KR100191564B1 - 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 분해 효소 - Google Patents

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한센 핀 베네드, 안네 제헤르
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Abstract

Trichoderma 또는 Phanerochaete 이외의 균류에서 유도될 수 있고, Trichoderma reesei 셀룰라제의 말단 A 부위에 유사한 탄소화물 결합 도메인을 포함하는 셀룰로스-또는 헤미셀룰로스-분해효소 탄수화물 결합 도메인은 불용성 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 아미노산 서열 (α) 또는 이것의 아서열을 포함한다.

Description

[발명의 명칭]
셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 분해 효소
[발명의 분야]
본 발명은 셀룰로스-또는 헤미셀룰로스-분해효소, 이 효소를 코딩하는 DNA 구조체, 효소 생산 방법 및 이 효소를 포함하는 셀루로스 또는 헤미셀룰로스를 분해하는 제제에 관한 것이다.
[발명의 배경]
생체물질(biomass)의 액체연료, 가스 및 식용단백질로의 전환을 위해 셀룰로스를 분해할 수 있는 효소가 이전에 제안되어 왔다. 그러나, 셀룰로스 분해효소를 이용한 생체물질에서의 발효당 생산은 현재 사용되는 셀룰로스 분해효소의 비효율성 때문에, 예를들어 α-아밀라제를 이용한 전분에서의 포도당 생산과는 경제적으로 경쟁이 불가능하다. 셀룰로스 분해효소는 β-글루칸을 분해하는 양조산업, 밀가루 특성을 개선하는 제과산업, 셀룰로스의 비-결정부분을 제거하여 펄프의 결정화된 셀루로스 부분을 증가시키능 종이펄프공정 및 글루칸의 소화력을 개선시킨 동물사료에 사용될 수 있다. 셀룰로스 분해효소의 더욱 중요한 용도는 직물 처리, 예컨대 면-혼방 직물의 껄껄함(harshness) 감소(예를들어 휴1368 599 또는 US 4,435,307 참조), 직물의 오물제거 및 색명료화(예를들어, EP 220 016 참조) 또는 직물에 스톤-세척된(stone-washed) 외관을 주어 색상의 부분적 변화를 제공하는 것(예를들어, EP 307 564 참조)이다.
셀룰로스분해 효소의 실용적 이용은 알려진 셀룰라제 제제가 종종 단일 셀룰라제 성분의 다양한 복합 혼합물이고 특이적 활성이 다소 낮아진 특성을 갖기 때문에 제한되어 왔다.
복합 효소계에서 하나의 성분의 생산을 최적화하는 것은 어렵고, 따라서 셀룰로스 분해 효소의 비용이 절감되는 공업적 생산을 수행하는 것이 어려우며, 그 실제적 용도는 기대효과를 달성하기 위해 다소 많은 양의 효소를 사용하는 필요성에서 야기되는 어려움 때문에 방해되어 왔다. 이전에 제시된 셀룰로스 분해효소의 결점은 높은 특이적 활성도를 갖는 단일-성분 효소를 이용하므로서 개선될 수 있다.
단일-성분의 셀루로스분해 효소는 예컨대 Trichoderma reesei에서 분리되어 있다.
(Teeri등, Gene 51, 1987, pp. 43-52 : P.M. Abuja, Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 1988, pp. 180-185 : 및 P.J. Kraulis, Biochemistry 28, 1989, pp. 7241-7257참조). T.reesei 셀룰라제는 셀룰로스와의 결합에 관여하는 말단 A 영역, 효소의 코아(core)에 A영역을 연결시키는 B영역, 및 촉매 활성 도메인을 포함하는 코아로 이루어져 있다. 다른 T.reesei 셀룰라제의 A영역은 매우 보존되어 있는 것으로 밝혀졌고, 강한 상동성이 또한 Phanerochaete chrysosporium에 의해 생산된 셀룰라제에서 관찰되었다(Sims 등, Gene 74, 1988, pp. 411-422).
[발명의 요약]
놀랍게도 Trichoderma reesei 또는 Phanerochaete chrysosporium과는 밀접한 연관이 없는 다른 진균이 T. reesei 셀룰라제의 A영역과 유사한 영역을 포함하는 효소를 생산할 수 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 Trichoderma 또는 Phanerochaete 이외의 진균에서 유래되고, Tri-choderma reesei 셀룰라제의 말단 A영역과 유사한 탄수화물 결합 도메인을 포함하는 셀룰로스-또는 헤미셀룰로스-분해 효소에 관한 것이다. 탄수화물 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열
또는 불용성 셀룰로스 또는 헤미셀루로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 이것의 아서열(subsequence)을 포함한다. Xaa는 다른 효소의 탄수화물 결합 도메인에 해당하는 아미노산 서열의 변이를 나타낸다. 하이픈은 (다른, 유사한 효소와 비교한) 아미노산 서열내의 갭(gap)을 나타낸다.
본 명세서에서, 셀룰로스 용어는 가용성 및 불용성, 무형 및 결정형의 셀룰로스를 포함한다. 헤미셀룰로스 용어는 글루칸(전분 제외), 만난(mannan), 크실란(xylan), 아라비난(arabinan) 또는 폴리글루쿠론산 또는 폴리갈락투론산을 포함한다. 탄수화물 결합 도메인(CBD) 용어는 탄수화물 기질, 특히 상기에 정의한 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 아미노산 서열을 가리킨다. 상동적인(homologous) 용어는 본 효소의 탄수화물 결합 도메인을 구성하는 아미노산 서열 및 T. reesei 셀룰라제에서 발견되는 A영역(A영역은 T. reesei 셀룰라제의 셀룰로스(예컨대 탄수화물) 결합 도메인을 나타내는 용어다)를 구성하는 아미노산 서열에 있어서 고도의 동일성을 가리킨다.
최근, T. reesei 셀룰라제 A영역에 대한 상동성에 근거하여 탄수화물 결합 도메인(또는 A영역)으로 간주할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 셀룰로스-또는 헤미셀룰로스-분해효소는 고체기질(셀룰로스 포함)의 결합을 매개하여 결과적으로 그러한 기질에 대한 효소의 활성을 증가시키는 효소분자의 탄수화물 결합 도메인의 작용결과로서 소정의 원하는 특성을 지니는 것으로 믿어진다. 각종의 미생물에서 탄수화물 결합 도메인을 포함하는 효소의 확인 및 제조는 상당히 흥미있는 것이다.
본 발명의 셀루로스- 또는 헤미셀룰로스- 분해효소를 T. reesei 셀룰라제의 적어도 A영역을 코팅하는 DNA를 포함하는 프로브(probe)로 여러 가지 진균의 게놈 또는 cDNA 라이브러리(library)를 스크리닝(screening)하여 용이하게 확인할 수 있다. 다른 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스- 분해효소의 탄수화물 결합 도메인에서 관찰된 종내(예컨대 다른 T. reesei 셀룰라제) 및 종간의 상동성 때문에 이 스크리닝 방법이 현재 관심있는 효소를 분리하는 편리한 방법이라고 믿는 것은 타당하다.
[발명의 상세한 설명]
탄수화물 결합 도메인(CBD)을 포함하는 본 발명의 효소는 특히, Humicola 균주, 예컨대 Humicola insolens, Fusarium 균주, 예컨대 Fusarium oxysporum, 또는 Myceliopthora thermophile에서 우래될 수 있다.
상기 아미노산 서열의 일부 변이는 보존적(conservative)인데, 어떤 아미노산들은 본 발명의 다양한 CBD- 함유 효소들에서 이 위치들에서 바람직하다. 그러므로, 상기 서열의 위치 1에서, 아미노산은 바람직하게는 Trp 또는 Tyr이다. 위치 2에서, 아미노산은 바람직하게는 Gly 또는 Ala이다. 위치 7에서, 아미노산은 바람직하게는 Gln, Ile 또는 Asn이다. 위치 8에서, 아미노산은 바람직하게는 Gly 또는 Asn이다. 위치 9에서, 아미노산은 바람직하게는 Trp, Phe 또는 Tyr이다. 위치10에서, 아미노산은 바람직하게는 Ser, Asn, Thr 또는 Gln이다. 위치12에서, 아미노산은 바람직하게는 Pro, Ala 또는 Cys이다. 위치13에서, 아미노산은 바람직하게는 Thr, Arg 또는 Lys이다. 위치14에서, 아미노산은 바람직하게는 Thr, Cys 또는 Asn이다. 위치18에서, 아미노산은 바람직하게는 Gly 또는 Pro이다. 위치19에서, 아미노산은 (존재시) 바람직하게는 Ser, Thr, Phe, Leu 또는 Ala이다. 위치20에서, 아미노산은 바람직하게 Thr 또는 Lys이다. 위치24에서, 아미노산은 바람직하게 Gln 또는 Ile이다. 위치26에서, 아미노산은 바람직하게 Gln, Asp 또는 Ala이다. 위치27에서, 아미노산은 바람직하게 Trp, Phe 또는 Try이다. 위치29에서, 아미노산은 바람직하게 Ser, His 또는 Tyr이다. 위치32에서, 아미노산은 바람직하게 Leu, Ile, Gln, Val 또는 Thr이다.
본 발명의 특정한 CBD-함유 효소의 실례는 하기의 아미노산 서열중의 하나를 포함하는 것이다.
