy zamienione, odpowiednio wytwarzaniem zrekombinowanego rdzenia EG2. Powinno być zrozumiałe, że rdzeń endoglukanazy także obejmuje fragmenty lub pochodne rdzenia endoglukanazy, w tym podstawienia, delecje, insercje w sekwencji rdzenia endoglukanazy co, jak wiadomo specjaliście w dziedzinie, prowadzi do tego, że fragmenty i pochodne wykazują aktywność endoglukanazy jak tu opisano. Powinno być także zrozumiałe, że białko rdzeniowe endoglukanazy można izolować z organizmu, gdzie białko rdzeniowe endoglukanazy nie obejmuje domeny wiążącej celulozę lub regionu łącznikowego.
Termin „rdzeń endoglukanazy z łącznikiem oznacza fragment endoglukanazy obejmujący rdzeń endoglukanazy i sekwencję aminokwasową łącznika, lub jego fragment, który łączy rdzeń endoglukanazy z CBD endoglukanazy. Część łącznika z rdzenia endoglukanazy z łącznikiem może obejmować dowolną długość sekwencji aminokwasowej. Rdzeń endoglukanazy z łącznikiem może obejmować fragmenty lub pochodne rdzenia endoglukanazy z łącznikiem w tym podstawienia, delecje, insercje w sekwencji rdzenia endoglukanazy z łącznikiem co, jak wiadomo specjaliście w dziedzinie, prowadzi do tego, że fragmenty i pochodne rdzenia endoglukanazy z łącznikiem wykazują aktywność rdzenia endoglukanazy. Rdzeń endoglukanazy z łącznikiem można izolować z organizmu, gdzie białko rdzeniowe endoglukanazy z łącznikiem nie obejmuje domeny wiążącej celulozę i może być wytworzone przy użyciu technik rekombinacji lub może być wytworzone poprzez proteolizę, co będzie znane specjalistom w dziedzinie.
PL 208 254 B1
Termin „endoglukanaza z nieaktywną domeną wiążącą celulozę oznacza białko obejmujące rdzeń endoglukanazy lub rdzeń endoglukanazy z łącznikiem oraz domenę wiążącą celulozę (CBD), która jest zinaktywowana. Inaktywację CBD można przeprowadzić za pomocą metod znanych specjalistom, przykładowo, lecz nie wyłącznie, według Linder i wsp. (Linder i wsp., 1995; Linder i wsp., 1999, włączone tutaj na drodze odniesienia). Wynikiem inaktywacji CBD jest redukcja zdolności CBD do wiązania celulozy w porównaniu z aktywnością wiązania odpowiadającej endoglukanazie dzikiego typu. Ponadto, uważa się, że endoglukanaza z nieaktywną domeną wiążącą celulozę także obejmuje fragmenty lub pochodne endoglukanazy, w tym podstawienia, delecje, insercje w sekwencjach endoglukanazy, łącznika, CBD lub ich kombinacje, co, jak wiadomo specjaliście w dziedzinie, prowadzi do tego, że fragmenty i pochodne wykazują aktywność endoglukanazy i wykazują zredukowaną zdolność wiązania glukozy. Powinno być zrozumiałe, że endoglukanazę z nieaktywną domeną wiążącą celulozę można izolować z organizmu, gdzie endoglukanaza obejmuje domenę wiążącą celulozę, chociaż CBH wykazuje słabą aktywność wiązania celulozy. Endoglukanaza wykazująca słabą aktywność wiązania celulozy wykazuje mniej niż około 70% aktywności wiązania celulozy endoglukanazy uzyskanej z Trichoderma reesei, przy uż yciu tego samego substratu. Korzystnie, endoglukanaza wykazująca słabą aktywność wiązania celulozy wykazuje mniej niż około 50% aktywności wiązania celulozy przez endoglukanazę z Trichoderma reesei.
„Białko rdzeniowe endoglukanazy lub „ECP oznacza białko obejmujące rdzeń EG, rdzeń EG z łącznikiem, EG z nieaktywna domeną wiążącą celulozę lub natywne EG bez CBH, przykładowo, lecz nie wyłącznie, EG3 lub ich kombinację. Białko rdzeniowe endoglukanazy (ECP) charakteryzuje się posiadaniem aktywności rdzenia endoglukanazy wraz, ze zredukowaną lub nie, aktywnością wiążącą celulozę dla CBD.
Mieszaniny celulazowe, jak opisano tu powyżej, mogą także obejmować β-glukozydazę (BG). β-glukozydazę można uzyskać z dowolnego stosownego gospodarza, przykładowo, lecz nie wyłącznie, z Trichoderma, Hypocrea, Thermomonospora, Aspergillus, Streptomyces, Cellulomonas, Humicola, Fusarium, Fibrobacter, Clostridium, Bacillus lub ich kombinacji. Jest pożądanym by β-glukozydaza była uzyskiwana z Aspergillus lub Trichoderma.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposób przekształcania celulozy w substracie celulozowym w glukozę obejmujący: poddanie, wstępnie obrobionego substratu lignocelulozowego, działaniu mieszaniny enzymatycznej obejmującej celobiohydrolazę, β-glukozydazę, enzymy EG i białko rdzeniowe endoglukanazy (ECP), gdzie enzymy EG obejmują od 2% (wagowo) do 50% (wagowo) całkowitej ilości enzymów CBH i EG (ilość enzymu BG nie jest włączona do tego określenia) w obecnej mieszaninie celulaz i ECP stanowi od 35% (wagowo) do 100% (wagowo) wszystkich enzymów typu EG. Nie obserwuje się znaczącej utraty aktywności mieszaniny celulaz jak opisano powyżej, jeśli cała endoglukanaza jest wymieniona przez rdzeń endoglukanazy (fig. 1). Jak wskazano powyżej korzystnie, ilość ECP wynosi od około 50 do 90% (wagowo) enzymu typu EG i korzystniej, od około 60 do około 80% (wagowo). Korzystne jest jeśli białko rdzeniowe endoglukanazy jest endoglukanaza z Trichoderma.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem możliwym jest wytorzenie użytecznej w sposobie według wynalazku kompozycji celulaz obejmującej CBHI, CBHII, EGI, EGII, EGIII, β-glukozydazę i białko rdzeniowe endoglukanazy, gdzie ECP jest obecne w kompozycji celulaz w ilości, w stosunku do wszystkich typów enzymu EG, od około 35 do około 100% (wagowo). Jest pożądanym, by ECP stanowiło od około 50 do 90% (wagowo) enzymu typu EG a w szczególności od około 60 do 80% (wagowo). Szczególnie użyteczne jest, gdy ECP jest endoglukanaza z Trichoderma. Do mieszaniny celulaz (obejmującej jedno lub więcej z CBHI, CBHII, EGI, EGII, EGIII i β-glukozydazy) można dodać białko rdzeniowe endoglukanazy wytworzonej przez, przykładowo, lecz nie wyłącznie, grzyby nitkowate, a zwłaszcza Trichoderma. Podobnie, białko rdzeniowe endoglukanazy można wytworzyć w gospodarzu zdolnym do wytwarzania enzymatycznej mieszaniny celulaz (obejmującej CBHI, CBHII, EGI, EGII, EGIII i β-glukozydazę).
