JP2010520767A - Alkaline Bacillus species alpha (Bacillussp.) - amylase variant, alpha - compositions and methods of use comprising the amylase variants. - Google Patents

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Abstract

バシルス種(Bacillus sp.)707番由来アルファ‐アミラーゼの変異体、前記変異体を含む組成物、及び変異体の使用方法を開示する。 Bacillus species 707 from the alpha (Bacillus sp.) - variants of amylases, compositions comprising the mutant, and discloses the use of mutants. 使用方法は、表面洗浄、繊維洗濯、湯通し、多様な物質を放出するバイオフィルムを加水分解し、及びデンプン処理(例えば、液化及び糖化)の方法を含む。 The method used is surface cleaning, textile washing, blanching, the biofilm to release a variety of substances was hydrolyzed, and the methods of starch processing (e.g., liquefaction and saccharification).
【選択図】図1 .FIELD 1

Description

関連出願 RELATED APPLICATIONS
本願の特許請求の範囲は2007年3月9日に出願した、「アルカリ性バシルス(Bacillus)種変異体、アルファ‐アミラーゼ変異体を含む組成物、及び使用方法」というタイトルである米国仮出願番号第60/905,811に基づき優先権を主張する。 Claims of the present application was filed on March 9, 2007, "alkaline Bacillus (Bacillus) species variant, alpha - composition comprising the amylase variants, and methods of use" The U.S. Provisional Application No. is titled based on the 60 / 905,811 claims priority.

配列リスト Sequence Listing
すべての目的のためにその全体を参照により本明細書に取り込まれる配列番号1−3を含む配列リストを添付する。 Attached sequence listings including SEQ ID NO: 1-3 are incorporated herein in its entirety by reference for all purposes.

発明の分野 Field of the invention
バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ及びその変異体、それらの組成物及び使用を開示する。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase and variants thereof, disclosed their compositions and use.

デンプンはアミロース(15から30%w/w)とアミロペクチン(70から85%w/w)の混合物からなる。 Starch consists of a mixture of amylose (15 to 30% w / w) and amylopectin (70 to 85% w / w). アミロースは約60、000から約800、000からの分子量(MW)を有する直鎖アルファ‐1,4‐結合グルコースユニットからなる。 Amylose consists of linear alpha-1,4-linked glucose units of about 60,000 with a molecular weight of about 800,000 (MW). アミロペクチンは24から30のグルコースのユニットごとにアルファ‐1、6分岐点を含む枝分かれポリマーであり、そのMWは100万位である。 Amylopectin is a branched polymer containing alpha 1,6 branch points every unit of 30 glucose 24, the MW is 1,000,000 position.

濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、(1)アルファ‐アミラーゼでの固体デンプンの液状化(又は粘度低下)による約7から10の平均重合度を有するデキストリンの生成(2)アミログルコシダーゼ(またグルコアミラーゼ又はGAと呼ばれる)で得られた液状デンプン(言い換えると、デンプン加水分解物)の糖化を含む酵素の触媒によるプロセスで生産される。 Sugars derived from starch in the form of concentrated dextrose syrups, are currently (1) alpha - liquefaction of solid starch with amylase (or viscosity reduction) produced dextrins having an average degree of polymerization of from about 7 to 10 by (2) amylo glucosidase (also called glucoamylase or GA) (in other words, a starch hydrolyzate) obtained liquid starch produced by the process according to the catalyst of an enzyme comprising saccharification of. 得られたシロップは高いグルコース含有量を有する。 The resulting syrup has a high glucose content. 商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後に、イソシロップで知られるデキストロース/フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。 Many glucose syrup that is commercially produced is later enzymatically isomerized to dextrose / fructose mixture known in isosyrup.

アルファ‐アミラーゼ類(EC 3.2.1.1)は不規則に内部のアルファ‐1,4‐グルコシド結合を切断することによりデンプン、グリコーゲン、関連する多糖を加水分解する。 Alpha - amylases (EC 3.2.1.1) starch by irregularly cut the inside of the alpha-1,4-glucosidic bonds, glycogen, hydrolyze the relevant polysaccharide. この酵素のクラスは、例えばデンプンの液状化、繊維の湯通し、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの改変、及び醸造において数多くの重要な産業上の利用を有する。 This class of enzyme includes, for example, liquefaction of starch, desizing textile, starch modification in the paper and pulp industry, and the use of the number of important industries in brewing. また、これらの酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除くため及び糖、醸造、アルコール及び繊維産業において用いることができる。 These enzymes can be used in and sugar, brewing, alcohol and textile industry to remove starch stains in dishwashing and laundry. アルファ‐アミラーゼは、広範囲の細菌類、菌類、植物、及び動物の供給源から単離される。 Alpha - amylase, a wide range of bacteria, fungi, are separated plants, and from animal sources single. 産業的に、多くの重要なアルファ‐アミラーゼは、バシルス(Bacilli)から単離されたものである。 In industry, many of the important alpha - amylase, has been isolated from Bacillus (Bacilli).

ある特徴的なアルファ‐アミラーゼはアルカリ性バシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼである。 There characteristic alpha - amylase Alpha alkaline Bacillus species 707 - amylase (Bacillus sp.). バシルス種(Bacillus sp.)707番はデンプン加水分解活性を有する主に5種類の酵素を生産する。 Bacillus species (Bacillus sp.) 707 number will produce mainly five kinds of enzymes having starch hydrolyzing activity. それらの分子量は約110、95、85、75、及び60kDaである。 Their molecular weight is about 110,95,85,75, and 60 kDa. A. Tsukamoto他「Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp. #707 and structural similarity to liquefying type α-amylase」 Biochem. & Biophys. Res. Comm. 151(1): 25-31 (1988)。 ... A. Tsukamoto et al., ". Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp # 707 and structural similarity to liquefying type α-amylase" Biochem & Biophys Res Comm 151 (1):. 25-31 ( 1988). 同定されたアルファ‐アミラーゼは59,007.5ダルトンの測定分子量を有する518アミノ酸の長さである。 Identified alpha - amylase is the length of 518 amino acids with a molecular weight measurement of 59,007.5 Daltons. Tsukamoto 他(1988)。 Tsukamoto et al. (1988). 初めの33アミノ酸は蛋白質排出の分泌に関するシグナルペプチドとして作用する。 33 amino acids of the first acts as a signal peptide regarding the secretion of the protein excretion. それゆえ、細胞外形態は、55,372ダルトンの測定分子量を有する485アミノ酸の長さである。 Therefore, extracellular form is a length of 485 amino acids with a molecular weight measurement of 55,372 daltons. 酵素をコードする核酸はクローン化され、K. Kimura他「Cloning of a gene for maltohexaose producing amylase of an alkalophilic Bacillus and hyper-production of the enzyme in Bacillus subtilis cells」、Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 372-377 (1988)に記載のように特徴づけられた。 .... A nucleic acid encoding the enzyme are cloned, K Kimura et al., "Cloning of a gene for maltohexaose producing amylase of an alkalophilic Bacillus and hyper-production of the enzyme in Bacillus subtilis cells", Appl Microbiol Biotechnol 27: 372- It characterized as described in 377 (1988). アルファ‐アミラーゼはG6アミラーゼ又はマルトヘキサオーズ生産アミラーゼ(EC 3.2.1.98)及びグルコシド加水分解ファミリー13に属する。 Alpha - amylase belonging to G6 amylase or maltohexaose OOO Production amylase (EC 3.2.1.98) and glucosidic hydrolysis Family 13. バシルス種(Bacillus sp.)707番由来のアルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列は、それぞれバシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)(BAA)、バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)(BLA)、及びバシルス ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)由来の液化アルファ‐アミラーゼのそれと65.5%、65.9%、及び66.3%相同性を有する。 (. Bacillus sp) Bacillus species 707 derived from the alpha - amino acid sequence of the amylase, respectively Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) (BAA), Bacillus licheniformis (B. licheniformis) (BLA), and Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus) derived from the liquefaction alpha - At the same 65.5% of amylase, 65.9%, and a 66.3 percent homology. R. Kanai他「Biochemical and crystallographic analyses of maltohexaose-producing amylase from alkalophilic Bacillus sp. 707」、 Biochemistry 43: 14047-14056 (2004)。 R. Kanai et al., ". Biochemical and crystallographic analyses of maltohexaose-producing amylase from alkalophilic Bacillus sp 707", Biochemistry 43: 14047-14056 (2004). それゆえ、バシルス種(Bacillus sp.)707番のG6‐アミラーゼはG4‐アミラーゼのそれと構造的に異なると推測される。 Therefore, Bacillus species (Bacillus sp.) 707 number of G6- amylase is estimated to be different in the same structural of G4- amylase. R. Kanai他(2004)。 R. Kanai et al. (2004).

