ES2440741T3

ES2440741T3 - Prevención y reducción de la formación de biopelícula y proliferación planctónica

Info

Publication number: ES2440741T3
Application number: ES08732576.7T
Authority: ES
Inventors: Sarah Mchatton; Irene Michelle Williams; David Drahos
Original assignee: Novozymes Biologicals Inc
Current assignee: Novozymes Biologicals Inc
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2014-01-30
Anticipated expiration: 2028-03-20
Also published as: US9809477B2; ES2503619T3; JP5427041B2; JP2016147904A; CN101679087B; EP2500325A1; CA2680370C; DK2500325T3; WO2008118749A3; JP2010522205A; AU2008231038A1; EP2500325B1; US20150225272A1; US20080233093A1; DK2134657T3; CA2680370A1; EP2134657B1; CN101679087A; JP2014043467A; AU2008231038B2

Abstract

Método para evitar o reducir la formación de biopelícula provocada por microorganismos no deseados en una superficie,que comprende someter dicha superficie a una o más cepas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en: la cepa con el número de acceso de depósito NRRL B-50017; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7541; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7542; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7543; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7544; la cepa con el número de acceso de depósito PT A-7545; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7546; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7549; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7791; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7792; la cepa con el número de acceso de depósito PT A-7793 o una mezcla de dos o más de las cepas.

Description

Prevención y reducción de la formación de biopelícula y proliferación planctónica

Campo de la invención

10001J La presente invención proporciona métodos y composiciones para evitar y/o reducir la formación de biopelícula en superfICies y/o proliferación planct6nica en ambientes acuosos, especialmente en entornos indu striales y domésticosJcaseros.

Antecedentes de las invenciones

10002J La formación de biopelicula y la proliferación planctónica por microorganismos son fenómenos no deseados conocidos en entornos domésticos al igual que industriales. Por ejemplo, los inodoros albergan bacterias indeseables en superfICies y en la solución que pueden contribuir a una apariencia evidentemente sucia de la taza. Además, la presencia de microorganismos no deseados en la taza pueden causar disperSión de aerosoles en la descarga. La formación de biopelícula masiva y la proliferación planctónica en los sistemas de agua, por ejemplo, tuberías, bombas y vasos, es conocida por causar riesgos del cuidado de salud, corrosión, y problemas estéticos.

10003J La prevención o reducción de la formación de biopelicula y/o proliferación planctónica por microorganismos indeseables requiere generalmente el uso de dispersantes, tensioactivos, enzimas, microbios, agentes antimicrobianos, biocidas, procedimientos de ebullición, y/o productos químicos.

10004) Patente EE. UU. n.o. 5,171,591 concierne el controlo eliminación de bacterias no deseadas en o sobre alimentos determinados o en superfICies en contacto con comida usando bacterias parasitarias del género Bdellovibrio.

[0005) Patente EE. UU. n.o. 5,242,593 concierne un método para reducir la acumulación de lodo y/o película en los sistemas de circulación de agua añadiendo microbios sin sésil en forma única al agua circulante.

[OOO6J Patente EE. UU. n.o. 5,360,517 divulga un proceso de regulación del crecimiento de la flora microbianalbacteriana existente en una corriente acuosa de un circuito/proceso de fabricación de papel que comprende introducir una cantidad eficaz de desinfectante de bacterias de la especie Staphylococcus camosus.

10007] Patente EE. UU. n.o. 5,863,882 concierne formulaciones de limpieza y desinfección liquida que comprenden una composición de desinfección, esporas de Bacillus viables, y tensioactivos capaces de reducir cuatro microorganismos patógenos.

10008J Patente Australiana n.o. 719544 concierne un método de control del número de bacterias patógenas en un cuerpo de agua añadiendo bacterias gram poSitivas no patógenas.

[0009) WQ 2006/031554 revela un método de prevención, eliminación, reducción o alteración de biopelículas en superficies mediante la puesta en contacto de dicha superfICie con una alfa-amilasa derivada de una bacteria.

10010) EP-A-2066785 (publicado como WO 2008/021761) y sus documentos de prioridad revelan composiciones que comprenden algunos de los cultivos bacterianos de la solicitud instantánea -salvo la cepa bacteriana aislada recién depositada como NRRL 8-5001 7. También divulga que las cepas bacterianas identificadas en estas se pueden utilizar para el lavado, especialmente lavanderia y tejidos recién fabricados y superfiCies de limpieza. No obstante, esta publicación no concierne en absoluto la prevenCión o reducción de la formación de biopelfcula provocada por microorganismos no deseados en una superficie. De hecho, la palabra biopelícula no se encuentra en ningún sitio en WQ 2008/021761. La limpieza de una superficie es algo que se quiere hacer después de que una biopelícula se ha formado en dicha superfICie, mientras que la presente solicitud se refiere a la fase anterior, donde se puede prevenir o reducir la formación de una biopelicula en una superfiCie.

10011J Aunque métodos de reducción y prevención de la formación de biopelicula y proliferación planctónica de microorganismos no deseados se conocen en la técnica, sigue habiendo una necesidad de métodos y composiciones para hacer eslo.

Breve descripción del dibujo

10012J

Fig. 1 muestra una proliferación planctónica reducida de población de Pseudomonas en presencia de mezcla de Bacillus

(688) en proporciones de Bacillus:Pseudomonas diferentes.

Fig. 2 muestra poblaciones de biopelícula de Pseudomonas reducidas en presencia de mezcla de Bacillus (688) a diferente proporciones de Bacillus : Pseudomonas.

Fig. 3 muestra una proliferación planctónica reducida de Pseudomonas en presencia de mezcla de Bacillus (688) en diferentes proporciones de Bacillus:Pseudomonas.

Descripción de la invención

[0013J La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la reducción o prevención de la fonnación de biopelicula.

[0014) Los inventores han aislado y evaluado un número significativo de cepas de bacterias por su capacidad para reducir o prevenir la formación de biopelícula en ambientes acuosos. Ellos han encontrado que un número pequeño de las cepas evaluadas del género Bacillus puede reducir y/o prevenir la fonnación de biopelícula y/o proliferación planctónica cuando se co-cultiva con microorganismos indeseables incluyendo Pseudomonas aefUginosa, Pseudomonas monfelli, Pseudomonas pufida, Vibrio haNeyi, Vibrio alginolyticus, Vibrio fischerii, y/o Escherichia eoli. Esto está descrito en detalle en los ejemplos.

Métodos para prevenir yIo reducir la fonnación de biopelicula

/0015) En el primer aspecto la invención se refiere a métodos para evitar o reducir la fonnación de biopelicula provocada por microorganismos no deseados en una superficie Que comprende someter dicha superficie a una o más cepas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en:

la cepa con el número de acceso de depósito NRRL 8-50017;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7541;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7542;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7543;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7544;

la cepa con el numero de acceso de depósito PT A-7545;

la cepa con el número de acceso de depósito PT A-7546;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7549;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7791;

la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7792;

la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7793 o una mezcla de dos o más de las cepas.

[0016) En una fOnTIa de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir la formación de biopelícula en una superfICie Que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito NRRL 8-50017. En una fOnTIa de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelicula en una superficie Que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7541. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7542. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depóSito PTA-7543. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7544. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7545. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelicula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7546. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7549. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopeliclJla en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7550. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7789. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7791. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelícula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7792. En una forma de realización la invención se refiere a métodos para evitar o reducir formación de biopelicula en una superficie que comprenden someter dicha superficie a la cepa con el numero de acceso de depósito PTA-7793.

[0017) En una forma de realización una mezcla de bacterias se puede utilizar según el método de la invención. Ejemplos de mezclas se pueden encontrar debajo en la sección "Cepas de Bacterias y Mezclas de cepas de Bacterias".

[0018) El término "formación de biopelicula" significa la formación de una capa o película de lodo por microorganismos no deseados en una superfICie. La formación de biopelicula es una consecuencia del crecimiento de microorganismos no deseados que se adhieren individualmente o en colonias a una superficie.