Sposób przekształcania celulozy w glukozę może być również prowadzony przy użyciu mieszaniny enzymatycznej obejmującej CBHI, CBHII, EGI, EGII, EGIII, β-glukozydazę i białko rdzeniowe endoglukanazy, gdzie białko rdzeniowe endoglukanazy, przykładowo, rdzeń EG z nieaktywną domeną wiążącą celulozę, jest przykładowo obecne w kompozycji celulaz w ilości, w stosunku do wszystkich enzymów typu EG, od około 35 do około 100% (wagowo). W takiej sytuacji rdzeń EG z nieaktywną domeną może stanowić od około 50 do 90% (wagowo) enzymu typu EG i korzystniej od około 60 do 80% (wagowo), przy czym jest pożądanym by EG z nieaktywną domeną wiążącą celulozę pochodziło z Trichoderma. Inaktywację CBD z EG można osiągnąć przy użyciu dowolnej stosownej metody
PL 208 254 B1 według Linder (Linder i wsp., 1995 i 1999, włączone tutaj na drodze odniesienia). Przytoczone niniejszym odnośniki literaturowe opisują zmiany pojedynczych aminokwasów w CBD, wynikiem których jest częściowa lub całkowita utrata zdolności CBD do wiązania celulozy. Inne metody inaktywacji CBD mogą obejmować delecje części CBD lub insercje sekwencji peptydowej w CBD w celu uszkodzenia aktywności wiążącej CBD.
Specjaliści w dziedzinie rozumieją, że hydroliza celulozy może zachodzić w zróżnicowanych warunkach. Hydrolizę celulozy można przeprowadzić za pomocą celulaz w zawiesinie wody i celulozy obejmującej około 1 do około 25% (wagowo) lignocelulozowych składników stałych, w pH od około 4 do około 5 i temp. około 50°C. Przy stężeniach stałych składników lignocelulozowych poniżej 1% (wagowo) uzyskiwany rozcieńczony roztwór glukozy jest typowo zatężany dla dalszego przetwarzania. Sposób nie jest użyteczny jeśli pojawia się możliwość przeprowadzenia tego etapu zatężania. Przy wysokich stężeniach celulozy, powyżej 25% (wagowo) stałych składników lignocelulozowych, stałe składniki w reakcji mogą stać się zbyt trudne do mieszania, filtrowania i przetwarzania. Jest oczywistym dla specjalistów w dziedzinie, że po wstępnej obróbce materiały lignocelulozowe mogą wykazywać szeroki zakres zawartości celulozy, a zatem ilość materiału lignocelulozowego wymagana do osiągnięcia pożądanego stężenia celulozy może być różna. W takich przypadkach jest pożądanym by ilość wstępnie obrobionego substratu lignocelulozowego wynosiła od około 10% (wagowo) do około 16% (wagowo), a zwłaszcza od około 12% (wagowo) do około 16% (wagowo). Warunki te są stosowne dla większości celulaz. Należy również podkreślić, iż Twórcy niniejszego wynalazku rozważali także hydrolizowanie celulozy w innych warunkach, które mogą lepiej pasować dla konkretnej celulazy/rdzenia EG, EG-rdzenia EG lub innych mieszanin obejmujących białko rdzeniowe EG jak tu zdefiniowano. Warunki takie mogą być jednak z łatwością określone przez specjalistę w dziedzinie.
Niniejszy wynalazek ujawnia również kompozycję celulaz obejmującą CBHI, CBHII, EGI, EGII,
EGIII, β-glukozydazę i białko rdzeniowe endoglukanazy, gdzie enzym EG jest obecny w kompozycji celulaz w ilości od 2% (wagowo) do 50% (wagowo) w stosunku do obecnych CBH i EG. Specjaliści w dziedzinie są świadomi tego, że enzymy CBH i EG działają synergistycznie. Ilość EG mniejsza niż 2% (wagowo) w odniesieniu do całkowitej ilości enzymów CBH i EG może być za niska dla zajścia skutecznej hydrolizy. W miarę jak wzrasta ilość EG w stosunku do CBH wzrasta obserwowana wydajność. Wydajność przekształcania celulozy jest wyższa dla enzymów CBH w porównaniu z enzymami EG, zatem pożądane jest, aby mieszanina celulaz zawierała co najmniej około 50% CBH. Uważa się, że odpowiednia ilość CBH1 i CBH2 może wahać się od 25% (wagowo) do 95% (wagowo) CBH1. Specjaliści w dziedzinie są świadomi tego, że CBH1 i CBH2 także działają synergistycznie w hydrolizie celulozy do glukozy i aktywność tych enzymów w kombinacji jest wyższa niż suma pojedynczych aktywności.
Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku można zastosować dowolne źródło systemu celulaz, choć szczególnie użyteczne celulazy pochodzą z Trichoderma longibrachiatum i Trichoderma reesei lub z ich kombinacji. Ponadto, EG i białko rdzeniowe EG, przykładowo, lecz nie wyłącznie, rdzeń EG2, korzystnie są także uzyskiwane z T. longibrachiatum i T. reesei lub z ich kombinacji.
