JP2010520767A - アルカリ性バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）アルファ‐アミラーゼ変異体、アルファ‐アミラーゼ変異体を含む組成物及び使用方法。 - Google Patents

Abstract

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番由来アルファ‐アミラーゼの変異体、前記変異体を含む組成物、及び変異体の使用方法を開示する。使用方法は、表面洗浄、繊維洗濯、湯通し、多様な物質を放出するバイオフィルムを加水分解し、及びデンプン処理（例えば、液化及び糖化）の方法を含む。
【選択図】図１

Description

関連出願
本願の特許請求の範囲は２００７年３月９日に出願した、「アルカリ性バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種変異体、アルファ‐アミラーゼ変異体を含む組成物、及び使用方法」というタイトルである米国仮出願番号第60/905,811に基づき優先権を主張する。

配列リスト
すべての目的のためにその全体を参照により本明細書に取り込まれる配列番号１−３を含む配列リストを添付する。

発明の分野
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ及びその変異体、それらの組成物及び使用を開示する。

デンプンはアミロース（１５から３０％ｗ／ｗ）とアミロペクチン（７０から８５％ｗ／ｗ）の混合物からなる。アミロースは約６０、０００から約８００、０００からの分子量（ＭＷ）を有する直鎖アルファ‐１，４‐結合グルコースユニットからなる。アミロペクチンは２４から３０のグルコースのユニットごとにアルファ‐１、６分岐点を含む枝分かれポリマーであり、そのＭＷは１００万位である。

濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、（１）アルファ‐アミラーゼでの固体デンプンの液状化（又は粘度低下）による約７から１０の平均重合度を有するデキストリンの生成（２）アミログルコシダーゼ（またグルコアミラーゼ又はＧＡと呼ばれる）で得られた液状デンプン（言い換えると、デンプン加水分解物）の糖化を含む酵素の触媒によるプロセスで生産される。得られたシロップは高いグルコース含有量を有する。商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後に、イソシロップで知られるデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。

アルファ‐アミラーゼ類（ＥＣ ３．２．１．１）は不規則に内部のアルファ‐１，４‐グルコシド結合を切断することによりデンプン、グリコーゲン、関連する多糖を加水分解する。この酵素のクラスは、例えばデンプンの液状化、繊維の湯通し、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの改変、及び醸造において数多くの重要な産業上の利用を有する。また、これらの酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除くため及び糖、醸造、アルコール及び繊維産業において用いることができる。アルファ‐アミラーゼは、広範囲の細菌類、菌類、植物、及び動物の供給源から単離される。産業的に、多くの重要なアルファ‐アミラーゼは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）から単離されたものである。

ある特徴的なアルファ‐アミラーゼはアルカリ性バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼである。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番はデンプン加水分解活性を有する主に５種類の酵素を生産する。それらの分子量は約１１０、９５、８５、７５、及び６０ｋＤａである。A. Tsukamoto他「Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp. #707 and structural similarity to liquefying type α-amylase」 Biochem. & Biophys. Res. Comm. 151(1): 25-31 (1988)。同定されたアルファ‐アミラーゼは５９，００７．５ダルトンの測定分子量を有する５１８アミノ酸の長さである。Tsukamoto 他(1988)。初めの３３アミノ酸は蛋白質排出の分泌に関するシグナルペプチドとして作用する。それゆえ、細胞外形態は、５５，３７２ダルトンの測定分子量を有する４８５アミノ酸の長さである。酵素をコードする核酸はクローン化され、K. Kimura他「Cloning of a gene for maltohexaose producing amylase of an alkalophilic Bacillus and hyper-production of the enzyme in Bacillus subtilis cells」、Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 372-377 (1988)に記載のように特徴づけられた。アルファ‐アミラーゼはＧ６アミラーゼ又はマルトヘキサオーズ生産アミラーゼ（E.C. 3.2.1.98）及びグルコシド加水分解ファミリー１３に属する。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番由来のアルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列は、それぞれバシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＡ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＢＬＡ）、及びバシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の液化アルファ‐アミラーゼのそれと６５．５％、６５．９％、及び６６．３％相同性を有する。R. Kanai他「Biochemical and crystallographic analyses of maltohexaose-producing amylase from alkalophilic Bacillus sp. 707」、 Biochemistry 43: 14047-14056 (2004)。それゆえ、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のＧ６‐アミラーゼはＧ４‐アミラーゼのそれと構造的に異なると推測される。R. Kanai他(2004)。

すなわち、増強された特徴及び／又は生産速度を有するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼ変異体の必要性が存在する。とりわけ、生産の増加はコストマージン、プラント容量の節約、及び高い活性産物を改善するに至るであろう。さらに、特異活性の増加は例えば酵素需要の減少をもたらすことによってコストマージンを同様に改善する。

すなわち、本発明は組成物及び組成物の使用方法を提供し、改良された特徴を有するアルファ‐アミラーゼを用いる前記組成物及び組成物の使用方法を提供する。

例えば、ある実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物を含む。食器洗浄組成物は手作業用又は自動装置用食器洗浄に使用する組成物でよい。

他の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗濯洗剤添加剤を意図する。

他の実施態様においては、上記記載の洗剤添加剤と、さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む洗剤添加剤を含む洗濯洗剤を意図する。

さらに他の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする単離される核酸であって、前記変異体が配列番号３のＭ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２、及び／又はＭ２６１の置換からなる群から選択される置換又は欠損残基を有することを意図する。Ｍ２０２変異体はＭ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択される置換変異体でよい。Ｓ２５５変異体はＳ２５５Ｎの置換である。Ｒ１７２の置換はＲ１７２Ｑでよい。また、考えられる変異体にはこれらの置換の組み合わせを有する変異体も意図される。また、考えられる変異体にはポリペプチド中にこれらの置換を有するアルファ‐アミラーゼポリペプチド（シグナル配列を有する又は有しない）も意図される。

他の実施態様においては、前述の任意の変異体をコードする核酸を含むベクターを意図する。また、例えばベクターを介して核酸が挿入される単離細胞も意図する。単離宿主細胞は微生物でよく、例えば、バシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ）、 バシルス ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アルカロフィリス（Ｂ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス コアグランス（Ｂ． ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス シルクランス（Ｂ． ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス ランツス（Ｂ． ｌａｕｔｕｓ）、 バシルス ツリンギエンシス（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ストレプトミセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス ムリナス（Ｓ． ｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群から選択されるグラム陽性菌又はグラム陰性菌であって、前記グラム陰性菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。

別の実施態様においては、洗濯洗浄及び／又は食器洗浄用の本明細書に記載のポリペプチドの使用を意図する。これらのポリペプチド変異体は任意に非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒状、マイクロ粒状、被安定化液、又は被保護酵素の形態でよい。別の実施態様においては、さらに、洗浄添加物又は洗剤組成物がセルラーゼ、プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含むことを意図する。他のアミラーゼは二以上の他のアルファ‐アミラーゼ、ベータアミラーゼ、イソアミラーゼ、又はグルコアミラーゼを含む組成物の使用を意図する。

また、考えられることは繊維及び食器又は任意の上述組成物を用いる他の固い表面を洗浄する方法である。

他の実施態様においては、繊維の湯通し組成物であって、組成物が水溶液における本明細書記載のアルファ‐アミラーゼ又は任意のアルファ‐アミラーゼ変異体の使用を意図する。また、考えられることは組成物を用いる繊維の湯通し方法である。

さらに実施態様においては、水溶液中のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン処理用の組成物を意図する。また、考えられることはデンプンを処理するための組成物の使用方法である。さらに、方法及び組成物はグルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ又はそれらの組み合わせを含んでよい。さらに別の実施態様においては、溶液又はゲル中のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はそれらの変異体を含み及びさらに任意にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、抗菌剤、又はそれらの組み合わせを含むバイオフィルム加水分解組成物を意図する。また考えられることは前記組成物を用いるバイオフィルム加水分解の方法である。

別の実施態様においては、溶液中のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプンを糖化するための組成物を意図する。従って、また前記デンプンを糖化するために十分な時間請求項３３の組成物を投与することを含むデンプンを糖化する方法を意図する。

別の実施態様においては、溶液中にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン液化用組成物を意図する。また、考えられるものは前記デンプンを液化するのに十分な時間前記組成物を投与することを含むデンプンを液化する方法である。

さらなる実施態様においては、溶液又はゲル中にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を用いる焼成組成物を意図する。またそのような焼成組成物を用いる焼成方法を含む。

添付する図面は本明細書、実施態様の説明に取り込まれ、本明細書、実施態様の説明の一部を構成する。図は開示する実施態様の説明図である。
ｐＨ８．０での米見本試験におけるＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）（△）、ＯｘＡｍ（■） (Purastar（商標）)及びバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ（□）比較。 ｐＨ１０．１での米見本試験におけるＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）（□）、ＯｘＡｍ（△） (Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)及びバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ（■）比較。 図３ＡはＰｒｅ‐ＬＡＴシグナルペプチドコードＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。 図３Ｂは天然型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ遺伝子（配列番号２）を示す。 ｐＩＣａｔＨプラスミドの図。 Ａｍｙ７０７遺伝子配列を含むｐＩＣａｔＨプラスミドの図。 Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒ試験結果を示す。タイド（Ｔｉｄｅ）活性（１．８ｇ／Ｌ）、タイド（Ｔｉｄｅ）不活性（１．８ｇ／Ｌ）、又はＡＡＴＣＣ（１．５ｇ／Ｌ）を含む洗剤組成物をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ（０．１ｐｐｍ）又はＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）（０．１ｐｐｍ）存在下試験を行った。いくつかのサンプルにおいて、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）Ｐｒｉｍｅ（０．５ｐｐｍ）も存在した。この試験を５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、６ｇｐｇ（ｇｒａｉｎｓ ｐｅｒ ｇａｌｌｏｎ）水の硬度、７４°Ｆ、ｐＨ７．５で行った。試験対象の見本は着色デンプン綿（ＥＭＰＡ１６１，１３‐０２）であった。ＳＲＩパーセント（％ＳＲＩ）は汚れ除去指標の割合又は洗浄プロセスにて除かれる汚れの割合を表す。汚れ除去を汚れの無い見本、完全に汚れている見本、及び酵素処理による洗浄処理後の汚れている見本を測定することにより算出した。測定をＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊カラースペースを用いる反射率測定によって測定する。％ＳＲＩを洗浄見本及び汚れ見本の着色間の差、及び汚れの無い見本及び汚れ見本の着色間の差の割合により算出する。「ｄＥ」は、ＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊カラースペースでの各着色成分の差の二乗の合計の平方根を表す。視覚できる色をカラースペースで調整されるＬ＊ａ＊ｂ＊により表すことができる。「Ｌ＊」は、明度スケール又は真っ黒から真っ白を０から１００のスケール値であるグレイスケールを示す。「ａ＊」はマゼンタから緑へのシフトを表し、高い陽性値は高いマゼンタの色調及び高い陰性値は高い緑の色調を示す。「ｂ＊」は黄色から青色へのシフトを表し、高い陽性値は高い黄色の色調及び高い陰性値は高い青い色調を示す。ａ＊及びｂ＊値が０の場合、色が存在せず、Ｌ＊値により決定される明度を有する純粋なグレイカラーを放出する。試験の対象となる見本はＣＳ−２（０７２、ココア汚れを伴う）、ＣＳ−３７（００５、全卵汚れを伴う）、又は着色デンプン綿（ＥＭＰＡ１６１、１３‐０２）いずれかであった。 ４０°Ｆで１２ｇｐｇ水硬度で漂白剤を有する５ｇ／ＬのＩＥＣ Ａ＊で実施したＬａｕｎｄｅｒ‐Ｏ‐ｍｅｔｅｒの結果を示す。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ及びＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）は０．１ｐｐｍの量で存在した。組成物を５つの異なる汚れ見本にて試験した。 バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）及びＯｘＡｍ (Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)の欧州条件下自動食器洗浄能力を示す。米ミルクを除去する洗浄能力をｍｇ活性蛋白質に比較する汚れ除去能力にて測定する。 バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）及びＯｘＡｍ (Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)の欧州条件下自動食器洗浄能力を示す。混合デンプンを除去する洗浄能力をｍｇ活性蛋白質に比較する汚れ除去能力にて測定する。 ２０℃で漂白剤存在下又は非存在下バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼのＭ２０２→Ｌ（Ｍ２０２Ｌ）変異体調製物の試験。洗浄試験の吸光度を酵素量の増加と共に４８８ｎｍで測定（ｐｐｍで測定）した。Ｍ２０２Ｌ変異体をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番の野生型アルファ‐アミラーゼと比較した。

詳細な説明
次のものは化合物、組成物、前記化合物の製造方法、及び前記化合物及び組成物の使用方法に関し、特に、前記化合物がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番又はその変異体である。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ形態もその変異体も例えば、洗濯及び食器洗浄試験において高い性能を有すると研究されてきた。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼは最適ｐＨ８．８を有し、広いｐＨ（言い換えると、ｐＨ４．７からｐＨ１０．８）に渡って安定である。ポリペプチドは４５℃の最適温度を有した。酵素は低い温度、例えば１５℃から２０℃で活性を有した。５５℃以上の温度で３０分インキュベーション後、酵素はその活性の２０％以下となる。

１． 略語及び定義
本明細書の詳細な説明に従って、次の略語及び定義を適用する。本明細書にて使用する単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素（ａｎ ｅｎｚｙｍｅ）」はそんな酵素の複数を含み、「製剤（ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」の意味は一以上の製剤及び当業者が知っているそれらと等価の製剤のー又は複数の意味を含む。

別段の指示がない限り、本明細書にて用いるすべての技術及び科学用語は当業者が通常理解するものと同様の意味を有する。次の用語を以下に示す。

１．１定義
「アミラーゼ」はグルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、及びバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のような細菌の野生型アルファ‐アミラーゼのような任意のアミラーゼを含むことを意味する。「アミラーゼ」は、とくに、デンプンの分解の触媒能力を有する酵素を意味する。アミラーゼ類はデンプン中のアルファ‐Ｄ‐（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、アルファ‐アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１； α‐Ｄ‐（ｌ→４）‐グルカン グルカノヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐Ｄ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。それに対して、ベータ‐アミラーゼ（（ＥＣ ３．２.１．２． α‐Ｄ‐（ｌ→４）−グルカン マルトヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））及び麦芽アルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ α‐ａｍｙｌａｓｅ）（ＥＣ ３．２．１．１３３）のようにある産物特異的アミラーゼ類のような、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ (ＥＣ ３．２．１．２０; α‐Ｄ‐グルコシド グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、グルコアミラーゼ (ＥＣ ３．２．１．３; α‐Ｄ‐（ｌ→４）-グルカン グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、及び産物特異的アミラーゼ類はデンプンから特徴的な長さの麦芽オリゴ糖を生産する。

「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ」はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番由来のアルファ‐アミラーゼである。アルファ‐アミラーゼをコードする遺伝子は野生型遺伝子又はアルファ‐アミラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドである。「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ変異体」は、野生型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼの変異体を意味し、それはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番の親ポリペプチド配列からの配列置換、追加、又は欠損を含む。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番の成熟アルファ‐アミラーゼを（アミノからカルボキシの方向）（配列番号３）次に示す。

本明細書にて用いる「親酵素」、「親ポリペプチド」はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のポリペプチドを意味する。「親核酸」は該親ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼは親ポリペプチドのシグナル配列に又は、アルファ‐アミラーゼ親ポリペプチドの他のところにおける変異体を含んでよい。即ち、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼは異種のアルファ‐アミラーゼポリペプチドを含む融合蛋白質の形態でもよい。また、キメラ（言い換えると、少なくとも二つのアルファ‐アミラーゼ組み合わせ）を含んでよい。例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番は、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）のような別のアルファ‐アミラーゼ由来のシグナルペプチドを含んでよい。例えば、ＬＡＴシグナルペプチドコード配列を示す図３Ａを参照願いたい。また、最初のアラニン（バリン以外の任意の置換）の代わりに、例えば、１、２又はそれ以上のトレオニンのような二以上のアミノ酸置換が考えられる。「変異体」という用語は、「ミュータント」という用語と互換可能に用いてよい。変異体はポリペプチド及びバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番に対してさらに置換、トランスバージョン、挿入、及び欠損をコードする核酸を含む。変異体は本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド可能な相補的配列である配列を含んでよい。例えば、変異核酸配列はストリンジェント条件（例えば、５０℃及び０．２ＸＳＳＣ｛１ＸＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５ Ｍ Ｎａ_３ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０｝）下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する。用語「変異核酸配列」は、高いストリンジェント条件（例えば、６５℃及び０．１ＸＳＳＣ｛１ＸＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５ Ｍ Ｎａ_３ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０｝）下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する配列を含む。

本明細書で用いる用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合し及び自然に見られる少なくとも一つの成分から除去される化合物、蛋白質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。

用語「精製される」は、材料が相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。

用語「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、活性を維持するような酵素能力を意味する。酵素の熱安定性、例えば、アルファ‐アミラーゼの熱安定性はその半減期によって測定される。半減期（ｔ_１／２）は、所定の条件下、半分の酵素活性が消失する間の分、時間、日の単位で表す時間である。半減期の値は残りのアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。

用語「ｐＨ範囲」は、５からそれ以上のｐＨ単位の範囲の酸性からアルカリ性条件での触媒活性を有する酵素の能力をいう。

本明細書にて用いる用語「ｐＨ安定性」は、所定の時間（例えば、１５分、３０分、１時間）にｐＨの広い範囲に渡って活性を維持する酵素能力に関する。

本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び／又は用語「蛋白質」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義語である。従来の１文字又は３文字アミノ酸残基コードを本明細書にて用いる。

用語「核酸」はＤＮＡ、ＲＮＡ，一本鎖又は二本鎖及びそれらの化学的修飾を含む。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は本明細書にて互換可能に用いてよい。

本明細書にて用いる用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アミノ酸ポリペプチド又はその変異体をコードするオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びフラグメント及びその誘導体（それらの一部のような）をいう。そのヌクレオチド配列はゲノム、合成又は組み換え体由来のものでよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかどうかで、二本鎖又は一本鎖でよい。本明細書にて用いるように、その用語ヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。例えば、ＤＮＡはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするｃＤＮＡ配列である。遺伝子コードの縮退により、二以上のコドンを特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、本発明は特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある度合いの相同性を有する物を意味する。相同配列は対象配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、又は９０％相同的なアミノ酸配列、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同的なアミノ酸配列を含むと考えられる。一般的に、相同性は対象アミノ酸配列の同様の活性部位を含む。

本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する過程及びポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）において実施する場合の増幅する過程も含む。アルファ‐アミラーゼ又はその変異核酸は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖又はＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーを含んでよい。

本明細書にて用いる「合成の」はインビトロで化学的又は酵素的合成によって生産されるものいう。メチロトローフ酵母ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例、トリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）、または他の発現宿主のような宿主生物にとって最適化コドンを使用したバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。

用語「水の硬度」は洗浄目的（１．４‐１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）用の水に含まれるカルシウム及びマンガンの量を意味し、食器洗浄の目的のための量を意味する。

本明細書にて、細胞に関して用いる場合の用語「形質転換される」「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれる外来種（例えば、異種の）の核酸配列を有することを意味する。

細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）の遺伝子へ取り込まれ、自律レプリコンへ転換し、又は一時的に発現（例えば、トランスフェクションｍＲＮＡ）する原核細胞又は真核細胞への核酸配列の取り込みに関することを含む。

本明細書に用いる「形質転換細胞」は組み換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子操作された細胞を含む。一般的に形質転換は細胞に一以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されたヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列（言い換えると、融合蛋白質又は異種配列をコードするＤＮＡ配列のような、形質転換された細胞に本来有していない配列）でもよい。

本明細書に用いる「作動的に連結される」とは、記載される要素が、それらが意図する態様で機能するようにする関係である。コード配列に作動的に連結する調節配列は、制御配列に適合する条件下、コード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。

本明細書にて用いる「生物学的活性な」とは、自然的に発生する配列と同様な構造機能（同じ程度とは必ずしも限らない）、及び／又は同様な調節機能（同じ程度とは必ずしも限らない）、及び／又は同様な生物学的機能（同じ程度とは必ずしも限らない）を有する配列をいう。

「宿主菌株」又は「宿主細胞」は、本明細書に開示する多様なアルファ‐アミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はＤＮＡ構築体に適した宿主を意味する。特に、宿主菌株は好ましくは、細菌細胞である。本明細書好ましい実施態様においては、「宿主細胞」は微生物の菌及び特にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の細胞から創製される細胞及びプロトプラスト両者を意味する。

用語「選択的マーカー」は導入される核酸又はベクターを含む宿主の選択を容易にする宿主中の発現可能な遺伝子をいう。選択マーカーの例は抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。

用語「培養する」は液体又は固体培地において適切な条件下微生物細胞の集団の増殖をいう。ある実施態様においては、培養するは、最終産物（一般的に容器又は反応器）への粒状デンプンを含むデンプン基質の発酵性バイオコンバージョンをいう。発酵は、単純な有機化合物を生産するために行われる微生物による有機基質の酵素的及び嫌気的分解である。発酵は嫌気的条件下に行われるけれども、酸素存在下でも発酵が行われるので、その用語は厳格な嫌気的条件に限定されることを意図していない。

「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するＤＮＡセグメントをいい、コード領域の前後に位置する領域や個々のコードセグメント（エクソン）間に介在する配列（イントロン）を含む。

「ベクター」は一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、及びそれらの類似物を含む。

「発現ベクター」は適切な宿主においてＤＮＡの発現に影響をあたえる適切な制御配列に作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、転写を制御する適切なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾーム結合部位をコードしている配列及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。

「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。プロモーターは誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。本発明に用いる好ましいプロモーターはバシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＬ）である。

用語「作動的に連結する」は、要素が機能的に関連するように配列中にあるように並べられることをいう。つまり、本明細書にて用いる「作動的に連結する」は記載する成分が意図する機能を行うような関係であることを意味する。例えば、コード配列に作動的に連結する調節配列はコード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下に行われるようなライゲーションである。

「転写コントロール下」はポリヌクレオチドの配列（普通ＤＮＡ配列）が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動的に連結することにより依存することを示す当業者によく理解される用語である。

「翻訳コントロール下」はｍＲＮＡが形成された後起こる調整プロセスを示す用語として周知である。

「シグナル配列」は蛋白質のＮ末端の一部に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞外への蛋白質の成熟型の分泌を手助けする。シグナル配列の定義は機能的なものである。細胞外蛋白質の成熟型は分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。

本明細書に用いるように、蛋白質及び遺伝子をコードする蛋白質及び遺伝子を記載する場合に遺伝子に関する用語はイタリック体、（例えば、ａｍｙＬ（バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） ＡＡ）をコードする遺伝子はａｍｙＬ（イタリック体）で表示されてよい。一般的に、蛋白質のための用語はイタリック体ではなく、一般的に最初の文字が大文字である（例えば、ａｍｙＬ遺伝子によりコードされる蛋白質はＡｍｙＬ又はａｍｙＬと表示する）。同様に、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番由来のアミラーゼ遺伝子及び蛋白質は本明細書にてそれぞれａｍｙ７０７（イタリック体）Ａｍｙ７０７で示す。

ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「異種の」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。いくつかの実施態様においては、蛋白質は商業的に重要な産業用蛋白質である。その用語は自然的に発生する遺伝子、変異遺伝子、及び／又は合成遺伝子によりコードする蛋白質を含むと考えられる。

ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然的に発生するポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。

本明細書にて用いる用語「発現」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。プロセスは転写及び翻訳を含む。

本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下単位時間当たり酵素の調製により生産のために転換される基質のモル数として定義される酵素単位を意味する。特異的活性は（Ｕ）／ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ単位として表わされる。

「ＡＴＣＣ」はマナッサス、Ｖａ、２０１０８（ＡＴＣＣ）に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションをいう。

「ＮＲＲＬ」はアグリカルチャー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナルセンター・フォー・アグリカルチャー・ユーティリゼーション・リサーチ（以前はＵＳＤＡ ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーとして知られる）ピオリア、Ｉｌｌをいう。

