JP5427041B2 - バイオフィルム形成及びプランクトン様増殖の予防及び低減 - Google Patents
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Description
米国特許第5,242,593号は、単一形態で非固着微小管を循環水へ添加することにより、水循環系における粘液及び/又はフィルム積層を低減させるための方法に関する。
米国特許第5,360,517号は、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)種の細菌を有効な殺菌量を導入することを含んでなる、水性の製紙回路/過程の流れの中で、微生物/細胞叢の増殖を調節する過程を開示する。
米国特許第5,863,882号は、4つの病原性微生物を低減させることができる、殺菌組成物、生きたバチルス胞子、及び界面活性剤を含んでなる、液体の洗浄及び殺菌製剤に関する。
豪州特許第719544号は、非病原性グラム陽性細菌による、水中の病原性細菌の数を制御する方法に関する。
国際公開第2006/031554号は、表面を細菌由来のアルファ−アミラーゼと接触させることにより、表面上のバイオフィルムを予防、除去、低減又は崩壊させる方法を開示する。
第一の態様によれば、本発明は、表面上のバイオフィルム形成の防止及び/又は低減のための方法であって、当該表面を以下の、
受託番号NRRL B−50014を有する菌株、
受託番号NRRL B−50015を有する菌株、
受託番号NRRL B−50016を有する菌株、
受託番号NRRL B−50017を有する菌株、
受託番号NRRL B−50018を有する菌株、
受託番号PTA−7541を有する菌株、
受託番号PTA−7542を有する菌株、
受託番号PTA−7543を有する菌株、
受託番号PTA−7544を有する菌株、
受託番号PTA−7545を有する菌株、
受託番号PTA−7546を有する菌株、
受託番号PTA−7547を有する菌株、
受託番号PTA−7549を有する菌株、
受託番号PTA−7790を有する菌株、
受託番号PTA−7791を有する菌株、
受託番号PTA−7792を有する菌株、
受託番号PTA−7793を有する菌株、又は2以上の当該菌株の混合物、
からなる群から選択される1又は複数の細菌株に晒すことを含んでなる方法に関する。
第一の態様によれば、本発明は、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の防止及び/又は低減のための方法であって、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で以下の、
受託番号NRRL B−50014を有する菌株、
受託番号NRRL B−50015を有する菌株、
受託番号NRRL B−50016を有する菌株、
受託番号NRRL B−50017を有する菌株、
受託番号NRRL B−50018を有する菌株、
受託番号PTA−7541を有する菌株、
受託番号PTA−7542を有する菌株、
受託番号PTA−7543を有する菌株、
受託番号PTA−7544を有する菌株、
受託番号PTA−7545を有する菌株、
受託番号PTA−7546を有する菌株、
受託番号PTA−7547を有する菌株、
受託番号PTA−7549を有する菌株、
受託番号PTA−7790を有する菌株、
受託番号PTA−7791を有する菌株、
受託番号PTA−7792を有する菌株、
受託番号PTA−7793を有する菌株、又は2以上の当該菌株の混合物、
からなる群から選択される1又は複数の細菌株に晒すことを含んでなる方法に関する。
ある実施態様によれば、受託番号PTA−7541を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7542を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7543を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7544を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7545を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7546を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7547を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7549を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7550を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7789を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7790を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7791を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7792を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。ある実施態様によれば、受託番号PTA−7793を有する菌株に、当該(1又は複数の)微生物を水溶液中で晒すことを含んでなる、(1又は複数の)微生物のプランクトン様増殖の予防及び/又は低減のための方法に関する。