본 발명의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소는 더 나아가서 탄수화물 결합 도메인을 연결시켜 이것을 효소의 촉매 활성 도메인에 결합시키는 연결(linking) B영역(T. reesei 셀룰라제에 대해 확립된 명칭을 사용)를 한정하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 효소에 대해 확립된 B영역 서열은 이러한 서열이 주로 친수성이고 전하를 띠지 않으며, 어떤 아미노산, 특히 글리신 및/또는 아스파라긴 및/또는 프롤린 및/또는 세린 및/ 또는 트레오닌 및/또는 글루타민이 풍부한 것에 의해 특정화됨을 나타낸다. B영역의 특정화된 구조는 서열, 특히 주로 글리신 및 아스파라긴의 짧은 반복단위를 포함하는 서열에 유연성을 준다. 그러한 반복서열은 세린/트레오닌 형의 B영역을 포함하는 T. reesei 또는 P. chrysosporium의 B영역 서열에서는 발견되지 않는다. 이 유연한 구조는 A영역이 불용성 기질에 결합된 효소의 촉매활성 도메인의 작용을 촉진하여, 본 발명의 효소에 유리한 특성을 부여하는 것으로 믿어진다.
본 발명의 효소에 포함된 B영역의 특정한 실례는 하기의 아미노선 서열을 지닌다.
다른 일면에 있어서, 본 발명은 Trichoderma reesei 셀룰라제의 말단 A영역과 상동적인 탄수화물 결합 도메인에 관한 것으로, 탄수화물 결합 도메인을 하기의 아미노산 서열
또는 불용성 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 단백질을 효과적으로 결합시킬 수 있는 이것의 아서열을 포함한다.
특정한 탄수화물 결합 도메인의 실례는 위에 나타낸 아미노산 서열을 지니는 것이다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소에서 유래된 연결 B영역에 관한 것인바, 상기 영역은 글리신 및/또는 아스파라긴 및/또는 프롤린 및/또는 세린 및/또는 트레오닌 및/또는 글루타민등의 아미노산이 풍부한 아미노산 서열을 포함한다. 상기에 나타낸 바와같이, 이들 아미노산은 대개 짧은 반복단위일 수 있다. 특정한 B영역 서열의 실례는 상기에 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소의 각종 영역을 혼합(shuffle)하여, CBD, B 영역 및 촉매활성 도메인의 새로운 조합체를 만들어 이런 형태의 효소에 새로운 활성 프로필을 야기시키는 유일한 기회를 제공한다. 그러므로, 본 발명의 효소는 자연적으로 나타나는 하나의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소에서 유해된 CBD 한정 아미노산서열, 자연적으로 나타나는 다른 하나의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스- 분해 효소에서 유리된 연결 B영역을 한정하는 아미노산 서열뿐만 아니라 CBD 또는 B 영역을 제공하는 효소 또는 제 3의 효소에서 유래된 촉매활성 도메인을 포함한다. 특별한 구체예에서, 촉매활성 도메인은 본래 CBD 또는 B영역이 없는 효소로부터 유도된다. 이 경우, CBD 또는 B영역이 없는 효소로부터 개선된 결합 특성을 갖는 효소를 구성하는 것이 가능하다.
본 발명의 효소는 바람직하게는 엔도글루카나제(셀룰로스 섬유에서 낮은 결정성의 무정형 부위를 가수분해할 수 있음)와 같은 셀룰라제, 셀로비오히드롤라제(cellobiohydrolase) (엑소글루카나제라고도 알려져 있음, 셀로비오스 단위를 제거하여 비-환원성 사슬 말단에서 셀룰로스의 분해를 시작할 수 있음) 또는 β-글루코시다제(β-glucosidase)이다.
더욱 다른 면에 있어서, 본 발명은 상기의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 서열은 예를 들어 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소를 생산하는 것으로 알려진 미생물 예컨대 Humicola, Fusarium 또는 Mycelopthora 균주 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 만들어 통상적인 방법으로 스크리닝하여 분리할 수 있다. 통상적인 방법에는 예컨대 효소의 전체 또는 부분적 아미노산 서열에 대하여 합성한 올리고 뉴클레오티드 프로브 또는 T. reesei 셀룰라제에서 얻은 A영역의 부분 또는 전체 DNA 서열에 대한 프로브로 상기와 같이 혼성화하거나, 또는 적당한 효소활성을 나타내는 클론은 선택하거나 또는 본래의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소에 대해 생성된 항체에 반응하는 단백질을 생산하는 클론을 선택하는 방법이 있다.
선택적으로, 효소를 코딩하는 DNA 서열을 확립된 표준방법, 예컨대 S.L. Beaucage 및 M.H Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869가 기술한 포스포아미디트 방법, 또는 Mattes등, The EMBO J. 3, 1984, PP. 801-805, 이 기술한 방법으로 합성하여 제조할 수 있다. 포스포아미티드 방법에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되어 어닐링(annealing)된후, 연결되고 적절한 벡터에서 클로닝된다.
최종적으로, DNA 서열은 합성한 것, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한 것)의 단편을 연결하여 표준기술에 따라 제조한 게놈 및 합성한 것의 혼합체, 합성된 것 및 cDNA의 혼합체 또는 게놈 및 cDNA의 혼합체일 것이다. 단편은 전체 DNA 구조체의 각종 부분에 해당하는 것이다.
그러므로, 효소의 CBD를 코드화하는 DNA 서열은 게놈의 기원일 수 있고, 반면에 효소의 B영역을 코드화한 서열은 합성한 기원이거나, 이와 반대일 수 있고: 효소의 촉매활성 도메인을 코드화한 DNA 서열은 게놈 또는 cDNA 기원일 수 있음을 상상할 수 있다. DNA 구조체는 또한 US 4,683,202 또는 Saiki 등, science 239, 1988, pp. 487-491, 이 기술한 특정 프라이머를 사용하여 중합효소 사슬반응으로 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 삽입된 상기의 DNA 구조체를 지니는 발현벡터에 관한 것이다. 발현벡터는 특정한 숙주생물에서 효소를 발현시는 적합한 포르모터, 오퍼레이터(operator) 및 터미네이터 서열, 및 문제의 숙주생물체에서 벡터가 복제할 수 있도록 하는 복제기원을 포함한다.
얻어진 발현벡터는 이어서 적절한 숙주세포, 예컨대 진균 세포로 형질전환되는데, 진균세포의 바람직한 실례는 Aspergillus 종, 가장 바람직하게는 Aspergillus oryzae 또는 Aspergullus niger이다. 진균 세포는 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환에 이어서 본질적으로 알려진 방식으로 세포벽이 재생되는 단계로 이루어지는 방법을 통해 형질전환된다. 숙주미생물로서의 Aspergillus 용도는 EP 238,028(Novo Industry A/S 에 속함)에 기술되어 있으며, 내용은 여기에 참고로 포함되어 있다.
선택적으로, 숙주 개체는 세균, 특히 Streptomyces 및 Bacillus 균주, 및 E. coli 일 것이다. 세균세포의 형질전환은 Sambrook등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 이 기술한 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다.
적절한 DNA 서열의 스크리닝 및 벡터의 제조는 또한 상기에 인용한 Sambrook등의 표준방법으로 수행될 수 있다.
본 발명은 더 나아가서 상기의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스- 분해 효소를 생산하는 방법에 관한 것인데, 본 발명의 발현벡터의 형질전환된 세포는 효소의 생산이 가능한 조건하에서 배양되고, 효소는 계속해서 배지로부터 회수된다. 형질전환된 숙주세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주세포가 적절히 성장할 수 있는 통상적인 배지일 것이다. 발현된 효소는 용이하게 배지로 분비되고 원심분리 및 여과를 통해 배지에서 세포를 분리하는 단계, 황산암모늄등의 염으로 배지의 단백질성분을 침전시키는 단계, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 따위로 크로마토그래피를 하는 단계로 이루어지는 공지의 방법으로 배지에서 회수될 수 있다.
상기의 재조합 DNA 기술, 발효 및 돌연변이 기술 또는 본 발명에서 알려진 다른 기술을 이용하여, 고순수도 및 고수율의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소를 제공하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스를 분해시키는 제제에 관한 것이다. 이 제제는 상기의 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소를 포함한다. 효소의 특이성에 의존하여 위에 언급된 응용의 하나(또는 가능하면 이상)에 그것이 사용될 수 있음을 예측할 수 있다. 특별한 구체예에서, 작용물은 본 발명의 둘 또는 이상의 효소조합체, 또는 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 활성을 지니는 하나 또는 이상의 다른 효소를 지니는 본발명의 하나 또는 이상의 효소 조합을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 플라스미드 pSX224의 구성을 나타내는 도면.
제2도는 플라스미드 pHW485의 구성을 나타내는 도면.
제3도는 플라스미드 pHW697 및 pHW704의 구성을 나타내는 도면.
제4도는 플라스미드 pHW768의 구성을 나타내는 도면.
제5도는 플라스미드 pSW320의 구성을 나타내는 도면.
제6도는 플라스미드 pSX777의 구성을 나타내는 도면.
제7도는 플라스미드 pCaHj170의 구성을 나타내는 도면.
제8도는 플라스미드 IM4의 구성을 나타내는 도면.
제9도는 ∼43KD 엔도글루카나제 신호 펩티드 및 Endo 1 N-말단의 SOE 융합을 나타내는 도면.
제10도는 플라스미드 pCaHj180의 구성을 나타내는 도면.
제11도는 F. oxysporum C-족 셀로비오히드롤라제의 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서열을 나타내는 도면.
제12도는 F. oxysporum F-족 셀룰라제의 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서열을 나타내는 도면.
제13도는 F. oxysporum C-족 엔도글루카나제의 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서열을 나타내는 도면.
제14a-e는 H. insolens 엔도글루카나제 1(EG1)의 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서열을 나타내는 도면.
제15a-d는 B. lautus(NCIMB 40250) Endo 1 촉매도메인 및 H. insolens ∼43KD 엔도글루카나제의 CBD 및 B영역의 융합체에 해당하는 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서열을 나타내는 도면.
본 발명은 더 나아가서 하기 실시예에 예시되어 있는바 어떤 방식으로도 청구하는 본 발명의 범위를 제한하기 위해 의도된 것이 아니다.