本明細書にて用いる用語「含む」及びそれと同じ語源の用語は「包括」の意味で用い、「含有する」及び同語源用語と同等である。

１．２略語
次の略語は、定義が本明細書の範囲内で述べている内容について他に示していない限り、以下の意味を有する。

ＡＥ アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯ アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯＳ アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）
ＡＥＳ アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）
ＡＦＡＵ 酸性菌アルファ‐アミラーゼユニット（ａｃｉｄ ｆｕｎｇａｌ α−ａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔｓ）
ＡＧＵ グルコアミラーゼ活性単位（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｎｉｔ）
ＡＯＳ アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＡＳ アルコール硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
ＢＡＡ バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ
ＢＬＡ バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（又はＬＡＴ）
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）
ＣＭＣ カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
ＤＮＡ デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＤＰ３ ３つのサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）
ＤＰｎ ｎ個のサブユニットを有する重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）
ＤＳ 乾燥固体（ｄｒｙ ｓｏｌｉｄｓ）
ＤＴＭＰＡ ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＣ 酵素委員会（ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＯ エチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）
Ｆ＆ＨＣ 繊維及び家庭用ケア（ｆａｂｒｉｃ ＆ ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ ｃａｒｅ）
ＦＡＵ 菌アルファ‐アミラーゼ単位（ｆｕｎｇａｌ ａｍｙｌａｓｅ ｕｎｉｔ）
ＧＡ グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）
ｇｐｇ １ガロン当たりのグレイン（ｇｒａｉｎｓ ｐｅｒ ｇａｌｌｏｎ）
ＨＦＣＳ 高フルクトーストウモロコシシロップ（ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）
ＨＦＳＳ 高フルクトースデンプンベースシロップ（ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｓｔａｒｃｈ ｂａｓｅｄ ｓｙｒｕｐ）
ＩＫＷ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｖｅｒｂａｎｄ Ｋｏｅｒｐｅｒｐｆｌｅｇｅ− ｕｎｄ Ｗａｓｃｈｍｉｔｔｅｌ ｅ． Ｖ
ＩＰＴＧ イソプロピル ベータ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
ＬＡＳ リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＬＯＭ ラウンダー‐Ｏ‐メーター（Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ）
ＬＵ Ｌｉｑｕｉｐｈｏｎ ｕｎｉｔ
ＭＷ 分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）
ＭＷＵ 修飾ウォルゲムス単位（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ ｕｎｉｔ）
ＮＯＢＳ ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩 （ｎｏｎａｎｏｙｌｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＮＴＡ ニトリロ三酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＣＲ ポリメラーゼチェーン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＰＥＧ ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）
ＰＶＡ ポリ（ビニル アルコール）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ））
ＰＶＰ ポリ（ビニルピロリドン）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））
ＲＮＡ リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＳＡＳ 第二級アルカンスルホン酸塩（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｋａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）
ＴＡＥＤ テトラアセチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）
ＴＣＡ トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＴＳＢ トリプティックソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）
ＵＦＣ 限外ろ過濃縮（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）
ｗ／ｖ 質量／体積（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）
ｗ／ｗ 質量／質量（ｗｅｉｇｈｔ／ｗｅｉｇｈｔ）
ｗｔ 野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）

１．３ 命名法
本明細書及び特許請求の範囲において、従来のアミノ酸残基用の１文字及び３文字コードを用いる。見やすいように、本発明のアルファ‐アミラーゼ変異体は次の命名法を用いて記載する。

原型のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸
この命名法に従って、例えば２４２位のアラニンによるセリンの置換を次のように示し、
Ser242Ala又はS242A
３０位でのアラニンの欠損を次のように示し、
Ala30*又はA30*又はΔA30
及びリジンのような追加するアミノ酸残基の挿入を次のように示す
Ala30AlaLys又はA30AK。

アミノ酸残基３０−３３のようなアミノ酸残基の連続ストレッチの欠損を(30-33)*又は Δ(A30-N33)又はΔ30-33のように示す。アミノ酸残基R18O-S181のような二つの連続するアミノ酸の欠損をΔRS又はΔ18O-181のように示す。

具体的なアルファ‐アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼと比較して「欠損」を含む及びそのような位置に挿入される場合次のように示す
例えば３６位にアスパラギン酸を挿入する場合
*36Asp又は*36D。

複数の変異はプラス記号によって分離され、言い換えると、
Ala30Asp+Glu34Ser又はA30N+E34S
であり、３０及び３４位にてそれぞれアラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンへ置換する変異を表す。

一以上の改変アミノ酸残基が与えられる位置に挿入される場合それは次のように示す
A30N,E又は
A30N又はA30E。

さらに、修飾に有用な位置が任意の具体的修飾が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置でそのアミノ酸残基に置換されてよいことが理解される。すなわち、例えば、これに特定されないが、３０位でアラニンの修飾が意図される場合、アラニンが欠損又は他のアミノ酸、言い換えると、
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V
の任意のひとつに置換されてよいことが理解される。

さらに、「A30X」は次の置換のいずれか一つを意味する
A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y,又はA30V;
又は略した場合、A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,Vとなる。

親酵素が、ナンバリングを用いて、その位置での置換を示唆される問題のアミノ酸残基をすでに有する場合、次の命名法を用いる
例えば、Ｎ又はＶが野生型に存在する場合
「X30N」又は「X30N,V」
つまり、親酵素に相当する他のものは３０位にて「Asn」又は「Val」に置換される。

１．４アミノ酸残基の特徴
荷電アミノ酸、
Asp, Glu, Arg, Lys, His
負の電荷を持つアミノ酸（最も負に帯電している残基を最初に）
Asp, Glu
正の電荷を持つアミノ酸（最も正に帯電している残基を最初に）
Arg, Lys, His
中性アミノ酸
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性が高い残基を最後に記載して）
Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp
親水性アミノ酸残基（最も親水性が高い残基を最後に記載して）
Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

１．５相同性（同一性）
整列後に別の配列に対して特定のパーセント（例えば、80%、83%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%）の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは塩基又はアミノ酸残基の割合が二つの配列を比較して同じである。このアライメント及びパーセント相同性又は同一性は周知の任意の適切なソフトウエアプログラムを用いて決定できる。例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel他、(eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18)に記載される。好ましいプログラムはthe Vector NTI Advance^TM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup program, FASTA (Pearson 他 (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)、及びBLAST (BLAST Manual, Altschul 他, Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md.及びAltschul他, (1997) NAR 25:3389-3402)を含む。他の好ましいアライメントプログラムはALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)であり、好ましくはデフォルトパラメータを用いる。使用に適した別の配列ソフトウエアプログラムはthe Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)で入手できるTFASTA Data Searching Programである。

相同性は第二から第一配列の導出を示す二つの配列間の相同性割合として決定されてよい。相同性はＧＣＧプログラムパッケージ（上述）が提供するＧＡＰのような周知のコンピュータープログラム手段により適切に決定されてよい。つまり、Gap GCG v8は相同性用デフォルトスコアリングマトリックス及び次のデフォルトパラメータを用いてよい。それは、核酸配列比較のためにそれぞれ５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．３のエクステンションペナルティー及び蛋白質配列比較のためにそれぞれ３．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．１のエクステンションペナルティーである。アライメントを作り、相同性を計算するためにＧＡＰはNeedleman and Wunsch, (1970), J.Mol. Biol. 48:443-453の方法を用いる。

Ａｍｙ７０７（配列番号１）及び例えば、別のアルファ‐アミラーゼの間の構造アライメントはＡｍｙ７０７と高い相同性、例えば、80%、85%、90%、95%、97%又は99%を有する他のアルファ‐アミラーゼにおける同等／相当の位置を同定するために用いてよい。前記構造アライメントを得る一つの方法はギャップペナルティーのデフォルト値、言い換えると、３．０のギャップクリエーションペナルティー及び０．１のエクステンションペナルティーを用いるＧＣＧパッケージからのPile Up プログラムを用いることである。他の構造アライメント方法は疎水性クラスター分析(Gaboriaud他, (1987), FEBS LETTERS 224, pp.149-155)及びリバーススリーディング（reverse threading）(Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No.1 pp. 142-149 (1998))を含む。

１．６ハイブリダイゼーション
上記Ａｍｙ７０７の特徴を用いたオリゴヌクレオチドは問題とするアルファ‐アミラーゼの完全又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列の基礎として適切に調製される。

ハイブリダイゼーションを試験するために適した条件は５ＸＳＳＣに予浸及び２０％ホルムアミド、５Ｘデンハート液（Denhardt's solution）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、及び５０ｍｇの変性超音波処理仔牛胸腺ＤＮＡに４０℃で１時間予ハイブリダイゼーションを伴い、引き続き、１００ｍＭＡＴＰを補給した同様の溶液に４０℃にて１８時間ハイブリダイゼーションをし、それから２ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中４０℃で３０分間（低いストリンジェンシー）好ましくは５０℃（中程度のストリンジェンシー）で、より好ましくは６５℃（高いストリンジェンシー）でさらに好ましくは７５℃（より高いストリンジェンシー）で三回のフィルター洗浄を行う。より詳しいハイブリダイゼーション方法についてはSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載される。

本明細書の文脈で、「から由来する」はアルファ‐アミラーゼの生産又は問題となる生物の菌種による生産だけでなくそのような菌種から単離される及び宿主生物中に生産されるＤＮＡ配列によってコードするアルファ‐アミラーゼも示す。最後に、その用語は合成の及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、問題とするアルファ‐アミラーゼの同定される特徴を有しているアルファ‐アミラーゼ示すと意図される。また、その用語は親アルファ‐アミラーゼが自然に発生するアルファ‐アミラーゼの変異体、言い換えると、自然に発生するアルファ‐アミラーゼの一以上のアミノ酸残基修飾（挿入、置換、欠損）の結果である変異体でもよいことを示すと考えられる。

また、本発明により含まれる配列が例示するａｍｙ７０７（イタリック体表示）配列（例えば、図３に示す配列番号３）を伴うストリンジェントハイブリダイゼーション条件下ハイブリダイゼーションする能力によって明らかとなることを当業者は理解できる。核酸の一本鎖の形態が温度及びイオン強度の溶液の適切な条件下他の核酸にアニールできる場合、核酸は別の核酸配列とハイブリダイゼーションできる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知である（例えば、Sambrook (1989)上述、特に 9章及び11章を参照願いたい）。いくつかの実施態様においては、ストリンジェントな条件は６５℃のＴｍ及び０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する。

１．７親アルファ‐アミラーゼ
本明細書によれば、任意のＡｍｙ７０７アルファ‐アミラーゼは、上記に明らかにするように、親（言い換えると、バックボーン）アルファ‐アミラーゼとして用いてよい。好ましい実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは、例えば、上記に参照されるものの一つ、配列番号１（図１参照）に示すアミノ酸配列を有する７０７アルファ‐アミラーゼのようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７菌株の由来である。

１．８改変される特徴
次のセクションは本明細書にて記載する変異体中に存在する改変及びそれらから得られる特徴（親７０７アルファ‐アミラーゼの特徴と相対的に）についての所望の改変との関係を記載する。

上述のように、本発明はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番及び改変される特徴を有するその変異体由来のアルファ‐アミラーゼに関する。

特に、具体的に意図される改変特徴に関して考えられる親７０７アルファ‐アミラーゼは上述の親７０７アルファ‐アミラーゼ及び少なくとも７０７アルファ‐アミラーゼの一部を含む親ハイブリッドアルファ‐アミラーゼである。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の菌株７０７アルファ‐アミラーゼ（配列番号１）が開始点として用いられるが、高い相同性を有する他のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼにおける相当する位置も開示され、具体的にも開始点として考えられるとして理解されるべきである。

実施態様においては、本発明は上述のように改変特徴を有する変異体に関する。

最初の実施態様においては、親バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌種アルファ‐アミラーゼの変異体であって、次の改変を少なくとも一つ又は少なくとも二つ含む。それは、
（ａ）Ｃ末端の欠損
（ｂ）配列番号１のナンバリングを用いてアミノ酸２０２（言い換えると、Ｍ２０２）の置換、又は
（ｃ）配列番号１のナンバリングを用いてＲ１８１、Ｇｌ８２、Ｈ１８２およびＧ１８４からなる群から選択される少なくとも二つの残基の欠損、及び前記変異体がアルファ‐アミラーゼ活性を有することを特徴とする。

１．８．１安定性
本明細書にて記載する変異体の文脈において、改変される安定性（言い換えると、より高い又はより低い安定性）、特に、安定性の改善、特に高い温度（言い換えると、７０−１２０℃）及び／又は極端なｐＨ（言い換えると、低い又は高いｐＨ、言い換えると、それぞれｐＨ４−６又はｐＨ８−１１）、特に、６０ｐｐ以下の遊離（言い換えると、溶液中のその非結合）カルシウム濃度での安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠損を含む）は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．２Ｃａ ^２＋ 安定性
改変されるＣａ^２＋安定性はＣａ^２＋減少下酵素の安定性が改善される、言い換えると、より高い又はより低い安定性を意味する。本明細書に記載する変異体の文脈において、改変されるＣａ^２＋安定性、特に、Ｃａ^２＋安定性の改善、言い換えるとより高い又はより低い安定性、特に、高いｐＨ（言い換えると、ｐＨ８−１０．５）の安定性を達成することについて重要な変異（アミノ酸置換及び欠損を含む）は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。

１．８．３特異的活性
さらなる実施態様においては、改変される特異的活性、特に特異的活性の増減、特に、１０から６０℃までの温度、好ましくは２０から５０℃、特に３０から４０℃の温度で特異的活性を有する変異体を得ることに関して重要な変異（アミノ酸置換及び欠損を含む）は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。特異的活性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．４酸化安定性
本明細書にて記載される変異体は、親アルファ‐アミラーゼと比較して、改変される酸化安定性、特に高い酸化安定性を有してよい。増加される酸化安定性は例えば、洗剤組成物において有利であり、減少される酸化安定性はデンプン液状化用組成物において有利である。酸化安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。

１．８．５改変されるｐＨプロファイル
改変されるｐＨプロファイル、特に高いｐＨ（言い換えると、ｐＨ８−１０．５）又は低いｐＨ（言い換えると、ｐＨ４−６）で活性を改善されるプロファイルを有する重要な位置及び変異体は活性部位残基のそばに位置するアミノ酸残基の変異を含む。

好ましい具体的変異／置換は問題とする位置について「改変される特徴」セクションにおいて上述したもののひとつである。適切な試験は下記の「方法」のセクションにて記載される。

１．８．６洗浄能力
改善される洗浄能力、特に高いｐＨ（言い換えると、ｐＨ８．５−１１）での洗浄能力を有する変異体を得ることに関して重要な位置及び変異は、問題とする位置について「改変される特徴」セクションにおいて上述する具体的な変異体／置換を含む。洗浄能力は下記の「方法」のセクションにて記載されるように試験される。

２．バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ、その変異体、及びそれらの生産方法
すなわち、ある実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼの変異体を生産するために、すでに決定されているアミノ酸の置換、欠損、トランスバージョン、挿入、及びそれらの組み合わせを含む組み換え体を創るバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ配列の提供である。これらの変異体はさらに生産増強する、ｐＨ安定性の増加、温度安定性の増加、Ｃａ^２＋の要求性の低減、特異的活性の増加、食器洗浄又は洗浄能力の増加、可溶性の増加、保存安定性の増加、又はこれらの組み合わせを有することができる。変異体を遺伝子組み換えで生産する方法は提供される配列及びベクターを用いて実施され、又は他の周知の方法で実施された。

２．１アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親アルファ‐アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、周知の多様な方法を用いて、問題とするアルファ‐アミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離されてよい。まず、ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、研究されるべきアルファ‐アミラーゼを生産する生物由来の遺伝子染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築される。それから、アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、問題とする生物から調製する遺伝子ライブラリーからのアルファ‐アミラーゼをコードするクローンを同定するために相同体、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを合成しそして用いる。あるいは、知られているアルファ‐アミラーゼ遺伝子に相同性のある配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーション及び低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのプローブとして用いることができる。

アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのさらに別の方法はプラスミドのような発現ベクターに遺伝子ＤＮＡのフラグメントを挿入し、アルファ‐アミラーゼ陰性細菌を得られる遺伝子ＤＮＡライブラリーと形質転換し、及びそれからアルファ‐アミラーゼに対する基質を含む寒天培地の上に形質転換細菌を置き、それによってアルファ‐アミラーゼを発現するクローンを同定できる。

あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列を例えば、S. L. Beaucage及びM. H. Caruthers (1981)により記載されるフォスフォアミダイト（phosphoamidite）法又はMatthes他(1984)により記載される方法のような確立した標準方法により合成的に調製してもよい。フォスフォアミダイト（phosphoamidite）法において、オリゴヌクレオチドを例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、及び適切なベクターへクローニングする。

最後にＤＮＡ配列は、標準的な方法に従って、合成、遺伝子、又はｃＤＮＡ原型（必要に応じて、完全なＤＮＡ配列の多様な一部に相当するフラグメント）のフラグメントをライゲーションにより調製される遺伝子及び合成の原型の混合、合成の及びｃＤＮＡの原型の混合又は遺伝子及びｃＤＮＡ原型の混合でよい。また、ＤＮＡ配列を例えば、U.S. Pat. No. 4,683,202又はR. K. Saiki他(1988)に記載されるように、特異的なプローブを用いるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）により調製してよい。

２．２部位特異的突然変異誘発法
一度アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列を単離し、変異のための必要な部位を同定すると、変異を合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。これらのオリゴヌクレオチドは必要な変異部位を攻撃するヌクレオチド配列を含む。すなわち、オリゴヌクレオチドを合成する間に変異ヌクレオチドを挿入する。具体的方法において、アルファ‐アミラーゼコード配列をブリッジングするＤＮＡの一本鎖ギャップをアルファ‐アミラーゼ遺伝子を保持するベクター中に創製する。それから、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同性のある部分にアニーリングする。それから、残されるギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片（Klenow fragment））で満たし、構築体をＴ４リガーゼを用いてライゲーションする。Morinaga他(1984)U.S. Pat. No. 4,760,025に記載のこの方法の具体例は、カセットのマイナー改変を実施することにより多数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、多数の、種々の長さのオリゴヌクレオチドが導入できるので、多くの変異でさえもMorinagaの方法によって一度で導入できる。

アルファ‐アミラーゼコードＤＮＡ配列に変異の導入の別の方法がNelson及びLong (1989)に記載される。それはＰＣＲ反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成されるＤＮＡ鎖を用いることによって導入される所望の変異を含むＰＣＲフラグメントの３段階の配列性を含む。ＰＣＲ生産フラグメントから変異を有するＤＮＡフラグメントを制限エンドヌクレアーゼの切断により単離し、発現プラスミドへ再挿入してよい。

３．アルファ‐アミラーゼ変異体の生産
本明細書に記載する方法により又は任意の別の周知の方法により生産するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列を適切なプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意に抑制遺伝子及び／又は種々の活性遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現できる。

アルファ‐アミラーゼ変異体をコードＤＮＡ配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えＤＮＡ手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。つまり、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、言い換えると、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。また、組み込まれる遺伝子を、促進される増幅可能な構築体の使用により、抗体選別又は必須調節遺伝子のような他の選別圧によって、又は必須代謝経路遺伝子の効果を通じて相補性によって染色体内に遺伝子の複製コピーを創製するために増幅してもよい。

ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は適切なプロモーター配列に作動的に連結する。プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同のまたは異種のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子由来でもよい。アルファ‐アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向付ける典型的なプロモーターは、特に細菌の宿主において、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ、又はｃｅｌＡプロモーター、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）麦芽アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バシルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。菌における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)、アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)リパーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス ニドゥラン（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする遺伝子が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような細菌類に発現する場合、適切なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーターを含むバクテリオファージプロモーター及びファージラムダプロモーターから選択される。酵母菌で発現のために適したプロモーターの例は、サッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸｌ又はＡＯＸ２プロモーターを含むが、これらに限定されない。トリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）における発現のために、ＣＢＨＩＩ（セロビオヒドロラーゼ ＩＩ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＩＩ））プロモーターを用いてよい。

発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結するポリアデニル化配列を含んでもよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に、しかし必ずではないが、由来してもよい。

さらに、ベクターは宿主細胞でベクターが複製可能なＤＮＡ配列でもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＣａｔＨ（図４、ジェネンコア インターナショナル社（Genencor International, Inc.））ｐＨＰＬＴ、及びｐＩＪ７０２の複製の原型や当業者が周知の必須要素から構築されるベクターである。

ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。例えば、バシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ｄａｌ遺伝子のような、単離される宿主細胞中の欠点を補完する遺伝子産物、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を有する遺伝子である。さらに、ベクターは、ハイグロマイシン耐性を増加するマーカーで、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｘｘｓＣのようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカーを含んでよく、選択は、周知の技術のような同時形質転換によって行われてよい。例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１７２４３を参照願いたい。

例えば、ある細菌又は菌類を宿主細胞として用いる場合、細胞外発現又は固形発酵がある点では有利であるので、一般的に酵素の発現は細胞外及び培養培地である。一般的に本明細書にて記載するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼおよびその変異体は、培地への発現酵素の分泌を可能とするシグナルポリペプチド型を含む。必要ならば、シグナルポリペプチドを、個別のシグナルポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の置換によって便利に行われる異なる配列により置換してもよい。一般的にシグナルポリペプチドは、３つの領域、Ｎ‐末端領域、Ｈ‐領域、及びＣ‐末端領域及び通常１８から３５残基の範囲の長さで特徴づけられる。これらは任意の野生型シグナルアルファ‐アミラーゼ又は細菌類又は真核細胞由来の他の分泌蛋白質由来でもよい。

発現ベクターは、例えば、選択宿主生物中ベクターの自律複製を可能とする要素及び選択目的に対して表現的に検出可能な一以上のマーカーのようなクローニングベクターの成分を一般的に含む。発現ベクターは通常プロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意的に、抑制遺伝子又は一以上の活性化遺伝子のような、ヌクレオチド制御配列を通常含む。一般的に、容易に酵素を回収し、及び該当する場合、精製するために用いるすべてのシグナル配列は細胞培養培地への原料に標的を絞る。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の必要な要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築体をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、 ２ｎｄ ｅｄ．, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９、 ａｎｄ ３^ｒｄ ｅｄ．，２００１を参照）。

ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含む単離される細胞は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の組み換えの生産における宿主細胞として有効に用いられる。宿主染色体にＤＮＡ構築体（一以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、細胞は変異体をコードするＤＮＡ構築体で形質転換される。ＤＮＡ配列が細胞で安定的に維持される可能性が高い場合、この組み込みは有効であると一般的に考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型では上述のように発現ベクターで形質転換されてもよい。

適切な細菌宿主生物の例は、バシルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）バシルス ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バシルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及び バシルス ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むバシラス属（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）; ストレプトミセス ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）のようなストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種;ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のようなラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）；ラクトバシルス ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバシルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ.）リューコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ.）ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）を含む乳酸菌属;及びストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）のようなグラム陽性細菌種である。あるいは、グラム陰性菌種の菌は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を含むエンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属する。適切な酵母宿主生物は、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ.）ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ.）、又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィニア（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）、又はサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種または、例えばシゾサッカロミセス ポンベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）種のようなシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種のようなバイオテクノロジー的に関係のある酵母の種から選択されてよいが、これらに限定されない。メタノール資化酵母である、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の菌株を宿主生物として用いてよい。あるいは、宿主生物は、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種でもよい。糸状菌の間で適切な宿主生物は、例えば、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、又はアスペルギルス ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種を含む。あるいは、例えばフザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のようなフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の菌株又はリゾムコール ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のようなリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種の菌株が宿主生物として用いられる。他の適切な菌株はテルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）種を含む。

典型的な酵母の種は、例えばサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種を含む。糸状菌は、例えば、アスペルギルス オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種に有利に属する。菌細胞をプロトプラスト形成及びそれ自体知られている方法の細胞壁の再生を伴うプロトプラストの形質転換／トランスフェクションを含むプロセスにより形質転換してよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、ＥＰ２３８０２３の記載を含む。

さらなる実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を生産する方法は、変異体の生産をもたらす条件下、上述のように、宿主細胞を培養すること細胞及び／又は培養培地から変異体を回収する方法を含んでいる。