本発明の方法に従って使用される細菌株は、上記寄託菌株の1つの培養物であってもよいが、上記の単離された寄託菌株と実質的に同一の特性を有する菌株の培養物であってもよいことは理解されるべきである。好ましい実施態様によれば、前記菌株は寄託菌株又はその子孫の1つである。
本発明の文脈において、「不所望微生物」なる用語は、問題の表面上及び/又は問題の水性環境中、特に家庭又は工業環境中で、負と考えられる効果をもたらし得る微生物を意味する。当該負の効果の例としては、物質の臭気、腐食、孔食、又はその他の分解、感染、汚染又はその他の表面を審美的に不快な外観にすることが挙げられる。不所望微生物にはまた、病原性微生物、特に病原性細菌がある。
別のより好ましい実施態様によれば、前記嫌気性細菌はデスルホビブリオ菌である。別のより好ましい実施態様によれば、前記嫌気性細菌はデスルホビブリオ・デスルフリカンス(Desulfovibrio desulfuricans)である。
本発明はまた、1又は複数の本明細書に記載の寄託細菌株を含んでなる組成物に関する。本発明の組成物は単一の菌株として、又は2以上の菌株の混合物として、本明細書に関与する1又は複数の細菌株を含んでもよいが、他の細菌株及び/又は有効成分を含んでもよい。ある実施態様によれば、当該組成物は、以下に記載の界面活性剤又は1又は複数の他の成分をさらに含む。
界面活性剤は、非イオン性であってもよく、例えば準極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は双性イオン性でもよい。(1又は複数の)界面活性剤は、当該細菌培養物の活性に対して可能な限り低害性である。
界面活性剤は、組成物中に0.01〜60質量%のレベルで存在してよい。
組成物は1又は複数の酵素を含んでもよい。考慮される酵素の例は、「酵素」の節に記載する。
他の成分には、限定するものではないが、分散剤、安定化剤、抗微生物剤、香料、色素、及び殺生物剤がある。
本発明の組成物中には、1又は複数の酵素が存在してよい。特に、考慮される酵素には、プロテアーゼ、アルファ−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びマンナナーゼ、又はその混合物がある。
好適なプロテアーゼには、動物、植物又は微生物由来のものがある。微生物由来が好ましい。化学修飾又はタンパク質改変された変異体が含まれる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例としては、特にバチルス由来のもの、例えばサブチリシン・ノボ(subtilisin Novo)、サブチリシン・カールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、サブチリシン309、サブチリシン147及びサブチリシン168(国際公開第89/06279号に記載)がある。トリプシン様プロテアーゼの例としては、国際公開第89/06270号及び国際公開第94/25583号に記載の、トリプシン及びフサリウムプロテアーゼがある。
好適なリパーゼには細菌又は真菌由来のものがある。化学修飾又はタンパク質改変された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、フミコラ(Humicola)(サーモマイシス(Thermomyce)の異名)由来のリパーゼ、例えば欧州特許第258 068号及び欧州特許第305 216号に記載のH.ラヌギノサ(lanuginosa)(T.ラヌギノサ)由来、又は国際公開第96/13580号に記載のH.インソレンス(insolens)由来、シュードモナスリパーゼ、例えばP.アルカリゲネス(alcaligenes)又はP.シュードアルカリゲネス(pseudoalcaligenes)(欧州特許第218 272号)、P.セピシア(cepacia)(欧州特許第331 376号)、P.スツトゼリ(stutzeri)(英国特許第1,372,034号)、P.フルオレッセンス(fluorescens)、シュードモナス属株SD705(国際公開第95/06720号及び国際公開第96/27002号)、P.ウィスコンシネンシス(wisconsinensis)(国際公開第96/12012号)由来のもの、バチルスリパーゼ、例えばB.サブチリス(subtilis)(Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta 1131: 253-360)、B.ステアロサーモフィルス(stearothermophilus)(特開昭64/744992号)又はB.プミルス(pumilus)(国際公開第91/16422号)由来のものがある。
好ましい市販のリパーゼ酵素には、LIPOLASE(商標)及びLIPOLASE ULTRA(商標)、LIPOZYME(商標)、並びにLIPEX(商標)(ノボザイム社)がある。