すなわち、増強された特徴及び/又は生産速度を有するバシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼ変異体の必要性が存在する。 That is, enhanced features and / or Bacillus species having a production rate 707 of the alpha (Bacillus sp.) - there is a need for a-amylase variant. とりわけ、生産の増加はコストマージン、プラント容量の節約、及び高い活性産物を改善するに至るであろう。 Especially, the increase in production will lead to improved cost margins, savings of the plant capacity, and a high active product. さらに、特異活性の増加は例えば酵素需要の減少をもたらすことによってコストマージンを同様に改善する。 Furthermore, the increase in specific activity likewise improve cost margins by providing a reduction in such as enzymes demand.

すなわち、本発明は組成物及び組成物の使用方法を提供し、改良された特徴を有するアルファ‐アミラーゼを用いる前記組成物及び組成物の使用方法を提供する。 That is, the present invention provides the use of compositions and compositions, alpha with improved characteristics - provides for the use of the composition and the composition is used amylase.

例えば、ある実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物を含む。 For example, in some embodiments, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof, and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaching system, a stabilizer, foam enhancing agents, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, tarnish agent, and manual or for dishwashing compositions for automatic device comprises a perfume including. 食器洗浄組成物は手作業用又は自動装置用食器洗浄に使用する組成物でよい。 Dishwashing compositions can be a composition for use in manual or for automatic device for dishwashing.

他の実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗濯洗剤添加剤を意図する。 In another embodiment, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - intended laundry detergent additive comprising amylase or variant thereof.

他の実施態様においては、上記記載の洗剤添加剤と、さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む洗剤添加剤を含む洗濯洗剤を意図する。 In another embodiment, the detergent additive described above, one more or more of the following and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaching system, a stabilizer, foam enhancers, soaps suds suppressors, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, fluorescent whitening agents, fibers conditioners, and contemplates laundry detergents containing a detergent additive comprising a perfume.

さらに他の実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする単離される核酸であって、前記変異体が配列番号3のM202、M208、S255、R172、及び/又はM261の置換からなる群から選択される置換又は欠損残基を有することを意図する。 In yet another embodiment, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - a-amylase or a single nucleic acid that is released encoding the variant, M202 of the variants SEQ ID NO: 3, M208, S255, R172 , and intended to have a substitution or deletion residue selected from the group consisting of substituted / or M261. M202変異体はM202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択される置換変異体でよい。 M202 mutant M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and may be a substitution variant selected from the group consisting of M202W. S255変異体はS255Nの置換である。 S255 variant is the substitution of S255N. R172の置換はR172Qでよい。 Replacement of R172 may be a R172Q. また、考えられる変異体にはこれらの置換の組み合わせを有する変異体も意図される。 Further, the variants considered intended also variants with combinations of these substitutions. また、考えられる変異体にはポリペプチド中にこれらの置換を有するアルファ‐アミラーゼポリペプチド(シグナル配列を有する又は有しない)も意図される。 Also, alpha with these substitutions in the polypeptide variants contemplated - (or having a signal sequence having no) amylase polypeptides are also contemplated.

他の実施態様においては、前述の任意の変異体をコードする核酸を含むベクターを意図する。 In another embodiment, it contemplates a vector comprising a nucleic acid encoding any of the variants described above. また、例えばベクターを介して核酸が挿入される単離細胞も意図する。 Also contemplates isolated cell the nucleic acid is inserted through, for example, vectors. 単離宿主細胞は微生物でよく、例えば、バシルス ズブチリス(B. subtilis)、バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)、バシルス レンツス(B. lentus)、 バシルス ブレビス(B. brevis)、バシルス ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)、バシルス アルカロフィリス(B. alkalophilus)、バシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バシルス コアグランス(B. coagulans)、バシルス シルクランス(B. circulans)、バシルス ランツス(B. lautus)、 バシルス ツリンギエンシス(B. thuringiensis)ストレプトミセス リビダンス(St Isolated host cell may be a microorganism, for example, Bacillus subtilis (B. subtilis), Bacillus licheniformis (B. licheniformis), Bacillus lentus (B. lentus), Bacillus brevis (B. brevis), Bacillus Sutearoterumo Fils (B. stearothermophilus), Bacillus Al Caro Phyllis (B. alkalophilus), Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens), Bacillus coagulans (B. coagulans), Bacillus silk lance (B. circulans), Bacillus Rantsusu (B. lautus), Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) Streptomyces lividans (St reptomyces lividans)又はストレプトミセス ムリナス(S. murinus)からなる群から選択されるグラム陽性菌又はグラム陰性菌であって、前記グラム陰性菌は大腸菌(Escherichia coli)又はシュードモナス(Pseudomonas)種である。 reptomyces lividans) or a gram positive bacteria or gram negative bacteria is selected from the group consisting of Streptomyces murinus (S. murinus), the gram-negative bacterium is E. coli (Escherichia coli) or Pseudomonas (Pseudomonas) species.

別の実施態様においては、洗濯洗浄及び/又は食器洗浄用の本明細書に記載のポリペプチドの使用を意図する。 In another embodiment, it contemplates the use of polypeptides as described herein for laundry washing and / or dishwashing. これらのポリペプチド変異体は任意に非粉塵化(dusting)粒状、マイクロ粒状、被安定化液、又は被保護酵素の形態でよい。 These polypeptide variants optionally non dusting (dusting) particulate, a micro particulate, the stabilized liquid, or in the form of the protected enzyme. 別の実施態様においては、さらに、洗浄添加物又は洗剤組成物がセルラーゼ、プロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタ In another embodiment, further, washed additive or detergent composition cellulase, protease, acyl transferase, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, an esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase, halo peroxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectin-degrading enzymes, peptide transglutaminase, peroxidase, phytase, polyphenol oxidase, starch degrading enzyme, ribonuclease, transglutaminase ミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含むことを意図する。 Minaze, is intended to include xylanase, pullulanase, isoamylase, carrageenase, or an enzyme selected from the group consisting of any combination thereof. 他のアミラーゼは二以上の他のアルファ‐アミラーゼ、ベータアミラーゼ、イソアミラーゼ、又はグルコアミラーゼを含む組成物の使用を意図する。 Other amylases two or more other alpha - amylase, beta-amylase, contemplates the use of isoamylase, or a composition comprising a glucoamylase.