[실시예 1]
[H. insolens에서 A 영역-함유 클론의 분리]
셀룰로스상에서 자라는 H. insolens 균주 DSM 1800(예컨대 WO 89/09259에 개시됨)으로부터, Koplan등, Bichem. J. 183(1979) 181-184, 이 기술한 방법에 따라 mRNA를 제조하였다. 20,000 클론을 포함하는 cDNA 라이브러리를 Okayama 및 Berg, Methods in Enzymology 154, 1987, pp. 3-28의 방법에 따라 실질적으로 얻었다.
네 개의 T. reesei 셀룰라제 유전자의 A-영역의 N-말단부분의 공표된 서열에 따라 디자인한 안티센스(antisense) 형태의 올리고뉴클레오티드 프로브로 Gergen등, Nucl. Acids Res. 7(8), 1979, pp. 2115-2136이 기술한 바에 따라 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다.
(Penttila 등, Gene 45(1986), 253-63: Saloheimo등, Gene 63(1988), 11-21: Shoemaker 등, Biotechnology, 1983년 10월, 691-696: Teeri등, Gene 51(1987) 43-52). 프로브 서열은 하기와 같다.
스크리닝을 통해 웰(well)을 A-영역 프로브에 혼성화시킨 많은 수의 후보클론을 찾았다. 제한 맵핑(mapping)을 통행 관심있는 클론의 수를 17로 감소시켰고, 그중 8개의 서열은 B-영역뿐만 아니라 말단 CBD의 존재를 확실히 확인됨을 밝혔다(Haltiner 등, Nucl. Acids Res. 13, 1985, pp. 1015-1025, 이 기술함).
CBD에 대해 얻은 추론한 아미노산 서열은 하기와 같다.
B영역에 대해 얻은 추론한 아미노산 서열은 하기와 같다.
[실시예 2]
[H. insolens에서 얻은 CBH 2-형 셀룰라제의 A. oryzae에서의 발현]
CBD 클론 한 개의 완전한 서열은 T. reesei에서 얻은 셀로비오히드롤라제(CBH 2)와 현저한 상동성을 나타냈다.
A. oryzae에서 발현시키고 분비시키기 위해 H. insolens CHB 2 유전자를 지니는 pSX224 발현 벡터의 제조를 제 1도에 개략적으로 나타냈다. pUC19 레프리콘(replicon) 및 A. oryzae에서 얻은 TAKA 아밀라제 프로모터의 조절영역 및 A. niger에서 얻은 글루코아밀라제 터미네어터를 포함하는 p777 벡터가 EP 238 023에 개시되어 있다. pSX 217은 1.8kb 단편상에 H. insolens CBH 2 유전자를 지니는 pcDVl-pL1 클로닝 벡터(Okayama 및 Berg의 이전에 인용된 문헌참조)로 이루어져 있다. CBH 2 유전자는 그 구성에 사용되는 세 개의 제한 위치를 포함한다: 신호서열에 개시메티오닌 코돈에 있는 Bal Ⅰ부위, Bal 그 부위에서 아래쪽으로 620 bp 떨어진 Bst BI 부위 및 Bst BI 부위에서 아랫쪽으로 860 bp 떨어진 Ava Ⅱ 부위, Ava Ⅱ부위는 폴리 A영역의 윗쪽에 있는 유전자의 번역되지 않는 C-말단 부분에 놓여 있으며, 최종적인 구성에는 요구되지 않는다. 클로닝 벡터에 있는 유전자의 윗쪽에 있는 폴리 G영역도 요구되지 않는다. 이 영역을 잘라내고 올리고뉴클레오티드 링커(linker)로 대체시켜 TAKA 프로모터의 말단에 있는 BamHI 위치에 가깝게 번역 개시 코돈을 배열하였다.
발현벡터 pSX 224를 선별 표지로 A. nidulans에서 얻은 amdS 유전자를 사용하여 EP 238023에 기술된 바와 같이 A. oryzae IFO 4177로 형질전환시켰다. 형질전환체를 YPD 배지(Sherman등, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)에서 3-4일간 증식시켜 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 상등액에 있는 새로운 단백질 종류를 분석하였다. H. insolens에서 얻은 CBH 2는 겉보기 분자량 65KD를 나타내는 밴드를 형성하였는데, 이는 단백질 사슬의 실질적인 글리코실화를 가리키며, 아미노산 조정에 근거하여 분자량 51KD로 계산되었다. 본래의 효소는 셀룰로스에 잘 결합하나 55KD 및 40KD의 효소분해 생성물은 결합하지 않는 것으로 보아, A-영역 및 추정상 B-영역이 제거되었음을 알 수 있다. 효소는 여과지에 대해 약간의 활성을 지니고 있어서, 포도당의 방출을 야기시켰다. 예상한 바와 같이, 카르복시 메틸 셀룰로스 형태로 가용성 셀룰로스에서 측정한 결과, 그것은 매우 제한된 엔도글루카나제 활성을 지녔다.
[실시예 3]
[Fusarium oxysporum 게놈 DNA의 분리]
동결건조한 Fusarium oxysporum 배양물에 인산염 완충용액을 넣고 5FOX 배지(6% 효모추출액, 1.5% K2HPO4, 0.75% MgSO47H2O, 22.5%포도당, 1.5%한천, pH5.6)에 각각 5회점을 스포트(spot)한 후 37℃에서 배양하였다. 6일간 배양한 후, 플레이트에서 콜로니를 긁어모아 0.001% Tween-80 15ml에 넣고 짙은 현탁액으로 만들었다.
액체 FOX 배지 30ml이 들어 있는 네 개의 1리터 플라스크에 포자 현탁액 2ml을 접종한 후 30℃에서 240rpm으로 배양하였다. 배양 4일째에, 배양물을 네겹의 멸균된 가제로 여과한 후 멸균수로 세척하였다. 균사체를 Whatman 여과지에서 건조시킨 후, 액체 질소에서 냉동시켜, 찬 모르타르로 갈아서 미세한 분말로 만든후, 새로운 용해 완충용액(10mM tris-HCl pH. 7.4, 1% SDS, 50mM EDTA, 100μl DEPC) 75ml에 첨가하였다. 철저히 혼합된 현탁액을 65℃수욕(water bath)에서 1시간 동안 배양한 후 벤치-톱 원심분리기에서 10분동안 5℃에서 4000rpm으로 회전시켰다. 상등액을 따라내어 에탄올로 침전시켰다. 얼음에 1시간 동안 방치한 후, 용액을 20동안 19,000rpm으로 회전시켰다. 상등액을 따라내어 이소프로판올로 침전시켰다. 10,000rpm에서 10분동안 원심분리한 후, 상등액을 따라내고 펠레트를 건조시켰다.
TER 용액(10mM Tris-Hcl, pH 7.4, 1mM EDTA, 100μg RNase A) 1ml을 각각의 시험관에 첨가한 후 시험관을 4℃에서 이틀간 방치하였다. 시험관을 모아 65℃수욕에서 30분간 방치하여 용해되지 않는 DNA를 현탁시켰다. 용액을 페놀/CHCl3/이소아밀 알코올로 2회, CHCl3/이소아밀 알코올로 2회 추출한 후 에탈올로 침전시켰다. 펠레트를 가라앉힌 후 에탄올을 제거하였다. 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 20℃에서 밤새 방치하였다. 용액을 따라내고 건조시킨 후, TER 1ml을 넣고 시험관을 60℃에서 1시간 동안 배양하여 DNA를 용해시켰다. 게놈 DNA 1.5mg을 얻었다.
[축퇴(degenerate) 프라이머로 DNA의 증폭, 증폭된 DNA의 클로닝 및 서열 결정]
PCR을 이용하여 C-족(Henrissat 등, Gene 81(1), 1989, PP, 83-96)의 명명에 따름)셀룰라제로부터 DNA를 증폭시키기 위해 각 센스 올리고뉴클레오티드를 각 안티센스(antisense)올리고뉴클레오티드와 조합하여 사용하였다. 이런 식으로, 하기의 프라이머 쌍을 사용하였다:
PCR 반응에서, Fusarium oxysporum 게놈 DNA 1μg을 주형으로 사용하였다. 열배의 PCR 완충용액은 100mM Tris-Hcl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl, 0.1% 젤라틴(Perkin-Elmer Cetus)이다. 반응물은 하기 성분을 포함하였다.
dH20 35.75μl
10X PCR 완충용액 5 μl
주형 DNA 5 μl
프라이머 1 2 μl(40pmol)
프라이머 2 2 μl(40pmol)
Taq 중합효소 0.25μl(1.25U)
합계 50μl
PCR반응을 하기 조건에서 40 싸이클 동안 수행하였다.
94℃ 1.5분
45° 2.0분
72° 2.0분
각 반응의 5마이크로리터를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. DNA 분자량 표지로부터 DNA단편의 크기를 추정하였다. ZC3220 및 ZC3221을 프라이머로 사용한 반응을 C-족 셀룰라제에 대한 적절한 크기의 두가지 DNA단편을 생산하였다. 두가지 DNA단편을 포함하는 아가로스 부분을 잘라내어, DNA를 전기로 용출시킨 후 제한효소 Kpnl 및 Zbal로 소화하였다. 단편을 동일한 두 제한효소로 절단한 pUC18벡터에 연결하였다. 연결체를 E. Coli로 형질전환시킨 후, 얻어진 콜로니에서 미니프렙(miniprep) DNA를 제조하였다. 이 삽입체의 DNA서열을 결정하여 나타낸 바, 두가지 새로운 C-족 셀룰라제를 확인하였는데, 하나는 새로운 셀로비오히드로라제이고 다른 하나는 새로운 엔도글루카나제였다. 상기의 C-족 셀룰라제에 대한 PCR 클로닝 방법을 알려진 F-족 셀룰라제내의 보존된 셀룰라제 서열을 코드화한 다른 프라이머를 사용하여 수행하였다(Henrissat 등, 이전에 인용한 것 참조). 하기 플라이머쌍을 Fusarium 게놈 DNA의 증폭에 사용하였다.