10019) El término "superficie" se refiere a cualquier superfICie, superfICies preferiblemente duras, que pueden ser propensas a formación de biopelicula y adhesión de microorganismos. Ejemplos de superfICies contempladas incluyen superficies duras hechas de uno o varios de los siguientes materiales: metal, plástico, caucho, cartón, vidrio, madera, papel, hormigón, roca, mármol, yeso y materiales cerámicos, tales como porcelanas, que opcionalmente son recubiertos, por ejemplo, con pintura o esmalte. Ejemplos de superficies blandas incluyen superficies hechas de fibras de cualquier tipo (p. ej., madejas, tejidos, fibras vegetales, lana de roca, y cabello); o cualquier superficie porosa; piel (humana o animal); materiales queratinosos (p. ej., uñas); y órganos internos (p. ej., pulmones).

10020J Superficies duras se encuentran, por ejemplo, en cuartos de baño, por ejemplo, accesorios, fregaderos, bañeras, inodoros, y depósitos de agua de enjuague; en las torres de enfriamiento; plantas de tratamiento de agua; tanques de agua; lecherfa, plantas de procesamiento alimenticias etc.; plantas de procesos qufmioas o farmacéuticos; o dispositivos médicos

(p. ej., catéteres, dispositivos ortopédicos, e implantes). Superficies propensas a biopelicuta también pueden ser superfiCies porosas. Superficies porosas pueden, por ejemplo, estar presentes en filtros, por ejemplo, filtros de membrana.

Cepas de bacterias y mezcla de cepas de bacterias

[0021) Debe entenderse que una cepa de bacterias usada en acuerdo con métodos de la invención puede ser un cultivo de una de las cepas depositadas anteriormente mencionadas. En una forma de realización preferida la cepa es una de las cepas depositadas o una descendiente de la misma.

10022J La(s) cepa(s) de bacterias puede(n) ser un(unos) ingrediente(s) activo(s) en composiciones que también comprenden otros ingredientes activos yfo inactivos.

10023) Los términos, "cantidad efICaz", "dosis eficaz" o "concentración eficaz" se definen aquf como la cantidad, concentración o dosis de una o más cepas de bacterias que pueden reducir yfo prevenir la formación de biopelicula provocada por microorganismos no deseados en una superficie y/o reducir y/o prevenir la proliferación planctónica de microorganismos no deseados en un entomo acuoso. La dosis eficaz real en números absolutos depende de factores que incluyen: el(los) microorganismo(s) no deseado(s) en cuestión; si el objetivo es la prevención o la reducción; el tiempo de contacto entre la(s) cepa(s) o composición que comprende dicha(s) cepa(s); otros ingredientes presentes, y también la superfICie o entorno acuoso en cuestión. En una forma de realización una dosificación efICaz de bacterias, por ejemplo, de las seis mezclas de cepas de Bacillus mencionadas a continuación, eslarfa en el rango de 1 a 1x108 ufcfmL, preferiblemente 50 a 1x107 ufclmL. Además, en una forma de realización la proporción entre la cepa de bacterias o mezclas concemidas aquí y el(los) microorganismo(s) no deseado(s) en cuestión puede(n) estar entre 1:100 000 y 100 000:1 (cepafmezcla:microorganismo no deseado), preferiblemente 1:10 000 a 10000:1, más preferiblemente 1:1000 a 1000:1, más preferiblemente 1:100 a 100:1, inclu so más preferiblemente 1 :10 a 10:1.

[0024) En general, ambientes que reciben aftas cargas de microorganismos indeseables y nutrientes requieren altas dosis de cepas de bacterias de mitigación, mientras que ambientes con bajas cargas de organismos indeseables requieren dosis inferiores de cepas de bacterias de mitigación. Además, por ejemplo, la prevención de formación de biopelícula en superfICies o prevención de la formación planctónica en ambientes acuosos, en general, requiere dosis inferiores de la(s) cepa(s) de bacterias concernida(s) que la reducción de la formación de biopel1cula en las superfiCies correspondientes o reducir el número de de microorganismo(s) no deseado(s) ya existentes en ambientes acuosos correspondientes.

[0025) Consecuentemente, un método de la invención se puede usar para inhibir el crecimiento (es decir, conduciendo a la reducción de la formación de biopelícula) de uno o más microorganismos no deseados, preferiblemente bacterias ya presentes en una superficie o ya presentes en un entomo acuoso. En otra forma de realización la invención se refiere a prevenir y/o retardar significativamente la formación de biopelicula en una superfiCie esencialmente limpia (es decir, superfICie sin esencialmente microorganismos no deseados) y/o proliferación planctónica en el agua esencialmente limpia (es decir, entorno acuoso que no contiene esencialmente ningún microorganismo no deseado). En otras palabras, la(s) cepa(s) de bacterias concemida(s) protege(n) la superficie y/o entamo acuoso contra el crecimiento futuro de uno o más microorganismos no deseados. Un método de la invención puede tener como resultado la reducción o incluso eliminaciónJIimpieza de microorganismos no deseados ya existentes. la(s) cepa(s) de bacterias concernida(s) puede(n) en una forma de realización preferida ser aplicadas a la superfiCie en cuestión y/o o añadidas al entorno acuoso en cuestión periódicamente. Periódicamente signifICa que el método de la invención se puede reiterar o repetir durante un periodo de tiempo, por ejemplo, cada minuto, hora, día, semana, mes, etc. como se ha mencionado anteriormente, el efecto puede no durar durante un periodo de tiempo largo. Puede requerir redosificación de cepas de bacterias. Por ejemplo, cuando la superfICie y entorno acuoso esta en el interior de la taza del inodoro y el agua de aclarado en la taza del inodoro, respectivamente, la redosificación puede ocurrir (periódicamente), por ejemplo, con cada descarga. la(s) cepa(s) de bacterias concernidas puede(n), por ejemplo, ser incorporada(s) en un block.

[0026) Un método de la invención también se puede realizar sometiendo manualmente y/o mecánicamente (es decir, aplicando o poniendo en contacto) la(s) cepa(s) de bacterias o composición que oomprende una o más cepas de bacterias (es decir; mezclas) a la superfICie en cuestión .

[0027) En una forma de realización preferida la bacteria, que se puede utilizar sola o en combinación con otras bacterias, es NRRl8-50017.

10028J Se debe entender que una mezcla de la invención puede o puede no comprender otras cepas además de las depositadas en relación con la presente invención . Debe entenderse que una mezcla de la invención puede además de unas cepas depositadas en relación con la invención, también comprender otras cepas. Un ejemplo es Bacillus megaterium S8-3112 (NÚmero de depósito de ATCC PTA-3142) descrito en US 2005f0036990. En una forma de realización las mezclas comprenden NRRl 6-50014, NRRl 8-50015, NRRl 8-50016, NRRl 6-50017, NRRl 8-50018 Y PTA-3142.

Microorganismos no deseados

10029) En el contexto de la invención el término "microorganismos no deseados" signifICa microorganismos que pueden suponer un efecto que se considera negativo en la superfiCie en cuestión y/o en el entorno acuoso en cuestión, especialmente en entornos industriales o domésticos. Ejemplos de tales efectos negativos incluyen olor, corrosión, picadura, u otra degradación de material; infección; coloración o de otra manera hacer que una superficie aparezca estéticamente desagradable. Microorganismos no deseados también incluyen microorganismos patógenos, especialmente bacterias patógenas.

10030) Usando una o varias de las cepas de bacterias aisladas concernidas aqui en una cantidad eficaz la formación de biopelicula en superfiCies yfo la proliferación planctónica en ambientes acuosos se pueden reducir y/o evitar.

10031) En una forma de realización preferida la superficie en cuestión propensa a la formación de biopelicula se puede someter a una o varias de las cepas de bacterias como una medida preventiva antes de cualquier formaciónfacumulación de biopelícula. Esto tiene como resultado que se forme significativamente menos biopelícula. Alternativamente, si una biopelícula se ha formado ya, o al primer signo de acumulación de biopelícula, un método de la invención se puede utilizar para reducir una mayor formación de biopelícula. Un método de la invención puede incluso suponer la eliminación completa

o parcialmente de la biopel1cula.