また、考えられることは繊維及び食器又は任意の上述組成物を用いる他の固い表面を洗浄する方法である。 Moreover, contemplated is a method of cleaning other hard surfaces using the fibers and dishes or any of the aforementioned compositions.

他の実施態様においては、繊維の湯通し組成物であって、組成物が水溶液における本明細書記載のアルファ‐アミラーゼ又は任意のアルファ‐アミラーゼ変異体の使用を意図する。 In another embodiment, a desizing composition of fibers, alpha herein wherein the composition in the aqueous solution - amylase or any of the alpha - contemplates the use of amylase variant. また、考えられることは組成物を用いる繊維の湯通し方法である。 Moreover, contemplated is a desizing method of a fiber using the composition.

さらに実施態様においては、水溶液中のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン処理用の組成物を意図する。 In yet embodiment, Bacillus species in aqueous solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - intended amylase or composition for starch processing comprising a variant thereof. また、考えられることはデンプンを処理するための組成物の使用方法である。 Moreover, contemplated is use of the composition for treating a starch. さらに、方法及び組成物はグルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ又はそれらの組み合わせを含んでよい。 Furthermore, methods and compositions are glucoamylase, isoamylase, pullulanase, may comprise a phytase or a combination thereof. さらに別の実施態様においては、溶液又はゲル中のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はそれらの変異体を含み及びさらに任意にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、抗菌剤、又はそれらの組み合わせを含むバイオフィルム加水分解組成物を意図する。 In yet another embodiment, the solution or Bacillus species in the gel 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or their include variants and further optionally cellulases, hemicellulases, xylanases, lipases, proteases, pectinases, antibacterial agent, or intended biofilm hydrolyzate composition comprising a combination thereof. また考えられることは前記組成物を用いるバイオフィルム加水分解の方法である。 Also contemplated is a method of biofilm hydrolysis using the composition.

別の実施態様においては、溶液中のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプンを糖化するための組成物を意図する。 In another embodiment, Bacillus species in the solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - intended amylase or composition for saccharifying starch comprising a variant thereof. 従って、また前記デンプンを糖化するために十分な時間請求項33の組成物を投与することを含むデンプンを糖化する方法を意図する。 Therefore, also contemplates a method of saccharifying starch comprising administering the composition for a sufficient time claims 33 to saccharify said starch.

別の実施態様においては、溶液中にバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン液化用組成物を意図する。 In another embodiment, Bacillus species in solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - intended amylase or starch liquefying composition comprising a mutant thereof. また、考えられるものは前記デンプンを液化するのに十分な時間前記組成物を投与することを含むデンプンを液化する方法である。 Further, conceivable is a method of liquefying a starch comprising administering a sufficient time the composition to liquefy the starch.

さらなる実施態様においては、溶液又はゲル中にバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を用いる焼成組成物を意図する。 In a further embodiment, Bacillus species in a solution or gel 707 [alpha (Bacillus sp.) - intended amylase or firing compositions using a variant thereof. またそのような焼成組成物を用いる焼成方法を含む。 Also includes a firing method of using such sintered compositions.