Surowe celulazy z Trichoderma, stosowane jako podstawowe w sposobie według niniejszego wynalazku, można uzyskiwać bezpośrednio poprzez hodowanie stosownego mikroorganizmu lub enzymy można nabywać handlowo (np. z Iogen Corporation). Białko rdzeniowe EG można uzyskiwać poprzez ekspresję odpowiednich sekwencji genetycznych w komórce stosownego gospodarza, jak to się powszechnie przeprowadza w dziedzinie i jak opisano w opisie patentowym USA nr 5874276 (włączonym tu na drodze odniesienia) lub białko rdzeniowe EG można przygotować poprzez enzymatyczne cięcie EG, jak opisano powyżej. Podobnie rdzeń EG z łącznikiem można uzyskać poprzez ekspresję sekwencji nukleotydowej obejmującej rdzeń EG i region łącznikowy lub poprzez proteolityczne cięcie holoenzymu. EG z nieaktywną domeną wiążącą celulozę można uzyskać jak opisano powyżej, poprzez ekspresję odpowiedniej sekwencji genu kodującego nieaktywną CBD lub przez podstawienie, delecje lub insercje, co będzie znane specjaliście w dziedzinie.
Specjalista w dziedzinie jest świadomy faktu, że ilość celulazy użytej w procesie hydrolizy celulozy do glukozy można określić stosowanie do natury substratu celulozowego, sposobu wstępnej obróbki, kosztu enzymów, pożądanego czasu hydrolizy i pożądanej wydajności pozyskiwania glukozy z danego substratu celulozowego. Typowa dawka enzymu zawiera się w zakresie około 1 do około 50 jednostek papieru filtracyjnego (FPU) celulazy na gram celulozy przez okres czasu od około 3 do około 200 godz. W korzystnym wykonaniu dawka celulazy wynosi od około 1 do około 10 FPU na gram celulozy.
PL 208 254 B1
Specjaliści w dziedzinie są świadomi również tego, że stężenie celulozy powinno być dobrane tak, aby przystosować zdolności pomp do przesuwania i mieszania składników stałych. W zależności od materiału, stężenie wstępnie obrobionego substratu lignocelulozowego do użycia w hydrolizie celulozy w glukozę wynosi od około 1% (wagowo) do około 25% (wagowo). Korzystna ilość wstępnie obrobionego substratu lignocelulozowego wynosi od około 10% (wagowo) do około 16% (wagowo).
Figura 1 pokazuje względną aktywność mieszaniny celulaz gdzie procent białka rdzeniowego endoglukanazy wzrasta względem całkowitej endoglukanazy w mieszaninie. Mieszanina celulaz zastosowana w tym doświadczeniu, która nie jest rozpatrywana w żaden sposób jako wyłączna, zawiera 18% (wagowo) endoglukanazy względem obecnych enzymów EG i CBH. Ilość białka rdzeniowego endoglukanazy zmieniała się do maksymalnego procentu raportowanego dla Trichoderma (33% (wagowo) do 100% (wagowo)). Jeśli ilość białka rdzeniowego endoglukanazy wzrasta względem całkowitej endoglukanazy w mieszaninie od 33% do 100%, obserwowana jest tylko niewielka utrata aktywności hydrolitycznej. Aktywność enzymatyczną można porównać stosując ustalone Et i porównując procent przekształcenia celulozy.
Et jest zdefiniowane jako stężenie w mg celulazy na g celulozy pomnożone przez czas reakcji w godz. Stosując tę analizę, przy Et = 1000 (mg/g)godz. (patrz przykład 1, Tab. 2 i fig. 1), obserwowano tylko 13% zmniejszenie aktywności kiedy 100% białka rdzeniowego endoglukanazy było obecne w mieszaninie enzymatycznej w porównaniu z Et obserwowanym przy 33% ECP w mieszaninie EG.
Ponieważ podniesienie względnej ilości białka rdzeniowego endoglukanazy nie obniża aktywności mieszaniny celulaz (fig. 1), zbadano zdolność odzyskiwania rdzenia EG2 względem EG2. Jak pokazano na fig. 2A, podczas hydrolizy wstępnie obrobionego materiału lignocelulozowego, ilość rdzenia EG2 pozostająca w roztworze, po częściowym odzyskaniu białka była większa, 30 do 85%, od ilości EG2. Podczas hydrolizy Sigma-cell™ ilość ECP pozostającego w roztworze była ponad dwukrotnie wyższa w porównaniu z EG2. Białko rdzeniowe EG, przykładowo, lecz nie wyłącznie, rdzeń EG2 można łatwiej odzyskiwać niż EG i ta właściwość może być korzystna dla hydrolizy celulozy.
Odnośnie fig. 3, pokazuje ona podsumowanie stosownych aktywności EG2 i rdzenia EG, których obserwowana stabilność była porównywalna przez 15 do 20 dni w 50°C i pH 4,8. Ta właściwość może być korzystna przy odzyskiwaniu i ponownym użyciu enzymów w hydrolizie celulozy.
Enzym pozostający w roztworze po hydrolizie można odzyskiwać stosując standardowe techniki znane w dziedzinie. Przykładowo, co nie jest rozpatrywane w żaden sposób jako wyłączne, z mieszaniny reakcyjnej można usunąć frakcję stałą, poprzez filtrację lub wirowanie, i białko pozostające w roztworze można oddzielić od roztworu cukru i odzyskać poprzez ultrafiltrację lub wytrącanie, w tym wytrącanie indukowane pH, solą lub temperaturą.
Zatem wynalazek ten jest skierowany na hydrolizę substratów celulozowych wykorzystującą mieszaniny celulaz zawierające białko rdzeniowe endoglukanazy (ECP) takie jak-białko rdzeniowe EG2, które charakteryzuje się obniżoną tendencją do wiązania substratów celulozowych, lecz stale zachowuje wysoką aktywność.
Odnosi się on także do sposobu hydrolizy substratu celulozowego obejmującego dodanie wystarczającej ilości ECP takiego jak rdzenia EG, do mieszaniny celulaz i umożliwienie zajścia reakcji przez okres czasu wystarczający dla hydrolizy celulozy w glukozę.
Niniejszy wynalazek ilustrują zamieszczone poniżej przykłady wykonania. Jednakże, dla specjalisty w dziedzinie jest oczywistym, że przykłady te służą jedynie celom ilustracyjnym i w żaden sposób nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Hydroliza za pomocą mieszanin enzymów z różnymi poziomami rdzenia EG
Zastosowany substrat stanowi cały owies jak w opisie patentowym USA nr 4461648; proces wstępnej obróbki obejmował dodawanie do całego owsa kwasu siarkowego, w ilości od około 0 do 5%, a zakwaszoną mieszaninę gotowano przez około 5 sek. do 2 min w temp. około 180 do około 250°C. Zawartość celulozy w materiale po wstępnej obróbce wynosi 50%.