10032) Ejemplos de microorganismos no deseados inCluyen aquellos descritos a continuación.

10033) Microorganismos no deseados incluyen, pero de forma no limitativa, bacterias aeróbicas o bacterias anaeróbicas, Gram negativas y Gram poSitivas, hongos (levadura u hongo filamentoso), algas, y/o protozoos. las bacterias contempladas incluyen bacterias seleccionadas del grupo que consiste en. Pseudomonas spp. incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter vinelandií, Escherichia coli, Corynebacterium diphteriae, Clostridium botulinum, Stroptococcus spp. , Acetobacter, Leuconostoc, Betabacterium, Pneumococcus, Mycobacterium tuberculosis, Aeromonas, Burkholderia, Flavobacferium, Sa/mone/la, Staphy/ococcus, Vibrio spp., Listeria spp., y Legionella spp.

10034J En una forma de realización preferida, el microorganismo no deseado es una bacteria aeróbica. En una forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una cepa de Aeromonas.En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una cepa de Burkholden'a.En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una Cepa de Flavobacterium. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una cepa de Microbacterium. En otra forma de realización más prefe rida, la bacteria aeróbica es una Cepa de Pseudomonas. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una Cepa de Sa/monella. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una cepa de Staphy/ococcus. En otra fama de realización más preferida, la bacteria aeróbica es de la familia Enterobacteriaceae (incluyendo por ejemplo, Escherichia CO/I).

[0035) En una forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Burkholderia cepacia. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es una Microbacterium imperia/e o Mycobacterium tuberculosis. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Pseudomonas aeruginosa. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Pseudomonas fluorescens . En otra forma de realizaci6n más preferida, la bacteria aeróbica es Pseudomonas oleovorans. En otra forma de realización más preferida. la bacteria aeróbica es Pseudomonas pseudoa/caligenes. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Sa/mone/la enteritidis. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Staphylococcus aurous. En otra forma de realización más preferida, la bacteria aeróbica es Staphylococcus epidermidis.

10036) En otra foma de realización más prefe rida la bacteria es Lisieria monocytogenes.

[0037) En otra forma de realización más preferida la bacteria es Legionella ade/aidensis. En otra forma de realización más preferida la bacteria es Legionella pneumophila. En otra forma de realización más preferida la bacteria es Legionella fee/eii. En otra fama de realización más prefe rida la bacteria es Legionella moravica.

[0038) En otra forma de realización la bacteria es Vibrio harveyi, Vibrio fischerii, y/o Vibrio a/ginolyticus.

[0039) En otra forma de realización preferida, el microorganismo es una bacteria anaeróbica. En otra forma de realización más preferida, la bacteria anaeróbica es una cepa de Desulfovibrio. En otra forma de realización más preferida, la bacteria anaeróbica es Desuffovibrio desuffuricans.

10040J En otra forma de realización preferida, el microorganismo no deseado es un hongo tal como una levadura u hongo filamentoso. En otra forma de realización más preferida, la levadura es una cepa de Candida. En otra forma de realización más preferida, la levadura es Candida albicans.

Composición de la invención

10041 J l a invención también se refiere a una composición que comprende una o varias de las cepas de bacterias depositadas como se describe en este caso. Debe entenderse que una composición de la invención puede comprender una

o varias de las cepas bacterianas concernidas aquí como cepas únicas o mezcla de dos o varias cepas, pero también puede incluir otras cepas de bacterias y/o ingredientes activos. En una forma de realización la composición comprende además un surfactante o uno o varios otros ingredientes mencionados a continuación.

Surfacatantes

[0042) los surfactantes pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o zwitteriónicos y/o catiónicos. EI(los) tensioactivo(s) deberfa(n) causar un daño a la actividad del cultivo de bacterias tan pequeña como sea posible.

¡0043) los tensioactivos pueden estar presentes en la composición a un nivel de 0,01% a 60% en peso.

[0044) Cuando se incluye alli, la composición contiene normalmente de aproximadamente O a aproximadamente un 40% de un surfactante aniónico tal como alquilbencenosutfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, éster matuico de alfa-sulfo ácido graso, ácido alquil-o alquenilsuccínico o jabón.

[0045) Cuando se incluye allí, la composición contiene normalmente de aproximadamente O a aproximadamente un 40% de un surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglic6sido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de polihidroxi alquil ácido graso, o derivados de N-alquilo N-acilo de glucosamina ("glucamidas").

Otros ingredientes

[0046) La composición puede comprender una o más enzimas. Ejemplos de enzimas contempladas se mencionan en la sección "Enzimas".

[0047) Otros ingredientes incluyen, pero de forma no limitativa, dispersantes, estabilizadores, agentes antimicrobianos, fragancias, tintes, y biocidas.

Enzimas

[0048) Una o más enzimas puede estar presente en una composición de la invención. Enzimas especialmente contempladas incluyen proteasas, alfa-amilasas, celulasas, lipasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, y mananasas, o mezclas derivadas.

[0049) Proteasas: proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Origen microbiano es preferido. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína están incluidos. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de 8acillus, por ejemplo, subtilisina Novo, sublilisina Carlsberg, sublilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de lipo tripsina son tripsina (p. ej., de origen bovino o porcino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.

¡OOSOJ Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98120116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 Y 274. Enzimas proteasas disponibles comercialmente preferidas incluyen ALCALASE TM, SAVINASE rM, PRIMASE rM , OURALASE TM, OYRAZYM TM , ESPERASE TM , EVERLASE TM, POLARZYMETM Y KANNASETM, lIQUANASETM (Novozymes AlS), MAXATASETM, MAXACAL rM , MAXAPEM rM , PROPERASETM, PURAFECT rM, OxprM PURAFECT, FN2rM, Y FN3rM (Genencor intemacionallnc.).

[0051J lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes quimicamente modificados o creados genéticamente de protefna están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 Y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SO 705 (WO 95/06720 Y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. sublilis (Oartois et al., 1993, Biochemica et Biophyisica Acta 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64(744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

[0052) Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95114783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

10053) Enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen lIPOLASE TM y lIPOLASE ULTRATM, lIPOZVMETM, Y lIPEXTM (Novozymes AlS).

10054) Cufnasa: el método de la invención se puede llevar a cabo en presencia de cutinasa clasificada en EC 3.1 1.74.

[0055) La cutinasa usada según la invención puede ser de cualquier origen. Preferiblemente las cutinasas son de origen microbiano, en particular de bacteriano, fúngico o de origen de levadura.

10056) las cutinasas son enzimas que son capaces de degradar cutina. En una forma de realización preferida, la cutinasa es derivada de una cepa de Aspergillus, en particular Aspergillus oryzae, una cepa de Alternaria, en particular Alternarla brassiciola, una cepa de Fusarium, en particular Fusarium solani, Fusarium solani pisi, Fusariurn roseurn culmorurn, o Fusarium roseum sambucium, una cepa de Helminthosporum, en particular Helminthosporum sativum, una cepa de Humicola, en particular Humicola insolens, una cepa de Pseudomonas, en particular Pseudomonas mendocina, o Pseudomonas putida, una cepa de Rhizoctonia, en particular Rhizoctonia solani, una cepa de Streptomyces, en particular Streptomyces scabies, o una cepa de Ulocladium, en particular Ulocladium consortiale. En una forma de realización más preferida la cutinasa es derivada de una cepa de Humicola insolens, en particular la cepa Humicola insolens DSM 1800. Cutinasa de Humicola inso/ens es descrita en WO 96/13580. La cutinasa puede ser una variante, tal como una de las variantes descritas en WO 00/34450 y WO 01/92502. Variantes de cutinasa preferida incluyen variantes catalogadas en el ejemplo 2 de WO 01/92S02.

(0057J CuUnasas comerciales preferidas incluyen NQVQZYM 1M 51032 (disponibles de Novozymes AJS, Dinamarca).