PCR 반응을 하기의 조건하에서 40 싸이클 동안 수행하였다.
94℃ 1.5분
50℃ 2.0분
72℃ 2.0분
180bp 밴드를 아가로스 겔 단편에서 용출시킨 후, 제한효소 Hind Ⅲ 및 Cla Ⅰ으로 소화하여, Hind Ⅲ 및 Acc Ⅰ으로 소화한 pUC19에서 연결시켰다. 연결된 DNA를 E. Coli내로 형질전환시킨 후, 콜로니 분리체에서 미니프렙 DNA를 제조하였다. 콜로닝된 DNA된 DNA 서열을 결정하였다. 이 단편은 새로운 F-족 셀룰라제 구성원에 상응하는 서열을 코드화하였다.
[Fusarium oxysporum cDNA 라이브러리의 구성]
발효를 통해 Fusarium oxysporum을 증식시킨 후, RNA 추출 및 셀룰로스 활성도 분석을 위해 다양한 시간에서 샘플을 회수하였다. 활성도 분석은 색의 명도에 대한 분석 뿐만 아니라 전체 셀룰라제 활성도에 대한 분석을 포함하였다. 최대의 색명도를 나타내는 Fusarium oxysporum 샘플에서 전체 RNA를 추출한 후, 이것으로부터 폴리(A)+RNA를 분리하였다.
Fusarium oxysporum cDNA 라이브러리를 구성하기 위해, 첫째-가닥 cDNA를 방사성 표지의 DATP가 있는 경우와 없는 경우의 두가지 반응으로 합성하였다. 하기 순서에 따라 하기 시약을 혼합하여 실온에서 2.5X 반응혼합물을 제조하였다:
5X역전사 완충용액 10μl(Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland), 200mM 디티오트레이톨 2.5μl(새로 제조하거나 70℃ 보관중인 원액에서 취했음) 및 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dTAP, dGTP, dTTP) 및 5-메틸 dCTP, Pharmacia LKB Biotechnalogy, CA에서 구입) 10mM을 포함한 혼합물 2.5μl. 반응 혼합물을 나누어 두 개의 7.5μl 시험관에 넣었다. 10μCi/μl 32Pα-dATP(Amersham, Arlington Heights, IL) 1.3μl를 한 시험관에 첨가하고 나머지에는 물 1.3μl를 넣었다. 각 혼합물의 7μl를 최종반응 시험관에 넣었다.
분리된 시험관에서, 5mM Tris-HCl pH7.4, 50μM EDTA 14μl 중의 Fusarium oxysporum 폴리(A)_RNA 5μg을 1μg/μ1 첫째 가닥 프라이머(ZC 2398 GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT15)와 혼합하였다. RNA-프라이머 혼합물을 60℃에서 4분동안 가열하고, 냉수에서 냉각시켜 마이크로푸지(microfuge)에서 짧게 원심분리하였다. RNA-프라이머 혼합물 8마이크로리터를 최종 반응시험관에 첨가하였다. 200U/ml SuperscriptTM역전사효소(Gibco-BRL) 5 마이크로리터를 각 시험관에 첨가하였다. 알맞게 교반한 후, 시험관을 45℃에서 30분간 배양하였다. 10mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA 8마이크로리터를 각 시험관에 첨가하여 샘플을 와동(vortex)시킨 후, 짧게 원심분리하였다. 각 시험관에서 3마이크로 리터를 취하여 TCA침전으로 삽입된 계수 및 반응의 전체계수를 결정하였다. 각 시험관에서 샘플 2μl를 취하여 겔 전기영동으로 분석하였다. 각 샘플의 나머지를 굴 글리코겐의 존재하에서 에탄올로 침전시켰다. 핵산을 원심분리하여 펠레트로 만든후, 펠레트를 80%에탄올로 세척하였다. 에탄올로 세척한 후, 샘플을 대기에서 10분간 건조시켰다. 첫째 가닥 합성을 통해 Fusarium oxysporum cDNA 1.6μg을 얻었는데, 폴리(A)+RNA의 33%가 DNA로 전환되었다.
첫째 가닥이 둘째 가닥 합성을 준비하도록 하는 조건하에서 첫째 가닥 반응에서 얻은 RNA-DNA 혼성체로 둘째 가닥 cDNA 합성을 수행하여 헤어핀 DNA를 얻었다. 두 개의 첫째 가닥 반응에서 얻은 각각의 첫째 가닥 생성물을 물 71μl에 재현탁하였다. 하기 시약을 실온에서 반응 시험관에 첨가하였다: 5X 둘째 가닥 완충용액 20μl(100mM Tris pH7.4, 450mM KCl, 23mM MgCl2, 및 50mM(NH4)2, 및 50mM(NH4)2 SO4), 5mM β-NAD 3μl, 및 각각 10mM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 1μl. 첫째 사슬 합성시 표지되지 않은 dATP를 첨가한 반응혼합물에는 1μl의 α-32P dATP를 첨가하고, 첫째 사슬 합성시 표지된 dATP를 첨가한 시험관에는 1μl의 물을 첨가하였다. 그 다음 각 시험관에 0.6μl의 7U/μl E. coli DNA 리가제(Boehringer- Mannheim, Indianapolis, IN), 3.1μl의 8U/μl E. coli DNA 중합효소 I(Amersham), 및 1μl의 2U/μl RNase H(Gibco-BRL)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 16℃에서 배양하였다. 반응후에 반응의 TCA 침전가능 계수와 전체 계수를 결정하기 위해 각 반응물의 2μl를 이용했고 각 반응물의 2μl를 겔전기영동에 의하여 분석하였다. 각 샘플의 나머지에 2μl의 2.5μg/μl굴 글리코겐, 5μl의 0.5EDTA, 200μl의 10mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA를 첨가했다. 샘플을 페놀-클로로포름 추출하고 이소프로판올로 침전시켰다. 원심분리후에 펠레트를 100μl의 80% 에탄올로 세척하고 공기로 건조시켰다. 각각의 반응에서 이중가닥 cDNA의 수율을 대략 2.5μg이었다.
헤어-핀의 단일가닥 DNA의 끝을 절단하는데 녹두의 뉴클레아제 처리를 이용하였다. 각 cDNA 펠레트를 15μl의 물에 재현탁시키고 각 시험관에 2.5μl의 10×녹두 완충 용액(0.3M NaAc pH 4.6, 3M NaCl, 및 10mM ZnSo4), 2.5μl의 10mM DTT, 2.5μl의 50% 글리세롤, 및 2.5μl의 10U/μl 녹두 뉴클레아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 첨가하였다. 반응물을 30분간 30℃에서 배양하고 각 시험관에 76μl의 10mM Tris-HCl pH 7.4 및 1mM EDTA를 첨가했다. 2μl의 분취량을 알칼리 아가로스겔 분석에 의해 분석했다. 100μl의 1M Tris-HCl(pH 7.4)을 각 시험관에 첨가하고 샘플을 두 번 페놀-클로로포름 추출하였다. DNA를 이소프로판올로 침전시키고 원심분리에 의해 펠리트화시켰다. 원심분리후에 DNA 펠레트를 80% 에탄올로 세척하고 공기로 건조시켰다. 두 반응의 각각의 DNA 수율은 대략 2μg였다.
T4 DNA 중합효소로 처리하며 cDNA 말단을 평활말단화시켰다. 전체부피 24μl의 물에 재현탁시킨후에 두 샘플의 DNA를 모았다. 그 DNA에서 4μl의 10×T4 완충액(330mM Tris-아세트산 pH 7.9, 670mM KAc, 100mM MgAc, 1mg/ml 젤라틴), 4μl의 1mM dNTP, 4μl의 50mM DTT, 4μl의 1U/μl T4 DNA 중합효소(Boehringer-Mannheim)를 첨가하였다. 샘플을 1시간 동안 15℃에서 배양했다. 배양후 160μl의 10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA를 첨가했다. 그리고 샘플을 페놀- 클로로포름으로 추출하였다. DNA를 이소프로판올로 침전시키고 원심분리로 펠레트화시켰다. 원심분리후 DNA를 80% 에탄올로 세척하고 공기로 건조시켰다.
DNA를 물 6.5μl에 재현탁시킨후 EcoRI 어댑터(adapter)를 평활말단 DNA에 첨가했다. DNA에 1μl의 1u/μl EcoRI 어댑터(Invitrogen, San Diego, CA Cat. # N409-20), 1μl의 10×리가제 완충용액(0.5M Tris pH7.8 및 50mM MgCl2), 0.5μl의 10mM ATP, 0.5μl의 100mM DTT 및 1μl의 1U/μl T4 DNA 리가제(Boehringer-Mannheim)를 첨가하였다. 샘플은 밤새 실온에서 배양한 후에, 리가제를 65℃에서 15분간 열변성시켰다.
첫 번째 사슬 프라이머에 의해 코드화된 Sst I 클로닝부위를 Sst I 엔도뉴클레아제로 분해시켜 드러내었다. 33μl의 물, 5μl의 10×Sst I 완충용액(0.5M Tris pH 8.0, 0.1M MgCl2및 0.5M NaCl), 2μl의 5U/μl Sst I을 DNA에 첨가하고, 샘플을 2시간 동안 37℃에서 배양했다.