Oczyszczone CBH1 i CBH2 uzyskiwano z surowego bulionu celulaz z Trichoderma poprzez pierwsze filtrowanie bulionu przez bibułę filtracyjną z mikrowłókna szklanego. Następnie płyn celulazowy dializowano stosując membranę o wartości odcięcia 10000 MW, w celu zmniejszenia jego przewodzenia do 12000 μβ. Wzbogacanie w CBH1 prowadzono przez naniesienie 190 mg białka/ml żywicy jonowymiennej DEAE Sepharose o pH 6. Przed CBH1 z żywicy usuwano inne składniki za
PL 208 254 B1 pomocą przepływającego 50 mM buforu fosforanowego z 25 mM NaCl, przy przewodzeniu przez kolumnę równym 9000 μβ. CBH1 usuwano za pomocą przepływającego 50 mM buforu fosforanowego z 25 mM NaCl, przy przewodzeniu przez kolumnę równym 30000 μβ. Następnie CBH1 zagęszczano poprzez ultrafiltrowanie, a jego czystość określano za pomocą zestawu elektroforetycznego LKB Bromma do izoelektroogniskowania.
CBH2 oczyszczano poprzez dializę do 700 μβ i nanoszenie mieszaniny pozbawionej CBH1, otrzymanej powyżej, na żywicę jonowymienną z sefarozą β, zrównoważoną buforem octanowym o pH 5. Wzbogacanie w CBH2 przeprowadzano poprzez zbieranie słabo związanych białek zebranych przy przewodzeniu 1300 μβ. Mieszaninę wzbogaconą w CBH2 dializowano wobec buforu octanowego o pH 4 i przepuszczano przez kolumnę z sefarozą CM. CBH2 usuwano z kolumny przy pomocy 6 mM buforu octanowego z 40 mM NaCl, przy przewodzeniu 5100 μβ. Czystość CBH2 określano poprzez izoelektroogniskowanie.
EG1 i EG2, i EG3 uzyskiwano poprzez zbieranie niezwiązanych białek z opisanej powyżej kolumny z sefarozą β. Alternatywnie hodowlę wzbogaconą w EG, EG2 i EG3 można uzyskać ze szczepu Trichoderma pozbawionego CBH1 i CBH2. Rozdzielenie EG1 i EG2 przeprowadzano metodami chromatoogniskowania, które były możliwe, dzięki zastosowaniu żywicy anionowymiennej PBE 94 i 12,5% roztworu polibuforu 74 oraz 0,025 M buforu imidazolowego o pH 7,4 pozwalającego na uzyskanie gradientu od pH 4 do pH 7. EG2 (pl = 5,3) eluowano przed EG1 (pl = 4,6). Czystość określono w żelu SDS-PAGE i izoelektroforezę kapilarną w aparacie do kapilarnej elektroforezy PAGE Beckman MDQ.
Rdzeń EG2 uzyskiwano stosując szczep Trichoderma wzbogacony w rdzeń EG2 przy pomocy krótkiego oczyszczania termicznego (pH 5,1, 60°C, 4 godz.), a następnie etapu chromatoogniskowania stosując gradient pH od 4 do 7, żywicę anionowymien-ną PBE 94 i 12,5% roztwór polibuforu 74, jak opisano powyżej. Czystość określono poprzez żel SDS-PAGE i izoelektroforezę kapilarną.
Reakcje hydrolizy zawierały 5% celulozy w 50mM buforze cytrynianowym o pH 4,8 w całkowitej masie 2,5 gramów. Do każdej probówki na gram celulozy dodawano 116 jedn. β-glukozydazy. Dla każdej reakcji przygotowywano pięć dawek mieszaniny enzymu 6,25; 12,5; 25; 50; 75 mg enzymu/gram celulozy. Każda dawka miała skład % (wagowo) jak opisano w Tab. 2. Mieszaniny zawierały 18% endoglukanazy w stosunku do ilości CBH i enzymu EG. Wychodząc z początkowej kompozycji zawierającej 33% białka rdzeniowego endoglukanazy w odniesieniu do całkowitego białka endoglukanazy, uzyskano wzrost zawartości białka rdzeniowego EG do 100%. Mieszaniny inkubowano przez 20 godz. w 50°C z wytrząsaniem przy 250 RPMP. Po tym czasie mieszaninę filtrowano przez bibułę filtracyjną z mikrowłókna szklanego. Ilość pozostałej celulozy w reakcji mierzono poprzez przemianę polimerycznej celulozy w glukozę, przy użyciu hydrolizy kwaśnej i pomiar glukozy z zastosowaniem sprzężonego testu z oksydazą glukozy/peroksydazą z chrzanu (Bauminger, 1974).
Mieszaninę celulaz z pojedynczych składników można przygotować w dwojaki sposób. W tym doświadczeniu składniki celulazowe są łączone przy użyciu stosunku % (wagowo), gdzie % (wagowo) pojedynczego składnika jest wyliczany w odniesieniu do całkowitej mieszaniny celulaz złożonej z CBH1, CBH2, EG1, EG2 i EG3. β-glukozydazę dodaje się do tej mieszaniny w nadmiarze (116 jedn./g celulozy). Składniki celulazowe można również mieszać stosując stosunek molowy. Przykładowo, Schulein połączył CBH1 i EGV z Humicola insolens w stosunku molowym 90:5. Przyjmując, że masa cząsteczkowa tych dwóch składników wynosi odpowiednio 72 kD i 30 kD, taki stosunek molowy odpowiada 2,3% (wagowo) endoglukanazy w całkowitej ilości CBH i EG. Przyjmując, że rdzeń EGV posiada masę cząsteczkową 22 kDa, stosunek molowy CBH1 do rdzenia EGV 90:5 będzie odpowiadać 1,7% (wagowo) białka rdzeniowego endoglukanazy w całkowitej ilości CBH i enzymu EG.