[0058) El método de la invención se puede realizar en presencia de fosfolipasa clasificada como EC 3.1.1.4 y/o EC 3.1.1.32. Como se utiliza en este caso, elténnino fosfolipasa es una enzima que tiene actividad hacia fosfolípidos. Fosfolípidos, tales como lecilina o fosfatidilcolina, consisten en glicerol esterificado con dos ácidos grasos en una posición externa (sn-1) y en el medio (sn-2) y esterificados con ácido fosfórico en la tercera posición; el ácido fosfórico, a su vez, se puede esterificar a un amino-alcohol. Fosfolipasas son enzimas que participan en la hidrólisis de fosfolípidos. Diferentes tipos de actividad fosfolipásica pueden ser distinguidos, incluyendo fosfolipasas A1 y A2 que hidrolizan un grupo acilo graso (en las posiciones sn-1 y sn-2, respectivamente) para formar un lisofosfolípido; y lisofosfolipasa (o fosfolipasa B) que puede hidrolizar el grupo acilo graso restante en el lisofosfolipido. Fosfolipasa C y fosfolipasa D (fosfodiesterasas) liberan diacil glicerol o ácido fosfatídico respectivamente.

10059) El término fosfolipasa incluye enzimas con actividad fosfolipásica, por ejemplo, fosfolipasa A (A1 o Al), actividad de fosfolipasa B, actividad de fosfolipasa C o actividad de fosfolipasa D. El término usado "fosfolipasa A" aqu í en relación con una enzima de la invención se destina a cubrir una enzima con actividad de fosfolipasa A, y/o fosfolipasa A2. La actividad de fosfolipsa se puede proporcionar por enzimas con otras actividades también, tal como, por ejemplo, una lipasa con actividad de fosfolipasa. La actividad de fosfolipasa puede, por ejemplo, ser de una lipasa con actividad de fosfolipasa lateral. En otras formas de realización de la invención la actividad enzimática de fosfolipasa esta provista por una enzima con esencialmente sólo actividad de fosfolipasa y donde la actividad enzimática de fosfolipasa no es una actividad lateral.

[0060J La fosfolipasa puede ser de cualquier origen, por ejemplo, de origen animal (tal como, por ejemplo, mamífero), por ejemplo, de páncreas (p. ej., bovino o páncreas porcino), o veneno de serpiente o veneno de abeja. Preferiblemente la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, de hongos filamentosos, levadura o bacterias, tal como el género o especies Aspergillus, por ejemplo, A. niger, Oictiostelium, por ejemplo, O. discoideum; Mucor, por ejemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por ejemplo, N. crassa; Rhizomucor, por ejemplo, R. pusillus; Rhizopus, por ejemplo,

R. arrhizus, R. japoniCus, R. stolonifer, Sclerotinia, por ejemplo, S. libertiana; Trichophyton, por ejemplo, T. rubrum; Whetzelinia , por ejemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por ejemplo, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, por ejemplo, C. freundii; Enterobacter, por ejemplo, E. aerogenes, E. cloacas; Edwardsiel/a, E. tarda; Erwinia, por ejemplo, E. heroico/a; Escherichia, por ejemplo, E. colf; Kiebsiella, por ejemplo, K. pneumoniae; Proteus, por ejemplo, P. vulgaris; Providencia, por ejemplo, P. stuartif, Salmonella, por ejemplo, S. typhimurium; Serratia, por ejemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por ejemplo, S. flexneri; Streptomyces, por ejemplo, S. violeceoruber, Yersinia, por ejemplo, Y. enterocolitica. Asr, la fosfolipasa puede ser fúngica, por ejemplo, de la clase Pyrenomycetes, tal como el género Fusarium, tal como una cepa de F. culmorum, F. heterosporom, F. so/ani, o una cepa de F. oxysporum. La fosfolipasa también puede ser de una cepa de hongo filamentoso en el género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus awamori, Aspsrgillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

10061J Fosfolipasas preferidas son derivadas de una cepa de Humicola, especialmente Humicola lanuginosa. La fosfolipasa puede ser una variante, tal como una de las variantes descritas en WO 00/32758. Variantes de fosfolipasa preferida incluyen variantes catalogadas en el Ejemplo 5 de WQ 00/32758. En otra forma de realización preferida la fosfolipasa es una descrita en WO 04f111216, especialmente las variantes catalogadas en la tabla en el Ejemplo 1.

10062J En otra forma de realización preferida la fosfolipasa es derivada de una cepa de Fusarium, especialmente Fusarium oxysporum. La fosfolipasa puede ser la concernida en WO 981026057 visualizada en SEC ID n.o: 2 derivada de Fusarium oxysporum DSM 2672, o variantes de las mismas.

10063) En una forma de realización preferida de la invención la fosfolipasa es una fosfolipasa A1(EC. 3.1.1.32). En otra fOOlla de realización preferida de la invención la fosfolipasa es una fosfolipasa Al (EC.3.1.1.4.).

[0064) Ejemplos de fosfolipasas comerciales incluyen LECITASETM y LECITASE1M ULTRA, YIELSMAX, o lIPQPAN F (disponibles de Novozymes AlS, Dinamarca).

10065) Amilasas: amilasas adecuadas (beta y/o alfa) incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes qulmicamente modificados o creados genéticamente de protelna están incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, alfaamilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839, o las cepas de especie Bacillus descritas en WQ 95/026397 o WQ 00/060060.

[0066) Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WQ 94102597, WQ 94/18314, WQ 96/23873, WQ 97/43424, WQ 01/066712, WO 021010355, WO 021031124 Y WO 2006/002643.

[0067) Amilasas disponibles comercialmente son DURAMYL 1M, TERMAMYL ni, ULTRA TM de TERMAMYL, NAT ALASE TM, STAINZYME1M , STAINZYME ULTRATM , FUNGAMYLTM Y BANTM (Novozymes AlS), RAPIDASE TM y PURASTARTM (de Genencor internacional lnc.).

[0068) Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fúngico o bacteriano. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína están incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas del genéro Bacil/us, Pseudomonas, Humico/a, Fusarium, Thie/avia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humico/a inso/ens, Thie/avia terrestris, Myce/iophthora thermophi/a, y Fusarium oxysporom descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691 ,178, US 5,776,757, WO 89109259, WO 961029397, y WO 981012307.

[0069) Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas con benefICios de cuidado de color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP O 495 257, EP O 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en WQ 94/07998, EP O 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WQ 95/24471 , WO 98/12307 Y WQ 19991001544.

10070J Celulasas disponibles comercialmente incluyen CELlUZVMETM, CElLUCLASTTM, CAREZVMETM, ENOQLASETM. RENQZYMETM (Novozymes AlS), CLAZINASE TM y PURAOAX HATM, ACCELERASETM 1000 (Genencor intemacionallnc.), y KAC-500(B) TM (Kao Corporation).

[0071 J Peroxidasasloxidasas: peroxidasasloxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, fúngico o bacteriano. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WQ 95/10602, y WO 98/15257.

¡0072J Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme TM y Novozym TM 51004 (Novozymes AlS).