添付する図面は本明細書、実施態様の説明に取り込まれ、本明細書、実施態様の説明の一部を構成する。 Accompanying drawings herein, incorporated into the description of embodiments, herein, constitutes a part of the description of the embodiments. 図は開示する実施態様の説明図である。 Is an explanatory diagram of embodiments disclosed.
pH8.0での米見本試験におけるStainzyme(商標)(△)、OxAm(■) (Purastar(商標))及びバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ(□)比較。 Stainzyme in the US sample test at pH8.0 (trademark) (△), OxAm (■) (Purastar (TM)) and Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase (□) comparison. pH10.1での米見本試験におけるStainzyme(商標)(□)、OxAm(△) (Purastar(商標))及びバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ(■)比較。 Stainzyme in the US sample test at pH10.1 (trademark) (□), OxAm (△) (Purastar (TM)) and Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase (■) comparison. 図3AはPre‐LATシグナルペプチドコードDNA配列(配列番号1)を示す。 3A shows Pre-LAT signal peptide coding DNA sequence (SEQ ID NO: 1). 図3Bは天然型バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ遺伝子(配列番号2)を示す。 Figure 3B is native Bacillus species 707 alpha - shows the amylase gene (SEQ ID NO: 2) (Bacillus sp.). pICatHプラスミドの図。 Figure of pICatH plasmid. Amy707遺伝子配列を含むpICatHプラスミドの図。 Figure of pICatH plasmid containing the Amy707 gene sequence. Terg‐o‐tometer試験結果を示す。 It shows the Terg-o-tometer test results. タイド(Tide)活性(1.8g/L)、タイド(Tide)不活性(1.8g/L)、又はAATCC(1.5g/L)を含む洗剤組成物をバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ(0.1ppm)又はStainzyme(商標)(0.1ppm)存在下試験を行った。 Tide (Tide) activity (1.8g / L), Tide (Tide) inactive (1.8g / L), or AATCC (1.5g / L) Bacillus species detergent composition comprising (Bacillus sp.) 707 Ban alpha - amylase (0.1ppm) or Stainzyme (TM) (0.1ppm) was carried out in the presence test. いくつかのサンプルにおいて、Purafect(商標)Prime(0.5ppm)も存在した。 In some samples, Purafect (TM) Prime (0.5 ppm) was also present. この試験を5mMHEPES緩衝液、6gpg(grains per gallon)水の硬度、74°F、pH7.5で行った。 5mMHEPES buffer this test, 6gpg (grains per gallon) of water hardness, 74 ° F, was performed at pH 7.5. 試験対象の見本は着色デンプン綿(EMPA161,13‐02)であった。 Sample of the test subjects were colored starch cotton (EMPA161,13-02). SRIパーセント(%SRI)は汚れ除去指標の割合又は洗浄プロセスにて除かれる汚れの割合を表す。 SRI percent (% SRI) represents the fraction of dirt to be removed at a rate of stain removal index or cleaning process. 汚れ除去を汚れの無い見本、完全に汚れている見本、及び酵素処理による洗浄処理後の汚れている見本を測定することにより算出した。 No soil removal clean swatch, completely dirty swatch, and was calculated by measuring the dirty swatch after the washing treatment with the enzyme treatment. 測定をCIE L*a*b*カラースペースを用いる反射率測定によって測定する。 Measured is measured by the CIE L * a * b * using the color space reflectance measurement. %SRIを洗浄見本及び汚れ見本の着色間の差、及び汚れの無い見本及び汚れ見本の着色間の差の割合により算出する。 The difference between the coloring percent SRI washed swatch and soil samples, and calculates the percentage difference between coloration of free samples and soil swatches soiled. 「dE」は、CIE L*a*b*カラースペースでの各着色成分の差の二乗の合計の平方根を表す。 "DE" represents the square root of the sum of the squares of the differences between the coloring component in the CIE L * a * b * color space. 視覚できる色をカラースペースで調整されるL*a*b*により表すことができる。 The color that is visually can be represented by the L * a * b * to be adjusted in color space. 「L*」は、明度スケール又は真っ黒から真っ白を0から100のスケール値であるグレイスケールを示す。 "L *" is a white lightness scale or pure black indicating the gray scale is a scale value from 0 to 100. 「a*」はマゼンタから緑へのシフトを表し、高い陽性値は高いマゼンタの色調及び高い陰性値は高い緑の色調を示す。 "A *" represents a shift to the green from magenta, high positive value is high color and high negative value of magenta indicates a high green color. 「b*」は黄色から青色へのシフトを表し、高い陽性値は高い黄色の色調及び高い陰性値は高い青い色調を示す。 "B *" represents a shift to blue from yellow, high positive value is higher yellow shades and high negative values ​​indicate a high blue shades. a*及びb*値が0の場合、色が存在せず、L*値により決定される明度を有する純粋なグレイカラーを放出する。 If a * and b * values ​​are 0, there is no color, emits pure gray color having a brightness determined by the L * value. 試験の対象となる見本はCS−2(072、ココア汚れを伴う)、CS−37(005、全卵汚れを伴う)、又は着色デンプン綿(EMPA161、13‐02)いずれかであった。 Subject to sample tests CS-2 (072, accompanied by cocoa stains), CS-37 (005, involving whole egg stains), or colored starch cotton (EMPA161,13-02) was either. 40°Fで12gpg水硬度で漂白剤を有する5g/LのIEC A*で実施したLaunder‐O‐meterの結果を示す。 The results of Launder-O-meter was conducted in IEC A * of 5 g / L with a bleaching agent in 12gpg water hardness 40 ° F. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ及びStainzyme(商標)は0.1ppmの量で存在した。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase and Stainzyme (TM) was present in an amount of 0.1ppm. 組成物を5つの異なる汚れ見本にて試験した。 The compositions were tested in five different stains swatches. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ、Stainzyme(商標)及びOxAm (Purastar(商標))の欧州条件下自動食器洗浄能力を示す。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase, shows the European conditions automatic dishwashing ability of Stainzyme (TM) and OxAm (Purastar (TM)). 米ミルクを除去する洗浄能力をmg活性蛋白質に比較する汚れ除去能力にて測定する。 Measured at soil removal ability to compare the cleaning ability to remove the rice milk in mg active protein. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ、Stainzyme(商標)及びOxAm (Purastar(商標))の欧州条件下自動食器洗浄能力を示す。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase, shows the European conditions automatic dishwashing ability of Stainzyme (TM) and OxAm (Purastar (TM)). 混合デンプンを除去する洗浄能力をmg活性蛋白質に比較する汚れ除去能力にて測定する。 The cleaning ability to remove mixed starch is measured at soil removal ability compared to mg active protein. 20℃で漂白剤存在下又は非存在下バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼのM202→L(M202L)変異体調製物の試験。 Bleach the presence or non-presence of Bacillus species at 20 ℃ 707 No. alpha (Bacillus sp.) - the M202 → L (M202L) mutant preparations of amylase test. 洗浄試験の吸光度を酵素量の増加と共に488nmで測定(ppmで測定)した。 The absorbance of the cleaning tests was measured at 488 nm (measured in ppm) with increasing amount of enzyme. M202L変異体をバシルス種(Bacillus sp.)707番の野生型アルファ‐アミラーゼと比較した。 Bacillus species M202L variant 707 of the wild-type alpha (Bacillus sp.) - were compared with amylase.

詳細な説明 Detailed description
次のものは化合物、組成物、前記化合物の製造方法、及び前記化合物及び組成物の使用方法に関し、特に、前記化合物がバシルス種(Bacillus sp.)707番又はその変異体である。 Those compounds following composition, processes for the manufacture of said compounds, and a method using said compounds and compositions, in particular, the compound is Bacillus species (Bacillus sp.) Is 707 or a variant thereof. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ形態もその変異体も例えば、洗濯及び食器洗浄試験において高い性能を有すると研究されてきた。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - Amylase embodiment also variants thereof e.g., has been studied and has high performance in laundry and dishwashing tests.

バシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼは最適pH8.8を有し、広いpH(言い換えると、pH4.7からpH10.8)に渡って安定である。 (. Bacillus sp) Bacillus species 707 alpha - amylase has an optimum pH 8.8, (in other words, from pH 4.7 pH 10.8) wide pH is stable over. ポリペプチドは45℃の最適温度を有した。 Polypeptide had a temperature optimum of 45 ° C.. 酵素は低い温度、例えば15℃から20℃で活性を有した。 Enzyme had lower temperatures, the activity at 20 ° C., for example, from 15 ° C.. 55℃以上の温度で30分インキュベーション後、酵素はその活性の20%以下となる。 After 30 min incubation at temperatures above 55 ℃ temperature, the enzyme becomes less than 20% of its activity.

1. 1. 略語及び定義 Abbreviations and Definitions
本明細書の詳細な説明に従って、次の略語及び定義を適用する。 According to the detailed description of this specification, apply the following abbreviations and definitions. 本明細書にて使用する単数形「a」「an」及び「the」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。 The singular forms as used herein, "a", "an" and "the" are, as long as the content is not clearly points to other things, includes a plurality of instruction target. すなわち、例えば、「酵素(an enzyme)」はそんな酵素の複数を含み、「製剤(the formulation)」の意味は一以上の製剤及び当業者が知っているそれらと等価の製剤のー又は複数の意味を含む。 Thus, for example, include "enzyme (an, enzyme)" is a plurality of such enzymes, "preparation (the Formulation)" means the one or more formulations and those skilled in the art are the equivalents thereof that are formulated over or Know meaning, including the.

別段の指示がない限り、本明細書にて用いるすべての技術及び科学用語は当業者が通常理解するものと同様の意味を有する。 Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those skilled in the commonly understood. 次の用語を以下に示す。 It shows the following terms below.