Dla każdej mieszaniny enzymatycznej oznaczano ilość przekształconej celulozy (Tab. 2) przy ustalonym Et=1000, gdzie Et jest definiowane jako produkt stężenia enzymu w mg enzymu/g celulozy pomnożony przez czas w godzinach na reakcję. Względną aktywność mieszaniny enzymów jako funkcja kompozycji rdzenia EG przedstawiono w Tab. 2, a graficznie przedstawiono na fig. 1. Można zauważyć, że kiedy ilość białka rdzeniowego endoglukanazy wzrasta z 33% (wagowo) do 80% (wagowo) aktywność pozostaje stała. Mały spadek aktywności, wynoszący około 13%, obserwuje się przy zwiększeniu ilości białka rdzeniowego endoglukanazy z 80% (wagowo) do 100% (wagowo), w stosunku do całkowitego białka rdzeniowego endoglukanazy.
PL 208 254 B1
T a b e l a 2
Względna aktywność przy wzrastającym stężeniu rdzenia endoglukanazy w mieszaninie celulaz*
| EG (%całkowitej celulazy) | % rdzenia w mieszaninie EG | % przekształcenia przy Et=1000 (mg/g)godz. | Względna aktywność |
| EG1(6):EG2(6):EG3(6) | 33 | 74,2 | 1,00 |
| EG1(6):EG2(3):rdzeń EG2(3): EG3(6) | 50 | 77,2 | 1,04 |
| EG1(6):rdzeń EG2(6):EG3(6) | 67 | 73,5 | 0,99 |
| EG1(3):rdzeń EG2(7):EG3(8) | 83 | 71,7 | 0,96 |
| rdzeń EG2(9):EG3(9) | 100 | 65,0 | 0,87 |
*całkowita mieszanina celulaz zawiera 76% CBH1,6% CBH2, 18% EG i 116 jedn. β-G na gram celulozy.
Dane te pokazują, że białko rdzeniowe endoglukanazy jest aktywne w pełnym zakresie ilości białka rdzeniowego EG (ECP), w kompozycji enzymu typu EG.
P r z y k ł a d 2. Odzyskiwanie białka z roztworu po hydrolizie
Jak opisano powyżej, przygotowano trzy niezależne reakcje hydrolizy 5% celulozy w 50 mM buforze cytrynianowym o pH 4,8 zawierającym EG2, EG2:rdzeń EG2 (w stosunku 50% (wagowo)) i rdzeń EG2. Po 24, 48 i 72 godz. inkubacji w 50°C, mieszaniny reakcyjne filtrowano w celu usunięcia pozostałych składników stałych i mierzono ilość białka pozostałego w roztworze po reakcji.
Pomiar białka wykonano stosując test białkowy Biorad używając jako wzorzec, komercyjny produkt Iogen Cellulase (90g/l). Wyniki przedstawiono w Tab. 3. Dwa analizowane substraty stanowiły łuski owsa i Sigmacell™.
T a b e l a 3
Białko pozostające w roztworze po hydrolizie
| Substrat/enzym | % odzyskanego białka | ||
| 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | |
| łuski owsa | |||
| EG2 | 39,6 | 34,1 | 29,1 |
| EG2:rdzeń EG2 | 37,4 | 36,0 | 37,4 |
| rdzeń EG2 | 53,9 | 43,8 | 53,9 |
| Sigmacell | |||
| EG2 | 38,5 | 41,2 | 38,4 |
| EG2:rdzeń EG2 | 70,9 | 56,0 | 70,9 |
| rdzeń EG2 | 85,1 | 76,8 | 85,1 |
Ilość rdzenia EG2 w roztworze w czasie procesu hydrolizy jest wyższa niż ilość EG2. W roztworze po hydrolizie można wykryć około 30 do 85% więcej rdzenia EG2 niż EG2. Obserwowano to zarówno dla lignocelulozowego substratu o dużej powierzchni jak cały owies jak i Sigmacell™. Wyniki te przedstawiono graficznie na fig. 2A i 2B. Przyjmując, że rdzeń EG2 jest tak samo wydajny jak EG2 w mieszaninie celulazy jak tu opisano, zastosowanie rdzenia EG2 daje możliwość odzysku i ponownego zastosowania. Zaobserwowano również, że ilość białka pozostającego w roztworze jest zależna od substratu i bez konieczności wiązania z teorią może być zależna od ilości ligniny obecnej w lignocelulozowym substracie.
Po zakończeniu reakcji hydrolizy, enzymy pozostające w roztworze mogą być odzyskiwane z mieszaniny reakcyjnej poprzez usunięcie składników stałych, niebiorących udziału w reakcji, za pomocą filtracji i rozdzielania oraz odzyskiwania enzymów z wodnego roztworu cukru stosując ultrafiltrację. Enzym można również odzyskać poprzez wytrącanie z wodnego roztworu cukru, przykładowo poprzez wytrącanie indukowane pH, solą lub temperaturą.
PL 208 254 B1
P r z y k ł a d 3. Stabilność EG2 i rdzenia EG2 w roztworze
Stabilność oczyszczonych EG2 i rdzenia EG2 oceniano w typowych warunkach hydrolizy. Enzymy inkubowano odpowiednio w stężeniu 2,4 mg/ml i 2,9 mg/ml w buforze cytrynianowym o pH 4,8 w temp. 50°C. Pobierano porcje i oceniano poziom hydrolizy karboksymetylocelulozy (CMC) poprzez ilościowe oznaczanie redukcji cukrów stosując DNS.
Wyniki przedstawiono na fig. 3. Zarówno EG2 jak i rdzeń EG2 były w stabilne takim samym stopniu. Przyjmując, że rdzeń EG2 jest tak samo stabilny i tak samo aktywny w mieszaninie enzymatycznej celulaz, jak tu opisano, a także jest łatwiejszy w odzyskiwaniu niż EG2, daje to możliwość jego odzysku i ponownego zastosowania.
P r z y k ł a d 4. Sposób określania procentu EG i białka rdzeniowego EG w mieszaninie celulaz.
Mieszaniny celulaz z Trichoderma, wytwarzane przez szczep RUT-C30 (dostępny w ATCC #56765) analizowano pod względem składu. Oznaczenia CIEF wykonywano w aparacie PAGE 5000.