150μl의 10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA를 첨가하고 샘플을 페놀- 클로로포름으로 추출한 후 DNA를 이소프로판올로 침전시켰다.
cDNA를 크기에 의해 선택하고 유리된 어댑터를 제거하기 위해서 cDNA를 Sepharose CL 2B(Pharmacia LKB Biotechnology) 컬럼상에서 크로마토그래피하였다. Sepharose CL 2B 컬럼 1.1ml을 1ml의 일회용 플라스틱 펠레트속에 붓고 칼럼을 50 컬럼 부피의 완충액(10mM Tris pH 7.4 및 1mM EDTA)으로 세척하였다. 샘플을 로딩하고 한방울씩 분획을 모아서 공극 부피(void volumed)에 있는 DNA를 모았다. 분획화된 DNA를 이소프로판올로 침전시켰다. 원심분리후 DNA를 80% 에탄올로 세척하고 공기에서 건조시켰다.
Fusarium oxysporum cDNA 라이브러리를 cDNA를 EcoRI과 Sst I으로 분해된 벡터 pYCDE8'(WO 90/10698참조)에 결합시켜 만들었다. 벡터 390ng 8μg의 10×리가제 완충용액, 4μl의 10mM ATP, 4μl의 200mM DTT, 1단위의 T4DNA 리가제(Boehringer-Mannheim)를 함유하는 80μl의 결합반응물에서 400ng의 cDNA와 결합시켰다. 실온에서 밤새 배양한 후에 5μg의 굴글리코겐, 120μl의 10mM Tris-HCl 및 1mM EDTA를 첨가하고 샘플을 페놀-클로로포름으로 추출했다. DNA를 에탄올로 침전시키고, 원심분리한 후 DNA 펠레트를 80% 에탄올로 세척하였다. 공기에서 건조시킨후에 DNA를 3μl의 물에 재현탁시켰다. 37μl의 일렉트로포레이션에 적절한 DH10B 세포(Gibco-BRL)를 DNA에 첨가하고, Bio-Rad Gene Pulser(Model # 1652076) 및 Bio-Rad Pulse Controller(Model # 1652098) 일렉트로포레이션 유니트(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)로 일렉트로포레이션을 수행했다. 4ml의 SOC(Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580)를 일렉트로포레이션된 세포에 첨가하고, 400μl의 세포 현탁액을 10개의 150mm LB 암피실린 플레이트의 각각에 깔았다. 밤새 배양한 후에 각 플레이트로부터 글리세롤 스톡(stocks)과 플라스미드 제조물을 만들었다. 삽입체없이 벡터를 결합시키고 일렉트로포레이션후 클론의 수를 측정함으로써 라이브러리의 백그라운드(삽입체 없는 벡터)가 대략 1%가 되도록 하였다.
[cDNA 라이브러리 스크리닝]
완전한 길이의 셀룰라제 cDNA 클론을 PCR로 제조한 게놈의 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 혼성화를 통하여 Fusarium oxysporum 으로부터 분리하였다.
PCR로 제조한 올리고뉴클레오티드: ZC3309, C족 셀로비오히드로라제 부분을 코딩하는 40-mer, ATT ACC AAC ACC AGC GTT GAC ATC ACT GTC AGA GGG CTT C: ZC3310, C족 엔도클루카나제를 코딩하는 28-mer, AAC TCC GTT GAT GAA AGG AGT GAC GTA G: ZC3311, F족 셀룰라제를 코딩하는 40-mer, CGG AGA GCA GCA GGA ACA CCA GAG GCA GGG TTC CAG CCA C를 T4폴리뉴클레오티드키나제 및32-P 감마 ATP로 말단을 표지하였다. 키나제 반응을 위해, 각 올리고뉴클레오티드 17 피코몰을 탈이온수로 12.5μl 부피가 되도록 만들었다. 여기에 10×키나제 완충용액 20ml(1×10mM 염화마그네슘, 0.1mM EDTA, 50mM Tris pH 7.8), 200mM 디티오트레이톨 0.5μl, 1μl의 32P감마 ATP 150m Ci/ml(Amersham), T 폴리뉴클레오티드 키나제(10U/μl BRL)를 첨가하였다. 이어서 샘플을 혼합한 후 37℃에서 30분간 배양하였다. TE 180μl(10mM Tris pH8.0 1mM EDTA), 7.5M 아세트산 암모늄, 홍합 글리코겐 2μl(20mg/ml, Gibco-BRL) 및 100% 에탄올 750μl로 침전시켜 올리고뉴클레오티드를 삽입되지 않은 뉴클레오티드로부터 분리하였다. 펠레트를 증류수 200μl에 녹였다. 올리고뉴클레오티드에 삽입된 방사능 양을 결정하기 위해, Beckman LS 1800 Liquid Scintillation System에서 신틸레이션 용액없이 1:1000 희석액의 1μl를 측정하였다. 활성도는 다음과 같다: ZC3309은 115000000cpm, ZC3310은 86000000cpm, 및 ZC3311은 79000000cpm.
처음에는 20,000 cDNA클론의 라이브러리를 C족 셀로비오히드로라제, C족 엔도글루카나제 및 F족 셀룰라제 클론에 상응하는 세가지 올리고뉴클레오티드 각각의 혼합물로 조사하였다. -70℃에 저장된 적정량의 글리세를 저장물에서 얻은 cDNA 라이브러리를 플레이팅하였다.
4천개의 클론을 150mmLB 임피실린(1000 μg/ml) 플레이트 5개에 각각 플레팅하였다. 리프트(lift)는 표준방법(Sambrook 등, Molecular Cloning, 1989)에 따라 Biotrans 0.2 μm 137mm 필터를 이용하여 중복해서 수행하였다. 필터를 진공에서 80℃로 2시간 동안 구웠다. 이어서 크리스탈 접시에 있는 37℃의 전혼성화(prehybridization)용액(5×Denhardt's(1×:0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소혈청알부민 Pentax Fraction 5(Sigma, St. Louis, MO)) 5 ×SSC(1×:0.15M 염화나트륨, 0.5M 시트르산 나트륨 pH 7.3), 초음파로 변성시킨 연어정자 DNA 100μg/ml, 50mM 인산나트륨 pH6.8, 1mM 피로인산 나트륨, 100μm ATP, 20% 포름아미드, 1%소다움 도데실 셀페이트)에서 밤새 흔들어주었다(Ulrich 등 EMBO J. 3 (1984), 361-364).
전혼성화된 필터에 80000000cpm ZC3311, 86000000cpm ZC3310 및 79000000cpm ZC3311이 들어있는 전혼성화 용액 80ml의 크리스탈 접시에 한꺼번에 첨가한 후 밤새 교반하여 프로브와 반응시켰다. 이어서 필터를 고 스트린젠시(high stringency)로 세척하였다. 프로브와 반응한 필터를 저 스트린젠시 세척용액(2×SSC, 0.1% SDS) 400ml부피로 실온의 크리스탈 접시에서 3회 세척한 후, 플라스틱 박스에서 1리터 부피로 4회 세척하였다. 염화 테트라메틸암모늄 세척용액(TMACL: 3M 염화 테트라메틸 암모늄, 50mM Tris-HCl pH8.0, 2mM EDTA, 1g/l SDS) (Wood 등, Proc, Natl, Acad, Sci, 82(1985))으로 60℃에서 20분간 더 세척하여 염기조성 1585-1588과는 독립적으로 28-mer ZC3310에 고 스트린젠시 세척을 제공하였다. 필터를 건조시켜 얼룩지게 한 후 Whatman 3MM 여과지로 봉한 후 플라스틱 랩(wrap)으로 싸서 오토라디오그래피를 시행하였다. 강한 스크린 및 Kodak XAR-5필름에 -70℃에서 밤새 노출시켰다.
두 개의 추정상 포지티브가 중복필터에 나타났다. 플레이트의 상응하는 영역에 있는 콜로니를 떠내어 1×중합효소 사슬반응(PCR) 완충용액 1ml(100mM Tris-HCl pH8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl, 0.1% 젤라틴: Perkin Elmercetus)에 넣은 후 70μg/ml 암피실린이 들어있는 100mm LB 플레이트에 5개의 10배 희석액을 플레이팅하였다. 이 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 각 추정상 클론의 두 희석액을 상기에 요약한 바와 같이 재스크리닝하여 선택하였다. 하나의 분리된 클론 pZFH 196을 발견하였다. 이것을 2×YT 브로스(broth) 10ml(리터당:박토-트립톤 16g, 박토-효모 추출액 10g, Nacl 10g)에서 밤새 배양하였다. 빠른 비등방법(Holmes 및 Quigley, Anal, Biochem, 114(1981), 193-197)으로 DNA 23μg을 정제하였다. 제한분석결과, 클론은 길이가 약 2000 염기쌍임을 알았다. 서열분석은 PCR로 클로닝된 C-족 셀로비오히드롤라제 단편에 유사한 단편을 포함하고 있음을 보여 주었다.