本発明の方法は、EC 3.1.1.74に分類されるクチナーゼの存在下で実施してもよい。
本発明により使用されたクチナーゼは、任意の由来のものでよい。好ましいクチナーゼは微生物由来、特に細菌、真菌又は酵母由来のものである。
好ましい市販のクチナーゼには、NOVOZYME(商標)51032(ノボザイム社、デンマークから入手可能)がある。
好適なアミラーゼ(アルファ及び/又はベータ)には、細菌又は真菌由来のものがある。化学修飾又はタンパク質改変された変異体が含まれる。アミラーゼには、例えば、バチルス、例えば英国特許第1,296,839号により詳細に記載されるB.リケニフォルミスの特別種、又は国際公開第95/026397号もしくは国際公開第00/060060号に開示のバチルス種から得られるアルファ−アミラーゼがある。
有用なアミラーゼの例は、国際公開第94/02597号、国際公開第94/18314号、国際公開第96/23873号、国際公開第97/43424号、国際公開第01/066712号、国際公開第02/010355号、国際公開第02/031124号及び国際公開第2006/002643号(これらは全て参照により組み込まれる)に記載の変異体がある。
市販のアミラーゼは、DURAMYL(商標)、TERMAMYL(商標)、TERMAMYL ULTRA(商標)、NATALASE(商標)、STAINZAYME(商標)、STAINZAYME ULTRA(商標)、FUNGAMYL(商標)及びBAN(商標)(ノボザイム社)、RAPIDASE(商標)及びPURASTAR(商標)(ジェネンコア・インターナショナル社から)である。
好適なセルラーゼには、細菌又は真菌由来のものがある。化学修飾又はタンパク質改変された変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコラ属、フサリウム属、チエラビア(Thielavia)属、アクレモニウム(Acremonium)属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号、国際公開第89/09259号、国際公開第96/029397号、及び国際公開第98/012307号に開示の、フミコラ・インソレンス、チエラビア・テレストリス(terrestris)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、及びフサリウム・オキシスポラムから産生された真菌セルラーゼがある。
特に好適なセルラーゼは、色素保護の点で有益である、アルカリ性又は中性セルラーゼである。当該セルラーゼの例は、欧州特許第0 495 257号、欧州特許第0 531 372号、国際公開第96/11262号、国際公開第96/29397号、国際公開第98/08940号に記載のセルラーゼである。他の例は、国際公開第94/07998号、欧州特許第0 531 315号、米国特許第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特許第5,763,254号、国際公開第95/24471号、国際公開第98/12307号及び国際公開第1999/001544号に記載のセルラーゼ変異体である。
市販のセルラーゼには、CELLUZYME(商標)、CELLCLAST(商標)、XAREZYME(商標)、ENDOLASE(商標)、RENOZYME(商標)(ノボザイム社)、CLAZINASE(商標)及びPURADAX HA(商標)、ACCELERASE(商標)1000(ジェネンコア・インターナショナル社)、及びKAC−500(B)(商標)(花王社)がある。
好適なペルオキシダーゼ/オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌由来のものがある。化学修飾又はタンパク質改変された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、コプリナス(Coprinus)由来の、例えばC.シネレウス(C. cinereus)、及び国際公開第93/24618号、国際公開第95/10602号、及び国際公開第98/15257号に記載のその変異体由来のペルオキシダーゼがある。
市販のペルオキシダーゼには、Guardzyme(商標)及びNovozym(商標)51004(ノボザイム社)がある。
ペクチン酸リアーゼの例には、異なる細菌種、例えばエルウィニア(Erwinia)、シュードモナス、クレブシエラ(Klebsiella)及びキサントモナス(Xanthomonas)、並びにバチルスYA−14(Kim et al., 1994, Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949)からクローン化されたペクチン酸リアーゼがある。pH8〜10の範囲で最大活性を有する、バチルス・プミルス(Dave and Vaughn, 1971, J. Bacteriol. 108: 166-174)、B.ポリミキサ(B. polymyxa)(Nagel and Vaughn, 1961, Arch. Biochem. Biophys. 93: 344-352)、B.