細胞を培養のために用いる培地は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の発現が得られ、問題となる宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。適切な培地及び培地成分は業者（例えばＤｉｆｃｏ（商標））から入手可能であり、又は出版された手順（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（the Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載された手順）に従って調製してもよい。用いる培地は用いる宿主細胞に最も適するものである。例えば、バシルス リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）培養について下記に述べる培地である。この場合培養培地は、ナトリウム、カリウム、リン酸、マグネシウム及び硫酸の供給源や微量元素の供給源としての無機塩を伴う有機化合物の供給源として浸トウモロコシ固体及び大豆粉からなってよい。また、一般的にグルコースのような炭水化物供給源は初期の培地の一部である。一度培養がそれ自身で確立し、培養が開始すると、炭水化物は、周知の技術により、培養を維持するためタンクで測定される。例えば、比色分析法を用いて酵素の力価を測定するために一定間隔で発酵槽からサンプルを採集する。酵素生産速度が測定に従って増加が止まる時発酵プロセスは中止される。

宿主細胞から分泌されるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地の蛋白質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、又はそれと類似のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。

宿主細胞を、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現させる適切な条件下にて培養してよい。蛋白質の発現は、酵素が連続的に生産されるように、又は発現開始のため刺激を誘導するように構成してもよい。誘導発現の場合、例えば、蛋白質の生産は、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はセファロースのような誘導物質が、培養培地へ添加されることによって要求されるとき、開始される。また、ポリペプチドを、ＴｎＴ（商標）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））ウサギ網赤血球システムのようなインビトロ、無細胞システムで組み換え的に生産できる。

また、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現する宿主を好気状態の下、宿主に適切な培地で培養する。振盪及び攪拌と給気の組み合わせを、例えば、約３０℃から約７５℃のような宿主の必要とする条件及び所望の酵素の生産に応じた宿主の適切な温度で生産が得られるように提供する。培養は、約１２から約１００時間（及びそれらの間任意の時間）またはそれ以上又は例えば２４から７２時間、あるいは、７５から約１２０時間まで行う。典型的に、培養培地は、酵素の生産に関与する宿主の必要とする培養条件に応じて、再びｐＨ約５．５から約８．０とする。

活性測定用の試験は周知である。例えば、U.S. Patent No. 6,297,037を参照願いたい。例えば、変異体の活性を測定するために可溶性基質試験を実施できる。例えば、これはMegazyme(Aust.) Pty. Ltdにより供給されるエンドポイント試験キットに基づいて開発される速度試験を用いて実施される。基質（ｐ−ニトロフェニル マルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）、BPNPG7）を１０ｍＬの滅菌水に溶解し、引き続き、試験用緩衝液(50 mM マレイン酸エステル緩衝液pH 6.7、5 mM塩化カルシウム、0.002% Tween 20)に１から４倍に希釈する。試験を２５℃でキュベット中に１０μＬのアルファ‐アミラーゼを７９０μＬの基質に添加することにより実施する。７５秒遅れて、加水分解速度を４１０ｎｍで吸収の変化速度として測定する。一般的に試験は０．４吸収ｕｎｉｔ／ｍｉｎの速度まで直線状である。例えば、酵素濃度をM. Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976)の方法に基づき及びウシ血清アルブミン標準曲線を用いてBio-Rad assay (Bio-Rad Laboratories) 測定できる。

変異体活性を評価するために実施する別の試験はデンプン加水分解試験である。例えば、これは次に用に行う。Spezyme（商標）AA20のアルファ‐アミラーゼ活性を試験するための標準的な方法を用いることができ、又は他の代替的な周知の方法でもよい。Spezyme（商標）AA20試験は、参照により本明細書に取り込まれるU.S. Application No. 07/785,624の実施例１の実験例に記載される。天然デンプンはヨウ素で青色となるが、短いデキストリン分子に加水分解されるとそうならない。基質はリン酸緩衝液、pH 6.2 (42.5 gm/literリン酸２水素カリウム、3.16 gm/liter水酸化ナトリウム) に5 g/Lリントナー（Lintner）デンプンを溶解する。サンプルに２５ｍＭ塩化カルシウムを加え、３０℃でインキュベーション中陰性よう素テスト与える時間として活性を測定する。活性は、次の式に従って計算されるｌｉｑｕｅｆｏｎｓ／ｇｒａｍ又はｍＬ（ＬＵ）として記録される。

ＬＵ／ｍＬ又はＬＵ／ｇ＝（５７０） Ｘ Ｄ
Ｖｘｔ
ここでＬＵ＝ｌｉｑｕｅｆｏｎ ｕｎｉｔ；Ｖ＝サンプル体積（５ｍＬ）；ｔ＝デキストリニゼーション（dextrinization）（分）；Ｄ＝希釈ファクター＝希釈体積／添加酵素のｍＬ又はｇ。

４．アルファ‐アミラーゼ変異体の精製
発酵、分離、及び濃縮方法は周知であり、溶液を含む濃縮バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を調製するために従来の方法を用いてよい。

発酵後、発酵培地を得て、原発酵材料残渣を含む微生物細胞及び種々の懸濁した固体物は、溶液含有酵素を得るために従来の分離方法によって除かる。アミラーゼ溶液を得る。ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、抽出、又はクロマトグラフィー、又は同類の方法が、一般的に用いられる。

回収の最適化を図るために溶液を含む酵素を濃縮することが望ましい。非濃縮溶液を使用すると、沈殿を含む精製酵素を集めるためにインキュベーション時間の増加が必要となる。

所望の酵素レベルが得られるまで、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含む溶液を従来の濃縮方法を用いて濃縮する。例えば、酵素含有溶液の濃縮は本明細書に記載される任意の方法により行うことができる。例えば、回転式真空ろ過及び／又は限外ろ過又は限外ろ過単独を用いることができる。

精製の目的において「沈殿剤」は、濃縮酵素溶液からバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を、自然の形は結晶、非結晶、これらの両者の混合のいずれでもよい固体形態で沈殿するために効果的な化合物を意味する。

沈殿は例えば、金属ハロゲン沈殿剤を用いて行われる。金属ハロゲン沈殿剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含むがこれらに限定されない。典型的な金属ハロゲン化物は塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含む。又は、金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムの中から選択できる。塩化ナトリウムは金属ハロゲン沈殿剤及び保存料として両方に用いられる。

金属ハロゲン沈殿剤はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を沈殿するために効果的な量を用いる。少なくとも、効果的な量及び酵素の沈殿をさせるのに効果的な金属ハロゲン化物の最適量の選択も、インキュベーション時間、ｐＨ、温度、及び酵素の濃度を含む最大量の回収のための沈殿条件も、通常の試験後、当業者にとって容易に明らかである。

一般的に金属ハロゲン化物の少なくとも約５％ｗ／ｖ（重量／体積）から約２５％ｗ／ｖが濃縮酵素溶液に添加され、通常少なくとも８％ｗ／ｖである。一般的に、約２５％ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加され、普通約２０％ｗ／ｖ以下である。金属ハロゲン沈殿剤の最適濃度は他の間ではバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ変異体の性質及びその濃度によって決まる。

酵素の効果的な沈殿の別の代替方法は濃縮酵素溶液に添加できる有機化合物を用いることである。有機化合物沈殿剤は４‐ヒドロキシ安息香酸、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合を含む。前記有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン沈殿剤の添加、及び有機化合物及び金属ハロゲン化物の両者の沈殿剤の添加の前に、同時に、又は続いて行うことが可能であり、それは、連続、又は同時に行われてもよい。

さらなる記載は、例えば、米国特許第５、２８１、５２６を参照願いたい。一般的に、有機沈殿剤は、ナトリウム又はカリウム塩、及び４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖のようなアルキルエステルであって、ここでアルキル基は１から１２の炭素原子を含み、二以上のこれらの有機化合物の混合のような４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される。例えば、有機化合物沈殿剤は、４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は１から１０炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。例えば、有機化合物沈殿剤は、４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は１から６炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合もまた用いることができる。またさらなる有機化合物は４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル（メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）と名づける）、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル（プロピルパラベン（ｐｒｏｐｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）と名づける）を含むがこれらに限定されない。この両者はアミラーゼ保存剤でもある。

有機化合物沈殿剤の添加によって、ｐＨ、温度、酵素の濃縮、沈殿剤の濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に対して高い柔軟性という有益性をもたらす。

有機化合物沈殿剤は金属ハロゲン沈殿剤の手段により酵素の沈殿を改善するのに効果的な量を用いる。有機化合物沈殿剤の少なくとも効果的な量及び最適量の選択も、インキュベーション時間、ｐＨ、温度、及び酵素の濃度を含む最大回収のための沈殿条件の選択も、規定の試験後、本発明の開示の点から、当業者に容易に明らかとなる。

一般的に少なくとも約０．０１％ｗ／ｖ（重量／体積）の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素の種々の溶液に加えられ、通常少なくとも約０．０２％ｗ／ｖである。一般的に、約０．３％ｗ／ｖ（重量／体積）以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素溶液に加えられ、通常約０．２％ｗ／ｖ以下である。

濃縮酵素溶液は、金属ハロゲン沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有し、精製すべき酵素に応じて、必要があれば、ｐＨを調製してもよい。一般的にｐＨはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アミラーゼ又はその変異体の等電点に近いレベルに調整する。一般的に、ｐＨは、等電点（ｐＩ）下約２．５ｐＨから等電点の上２．５ｐＨまでの範囲のｐＨに調整する。説明の目的のために、濃縮酵素溶液を約５．５及び９．７の間のｐＨ又は約６．５及び９．０の間のｐＨに調整できる。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に対するｐＨの変化は同様に調整できる。

精製酵素沈殿を得るために必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質、酵素濃度、及び特定の沈殿剤とその濃度によって決まる。一般的に酵素を沈殿するのに効果的な時間は約１時間から３０時間の間である。通常、約２５時間を超えない。有機化合物沈殿剤存在下、インキュベーション時間は、約１０時間以下に減少し、多くの場合は約６時間である。

一般的に、インキュベーション間の温度は約４℃から約５０℃の間である。通常、その方法は、例えば、約１０℃と４５℃又は約２０℃と約４０℃の間の温度で行う。沈殿を誘発する最適温度は溶液条件、酵素又は用いた沈殿剤に応じて変化する。

精製酵素沈殿の全量回収、及び実施過程での効率は酵素、添加金属ハロゲン化物及び添加有機化合物含有溶液を攪拌によって改善される。攪拌段階は金属ハロゲン化物と有機化合物両方の添加の間及びその後のインキュベーションの間に行われる。適切な攪拌方法は機械的な攪拌、振盪、激しい給気、又は任意の同様な方法を含む。

インキュベーション期間を終えて、精製酵素を、解離色素と他の不純物から分離され、ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、加圧ろ過、クロスメンブラン（ｃｒｏｓｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）マイクロろ過、クロスフローメンブラン（ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｍｅｍｂｒａｎｅ）マイクロろ過、又は同様のもののような、従来の分離方法により集める。さらに、精製酵素沈殿物の精製は水で沈殿物を洗浄することで得られる。例えば、精製酵素沈殿物を金属ハロゲン沈殿剤含有水で、又は金属ハロゲン及び有機化合物沈殿剤含有水で洗浄する。

発酵の間アルファ‐アミラーゼは培養培地中細胞外に蓄積する。所望のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の単離及び精製のために、培養培地は細胞を除くために、遠心分離又はろ過され、得られた細胞のない溶液は酵素精製のために用いる。ある実施態様おいては、細胞のない溶液で約７０％飽和硫酸アンモニウムを用いる塩析を行う。それから、７０％飽和沈殿分画を緩衝液に溶解し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ)Ｇ−１００カラムのようなカラムにて処理し、酵素活性分画を回収するために溶出する。さらに、精製のために、イオン交換クロマトグラフィーのような従来の方法が用いられてよい。あるいは、ろ過又は遠心分離によって細胞又は細胞くずを除くために有機凝集剤を細胞又は細胞くずを凝集するために用いる。凝集剤を単独で又は金属ハロゲン化物と組み合わせて又は本明細書に記載する任意の方法で用いてよい。一般的に、酵素濃度は適用に応じて４ｇ／Ｌ以上のオーダーであり、特定の適用にあっては２５ｇ／Ｌ以上である。

精製酵素は酵素が一般的に利用されるすべての適用に有用である。例えば、洗濯洗剤及び染み取り剤中に、食品業界にて、デンプン処理及びパンの焼成、及び消化剤として薬品組成物中に用いられる。それらは、液体（液状、スラリー）又は固体（粒状、粉状）のいずれかで最終製品に用いられてよい。精製バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の製剤処方を本明細書にて記載する。

すなわち、酵素は一般的に本明細書に記載のように部分的に精製してよい。これはポリマーを用いる凝集により又は濃縮、膜及び入手可能な材料を用いる限外ろ過により細胞を除くことからなる。いくつかの適用のために、酵素を精製する必要はなく、培養培地全体を溶解しさらなる処置なしで用い又は粒子又は微粒子に処理してよい。

５．洗浄及び食器洗浄組成物及び使用
本明細書に記載されるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を食器の洗浄における使用のための洗剤組成物又は他の洗浄組成物のための洗剤組成物中に製剤設計する。これらは粉又は液体でよい。例えば、組成物は粒子又は微粒子の形態である。さらに、ポリペプチドを周知の方法に従って安定化する。組成物はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を単独、他の蛋白質分解酵素、他の洗浄酵素、及び洗浄組成物と共通する他の成分を含んでよい。

組成物は、主要な酵素成分、例えば、単一成分組成物として、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような複合酵素活性を含んでもよい。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌（Ａ． ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）を含む。フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属の典型的な仲間はフミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を含む。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス（Ｆ． ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム セレアリス（Ｆ． ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロオクウェレンセ（Ｆ． ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモルム（Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム グラミナム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆ． ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネガンディニス（Ｆ． ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）, フザリウム レティクラタム（Ｆ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆ． ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サンブシヌム（Ｆ． ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆ． ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スルフリューム（Ｆ． ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルローサム（Ｆ． ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム トリコテキオイデス（Ｆ． ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム ベネナツム（Ｆ． ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。

すなわち、食器洗浄洗剤組成物は界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオン又はこれらのタイプの混合でよい。洗剤は、低から非発泡エトキシレートポリオキシレート直鎖アルコールのような０％から約９０％の非イオン界面活性剤を含むことができる。

洗剤の適用において、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、プロピレングリコールを含む水溶性組成物中に用いてよい。例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を１０％塩化カルシウム含有２５％体積／体積プロピレングリコール溶液中に循環することによってプロピレングリコールに溶解する。

洗剤組成物は無機及び／又は有機タイプの洗剤ビルダー塩を含んでよい。洗剤ビルダーは、リン酸を含む及びリン酸を含まないタイプに細分化される。洗剤組成物は通常約１％から約９０％の洗剤ビルダーを含む。リン酸を含む無機アルカリ性洗剤ビルダーの例は、本発明の場合、水溶性塩、特に、アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、及びポリリン酸塩を含む。リン酸を含む有機アルカリ性洗剤ビルダーの例は、本発明の場合、ホスホン酸塩の水溶性塩である。リン酸を含まない無機ビルダーの例は、本発明の場合、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸、及びケイ酸塩も非水溶性結晶又はゼオライトがよく知られている典型例であるが、非結晶性のアルミノケイ酸塩をも含む。

適切な有機ビルダーの例はアルカリ金属、アンモニウムや置換アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩、及びポリヒドロキシスルホン酸塩を含む。

他の適切な有機ビルダーは、ビルダーの特徴を有している周知の高分子量ポリマーとコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル／ポリマレイン酸コポリマー及びそれらの塩を含む。

洗浄組成物は塩素／ホウ素タイプ又は酸素タイプの漂白剤を含んでもよい。無機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム、又はカルシウム次亜塩素酸塩、及び次亜臭素酸塩も塩化リン酸三ナトリウムもある。有機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸、及びジクロロイソシアヌル酸、及びカリウム及びナトリウムのような水溶性陽イオンを伴うそれらの塩のような複素環Ｎ‐ブロモ‐及びＮ‐クロロ‐イミド類である。ヒダントイン化合物もまた有用である。

洗浄組成物は酸素漂白剤を含み、例えば、無機過酸基塩（ｐｅｒｓａｌｔ）の形態、さらに、任意に漂白前駆体又は過酸化合物としての漂白前駆体を含む。一般的な、適切な過酸漂白化合物の例は、アルカリ金属過ホウ酸塩、四水和物及び一水和物の両方、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩、及び過リン酸塩である。典型的な活性原料はＴＡＥＤ及びグリセロールトリアセテートを含む。

洗浄組成物は、酵素に適した従来の安定化剤を用いて安定化してよく、例えば、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）である。

また、洗浄組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、解膠剤、賦形剤、泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗泥再堆積剤、脱水剤、染料、抗菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料を含んでよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体が例えば任意のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ由来の単一配列を含むことができると考えられるのでいずれかの次の特許公報に記載の任意の洗剤のような従来の食器洗浄洗剤中に用いてよいバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は例えば次の特許及び特許公報に記載されている。即ち、CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、 EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197、U.S. Patent No. 5,112,518、U.S. Patent No. 5,141,664、及びU.S. Patent No. 5,240,632である。

これらの組成物は手作業及び自動両方の食器洗浄条件で用いることができる。典型的な製剤処方は次を含むがこれらに限定されない。

１）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤０．４‐２．５％、メタケイ酸ナトリウム ０‐２０％、ソジウムヂシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）３‐２０％、３リン酸ナトリウム２０‐４０％、炭酸ナトリウム０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム２‐９％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）１‐４％、硫酸ナトリウム５‐３３％及び酵素０．０００１‐０．１％。

２）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤(例アルコールエトキシレート)１‐２％、 ソジウムヂシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）２‐３０％、炭酸ナトリウム１０‐５０％、リン酸ナトリウム０‐５％、クエン酸３ナトリウム２水和９‐３０％、ニトリロトリソジウム酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）（ＮＴＡ）０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム一水和物５‐１０％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）１‐２％、ポリアクリル酸塩ポリマー (例えば、マレイン酸／アクリル酸６‐２５％コポリマー)、酵素 ０．０００１‐０．１％、香料０．１‐０．５％、及び水５％‐１０％。

３）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤(例アルコールエトキシレート)１‐２％、 ソジウムヂシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）２‐３０％、炭酸ナトリウム１０‐５０％、リン酸ナトリウム０‐５％、クエン酸３ナトリウム２水和９‐３０％、ニトリロトリソジウム酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）（ＮＴＡ）０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム一水和物５‐１０％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、１‐２％ ポリアクリル酸塩ポリマー (例えば、マレイン酸／アクリル酸６‐２５％cコポリマー)、酵素 ０．０００１‐０．１％、香料０．１‐０．５％、及び水５％‐１０％。

４）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤１‐２％、ゼオライト ＭＡＰ１５‐４２％、ソジウムヂシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）３０‐３４％、クエン酸ナトリウム０‐１２％、炭酸ナトリウム０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム一水和物７‐１５％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐３％、ポリマー０‐４％、 マレイン酸／アクリル酸コポリマー０‐５％、有機ホスホン酸塩（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）０‐４％、泥１‐２％、酵素０．０００１‐０．１％、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。

５）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤１‐２％、ゼオライト ＭＡＰ１５‐４２％、ソジウムジシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）３０‐３４％、クエン酸ナトリウム０‐１２％、炭酸ナトリウム０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム一水和物７‐１５％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐３％、ポリマー０‐４％、 マレイン酸／アクリル酸コポリマー０‐５％、有機ホスホン酸塩（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）０‐４％、泥１‐２％、酵素０．０００１‐０．１％、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。

６）粉状自動食器洗浄組成物：非イオン界面活性剤１‐２％、ゼオライト ＭＡＰ１５‐４２％、ソジウムジシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）３０‐３４％、クエン酸ナトリウム０‐１２％、炭酸ナトリウム０‐２０％、過ホウ酸ナトリウム一水和物７‐１５％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐３％、ポリマー０‐４％、 マレイン酸／アクリル酸コポリマー０‐５％、有機ホスホン酸塩（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）０‐４％、泥１‐２％、酵素０．０００１‐０．１％、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。

７）非水溶性液状自動食器洗浄組成物：液状非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）２．０‐１０．０％、アルカリ金属ケイ酸塩３．０‐１５．０％、アルカリ金属リン酸塩 ２０．０‐４０．０％、高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリグリコールから選択される液状担体２５．０‐４５．０％、ポリオキシド、グリコールエーテル安定剤(例えば、リン酸エステルの一部及び０．５‐７．０％Ｃ_１６−Ｃ_１８アルカノール)、泡抑制剤(例えば、シリコーン) ０‐１．５％及び酵素０．０００１‐０．１％。

８）非水溶性液状食器洗浄組成物：液状非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）２．０‐４０．０％、ケイ酸ナトリウム３．０‐１５．０％、アルカリ金属炭酸塩７．０‐２０．０％、クエン酸ナトリウム０．０‐１．５％、 、安定化システム(例えば、微粉化０．５‐７．０％シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合)低分子量ポリアクリレートポリマー５．０‐１５．０％、粘度ゲル増粘剤（ｃｌａｙ ｇｅｌ ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）(例えば、ベントナイト)０．０‐１０．０％、ヒドロキシプロピルセルロースポリマー（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）０．０‐０．６％、酵素０．０００１‐０．１％、及び高グリコール（ｈｉｇｈｅｒ ｇｌｙｃｏｌｓ）、ポリ‐バランスグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエーテルから選択される液状担体。

９）非水溶性液状食器洗浄組成物：液状非イオン界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）２．０‐４０．０％、ケイ酸ナトリウム３．０‐１５．０％、アルカリ金属炭酸塩７．０‐２０．０％、クエン酸ナトリウム０．０‐１．５％、 、安定化システム(例えば、微粉化０．５‐７．０％シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合)低分子量ポリアクリレートポリマー５．０‐１５．０％、粘度ゲル増粘剤（ｃｌａｙ ｇｅｌ ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）(例えば、ベントナイト)０．０‐１０．０％、ヒドロキシプロピルセルロースポリマー（hydroxypropyl cellulose polymer）０．０‐０．６％、酵素０．０００１‐０．１％、及び高グリコール（higher glycols）、ポリ‐バランスグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエーテルから選択される液状担体。

１０）液状自動食器洗浄組成物：アルコールエトキシレート０‐２０％、脂肪酸エステルスルホン酸塩０‐３０％、ドデシル硫酸ナトリウム０‐２０％、アルキル ポリグリコシド０‐２１％、オレイン酸０‐１０％、ソジウムジシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）一水和物１８‐３３％、クエン酸ナトリウム二水和物１８‐３３％、ステアリン酸ナトリウム０‐２．５％、過ホウ酸ナトリウム一水和物０‐１３％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐８％、 マレイン酸／アクリル酸コポリマー４‐８％、及び酵素０．０００１‐０．１％。

１１）液状自動食器洗浄組成物：アルコールエトキシレート０‐２０％、脂肪酸エステルスルホン酸塩０‐３０％、ドデシル硫酸ナトリウム０‐２０％、アルキル ポリグリコシド０‐２１％オレイン酸０‐１０％、ソジウムジシリケート（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅ）一水和物１８‐３３％、クエン酸ナトリウム二水和物１８‐３３％、ステアリン酸ナトリウム０‐２．５％、過ホウ酸ナトリウム一水和物０‐１３％、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）０‐８％、 マレイン酸／アクリル酸コポリマー４‐８％、及び酵素０．０００１‐０．１％。

１２）過ホウ酸が過炭酸塩によって置き換えられる１）、２）、３）、４）、６）及び１０）記載の自動食器組成物。

１３）さらにマンガン触媒を含む１）‐６）に記載の自動食器洗浄組成物。

６．洗濯洗剤組成物及び使用
実施態様によれば、一以上のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、一般的に、洗濯洗剤組成物の成分としてよい。そのような場合、非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、安定化した液体、又は保護された酵素の形態での洗浄組成物を含んでもよい。ドライ用の製剤は粒子又は微粒子の形態でもよい。非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子は例えば米国特許第４，１０６，９９１、及び４，６６１，４５２に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。ワックスのコーティング原料の例は、平均分子量１、０００から２０、０００であるポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子及び１５から８０のエチレンオキシド単位を含有するアルコールであるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、モノ、ジ、トリグリセリドの脂肪酸である。流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばＧＢ １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製は、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。他の酵素の安定化剤は周知の技術である。被保護酵素を例えばＥＰ Ａｐｐｌｎ．２３８、２１６に記載される方法に従って調製してよい。ポリオールは蛋白質の安定化剤としても、蛋白質溶解性の改善としても長い間認められている。例えば、Ｊ． Ｋ． Ｋａｕｓｈｉｋ他、「Ｗｈｙ ｉｓ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ?」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： ２６４５８−６５ （２００３）及び そこに引用されている文献Ｍｏｎｉｃａ Ｃｏｎｔｉ他、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ： ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ７５７： ２３７−２４５ （１９９７）を参照願いたい。