¡0073J Pectato liasas (también llamadas poligalacturonato liasas): ejemplos de pectato liasas incluyen pectato liasas Que han sido clonadas de distintos géneros bacterianos tal como Erwinia, Pseudomonas, K/ebsiella y Xanthomonas, al igual que de Bacil/us subtilis (Nasser et al., 1993, FEBS Letts. 335:319-326) y Bacillus sp. YA-14 (Kim et al., 1994, Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949). La purificación de pectato liasas con actividad máxima en el rango de pH de 8-10 producidas por Bacil/us pumilus (Oave and Vaughn, 1971, J. Bacteriol. 108: 166-174), B. po/ymyxa (Nagel and Vaughn, 1961, Arch. Biochem. Biophys. 93: 344-352), B. stearothermophilus (Karbassi and Vaughn, 1980, Can. J. Microbiol. 26: 377-384), Bacil/us sp_ (Hasegawa and Nagel, 1966, J. Food Sci. 31: 838-845) y Bacillus sp. RK9 (Kelly and Fogarty, 1978, Can. J. Microbiol. 24: 1164-1172) también ha sido descrita. Cualquiera de los anteriores, al igual que cationes bivalentes independientes y/o pectato liasas termoestables, se pueden utilizar al practicar la invención. En formas de realización preferidas, la pectato liasa comprende la secuencia de aminoácidos de una pectato liasa descrita en el Heffron et al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interac!. 8: 331-334 and Henrissat et al., 1995, Plant Physiol. 107: 963-976. Pectato liasas En concretas contemplado son descritas en WO 99/27083 y WO 99/27084. Otras pectato liasas concretas contempladas derivadas de Bacil/us /icheniformis están descritas como SEC 10 n.o: 2 en la patente EE.UU. n.o 6,284,524 (el cual documento es por la presente incorporado por referencia). Variantes de pectato liasa específicamente contempladas están descritas en WO 021006442, especialmente las variantes descritas en los ejemplos en WO 021006442.

[0074) Ejemplos de pectato liasas alcalinas disponibles comercialmente incluyen BIQPREp TM y L de SCQURZYME TM de Novozymes AlS, Dinamarca.

10075) Mananasa: ejemplos de mananasas (EC 3.2.1.78) incluyen mananasas de origen fúngico y bacteriano. En una forma de realización espeCifica la mananasa es derivada de una cepa del género de hongo filamentoso Aspergillus, preferiblemente Aspergillus niger o Aspergillus acu/eatus (WO 94/25576). WO 93/24622 divulga una mananasa aislada de Trichoderma reesei. Mananasas también han sido aisladas de diferentes bacterias, incluyendo organismos de Bacil/us. Por ejemplo, Talbot et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(11): 3505·3510 describe una beta mananasa derivada de Bacillus stearotermofilus. Mendoza el al., 1994, Wond J. Microbiol. Biotech. 10(5): 551-555 describe una beta mananasa derivada de Bacillus subtilis. JP-A-03047076 divulga una beta mananasa derivada de Bacillus sp. JP-A-63056289 describe la producción de una beta mananasa alcalina termoestable. JP-A·63036775 se refiere al microorganismo de Bacillus FERM P8856 que produce beta mananasa y beta manosidasa. JP-A-OB051975 divulga beta mananasas alcalinas a partir de Bacillus alcalofilico sp. AM-001. Una mananasa purificada de Bacillus amy/oliquefaciens se describe en WO 97111164. WO 91118974 describe una hemicelulasa tal como una glucanasa, xilanasa o mananasa activa. Están contempladas las mananasas alcalinas de familia 5 y 26 derivadas de Bacillus agaradhaerens, Bacillus Iicheniformis, Bacillus halodurans, Bacil/us c/ausii, Bacillus sp. , y Humico/a inso/ens descrita en WQ 99/64619. Están especialmente contempladas las mananasas de Bacillus sp. concernidas en los ejemplos en WO 99164619.

¡0076) Ejemplos de mananasas d¡sponibles comercialmente inCluyen MANNAWAy TM disponible de Novozymes A/S Dinamarca.

Materiales y metodos

[0077) Productos químicos usados como tampones y reactivos fueron productos comerciales de, al menos, calidad reactiva. Caldo de recuento en placa (Difco 275120)

5 Agar de MacConkey ($mith River 8iologicals, Ferrum, VA cat#11-00380) Caldo Luria (Difco 241420) Placas de agar de Standard Methods (placas SMA) (Smith River 8iologicals, Fel'TlJm, VA cat# 11-00450)

Cepas de bacterias:

[0078)

-: Mezcla de bacillus (688): mezcla de seis Bacillus spp. cepas consistiendo en las siguientes cepas depositadas: NRRL# 850014 (30%), 8-50015 (30%), 8-50016 (10%), 8-50017 (10%), 8-50018 (10%), 8-50019 (10%). La proporción real entre las 15 cepas en la mezcla 6BB se indica en paréntesis (x %).

-: Pseudomonas aeruginosa: la cepa Pseudomonas aeruginosa usada en todos ejemplos equipada con un plásmido que expresa una proteína fluorescente verde fue constitutivamente construida como se describe por Nivens et al., 2001, J. Bacteriol. 183: 1047-1057.

-: Pseudomonas montelli (ATCC 700412) -Psaudomonas putida (ATCC 49451) 25 -Vibrio halVayi (ATCC 25919)

• Vibrio algillolyticus (ATCC 17749) -Vibrio fisherii (MJ-1): cepa tipo salvaje

Depósito de Material biológico [0079] El material biológico ha sido depositado según las condiciones del tratado de Budapest en 35 -American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20108, EE. UU. y -Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL) Nalional Center for Agricultural Utilization Research 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, EE. UU. Las cepas de bacterias recibieron la siguiente identificación #:

continuación

Identificación Numero de acceso Fecha de de ósito 8acillus umilus NRRL B-50016 14 Marzo 2007

[0080) Las cepas han sido depositadas bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estaré disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente para uno autorizado para ello determinado por el comisiario de patentes y marcas registradas bajo 37 CFR. §1,14 Y 35 U.S.C. §122. Los depósitos representan cultivos puros. Los depOsitos están disponibles según sea necesario por leyes patentes extranjeras en países donde equivalentes de la solicitud de sujeto o su descendiente son solicitadas. No obstante, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en menoscabo del derecho resultante de las patentes concedido por acción gobernativa.

¡0081 JLas cepas de bacterias depositadas en ATTC son derivadas de cepas de bacterias de origen natural aislado. Todas las cepas fueron recogidas en el Estados Unidos en 2005.

[0082) Para las cepas de bacterias depositadas en NRRL dos fueron recogidas de suciedad en Estados Unidos (depositado como NRRL 8-50017 Y NRRL 8-50018) Y cuatro vinieron de nuestras colecciones de cultivo. A nuestro leal saber y entender NRRL 8-50014 es el mismo que ATCC # 23842 NRRL 8-50015 es el mismo que ATCC # 21415 NRRL 8-50016 es el mismo que NRRL b-4064 Y NRRL 8-50019 = NRRL 83254).

10083) Las cepas pueden consistir en esporas de bacterias latentes y/o bacterias viables.

Equipamiento:

\0084J Lector de placa de microtitulación cinética fluorescente (BioTek sinergia HT-I) Recipiente de policarbonato (Biosurfaces Technology, USA) Probeta de porcelana (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta, Canada) Probeta de boca ancha (Fishercat#NC9421998, Pittsburg, PA, USA)

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Proliferación planctónica de Pseudomonas en presencia de mezcla de Bacillus (6BB) · Placa de Microtitulación Fluorescente (FMP)

¡0085) Los 96 pocillos de una placa de microtitulación fueron rellenados con 200 microL de caldo de recuento en placa (Difco DF0751.17-2) e inoculados con una cepa de Pseudomonas aernginosa equipada con un plásmido que expresa una proteína verde fluorescente constitutivamente. Una mezcla de seis Bacillus spp. (6BB) se añadió a los pocillos. La dosis inicial de Pseudomonas fue o bien 2,4xl08 o bien 4,8xl0s ufc::JmL mientras que la dosis de Bacillus spp. fue 6,8x106 a 1,Ox107 ufclmL dando como resultado proporciones Pseudomonas: Bacillus de 24:1 y 70:1. Las placas de microtitulación fueron monitorizadas con un lector de placa de microtitulación cinética fluorescente (8ioTek Synergy HT·I) con incubación a 21 "C y lecturas fluorescentes a 485120 nm excitación, 528/20 nm emisión, cada 20 minutos durante 43 horas. Las curvas cinéticas de fluorescencia resultantes mostraron una supresión de la fluorescencia gfp dependiente de la dosis de Bacillus (es decir, supresión de población de Pseudomonas) (Fig. 1).