Rozdziały przeprowadzano stosując obojętną kapilarę Beckman eCAP (ID 50 μΜ X OD 365 μΜ, długość 27 cm). Wzorce celulaz lub ekstrakty celulaz rozpuszczano do końcowego stężenia w roztworze wodnym zawierającym 3% zmieszanego nośnika amfolitowego (amfolit Beckman: Servalyt (3:1 v/v)). Anolitem był 10 mM kwas fosforowy, a katolitem był 20 mM NaOH. Zastosowano napięcie 13,5 kV w celu ogniskowania analizowanego prążka przez czas 10 min. po mobilizacji katodowej przy użyciu buforu metanol-woda-kwas octowy (50:49:1, obj./obj./obj.). Podczas ogniskowania i mobilizacji utrzymywane napięcie przy natężeniu pola wynosiło 13,5 kV (500V/cm). Detektor ustawiono na 280 nM. Stężenia białka wzorców i mieszaniny celulaz wydzielanej przez Trichoderma przeprowadzono w oparciu o oznaczanie według Bradford.
W tych warunkach, czasy migracji dla CBH1, CBH2, EG1, EG2 i EG3 wynosiły odpowiednio 31, 23, 29, 28 i 22 minuty. Czasy migracji mogą się różnić o około ±1 min., ale identyczność pików potwierdzano za pomocą wewnętrznych wzorców. Identyczność pików w mieszaninie potwierdzano za pomocą czterech wewnętrznych wzorców (mioglobina, pI 6,8; 7,2 - dwie izoformy), β-laktoglobulina A (pl = 5,l) i flankujący peptyd CCK (pl = 2,75), dostarczających czterech punktów do krzywej kalibracji, pI i identyczność poszczególnych pików jest potwierdzana poprzez kalkulację pI piku, stosując czas zatrzymania versus krzywa kalibracji pI wzorców.
Procent EG w odniesieniu do obecnych całkowitych EG i CBH obliczono na 8% w RUT-C30 (patrz Tab. 4). Procent EG jest określany jako stosunek białka EG do całkowitego EG i enzymów CBH obejmujących CBH1, CBH2, EG1, EG2 i EG3. Procent rdzenia endoglukanazy w ekstrakcie celulazy jest obliczony na podstawie ilości EG3 w odniesieniu do całkowitej ilości białka endoglukanazy. W mieszaninie celulaz nie obserwowano rdzenia EG1 i rdzenia EG2 i dlatego ilość białka rdzeniowego EG w ekstrakcie z RUT-C30 wynosi 0.
T a b e l a 4
Dystrybucja celulaz w ekstraktach wydzielanych białek uzyskanych z Trichoderma reesei.
| celulaza (ąg/ml) | RUT-C30 |
| CBH1 | 169,3±2,1 |
| rdzeń CBH1 | nie obserwowano |
| CBH2 | 8,1±0,2 |
| EG1 | 7,0±0,6 |
| rdzeń EG1 | nie obserwowano |
| EG2 | 8,2±0,6 |
| rdzeń EG2 | nie obserwowano |
| EG3 | nie obserwowano |
Wszystkie cytowania są tutaj włączone jako pozycje piśmiennictwa.
Niniejszy wynalazek opisano powyżej w odniesieniu do konkretnych przykładowych wykonań wynalazku. Jednakże dla specjalistów w dziedzinie jest oczywistym, że można dokonać ich licznych zmian i modyfikacji bez odchodzenia od zakresu wynalazku.
PL 208 254 B1
Odnośniki literaturowe:
Bissett, F.H., (1979) J. Chrom. 178, 515-523
Bauminger, B.B., (1974) J. Clin. Pathol. 27, str. 1015
Bhikhabhai, R. i wsp., (1984) J. App. Biochem. 6, 336-345
Fan i wsp, Evaluation of pretreatments for enzymatic conversion of agricultural residues, Proceedings of the Third Symposium on Biotechnology in Energy Production and Conservation, (Gatlinburg, Tennessee, 12-15 maj, 1981)
Gilkes i wsp., (1992) J. Biol. Chem. 267, 6743-6749
Grethlein i Converse (1991) Bioresource Technology 36 (2), 77-82
Grohmann i wsp., Optimization of dilute acid pr.etreatment of biomass, Seventh Symposium on
Biotechnology for Fuels and Chemicals ( (Gatlinburg, Tennessee, 14-17 maj, 1985)
Henrissat i wsp., (1997) Curr. Opinl. 7, 637-644
Henrissat i wsp., (1998) FEBS Lett.425, 352-254
Hui J. i wsp, (2001) J. Chrom. B. 752, 349-368
Hui, J. i wsp, (2001) Praca magisterska, University of Ottawa
Kotiranta, P. i wsp., (1999) App. Biochem. Biotech. 81, 81-90
Linder i wsp., (1995) Prot. Sci. 4, 1056-1064
Linder i wsp., (1999) FEBS Lett. 447, 13-16
Macarron i wsp., (1995) Biochim. Biopys. Acta 1245, 187-190
Knappert i wsp., (1980) Biotech. and Bioeng.23, 1449-1463
Nidetzky i wsp., (1994) Biochem. J. 303, 817-823
Penttila, M. i wsp., (1986) Gene 45, 253-263
Saloheimo, M. i wsp., (1988) Gene 63, 11-21
Schulein, M. Proceedings from CIFAR Conference XIV, UC Davis, 4 czerwiec, 2001
Shoemaker i wsp., (1983) Bio/Technology 1, 691-696
Stahlberg i wsp., (1988) Eur. J. Biochem. 173, 179-183
Teeri i wsp., (1987) Gene 51, 43-52
Teeri i wsp., (1992) J. Biotech. 24, 169-176
Teeri, T.T. i Koivuval A., (1995) Carbohydr. Eur. 12, 28
Tomme i wsp., (1988) Eur. J. Biochem. 170, 570-581.
Claims (20)
1. Sposób przekształcania celulozy w glukozę, znamienny tym, że poddany wstępnej obróbce substrat lignocelulozowy poddaje się działaniu mieszaniny enzymatycznej obejmującej celobiohydrolazę (CBH), β-glukozydazę i endoglukanazy (EG), przez okres czasu wystarczający do przekształcenia od 60% do 100% cellulozy w glukozę, przy czym wspomniane enzymy EG stanowią od 2% (wagowo) do 50% (wagowo) enzymów CBH i EG, i gdzie wspomniane enzymy EG zawierają od 35% (wagowo) do 100% (wagowo) białka rdzeniowego endoglukanazy (ECP).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzymy EG stanowią 7% (wagowo) do 30% (wagowo) enzymów CBH i EG.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ECP stanowi od 50% (wagowo) do 90% (wagowo) enzymu EG.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ECP stanowi od 60% (wagowo) do 80% (wagowo) enzymu EG.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ECP jest wybrane z grupy składającej się z rdzenia EGI, rdzenia EGII, EGI z nieaktywną domeną wiążącą celulozę, EGII z nieaktywną domeną wiążącą celulozę, rdzenia EGI z łącznikiem, rdzenia EGII z łącznikiem i ich kombinacji.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że CBH, β-glukozydaza i enzymy EG uzyskuje się z Trichoderma, Hypocrea, Thermomonospora, Aspergillus, Streptomyces, Cellulomonas, Humicola, Fusarium, Fibrobacter, Clostridium, Bacillus i ich kombinacji.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że CBH i enzymy EG uzyskuje się z Trichoderma, a β-glukozydazę uzyskuje się z Aspergillus lub Trichoderma.