組成物は、主要な酵素成分、例えば、単一成分組成物として、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような複合酵素活性も以下に記載の他の酵素も含んでもよい。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（例、フミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ））及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス（Ｆ． ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅ）、フザリウム セレアリス（Ｆ． ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロオクウェレンセ（Ｆ． ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモルム（Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム グラミナム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆ． ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネガンディニス（Ｆ． ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）, フザリウム レティクラタム（Ｆ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆ． ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サンブシヌム（Ｆ． ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆ． ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スルフリューム（Ｆ． ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルローサム（Ｆ． ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム トリコテキオイデス（Ｆ． ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム ベネナツム（Ｆ． ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）。

洗剤組成物は例えば、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。一般的に、液体洗剤は、最大約７０％の水及び０％から約３０％の有機溶剤を含有する液体でよい。また、約３０％の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態でもよい。酵素は酵素の安定性に適合する任意の洗剤組成物を用いてよい。一般的に、酵素は、カプセル化という周知の形態によって有害な成分から保護される。例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。酵素及び特定のアルファ‐アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄に適用に限定されず、また、表面洗浄剤、デンプン又はバイオマスからのエタノール産物でも用いられる。

洗剤組成物は一以上のそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンである界面活性剤を含む。洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＬＡＳ）、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）(脂肪アルコール硫酸塩（ｆａｔｔｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｕｌｆａｔｅ）)（ＡＳ）、アルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）第二級アルカンスルホネート（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）（ＳＡＳ）、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル（α‐ｓｕｌｆｏ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）、アルキル‐又はアルケニルコハク酸（ａｌｋｙｌ‐ ｏｒ ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）又は石鹸のような０％から５０％の陰イオン界面活性剤を含む。また、組成物は、アルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ） （ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコール エトキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、ノニルフェノールエトキシレート（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、アルキルポリグリコシド（ａｌｋｙｌｐｏｌｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）, アルキルジメチルアミンオキシド（ａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｏｘｉｄｅ）、 エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、脂肪酸モノエタノールアミド（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋｙｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｍｉｄｅ） (例えばＷＯ ９２／０６１５４に記載されるように)のような０％から約４０％の非イオン界面活性剤を含んでもよい。

さらに、洗剤組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又は任意の組み合わせのラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。

洗剤は、任意に、約１％から約６５％の洗剤ビルダー又はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例えば、ヘキストからＳＫＳ−６）のような錯化剤を含んでよい。また、洗剤は、アンビルト（ｕｎｂｕｉｌｔ）でもよい。言い換えると、本質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。

洗剤は、任意に、一以上のポリマーを含んでよい。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル アルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。

洗剤は、任意に、漂白システムを含んでよく、それは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と結合する過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなＨ_２Ｏ_２供給源を含む。あるいは、漂白システムは、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでよい。また、漂白システムは、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ ２００５／０５６７８３に記載されるような、ペルヒドロラーゼが過酸を活性化する酵素的漂白システムでもよい。

洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が例えばＷＯ ９２／１９７０９及びＷＯ ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてもよい。

また、洗剤は、泥、発泡剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗汚染剤、染料、抗菌剤、曇り防止剤、蛍光増白剤、又は香料を含む例えば繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。

ｐＨ（用いる濃度での水溶液で測定）は通常中性又はｐＨ約７．０から約１１．０のアルカリ性である。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有洗剤組成物の特定の形態は次を含むように製剤設計される。

１）約７％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１８}アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１６−１８}）、約５％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１４−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約２から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約１５％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約６％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７／Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、約１１％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約６％のＴＡＥＤ、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

２）約６％から約１１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約３％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１８}アルコール、１−２ＥＯ）、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１６−１８}）、約５％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１４−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１５％から約２１％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２４％から約３４％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約４％から約１０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７／Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−６％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗浄組成物。

３）約５％から約９％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約７％から約１４％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１から約３％脂肪酸（例、Ｃ_{１６−２２}脂肪酸）としての石鹸、約１０％から約１７％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約３％から約９％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２３％から約３３％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約４％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約８％から約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約１％のホスホン酸塩（例、ＥＤＴＭＰＡ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

４）約８％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１０％から約２５％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ_２ＣＯ_３として）、約１％から約５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２５％から約３５％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約１０％の硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

５）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１２％から約１８％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１３％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、０％から約１３％のアルケニルコハク酸（ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｃ_{１２−１４}）、約８％から約１８％のアミノエタノール、約２％から約８％のクエン酸、０％から約３％のホスホン酸塩、０から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０から約３％のエタノール、約８％から約１４％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

６）約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、３−９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１０％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、約１４％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約９％から約１８％のクエン酸カリウム、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０から約３％の例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、分子量３８００のような固着用ポリマー、０％から約５％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む液体洗剤組成物を製剤設計する水溶液。

７）約５％から約１０％の脂肪アルコール硫酸塩、約３％から約９％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０−３％脂肪酸としての石鹸、約５％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約２０％から約４０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約２％から約８％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約１２％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約２％から約７％のＴＡＥＤ、約１％から約５％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、石鹸泡抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

８）約８％から約１４％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約５％から約１１％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０％から約３％脂肪酸としての石鹸、約４％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約３０％から約５０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約３％から約１１％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約５％から約１２％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７）、約１％から約５％のポリマー（例、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、石鹸泡抑制剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。

９）約６％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％の非イオン界面活性剤、約２％から約６％脂肪酸としての石鹸、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約１８％から約３２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約５％から約２０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約３％から約８％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ_６Ｈ_５Ｎａ_３Ｏ_７）、約４％から約９％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約１％から約５％の漂白活性剤（例、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、約１％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＥＧ）、 ０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１０）約１５％から約２３％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約８％から約１５％のアルコール エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、２−３ＥＯ）、約３％から約９％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、０％から約３％脂肪酸（例、ラウリン酸）としての石鹸、約１％から約５％のアミノエタノール、約５％から約１０％のクエン酸ナトリウム、約２％から約６％のハイドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）（例トルエンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、約１％から約３％のエタノール、約２％から約５％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１１）約２０％から約３２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、６−１２％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ_{１２−１５}アルコール、７ＥＯ又はＣ_{１２−１５}アルコール、５ＥＯ）、約２％から約６％のアミノエタノール、約８％から約１４％のクエン酸、約１％から約３％のホウ酸塩（Ｂ_４Ｏ_７）、０％から約３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー）、約３％から約８％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。

１２）約２５％から約４０％の陰イオン界面活性剤（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸）、約１％から約１０％の非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）、約８％から約２５％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、約５％から約１５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、０％から約５％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ_２ＳＯ_４）、約１５％から約２８％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、０％から約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、０％から約５％の漂白活性剤（例、ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−３％の少量の成分（例、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１３）上記組成物１）−１２）に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキルスルホン酸塩により置換される洗剤組成物。

１４）約９％から約１５％の（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキルスルホン酸塩、約３％から約６％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ ａｌｋｙｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｍｉｄｅ）、約１０％から約２０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ_４）、約１０％から約２０％層状ジケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（ヘキストからＳＫ５６）、約３％から約１２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、０％から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約４％から約８％のクエン酸ナトリウム、１３％から約２２％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ_３Ｈ_２Ｏ）、約３％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、光退色、香料、石鹸泡抑制剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１５）約４％から約８％の（Ｃ_１２−Ｃ_１８）アルキル硫酸塩、約１１％から約１５％のアルコール エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約４％の石鹸、約３５％から約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ、約２％から約８％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ_２ＣＯ_３）、０％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ_２Ｏ, ２ＳｉＯ_２）、約１３％から約２２％の過炭酸ナトリウム、１―８％のＴＡＥＤ、０％から約３％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０％から約３％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−３％の少量の成分（例、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。

１６）追加的成分か又はすでに特定された漂白系に置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述１）から１５）に記載の洗剤製剤。

１７）過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、１）、３）、７）、９）、及び１２）に上述するような洗剤製剤。

１８）マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に上述するような洗剤製剤。例えば、該マンガン触媒は、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ‐ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６３７‐６３９ （１９９４）に記載の化合物の一つである。

１９）例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダーシステム（例、リン酸塩）、酵素、及びアルカリのような液体非イオン界面活性剤を含む非水性洗剤液として製剤設計される洗剤組成物。洗剤は陰イオン界面活性剤及び／又は漂白システムを含んでもよい。

２０）Ａ）陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤、両性イオン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）界面活性剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つ界面活性剤、Ｂ）シリコン材料の混合物の液滴であって、ｉ）機能性ポリシロキサン材料を含むアミン又はアンモニウム基であり、ａ）生産される機能性ポリシロキサン材料中本質的に硬化性／反応性基を放出するプロセスにより調製され、ｂ）硬化性／反応性基を含有しないケイ素末端に対するケイ素原子含有硬化性／反応性基モル比が約３０％以下であり、ｃ）重量で約０．０５％から約０．３０％の窒素含有量を有し、ｄ）２０℃で０．００００２ｍ；２；／ｓから約０．２ｍ；２；／ｓの範囲の粘度を有するアミン又はアンモニウム基、及びｉｉ）窒素の無い、非機能性ポリシロキサン材料であって、０．０１ｍ；２；／ｓから約２．０ｍ；２；／ｓの粘度を有し及び該混合物内で機能性ポリシロキサン材料対非機能性ポリシロキサン材料の重量比が約１００：１から約１：１００の範囲で存在するポリシロキサン材料を含有するシリコン材料混合物液滴、及びＣ）色移り阻害剤、蛍光増白剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つ追加的非ケイ素洗濯添加物を含む水溶性液体洗濯洗剤組成物。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗剤中に従来使用される濃度で含まれてよい。本発明において、洗剤組成物中バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗浄液のリットル当たり０．００００１‐１．０ｍｇ（純粋酵素蛋白質として計算）に相当する量を加えることを意図する。

他の実施態様においては、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び／又は産業用の繊維／洗濯に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に用いてよい。

例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業、又は機械用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。

特定の実施態様においては、洗剤組成物はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及びプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はこれ等の組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素に加えて２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、一以上のアルファ‐アミラーゼをさらに含んでもよい。

一般的に選択される酵素の特徴は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。

プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。自然的に処理されたプロテアーゼ同様、化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。プロテアーゼはアルカリ微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼのような、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えばサブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｎｏｖｏ）、サブチリシンカールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８ (参照、例えば、ＷＯ ８９／０６２７９)のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例、豚又は牛由来の）、及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ（例えば、ＷＯ ８９／０６２７０及びＷＯ ９４／２５５８３を参照）である。また、有用なプロテアーゼの例はＷＯ ９２／１９７２９、ＷＯ ９８／２０１１５、ＷＯ ９８／２０１１６、及びＷＯ ９８／３４９４６に記載される変異体を含むが、これらに限定されない。商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はアルカラーゼ（商標）（Ａｌｃａｌａｓｅ）、サビナーゼ（商標）（Ｓａｖｉｎａｓｅ）、プリマーゼ（商標）（Ｐｒｉｍａｓｅ）、ドゥララーゼ（商標）（Ｄｕｒａｌａｓｅ）、エスペラーゼ（商標）（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）、及びカンナーゼ（商標）（Ｋａｎｎａｓｅ）(ノボ ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ)）、マキサターゼ（商標）（Ｍａｘａｔａｓｅ）、マキサカール（商標）（Ｍａｘａｃａｌ）、マキサペム（商標）（Ｍａｘａｐｅｍ）、プロペラーゼ（商標）（Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ）、プラフェクト（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ）、プラフェクトＯ_ＸＰ（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（ジェネンコ インターナショナル社 (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)）を含むが、これらに限定されない。

リパーゼ：適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、蛋白質分解的に修飾され又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、例えば、フミコーラ ラヌギノサ（Ｈ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ (Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)）（例えば、ＥＰ ２５８０６８及びＥＰ ３０５２１６を参照）由来、フミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）（例えばＷＯ ９６／１３５８０を参照）由来のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語 サーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)）由来のリパーゼ、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（例えば、シュードモナス アルカリゲネス（Ｐ． ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナス シュードアルカリゲネス（Ｐ． ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来（例えばＥＰ ２１８ ２７２を参照）、 シュードモナス セパシア（Ｐ． ｃｅｐａｃｉａ）(例えばＥＰ ３３１ ３７６を参照)、シュードモナス スタッチェリ（Ｐ． ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、ＧＢ １，３７２，０３４を参照）、シュードモナス フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の菌株ＳＤ ７０５（例えば、ＷＯ ９５／０６７２０及びＷＯ ９６／２７００２を参照）、シュードモナス ウィスコンシネンシス（Ｐ． ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＷＯ ９６／１２０１２を参照）由来）、又は バシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バシルス スブチリス由来（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）例えばＤａｒｔｏｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １１３１ ： ２５３−３６０ （１９９３）を参照）、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（例えばＪＰ ６４／７４４９９２を参照）、又はバシルス プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（例えばＷＯ ９１／１６４２２を参照）由来）を含むが、これらに限定されない。製剤設計の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体は、例えば ＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ ９４／０１５４１、ＷＯ ９５／３５３８１、ＷＯ ９６／００２９２、ＷＯ ９５／３０７４４、ＷＯ ９４／２５５７８、ＷＯ ９５／１４７８３、ＷＯ ９５／２２６１５、ＷＯ ９７／０４０７９、ＷＯ ９７／０７２０２、ＥＰ ４０７２２５、及びＥＰ ２６０１０５に記載のものも含む。商業的に入手可能なリパーゼ酵素はリポラーゼ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ）及びリポラーゼウルトラ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ^TM）（ノボ ノルディスク (Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ)）である。

ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼを組成物に含むことができる。適切なポリエステラーゼは、例えば、ＷＯ ０１／３４８９９及びＷＯ ０１／１４６２９に記載のものを含む。

アミラーゼ：組成物は、非生産増強アルファ‐アミラーゼのような他のアミラーゼとの組み合わせでもよい。これらは、デュラミル（商標）（Ｄｕｒａｍｙｌ）、ターマミル（商標）（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）、ファンガミル（商標）（Ｆｕｎｇａｍｙｌ）、及びバン（商標）（ＢＡＮ）(ノボ ノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／S)）又はラピダーゼ（商標）（Ｒａｐｉｄａｓｅ）、及びプラスター（商標）（Ｐｕｒａｓｔａｒ）（ジェネンコ インターナショナル社から(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)）のような商業的に入手可能なアミラーゼを含むがこれらに限定されない。

セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加してよい。適切なセルラーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、バシルス 属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼを含む。例えば、米国特許第４，４３５，３０７、５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、５，７７６，７５７、及び国際ＰＣＴ出願 ＷＯ ８９／０９２５９に開示されるフミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生産される菌類のセルラーゼである。一般的に使用を意図するセルラーゼは繊維に有益な色のケアを有している。そのようなセルラーゼの例は、例えば、ＥＰ ０４９５２５７、ＥＰ ０５３１３７２、ＷＯ ９６／１１２６２、ＷＯ ９６／２９３９７、及びＷＯ ９８／０８９４０に記載のセルラーゼである。他の例では、ＷＯ ９４／０７９９８、ＷＯ ９８／１２３０７、ＷＯ ９５／２４４７１、ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９、ＥＰ ５３１３１５、米国特許第５，４５７，０４６、５，６８６，５９３、及び５，７６３，２５４に記載のようなセルラーゼ変異体である。商業的に入手可能なセルラーゼはセルザイム（商標）（ｅｌｌｕｚｙｍｅ）及びケアザイム（商標）（Ｃａｒｅｚｙｍｅ）（ノボ ノルディスク (Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ)）又はクラジネース（商標）（Ｃｌａｚｉｎａｓｅ）及びプラダックス ＨＡ（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ ＨＡ）（ジェネンコ インターナショナル社 (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．)）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王社）を含む。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物での使用が意図される適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス シネレウス（Ｃ． ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のようなコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びＷＯ ９３／２４６１８、ＷＯ ９５／１０６０２、及びＷＯ ９８／１５２５７に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム（商標）（Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ）（ノボ ノルディスク (Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ)）を含む。

洗剤酵素を一以上の酵素を含む個別の添加物を加えることによって、又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。洗剤添加物、すなわち、個別の添加物又は組合せ添加物は、例えば粒子、液体、スラリー等として製剤設計される。一般的に洗剤添加物製剤は、粒子、特に非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子、液体、特に安定化液体又はスラリーを含むが、これらに限定されない。

非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒子を、米国特許第４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。ワックスコーティング材の例は、平均分子量１、０００から２０、０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティング材の例は、例えば、ＧＢ １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製は、プロピレングリコール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸のようなポリオールを確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。被保護酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って調製されてよい。

一般的に、洗剤組成物は例えば棒状、錠剤、粉、粒子、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。液体洗剤は水性、典型的には、約７０％水分まで、及び０％から約３０％の有機溶剤まで含んでよい。例えば、約３０％以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルである。

洗剤組成物は一以上の界面活性剤を含み、それは、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性イオン性を含む非イオン性でもよい。界面活性剤は一般的に、約０．１％から約６０％重量の広い範囲に存在する。

界面活性剤が含まれる場合、洗剤は通常約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコール エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。

界面活性剤を含む場合、一般的に、洗剤は約０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、 エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミン（「グルカミド」）のＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキル誘導体である。

洗剤はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例、ヘキスト社製ＳＫＳ−６）のような０％から約６５％の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよい。

洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレン グリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル アルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン‐Ｎ‐オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。

洗剤は、過酸形成漂白活性化剤（例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）と結合する過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなＨ_２Ｏ_２供給源を含む漂白システムを含んでよい。あるいは、漂白システムは、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸）を含んでよい。また、漂白システムは、酵素的漂白システムでもよい。

洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤を用いて安定化してよい。例えば、ポリオール（例、プロピレングリコール又はグリセロール）として、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例、芳香族ホウ酸エステル）、又はフェニルホウ酸誘導体（例、４−フォルミルフェニルホウ酸）である。組成物はＷＯ ９２／１９７０９及びＷＯ ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてよい。

また、洗浄組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、クレー、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、蛍光増白剤、ヒドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む布地コンディショナーンである。

洗剤組成物として、特にバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を洗浄液１リットル当たり０．０１から１００ｍｇの酵素蛋白質に相当する量を添加してよいことが本発明にて意図される。例えば、洗浄液１リットル当たり約０．０５から約５．０ｍｇの酵素蛋白質、又は洗浄液１リットル当たり約０．１から約１．０ｍｇの酵素蛋白質である。

７．方法
７．１ フィルタースクリーニング試験
下記に説明する試験を親アルファ‐アミラーゼ酵素に比してＣａ^２＋消耗条件下高い又は低いｐＨで改変される安定性を有するＡｍｙ７０７アルファ‐アミラーゼ変異体のスクリーニング中に用いてよい。

７．２ 高いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＴＹ寒天プレート上にセルロースアセテート(ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜はＴＹ寒天プレートに置かれる。

変異体を結合しているフィルター及びニトロセルロースフィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、特に、インキュベーション前であって、固定後、針で印を入れ、ｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液を有する容器へ移し、１５分間室温（１０‐６０℃変化できる）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性を１％寒天、ｐＨ８．６−１０．６のグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液中０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

７．３ 低いカルシウムフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で例えば、カナマイシン又はクロラムフェニコールのような関連抗生物質含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート (ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは特に針で印を入れ、固定化変異体を有するニトロセルロース膜をｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液及び異なるＥＤＴＡ濃度（０．００１ｍＭ‐１００ｍＭ）を有する容器へ移す。フィルターを１時間室温でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性を１％寒天、ｐＨ８．５−１０の炭酸／重炭酸緩衝液中０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

７．４ 低いｐＨフィルター試験
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーを少なくとも２１時間、３７℃で例えば、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＴＹ寒天プレート上のセルロースアセテート (ＯＥ ６７, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ, Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)及びニトロセルロースフィルター(Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５, Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ,Ｄａｓｓｅｌ, Ｇｅｒｍａｎｙ)のサンドイッチ上に固定する。セルロースアセテート膜をＴＹ寒天プレートに置く。

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは特に針で印を入れ、固定化変異体を有するニトロセルロース膜をｐＨ４．５のクエン酸を有する容器へ移し、フィルターを２０分間８０℃（野生型バックボーン中変異体をスクリーニングする場合）又は、６０分間８５℃（親型アルファ‐アミラーゼ変異体をスクリーニングする場合）でインキュベーションする。コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてＴＹプレート上に保管できる。インキュベーション後、残りの活性を１％寒天、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中０．２％デンプン含有プレートで検出する。ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、５０℃にて２時間インキュベーションする。フィルターの除去後、試験プレートを１０％ルゴール液で染色する。デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。

７．５ 第二次スクリーニング
再スクリーニング後、陽性形質転換体を保管プレートから拾い、第二次プレート試験を実施する。陽性形質転換体を５ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中３７℃で２２時間培養する。各陽性形質転換体及びコントロールとして対応するバックボーンを発現するクローンのバシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を９０℃クエン酸緩衝液ｐＨ４．５中インキュベーションし、サンプルを０、１０、２０、３０、４０、６０、及び８０分にて採取する。３マイクロリットルのサンプルを試験用プレートに付ける。試験用プレートを１０％ルゴール液で染色する。改善変異体がバックボーンより高い残留活性（試験用プレート上ハローとして検出される）を有する変異体として得らる。改善変異体はヌクレオチドスクリーニングによって決定される。

７．６ 未精製変異体の安定性試験
変異体の安定性を次のように試験できる。それは、分析すべき変異体を発現するバシルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を１０ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中３７℃２１時間で培養する。８００マイクロリットル培養物を２００マイクロリットルのクエン酸緩衝液ｐＨ４．５で混合する。サンプリング時点の数に相当する７０マイクロリットルのサンプルの一部をＰＣＲ試験管に入れ、種々の時間（一般的に５、１０、１５、２０、２５、及び３０分）７０℃又は９０℃にてインキュベーションする。０分サンプルは高い温度でインキュベーションしていない。サンプル中の活性を「アルファ‐アミラーゼ活性用試験」の下、下記に記載のように２０マイクロリットルを２００マイクロリットルのアルファ‐アミラーゼＰＮＰ−Ｇ_７基質ＭＰＲ３ ((Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ番号１６６０７３０)に移すことにより測定する。結果を時間に対して活性率（０時点と比較して）としてグラフに表す、又は特定の時間のインキュベーション後の残留活性率として表す。

７．７ アルファ‐アミラーゼ変異体の発酵及び精製
関連する発現プラスミドを保持しているバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を次のように発酵及び精製する。菌株を−８０℃にて保管される１０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩培養する。コロニーを５００ｍｌ振盪フラスコ中１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有１００ｍｌのＰＳ−１培地に移す。

ＰＳ−１培地の組成物
パールシュガー（Ｐｅａｒｌ ｓｕｇａｒ） １００ｇ／ｌ
大豆ミール（Ｓｏｙ Ｂｅａｎ Ｍｅａｌ） ４０ｇ／ｌ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１２Ｈ_２Ｏ １０ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ６１００ ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣＯ_３ ５ｇ／ｌ。

培養物を５日間２７０ｒｐｍで３７℃にて振盪培養する。

細胞及び細胞かすを２０から２５分間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより培養培地から除く。後で、完全に透明な溶液を得るために上清をろ過する。ろ過物を濃縮しＵＦ−フィルター（１００００カットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液を２０ｍＭ酢酸ｐＨ５．５に変える。ＵＦ−ろ過物をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し同じ緩衝液で０．２ＭＮａＣｌ溶出ステップを用いて溶出を行う。溶出物を１０ｍＭトリスｐＨ９．０にて透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に注入し６カラム体積以上、０から０．３ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出する。活性（ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験により測定）を含む分画を集め、ｐＨをｐＨ７．５に調整し、着色を５分間、０．５％Ｗ／ｖｏｌの活性炭素で処理することにより除く。