Ejemplo 2

Reducida formación de biopelicula de Pseudomonas y prol"feración planctónica en la presencia de mezcla de Bacillus . probeta + Biocontrol probeta (TTCBCl

¡0086) Un recipiente de policarbonato (8iosurfaces Technology) con tres probetas de porcelana (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta) fue insertado en una probeta de boca ancha (Fisher cat#NC9421998) y 50 mL caldo de recuento en placa (Difco DF0751.17-2) hecho según instrucciones de marcador fueron añadidos y sometidos a autoclave. Los tubos fueron inoculados oon una mezcla de esporas de Bacillus e incubados a 28"C oon agitación moderada durante toda la noche permitiendo así la germinación. Dosis inicial de esporas de Bacillus en el rango de 2,6x102 a 7,8x105ufc::JmL.

[0087) El siguiente dla, una cepa de Pseudomonas aeroginosa con expresión de gfp se añadió a los tubos a una concentración de 70 ufcJmL dando como resultado proporciones Pseudomonas:Bacillus de inóculo inicial que varían de 1:3,5 a 1:10000. Después de los periodos de incubación adicionales de 24 y 48 horas, se tomaron muestras de los tubos de modo destructivo rascando cada probeta (células de biopelícula) en el suero salino tamponado con fosfato, homogenizando la suspensión, luego diluyendo y colocando en placas en agan de MacConkey (Difco DF0075-17-1) para enumerar sólo células Pseudomonas. El caldo en los tubos (células planctónicas) fue también muestreado, diluido y colocado en placas. El recuento de Pseudomonas en presencia de Bacillus spp. fue comparado con controles negativos sin Bacillus spp. presente y se apreció que el tratamiento con Bacillus spp. tuvo como resultado una reducción significativa y aproximadamente

5 dependiente de la dosis de poblaciones de Pseudomonas en los estados de biopelicula (Fig. 2) Y planctónicos (Fig. 3).

Ejemplo 3

Reducida fonnación de biopelícula de Pseudomonas y prorferación planctónica en la presencia de aislados de Bacillus 10 probeta + Biocontrol de probela (TTCBCl

¡0088J Un recipiente de policarbonato (Biosurfaces Technology) con tres probetas de porcelana (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta) fue insertado en una probeta de boca ancha (Fisher cat#NC942199S) y 50 mL caldo de recuento en placa (Difco DF0751-17-2) hecho segun instrucciones de marcador fueron añadidos y sometido a autoclave. Cada tubo

15 fue inoculado con un cultivo celular vegetativo durante toda la noche de un candidato individual Bacillus y un durante toda la noche con un cultivo de Pseudomonas aeruginosa equipado con un plásmido de gfp. Los tubos fueron incubados a 2SoC con agitación moderada. La dosis inicial de células de Bacillus estaba en el rango de 1,Ox103 a 8,2x105 ufc/mL y la dosis inicial de Pseudomonas fue aproximadamente 1x103 a 1x105. La proporción de Pseudomonas a Bacillus estaba en el rango de1 : 2a1 :147.

20 [0089) A puntos en el tiempo de 24 y 48 horas en la incubación, se tomaron muestras de los tubos de modo destructivo raspando cada probeta (células de biopelícula) en el suero salino tamponado con fosfato, homogenizado de la suspenSión, luego diluyendo y colocando en placas en agan de MacConkey (Difco DFOO75-17-1) para recontar sólo células Pseudomonas. El caldo en los tubos (células planclónicas) fue también muestreado, diluido y colocado en placas. El

25 recuento de Pseudomonas en presencia de Bacillus spp. fue comparado con controles negativos sin Bacillus spp. presente y el 109 del control de Pseudomonas para cada candidato Bacillus fue calculado a tiempos 24 y 48 horas para células adheridas y planctónicas.

30 Ejemplo 4

Reducida fonnación de biopelícula de E. colí y proliferación planctónica en presencia de aislados de Bacillus -probeta + Biocontrol de probeta fTTCBCl

35 [0090J Un recipiente de policarbonato (Biosurfaces Technology) con tres probetas de porcelana fue insertado en una probeta de boca ancha (Fisher ca1#NC9421998) y 50 mL caldo de recuento en placa (Difco DF0751-17-2) hecho segun las instrucciones de marcador fue añadido y sometido a autoclave. Cada tubo fue inoculado con un cultivo celular vegetativo durante toda la noche de un candidato Bacillus individual y con un cultivo de E. coli durante toda la noche. Los tubos fueron incubados a 2SoC con agitación moderada. La dosis inicial de células de Bacitlus estaba en el rango de 1 ,Ox103 a S,2x105

40 ufc/mL y la dosis inicial de E. coli estaba en el rango de 1x103 a 1x105. Las proporciones de E. coli respecto a Bacillus variaron de 1: 0.6 a 1 :32.

[0091 ) A puntos en el tiempo a 24 y 48 horas en incubación , se tomaron muestras de los tubos de modo destructivo raspando cada probeta (células de biopelícula) en el suero salino tamponado con fosfato, hom0genizando de la suspensión,

45 luego diluyendo y colocando en placas en agan de MacConkey (Difco DF0075-17-1) para recontar sólo células de E. coli. El caldo en los tubos (células planctónicas) fue también muestreado, diluido y colocado en placas. El recuento de E. coli en presencia de Bacillus spp. fue comparado con controles negativos sin Bacillus spp. presente y el 109 control de E. coli para cada candidato Bacillus fue calculado a tiempos 24 y 48 horas para células adheridas y planctónicas.

Log control
Log control
Log control
Log control

Ce a: P:B "' rción 24 horas lanctónico 24 horas adherido 48 horas lanctónico 48 hora adherido

PTA-7544: 27 44 52 >9 >9

PTA-7790: 21 ,0 5,2 6,3 >9 >9

PTA-7791: 2,8 2,5 2,1 7,3 4,2

PTA-7792: 2,3 00 06 0,0 0,0

PTA-7549: 08 52 68 97 65

PTA-7542: 5,7 5,1 4,7 >9 5,4

PTA-754S: 17,0 5,1 4,9 >9 >9

NRRL 8-50017: 0,6 3,7 4,1 8,7 7,4

PTA-7546: 32,4 40 39 9,7 7,2

Ejemplo 5

Zona de inhibición de E. coli en Placa Petri

[0092) Candidalos de 8acillus fueron crecidos en el caldo de recuento en Pc1aca duranle 18 a 24 horas dando como resultado appx 107 a 108 ufc/ml. E. coli crecido de 18 a 24 horas (appx 108 a 10 o cfu .mL) fue estriado para formar un tamiz en la supeñteie de placas de agar Standard Methods (placas SMA) Smith River Biologicals, Ferrum, VA) y cuatro agujeros de 5 mm fueron perlorados en el agar con un tubo de acero inoxidable estéril. 50 microL de cada cultivo de liquido de 8acillus fue

10 entregado en los agujeros (1 cepa por agujero) y la placa fue incubada durante 18 a 48 horas a 3S"C, lado de agar abajo. El tamiz de E. coli inhibido en la proximidad a un agujero fue marcado como biocontrol positivo para el candidato Bacillus. la zona de inhibición fue medida en milfmetros (mm) para permitir la evaluación semicuantitativa de control. Inhibición discernible >1 mm fue marcada como un positivo.

i

I NR:L 8-'0017

-

+ + +

~

+

Ejemplo 6

Zona de inhibición de Pseudo monas aeruginosa en Placa Petri

20 10093J Candidatos de 8acillus fueron crecidos en el caldo de recuento en placa durante 18 a 24 horas dando como resultado appx 107 a 108 ufc/mL cultivo. Pseudomonas aeruginosa fue crecida de 18 a 24 horas (appx 108 a 1010 ufc/mL) y estriada para formar un tamiz en la supeñteie de placas de agar Standard Methods (Srnith River Biologica!s, Ferrum, VA) y cuatro agujeros de 5 mm fueron perlorados en el agar con un tubo de acero inoxidable estéril. 50 miCloL de cada cultivo de líquido de Bacillus fueron entregados en los agujeros (1 cepa por agujero) y la placa fue incubada durante 18 a 48 horas a 3S"C,

25 lado de agar abajo. El tamiz de Pseudomonas inhibido en la proximidad a un agujero fue marcado como biocontrol pOSitivo para el Bacillus candidato. l a zona de inhibición fue también medida en micrómetros (mm) para permitir la evaluación semlcuantitativa del control. Inhibición discernible.> 0,5 mm fue marcada como un positivo.