부가적인 셀룰라제 cDNA 클론을 분리하기 위한 시도에 있어서, 2백만 클론의 cDNA 라이브러리를 약 100,000 cDNA 클론을 포함하는 150mm LB 플레이트(100μg/ml 암파실린) 20개에 플레이팅 하였다. 리프트를 첫 번째 스크리닝 시도에서와 같이 중복해서 수행하였다. 전혼성화 완충용액에 포름아미드를 사용하여 30℃에서 수행한 것을 제외하고는 상기에 기술한 바와 같이 세가지 셀룰라제 종류에 상응하는 올리고뉴클레오티드로 이 라이브러리를 스크리닝하였다. TMACL 세척을 67℃에서 20분간 2회 수행하였다. 20개의 플레이트에 해당하는 각 복제필터에서 8 내지 20개의 신호를 발견하였다. 파스퇴르 피펫의 큰 말단으로 첫 번째 플레이트에서 15개의 플러그(plug)를 취하여 1×PCR 완충용액 1ml(Perkin-Elmercetus)에 넣었다. 세 개의 분리된 올리고뉴클레오티드 혼합물로 세균 플러그에서 PCR을 수행하였다. 각 혼합물은 벡터에 특이적인 올리고뉴클레오티드 ZC2847 및 부가적으로 다른 셀룰라제에 특이적인 올리고뉴클레오티드(ZC 3309, ZC3310 또는 ZC3311)를 포함하였다. Amplitaq 플리머라제(perkin-Elmercetus)를 Pharmacia Ultrapure dNTP 및 하기의 Perkin Eimer Cetus 방법과 함께 사용하였다. 각 플라이머의 16 피코몰을 40μl 반응 부피에 사용하였다. 1×PCR 완충용액의 세포 20μl를 DNA를 제외하고 PCR에 필요한 모든 것을 포함하는 20μl를 마스터믹스(mastermix)에 첨가하였다. 94℃에서 1분 45초 동안 최초로 변성시킨 후 72℃에서 10분간의 최종신장 및 94℃에서 45초, 45℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 28 싸이클을 Perkin Eimer 열순환기에서 수행하였다. C족에 특이적인 올리고뉴클레오티드 ZC3309 및 ZC2847로 프라임된 경우 15개의 플러그 중 10개가 밴드를 나타냈다. 다른 혼합물은 특이적 생성물을 만들지 않았다. PCR에 의해 가장 큰 밴드를 나타낸 다섯 개의 플로그는 PCR밴드를 나타내지 않은 다섯 개의 플로그와는 별도로 전체 길이의 C족 셀로비오히드롤라제인 가능성이 있다. 밴드를 형성한 다섯 개의 플러그를 70μg/ml 암피실린을 지닌 100mm LB 플레이트 5개에 10배로 희석하여 플레이팅하였다. 복제 리프트를 2개의 10배 희석액에서 수행하였다. 전혼성화 및 혼성화를 상기와 같이 3올리고뉴클레오티드의 혼합물로 수행하였다. 플레이팅의 10개 전부에서 분리된 클론을 발견하였다. 희석된 플레이트에서 이쑤시게로 이것을 취하여 70μg/ml 암피실린이 들어있는 100mm LB 플레이트에 하나의 분리된 클로니를 형성시켰다. C족 셀로비오히드롤라제(ZC3409(CCG TTC TGG ACG TAC AGA) 및 ZC3411(TGA TGT CAA GTT CAT CAA)을 사용하여 분리된 세균 콜로니상에서 PCR을 수행하였다. 조건은 25μl 반응 부피에 10 피코몰의 각 프라이머를 사용한 것을 제외하고는 상기의 것과 동일하였다. 이쑤시게로 콜로니를 25μl 마스터믹스(mastermix)가 들어있는 시험관에 첨가한 후 싸이클링(cycling)하였다. 10개중 5개는 C족 셀로비오히드롤라제로 예측되는 크기의 강한 밴드를 나타냈다. 분리된 콜로니를 Terrific Broth 20ml(Sambrook 등, 이전에 기술한 문헌, A2)에서 생장시킨 후 빠른 비등방법으로 DNA를 분리하였다. Sanger 디데옥시 서열결정법으로 클론일부의 서열을 결정하였다. 서열분석 결과 PCR을 통해 C족 셀로비오히드롤라제에 특이적인 밴드를 나타내지 않는 클론 5개는 F족 셀룰라제 클론으로 밝혀졌다.
C족 엔도글루카나제를 콜로닝하기 위해, 클론 2백만개의 cCNA 리아브러리를 ZC3310으로 만재스크리닝하였다. 전혼성화 및 혼성화 조건은 상기에서 사용한 것과 같았다. 필터를 포름아이드가 없는 전혼성화용액 ml당 백만 CPM으로 말단이 표지된 ZC3310으로 30℃에서 10시간 동안 혼성화시켰다. TMACL세척을 60℃에서 20분간 2회 수행하였다. 7개의 약한 신호가 복제 필터에 나타났다. 이것을 70μg/ml 암피실린이 있는 100mm LB 플레이트에 5개의 10배 희석액으로 플레이팅하였다. 복제 리프트를 각 2개의 희석물에서 얻어 상기와 같이 진행하였다. 전 혼성화, 혼성화 및 세척을 스크리닝의 첫째 수준으로 수행하였다. 3개의 분리된 클론을 확인하였으며 단열 콜로니 혼성화를 위해 줄무늬를 만들었다. 분리체를 Terrific Broth 50ml(리터당:12g트립톤, 20g 효모추출물, 멸균된 4ml글리세롤, 및 100ml의 0.17M KH2PO4, 0.72M K2HO4, Sambrllk 등, 상기에 인용한 문헌, A2)에서 밤새 배양한 후 표준방법의 알칼리 용해 및 PEG침전으로 DNA를 분리하였다(Maniatis 1989, 1.38-1.41).
제한 분석결과, 하나의 클론(pZFH223)이 다른 것 보다 길어서 완전한 서열결정을 위해 선택하였다. 서열분석은 초기에 클로된 PCR 단편을 포함한다.
[DNA 서열분석]
효모의 발현벡터 pYCDE 8'에서 cDNA의 서열을 결정하였다. 모든 서열결정 반응에서 New England Nuclear의 35-S dATP(M.D.Biggin 등, Proc.Nat1 Acad Sci.USA 80, 1983, 99.3963-3965)를 이용하는 디데옥시사슬 종결방법(F.Sanger 등, Proc.Nat1 Acad Sci.USA 74,1977, 99.5463-5467)을 이용하였다. 이 반응은 Pharmacia의 변형된 T7 DNA 중합효소에 의해 촉매되었다(S.Tabor 및 C.C Richardson, Proc.Nall.Acad.Sci.USA 84,1987,99,4767-4771). 그리고 ADH1 프로모터(ZC996:ATT GTT CTC GTT CCC TTT CTT)에 상보적인 올리고뉴클레오티드로, CYC1 터미네이터에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 관심있는 DNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하였다. 서열결정 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키기 전에 이중가닥 주형을 NaOH로 변성시켰다(E.Y.Chen 및 P.H. Seeburg, DNA 4, 1985. PP.165-170). 올리고뉴클레오티드는 Applied Biosytems Mod 380A DNA합성기에서 합성하였다. 서열결정 반응에 사용한 올리고뉴클레오티드를 하기의 서열결정 올리고뉴클레오티드 표에 기술하였다.
[C-족 셀로비오히드롤라제 서열결정 프라이머]
[F-족 셀룰라제에 특이적인 서열결정 프라이머]
[C-족 엔도글루카나제에 특이적인 서열결정 프라이머]
유도된 아미노산 서열뿐만 아니라 전체-길이 cDNA 클론의 DNA 서열을 부록의 제11도(C-족 셀로비오히드롤라제), 제12도(F족 셀룰라제) 및 제13도(C-족 엔도글루카나제)에 나타냈다.
[실시예 4]
[H. insolens로부터 엔도글루카나제 EGI 유전자의 분리]
실시예 1에 기술된 cDNA 라이브러리를 또한 하기 서열의 안티센스(antisense) 형태인 35bp 올리고뉴클레오티드 프로브로 스크리닝하였다.
NOR-770:5'GCTTCGCCCATGCCTTGGGTGGCGCCGAGTTCCAT 3'
서열은 H. insolens의 코돈 바이어스(bias) 지식을 이용하여 이 생물체에서 정제한 EGI의 알카리제(alcalase) 단편의 아미노산 서열로부터 유도하였다. 1.6kb의 완전한 클론은 제14a-e도에 나타낸 1.3kb의 전체 코딩 서열을 포함하였다. 프로브 서열 NOR-770은 Met344-Ala355에 위치해 있다.
[EGI(전체길이) 및 EGI'(끝이 절단됨)의 발현 플라스미드 제조]
폴리-A 꼬리를 여전히 포함하는 EGI 유전자를 제2도에 요약된 바와 같이 A. oryzae 발현 플라스미드로 삽입시켰다. EGI의 코딩 영역을 개시 Met-코돈의 NcoI-위치에서 폴리 A영역의 아래쪽인 Bam HI-위치까지의 1450bp 단편을 pHW480에서 잘라냈다. 이것을 TAKA 프로모터와 대부분의 pUC19를 포함하는 pSX224(제1도)에서 얻은 3.6kb NcoI-BamHI 단편에 연결한 후, 이어서 AMG-종결체를 지닌 나머지 부분을 포함하는 p960bp NarI-BamHI 단편에 연결시켰다. 960bp 단편은 삽입된 유전자를 제외하고는 p777(EP 238, 023에 개시됨)과 같은 p960으로부터 얻었다. 얻어진 발현 플라스미드를 pHW485라 명명하였다.
폴리 A 꼬리가 없는 전체 길이의 EGI 유전자를 지닌 발현 플라스미드 pHW704를 제3도에 나타냈다. NcoI-위치의 아래쪽으로 1300bp 떨어져 있는 BstEII 위치에 벡터의 BalⅡ-위치에 연결된 102bp BstEⅡ-BamHI 링커(2645/2646)를 삽입하였다. 링커는 말단에 2개의 정지코돈이 있는 BstEⅡ-위치의 아래쪽에 코딩 영역 및 CBD와 B-영역들 첨가하는데 사용하는 C-말단에 인접한 PvuI-위치를 지닌다. 끝이 절단된 EGI' 유전자를 지닌 발현 플라스미드 pHW697을 69bp의 BstEⅡ-BamHI 링커(2492/2493)를 사용하여 유사하게 제조하였다. 이 링커에서, 본 발명자들은 Val421이 Leu421로 바뀐 PstI-위치를 삽입하였고 코딩 영역의 마지막 13 아미노산:K423PKPKPGHGPRSD435를 제거하였다. 보다 특이한 서열을 갖는 짧은 꼬리를 잘라 A 및 B-영역옆의 위쪽에 있는 T. reesei EGI에서 발견되는 것에 상응하는 EGI' C-말단을 만들었다.