７．８ 特異的活性の検出
特異的活性を活性／ｍｇ酵素（ａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ）としてファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標）試験(ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ)）を用いて検出する。取扱説明書は次に示す（また下記「アルファ‐アミラーゼ活性試験」を参照）。

７．９ 等電点の検出
ｐＩを等電点電気泳動法 (例：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ，ｐＨ ３．５−９．３)にて検出する。

７．１０ 促進される安定性試験
５０ｍｌのプロプレン試験管に、１０ｍｌの対象となる洗剤を加えた。適切な希釈をＡｍｙ７０７ｔ及びＡｍｙ７０７ｔΔＲＳ両者に行い、各１８０ｐｐｍをピペットで洗剤を含む別々の試験管に移し測定した。各変異体酵素を含む洗剤を３０秒間ボルテックスし、それから１０分間ＲｏｔａＭｉｘ （ＡＴＲ ＲＫＶＳ Ｍｏｄｅｌ）に固定した。変異体酵素を有する１００マイクロリットルの洗剤をピペットで測定し、１：６５１に希釈した。変異体の初期の活性をブロック化Ｐ‐ニトロ‐フェニル‐マルトヘパトース（Ｂｌｏｃｋｅｄ Ｐ−Ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅｎｙｌ−Ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｅ）(Ｂｌｏｃｋｅｄ ＰＢＮＰＧ７) 基質を用いてＫｏｎｅｌａｂ， Ｍｏｄｅｌ ２０ＸＴにて試験をした。洗剤サンプルをそれから３７℃にセットした一定温度のインキュベーターでインキュベーションした。サンプルを１、２、４、７、及び１７日で採取し、酵素活性を測定した。

７．１１ アルファ‐アミラーゼ活性試験
７．１１．１ ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）試験
アルファ‐アミラーゼ活性をファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））錠剤を基質として用いる方法によって検出する。ファデバス錠剤（ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））アミラーゼ試験、Pharmacia Diagnosticより供給）は、架橋された不溶性青色デンプンポリマーを含み、このポリマーは、ウシ血清アルブミン及び緩衝基質と混合され、錠剤化される。

一つの測定ごとに、ひとつの錠剤を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Britton-Robinson）緩衝液（５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭリン酸、５０ｍＭホウ酸、０．１ｍＭＣａＣl_２，ｐＨをＮａＯＨを用いて対象となる値に調整）含有試験管に懸濁する。試験を対象となる温度にて水浴中で行う。試験すべきアルファ‐アミラーゼをｘｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Britton-Robinson）緩衝液で希釈する。１ｍｌのこのアルファ‐アミラーゼ溶液を５ｍｌの５０ｍＭブリトン‐ロビンソン（Britton-Robinson）緩衝液に加える。デンプンを可溶性青色フラグメントを与えるアルファ‐アミラーゼによって加水分解する。得られる青色溶液の吸光度を６２０ｎｍで分光光度的に測定し、アルファ‐アミラーゼ活性の作用とする。

１０分又は１５分（試験時間）のインキュベーション後、測定された６２０ｎｍ吸光度は６２０ｎｍで０．２から２．０単位の範囲であることが重要である。この吸収範囲において活性と吸光度（ランベルトベールの法則）の間に直線性がある。それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するように調整すべきである。具体的な設定条件（温度、ｐＨ、反応時間、緩衝液の条件）下、１ｍｇの得られるアルファ‐アミラーゼは特定量の基質を加水分解し、青色を生じる。色の強さを６２０ｎｍで測定する。測定吸光度は、与えられる設定条件下、問題とするアルファ‐アミラーゼの特異的活性（純粋アルファ‐アミラーゼ蛋白質のａｃｔｉｖｉｔｙ／ｍｇ）に正比例する。

７．１１．２ 代替方法
アルファ‐アミラーゼ活性をＰＮＰ‐Ｇ_７基質を用いる方法で検出する。（ｐ−ニトロフェニル‐アルファ‐Ｄ‐マルトヘプタオシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ‐ａｌｐｈａ‐Ｄ‐ｍａｌｔｏｈｅｐｔａｏｓｉｄｅ）の略語であるＰＮＰ‐Ｇ_７はエンドアミラーゼにより切断できるブロック化オリゴサッカライドである。切断に続き、黄色を有する遊離ＰＮＰ分子を放出するためにキット中のアルファグルコシダーゼが基質を消化し、即ち、λ＝４０５ｎｍ（４００‐４２０ｎｍ）での可視分光光度法により測定する。ＰＮＰ‐Ｇ_７基質及びアルファ‐グルコシダーゼを含むキットはBoehringer-Mannheim(カタログ番号1054635)にて作られる。

試薬液を調整するために１０ｍｌの基質／緩衝液を当業者によって推奨される５０ｍｌの酵素／緩衝液に追加する。２０マイクロリットルのサンプルを９６穴マイクロプレートに移し、２５℃でインキュベーションすることにより試験を実施する。２５℃に前もって平衡化する２００マイクロリットルの試薬液を加える。溶液を混合し、一分間インキュベーションし、吸収をELISAリーダーでＯＤ４０５ｎｍにて４分以上３０秒ごとに測定する。

吸収曲線に依存する時間の勾配は与えられる設定条件下問題とするアルファ‐アミラーゼの活性に正比例する。

７．１２ 洗剤組成物中の酵素性能の検出
７．１２．１ ＵＳ条件
Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒの使用、ユーナイテッド・ステーツ・テスティング（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ）、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ.Ｊ.-ＵＳ洗浄条件下洗浄試験をシミュレートするために、対象となる変異体酵素の検量効率曲線（ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を蛍光増白剤及び／又は粉AATCC 1993 (American Association of Textile Chemists and Colorists)を含まないLiquid AATCC 2003のような標準的な洗剤を用いて２０℃で導入した。比較アルファ‐アミラーゼの相当するＤＥＣを本発明の変異体酵素の汚れ除去能力を比較するために導入した。このプロセスを４０℃で繰り返した。一般的に、CS-28米デンプン汚れ(オランダのCFT)の４つの見本を１リットルのＤＩ水及び１．５ｇの液体ＡＡＴＣＣで満たしたＴｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒのスチール製容器へ移した。粉ＡＡＴＣＣを用いる場合、１．５ｇの洗剤粉を化学天秤（Model PM4800, Mettler Instrument Corp., Highstown, NJ. 08520）で重量測定後、Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒへ加えた。二回の再現を同時に行った。他に述べていない限り、試験を１２分間で行い、３分間すすいだ。洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をコニカミノルタ製Chroma Meter Model CR-410で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。

７．１２．２ 欧州条件
Ａｔｌａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ａｔｌａｎｔａ, Ｇｅｏｒｇｉａ製のＬａｕｎｄｅｒ‐Ｏ‐ｍｅｔｅｒの使用‐欧州洗浄条件下洗浄をシミュレートするために対象となる変異体酵素の検量効率曲線（ｄｏｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｕｒｖｅ）（ＤＥＣ）を標準欧州試験洗剤、ＩＥＣＡ及び漂白（ＴＡＥＤ‐テトラ‐アセチル‐エチレン‐ヂアミンアセテート）及び過ホウ酸ナトリウムを有するＩＥＣＡ洗剤を用いて４０℃で導入した。比較変異体酵素の相当するＤＥＣ曲線を本発明の変異体酵素汚れ除去能力を比較するために導入した。もし必要ならば、このプロセスを高い洗浄温度で繰り返してよい。一般的に、ＥＭＰＡ １６１ トウモロコシデンプン（ＥＭＰＡ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の４つの見本を６．８ｇ／ＬのＩＥＣ Ａ洗剤又は漂白洗剤を有する８．０ｇ／ＬのＩＥＣ Ａ５０を有する２５０ミリリットルのＤＩ水をスチール製容器へ移した。二回の再現を同時に実施した。他に述べていない限り、試験を４５分間で行い、５分間すすいだ。洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をChroma Meter Model CR-410で測定した。集めたデータを適切な統計分析で処理した。

７．１２．３ 試験洗剤組成物のマイクロスウォッチ方法
多くのアルファ‐アミラーゼ洗浄試験が存在する。洗浄試験の典型的な記載は次を含む。

「見本（ｓｗａｔｃｈ）」は、布地に着いた染みを有する布地のような材料の一片をいう。例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合から作製してよい。さらに、該見本は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスのような固い材料でもよい。アミラーゼにとって、汚れはデンプンベースであり、血液、牛乳、インク、草、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含むが、これらに限定されない。

「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ ｓｗａｔｃｈ）」は、一穴式の穴開け器でカットされている見本の切断部であり、又は客のリクエストにより製造された９６穴用穴開け器であって、多数の穴が標準９６穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされる見本の切断部、又は見本から別な方法で取り出されている部分である。見本は繊維、紙、金属、又は他の適切な材料である。該小さな見本は、その見本が、２４‐、４８‐、又は９６‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ ｓｗａｔｃｈ）」はまた少量の材料に染みを適用して作成してもよい。例えば、小さな見本は、汚れが付いた直径５／８″又は０．２５″の布地のものでよい。客のリクエストにより製造された穴開け器は９６穴プレートのすべてに同時に９６個の見本が挿入されるように設計されている。装置は、単に同じ９６穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の見本の搬送をさせる。複数穴用穴開け器は、任意の設定プレートに見本の同時挿入をすることができるものであり、２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズであり、繊維以外材料での洗浄組成物試験に用いるためにコーティングされる。一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ９６‐、４８‐、又は２４‐穴プレート又はより大きい穴に挿入される。この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。また、分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。さらにマイクロスクリーニング試験は、例えばインディゴ染色デニムの見本をマルチウェルプレートの穴に供給し、固定し、砂のような粒子又は例えば６，８、又は９ゲージの粒子を含むふるいで得たガーネットのようなより大きな粒子を加え、添加粒子によって見本を摩耗させるようにプレートを攪拌する。この試験はストーンウォッシング適用におけるセルラーゼの評価に有用である。酵素の有効性を、反応液への色の放出（例えば、放出インディゴをジメチルスルホキシドに溶解し、Ａ_６００ｎｍの吸収で測定する。）によって又は摩耗する見本の反射率の測定により判断する。

例えば、未処理のＢＭＩ（血液（ｂｌｏｏｄ）／牛乳（ｍｉｌｋ）／インク（ｉｎｋ））見本を漂白剤のない洗剤で洗浄する場合、インクの大部分はプロテアーゼの助けなしでも除去される。プロテアーゼの添加によりインクの除去が少し増大する。これは大きなバックグラウンドにおいては定量化が困難である。本発明は、染みの固定度合いを制御する処理手順を提供する。結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、汚れの量を変えて放出することのできる見本の作製が可能となる。固定化見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の比に劇的な改善が得られる。さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。

種々のタイプの材料の周知の「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」の汚れを有する見本は商業的に入手可能であり（ＥＭＰＡ， Ｓｔ． Ｇａｌｌｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ； ｗｆｋ-Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｋｒｅｆｅｌｄ Ｇｅｒｍａｎｙ; 又はＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、専門家（Ｍｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｐｒａｔｏ， Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ５２（４）： ２８０ ２８６ （１９８２））によっても作成される。他の試験用見本は、繊維を含む綿上の血液／牛乳／インク（ＢＭI）染み、繊維を含む綿上のホウレンソウの染み、繊維を含む綿上の草の染み、及び繊維を含む綿上のチョコレート／牛乳／すすを含むがこれらに限定されない。

ＢＭＩ染みは０．０００３％から０．３％の過酸化水素で綿に固定される。他の組み合わせは０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、ゼラチン及び０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるクーマシィーブリリアントブルー染色又は０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。

また、見本を酵素及び／又は洗剤製剤でインキュベーションする間、攪拌する。洗浄能力データはウェル、特に９６穴プレートにおける見本の方向（水平対垂直）に依存する。これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示すであろう。インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計された。これの設置の仕方は単純で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆い、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで９６穴プレートに固定すれば足りる。それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。振盪機を約４００ｒｐｍで設定することによって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。これは、見本（例えば、Ｃａｙｏｔ ａｎｄ Ｔａｉｎｔｕｒｉｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４９： １８４−２００ （１９９７）参照。）から除去された蛋白質の量の測定に役立つ。しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から）を生じる場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、言い換えると「ノイズ」が生じる。

血液／牛乳／インク又は他の染みに対する洗浄能力を測定する他の手段は、インク放出に基づく。見本上の蛋白質の蛋白質分解によって、洗浄液の吸光度を測定することにより定量されるインク粒子の放出が得られる。吸光度を３５０ｎｍと８００ｎｍの間の任意の波長で測定する。波長を４１０ｎｍ又は６２０ｎｍで測定する。また洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、クーマシィーブリリアントブルー染色を含む汚れにおける洗浄能力を決定するために試験を行う。これらの染みに対する典型的な波長は、ホウレンソウ、又は草について６７０ｎｍ及びゼラチン又はクーマシィーについては６２０ｎｍを含む。例えば、洗浄液（例えば、一般的に９６穴プレートから１００‐１５０μＬ）の一部を除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。

またシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適切な基質上の血液／牛乳／インク染みを用いて食器洗浄用の強化酵素及び／又は洗剤組成物を決定するために用いる。

ある実施態様においては、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間２５℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定し、又は０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間６０℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定する。約０．２５″の小さな見本をＢＭＩ／綿見本から切り離し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異蛋白質のような酵素の周知の混合を添加する。粘着プレート用シールでマイクロタイタープレートの上に固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約１０から６０分間、約２５０ｒｐｍでオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートに移され、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは０．０１％グルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿見本又は草／綿見本に３０分間２５℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及び／又はすすの染みで行われる。さらに血液／牛乳／インク試験及び条件を米国特許第7,122,334 (Genencor International, Inc.)に記載する。

７．１３ ＬＡＳ感受性の検出
変異体を４０℃で１０分間、異なる濃度のＬＡＳ（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ ａｌｋｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；Nansa 1169/P）とインキュベーションする。

残留活性をファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））試験方法又はＰＮＰ−Ｇ７基質を用いる代替方法を用いて測定する。

ＬＡＳを０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５で希釈する。

次の濃度を用いる。それは５００ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、及び１０ｐｐｍを含むか、又はＬＡＳを含まない。

変異体を全体積１０ｍｌ中０．０１‐５ｍｇ／ｌの濃度になるように異なるＬＡＳ緩衝液で希釈し、温度を制御する水浴にて１０分間インキュベーションする。インキュベーションを少量のサンプルの一部を低温の試験緩衝液に移すことにより停止する。活性測定に影響しないために、活性測定の間ＬＡＳ濃度を１ｐｐｍ以下にすることは重要である。

それから残留活性を上記ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））試験又は代替方法を用いて複数測定する。

活性はブランクを除いた後測定する。

ＬＡＳを含まない活性を１００％とする。

８． バイオフィルム除去組成物及び使用
組成物は主要な酵素成分、例えばバイオフィルムを除去するときに用いるための単一成分として、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。あるいは、組成物は複数の酵素的活性を含んでよく、例えば複数アミラーゼ又は次の任意の組み合わせを含むカクテル酵素であり、それは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ（ベータ‐、又はアルファ‐、又はグルコ‐アミラーゼ）、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及び／又はキシラナーゼ、又はバイオフィルムを除去用のそれらの組み合わせである。添加酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（例、フミコーラ インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌（Ａ． ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）を含む。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス（Ｆ． ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅ）、フザリウム セレアリス（Ｆ． ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム クロオクウェレンセ（Ｆ． ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム クルモルム（Ｆ． ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）,フザリウム グラミナム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム ヘテロスポラム（Ｆ． ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ネガンディニス（Ｆ． ｎｅｇｕｎｄｉｎｉｓ）、フザリウム オキシスポラム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）, フザリウム レティクラタム（Ｆ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆ． ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム サンブシヌム（Ｆ． ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム サルコクロウム（Ｆ． ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム スルフリューム（Ｆ． ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム トルローサム（Ｆ． ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム トリコテキオイデス（Ｆ． ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）及び、フザリウム ベネナツム（Ｆ． ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。

周知の方法に従って調製される組成物を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は液体又は乾燥組成物の形態でよい。例えば、組成物を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は粒子又は微粒子の形態でよい。組成物中に含まれるポリペプチドは周知の方法に従って安定化される。

ポリペプチド組成物の一般的な使用が下記に示す実施例である。組成物及びその組成物が用いられる他の条件下バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の用量は周知の方法を用いて決定してよい。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体が２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼ又はその変異体と共に組成物中に用いることも考えられる。

他の実施態様はバイオフィルムを分解し及び／又は除去するための組成物及び方法を意図する。本明細書にて用いる用語「分解（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」はバイオフィルム中の個々の微生物の細胞を一緒に連結及び結合するバイオフィルムマトリックス中のポリサッカライドの加水分解として理解され、それにより、微生物細胞をバイオフィルムから放出及び除去できる。バイオフィルムは一般的に表面に存在し、バイオフィルムの分解を接触表面を持ってくることにより行う。例えば、表面をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又は一以上の例えば２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼであるが、これに限定されないバイオフィルムを破壊することのできる他の酵素を含む水溶性培地で浸し、覆い、濡らすことによる。組成物を例えば、パルプ及び製紙産業での白濁した水、スライムを加水分解するのに用いてよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は０．０００１から１００００ｍｇ／Ｌ、０．００１‐１０００ｍｇ／Ｌ、０．０１‐１００ｍｇ／Ｌ、又は０．１‐１０ｍｇ／Ｌの用量で存在してよい。追加酵素及び酵素変異体は同量またはそれ以下で存在してよい。

プロセスを室温から約７０℃の温度で適切に行う。一般的な温度範囲は約３０℃約６０℃を含み、例えば、約４０℃から約５０℃である。

バイオフィルの加水分解に適切なｐＨは約３．５から約８．５内にある。一般的なｐＨ範囲は約ｐＨ５．５から約８を含み、例えば、約６．５から約７．５である。バイオフィルムを効果的に除去するための酵素の接触時間又は反応時間は、バイオフィルムの特徴及び表面を酵素単独又は２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼのような他のバイオフィルム分解酵素との組み合わせに依存し、かなり多様である。一般的な反応時間は約０．２５時間から約２５時間及び約１時間から約１０時間内を含むことができ、例えば約２時間である。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及び２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼと組み合わせできる追加バイオフィルム分解酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、他のアルファ‐アミラーゼを含む他のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及び／又はペクチナーゼを含むが、これらに限定されない。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は酵素的又は非酵素的バイオサイドのような、抗生剤と組み合わせてよい。酵素的バイオサイド例えば、オキシドレダクターゼを含む組成物、例えばラッカーゼ又はペルオキシダーゼ、特にハロペルオキシダーゼ、及び任意に国際ＰＣＴ出願WO 97/42825及びDK 97/1273記載のようにアルキルシリンゲート（ａｌｋｙｌ ｓｙｒｉｎｇａｔｅ）のような増強剤でよい。

例えば、バイオフィルムを除き及び／又は洗い流す表面は固い表面であり、任意の表面で実質的に微生物に非透過的な面であると定義できる。表面の例は、例えば、ステンレススチール合金のような金属、プラスチック／合成ポリマー、ゴム、板、グラス、木材、紙、繊維、コンクリート、石、大理石、ジプサム及び任意に例えば、ペイント、エナメル、ポリマー及びその類似物のようなセラミック原料でコーティングされるセラミック原料から作られる。従って、表面はシステム保持、輸送、プロセッシング、又は水供給システムのような水溶液と接触、食品プロセッシングシステム、冷却システム、化学プロセッシングシステム、又は薬剤プロセッシングシステムの一部をなすものでよい。パルプ及び／又は製紙産業のような木材プロセッシング産業においてバイオフィルムを除去するための組成物を用いる方法及び組成物である。従って、酵素及び酵素を含む組成物は従来の定置洗浄（Ｃ‐Ｉ‐Ｐ）システムに有用である。表面はパイプ、タンク、ポンプ、膜、フィルター、熱変換機、遠心分離機、蒸発機、ミキサー、噴霧塔、バルブ、及び反応器の一部をなすものである。また、表面は、汚染内視鏡、人工補装具又は医療用インプラントのような医療科学及び医療産業で用いる器具又は器具の一部である。

またバイオフィルム除去用の組成物は金属表面、例えばパイプラインが微生物のバイオフィルムによる攻撃される時に起こるいわゆるバイオ腐食をバイオフィルムを分解することにより防ぎ、それによりバイオフィルムの微生物細胞が付着する金属表面を腐食するバイオフィルムの環境を作ることを防止することを意図する。

抗バイオフィルム組成物のための別の適用はオーラルケアである。しかしながら、表面は、粘膜、皮膚、歯、毛髪、爪等のような生物由来である。

例えば、プラークを有する歯は酵素を歯磨き粉に含むことで、汚れたコンタクトレンズは表面として考えられる。従って、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ及びその変異体は人間又は動物の歯に存在するプラークの分解のための薬剤を作るための組成物及びプロセスに用いることができる。さらに、嚢胞性線維症を発症している患者の肺中のバイオフィルムのような粘膜由来のバイオフィルムの分解の使用である。

従って、さらなる実施態様においては、任意の活性のある汚染物質の実質的にない精製酵素のような組み換え酵素を含むオーラルケア組成物に関する。オーラルケア組成物は組み換え酵素の量を適切に含有してよい。

オーラルケア組成物に用いる他のバイオフィルム分解酵素はオーラルケア組成物における２、６‐β‐Ｄ‐フルクタンヒドロラーゼ活性を含むが、これに限定されない。考えられる酵素活性はデキストラナーゼ、ムタナーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ、WO 95/10602記載のヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐ．）ペルオキシダーゼ、又はラクトペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、特に、カーブリア ウェルクロサ（Ｃ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）及びカーブラリア イナエクアリス（Ｃ． ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）のようなカーブラリア種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．）由来のハロペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、パパイン、酸性プロテアーゼ（例、ＷＯ ９５／０２０４４記載の酸性プロテアーゼ）、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、ＡＭＧ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）のようなアミログルコシダーゼを含むアミラーゼのようなプロテアーゼ、抗菌性酵素、及びそれらの混合物を含む酵素の群由来の活性を含む。

オーラルケア組成物は任意の適切な物理的形態（例えば、粉、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等）でよい。「オーラルケア組成物（ｏｒａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、虫歯を防止し、歯のプラーク及び歯石の形成を防止し、歯のプラーク及び歯石を除去し、歯の病気など予防及び／又は治療することにより、人間及び動物の口中の口腔衛生を維持又は改善するために用いてよい組成物を含む。また、少なくともオーラルケア組成物という用語は入れ歯、人工歯及びその類似物を洗浄するための製品を含む。そのようなオーラルケア組成物の例は練り歯磨き、デンタルクリーム、ゲル又は歯磨き粉、歯科用洗口剤、歯磨き前又は後の漱ぎ製剤、チューインガム、トローチ及びキャンディーを含む。一般的な練り歯磨き及びゲルは研磨磨き剤、発泡剤、香料、保湿剤、バインダー、増粘剤、甘味剤、ホワイトニング／漂白／染み除去剤、水、および任意に追加酵素及び酵素の組み合わせを含む。

マウスウォッシュはプラーク除去液を含み、一般的に水／アルコール溶液、香味料、保湿剤、甘味料、発泡剤、着色剤、及び任意に追加の酵素及び酵素組成物を含む。

また、研磨磨き剤も歯磨き剤のようなオーラルケア組成物へ含まれてよい。

従って研磨磨き剤はアルミナ及びその水和物を含み、例えば、アルファアルミナ３水和物、３ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、か焼アルミナケイ酸塩、及びケイ酸アルミニウムのようなアルミノケイ酸塩、炭酸カルシウム、ケイ酸ジリコニウム、及び塩化ポリビニルのような粉状プラスティックも、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノールホルムアルデヒド樹脂、メラミン‐ホルムアルデヒド樹脂、尿素‐ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉状ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル、及びエアロゲル及びその類似物である。また、適切な研磨剤はピロリン酸カルシウム、水に不溶のアルカリメタリン酸塩、リン酸二カルシウム、及び／又はその二水和物、オルトリン酸２カルシウム、リン酸トリカルシウム、特にハイドロキシアパタイト及びその類似物である。また、これらの物質の混合物を用いることができる。