1.1定義 1.1 Definition
「アミラーゼ」はグルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、及びバシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)及びバシルス ズブチリス(B. subtilis)のようなバシルス種(Bacillus sp.)のような細菌の野生型アルファ‐アミラーゼのような任意のアミラーゼを含むことを意味する。 "Amylase" glucoamylase, alpha - amylase, beta - (. Bacillus sp) amylase, and Bacillus licheniformis (B. licheniformis) and Bacillus subtilis Bacillus species such as (B. subtilis) wild bacteria such as It is meant to include any amylase such as amylase - type alpha. 「アミラーゼ」は、とくに、デンプンの分解の触媒能力を有する酵素を意味する。 "Amylase" is particularly meant an enzyme having the catalytic capability of degradation of starch. アミラーゼ類はデンプン中のアルファ‐D‐(1→4)O‐グリコシド結合を切断する加水分解酵素である。 Amylases are hydrolases that cleave the alpha -D- (1 → 4) O- glycosidic linkages in starch. 一般的に、アルファ‐アミラーゼ(EC 3.2.1.1; α‐D‐(l→4)‐グルカン グルカノヒドロラーゼ(glucan glucanohydrolase))は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐D(1→4)O‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。 Generally, the alpha - amylase (EC 3.2.1.1; α-D- (l → 4) - glucan glucanohydrolases (glucan glucanohydrolase)) alpha -D (1 in irregularly starch molecules → 4) is defined as the end effect enzymes that cleave O- glycosidic bond. それに対して、ベータ‐アミラーゼ((EC 3.2.1.2. α‐D‐(l→4)−グルカン マルトヒドロラーゼ(glucan maltohydrolase))及び麦芽アルファ‐アミラーゼ(maltogenic α‐amylase)(EC 3.2.1.133)のようにある産物特異的アミラーゼ類のような、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ (EC 3.2.1.20; α‐D‐グルコシド グルコヒドロラーゼ(glucoside glucohydrolase))、グルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3; α‐D‐(l→4)-グルカン グルコヒドロラーゼ(glucan glucohydrolase))、及び産物特異的ア In contrast, beta - amylase ((EC 3.2.1.2 α-D- (l → 4) -. Glucan maltohydrolase (glucan maltohydrolase)) and malt alpha - amylase (maltogenic α-amylase) (EC 3 .2.1.133), such as product-specific amylases in as exo acting amylolytic enzymes cleave the starch molecule from the non-reducing terminus of the substrate beta -. amylase, alpha - glucosidase (EC 3. 2.1.20; alpha-D-glucoside glucohydrolase (glucoside glucohydrolase)), glucoamylase (EC 3.2.1.3; α-D- (l → 4) - glucan glucohydrolase (glucan glucohydrolase)), and product-specific A ラーゼ類はデンプンから特徴的な長さの麦芽オリゴ糖を生産する。 Hydrolases such will produce malt oligosaccharides characteristic length from starch.

「バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ」はバシルス種(Bacillus sp.)707番由来のアルファ‐アミラーゼである。 "Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase" alpha derived from Bacillus species 707 - amylase (Bacillus sp.). アルファ‐アミラーゼをコードする遺伝子は野生型遺伝子又はアルファ‐アミラーゼをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドである。 Alpha - gene encoding amylase wild type gene or alpha - a codon optimized polynucleotide encoding a-amylase. 「バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ変異体」は、野生型バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼの変異体を意味し、それはバシルス種(Bacillus sp.)707番の親ポリペプチド配列からの配列置換、追加、又は欠損を含む。 "Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase variant", the wild-type Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - (. Bacillus sp) means a variant of amylase, it is Bacillus species 707 of sequence substitutions from a parent polypeptide sequence, including additional or missing. バシルス種(Bacillus sp.)707番の成熟アルファ‐アミラーゼを(アミノからカルボキシの方向)(配列番号3)次に示す。 (. Bacillus sp) Bacillus species 707 of the mature alpha - (direction of amino to carboxy) amylase (SEQ ID NO: 3) shown below.


本明細書にて用いる「親酵素」、「親ポリペプチド」はバシルス種(Bacillus sp.)707番のポリペプチドを意味する。 As used herein, "parent enzymes," "parent polypeptide" refers to a Bacillus species (Bacillus sp.) 707 number of polypeptides. 「親核酸」は該親ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。 "Parent nucleic acid" means a nucleic acid sequence encoding the parent polypeptide. さらに、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼは親ポリペプチドのシグナル配列に又は、アルファ‐アミラーゼ親ポリペプチドの他のところにおける変異体を含んでよい。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or the signal sequence of the parent polypeptide, alpha - may include variants in place of other amylase parent polypeptide. 即ち、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼは異種のアルファ‐アミラーゼポリペプチドを含む融合蛋白質の形態でもよい。 That is, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase alpha heterologous - may be in the form of a fusion protein comprising amylase polypeptide. また、キメラ(言い換えると、少なくとも二つのアルファ‐アミラーゼ組み合わせ)を含んでよい。 Further, chimeric (in other words, at least two alpha - amylase combination) may contain. 例えば、バシルス種(Bacillus sp.)707番は、バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)アルファ‐アミラーゼ(LAT)のような別のアルファ‐アミラーゼ由来のシグナルペプチドを含んでよい。 For example, Bacillus species 707 is Bacillus licheniformis (B. licheniformis) alpha (Bacillus sp.) - different alpha such as amylase (LAT) - may contain a signal peptide derived from amylase. 例えば、LATシグナルペプチドコード配列を示す図3Aを参照願いたい。 See, for example, refer to FIG. 3A showing the LAT signal peptide coding sequence. また、最初のアラニン(バリン以外の任意の置換)の代わりに、例えば、1、2又はそれ以上のトレオニンのような二以上のアミノ酸置換が考えられる。 Further, in place of the first alanine (any substitution other than valine), for example, it is considered more amino acid substitutions, such as, two or more threonine. 「変異体」という用語は、「ミュータント」という用語と互換可能に用いてよい。 The term "variant" may be used interchangeably with the term "mutant". 変異体はポリペプチド及びバシルス種(Bacillus sp.)707番に対してさらに置換、トランスバージョン、挿入、及び欠損をコードする核酸を含む。 Variant polypeptides and Bacillus species (Bacillus sp.) Further substituted for 707, transversions, insertions, and nucleic acids encoding the defect. 変異体は本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド可能な相補的配列である配列を含んでよい。 Variants may comprise a sequence that is a hybrid capable complementary sequence to the nucleotide sequence described herein. 例えば、変異核酸配列はストリンジェント条件(例えば、50℃及び0.2XSSC{1XSSC=0.15 M NaCl,0.015 M Na citrate, pH 7.0})下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する。 For example, a variant nucleic acid sequence stringent conditions (e.g., 50 ° C. and 0.2XSSC {1XSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na 3 citrate, pH 7.0}) under nucleotides described herein It has a complementary sequence capable of hybridizing to a sequence. 用語「変異核酸配列」は、高いストリンジェント条件(例えば、65℃及び0.1XSSC{1XSSC=0.15 M NaCl,0.015 M Na citrate, pH 7.0})下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する配列を含む。 The term "variant nucleic acid sequence", high stringency conditions (e.g., 65 ° C. and 0.1XSSC {1XSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na 3 citrate, pH 7.0}) below, herein It comprises a sequence that has complementary sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequence set forth.

本明細書で用いる用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合し及び自然に見られる少なくとも一つの成分から除去される化合物、蛋白質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。 The term "recovered" as used herein, "isolated", and "separated", compounds to be removed from at least one component found is naturally associated with and naturally, proteins, cells, nucleic acid , or it refers to an amino acid.

用語「精製される」は、材料が相対的に純粋状態、例えば少なくとも約90%純粋、又は少なくとも約95%純粋、又は少なくとも約98%純粋であることを意味する。 The term "purified" material is relatively pure state, e.g., at least about 90% pure, or at least about 95% pure, or at least about 98% pure.