ステアロセーモフィルス(B. stearothermophilus)(Karbassi and Vaughn, 1980, Can. J. Microbiol. 26: 377-384)、バチルス種(Hasegawa and Nagel, 1966, J. Food Sci. 31: 838-845)及びバチルス種RK9(Kelly and Fogarty, 1978, Can. J. Microbiol. 24: 1164-1172)から産生されたペクチン酸リアーゼの精製も報告されている。任意の上記、及び二価のカチオン誘導性及び/又は熱安定性のペクチン酸リアーゼは、本発明の実施に使用してもよい。好ましい実施態様によれば、ペクチン酸リアーゼは、Heffron et al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interact. 8: 331-334 及び Henrissat et al., 1995, Plant Physiol. 107: 963-976に開示のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を含んでなる。具体的に考慮されるペクチン酸リアーゼは、国際公開第99/27083号及び国際公開第99/27084号に開示される。他の具体的に考慮される、バチルス・リケニフォルミスに由来するペクチン酸リアーゼは、米国特許第6,284,524号中の配列番号2(この書類は参照により本明細書に組み込まれる)で開示されている。具体的に考慮されるペクチン酸リアーゼの変異体は、国際公開第02/006442号に開示され、特に国際公開第02/006442号の実施例(この書類は参照により本明細書に組み込まれる)中に開示の変異体である。
市販のアルカリ性ペクチン酸リアーゼの例は、ノボザイム社(デンマーク)製のBIOPREP(商標)及びSCOURZYME(商標)Lである。
マンナナーゼ(EC 3.2.1.78)の例には、細菌及び真菌由来のマンナナーゼがある。具体的な実施態様によれば、マンナナーゼはアスペルギルス属の糸状真菌類、好ましくはアスペルギルス・ニゲル又はアスペルギルス・アクレアタス(aculeatus)(国際公開第94/25576号)由来のものである。国際公開第93/24622号は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)から単離されたマンナナーゼを開示している。マンナナーゼはまた、複数の細菌、例えばバチルス生物から単離される。例えば、Talbot et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(11): 3505-3510は、バチルス・ステレオサーフィルス(stearothermophilus)由来のベータ−マンナナーゼを報告している。Mendoza et al., 1994, World J. Microbiol. Biotech. 10(5): 551-555はバチルス・サブチリス由来のベータ−マンナナーゼを報告している。特開2003−047076号公報では、バチルス種由来のベータ−マンナナーゼを開示している。特開昭63−056289号公報は、アルカリ性の熱安定なベータ−マンナナーゼの作製について報告している。特開昭63−036775号公報は、ベータ−マンナナーゼ及びベータ−マンノシダーゼを産生する、バチルス微生物FERM P−8856に関する。特開平08−051975号公報は好アルカリ性のバチルス種AM−001由来のアルカリベータ−マンナナーゼを開示している。バチルス・アミロリケファシエンス(amyloliquefaciens)からのマンナナーゼの精製は、国際公開第97/11164号に開示されている。国際公開第91/18974号は、ヘミセルラーゼ、例えばグルカナーゼ、キシラナーゼア又はマンナナーゼの活性について報告している。国際公開第99/64619号に開示の、バチルス・アガラドハエレンス(agaradhaerens)、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ハロデュランス(halodurans)、バチルス・クラウジイ、バチルス種及びフミコラ・インソレンス由来の、アルカリファミリー5及び26マンナナーゼが考慮される。特に、国際公開第99/64619号の実施例(この書類は参照により本明細書に組み込まれる)中に関するバチルス種マンナナーゼが考慮される。
市販のマンナナーゼの例には、ノボザイム社(デンマーク)から入手可能なMANNAWAY(商標)がある。
バッファ及び試薬として使用される化学物質は、少なくとも試薬級(reagent grade)の製品であった。
プレートカウント培地(Plate Count Broth)(Difco 275120)
MacConkey寒天(Smith River Biologicals, Ferrum, VA カタログ番号11-00380)
Luria培地(Luria Broth (Difco 241420)
標準法寒天プレート(Standard Methods agar plates (SMA plates))(Smith River Biologicals, Ferrum, VA カタログ番号 11-00450)