Ce: a Inhibición de Pseudomonas aeru inosa

continuación

NRRL B-S0016: -

NRR L B-S0017: +

PTA-7542: +

PTA-754S +

PTA-7791 +

Ejemplo 7

Zona de inhibición de Psuedomonas montelli y putida en Placa Petri

[0094) 8acillus NRRL candidato 8-S0014 fue crecido en el caldo de recuento en placa durante 18 a 24 horas dando como resultado appx 107 a 108 ufclmL cultivo. Pseudomonas montefli (ATCC 700412) y Ps. putida (ATCC 494S1) crecido 18 a 24 horas (app)( 106 a 1010 ufclmL cultivo) fueron estriados para formar un tamiz en la superficie de placas de agar Standard Methods y cuatro agujeros de S mm fueron perforados en el agar con un tubo de acero inoxidable estéril. SO microL de

10 cultivo de liquido de Bacillus fueron entregados en los agujeros y la placa fue incubada durante 18 a 48 horas a 3SoC, lado de agar abajo. El tamiz de Pseudomonas inhibido en la proximidad a un agujero fue marcado como biocontrol positivo para el candidato Bacillus. La zona de inhibición fue también medida en milímetros (mm) para permitir la evaluación semicuantitativa de control.

15 ¡009S) Inhibición discernible> 1 mm fue marcada como un positivo.

Ce a Inhibición de Pseudomonas monteilli Inhibición de Pseudomonas utida NRRL 8-S0014 + +

Ejemplo 8

20 Inhibición de detección de quórum

¡0096) Serratia rubídaea (ATCC 27S93) fue usada como bacteria indicadora ya que su pigmentación depende de la ruta de

detección de quórum de tacto. Compuestos de detección de quórum permiten que las bacterias "se comuniquen" y afectan a

fenotipos tales como pigmentación, motilidad, patogenicidad y foonación de biopelicula, as! la inhibición de detección de

25 quórum es un modo de acción para el control de biopelícula .

[0097) Candidatos de Bacillus fueron crecidos en el caldo de recuento de placa , de 18 a 24 horas, 3SoC, a una densidad de aprox. 107 ufcJml. Los bacilos fueron manchados (10 microL) sobre una placa de agar Standard Methods (Smith River 8iologicals, Ferrum, VA) e incubados durante 18 a 24 horas a 26"C, después del cual tiempo, colonias fueron visibles. El

30 cultivo de Serratía (S microL) (Caldo Luria, 18 a 24 horas, 26 "C, aprox. 107 ufc/mL) se añadió a S mL de agar LB fundido 0,5% (Caldo Luna 30,5 gil Y 0,5% agar noble), mezclado bien, y vertido sobre las placas con colonias candidatas de 8acillus maduro. Después de que el agar se colocara, la placa fue incubada de 18 a 24 horas a 26"C. Las zonas de pigmentación inhibida pero crecimiento de Serratia no inhibido per se fueron marcadas positivo para aSI y medidas a través de su diámetro completo para resultados semicuantitativos.

(continuación)

PTA-7790

PTA-7791 40 14

Ejemplo 9

Control de 8iopelicula de Pseudomonas y proliferación celular Planctónica en presencia de candidato Bacillus en reactores de biopelícula CDC

10098] Reactores de biopelícula CDC (Biosurfaces Technologies, Bozeman, MT, CaI#CBR90-2) con probetas de porcelana (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta) fueron rellenados con 400 mi caldo de recuento en placa y sometidos a autoclave. Esporas PTA-7546 fueron adicionadas a los medios enfriados de dos reactores (dosis inicial =4,5xl05 ufc/mL en el reactor) para pennitir un tiempo de pregenninación de 24 horas con incubación a temperatura 10 ambiente, la agitación se establece a 60 r.p.m. antes del ataque de Pseudomonas. Dos reactores adicionales fueron tratados como controles sin inoculación de Bscil/us. Pseudomonas aeruginosa fu e crecida durante toda la noche en el caldo de recuento en placa y 20 microL de una dilución 1:100 de cultivo de Pseudomonas fueron luego añadidos a los cuatro reactores (3590 ufe/mL) y la proporción de co-cultivo resultante fue 1 Pseudomonas:127 Bacilli. Después de 24 horas de crecimiento, la redosificación del medio inició a razón de 3 mLlmin caldo de recuento en placa diluido (concentración 1 gil).

15 La agitación fue establecida a 60 r.p.m.

10099] Un día más tarde (dos días después del inicio del co-cultivo), se tomaron muestras líquidas de cada reactor, colocadas en placas y diluidas en agar Maconkey e incubadas aprox. 18 horas a 35°C para obtener un recuento Gram negativo (=Pseudomonas=organismo no deseado). De forma similar, probetas fueron raspadas con bastoncitos de aplicooor

20 de madera estériles y el raspado fue suspendido en el tampón de fosfato estéril, homogeneizado, y colocado en placas y diluido en agan MacConkey que fue incubado durante 18 horas a 35°C. la comparación del recuento de Pseudomonas en reactores tratados vs. no tratados pennitió el cálculo de "Iog control en reactores de Bacillus".

Condición: Reactor tratado A t Reactor tratado B t Media de reactores tratados t Reactor no tratado A t Reactor no tratado B t Media reactores tratados t de 00 Media de I ~Og control

Biopelícula (rascada de probetas): 2,6xl02 h 5,7xl02 h 4,2xl02 h 6,7xl06 h 1 ,4xl06 h 4, lxl06 h 3,9

Muestras . ~'anct~~ica [líquida: l,4xl04h 1,lxl04 h 1,3xl04 h 2,lxl07 h 6,4xl07 h 4,3xl07 h 3,5

recuento ufclmL o ufcl robeta

25 Ejemplo 10

Control de biopelicula de Pseudomonas y prorferación celular planctónica en Presencia de candidato Bacillus en reactores de biopelícula CDC con redosificación de espora de Bacillus

30 ¡Ol00J Reactores de biopelícula CDC (Biosurfaces TechnOlogies, Bozeman, MT, CaI#CBR90-2) con probeta de porcelana (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta) fueron rellenados con 400 mL caldo de recuento en placa (resistencia completa) y sometidos a autoclave. Esporas de PTA-7545 (prueba 1) o NRRL 8-50017 (prueba 2) fueron adicionadas a los medios enfriados de dos reactores para permitir un tiempo de pregenninación de 24 hora a temperatura ambiente con 60 r.p.m. de agitación, antes el ataque de Pseudomonas (dosis de Bacillus inicial =1 ,3xl05 ufe/mL en la

35 prueba de reactor 1 ufc/mL prueba 2). Dos reactores adicionales fueron tratados como controles sin inoculación de Bacillus. Pseudomonas aeruginosa fue crecida durante toda la noche en el caldo de recuento en placa y 20 microL de una dilución de

1: 100 del cultivo de Pseudomonas se añadió a los cuatro reactores (127 ufe/mL prueba 1 lxl05 ufe/mL prueba 2) y la proporción de co-cultivo resultante fue 1 Pseudomonas:104 Bacilli para la prueba 1 y 1:0,1 para la prueba 2. Después de 24 horas de crecimiento, la red osificación del medio inició a razón de 90 mV15 min de caldo de recuento en placa diluido

40 (concentración 1 gIL) durante 15 min cada hora. Para los reactores tratados, esporas de Bacillus fueron dosificadas a razón de 1,5 mi concentrado de espora sobre el curso de 2,7 horas para una concentración final de 1,1x108 ufc de esporas de Bacillusrdia para la prueba 1 y 1,8x107 ufc de esporas de Bacillus/dia para la prueba 2. la agitación fue establecida a 60

r.p.m.