用語「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、活性を維持するような酵素能力を意味する。 The term "thermal stability", after exposure to high temperatures is meant the enzymatic ability to maintain the activity. 酵素の熱安定性、例えば、アルファ‐アミラーゼの熱安定性はその半減期によって測定される。 Thermal stability of the enzyme, e.g., alpha - thermostable amylase is measured by its half-life. 半減期(t 1/2 )は、所定の条件下、半分の酵素活性が消失する間の分、時間、日の単位で表す時間である。 The half-life (t 1/2) is the time expressed in minutes, hours, or days during which predetermined conditions, half of the enzyme activity is lost. 半減期の値は残りのアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。 The half-life value remaining alpha - is calculated by measuring the amylase activity.

用語「pH範囲」は、5からそれ以上のpH単位の範囲の酸性からアルカリ性条件での触媒活性を有する酵素の能力をいう。 The term "pH range" refers to the ability of an enzyme having the catalytic activity at alkaline conditions from acidic in the range of 5 to more pH units.

本明細書にて用いる用語「pH安定性」は、所定の時間(例えば、15分、30分、1時間)にpHの広い範囲に渡って活性を維持する酵素能力に関する。 The term "pH stability" as used herein is a predetermined time (e.g., 15 minutes, 30 minutes, 1 hour) for the enzymes ability to maintain activity over a wide range of pH in the.

本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び/又は用語「蛋白質」と同義語である。 As used herein "amino acid sequence" is synonymous with the term "polypeptide" and / or the term "protein". ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義語である。 If there is, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "peptide". ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義語である。 If there is, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "enzyme". 従来の1文字又は3文字アミノ酸残基コードを本明細書にて用いる。 Using conventional one-letter or three-letter amino acid residue code herein.

用語「核酸」はDNA、RNA,一本鎖又は二本鎖及びそれらの化学的修飾を含む。 The term "nucleic acid" encompasses DNA, RNA, single-stranded or double-stranded and their chemical modifications. 用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は本明細書にて互換可能に用いてよい。 The term "nucleic acid" and "polynucleotide" may be used interchangeably herein.

本明細書にて用いる用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、バシルス種(Bacillus sp.)707番アミノ酸ポリペプチド又はその変異体をコードするオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びフラグメント及びその誘導体(それらの一部のような)をいう。 The term "nucleotide sequence" or "nucleic acid sequence" as used herein is Bacillus species (Bacillus sp.) 707 th amino acid polypeptide or oligonucleotide sequence or polynucleotide sequence encoding the variant, and fragments and derivatives thereof It refers to (such as some of them). そのヌクレオチド配列はゲノム、合成又は組み換え体由来のものでよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかどうかで、二本鎖又は一本鎖でよい。 The nucleotide sequence of genomic, synthetic or may be of recombinant origin, on whether representing the sense or antisense strand, or double-stranded or single-stranded. 本明細書にて用いるように、その用語ヌクレオチド配列はゲノムDNA、cDNA、合成DNA、及びRNAを含む。 As used herein, including the term nucleotide sequence is genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, and RNA. 例えば、DNAはバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするcDNA配列である。 For example, DNA is Bacillus species 707 alpha - a cDNA sequence encoding the amylase or variant thereof (Bacillus sp.). 遺伝子コードの縮退により、二以上のコドンを特定のアミノ酸をコードするために用いてよく、本発明は特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。 The degeneracy of the genetic code may be used to encode a particular amino acid two or more codons, the present invention comprises a nucleotide sequence that codes for a specific amino acid sequence.

「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある度合いの相同性を有する物を意味する。 "Homologue" means an object having homology degree with the amino acid sequence and the target nucleotide sequence of interest. 相同配列は対象配列に対して少なくとも75%、80%、85%、又は90%相同的なアミノ酸配列、又は少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%相同的なアミノ酸配列を含むと考えられる。 At least 75% homologous sequence is subject sequence, 80%, 85%, or 90% homologous amino acid sequence, or at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homologous amino acid sequence It believed to contain. 一般的に、相同性は対象アミノ酸配列の同様の活性部位を含む。 Typically, homology contains similar active site of the subject amino acid sequence.

本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する過程及びポリメラーゼチェーン反応(PCR)において実施する場合の増幅する過程も含む。 "Hybridization" as used herein also includes the process of amplification when a single strand of nucleic acid is carried out in the process and the polymerase chain reaction of binding to a complementary strand through base pairs (PCR). アルファ‐アミラーゼ又はその変異核酸は一本鎖又は二本鎖DNA又はRNA、RNA/DNAへテロ二本鎖又はRNA/DNAコポリマーを含んでよい。 Alpha - amylase or variant nucleic acid may comprise single- or double-stranded DNA or RNA, RNA / DNA hetero duplex or RNA / DNA copolymer.

本明細書にて用いる「合成の」はインビトロで化学的又は酵素的合成によって生産されるものいう。 "Synthetic" as used herein refers those produced by chemical or enzymatic synthesis in vitro. メチロトローフ酵母ピキア(Pichia)、ハンゼヌラ(Hansenula)、ストレプトミセス(Streptomyces)、トリコデルマ(Trichoderma)(例、トリコデルマ レーシ(T. reesei)、または他の発現宿主のような宿主生物にとって最適化コドンを使用したバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。 Methylotrophic yeast Pichia (Pichia), Hansenula (Hansenula), Streptomyces (Streptomyces), was used to optimize codons Trichoderma (Trichoderma) (eg, Trichoderma Reshi (T. reesei), or a host organism, such as other expression hosts Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - including a nucleic acid encoding an amylase or variant thereof, and the like.

用語「水の硬度」は洗浄目的(1.4‐1.8mmol/L)用の水に含まれるカルシウム及びマンガンの量を意味し、食器洗浄の目的のための量を意味する。 The term "water hardness" means the amount of calcium and manganese in the water for cleaning purposes (1.4-1.8mmol / L), it means an amount for purposes of dishwashing.

本明細書にて、細胞に関して用いる場合の用語「形質転換される」「安定に形質転換される」及び「トランスジェニックの」は、細胞がその遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれる外来種(例えば、異種の)の核酸配列を有することを意味する。 Herein, a "transgenic" terms "transformed", "stably transformed" and when used in reference to cells, an episomal plasmid in which the cells are maintained through integrated into its gene or multiple generations exotic species incorporated (e.g., heterologous) means having a nucleic acid sequence of.

細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される」という用語は、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアDNA)の遺伝子へ取り込まれ、自律レプリコンへ転換し、又は一時的に発現(例えば、トランスフェクションmRNA)する原核細胞又は真核細胞への核酸配列の取り込みに関することを含む。 The term in the context of inserting a nucleic acid sequence into a cell referred to as "introduced" is "transfection", "transformation" means "transduction" nucleic acid sequence is a cell (e.g., chromosome, plasmid, plastid, or incorporated into a gene of mitochondrial DNA), including converted into an autonomous replicon, or transiently expressed (e.g., that relates to transfection mRNA) of the nucleic acid sequences into a prokaryotic or eukaryotic cell uptake.

本明細書に用いる「形質転換細胞」は組み換えDNA技術を用いて遺伝子操作された細胞を含む。 "Transformed cell" as used herein includes a genetically engineered cells using recombinant DNA techniques. 一般的に形質転換は細胞に一以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。 Generally transformation occurs by insertion of one or more nucleotide sequences into a cell. 挿入されたヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列(言い換えると、融合蛋白質又は異種配列をコードするDNA配列のような、形質転換された細胞に本来有していない配列)でもよい。 (In other words, a fusion protein or as DNA sequence encoding a heterologous sequence, sequences not inherent to the transformed cells) is inserted nucleotide sequence heterologous nucleotide sequences may be used.