[C-말단에 첨가된 ∼43kD 엔도글루카나제의 CBD 및 B 영역을 갖는 EGI'의 발현]
[플라스미드의 구성]
덴마크 특허출원 제 736/91호에 기술된 H. insolens의 ∼43kD 엔도글루카나제는 좋은 세척 성능을 나타냈다. 촉매 도메인외에, 43kD 셀룰라제는 본래 어떤 CBD 또는 B 영역을 지니지 않는 EGI'에 절단된 C-말단의 CBD 및 B 영역을 지녔다. 제4도에 요약된 바와 같이, 2단계로 제조하였다. EGI'의 C-말단을 43kD 셀룰라제의 B-영역에 연결시키게 되어 있는 PstI-HincⅡ 링커(028/030M)를 pSX320(제5도: DK736/91에 기술됨)의 40kD 셀룰라제 유전자에서 얻은 C-말단의 Hinc2-EcoRI 100bp 단편을 지닌 pUC19 PstI-EcorI에서 서브클로닝하였다. 서브클론 pHW767로부터 CBD 및 B-영역을 250bp PstI-BglⅡ 단편으로 잘라내어 5.7kb의 pHW485(제2도) BstEⅡ-BglⅡ 단편 및 pHW697(제3도)에서 얻은 55bp의 잔여 BstEⅡ-PstⅠ 단편에 연결하였다. 얻어진 발현 플라스키드 pHW768은 EGI'의 Gln422에 첨가된 ∼43kD 엔도글루카나제 CBD 및 C 영역을 지녔다.
[C-말단에 첨가된 ∼43kD 글루카나제의 CBD 및 B영역을 지닌 EGI 발현 플라스미드의 구성]
상기 플라스미드를 이 경우에는 C-말단 링커가 EGI의 완전한 서열을 나타낸 것을 제외하고는 pHW768에서와 동일한 방법으로 제조하였다. 제6도는 3단계에서의 방법을 보여준다. PvuⅠ-HincⅡ 링커(040M/014M)를 pUC18에서 서브클로닝하여 pHW775를 만든후, 여기에 pSX320(제5도)에서 얻은 HincⅡ-EcoRⅠ 1000bp 단편을 삽입하여 pHW776을 만들었다. 여기에서 250bp PvuⅠ-BglⅡ 단편의 CBD 및 B 영역을 잘라내어 pHW(제2도에)에서 얻은 5.7kb BstEⅡ-BglⅡ 단편 및 pHW705(제3도)에서 얻은 90bp BstEⅡ-PvuⅠ 단편에 연결시켰다. 얻어진 발현 플라스미드 pHW777은 완전한 EGI 서열의 Asp435에 첨가된 ∼43kD 엔도글루카나제 CBD 및 B 영역을 포함하였다.
[∼43kD 엔도글루카나제의 CBD 및 B 영역을 갖는 것 및 갖지 않은 EGI 및 EGI'의]
[A. oryzae에서의 발현]
발현 플라스미드 pHW485, pHW704, pHW697, pHW768 및 pHW777을 실시예 2에 기술한 바와같이 A. oryzae IFO 4177로 형질전환시켰다. 기술된 바와 같이 YPD 배지에서 자란 형질전환체로부터 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 바, 원래의 EGI는 53kD의 겉보기 분자량을 지녔다. EGI'는 기대한 것보다 약간 작게 보였으며, CBD 및 B 영역이 첨가된 종류는 일부 첨가된 탄수화물을 지닌 CBD 및 B 영역의 크기에 따라 분자량이 증가하였다. ∼43kD 엔도글루카나제에 대해 증가한 폴리클로날항체 AS169는 ∼43kD CBD 및 B 영역이 첨가된 경우에만 EGI 및 EGI'를 인식하였으나, 반면에 H. insolens에서 얻은 셀룰라제제조물에 대해 증가한 폴리클로날 항체 AS78은 4 종류 모두를 인식하였다. 4종류 모두는 카르복시 메틸 셀룰로스 형태의 가용성 셀룰로스에서 측정된 바와 같이 엔도글루카나제 활성을 지녔다.
[링커]
[실시예 5]
다른 CBD 및 B-영역을 갖는 ∼43kD 엔도글루카나제:
A영역 클론에서 얻은 다른 CBD 및 B 영역의 ∼43kD 엔도글루카나제에 대한 영향을 시험하기 위해 본 발명자들은 ∼43kD의 원래 CBD 및 B 영역을 다른 C-말단 CBD 및 B 영역, 예를 들어 A-1, A-8, A-9, A-11 및 A-19로 치환하였다(실시예 1 참조). 착상(concept)을 시험하기 위해 본 발명자들은 또한 43kD B 영역이 제거된 구조체를 만들었다.
단편:모든 단편은 Perkin-Elmer/Cetus DNA Amplification System을 제조자의 지침에 따라 PCR 증폭으로 만들었다.
1) pSX 320(제5도)에 있는 BamHI 위치의 56bp 윗쪽으로부터 ∼43kD 엔도글루카나제 유전자의 코딩 영역내 717bp까지의 DNA에 해당하는 PCR 단편을 만들었다. 동시에 위치 708에 있는 KpnI 부위 및 위치 702에 있는 SmaI 부위를 B 영역의 발단부분에 있는 코딩 영역에 삽입시켰다. 이 PCR 단편을 프라이머 NOR 1542 및 NOR 3010으로 만들었다(하기의 올리고뉴클레오티드 목록 참조).
2) B영역의 발단부분에 있는 KpnI 위치를 1)에서 삽입된 KpnI 위치를 지니는 프레임에 삽입시키고, 유전자의 코딩영역의 아래쪽에 위치하는 XhoI 위치를 삽입시켜서 A-1의 CBD 및 B 영역을 포함하는 PCR 단편을 만들었다. 사용한 프라이머: NOR 3012 윗쪽 및 NOR 3011 아래쪽.
3) 단편이 A-8의 CBD 및 B 영역과 유전자의 아래쪽에 있는 발현벡터의 XhoI 위치를 지니는 것을 제외하고는 2)와 같았다. 프라이머:NOR 3017 및 NOR 2516.
4) A-9의 CBD 및 B 영역에 해당하는 NOR 3016 및 NOR 3015를 프라이머로 사용한 것을 제외하고는 2)와 같았다.
5) A-11의 CBD 및 B 영역에 해당하는 NOR 3021 및 NOR 2516을 프라이머로 사용한 것을 제외하고는 3)과 같았다.
6) A-19의 CBD 및 B 영역에 해당하는 NOR 3032 및 NOR 3022를 프라이머로 사용한 것을 제외하고는 2)와 같았다.
7) B영역의 말단에 PvuⅡ 위치를 삽입시키는 pSX320 상의 유전자의 아래쪽에 있는 XhoI 위치 및 ∼43kD 글루카나제의 CBD를 포함하는 PCR 단편.
프라이머:NOR 3023 및 NOR 2516.
조합:
1)+2)는 BamHI-KpnI 및 KpnI-XhoI이 pToC68(DK736/91에 개시됨) BamHI-XhoI으로 삽입된 것으로, A-1의 CBD 및 B 영역을 지닌 43kD 코아(core)효소를 코딩한다.
1)+3):상기와 같이 A-8 CBD/8 영역을 지닌 43kD 효소를 만든다.
1)+4):상기와 같으나, A-9 CBD 및 B 영역을 갖는다.
1)+5):상기와 같으나, A-11 CBD 및 B 영역을 갖는다.
1)+6):상기와 같으나, A-19 CBD 및 B 영역을 갖는다.
1)+7)은 BamHI-SmaI 및 PvuⅡ-XhoI이 pToC 68BamHI-XhoI로 삽입된 것으로, B영역이 없는 43kD 효소를 코딩한다.
올리고뉴클레오티드:
[실시예 6]
[세균 촉매 도메인과 진균 CBD의 융합]
Bacillus lautus NCIMB(PCT/DK91/00013에 기재된)가 생산한 엔도글루카나제 Endo 1을 촉매 도메인(코아) (Ala(32)-Val(555)) 및 B. subtilis 엔도글루카나제(R.M. MacKay 등, 1986. Nucleic Acids Res. 14, 9159-70)에 유사한 C 말단 셀룰로스 결합 도메인(CBD)으로 구성된다. 효소가 CMC 분해 코아 효소를 생산하는 B. subtilis 또는 E. coli에서 발현될 때 CBD는 단백질 촉매에 의해 절단된다. 이 실시예에서, 이 코아 단백질은 Humicola insolens(DK 736/91에 개시됨)의 ∼43kD의 B 영역 및 CBD와 융합되어 있다.