バチルス混合物(6BB):
以下の寄託菌株からなる、6のバチルス種菌株の混合物:NRRL番号B−50014(30%)、B−50015(30%)、B−50016(10%)、B−50017(10%)、B−50018(10%)、B−50019(10%)。6BB混合物における菌株間の実際の比率は、括弧中に示す(x%)。
シュードモナス・エルギノーサ:
緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドを備える全ての実施例において使用されるシュードモナス・エルギノーサ菌株は、Nivens et al., 2001, J. Bacteriol. 183: 1047-1057の記載の通りに構造的に構築された。
シュードモナス・モンテリ(ATCC 700412)
シュードモナス・プチダ(ATCC 49451)
ビブリオ・ハルベイ(ATCC 25919)
ビブリオ・アルギノリティカス(ATCC 17749)
ビブリオ・フィシェリ(MJ−1):野生型菌株
生物物質は、ブダペスト条約の条項に従い、
米国培養細胞系統保存機関(ATCC)(10801 University Blvd., Manassas, VA 20108, USA.)及び
Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL))(National Center for Agricultural Utilization Research 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USA)
に寄託された。
菌株は、休眠細菌胞子及び/又は生細菌からなるものでもよい。
蛍光動力学的マイクロタイタープレートリーダー(Fluorescent kinetic microtiter plate reader)(BioTek Synergy HT-I)
ポリカーボネートホルダー(Polycarbonate holder)(Biosurfaces Technology, USA)
ポーセリンクーポン(Porcelain coupons) (Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta, Canada)
広口試験管(Fisher カタログ番号NC9421998, Pittsburg, PA, USA)
96マイクロタイタープレートのウェルを200マイクロLのプレートカウント培地(Difco DF0751-17-2)で満たし、構造的に緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドを備えるシュードモナス・エルギノーサ菌株を植菌した。6のバチルス種の混合物(6BB)をウェルに添加した。シュードモナスの初回用量は、2.4×108 cfu/mLか4.8×108 cfu/mLのいずれかであり、一方バチルス種は6.8×108 cfu/mL〜1.0×107 cfu/mLであり、シュードモナス:バチルス比率は24:1及び70:1となった。マイクロタイタープレートは、21℃でのインキュベーション及び485/20 nm励起、580/20 nm発光で、20分毎に43時間の蛍光測定(fluorescent reads)の条件で、蛍光動力学的マイクロタイタープレートリーダー(BioTek Synergy HT-I)で追跡する。得られた蛍光動力学的曲線はバチルス用量依存的なgfp蛍光の抑制が観察された(すなわちシュードモナス群の抑制)(図1)。
3つのポーセリンクーポン(Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta)を有するポリカーボネートホルダー(Biosurfaces Technology)を広口試験管(Fisher カタログ番号NC9421998)に挿入し、表示の指示書に従って作製した50 mLのプレートカウント培地(Difco DF0751-17-2)を添加しオートクレーブした。管にバチルス胞子の混合物を植菌し、穏やかに攪拌させながら28℃で一晩インキュベートし、発芽させた。バチルス胞子の初回用量は、2.6×102〜7.8×105 cfu/mLの範囲であった。
3つのポーセリンクーポン(Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta)を有するポリカーボネートホルダー(Biosurfaces Technology)を広口試験管(Fisher カタログ番号NC9421998)に挿入し、表示の指示書に従って作製した50 mLのプレートカウント培地(Difco DF0751-17-2)を添加しオートクレーブした。各管に、個々の対象バチルスの栄養細胞一晩培養物、及びgfpプラスミドを備えるシュードモナス・エルギノーサの一晩培養物を植菌した。管を、穏やかに攪拌させながら28℃で一晩インキュベートした。バチルス細胞の初回用量は、1×103〜8.2×105 cfu/mLの範囲であり、シュードモナスの初回用量はおよそ1×103〜1×105 であった。バチルスに対するシュードモナスの比率は1:2〜1:147の範囲であった。