本明細書に用いる「作動的に連結される」とは、記載される要素が、それらが意図する態様で機能するようにする関係である。 By "operatively linked" used herein, elements described is a relationship to function in a manner that they are intended. コード配列に作動的に連結する調節配列は、制御配列に適合する条件下、コード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。 Regulatory sequences operatively linked to a coding sequence, under conditions compatible with the control sequences, the expression of the coding sequence is ligated in order to achieve.

本明細書にて用いる「生物学的活性な」とは、自然的に発生する配列と同様な構造機能(同じ程度とは必ずしも限らない)、及び/又は同様な調節機能(同じ程度とは必ずしも限らない)、及び/又は同様な生物学的機能(同じ程度とは必ずしも限らない)を有する配列をいう。 By "biological activity" as used herein, sequences similar structure functions occurring naturally (but not necessarily to the same degree), and / or similar regulatory function (not necessarily to the same degree limited not), and it refers to a sequence having necessarily no) and / or similar biological function (same degree.

「宿主菌株」又は「宿主細胞」は、本明細書に開示する多様なアルファ‐アミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はDNA構築体に適した宿主を意味する。 "Host strain" or "host cell", various alpha disclosed herein - refers to a suitable host for an expression vector or DNA construct comprising a polynucleotide encoding an amylase enzyme. 特に、宿主菌株は好ましくは、細菌細胞である。 In particular the host strain is preferably a bacterial cell. 本明細書好ましい実施態様においては、「宿主細胞」は微生物の菌及び特にバシルス種(Bacillus sp.)の細胞から創製される細胞及びプロトプラスト両者を意味する。 In the present specification a preferred embodiment, "host cell" means a cell and protoplast both are created from the cells of bacteria and particularly Bacillus species of microorganisms (Bacillus sp.).

用語「選択的マーカー」は導入される核酸又はベクターを含む宿主の選択を容易にする宿主中の発現可能な遺伝子をいう。 The term "selective marker" refers to a gene capable of expressing in a host that allows for ease of selection of those hosts containing an introduced nucleic acid or vector. 選択マーカーの例は抗菌剤(例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール)及び/又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。 Examples of selectable marker is an antimicrobial agent (e.g., hygromycin, bleomycin, or chloramphenicol) and / or give metabolic benefits such as nutritional benefit of the host cell include genes, but are not limited to.

用語「培養する」は液体又は固体培地において適切な条件下微生物細胞の集団の増殖をいう。 The term "culturing" refers to the growth of the population of appropriate conditions microbial cells in a liquid or solid medium. ある実施態様においては、培養するは、最終産物(一般的に容器又は反応器)への粒状デンプンを含むデンプン基質の発酵性バイオコンバージョンをいう。 In some embodiments, the cultured refers to fermentative bioconversion of a starch substrate containing granular starch to the final product (typically vessel or reactor). 発酵は、単純な有機化合物を生産するために行われる微生物による有機基質の酵素的及び嫌気的分解である。 Fermentation is the enzymatic and anaerobic breakdown of organic substances by microorganisms to take place to produce simple organic compounds. 発酵は嫌気的条件下に行われるけれども、酸素存在下でも発酵が行われるので、その用語は厳格な嫌気的条件に限定されることを意図していない。 Although the fermentation is carried out under anaerobic conditions, since the fermentation is carried out also in the presence of oxygen, the term is not intended to be limited to strict anaerobic conditions.

「遺伝子」は、ポリペプチドを生産するのに関係するDNAセグメントをいい、コード領域の前後に位置する領域や個々のコードセグメント(エクソン)間に介在する配列(イントロン)を含む。 "Gene" refers to a DNA segment related to producing a polypeptide, comprising the sequence intervening between regions and individual coding segments located (exons) before and after the coding region (introns).

「ベクター」は一以上の細胞のタイプへ核酸を導入するために設計されるポリヌクレオチド配列をいう。 "Vector" refers to a polynucleotide sequence designed to introduce nucleic acids into types of one or more cells. ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、及びそれらの類似物を含む。 Vectors include cloning vectors, expression vectors, shuttle vectors, plasmids, phage particles, cassettes, and analogs thereof.

「発現ベクター」は適切な宿主においてDNAの発現に影響をあたえる適切な制御配列に作動的に結合されたDNA配列を含むDNA構築体を意味する。 "Expression vector" means a DNA construct comprising a operably linked DNA sequences in the proper control sequences affecting the expression of the DNA in a suitable host. そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、転写を制御する適切なオペレーター配列、mRNA上の適切なリボゾーム結合部位をコードしている配列及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでもよい。 Promoter affects the transcription of such control sequences may include suitable operator sequence to control the stopping of encoding a suitable ribosome binding site and sequences and transcription and translation of the mRNA sequence to control transcription.

「プロモーター」は遺伝子の転写を開始するためにRNAポリメラーゼを結合することに関係する調節配列である。 "Promoter" is a regulatory sequence involved in binding the RNA polymerase to initiate transcription of a gene. プロモーターは誘導プロモーター又は構成的プロモーターでよい。 The promoter may be an inducible promoter or a constitutive promoter. 本発明に用いる好ましいプロモーターはバシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルファ‐アミラーゼ(AmyL)である。 A preferred promoter for use in the present invention is Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) alpha - amylase (AmyL).

用語「作動的に連結する」は、要素が機能的に関連するように配列中にあるように並べられることをいう。 The term "operably linked", elements functionally speaking Sorting is possible to be in the sequence to be related. つまり、本明細書にて用いる「作動的に連結する」は記載する成分が意図する機能を行うような関係であることを意味する。 That is, "operatively linked" used herein means that a relationship perform the functions components described are intended. 例えば、コード配列に作動的に連結する調節配列はコード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下に行われるようなライゲーションである。 For example, regulatory sequences operatively linked to a coding sequence is ligated such that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

「転写コントロール下」はポリヌクレオチドの配列(普通DNA配列)が、転写開始又は転写の促進に貢献する要素に作動的に連結することにより依存することを示す当業者によく理解される用語である。 "Under transcriptional control" sequence of a polynucleotide (usually DNA sequence), it is a term that is well understood by those skilled in the art that indicates a dependency by operatively linked to the elements that contribute to the promotion of transcription initiation or transcription .

「翻訳コントロール下」はmRNAが形成された後起こる調整プロセスを示す用語として周知である。 "Under translational control" is a well known as a term representing a place adjustment process after mRNA has been formed.

「シグナル配列」は蛋白質のN末端の一部に結合するアミノ酸配列を意味し、細胞外への蛋白質の成熟型の分泌を手助けする。 "Signal sequence" means a sequence of amino acids bound to a portion of the N-terminus of the protein, to assist the secretion of the mature form of the protein outside the cell. シグナル配列の定義は機能的なものである。 Definition of signal sequence is a functional one. 細胞外蛋白質の成熟型は分泌過程で切断されるシグナル配列を欠損している。 Mature form of the extracellular protein lacks the signal sequence which is cleaved off during the secretion process.