PL 208 254 B1
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że CBH i enzymy EG uzyskuje się z Trichoderma reesei.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo po tym jak poddany wstępnej obróbce substrat lignocelulozowy poddaje się działaniu mieszaniny enzymatycznej obejmuje odzyskiwanie ECP.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że omawiany ECP jest ponownie używany po omawianym etapie odzyskiwania.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wstępnie obrobiony substrat lignocelulozowy wybiera się z grupy składającej się z odpadów rolnych, odpadów po usunięciu skrobi lub cukru, przeznaczonych do tego produktów etanolowych, produktów leśnych oraz masy celulozowej i produktów papierniczych lub ich kombinacji.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że:
odpady rolne są wybrane z grupy składającej się ze słomy z wymłóconej kukurydzy, słomy z pszenicy, słomy z jęczmienia, słomy z wymłóconej soi;
odpady po usunięciu skrobi lub cukru są wybrane z grupy składającej się z łusek z owsa, łusek z ryżu, wytłoków trzciny cukrowej i włókna zbożowego;
przeznaczone do tego produkty etanolowe są wybrane z grupy składającej się z prosa rózgowego, traw olbrzymich z rodzaju Miscanthus, spartiny i życicy; oraz produkty leśne są wybrane z grupy składającej się z drewna twardego, drewna miękkiego, rodzaju Eucalyptus i trocin.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wstępnie obrobiony substrat celulozowy poddany działaniu mieszaniny enzymatycznej jest obecny w stężeniu od 1% (wagowo) do 25% (wagowo).
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że substrat celulozowy poddany działaniu mieszaniny enzymatycznej jest obecny w stężeniu od 10% (wagowo) do 16% (wagowo).
15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że etap odzyskiwania obejmuje strącanie ECP lub zastosowanie do odzyskania ECP z roztworu filtra do ultrafiltracji.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wstępną obróbkę substratu celulozowego prowadzi się poprzez gotowanie w kwaśnej parze.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzymy CBH obejmują celobiohydrolazę I (CBHI) i celobiohydrolazę II (CBHII).
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że CBHI stanowi od 25% (wagowo) do 95% (wagowo) enzymów CBH.
19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że CBHI pochodzi z Trichoderma.
20. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że CBHII pochodzi z Trichoderma.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36402002P | 2002-03-15 | 2002-03-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL372388A1 PL372388A1 (pl) | 2005-07-25 |
| PL208254B1 true PL208254B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=28041858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL372388A PL208254B1 (pl) | 2002-03-15 | 2003-03-05 | Sposób przekształcania celulozy w glukozę |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8012721B2 (pl) |
| EP (1) | EP1485495B1 (pl) |
| AT (1) | ATE481496T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003208215A1 (pl) |
| CA (1) | CA2479248C (pl) |
| DE (1) | DE60334193D1 (pl) |
| DK (1) | DK1485495T3 (pl) |
| PL (1) | PL208254B1 (pl) |
| WO (1) | WO2003078644A2 (pl) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8580541B2 (en) * | 2003-03-19 | 2013-11-12 | The Trustees Of Dartmouth College | Lignin blockers and uses thereof |
| US7604967B2 (en) * | 2003-03-19 | 2009-10-20 | The Trustees Of Dartmouth College | Lignin-blocking treatment of biomass and uses thereof |
| US7910338B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-03-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Integration of alternative feedstreams for biomass treatment and utilization |
| US7781191B2 (en) | 2005-04-12 | 2010-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain a target chemical |
| US20070029252A1 (en) | 2005-04-12 | 2007-02-08 | Dunson James B Jr | System and process for biomass treatment |
| ES2606281T3 (es) | 2005-07-19 | 2017-03-23 | Inbicon A/S | Método y aparato para la conversión de material celulósico en etanol |
| FI120045B (fi) | 2005-12-22 | 2009-06-15 | Roal Oy | Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit |
| CN101437594B (zh) * | 2006-02-13 | 2012-07-04 | 唐纳森公司 | 包括细纤维和反应、吸附或吸收颗粒的过滤网 |
| CA2661531C (en) | 2006-08-18 | 2014-06-17 | Iogen Energy Corporation | Method of obtaining an organic salt or acid from an aqueous sugar stream |
| US8017373B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-09-13 | Iogen Energy Corporation | Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks |
| US8980599B2 (en) * | 2007-08-02 | 2015-03-17 | Iogen Energy Corporation | Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock |
| US8445236B2 (en) | 2007-08-22 | 2013-05-21 | Alliance For Sustainable Energy Llc | Biomass pretreatment |
| PL2188381T3 (pl) | 2007-08-30 | 2012-05-31 | Iogen Energy Corp | Enzymatyczna hydroliza surowców lignocelulozowych z zastosowaniem enzymów pomocniczych |
| BRPI0816478B1 (pt) * | 2007-08-30 | 2018-02-14 | Iogen Energy Corporation | Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação |
| EP2235191A2 (en) * | 2007-11-01 | 2010-10-06 | Novozymes Inc. | Methods of reducing the inhibitory effect of a redox active metal ion on the enzymatic hydrolysis of cellulosic material |
| FR2925521B1 (fr) * | 2007-12-20 | 2009-12-18 | Inst Francais Du Petrole | Complementation du secretome de trichoderma reesei limitant les contaminations microbiologiques dans le cadre de procedes industriels. |
| KR20110004861A (ko) * | 2008-04-29 | 2011-01-14 | 다니스코 유에스 인크. | 셀룰라아제의 효율을 증가시키는 방법 및 스올레닌 조성물 |
| US8212087B2 (en) | 2008-04-30 | 2012-07-03 | Xyleco, Inc. | Processing biomass |