3つのポーセリンクーポン(Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta)を有するポリカーボネートホルダー(Biosurfaces Technology)を広口試験管(Fisher カタログ番号NC9421998)に挿入し、表示の指示書に従って作製した50 mLのプレートカウント培地(Difco DF0751-17-2)を添加しオートクレーブした。各管に、個々の対象バチルスの一晩培養物、及びE.coliの一晩培養物を植菌した。管を、穏やかに攪拌させながら28℃で一晩インキュベートした。バチルス細胞の初回用量は、1×103〜8.2×105 cfu/mLの範囲であり、E.coliの初回用量はおよそ1×103〜1×105 であった。バチルスに対するE.coliの比率は1:0.6〜1:32の範囲であった。
対象バチルスを18〜24時間プレートカウント培地中で増殖させ、およそ107〜108 cfu/mL培養物にした。18〜24時間増殖させたE.coli(およそ108〜1010 cfu/mL)を標準法寒天プレート(SMAプレート)(Smith River Biologicals, Ferrum, VA)表面に菌叢を形成させるよう画線し、4つの5 mmの孔を滅菌ステンレス鋼管で寒天に対して穿孔した。50マイクロLの各バチルス培養液をその孔に移し(孔当たり1菌株)、プレートを18〜48時間、35℃で、寒天側を下にしてインキュベートした。孔に近接するインキュベートしたE.coli菌叢を、対象バチルスに対するポジティブコントロールとして点数化した。阻害域をミリメータ(mm)で測定し、コントロールの準定量的評価とした。1mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
対象バチルスを18〜24時間プレートカウント培地中で増殖させ、およそ107〜108 cfu/mL培養物にした。18〜24時間増殖させたシュードモナス・エルギノーサ(およそ108〜1010 cfu/mL)を標準法寒天プレート(Smith River Biologicals, Ferrum, VA)表面に菌叢を形成させるよう画線し、4つの5 mmの孔を滅菌ステンレス鋼管で寒天に対して穿孔した。50マイクロLの各バチルス培養液をその孔に移し(孔当たり1菌株)、プレートを18〜48時間、35℃で、寒天側を下にしてインキュベートした。孔に近接するインキュベートしたシュードモナス・エルギノーサ菌叢を、対象バチルスに対するポジティブコントロールとして点数化した。阻害域をミリメータ(mm)で測定し、コントロールの準定量的評価とした。0.5mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
対象バチルスNRRL B−50014を18〜24時間プレートカウント培地中で増殖させ、およそ107〜108 cfu/mL培養物にした。18〜24時間増殖させた(およそ108〜1010 cfu/mL)シュードモナス・モンテリ(ATCC 700412)及びPs.プチダ(ATCC 49451)を標準法寒天プレート(Smith River Biologicals, Ferrum, VA)表面に菌叢を形成させるよう画線し、4つの5 mmの孔を滅菌ステンレス鋼管で寒天に対して穿孔した。50マイクロLのバチルス培養液をその孔に移し(孔当たり1菌株)、プレートを18〜48時間、35℃で、寒天側を下にしてインキュベートした。阻害された孔に近接するインキュベートしたシュードモナス菌叢を、対象バチルスに対するポジティブバイオコントロールとして点数化した。阻害域をミリメータ(mm)で測定し、コントロールの準定量的評価とした。1 mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
セラチア・ルビダエア(ATCC 27593)は、その色素沈着が無処置のクオラムセンシング経路に依存する細菌指標として使用した。クオラムセンシング化合物は、細菌を「情報交換」させ、表現型、例えば色素沈着、遊走性、病原性及びバイオフィルム形成に作用する。すなわちクオラムセンシング阻害はバイオフィルム制御の作用状態である。
対象バチルスを18〜24時間、35℃で、プレートカウント培地中で増殖させ、およそ107 cfu/mLの密度にした。バチルスで標準法寒天プレート(SMAプレート)(Smith River Biologicals, Ferrum, VA)に染みをつけ(10マイクロL)、18〜24時間、26℃でインキュベートし、当該時間後に、コロニーが可視化した。セラチア培養物(5マイクロL)(Luria培地、18〜24時間、26℃で、およそ107 cfu/mL)を、5 mLの0.5%溶融LB寒天(Luria培地、30.5 g/L 及び 0.5%不活性寒天(noble agar)に添加し、よく混合し、成熟対象バチルスコロニーを有するプレート上に注いだ。寒天準備の後、プレートを18〜24時間、26℃でインキュベートした。阻害された色素沈着域は、それ自体が阻害されたセラチア増殖ではないが、QSIに対するポジティブとして点数化し、準定量的結果のためにその全直径にわたって測定した。