45 [0101J Un día más tarde (dos días después del inicio del co-cultivo) se tomaron muestras liquidas de cada reactor, se colocaron en placas y se diluyeron en agar Maconkey y se incubaron aprox. 18 horas a 35°C para obtener recuento Gram negativo (organismo indeseable). De fonna similar, probetas fueron raspadas con bastoncitos de aplicador de madera estériles y el raspado fue suspendido en el tampOn de fosfato estéril, colocado en placas y diluido y homogeneizado en agao de MacConkey que fue incubado durante 18 horas a 35°C. l a comparación del recuento de Pseudomonas en reactores

50 tratados vs. no tratados permitió el cálculo de "Iog control en reactores Bacillus".

Condición: PTA-7545 Lag control medio NRRL 8-50017 Lag control medio

8io lícula rascada de robetas Muestras planctónicas liquidas: 45 4,4 29 3,5

Ejemplo 11

Zona de inhibición de Vibrio harveyi en Placa Petri

10102J Candidatos de Bacillus fueron crecidos en el caldo nutritivo (3 gil extracto de carne bovina, 5 gIL peptona) a 35°C durante 18-24 horas. V. harveií ATCC 25919 fue crecido en el caldo nutritivo con 1,5% NaCI adicionado a 28°C durante 1824 horas. Agar nutritivo (1 .5% agar) con 1,5% NaCI fue sometido a autoclave en alícuotas de 25 mL y 250 microL durante toda la noche. Cultivo de Vibrio se añadió a cada alicuota de agar fundido dando como resultado aproximadamente 1 xl06

10 ufc/mL de Vibrio en el agar. DespuéS de que el agar solidificara , 4 agujeros fueron perforados en cada placa utilizando una pieza de tuberfa de acero inoxidable esterilizada. 50 microL de cada cultivo de Bacillus durante toda la noche fueron transferidos a cada pocillo. Las placas fueron incubadas oon el lado de agar abajo a 28"C durante 18-24 horas. las zonas de tamiz de Vibrio inhibido fueron medidas. Inhibición discernible> 0.5 mm fue marcada como un positivo.

Cepa NRRL '·SOO ffij: + + + +

Ejemplo 12

Zona de inhibición de Vibrio alginoMicus en Placa Petri

20 10103J Candidatos de Bacillus fueron crecidos en el caldo nutritivo (3 gfl extracto carne bovina, 5 gIL peptona) a 35"C durante 18-24 horas. V. alginolylicus ATCC 17749 fue crecido en el caldo nutritivo con 1,5% NaCI adicionado a 28"C durante 18-24 horas. Agar nutritivo (1 ,5% agar) con 1,5% NaCI fue sometido a autoclave en alícuotas de 25 mL y 250 microL de cultivo de Vibrio durante toda la noche se añadió a cada alícuota de agar fundido dando como resultado aproximadamente lx106 ufcJmL de Vibrio en el agar. Después de Que el agar solidificara, 4 agujeros fueron perforadOS en

25 cada placa utilizando una pieza de tuberfa de acero inoxidable esterilizada. 50 microL de cada cultivo de Bacillus durante toda la noche a cada pocillo. Las placas fueron incubadas con el lado de agar abajo a 28"C durante 18-24 horas. Las zonas de tamiz de Vibrio inhibido fueron medidas. Inhibición discernible> 0.5 mm fue marcada como un pOSitivo.

Cepa NRRL 8-50015 NRRl8-50016 NRRL 8-50017 PTA-7541 PTA-7592: Vibrio alginofylicus + + + + +

(continuación)

PTA-7542: +

PTA-7543: +

PTA-7544: +

PTA-7545 PTA-7546: 16 + +

PTA-7747 PTA-7748 PTA-7749 PTA-7793 PTA-7790 PTA-7791: + + + + + +

Ejemplo 13

Zona de inhibición de Vibrio flscherii en Placa Petri

10104) Candidatos de Bacillus fueron crecidos en el caldo nutritivo (3 gil extracto de carne bovina, 5 giL peptona) a 35°C durante 18-24 horas. V. fisherii fue crecido en el caldo nutritivo con 1,5% NaCI adicionado a 28°C durante 18-24 horas. Agar nutritivo (1 ,5% agar) con 1,5% NaCI fue sometido a autoclave en alicuotas de 25 mL y 250 microL de cultivo de Vibrio durante toda la noche se añadieron a cada alicuota de agar fundido dando como resultado aproximadamente 1x106 ufcJmL

10 Vibrio en el agar. Después de que el agar solidificara, 4 agujeros fueron perforados en cada placa utilizando una pieza de tuberla de acero inoxidable esterilizada. 50 microL de cada cultivo de Bacillus durante toda la noche fue transferido a cada pocillo.Las placas fueron incubadas con el lado de agar abajo a 28°C durante 18-24 horas. Las zonas de tamiz de Vibrio inhibido fueron medidas. Inhibición discemible > 0.5 mm fue marcada como un positivo.

Cepa PTA-7543 PTA-754S PTA-7546 PTA-7547 PTA-7548 PTA-7793 PTA-7790 PTA-7791: Vibrio fischerii + + + + + + + +

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método para evitar o reducir la formación de biopelícula provocada por microorganismos no deseados en una superficie, que comprende someter dicha superficie a una o más cepas de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en: la cepa con el número de acceso de depósito NRRL B-50017; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7541; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7542; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7543; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7544; la cepa con el número de acceso de depósito PT A-7545; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7546; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7549; la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7791;

la cepa con el número de acceso de depósito PTA-7792; la cepa con el número de acceso de depósito PT A-7793 o una mezcla de dos o más de las cepas.
2.

Método según la reivindicación 1, donde la superficie es una superficie dura, preferiblemente hecha de uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en metal, plásticos, caucho, cartón, vidrio, madera, papel, hormigón, roca, mármol, yeso, y materiales cerámicos, tales como porcelanas; o una superficie blanda, preferiblemente hecha de uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en fibras, por ejemplo, madejas, tejidos, fibras vegetales; lana de roca, pelo; piel; materiales querallnosos; y órganos intemos, por ejemplo, pulmones; o una superficie porosa.
3.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la superficie dura es la taza de un inodoro; depósito de agua del inodoro; torre de enfriamiento; planta de tratamiento de agua; tanque de agua; lecherla, planta de procesamiento de alimentos; planta de procesos quimicos o farmacéuticos; o dispositivo sanitario.
4.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la formación de biopelícula está provocada por uno o más microorganismos no deseados, preferiblemente bacterias, tales como bacterias patógenas.
5.

Método según la reivindicación 4, donde el microorganismo no deseado, preferiblemente bacterias, causa corrosión, picadura, degradación del material en cuestión; infección; coloración o de otra manera hace que una superficie aparezca estéticamente desagradable.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el método se repite periódicamente.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además someter la superficie a una enzima, preferiblemente una enzima seleccionada del grupo de proteasas, alfa-amilasas, celulasas, lipasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, y mananasas, o mezclas derivadas.
8.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además someter la superfICie a uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en dispersantes, surfactantes, agentes antimicrobianos, y biocidas.
9.

Composición que comprende la cepa de bacterias con el número de acceso de depósito NRRL B-5OO17.
10.

Composición según la reivindicación 9, que comprende además un surfactante.
11 . Composición según la re ivindicación 9 o 10, que comprende además una o más enzimas.
12.

Composición según la reivindicación 11, donde la enzima es seleccionada del grupo que consiste en proteasas, alfaamilasas, celulasas, lipasas, peroxidasasloxidasas, pectato liasas, y mananasas, o mezclas derivadas.
13.

Composición segun cualquiera de las reivindicaciones 9-12, que comprende además uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en dispersantes, estabilizantes, agentes antimicrobianos, fragancias, tintes, y biocidas.

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Tiempo (dlat)

Fig. 2

Fig.31