オーラルケア組成物次第で、研磨用製品は重量で約０％から約７０％、又は約１％から約７０％存在してよい。練り歯磨きにとって、研磨剤は最終練り歯磨き重量で一般的に１０％から７０％の範囲内にある。

保湿剤は例えば歯みがきのペーストから水分の消失を防ぐために使用する。オーラルケア組成物に用いる適切な保湿剤は次の化合物及びそれらの混合物を含む。それは、グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、１，３‐プロパンジオール、１，４‐ブタンジオール、部分的に水素化加水分解ポリサッカライド及びその類似物である。保湿剤は一般的に練り歯磨きの重量で０％から約８０％、又は約５％から７０％存在する。

シリカ、デンプン、トラガカントゴム、キサンタンゴム、アイリッシュモスの抽出物、アルギン酸塩、ペクチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロロリドンは有用な増粘剤及びバインダーの例として意味し、歯みがき製品を安定するのに役立つ。増粘剤は練り歯磨きクリーム及びゲルに重量で約０．１％から約２０％の量で存在し、ビルダーは最終製品の重量で約０．０１から約１０％の範囲で存在してよい。

発泡剤石鹸として、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、両性イオン性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）及び／又は両性イオン性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）界面活性剤を用いてよい。これらは、最終製品の重量で０％から約１５％、約０．１％から約１３％又は約０．２５％から約１０％のレベルで存在してよい。

界面活性剤はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に不活性化の影響を及ぼさない適切な範囲のみである。界面活性剤は脂肪アルコール硫酸塩、モノグルセリドスルホン酸塩又は１０から２０炭素原子を有する脂肪酸、脂肪酸アルブミン濃縮産物、脂肪酸アミド及びタウリンの塩及び／又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩を含む。

適切な甘味料は製剤に用いるサッカリンを含む。

通常スペアミントのような香味料は重量で約０．０１％から約５％特に約０．１％から約５％のような低い量で存在する。ホワイトニング／漂白剤はＨ_２Ｏ_２を含み最終製品の重量で計算して約５％以下又は約０．２５％から４％の量で添加してよい。ホワイトニング／漂白剤はオキシドレダクターゼのような酵素でよい。適切な漂白酵素の例はＷＯ ９７/０６７７５に記載のものである。

通常水は例えば、練り歯磨きのように流動性を有する形態を与える量を加える。
さらに、水溶性抗菌剤、例えばクロロヘキシジン ジグルコネート（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ヘキセチジン（ｈｅｘｅｔｉｄｉｎｅ）、アレキシジン（ａｌｅｘｉｄｉｎｅ）、トリクロサン（商標）（Triclosan（商標））、第４級アンモニウム抗菌剤化合物であり、特定の金属イオンの水溶性供給源、例えば、亜鉛、銅、銀、及びスズ（例えば、塩化亜鉛、塩化銅及び塩化スズ、及び硝酸銀）も含んでよい。

また、フッ化物供給源、染料／着色剤、保存剤、ビタミン剤、ｐＨ調整剤、虫歯予防剤、除痛剤などとして用いることができる化合物の添加を含む。

口腔の洗浄に用いる場合、バイオフィルム分解酵素はいくつかの利点を有する。プロテアーゼは歯の表面に吸着し、菌幕を形成し、プラークに至る最初の層である唾液蛋白質を分解する。リパーゼを伴うプロテアーゼは微生物の細胞壁及び細胞膜の構造成分を作る蛋白質及び脂質を溶かすことにより、微生物を分解する。

デキストラナーゼ及び他のカルボヒドラーゼ、例えば２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は微生物の接着マトリックスを形成する微生物により生産される有機骨格構造を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼはプラーク形成を防ぐだけでなく、石化の防止、つまり、カルシウムに結合する炭水化物蛋白質を分解することにより歯石形成も防ぐ。

練り歯磨きは一般的に次の成分（最終練り歯磨き組成物の重量％中）を含んでよい。それは、研磨剤約７０％まで、保湿剤０％から約８０％、増粘剤約０．１％から約２０％、バインダー約０．０１％から約１０％、甘味料約０．１％から約５％、発泡剤０％から約１５％、増白剤０％から約５％及び酵素約０．０００１％から約２０％である。

ある実施態様においては、練り歯磨きは約６．０から約８．０の範囲のｐＨを有してよく、ａ）研磨剤約１０％から約７０％、ｂ）保湿剤０％から約８０％、ｃ）増粘剤約０．１％から約２０％、ｄ）バインダー約０．０１％から約１０％、ｅ）甘味料約０．１％から約５％、ｆ）発泡剤０％から約１５％、ｇ）増白剤０％から約５％ｉ）酵素約０．０００１％から約２０％を含む。

i）で述べた酵素はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体単独又は２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）のような他のバイオフィルム分解酵素及び練り歯磨き及びその類似物に用いるものとして知られる上記酵素の他の任意のタイプとの組み合わせを含む。

一般的に口腔洗浄は次の成分（最終口腔洗浄組成物の重量中）を含む。それは保湿剤０％から約２０％、界面活性剤０％から約２％、酵素０％から約５％、エタノール０％から２０％、他の成分（例えば、香味料、甘味料、フッ化物のような活性成分）０％から約２％である。また、組成物は約０％から約７０％の水を含んでよい。

口腔洗浄組成物はクエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウムのような適切な緩衝液で約６．０から約７．５のｐＨ範囲に調整されてよい。口腔洗浄は非希釈形態で使用してよい（言い換えると、使用前に希釈してよい。）
オーラルケア組成物はオーラルケアの任意の周知技術を用いて生産されてよい。

９． デンプンプロセス組成物及び使用
他の実施態様においては、開示するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はデンプン液化又は糖化に用いてよい。

ある実施態様は、デンプンから甘味料を生産するための組成物使用及び組成物を含む。デンプンをフルクトースシロップへ転換する「伝統的な」プロセスは通常３つの連続的酵素プロセスからなり、つまり、液化プロセス、引き続き、糖化プロセス、及び異性化プロセスからなる。液化プロセスの間、デンプンは約２時間の間約５．５と約６．２の間のｐＨの値及び約９５℃から約１６０℃の温度でバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体によりデキストリンに分解される。これらの条件下最適酵素安定性を評価するために、１ｍＭのカルシウムを加える（４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）。デンプンプロセスはアルコール（例えば、燃料用の穀物液状化及び飲料アルコール、アルコール醸造）、甘味料生産用のデンプン液状化、サトウキビプロセス、及びデンプンプロセスをゴールとする他の関連食品を生産するのに有用である。異なるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体には他の条件を用いることができる。

液化プロセス後、デキストリンはグルコアミラーゼ（例、ＡＭＧ（商標））及びイソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標））のような脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換する。この段階の前に、ｐＨは約４．５以下の値に下げられ、高温（９５℃以上）に維持され、液化バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の活性は変性される。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を加える。一般的に糖化プロセスは約２４時間から約７２時間で行う。

糖化プロセスの後、ｐＨを約６．０から約８．０の範囲の値、例えば、ｐＨ７．５に上げ、カルシウムをイオン交換により除去する。デキストロースシロップをそれから例えば、固定化グルコースイソメラーゼ（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）のような）を用いてフルクトースシロップに転換する。

このプロセスの少なくとも一つの酵素的改善が行われる。液化バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のカルシウム依存性の低下である。遊離カルシウムの添加がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の高い安定性を十分に確保するために必要だが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害し、３‐５ｐｐｍ以下の遊離カルシウムレベルに低減する範囲まで、高価な単位操作手段で除去する必要がある。もし、そのような操作が避けられ、液化プロセスが遊離カルシウムイオンなしで実行できるならば、節約ができる。

例えば、少ないカルシウム依存酵素、つまり、低い遊離カルシウム濃度（＜４０ｐｐｍ）で安定及び高い活性である酵素は、組成物及び方法に用いることができる。そのようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は約４．５から約６．５の範囲又は、約４．５から約５．５の範囲のｐＨで最適ｐＨを有する。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はデンプン又は多様な目的のための任意のマルトデキストリン含有化合物加水分解のための実験室及び産業用施設で用いてよい。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は特異的活性を提供するために単独で用いてよく、又は活性の広いスペクトルをもつ「カクテル」を提供するために他のアミラーゼと組み合わせて用いてよい。一般的な使用は生物製剤、食品、動物用飼料、薬剤製剤、又は産業用試料からデンプン又は任意のマルトデキストリン含有化合物の除去又は一部又は完全な加水分解を含む。

他の実施態様においては、組成物及び発酵プロセス中にその組成物を用いる方法を含み、酵母のような発酵生物により発酵産物の転換に有用なグルコース及び／又はマルトースを生産するために、デンプン基質がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体存在下液化及び／又は糖化することである。そのような発酵プロセスは燃料用エタノール又は飲料用エタノール（飲料用アルコール）を生産するプロセス、飲料水を生産するプロセス、所望の有機化合物（例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような）ケトン、アミノ酸（グルタミン酸、モノグルタミンナトリウムのような）だけでなくより複雑な化合物（例えば、ペニシリン、テトラサイクリンのような抗生物質）、酵素、ビタミン（例えば、リボフラビン、ビタミンＢ_１２、ベータ‐カロテン）及び合成的に生産するのが困難なホルモンも生産するプロセスを含む。

処理されるデンプンは高度に精製されるデンプン品質でよく、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％の純度である。あるいは、デンプンは、麦芽残留及び繊維のような非デンプン分画を有する粉砕全粒穀物を含む材料を含有する未精製デンプンでよい。全粒穀物のような生原料の構造を破壊し、さらに処理するために、これを粉砕する。二つの粉砕プロセスを用いてよい。それは湿式及び乾式粉砕である。粉砕ひき割りトウモロコシのようなひき割りトウモロコシを用いてよい。

乾式粉砕穀物はデンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。そのような異種の材料がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７ｇ番を用いるジェットクッキングにより処理される場合、しばしば一部のデンプンゼラチン化のみしか行われない。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は非ゼラチン化デンプンへの高い活性を有するので、乾式粉砕デンプンをジェットクッキング処理する液化及び／又は糖化を含むプロセスに積極的に適用してよい。

さらに、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の優れた加水分解活性のより、糖化段階の間グルコアミラーゼの必要性が大幅に低減する。これにより低いグルコアミラーゼ活性で糖化を実施することができる。グルコアミラーゼ活性は無いか、もし存在するならば０．５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、又は０．４ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、０．３ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満で、０．１ＡＧＵ／ｇＤＳ未満で、デンプン基質の０．０５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満のような量で存在する。「ＤＳ」は乾燥固体基質の一グラム当たりに加える酵素の単位である。ミリグラム酵素蛋白質（ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表現するとき、グルコアミラーゼ活性を有する酵素が約０．５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．４ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．３ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は約０．１ｍｇＥＰ／ｇＤＳ（例えば、デンプン基質の約０．０５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満又は約０．０２ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満）以下又は未満の量で存在するか又は全く存在しない。グルコアミラーゼはアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、 タラロミセス種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、パチキトスポラ種（Ｐａｃｈｙｋｙｔｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、又はトラメテス種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｓｐ．）内の菌株由来であり、一般的例はアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、タラロミセス エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トラメテス シングラタ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、又はパチキトスポラ パピラケア（Ｐａｃｈｙｋｙｔｏｓｐｏｒａ ｐａｐｙｒａｃｅａ）である。

プロセスはａ）アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチド、を含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体とデンプン基質を接触させ、ｂ）少なくとも９０％、又は少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％ｗ／ｗの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するのに十分な時間及び温度で、前記酵素と前記デンプン基質をインキュベーションし、ｃ）発酵産物を生産するために発酵し、及びｄ）任意に発酵産物を回収することを含む。ｂ）及び／又はｃ）段階の間グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．００１から２．０ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０１から１．５ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０５から１．０ＡＧＵ／ｇＤＳ、０．０１から０．５ＡＧＵ／ｇＤＳの量で存在するか又は存在しない。グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、又は０．４ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、０．３ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満、０．１ＡＧＵ／ｇＤＳ（例えば、デンプン基質の０．０５ＡＧＵ／ｇＤＳ以下又は未満）、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。ミリグラム酵素蛋白質（ｍｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表現する場合、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は０．５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、又は０．４ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、０．３ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満、０．１ｍｇＥＰ／ｇＤＳ（例えば、デンプン基質の０．０５ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満又は０．０２ｍｇＥＰ／ｇＤＳ以下又は未満）、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。プロセスにおいて段階ａ）、ｂ）ｃ）及び／又はｄ）は別々に又は同時に実施される。

別の実施態様においては、プロセスはａ）アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現するために形質転換した酵母細胞とデンプン基質を接触させ、ｂ）少なくとも９０％ｗ／ｗの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するために十分な時間及び温度で、前記酵素と前記デンプン基質をインキュベーションし、ｃ）エタノールを生産するために発酵し、ｄ）任意にエタノールを回収することを含む。ａ）、ｂ）及びｃ）段階は、別に又は同時に実施される。

さらに他の実施態様においては、ゼラチン化又は粒状デンプンのスラリーの加水分解を含むプロセス、特に前記粒状デンプンの初期のゼラチン化温度以下の温度で可溶性デンプン加水分解物へ粒状デンプンを加水分解するプロセスである。さらに、アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むポリペプチドと接触することである。デンプンを任意の一以上の菌類のアルファ‐アミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．１)及び一以上のベータ‐アミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．２)、及びグルコアミラーゼ (ＥＣ ３．２．１．３)と接触させてよい。さらなる実施態様においては、イソアミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．６８)又はプルラナーゼ(ＥＣ ３．２.１．４１)のような別のデンプン分解酵素又は脱分岐酵素をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に追加してよい。

実施態様においては、プロセスは初期ゼラチン化温度以下の温度で実施される。そのようなプロセスをしばしば少なくとも約３０℃、少なくとも約３１℃、少なくとも約３２℃、少なくとも約３３℃、少なくとも約３４℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３６℃、少なくとも約３７℃、少なくとも約３８℃、少なくとも約３９℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４１℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４３℃、少なくとも約４４℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約４６℃、少なくとも約４７℃、少なくとも約４８℃、少なくとも約４９℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５１℃、少なくとも約５２℃、少なくとも約５３℃、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５７℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約５９℃、又は少なくとも約６０℃で行う。プロセスを実施するｐＨは約３．０から約７．０、又は約３．５から約６．０、又は約４．０から約５．０でよい。ある実施態様は発酵を含むプロセスを意図し、例えば、エタノール生産のための酵母、例えば、３０℃から３５℃のような約３２℃である。

別の実施態様においては、プロセスは同時糖化発酵を含み、例えば、エタノール生産のための酵母、又は所望の有機化合物を生産するための別の適切な発酵生物、例えば、３０℃から３５℃のような約３２℃である。

上記の発酵プロセスにおいて、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％のようなエタノールに達する。

任意の上記実施態様に用いるデンプンスラリーは約２０％から約５５％乾燥固体粒状デンプン、約２５％から約４０％乾燥固体粒状デンプン、又は約３０％から約３５％乾燥固体粒状デンプンを有する。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触後、酵素は可溶性デンプンを少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の量の粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解物へ転換する。

別の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はアルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒部位及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチドを含んでよく、液化プロセス、ゼラチンデンプンの糖化に用いられ、例えば、ジェットクッキングによりゼラチン化を含むが、これに限定さない。プロセスは発酵産物、例えばエタノールを生産するための発酵を含む。発酵によりデンプン含有材料からエタノールを生産するためのそのようなプロセスはｉ）アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒部位及び炭水化物結合モジュール、第一態様のポリペプチド、を含むポリペプチドと前記デンプン含有材料を液化させ、ｉｉ）得られる液化マッシュを糖化しｉｉｉ）発酵生物存在下（ｉｉ）段階で得られる材料を発酵することを含む。さらに、プロセスは任意にエタノールを回収することを含む。糖化及び発酵プロセスは同時糖化発酵プロセス（ＳＳＦプロセス）として行ってよい。発酵の間、エタノール含有量は少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％のようなエタノールに達する。

上記実施態様のプロセスで処理するデンプンは特に塊茎、根、茎、鞘、穀物又は未精白の穀物から得られる。より具体的には、粒状デンプンはトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、カッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得られる。また、トウモロコシ及び大麦のろう様又は非ろう様タイプ両方を含む。

上述の組成物はゼラチン化デンプン又は粒状デンプン及び一部ゼラチン化デンプンを液化及び／又は糖化するために用いてよい。部分的ゼラチン化デンプンはある程度ゼラチン化しているデンプンで、言い換えると、デンプン部分が不可逆的に膨張及びゼラチン化し、デンプンの一部がまだ粒状の状態で存在している。

上記組成物は０．０１から１０．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、又は０．１から５．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、又は０．５から３．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳ、又は０．３から２．０ＡＦＡＵ／ｇＤＳの量で存在する酸性アルファ‐アミラーゼ変異体を含んでよい。組成物は上記任意のデンプンプロセスに適用してよい。

本明細書にて用いる用語「液化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と同時に又はその後に添加するデンプンのゼラチン化を含む。追加的な液化導入酵素もまた加えてよい。

本明細書にて用いる用語「第一液化（ｐｒｉｍａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」はスラリーの温度がそのゼラチン化温度に上昇する又は近づいた場合の液化段階をいう。温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通して送られ、２００°Ｆから３００°Ｆ、例えば２２０‐２３５°Ｆの温度となる。熱交換器又はジェットに投入に引き続き、スラリーを３‐１０分間その温度で維持する。スラリーを２００°Ｆから３００°Ｆに維持するこの段階は第一液化である。

本明細書にて用いる用語「第二液化（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第一液化（２００°Ｆから３００°Ｆに加熱）に引き続く液化段階をいい、このときスラリーは室温に冷やされる。この冷却段階は、３０分から１８０分（３時間）であってよく、例えば９０分から１２０分（２時間）である。

本明細書にて用いる用語「第二液化の時間（ｍｉｎｕｔｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」は第二液化の開始からＤＥが測定される時間までの経過する時間をいう。

他の実施態様においては、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有組成物中のベータ‐アミラーゼのさらなる使用を意味する。ベータ‐アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）はエキソ作用のマルトジェニックアミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅｓ）であり、アミロース、アミロペクチン、及び関連するグルコースポリマー中の１，４‐α‐グルコシド結合の加水分解を触媒し、それにより、マルトースが放出される。

ベータ‐アミラーゼは種々の植物及び微生物（W. M. Fogarty and C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979）から単離される。これらのベータ‐アミラーゼは４０℃から６５℃の範囲の最適温度及び約４．５から約７．０の範囲の最適ｐＨを有することで特徴付けられる。考えられるベータ‐アミラーゼはオオムギ由来のベータ‐アミラーゼ、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＢＢＡ １５００、 Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌ（商標）ＢＢＡ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．)及びＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ)を含むがこれらに限定されない。

組成物に用いるために考えられる別の酵素はグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）である。グルコアミラーゼは微生物又は植物由来である。グルコアミラーゼの例は菌類又は細菌由来である。細菌のグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼであり、特に、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）Ｇ１又はＧ２グルコアミラーゼ（Boel 他、EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984)）又はＷＯ ９２／００３８１及びＷＯ ００／０４１３６に記載のようなその変異体、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ (ＷＯ ８４／０２９２１)、アスペルギルス オリザエ（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）(Agric. Biol. Chem., 55(4): 941-949 (1991))、又はその変異体又はフラグメントである。

他の考えられるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）グルコアミラーゼ変異体は熱安定性を増強する変異体を含み、G137A及びG139A(Chen他、Prot. Eng. 9: 499-505 (1996)); D257E及びD293E/Q (Chen他、Prot. Eng. 8: 575-582 (1995)); N182(Chen他、 Biochem. J. 301: 275- 281 (1994));ジスルフィド結合、A246C (Fierobe他、Biochemistry, 35: 8698-8704 (1996))及びA435 and S436 (Li他、Protein Eng. 10: 1199-1204 (1997))位にＰｒｏ残基の導入である。他の考えられるグルコアミラーゼはタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ、特に、タラロミセス エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）(ＷＯ ９９／２８４４８)、タラロミセス レイセタヌス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ） (Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ＲＥ ３２，１５３)、タラロミセス デュポンチ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｕｐｏｎｔｉ）、タラロミセス サーモフィリス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）(Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，５８７，２１５)由来である。考えられる細菌由来グルコアミラーゼはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属由来のグルコアミラーゼであり、特に、クロストリジウム サーモアミロリティカム（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）(ＥＰ １３５１３８)及びクロストリジウム サーモヒドロスルフリカム（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）(ＷＯ ８６／０１８３１)である。一般的に、グルコアミラーゼはアスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼを含む。また、商業的に入手可能なグルコアミラーゼはＡＭＧ ２００Ｌ、ＡＭＧ ３００ Ｌ、ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ及びＡＭＧ（商標）Ｅ(Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ)、 ＯＰＴＩＤＥＸ（商標）３００(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．製)、 ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）及びＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ (ＤＳＭ)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９００(Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ‐Ｓｙｓｔｅｍｓ)、Ｇ‐ＺＹＭＥ（商標）Ｇ９９０ ＺＲ(アスペルギルス ニガー（Ａ. ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量)を含む。

グルコアミラーゼを０．０２‐２．０ＡＧＵ／ｇＤＳ又は０．１‐１．０ＡＧＵ／ｇＤＳ例えば、０．２ＡＧＵ／ｇＤＳの量で加えてよい。

また、追加酵素及び酵素変異体は組成物中に抱合されると考えられる。一以上のアルファ‐アミラーゼをバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又に加えて用いてよく、又は本明細書にて記載の他の酵素を含むことができる。

任意に加える別の酵素はイソアミラーゼ(ＥＣ ３．２．１．６８)又はプルラナーゼ(ＥＣ ３．２.１．４１)のような脱分岐酵素である。イソアミラーゼはアミロペクチン中のα‐１，６‐Ｄ‐グルコシド分岐結合を加水分解し、β‐限界デキストリン及びイソアミラーゼがプルランを攻撃できない点及びα‐限界デキストリンに対する作用が限られている点がプルラナーゼと異なる。脱分岐酵素を当業者が周知の効果的な量で加えてよい。

プロセスの生産物の正確な組成は適用酵素の組み合わせや粒状デンプンプロセスのタイプに依存する。例えば、可溶性加水分解物は少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％の純度を有するマルトースでよい。あるいは、可溶性デンプン加水分解は、グルコース又は少なくとも約９４．５％、少なくとも約９５．０％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６．０％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７．０％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８．０％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９．０％、又は少なくとも約９９．５％のＤＸ（溶解乾燥固体の総量のグルコースの割合）を有するデンプン加水分解物でよい。プロセスは特製シロップである生産物を含むことができ、例えば、アイスクリーム、ケーキ、キャンディー、缶詰のフルーツの製品に用いるためのグルコース、マルトース、ＤＰ３、及びＤＰｎの混合物を含む特製シロップである。

二つの粉砕プロセスは湿式及び乾式粉砕である。乾式粉砕において、実全体を粉砕し用いる。湿式粉砕は胚芽と粉末（デンプン粒子及び蛋白質）のよい分離をもたらし、若干の例外はあるが、デンプン加水分解物がシロップの生産に用いられる場所で適用できる。乾式及び湿式粉砕両方ともデンプン処理の周知の技術であり、開示される組成物及び方法に用いるために均等として考えられる。プロセスは限外ろ過システムで行われ、同システムにおいて、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物は可溶性で加水分解物である。未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物である限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスは前記プロセスと均等であると考える。また、未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物であるマイクロろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。

ある点において、プロセスに用いる可溶性加水分解物は、高フルクトーストウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）のような高フルクトースデンプンベースシロップ（ＨＦＳＳ）に転換される。この転換はグルコースイソメラーゼを用いて実施され、固体支持体に坦持する固定化グルコースイソメラーゼにより実施される。考えられるイソメラーゼは市販用製品Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ ＡＪＳ）、Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）ＩＭＧＩ及びＧ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３, Ｋｅｔｏｍａｘ（商標）Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３（Ｒｈｏｄｉａ)、Ｇ‐ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９３ ｌｉｑｕｉｄ、ＧｅｎＳｗｅｅｔ（商標）ＩＧＩ(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ, Ｉｎｃ.)を含む 。