ポーセリンクーポン(Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta)を有するCDCバイオフィルムリアクター(Biosurfaces Technologies, Bozeman, MT, カタログ番号CBR90-2)に400 mLのプレートカウント培地を満たし、オートクレーブした。PTA−7546胞子を2つのリアクターの冷却した媒体に添加し、シュードモナス傷害の前に、攪拌棒を60rpmに設定し、室温で24時間の色素沈着時間インキュベーションした(リアクター中の初回用量=4.5x105 cfu/mL)。2つの追加のリアクターをバチルス植菌なしのコントロールとして処理した。シュードモナス・エルギノーサをプレートカウント培地中で一晩増殖させ、その後20マイクロLの1:100希釈シュードモナス培養物を全4つのリアクターに添加し、得られた共培養比率は1シュードモナス:127バチルスであった。24時間の増殖後、媒体再投与を、速度3mL/分で、希釈プレートカウント培地(1 g/L濃度)で開始した。攪拌を60rpmに設定した。
1日後(共培養開始から2日後)、液サンプルを各リアクターから採取し、希釈し、Maconkey agar上にプレートし、およそ18時間35℃でインキュベートし、グラム陰性(=シュードモナス=不所望生物)カウントを得る。同様に、couponを滅菌木製塗布棒で擦過し、擦過物を滅菌リン酸化バッファに懸濁させ、均一化し、希釈し、MacConkey寒天上にプレーティングし、これを18時間35℃でインキュベートする。処理対未処理のリアクター中で、シュードモナスカウントの比較により、「バチルスリアクター中の対数的制御」の計算ができる。
ポーセリンクーポン(Tyler Research Instruments Corp., Edmonton, Alberta)を有するCDCバイオフィルムリアクター(Biosurfaces Technologies, Bozeman, MT, カタログ番号CBR90-2)に400 mLのプレートカウント培地(完全強度)を満たし、オートクレーブした。PTA−7546(試行1)及びNRRL B−50017(試行2)の胞子を2つのリアクターの冷却した媒体に添加し、シュードモナス傷害の前に、攪拌棒を60rpmに設定し、室温で24時間の色素沈着時間インキュベーションした(リアクター中の初回バチルス用量=試行1で1.3x105 cfu/ml、試行2で1012 cfu/ml)。2つの追加のリアクターをバチルス植菌なしのコントロールとして処理した。シュードモナス・エルギノーサをプレートカウント培地中で一晩増殖させ、その後20マイクロLの1:100希釈シュードモナス培養物を全4つのリアクターに添加し(試行1が127 cfu/ml、試行2が1x105 cfu/ml)、得られた共培養比率は、試行1が1シュードモナス:104バチルス、試行2が1:0.1であった。24時間の増殖後、媒体再投与を、速度90 mL/15分で1時間に15分間、希釈プレートカウント培地(1 g/L濃度)で開始した。処理したリアクターについて、バチルス胞子を、2.7時間で1.5 mLの速さで投与し、終濃度が、試行1が1.1x108 cfu バチルス胞子/日、試行2が1.8x107 cfu バチルス胞子/日であった。攪拌は60rpmに設定した。
1日後(共培養開始から2日後)、液サンプルを各リアクターから採取し、希釈し、Maconkey agar上にプレートし、およそ18時間35℃でインキュベートし、グラム陰性(=不所望生物)カウントを得る。同様に、couponを滅菌木製塗布棒で擦過し、擦過物を滅菌リン酸化バッファに懸濁させ、均一化し、希釈し、MacConkey寒天上にプレーティングし、これを18時間35℃でインキュベートする。処理対未処理のリアクター中で、シュードモナスカウントの比較により、「バチルスリアクター中の対数的制御」の計算ができる。
対象バチルスを栄養培地(3 g/Lビーフ抽出物、5 g/Lペプトン)中、35℃で18〜24時間増殖させた。V.ハルベイATCC 25919を1.5%NaCl添加の栄養培地中、28℃で18〜24時間で増殖させた。1.5%NaCl添加の栄養寒天(1.5% 寒天)を25 mL分割量でオートクレーブした。250マイクロLのビブリオ一晩培養物を、溶融寒天の各分割量に添加し、寒天中およそ1×106 cfu/mLビブリオとなった。寒天を固化させた後、4つの孔を、滅菌ステンレス鋼管を用いて各プレートに穿孔した。50マイクロLの各バチルス一晩培養液を各ウェルに移した。プレートを28℃で18〜24時間、寒天側を下にしてインキュベートした。阻害ビブリオ菌叢域を測定した。0.5 mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
対象バチルスを栄養培地(3 g/Lビーフ抽出物、5 g/Lペプトン)中、35℃で18〜24時間増殖させた。V. アルギノリティカスATCC 17749を1.5%NaCl添加の栄養培地中、28℃で18〜24時間で増殖させた。1.5%NaCl添加の栄養寒天(1.5% 寒天)を25 mL分割量でオートクレーブした。250マイクロLのビブリオ一晩培養物を、溶融寒天の各分割量に添加し、寒天中およそ1×106 cfu/mLビブリオとなった。寒天を固化させた後、4つの孔を、滅菌ステンレス鋼管を用いて各プレートに穿孔した。50マイクロLの各バチルス一晩培養液を各ウェルに移した。プレートを28℃で18〜24時間、寒天側を下にしてインキュベートした。阻害ビブリオ菌叢域を測定した。0.5 mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