| WO2010080489A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-07-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Ozone treatment of biomass to enhance enzymatic saccharification |
| EP3594354A1 (en) | 2010-03-19 | 2020-01-15 | Poet Research Incorporated | Method for producing a fermentation product from biomass |
| EP2547779A1 (en) | 2010-03-19 | 2013-01-23 | POET Research, Inc. | System for treatment of biomass to facilitate the production of ethanol |
| US9663807B2 (en) | 2011-01-18 | 2017-05-30 | Poet Research, Inc. | Systems and methods for hydrolysis of biomass |
| CA2840995A1 (en) | 2011-07-07 | 2013-01-10 | Poet Research Incorporated | Systems and methods for acid recycle |
| CN103304281B (zh) * | 2013-06-17 | 2014-07-30 | 刘立鹤 | 一种有机废弃物快速资源化热酶好氧处理工艺 |
| CN108841810B (zh) * | 2018-07-21 | 2021-08-27 | 湖北大学 | 一种多功能纤维素酶基因及其应用 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3932307A (en) * | 1974-05-20 | 1976-01-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Tetra(neophyl) zirconium and its use in process for the polymerization of olefins |
| US4237226A (en) * | 1979-02-23 | 1980-12-02 | Trustees Of Dartmouth College | Process for pretreating cellulosic substrates and for producing sugar therefrom |
| US4461648A (en) * | 1980-07-11 | 1984-07-24 | Patrick Foody | Method for increasing the accessibility of cellulose in lignocellulosic materials, particularly hardwoods agricultural residues and the like |
| US4409329A (en) * | 1981-03-23 | 1983-10-11 | Gulf Research & Development Company | Saccharification method |
| FI841500A0 (fi) * | 1984-04-13 | 1984-04-13 | Valtion Teknillinen | Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar. |
| US4728613A (en) * | 1985-09-04 | 1988-03-01 | Miles Laboratories, Inc. | Method for the recovery of extracellular enzymes from whole fermentation beer |
| US5298405A (en) * | 1986-04-30 | 1994-03-29 | Alko Limited | Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production |
| US4826566A (en) * | 1988-01-11 | 1989-05-02 | Le Tourneau College | Rapid disolution of lignin and other non-carbohydrates from ligno-cellulosic materials impregnated with a reaction product of triethyleneglycol and an organic acid |
| US5712142A (en) * | 1989-09-26 | 1998-01-27 | Midwest Research Institute | Method for increasing thermostability in cellulase ennzymes |
| US5120463A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-09 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
| US5837515A (en) * | 1990-05-16 | 1998-11-17 | Alko-Yhtiot Oy | Enzyme preparations and methods for their production |
| US5861271A (en) | 1993-12-17 | 1999-01-19 | Fowler; Timothy | Cellulase enzymes and systems for their expressions |
| US5730837A (en) * | 1994-12-02 | 1998-03-24 | Midwest Research Institute | Method of separating lignocellulosic material into lignin, cellulose and dissolved sugars |
| US6184019B1 (en) * | 1995-10-17 | 2001-02-06 | Röhm Enzyme Finland OY | Cellulases, the genes encoding them and uses thereof |
| US6228629B1 (en) * | 1995-12-18 | 2001-05-08 | Röhn Enzyme Finland OY | Xylanases, genes encoding them, and uses thereof |
| US5922579A (en) * | 1995-12-18 | 1999-07-13 | Rohm Enzyme Finland Oy | Xylanases and uses thereof |
| US5859236A (en) * | 1996-02-29 | 1999-01-12 | Burkart; Leonard | Process for preparation of lignin and microcellulose |
| US5866407A (en) * | 1997-03-18 | 1999-02-02 | Iogen Corporation | Method and enzyme mixture for improved depilling of cotton goods |
| US5916780A (en) * | 1997-06-09 | 1999-06-29 | Iogen Corporation | Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol |
| EP1320588B2 (en) * | 2000-09-25 | 2017-06-28 | Iogen Energy Corporation | Method for glucose production with a cellulase mixture comprising a modified cellulase |
-
2003
- 2003-03-05 AT AT03706168T patent/ATE481496T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-03-05 WO PCT/CA2003/000299 patent/WO2003078644A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-03-05 DK DK03706168.6T patent/DK1485495T3/da active
- 2003-03-05 PL PL372388A patent/PL208254B1/pl unknown
- 2003-03-05 AU AU2003208215A patent/AU2003208215A1/en not_active Abandoned
- 2003-03-05 EP EP03706168A patent/EP1485495B1/en not_active Revoked
- 2003-03-05 US US10/507,618 patent/US8012721B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-05 CA CA2479248A patent/CA2479248C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-03-05 DE DE60334193T patent/DE60334193D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8012721B2 (en) | 2011-09-06 |
| ATE481496T1 (de) | 2010-10-15 |
| EP1485495A2 (en) | 2004-12-15 |
| EP1485495B1 (en) | 2010-09-15 |
| CA2479248C (en) | 2011-09-27 |
| DE60334193D1 (de) | 2010-10-28 |
| US20060008885A1 (en) | 2006-01-12 |
| AU2003208215A1 (en) | 2003-09-29 |
| WO2003078644A3 (en) | 2004-02-19 |
| WO2003078644A2 (en) | 2003-09-25 |
| CA2479248A1 (en) | 2003-09-25 |
| PL372388A1 (pl) | 2005-07-25 |
| DK1485495T3 (da) | 2010-11-22 |
| AU2003208215A8 (en) | 2003-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL208254B1 (pl) | Sposób przekształcania celulozy w glukozę | |
| Bhardwaj et al. | Current perspective on production and applications of microbial cellulases: a review | |
| EP1320588B2 (en) | Method for glucose production with a cellulase mixture comprising a modified cellulase | |
| RU2458128C2 (ru) | Способ обработки целлюлозного материала и используемые в нем ферменты | |
| RU2529949C2 (ru) | Ферментная композиция, способная эффективно разлагать целлюлозный материал | |
| CA2811789A1 (en) | Variant cbh i polypeptides with reduced product inhibition | |
| US20240254520A1 (en) | Polypeptides and compositions with lytic polysaccharide oxidase activity | |
| Dijkerman | (Hemi) cellulolytic enzymes from anaerobic fungi: production, characteristics and application potential |