他の実施態様においては、これらの方法により生産される可溶性デンプン加水分解物を燃料又は飲料用エタノールの生産に用いてよい。第三番目の局面のプロセスにおいて、発酵を粒状デンプンスラリーの加水分解へ同時又は別々に／続けて行ってよい。発酵を加水分解と同時に行う場合、温度は３０℃と３５℃の間、又は３１℃と３４℃の間である。プロセスは未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体を含むエタノールである限外ろ過システムを導入してよい。未透過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体含有エタノールである限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。

また、プロセスの可溶性デンプン加水分解物は、クエン酸、グルタミン酸１ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような発酵産物へ処理デンプンを発酵することを含む発酵産物の生産のために用いてよい。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のデンプン分解活性はジャガイモデンプンを基質として用いて検出してよい。この方法は酵素による修飾ジャガイモデンプンの分解に基づき、反応はヨウ素液を有するデンプン／酵素液のサンプルを混合することにより行う。最初黒っぽい青色になり、しかしデンプン分解の間に青色が薄くなり、次第に赤褐色になり、基準となる着色ガラスで比較する。

１０ 繊維湯通しのための組成物及び方法
また、本発明は、一以上のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を用いる布地の処理（例えば、繊維の湯通し）の組成物及び方法を含む。酵素は任意の布地処理方法を用いてよく、それは周知技術であり、例えば、U.S. Patent No. 6,077,316を参照願いたい。例えば、ある実施態様においては、布地の手触り及び外観が溶液中布地をバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触することを含む方法により改善される。ある実施態様においては、布地を加圧下溶液で処理する。

ある実施態様においては、酵素を繊維の製織の間又は後、又は湯通し段階、又は一以上の追加する布地処理段階に適用してよい。繊維の製織の間、糸に相当な機械的負荷がかかる。機械織機で製織する前に、伸長強度の増加及び切断防止のために、まかれた毛糸をしばしばサイジングデンプン又はデンプン誘導体でコートする。酵素をこれらのサイジングデンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用する。繊維が織られた後、布地を湯通し段階へ進めてよい。これは一以上の布地処理段階を伴う。湯通しは繊維からサイズを除く作用がある。製織後、さらに布地を処理する前に相同性及び洗浄効果の結果を評価するためにサイズのコーティングは除かなければならない。また、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の作用によりサイズの酵素的加水分解を含む湯通しの方法を提供する。

酵素を綿素材の布地を含む布地を湯通しするため単独又は他の湯通し用化学試薬及び／又は湯通し用酵素と共に用いてよく、例えば液体組成物中の洗剤添加剤として用いてよい。また、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をインディゴ染色デニム生地及び衣類に見られるストーンウォッシュを生産する方法に及び組成物として用いてよい。衣類製造のために、布地は衣服及び衣類に裁断及製縫され、その後完成する。特に、デニムのジーンズの製造のために異なる酵素的仕上げ方法が開発されている。衣類がデンプン分解酵素の作用を受けている間布地に柔軟性を与え、綿が次の酵素仕上げ段階をより受けやすくするためにデニム衣類の仕上げは通常酵素的湯通し段階で始まる。酵素をデニム衣類の仕上げ（例えば、「バイオ‐ストーン処理（ｂｉｏ‐ｓｔｏｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）、酵素的湯通し及び布地に柔軟性を与え、及び／又はプロセスの仕上げに用いてよい。アミラーゼの用量はプロセスのタイプで決まり多様である。小用量は大用量の同じ酵素より時間が必要となる。しかしながら、溶液の物理的制約条件によって示す量以外に湯通しアミラーゼ含有量に上限はない。すなわち、酵素の限界量は溶液の溶解できる量でよい。一般的に、アルファ‐アミラーゼのような湯通し酵素は、布地の重量で酵素蛋白質の約０．００００１％から約２％の量、又は布地の重量で酵素蛋白質の約０．０００１％から約１％の量、又は布地の重量で酵素蛋白質の約０．００１％から約０．５％の量で処理組成物に取り込まれるし、他の実施例では布地の重量で酵素蛋白質の約０．０１％から約０．２％の量である。

１１ 焼成及び食品の調製のための組成物及び方法
穀粉を焼成及び食品調製ための商業用及び家庭用に使用するには、穀粉中のアルファ‐アミラーゼ活性の適切なレベルを維持することは重要である。あまりに高い活性のレベルは粘性が高く及び／又はたるんだ及び商品にならない製品をもたらすが、不十分なアルファ‐アミラーゼ活性を有する穀粉は適切な酵母機能のための十分な糖を含有せず、その結果乾燥したもろいパンとなる。穀粉中の内因性アルファ‐アミラーゼ活性のレベルを増加するためにアルファ‐アミラーゼをバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の形態で穀粉に添加してよい。それゆえ、穀粉サンプル中の内因性の（天然の）及び菌類両者のアルファ‐アミラーゼ又は他のアルファ‐アミラーゼの活性のレベルを決定する能力は食品生産プロセスに利益を与え及び食品生産における穀粉のより効率的な使用を促進する。

焼成における穀物及び他の植物製品の使用に加えて、オオムギ、オートムギ、小麦、のような穀物や、トウモロコシ、ホップ、及び米のような植物成分は産業用及び家庭用醸造両方の醸造のために用いる。醸造にもちいる組成物は麦芽未処理又は麦芽処理されてよく、これは部分的発芽がアルファ‐アミラーゼ含有酵素のレベルを増加をもたらすことを意味する。連続醸造のために、十分なアルファ‐アミラーゼ酵素活性が発酵のための適切な糖のレベルを確保するのに必要である。

本明細書にて用いる用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は粉砕又は製粉された穀物をいう。また、用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は、粉砕又はつぶされたサゴ又は塊茎産物を意味する。ある実施態様においては、また、穀粉はさらに、粉砕またはつぶされた穀物または植物以外の成分を含んでよい。追加的成分の例はパン種剤であるが、これに限定されない。穀類は、小麦、オートムギ、ライ麦、及びオオムギを含む。塊茎産物はタピオカ粉、キャッサバ粉、及びカスタード粉を含む。また、用語「穀粉（ｆｌｏｕｒ）」は粉砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粒ミール粉、セルフライジングフラワー、タピオカ粉、キャッサバ粉、粉砕米、補強粉、及びカスタード粉を含む。

本明細書にて用いる、「原料（ｓｔｏｃｋ）」は粉砕又は破壊された穀物及び植物成分をいう。例えば、ビール生産で用いるオオムギは発酵用につぶしたものを生産するのにふさわしい濃度を生産するために荒く粉砕又はつぶした穀物である。本明細書にて用いる用語「原料（ｓｔｏｃｋ）」はつぶされ又は荒く粉砕した形態の植物及び穀物の任意の前述のタイプを含む。本明細書にて述べる方法は穀粉中又はつぶされた穀物、塊茎、及び他の植物産物の前述するタイプを含む原料中のアルファ‐アミラーゼ活性レベルを検出するために用いてよい。

また、本発明は穀粉及び穀物又は塊茎産物及び原料中のアルファ‐アミラーゼ活性を測定する方法を開示する。本明細書にて用いる用語「アルファ‐アミラーゼ（α‐ａｍｙｌａｓｅ）」は内因性のアルファ‐アミラーゼ（穀粉又は原料に存在する）または穀粉又は原料に添加するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をいう。

劣化を防ぐためにバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は単独にまたは他のアミラーゼとの組み合わせで添加してよい。抗劣化アミラーゼはパン製品の劣化（内部硬化）に関して効果的な任意のアミラーゼである。

アミラーゼはデンプン存在下例えば３０−９０℃、５０−８０℃、５５−７５℃、６０−７０℃の範囲の最適温度を有してよい。最適温度はｐＨ５．５で可溶性デンプン１％溶液中にて測定される。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼと組み合わせて用いる追加的抗劣化アミラーゼは例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来細菌エンドアミラーゼのような、エンド‐アミラーゼを含む。例えば、さらなるアミラーゼは、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来マルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｌｐｈａ‐ａｍｙｌａｓｅｓ）（ＥＣ３．２．１．１３３）でよい。Novamyl（商標）は、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株NCIB 11837由来のマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｌｐｈａ‐ａｍｙｌａｓｅｓ）及びC. Christophersen他１997 Starch 50(1): 39-45に記載される。

抗劣化エンドアミラーゼの他の例はバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の細菌類のアルファ‐アミラーゼを含む。

抗劣化アミラーゼは例えば、植物（例えば大豆）又は微生物由来（例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））のベータ‐アミラーゼのようなエキソアミラーゼである。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼはパン製品の劣化（内部硬化）を遅延するために効果的な量で単独に又は他のアミラーゼとの組み合わせで添加してよい。一般的に抗劣化アミラーゼは穀粉１ｋｇあたり０．０１−１０ｍｇの酵素蛋白質の範囲でよく、例えば、１−１０ｍｇ／ｋｇである。

バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼを含む焼成組成物は、さらにフォスフォリパーゼを含んでよい。フォスフォリパーゼはリン脂質又は溶解リン脂質から脂肪酸を除去するためにＡ_１又はＡ_２活性を有する。それはリパーゼ活性、言い換えるとトリグリセリドに対する活性を有しても有さなくてもよい。フォスフォリパーゼは３０−９０℃の範囲、例えば３０−７０℃の範囲で最適温度を有してよい。添加フォスフォリパーゼは動物由来、例えば、膵臓（例えば、ウシ又はブタ膵臓）、ヘビ毒又はハチ毒由来である。あるいは、フォスフォリパーゼは微生物由来、例えば、糸状菌、酵母又は細菌由来でよく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属又はその種のアスペルギルス ニガー（Ａ. ｎｉｇｅｒ）のような、タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属又はその種のキイロタマホコリカビ（Ｄ. ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のような、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属又はその種のムコール ジャバニカス（Ｍ. ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール ムセド（Ｍ. ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール サブチリシムス（Ｍ. ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）のような、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属又はその種のニューロスポラ クラッサ（Ｎ. ｃｒａｓｓａ）のような、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属又はその種のリゾムコール プシラス（Ｒ. ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属又はその種のリゾプス アルヒズス（Ｒ. ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス ジャポニカス（Ｒ. ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、リゾプス ストロニファー（Ｒ. ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）のような、スクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属又はその種のスクレロティニア リベルチアナ（Ｓ. ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ）のような、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属又はその種のトリコフィトン ルブルム（Ｔ. ｒｕｂｒｕｍ）のような、ウェトゼリニア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ）属又はその種のウェトゼリニア スクレロチニア（Ｗ.ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）のような、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はその種のバシルス メガトリウム（Ｂ. ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような、サイトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属又はその種のサイトロバクター フレウンディイ（Ｃ. ｆｒｅｕｎｄｉｉ）のような、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属又はその種のエンテロバクター アエロゲネス（Ｅ. ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター クロアカエ（Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ）のような、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属又はその種のエドワージエラ タルダ（Ｅ. ｔａｒｄａ）のような、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属又はその種のエルウィニア ヘルビコラ（Ｅ. ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）のような、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属又はその種の大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）のような、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属又はその種のクレブシエラニューモニアエ（Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のような、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属又はその種のプロテウス ブルガリス（Ｐ. ｖｕｌｇａｒｉｓ）のような、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属又はその種のプロビデンシア スチュアーティイ（Ｐ. ｓｔｕａｒｔｉｉ）のような、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属又はその種のサルモネラティフィムリウム（Ｓ. ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のような、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属又はその種のセラチア リクファシエンス（Ｓ. ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ）、セラチア マルセッセンス（Ｓ. ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属又はその種のシゲラ フレクスネリ（Ｓ. ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のような、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属又はその種のストレプトミセス バイオラセオルバー（Ｓ. ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ）のような、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属又はその種のエルシニアエンテロコリティカ（Ｙ. ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）のような、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属又はその種のフザリウム オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（例えば、ＤＳＭ２６７２菌株）ようなものでよい。

フォスフォリパーゼは焼成後初期の期間、特に、最初の２４時間パンのやわらかさを改善する量を加えてよい。フォスフォリパーゼの量は一般的に、穀粉（例えば、０．１−５ｍｇ／ｋｇ）のｋｇ当たり酵素蛋白質の０．０１−１０ｍｇ又は穀粉（例えば、５００−２０００ＬＥＵ／ｋｇ）の２００−５０００ＬＥＵ／ｋｇの範囲でよい。リパーゼ活性を有するフォスフォリパーゼは一般的に２０−１０００ＬＵ／ｋｇの穀粉、特に５０−５００ＬＵ／ｋｇのリパーゼ活性に相当する量を加えてよい。１ＬＵ（リパーゼ単位）は乳化剤としてアラビアゴム及び基質としてトリブチリンを有し、ｐＨ７．０、３０℃で１分当たり１μｍｏｌ酪酸を放出するために必要な酵素の量として定義される。

一般的にパン生地の組成物は小麦全粒粉又は小麦粉及び／又は他の全粒粉、粉、又はトウモロコシ粉、コーンスターチ、ライ麦の全粒粉、ライ麦の粉、エンバク粉、オートミール、大豆粉、ソルガム全粒粉、ソルガム粉、ジャガイモ全粒粉、ジャガイモ粉又はジャガイモデンプンのようなデンプンを含む。パン生地は生、冷凍又は標準的焼成（ｐａｒ‐ｂａｋｅｄ）状態でよい。

通常、パン生地は発酵生地又は発酵されるパン生地である。パン生地は種々の方法で発酵され、例えば、重層である化学膨張剤の添加により、又はイースト（パン生地を発酵する）を添加により発酵される。例えば、パン生地は例えば市場入手可能なサッカロミセス セレビジアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株であるサッカロミセス セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン用イースト）のような適切な酵母培養を添加することにより発酵される。

また、パン生地は他の従来よりのパン生地成分、例えば、牛乳粉、グルテン、及び大豆、のような蛋白質、卵（全卵、黄卵、又は卵白）、アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカ−ボンアミド（ＡＤＡ）又は過硫酸アンモニウムのような酸化剤、Ｌ‐システインのようなアミノ酸、糖、塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムのような塩を含む。

パン生地は粒状脂肪又はショートニングのような脂肪（トリグリセリド）を含んでよい。

さらに、パン生地は、モノ‐又はジグリセリド、モノ‐又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ｄｉａｃｅｔｙｌ ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒｓ）、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｌｉｙｌｅｎｅ ｓｔｅａｒａｔｅｓ）、又は、リゾレシチンのような乳化剤を含むが、乳化剤（任意のリン脂質以外）の添加をしていない生地を利用してよい。

任意に、追加的な酵素を抗劣化アミラーゼ及びフォスフォリパーゼと共に用いてよい。追加的な酵素はアミログルコシダーゼ、ベータ‐アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのような第二のアミラーゼでよく、又は追加的酵素はペプチダーゼ、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、特に、キシラナーゼ、プロテアーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼであって、例えば、ＷＯ ９５／００６３６記載のプロテインジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素（１，４‐アルファ‐グルカン分岐酵素）、４‐アルファ‐グルカノトランスフェラーゼ（デキストリン グリコシルトランスフェラーゼ）又は例えば、ペルオキシダーゼであるオキシドレダクターゼのようなペントサナーゼ、ラッカーゼ、グルコース オキシダーゼ、ピラノース オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、Ｌ‐アミノ酸オキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼでもよい。

追加的酵素は哺乳類及び植物由来や微生物（細菌類、酵母、又は菌類）由来を含む任意の原型に由来するものでよく、従来技術により得られる。

キシラナーゼは微生物由来でよく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌株、特に、セルロース高分解糸状菌（Ａ. ａｃｕｌｅａｔｕ）、アスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）(ｃｆ. ＷＯ ９１／１９７８２)、アスペルギルス アワモリ（Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）(ＷＯ ９１／１８９７７）、又はアスペルギルス ツビゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）(ＷＯ ９２／０１７９３)、例えばトリコデルマ レーシ（Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ）のようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株、又は例えばフミコーラ インソレンス（Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ）(ＷＯ ９２／１７５７３)のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株由来の細菌類又は菌類由来でよい。Pentopan（商標）及びNovozym 384（商標）はトリコデルマ レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）から生産される商業的に入手可能なキシラナーゼ調製品である。

アミログルコシダーゼはアスペルギルス ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ（商標）のような）でよい。他の有用なアミラーゼ製品はGrindamyl（商標）A 1000 又はA 5000 (Grindsted Products製, Denmark)及びAmylase（商標）H 又はAmylase（商標）P (DSM Gist Brocades製, The Netherlands)である。

グルコースオキシダーゼは菌のグルコースオキシダーゼ、特にアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（Gluzyme（商標）のような）でよい。

典型的なプロテアーゼはNeutrase（商標） (Novozymes)及びProtex OxG (Genencor International, Inc.)である。

典型的なリパーゼはサーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ) (フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）)、リゾムコール(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ), カンジダ（Ｃａｎｄｉｄ、ａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）または シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株由来であり、特にサーモミセス ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） (フミコーラ ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ)）、リゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)、カンジダ アンタルティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、リゾプス デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）又はリゾプス アルヒズス（Ｒ. ａｒｒｈｉｚｕｓ）又はシュードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来である。特定の実施態様においては、リパーゼは、WO 88/02775記載のカンジダ アンタルティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ又はリパーゼＢでよく、又はリパーゼはEP 238,023記載のリゾムコール ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ)又はEP 305,216記載のフミコーラ ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）又はEP 214,761及びWO 89/01032記載のシュードモナス セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来でよい。

本発明のプロセスは白色、ライト、ダークタイプの如何を問わず、ソフトとクリスピーとを問わず、これらのタイプのパン生地から調製される焼成産物の任意の種類に用いてよい。例えば、一般的に一斤のパン又はロール、フレンチバケットタイプのパン、ピタパン、トルチラス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイクラスト、クリスプパン、蒸しパン、ピザ、及びその類似物の形状のパン（特に、白、全粒又はライ麦パン）である。

別の実施態様においては、小麦粉とともに抗劣化アミラーゼ、フォスファターゼ及びフォスフォリピッドを一緒に含む予混合中におけるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用を含む。予混合は他のパン生地改善及び／又はパン改善添加剤、例えば、上述の酵素を含む任意の添加剤を含んでよい。

別の実施態様においては、パン添加剤として用いるために、抗劣化アミラーゼおよびフォスフォリパーゼを含む酵素調製を提供する。酵素調製は粒状又は凝集粉の形態でよい。それは２５から５００μｍの範囲で９５％（重量で）の粒子以上を有する分布の狭い分子サイズを有する。

粒状及び凝集粉は従来の方法により、例えば、流動層造粒において担体にアミラーゼをスプレーすることにより、調製してよい。担体は適切な粒子サイズを有する粒子の核の集合からなってよい。担体は可溶性又は不溶性でもよく、例えば、塩（ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムのような）、糖（スクロース又はラクトースのような）、糖アルコール（ソルビトールのような）、デンプン、米、ひき割りトウモロコシ、又は大豆でもよい。

別の実施態様は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼの被覆を含む。アルファ‐アミラーゼ粒子膜を調製するために、下記にさらに詳しく述べるようにすべてのアルファ‐アミラーゼ粒子を懸濁するために十分な量で、酵素を食品用の脂質と接触させる。

本明細書にて用いる食用脂質は、水に溶けないが、炭化水素又はジエチルエーテルのような非極性有機溶剤中に溶ける任意の自然の有機化合物でよい。用いる食用脂質は飽和又は不飽和の脂肪又は油のいずれかの形態であるトリグリセリドを含むがこれに限定されない。用いる飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、酪酸（乳脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物脂肪由来）、及び／又はステアリン酸（動物及び植物脂肪由来）を含むが、これに限定されない。用いる不飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、パルミトレイン酸（動物及び植物脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物脂肪由来）、 リノール酸（植物油由来）及び／又はリノール酸（亜麻仁油由来）を含むが、これらに限定されない。本発明に含まれる他の食用脂質は上述するトリグリセリド由来のモノグリセリド及びジグリセリド、リン脂質及びグリコリピッドを含むが、これらに限定されない。

液体の形態の食用脂質はアルファ‐アミラーゼ粒子の粉状形態と接触し脂質の材料がアルファ‐アミラーゼ粒子表面の少なくとも大半、例えば１００％覆うようにされる。すなわち、各アルファ‐アミラーゼ粒子は個別に脂質に包まれる。例えば、アルファ‐アミラーゼ粒子のすべて、又は実質的にすべては薄く、連続的な脂質のフィルム膜を有する。これは、まず容器に多量の脂質を注ぎ、それから脂質が各アルファ‐アミラーゼ粒子の表面を全面的に濡らすようにアルファ‐アミラーゼをスラリー化することにより実施される。短時間の撹拌後、被包されるアルファ‐アミラーゼ粒子は表面に相当量の脂質を有するように覆われる。コーティングの厚みは、アルファ‐アミラーゼ粒子が用いる脂質のタイプの選択により及び必要ならば、より厚い膜を構築するためにその操作を繰り返すことにより制御できるように適用できる。

封入輸送粒子の貯蔵、取扱い及び混合はパッケージ混合物の方法により実施できる。パッケージ混合物は被包アルファ‐アミラーゼを含むことができる。しかしながら、さらに、パッケージ混合物には製造業者又はパン職人が、必要に応じて、追加的な成分を加えることができる。被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に取り込み後、職人は製パンのための通常の生産工程を続ける。

被包されるアルファ‐アミラーゼの有利な効果は２点ある。第一に、食用脂質は焼成プロセスの間酵素が熱に不安定な場合酵素を熱変性から保護する。続いて、アルファ‐アミラーゼはプルーフィング及び焼成段階の間安定化及び保護されている間に、最終焼成産物中に保護コーティングから放出され、ポリグルカンのグルコシド結合を加水分解する。また、封入輸送粒子によって焼成産物へ活性酵素の多量な放出ができる。つまり、焼成プロセスに続いて、活性アルファ‐アミラーゼが中和する速度で保護膜から連続的に放出され、それ故、劣化作用の割合が低減できる。

一般的に、アルファ‐アミラーゼ粒子に適用する脂質の量はアルファ‐アミラーゼの全量の数パーセントから重量の何倍までと多様であり、これは脂質の性質、アルファ‐アミラーゼ粒子の適用方法、処理されるパン生地の組成物、及び関係するパン生地混合操作の激しさで決定される。

封入輸送粒子（言い換えると、脂質で被覆される酵素）は焼成品の保存期間を延長できる効果的な量で焼成品を調製するために用いる成分を加えてよい。パン職人は上述のように調製する被包される所望の抗劣化効果を得るために必要なアルファ‐アミラーゼの量を計算する。被包されるアルファ‐アミラーゼの必要量を包まれる酵素の濃度に基づき及び具体的な穀粉に対するアルファ‐アミラーゼの割合に基づいて計算する。広い範囲の濃度が効果を有するが、上述のように、抗劣化に見られる改善はアルファ‐アミラーゼの濃度に正比例しない。アルファ‐アミラーゼの濃度の上記の特定の最小限レベルでは大量の増加があるが、それ以上のレベルではアルファ‐アミラーゼを大量に加えても追加的改善はあまりない。職人による不用意な測定誤差に対してパン職人にある程度の保険を与えるために、特定のパン生産にて実際に用いるアルファ‐アミラーゼ濃度は必要最小限よりかなり高くてよい。酵素濃度の最低限度はパン職人が望む最小の抗劣化効果によって決定される。

本発明の方法に従って焼成品を調製する典型的な方法は、ａ）脂質でコートされるアルファ‐アミラーゼ粒子の調製であって、実質的にアルファ‐アミラーゼ粒子の１００％がコーティングされ、ｂ）小麦粉を含むパン生地を混合し、ｃ）混合が完全になり混合が終了する前に及び脂質膜がアルファ‐アミラーゼを放出する前に脂質コーティングアルファ‐アミラーゼをパン生地に添加し、ｄ）パン生地をプルーフィングし、ｅ）パン生地を焼いて焼成品を提供することであって、アルファ‐アミラーゼが混合、プルーフィング、及び焼成段階で不活化され、焼成品中にて活性であることを含む。