対象バチルスを栄養培地(3 g/Lビーフ抽出物、5 g/Lペプトン)中、35℃で18〜24時間増殖させた。V. フィシェリを1.5%NaCl添加の栄養培地中、28℃で18〜24時間で増殖させた。1.5%NaCl添加の栄養寒天(1.5% 寒天)を25 mL分割量でオートクレーブした。250マイクロLのビブリオ一晩培養物を、溶融寒天の各分割量に添加し、寒天中およそ1×106 cfu/mLビブリオとなった。寒天を固化させた後、4つの孔を、滅菌ステンレス鋼管を用いて各プレートに穿孔した。50マイクロLの各バチルス一晩培養液を各ウェルに移した。プレートを28℃で18〜24時間、寒天側を下にしてインキュベートした。阻害ビブリオ菌叢域を測定した。0.5 mmより大の識別可能な阻害をポジティブとして点数化した。
Claims (19)
- 表面上のバイオフィルム形成の防止及び/又は低減のための方法であって、当該表面を以下の、
受託番号NRRL B−50017を有する菌株、
受託番号PTA−7541を有する菌株、
受託番号PTA−7542を有する菌株、
受託番号PTA−7543を有する菌株、
受託番号PTA−7544を有する菌株、
受託番号PTA−7545を有する菌株、
受託番号PTA−7546を有する菌株、
受託番号PTA−7549を有する菌株、
受託番号PTA−7791を有する菌株、
受託番号PTA−7792を有する菌株、
受託番号PTA−7793を有する菌株、又は2以上の当該菌株の混合物、
からなる群から選択される1又は複数の細菌株に晒すことを含んでなる方法。 - 前記表面が、硬表面、軟表面、又は多孔質表面である、請求項1に記載の方法。
- 前記硬表面が、便器、トイレ用貯水容器、冷却塔、水処理施設、貯水槽、乳製品食品加工施設、化学もしくは医薬製造施設、又は医療機器である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記バイオフィルム形成が、1又は複数の不所望微生物により引き起こされる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記不所望微生物が、問題の物質の腐食、孔食、分解、感染、汚染又はその他の表面を審美的に不快な外観にする原因となる、請求項4に記載の方法。
- 前記方法が周期的に反復される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面を酵素に晒すことをさらに含んでなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面を、分散剤、界面活性剤、抗微生物剤、及び殺生物剤からなる群から選択される1又は複数に晒すことをさらに含んでなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 表面上のバイオフィルム形成の防止及び/又は低減のための組成物であって、受託番号NRRL B−50017を有する菌株を含んでなる組成物。
- 界面活性剤をさらに含んでなる、請求項9に記載の組成物。
- 1又は複数の酵素をさらに含んでなる、請求項9又は10に記載の組成物。
- 酵素が、プロテアーゼ、アルファ−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びマンナナーゼ、又はその混合物からなる群から選択される、請求項11に記載の組成物。
- 分散剤、安定化剤、抗微生物剤、香料、色素、及び殺生物剤からなる群から選択される1又は複数の成分をさらに含んでなる、請求項9〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記硬表面が、金属、可塑物、ゴム、板、ガラス、木材、紙、コンクリート、岩、大理石、石膏、及びセラミック物質からなる群から選択される1又は複数の物質からなる、請求項2に記載の方法。
- 軟表面、繊維、毛糸、織物、植物繊維、岩綿、髪、皮膚、角質物質、及び内臓組織からなる群から選択される1又は複数の物質からなる、請求項2に記載の方法。
- 前記不所望微生物が細菌である、請求項4に記載の方法。
- 前記不所望微生物が病原性細菌である、請求項16に記載の方法。
- 前記細菌が、問題の物質の腐食、孔食、分解、感染、汚染又はその他の表面を審美的に不快な外観にする原因となる、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記酵素が、プロテアーゼ、アルファ−アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びマンナナーゼ、又はその混合物からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
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