[융합체의 구성]
∼43kD 엔도글루카나제를 코드화하는 cDNA 유전자를 함유하는 플라스미드 pCaHj 170을 제7도에 나타낸 바와 같이 구성하였다. pCaHj 170을 XhoⅡ 및 SalⅠ으로 소화하였다. 223bp XhoⅡ-SalⅠ 단편을 분리하여 BamHI 및 ScaI으로 소화한 pUC19(Yanisch-Perron 등, 1985. Gene 33, 103-119)에 연결시켰다. 이 XhoⅡ-BamHI 연결에 의해 BamHI 위치가 재생되었다. 얻어진 플라스미드, IM2를 EcoRI 및 BamHI으로 소화하여 링커 NOR3045-NOR3046:
와 연결하였다. 생성된 플라스미드, IM3을 EcoRV 및 SacⅡ로소화하여 445bp HincⅡ-SacⅡ pPL517 단편에 연결시켰다. pPL517은 전체의 Bagillus Endo 1 유전자를 함유한다(PCT/DK91/00013). 이 연결체의 생성물을 IM4라 명명하였다. Endo 1의 Bacillus 신호펩티드를 43kD 엔도글루카나제로부터 얻은 진균의 신호 펩티드로 대체시키기 위하여 Splicing by Overlap Exten-tion(SOE) 융합(R M Horton 등 (1989):Gene, 77, 61-68)에 사용할 4가지 PCR 프라이머를 디자인하였다. 43kD 신호 서열을 5' 프라이머 NOR 3270 및 3' 프라이머 3275를 사용하여 BclⅠ 위치를 5' 말단에, Bacillus endo 1 유전자에 상동적인 21bp를 3' 말단에 도입하는 플라스미드 pCaHj 109(DK/736/91)로부터 증폭시켰다. 유일한 SacⅡ 위치의 5'에 있는 Endo 1 유전자의 일부를 43kD 유전자에 상동적인 21bp를 갖는 5' 프라이머 NOR 3276 및 SacⅡ 위치를 갖는 3' 프라이머 NOR 3271을 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 단편을 혼합하여 녹이고, 어닐링한후 taq 중합효소로 연결시켰다(제9도). 생성된 혼성체를 프라이머 NOR 3270 및 NOR 3271을 사용하여 증폭시켰다. 혼성 단편을 BclⅠ 및 SacⅡ로 소화한후 IM4에서 얻은 676bp SacⅡ-SacⅠ 단편 및 BamHI으로 소화한 Aspergillus 발현 벡터 pToc 67(DK 736/92)에 연결시켰다. 이 연결 생성물, pCaHj 18(제10도)은 43kD 신호 펩티드를 코드화한 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 및 Endo 1의 코아(Ser(34)-Val(549))에 연결된 완전한 ∼43kD 엔도글루카나제의 N-말단 아미노산(Met(1)-Arg(25)의 처음 4개를 포함하며, 43kD B영역 및 CBD(Ile(233)-Leu(285))에 융합된 펩티드 Ile-Ser-Glu(링커에 의해 코드화됨)이 연결되어 있다.공개된 EP 특허출원 제238 023호에 기술된 바와 같이 pToc90(DK 736/91 참조)을 이용한 공형질전환에 의한 아세트아미드상에서의 선별을 이용하여 pCaHj 180을 Aspergillus oryzae IFO 4177로 형질전환시켰다.
Endo 1 코아 및 ∼43kD CBD 및 B 영역의 서열을 첨부된 제15a-d도에 나타냈다.

Claims (19)

  1. 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소로서, Trichoderma 또는 Phanerochaete 이외의 진균에서 유래되고 Trichoderma reesei 셀룰라제의 말단 A 영역에 상동적인 탄수화물 결합 도메인을 포함하며 상기 탄수화물 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열
    상기에서 위치 1에서, 아미노산은 Trp 또는 Tyr; 위치 2에서, 아미노산은 Gly 또는 Ala; 위치 7에서, 아미노산은 Gln, Ile 또는 Asn; 위치 8에서, 아미노산은 Gly 또는 Asn; 위치 9에서, 아미노산은 Trp, Phe 또는 Tyr; 위치10에서, 아미노산은 Ser, Asn, Thr 또는 Gln; 위치12에서, 아미노산은 Pro, Ala 또는 Cys; 위치13에서, 아미노산은 Thr, Arg 또는 Lys; 위치14에서, 아미노산은 Thr, Cys 또는 Asn; 위치18에서, 아미노산은 Gly 또는 Pro; 위치19에서, 아미노산은(존재할 경우) Ser, Thr, Phe, Leu 또는 Ala; 위치20에서, 아미노산은 Thr 또는 Lys; 위치22에서, 아미노산은 Thr, Arg, Glu 또는 Lys; 위치23에서, 아미노산은 Lys, Gln 또는 Arg; 또는 위치 22 및 23에서, 아미노산은 Thr Lys, Arg Gln, Val Lys, Lys Lys, Arg Ala 또는 Glu Lys; 위치24에서, 아미노산은 Gln 또는 Ile; 위치26에서, 아미노산은 Gln, Asp 또는 Ala; 위치27에서, 아미노산은 Trp 또는 Phe; 위치29에서, 아미노산은 Ser, His 또는 Ala: 및/또는 위치32에서 아미노산은 Leu, Ile, Gln, Val 또는 Thr이고 또는 불용성의 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 그것의 아서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  2. 제1항에 있어서, Humicola, Fusarium 또는 Myceliopthora의 균주에서 유래되는 것을 특징으로 하는 효소.
  3. Trichoderma 또는 Phanerochaete 이외의 진균에서 유래되고 Trichoderma reesi 셀룰라제의 말단 A 영역에 상동적인 탄수화물 결합 도메인을 포함하는 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소로서, 상기 탄수화물 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열
    또는 불용성의 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 그것의 아서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소
  4. 제3항에 있어서, Humicola, Fusarium 또는 Myceliopthora 균주에서 유래되는 것을 특징으로 하는 효소.
  5. 제1항에 있어서, 탄수화물 결합 도메인과 효소의 촉매 활성 도메인을 결합시키는 연결 B 영역을 한정하는 아미노산 서열로서 하기 아미노산 서열을 갖는 B 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  6. 제1항에 있어서, 자연적으로 발생하는 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소에서 유래된 탄수화물 결합 도메인, 자연적으로 발생하는 다른 셀룰로스-또는 헤미셀룰로스-분해 효소에서 유래되고 연결 B 영역을 한정하는 아미노산 서열 뿐만아니라 제3의 효소에서 얻은 결합 도메인 또는 B 영역을 제공하는 효소에서 유래된 촉매활성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  7. 제6항에 있어서, 촉매 활성 도메인은 원래 본질적으로 촉매활성 도메인으로 구성된 효소로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 효소.
  8. 제1항에 있어서, 셀룰라제, 예컨대 엔도글루카나제, 셀로비오히드롤라제 또는 β-글루코시다제인 것을 특징으로 하는 효소.
  9. 제1 내지 제8항중 어느 한 항 효소를 코드화한 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 DNA 구조체.
  10. 제9항에 따른 삽입된 DNA 구조체를 지니는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. 제9항에 따른 DNA 구조체 또는 제10항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 제11항에 있어서, Aspergillus niger 또는 Aspergillus oryzae등의 Aspergillus 균주에 속하는 진균세포, 또는 Saccharomyces cerevisiae 등의 Saccharomyces 균주에 속하는 효모세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제1 내지 제8항중 어느 한 항의 효소를 생산하는 방법으로서, 제11항 또는 제12항에 따른 세포를 효소의 생산을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 및 배양물로부터 효소를 연속하여 수확하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. Trichoderma 또는 Phanerochaete 이외의 진균에서 얻어지며 Trichoderma reesei 셀룰라제의 말단 A 영역에 상동적인 탄수화물 결합 도메인을 포함하는 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스-분해 효소를 코드화하는 DNA 서열을 분리하는 방법으로서, 적어도 T. reesei 셀룰라제의 A 영역을 코드화하는 DNA를 포함하는 프로브로 다른 균주의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스를 분해하는 제제로서, 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  16. 제15항에 있어서, 제1 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 둘 이상의 효소의 조합, 제1 내지 제8항중의 어느 한 항의 하나 이상의 효소와 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 활성을 지닌 하나 이상의 다른 효소와의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제
  17. Trichoderma reesei 셀룰라제의 A 영역에 상동적인 탄수화물 결합 도메인으로서, 하기의 아미노산 서열
    상기에서 위치 1에서, 아미노산은 Trp 또는 Tyr; 위치 2에서, 아미노산은 Gly 또는 Ala; 위치 7에서, 아미노산은 Gln, Ile 또는 Asn; 위치 8에서, 아미노산은 Gly 또는 Asn; 위치 9에서, 아미노산은 Trp, Phe 또는 Tyr; 위치10에서, 아미노산은 Ser, Asn, Thr 또는 Gln; 위치12에서, 아미노산은 Pro, Ala 또는 Cys; 위치13에서, 아미노산은 Thr, Arg 또는 Lys; 위치14에서, 아미노산은 Thr, Cys 또는 Asn; 위치18에서, 아미노산은 Gly 또는 Pro; 위치19에서, 아미노산은(존재할 경우) Ser, Thr, Phe, Leu 또는 Ala; 위치20에서, 아미노산은 Thr 또는 Lys; 위치22에서, 아미노산은 Thr, Arg, Glu 또는 Lys; 위치23에서, 아미노산은 Lys, Gln 또는 Arg; 또는 위치 22 및 23에서, 아미노산은 Thr Lys, Arg Gln, Val Lys, Lys Lys, Arg Ala 또는 Glu Lys; 위치24에서, 아미노산은 Gln 또는 Ile; 위치26에서, 아미노산은 Gln, Asp 또는 Ala; 위치27에서, 아미노산은 Trp 또는 Phe; 위치29에서, 아미노산은 Ser, His 또는 Ala: 및/또는 위치32에서 아미노산은 Leu, Ile, Gln, Val 또는 Thr이고 또는 불용성의 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 그것의 아서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  18. Trichoderma reesei 셀룰라제의 말단 A 영역에 상동적인 탄수화물 결합 도메인으로서, 상기 탄수화물 결합 도메인은 하기의 아미노산 서열
    또는 불용성 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 기질에 효소를 효과적으로 결합시킬 수 있는 그것의 아서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소.
  19. 셀룰로스- 또는 헤미셀룰로스-분해 효소에서 유래된 연결 B 영역으로서, 하기의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 영역
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