つまり、被包アルファ‐アミラーゼを混合サイクルの最終に近い段階の生地に添加してよい。方法の特徴は、被包アルファ‐アミラーゼをパン生地全体に被包アルファ‐アミラーゼが十分に分布できる混合段階のある時点で添加し、保護膜がアルファ‐アミラーゼ粒子から剥がれる前に混合段階を終了する。パン生地のタイプ及び体積、混合作用及びスピード次第で、１分から６分以上の間が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に混合するために必要となるが、平均は２分から４分間である。つまり、正確な手法を決定するいくつかの変数がある。第一に、被包アルファ‐アミラーゼの量は十分に被包アルファ‐アミラーゼをパン生地混合全体に拡散させる全量を有さなければならない。被包アルファ‐アミラーゼの調製品が高い濃度の場合、被包アルファ‐アミラーゼがパン生地に追加される前に、追加油は予混合物に添加される必要性がある。レシピ及び製法プロセスは具体的な改変が必要とされることがある。しかしながら、パン生地製品の処方に用いられる２５％の油をパン生地に加えずに、ほぼ最終の混合サイクルで添加し、濃縮被包アルファ‐アミラーゼ用の担体として用いる場合に一般的に良い結果がもたらされる。かなり低脂肪含有量（フレンチスタイルのパンのような）を有するパン又は他の焼成品レシピにおいて、約１％乾燥粉末重量の被包アルファ‐アミラーゼ混合物が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地と適切に混合するのに十分であることがわかるが、作用するパーセントの範囲はかなり広く製造設計、最終産物、及び周知の制限よりも個別のパン職人が必要する生産方法に依存する。第二に、パン生地への混合を仕上げるために混合サイクルを維持する十分な時間をかけて、被包アルファ‐アミラーゼ懸濁液を混合物に添加しなければならないが、過度な機械的作用が被包アルファ‐アミラーゼ粒子の大部分から保護脂質膜をはがす前でなければならない。

他の実施態様においては、細菌のアルファ‐アミラーゼ（ＢＡＡ）を脂質コーティング酵素粒子に添加してよい。ＢＡＡは過度な耐熱性及び完全に焼いたパンの塊中で残留活性を維持するのでパンの粘着性を低減することが知られている。しかしながら、ＢＡＡが保護酵素産物に取り込まれる場合、実質的な追加的抗劣化保護が得られ、極めて低いＢＡＡの用量においてさえもかかる保護が得られることが明らかである。例えば、小麦粉１００パウンド当たり１５０ＲＡＵ（アミラーゼ単位参照）のＢＡＡ用量は効果的である。ある実施態様においては、約５０から２０００ＲＡＵ間のＢＡＡを脂質コーティング酵素産物に加える。この低いＢＡＡ用量レベルは、完全に焼けたパンの塊中で酵素が自由にデンプンと接触することを避ける（水蒸気が酵素をそのコーティングから不規則に放出する場合を除く）ために保護コーティング能力を備えており、ＢＡＡの消極的な副作用をもたらさずに抗劣化活性の非常に高いレベルを達成するために役立つ。

多様な改変及び多様性は本明細書に記載の組成物及び方法であること及びさらに特許請求の範囲から逸脱せずに下記実施例が実証されることは当業者にとって明らかである。

実施例１
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼのコドン最適化
合成バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ遺伝子、ｐｒｅＬＡＴ−Ａｍｙ７０７はＧｅｎｅＡｒｔ （Ｇｅｒｍａｎｙ）に発注した。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ（A. Tsukamoto他、1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 151(1): 25-31）をコードする遺伝子は、ｐＩＣａｔＨ（図４参照）ベクターに組み込まれ、結果としてｐＩＣａｔＨ−Ａｍｙ７０７（ｏｒｉｌ）を設計する産物を得る (図５参照)。ｐＩＣａｔＨは次の特徴を含む。それは、（１）複製（バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）複製用ｏｒｉ ｐＥ１９４）由来の温度感受性、（２）ｏｒｉ ｐＢＲ３２２ (大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における増幅用)、（３）選択のためのネオマイシン耐性遺伝子、及び（４）選択、染色体組み込み、及びカセット増幅のための天然バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）である。ｐＩＣａｔＨ−Ａｍｙ７０７（ｏｒｉｌ）をＢＭＬ７８０ (ｃａｔ−、ａｍｙＬ−、ｓｐｏ−、ａｐｒＬ−、ｅｎｄｏＧｌｕＣ−のＢＲＡ７誘導体)である宿主菌株へ許容状態の温度（３７℃）で形質転換した。あるネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）及びあるクロラムフェニコール耐性（ｃａｐＲ）形質転換体を選択し、ＢＭＬ７８０ （ｐＩＣａｔＨ−Ａｍｙ７０７（ｏｒｉｌ））を構築した。ＢＭＬ７８０（ｐＩＣａｔＨ−７０７（ｏｒｉ））のプラスミドをクロラムフェニコール含有ＴＳＢ（トリプティックソイブロス）培地中非許容状態温度（言い換えると、〜５０℃）で菌株を培養することによりバシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子上のｃａｔ領域に組み換えた。あるクロラムフェニコール耐性クローンを選択しＢＭＬ７８０−ｐＩＣａｔＨ−Ａｍｙ７０７（ｏｒｉｌ）を構築した。ベクター配列をループアウトするために選択される菌株を抗生物質を含まないで継代して許容状態の温度で培養し、それからあるネオマイシン感受性（ｎｅｏＳ 及びｃａｐＲ）クローンを選択した。このクローンにおける染色体上ｐＩＣａｔＨのベクター配列が切除され、ネオマイシン耐性遺伝子を含み、Ａｍｙ７０７−ｃａｔカセットのみ放出する。用いるｃａｔ遺伝子は
天然バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子であり、Ａｍｙ７０７遺伝子は宿主に導入される唯一異種のＤＮＡ断片であることに注意されたい。

次に染色体上のＡｍｙ７０７−ｃａｔカセットをクロラムフェニコールの濃度を増加する（言い換えると、５、２５、５０、及び７５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）状態でＴＳＢ培地にて菌株を培養することにより増幅した。多くの回数の増幅後、二個のクローンが選択（７５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールに対する耐性及び可溶性デンプン含有ハートインフィージョン寒天プレート上に培養の際ヨウ素染色後最も大きなハローを形成する）された。それは、ＢＭＬ７８０−Ａｍｙ７０７−ＣＡＰ７５クローン１及びクローン２である。両菌株はデンプン寒天プレート上に大きなハローを形成する。

実施例２
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼの精製
ＢＭＬ７８０−Ａｍｙ７０７−ＣＡＰ７５で形質転換する細胞を周知技術を用いて発酵した。細胞を培養培地から分離し、ＵＦＣを得るために培地をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｐｒｅｐ ｓｃａｌｅ ＴＦＦ−６ １０Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ＵＦ膜カートリッジ（Millipore Corp., Bedford, MA; Cat. No. CDUF 006 TG）を用いて濃縮した。１及び２ｇ／Ｌ間のアルファ‐アミラーゼを含有する限外濾過濃縮（ＵＦＣ）は１０Ｋ透析（SpecraPor カタログ番号 132119）チューブで２０Ｌの２ｍＭ塩化カルシウム含有２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に対して終夜透析した。透析液を濾過し材料の半分を陽イオン交換カラム（POROS HS 20 83 mL; Applied Biosystems, California）に注入した。陽イオン交換カラムを１ｍＭ塩化カルシウム含有２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０にて前もって平衡化した。カラムをＡ２８０ｎｍでの吸収（Ａ）が０．１ＯＤ以下になるまで同様の緩衝液で広く洗浄し、酵素活性を同様の緩衝液で０から１００ｍMの塩化ナトリウムの勾配で溶出した。アルファ‐アミラーゼ活性を９０ｍM塩化ナトリウムで溶出した。Megazyme（商標）アルファ‐アミラーゼキット(カタログ番号 K-CERA;Megazyme)用いて測定した際の酵素活性に基づいて活性を有する分画を集めた。残りのサンプルを同様に処理し第一サンプルとして集めた。硫酸アンモニウムをこの集めたサンプルの３分の１量に加え７５０ｍMにし、９６ｍLフェニルセファロースカラム（カタログ番号17-0973-10; GE Healthcare）に注入した。そのカラムは前もってｐH６．８に調整した７５０ｍM硫酸アンモニウム、２ｍM塩化カルシウム含有５０ｍMMES緩衝液（４−モルフォリンエタンスルフォン酸（4- morpholineethanesulfonic acid ）緩衝液）で平衡化していた。同様の緩衝液で洗浄後、アルファ‐アミラーゼ蛋白質を７５０ｍＭから０ｍＭ硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出した。酵素活性をこの勾配の最終段階で溶出した。酵素活性を有する分画を集めた。残りのイオン交換で集めた分画を同様に精製した。すべてのフェニルセファロース処理で集めたサンプルを合わせて１０Ｋセルロース性膜(Millipore)を有する撹拌アミコンセル(Millipore)で濃縮した。濃縮物を１６時間５ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭマレイン酸水素（hydrogen maleate ）緩衝液（ｐＨ６．８）に対して１０Ｋ透析チューブを用いて透析した。酵素の溶解性を助けるためにこの透析サンプルを１０％ソルビトールで補充した。滅菌濾過後、サンプルを含むバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼをゲルデンシトメトリーにより定量し、２．８ｍｇ／ｍＬの定量を示した。

実施例３
能力の特徴
能力試験は米デンプン（Test Fabrics カタログ番号CS-28; TestFabrics Inc.）に結合する指示染料を有する米デンプン汚れ生地見本（ｆａｂｒｉｃ ｓｗａｔｃｈｅｓ）を導入した。洗浄能力を溶液層への指示染料の放出のより判断した。試験前に、汚れた試験生地を１時間蒸留水で予洗浄し、空気乾燥した。試験生地の予洗浄によって試験前に弱く結合する指示染料が除かれた。

４分の１インチの断片を予洗浄生地から切り出し、９６穴プレートに移した。１９０μＬの洗剤を各ウェル（IEC-A* Base Detergent;カタログ番号88010-1; WFK Testgewebe GmBH, Germany）に加えた。見本及び洗剤を含むプレートを１５分間４０℃でプレインキュベーションした。反応を各ウェルにつき１０μＬ添加した０から３ｐｐｍの実施例２のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はコントロールとして、０から３ｐｐｍアルファ‐アミラーゼ（OxAm(Purastar（商標)） Genencor International, Inc.）を添加することにより開始した。プレートは７５０ｒｐｍで約４０℃で１０分間インキュベートした（Eppendorf Thermomix）。インキュベーション後１５０μＬの上清を新しいプレートに移し、上清（放出指示染料を有する）の吸光度をＡ４８８で測定した。

比較のために同様の試験をＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）(Novozymes) 及びＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）); Genencor International, Inc.)、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ誘導体（Genencor 製品）を用いて行った。上述同様の条件の下、試験において０から３．２ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）を用いた。

ＩＥＣ「Ａ」標準洗剤ｐＨ８．０（洗濯条件）のデータを図１に示す。吸光度はアルファ‐アミラーゼ濃度を関数として表した。この試験によりバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼがこれらの条件下、ＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)より顕著に良く及びＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）と同等であることがわかった。

同様の試験、同量のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ及び同量のＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)及びＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）を用いて、試験をｐＨ１０．１に調整して繰り返した。これらの条件（言い換えると、ｐＨの上昇）は自動食器洗浄の条件と類似している。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼの性能はｐＨ１０．１にて再度ＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)よりよく、驚くほどＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）よりよかった。図２を参照願いたい。

実施例４
Ｔｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒを用いた洗剤試験
材料及び方法
使用見本
CFT 綿上のココア、STC CFT CS-2 (TestFabrics)
CFT 綿上染料を有する全卵、STC CFT CS-37 (TestFabrics)
CFT 綿上着色米デンプン、 STC CFT CS-28 (TestFabrics)
2X 各運転ごとに白く漂白済み綿
レギュラーローディング（regular loading）４０ｇ／Ｌを作るために用いるエキストラバラスト（Extra ballast）
１ＬＴｅｒｇ‐ｏ‐ｔｏｍｅｔｅｒ中
5mM HEPES pH8.0, 1.5g/L
AATCC HDL WOB (2003)
漂白剤代替手段（不活化）を伴う1.8g/L タイド（Tide）
6gpg 水の硬度, 温度 74°F又は23.3℃
処理：1). AATCC、 2). AATCC + 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ、 3). AATCC + 0.1ppm Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、 4). タイド（Tide）、5). タイド不活化、6). タイド不活化+ 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ、7). タイド不活化 + 0.1ppm Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、8). タイド不活化 + 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ+ 0.5ppm Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）Ｐｒｉｍｅ、タイド不活化 + 0.1ppm Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）+ 0.5ppm Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）Ｐｒｉｍｅ (Genencor)。AATCCを１．５ｇ／Ｌ量存在し及び不活化タイドは１．８ｇ／Ｌ存在した。

結果。図６にて示すように、洗濯能力における違いがコントロール及びココア及び卵汚れ用処理酵素の間で見られず、両者の汚れに対する洗濯の飽和を示した。活性タイドは０．１ｐｐｍ７０７アルファ‐アミラーゼを用いる不活化タイドに匹敵する結果であった。７０７アルファ‐アミラーゼはＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）より低い効果であった。Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）Ｐｒｉｍｅの追加はＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）又は７０７アルファ‐アミラーゼのいずれの洗濯能力に変化を与えなかった（図６）。

実施例５
ラウンダー‐Ｏ‐メーター（Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ）試験を用いるアルファ‐アミラーゼ
材料及び方法
使用見本、
CFT 綿上のココア、STC CFT CS-2
CFT 綿上染料を有する全卵、STC CFT CS-37
綿上着色デンプン、EMPA 161
CFT綿上着色コーンスターチ、STC CFT CS-26
CCFT 綿上着色米デンプン、STC CFT CS-28
ポットへの添加、
2X 白く漂白した綿を各ポットに加えた。４２ｇ／２００ｍＬ（漂白綿インターロック）のレギュラーローディング（regular loading）になるようにエキストラバラスト（Extra ballast）を各ポットに加えた。水は１２ｇｐｇの硬水を有した。試験を４０℃で４０分間実施した。

処理：８ｇ／Ｌ 漂白剤を含むＩＥＣＡ＊。これらの洗剤組成物は洗剤単独で、洗剤に０．２ｐｐｍの７０７アルファ‐アミラーゼ（４ｍｇ／ｍＬ）を添加又は洗剤に０．２ｐｐｍのＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）を添加したもの存在下いずれかで実施した。洗浄を洗浄前後両方で５０ｍｍアパーチャーを有するミノルタ反射率計を用いて測定した。

結果。試験よりコントロール及び酵素処理間のココア及び全卵見本洗浄における顕著な効果はみられなかった（図７）。漂白剤を有するＩＥＣＡ＊コントロールはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼがＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）より良いことを示した。

実施例６
食器洗剤
材料及び方法。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼを米ミルク汚れにおける自動食器洗浄を用いてＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）及びＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)と比較して試験した。図８に示すように、洗剤はＷｆＫ Ｃ（標準ＡＤＤを含むリン酸）及び漂白剤（WFK Testgewebe GmBH, Germany）であった。漂白剤は過ホウ酸塩を用いた。Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）は活性酵素に等しい２５ｍｇ／ｇの濃度で用いた。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番を４ｍｇ／ｇの濃度で用いた。ＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)を３．２ｍｇ＝０．６％ｗ／ｗの用量の濃度で用いた。磁製皿をＩＫＷ製の混合デンプン及び米ミルク（Genencor International, Inc.）で汚した。ジェネンコア製の米ミルク汚れを１４０℃で磁製皿上にて焼いた。汚れた皿を水硬度２１°ＧＨで５０℃にてミーレ（Miele）食器洗浄機で洗浄した。米ミルク試験の結果を図８に示す。混合デンプン試験の結果を図９に示す。また、０．８％のプロペラーゼ（properase）４０００Ｄ洗剤組成物を加えた。アルファ‐アミラーゼを自動食器洗浄の条件中０．４、０．８、１．６、及び３．２ｍｇの総活性酵素の酵素用量で加えた。

結果。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼは自動食器洗浄（ＡＤＷ）試験の最大値の酵素量でＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）の効果と同じくらいであり、少なくともＳｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）の実験誤差範囲内である。自動食器洗浄条件におけるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼはＯｘＡｍ(Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）)より高い能力であった。

実施例７
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のアルファ‐アミラーゼ及び変異体
U.S. Patent Nos. 6,093,562、6,187,576、6,197,565、 6,204,232、6,297,038、6,309,871、6,486,113、6,528,298、6,623,948、6,673,589、6,867,031、及び6,887,986、Published U.S. Application Nos. 20040096952、20040253676、20050059131、20050084937、20050196853、2005025664、及び 20060035323、European Application Nos. EP 1423513及びEP 1538155、International PCT Application Nos.WO 01/64852、WO 0166712、WO 01/88107、WO 01/96537、WO 02/092797、及びWO 02/10355、及びJapanese Application Nos. JP2001520006、JP2001521739、JP2002530072、及びJP2004505606に開示する任意の変異体を含むために上記実施例１−２に記載のコドン最適化変異体をさらに組み換え修飾することができる。

実施例８
Ｍ２０２Ｌアルファ‐アミラーゼ変異体
Ｍ２０２Ｌ変異体を標準的な方法を用いてアルファ‐アミラーゼ配列の２０２位のメチオニンに変えてロイシンに置換することにより創製した。追加的な変異体はＭ２０８及びＭ２６１での異なるアミノ酸の置換及びこれらの３箇所で一以上の置換の組合せを含む。任意の変異体の精製を上記のように調製できる。

実施例９
Ａｍｙ７０７変異体の洗浄能
材料及び方法。上述のようにＣＳ−２８米デンプンで汚される見本を表示のアルファ‐アミラーゼ酵素の存在下２０℃で漂白剤の有る又は無い状態でインキュベートした。ＩＥＣ“Ａ”標準条件を試験に用いた。変異体を当業者が周知の方法で調製し、培地上清から精製せずに用いた。変異体の濃度をＳＤＳＰＡＧＥゲルの濃度により測定した。この実験の洗剤は８ｇ／Ｌで用いたＩＥＣ“Ａ”であった。洗剤存在下、漂白剤が漂白活性システムである過ホウ酸ナトリウム（１３．７ｍＭ）及びＴＡＥＤ（１．８５ｍＭ）により供給された。

結果。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番のＭ２０２Ｌ変異体は漂白剤の無い溶液に比較して漂白剤存在下高い活性を有した。Ｍ２０２Ｌ変異体は野生型バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼで得られた結果と比較して漂白剤存在下活性が増加した。図１０を参照願いたい。漂白剤非存在下、Ｍ２０２Ｌ変異体は野生型の酵素を含む組成物より活性が低下した。

上記に引用するすべての参考文献はすべての目的のためにその全部が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (55)

1. バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白剤、ＣａＣｌ_２、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物。
2. 請求項１に記載の手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物を投与することを含む食器を洗浄する方法。
3. バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗濯洗剤添加剤。
4. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、ＣａＣｌ_２、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項３記載の洗濯添加剤を含む洗濯洗剤。
5. 前記ＣａＣｌ_２が約０．１ｍＭから約２０ｍＭの量で洗剤中に存在することを特徴とする、請求項４記載の洗濯洗剤。
6. バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする単離された核酸であって、前記変異体が配列番号３のＭ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２、及び／又はＭ２６１の置換からなる群から選択される置換又は欠損残基を有することを特徴とする単離された核酸。
7. 前記Ｍ２０２変異体がＭ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択される置換変異体、Ｓ２５５置換がＳ２５５Ｎである、及びＲ１７２置換がＲ１７２Ｑであることを特徴とする、請求項５記載の単離された核酸。
8. 配列番号３又はその変異体を含むアルファ‐アミラーゼであって、前記変異体が配列番号３のＭ２０２、Ｍ２０８、及び／又はＭ２６１残基での置換又は欠損残基を含むことを特徴とするアルファ‐アミラーゼ。
9. 前記変異体が
   （a） Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
   （b） Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
   （c） Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
   を特徴とする、請求項８記載のアルファ‐アミラーゼ。
10. 請求項６記載の核酸を含むベクター。
11. 請求項６記載の核酸を含む単離された宿主細胞。
12. 請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。
13. 前記細胞が微生物であることを特徴とする、請求項１１又は１２いずれかの単離された宿主細胞。
14. 前記微生物が細菌又は真菌であることを特徴とする、請求項１３記載の宿主細胞。
15. 前記微生物がバシルス ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス リチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス レンツス（Ｂ． ｌｅｎｔｕｓ）、 バシルス ブレビス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス ステアロテルモフィルス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アルカロフィリス（Ｂ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス アミロリケファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス コアグランス（Ｂ． ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス シルクランス（Ｂ． ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス ランツス（Ｂ． ｌａｕｔｕｓ）、 バシルス ツリンギエンシス（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ストレプトミセス リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス ムリナス（Ｓ． ｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群から選択されるグラム陽性菌又はグラム陰性菌であって、前記グラム陰性菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種であることを特徴とする、請求項１４記載の単離された宿主細胞。
16. 洗濯洗浄及び／又は食器洗浄のための請求項８記載のポリペプチドの使用。
17. 洗濯洗浄及び／又は食器洗浄のための請求項８記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用。
18. 任意に非粉塵化（ｄｕｓｔｉｎｇ）粒状、マイクロ粒状、被安定化液、又は被保護酵素の形態である請求項８記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤添加剤。
19. さらに、前記洗浄添加物がセルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の洗剤添加剤。
20. 前記アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、イソアミラーゼ、又はグルコアミラーゼであることを特徴とする、請求項１９に記載の洗剤添加剤。
21. 請求項８に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤組成物。
22. 請求項１８に記載の洗剤添加物を含む洗剤組成物。
23. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項２１に記載の洗剤組成物。
24. 請求項８に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体のポリペプチドを含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。
25. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項２４に記載の手作業又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。
26. さらに、一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白剤、ＣａＣｌ_２、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む請求項２４又は２２のいずれかの手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。
27. 前記ＣａＣｌ_２が約０．１ｍＭから約２０ｍＭの量で洗剤中に存在することを特徴とする、請求項２６記載の手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。
28. 請求項８に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤添加剤
29. 請求項２８記載の洗剤添加物を含む手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
30. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項２９に記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
31. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、ＣａＣｌ_２、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項２９又は３０いずれかに記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
32. ＣａＣｌ_２が約０．１ｍＭから約２０ｍＭの量で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項３１記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
33. 請求項８に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物
34. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項３３に記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
35. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、ＣａＣｌ_２、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項３３又は３４いずれかに記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。
36. 繊維の湯通しのための請求項８に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用。
37. 水溶液中請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む繊維の湯通し組成物及び任意に酵素を含む繊維の湯通し組成物。
38. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項３７記載の繊維の湯通し組成物。
    
39. 前記繊維を湯通しするために十分な時間請求項３７又は３８のいずれかに記載の湯通し組成物を投与することを含む繊維を湯通しする方法。
40. 水溶液中請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン処理組成物。
41. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項４０記載のデンプン処理組成物。
42. さらに、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ又はそれらの組み合わせを含む請求項４０に記載のデンプン処理組成物。
43. 前記デンプンを処理するために十分な時間請求項４０から４２のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含むデンプンを処理する方法。
44. 溶液又はゲル中に請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むバイオフィルム加水分解組成物、及びさらに任意にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、抗菌剤、又はそれらの組み合わせを含むバイオフィルム加水分解組成物。
45. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項４４記載のバイオフィルム加水分解組成物。
46. 前記バイオフィルムを処理するために十分な時間請求項４４又は４５のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含むバイオフィルムを加水分解する方法。
47. 溶液中に請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン糖化用組成物。
48. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項４７記載の組成物。
    
49. デンプンを糖化するために十分な時間請求項４７又は４８のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含む前記デンプンを糖化する方法。
50. 溶液中に請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン液化用組成物。
51. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項５０に記載の組成物。
52. デンプンを液化するために十分な時間請求項５０又は５１のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含む前記デンプンを液化する方法。
53. 溶液又はゲル中に請求項８に記載のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むパンの焼成組成物。
54. 前記変異体が
    （ａ）Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、及びＭ２０２Ｗからなる群から選択されるＭ２０２変異体；
    （ｂ）Ｓ２５５ＮであるＳ２５５変異体；及び／又は
    （ｃ）Ｒ１７２ＱであるＲ１７２変異体
    を特徴とする、請求項５３に記載のパンの焼成組成物。
55. 請求項５３又は５４のいずれかに記載の前記パンの焼成組成物を投与することを含むパンの焼成方法。
    

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