本明細書に用いるように、蛋白質及び遺伝子をコードする蛋白質及び遺伝子を記載する場合に遺伝子に関する用語はイタリック体、(例えば、amyL(バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis) AA)をコードする遺伝子はamyL(イタリック体)で表示されてよい。一般的に、蛋白質のための用語はイタリック体ではなく、一般的に最初の文字が大文字である(例えば、amyL遺伝子によりコードされる蛋白質はAmyL又はamyLと表示する)。同様に、バシルス種(Bacillus sp.)707番由来のアミラーゼ遺伝子及び蛋白質は本明細書にてそれぞれamy707(イタリック体)Amy707で示す。 As used herein, the term relates to gene italics when describing proteins and genes encoding the proteins and genes, encoding (e.g., amyL (Bacillus licheniformis (B. licheniformis) AA) gene in it. generally appear in the amyL (italics), the term for the protein is not in italics, generally the first letter is capitalized (e.g., protein encoded by the amyL gene amyL or and displaying amyL). Similarly, shown in Bacillus species (Bacillus sp.) 707 No. amylase gene and protein from each herein Amy707 (italics) Amy707.

ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「異種の」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。 Reference to a polynucleotide or protein, the term "heterologous" refers to a polynucleotide or protein that does not naturally occur in a host cell. いくつかの実施態様においては、蛋白質は商業的に重要な産業用蛋白質である。 In some embodiments, the protein is a commercially important industrial protein. その用語は自然的に発生する遺伝子、変異遺伝子、及び/又は合成遺伝子によりコードする蛋白質を含むと考えられる。 The term is considered to include a protein encoded by the gene, the mutated genes, and / or synthetic genes occurring naturally.

ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「内因性の(endogenous)」は宿主細胞中に自然的に発生するポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。 Reference to a polynucleotide or protein, the term "endogenous (Endogenous)" refers to a polynucleotide or protein that occurs naturally in the host cell.

本明細書にて用いる用語「発現」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。 The term "expression" as used herein refers to the process by which a polypeptide is produced based on the nucleic acid sequence of a gene. プロセスは転写及び翻訳を含む。 Process including transcription and translation.

本明細書にて用いる用語「特異的活性」は、特定の条件下単位時間当たり酵素の調製により生産のために転換される基質のモル数として定義される酵素単位を意味する。 The term "specific activity" as used herein means an enzyme unit defined as the number of moles of substrate converted for production by enzyme preparation per certain conditions the unit time. 特異的活性は(U)/mg of protein単位として表わされる。 Specific activity is expressed as (U) / mg of protein units.

「ATCC」はマナッサス、Va、20108(ATCC)に位置するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションをいう。 "ATCC" Manassas, Va, refers to the American Type Culture Collection, located at 20108 (ATCC).

「NRRL」はアグリカルチャー・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナルセンター・フォー・アグリカルチャー・ユーティリゼーション・リサーチ(以前はUSDA ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーとして知られる)ピオリア、Illをいう。 "NRRL" the Agriculture Research Service Culture Collection, National Center for Agriculture utility internalized Research (formerly known as USDA Northern Regional Research Laboratory) Peoria, refers to Ill.

本明細書にて用いる用語「含む」及びそれと同じ語源の用語は「包括」の意味で用い、「含有する」及び同語源用語と同等である。 The term of the term "comprising" and the same origin as that used herein is used in the sense of "inclusive" is equivalent to "comprising" and cognates terms.

1.2略語 1.2 Abbreviations
次の略語は、定義が本明細書の範囲内で述べている内容について他に示していない限り、以下の意味を有する。 The following abbreviations, unless definitions are not shown in the other for the contents that are described in the context of the present specification have the following meanings.

AE アルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate) AE alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate)
AEO アルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate) AEO alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate)
AEOS アルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate) AEOS alcohol ethoxysulfate sulfate (alcohol ethoxysulfate)
AES アルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate) AES alcohol ethoxysulfate sulfate (alcohol ethoxysulfate)
AFAU 酸性菌アルファ‐アミラーゼユニット(acid fungal α−amylase units) AFAU acidic fungal alpha - amylase unit (acid fungal α-amylase units)
AGU グルコアミラーゼ活性単位(glucoamylase activity unit) AGU glucoamylase activity unit (glucoamylase activity unit)
AOS アルファ‐オレフィンスルホン酸塩(α‐olefinsulfonate) AOS alpha - olefin sulfonate (α-olefinsulfonate)
AS アルコール硫酸塩(alcohol sulfate) AS alcohol sulfate (alcohol sulfate)
BAA バシルス アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファ‐アミラーゼBLA バシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)(又はLAT) BAA Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliquefaciens) alpha - amylase BLA Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) (or LAT)
BSA ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin) BSA bovine serum albumin (bovine serum albumin)
cDNA 相補的DNA(complementary DNA) cDNA complementary DNA (complementary DNA)
CMC カルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose) CMC carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose)
DNA デオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid) DNA deoxyribonucleic acid (deoxyribonucleic acid)
DP3 3つのサブユニットを有する重合度(degree of polymerization with three subunits) DP3 degree of polymerization with three subunits (degree of polymerization with three subunits)
DPn n個のサブユニットを有する重合度(degree of polymerization with n subunits) Polymerization degree having a DPn n sub units (degree of polymerization with n subunits)
DS 乾燥固体(dry solids) DS dry solids (dry solids)
DTMPA ジエチレントリアミンペンタ酢酸(diethyltriaminepentaacetic acid) DTMPA diethylenetriaminepentaacetic acid (diethyltriaminepentaacetic acid)
EC 酵素委員会(enzyme commission for enzyme classification) EC Enzyme Commission (enzyme commission for enzyme classification)
EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸(ethylenediaminetetraacetic acid) EDTA ethylenediaminetetraacetic acid (ethylenediaminetetraacetic acid)
EO エチレンオキシド(ethylene oxide) EO ethylene oxide (ethylene oxide)
F&HC 繊維及び家庭用ケア(fabric & household care) F & HC fiber and household care (fabric & household care)
FAU 菌アルファ‐アミラーゼ単位(fungal amylase unit) FAU fungal alpha - amylase unit (fungal amylase unit)
GA グルコアミラーゼ(glucoamylase) GA glucoamylase (glucoamylase)
gpg 1ガロン当たりのグレイン(grains per gallon) gpg 1 per gallon grains (grains per gallon)
HFCS 高フルクトーストウモロコシシロップ(high fructose corn syrup) HFCS high fructose corn syrup (high fructose corn syrup)
HFSS 高フルクトースデンプンベースシロップ(high fructose starch based syrup) HFSS high fructose starch-based syrup (high fructose starch based syrup)
IKW Industrieverband Koerperpflege− und Waschmittel e. IKW Industrieverband Koerperpflege- und Waschmittel e. V
IPTG イソプロピル ベータ‐D‐1‐チオガラクトピラノシド(isopropyl β‐D‐thiogalactopyranoside) IPTG isopropyl beta -D-1-thiogalactopyranoside (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)
LAS リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate) LAS linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate)
LOM ラウンダー‐O‐メーター(Launder−O−meter) LOM Rounder -O- meter (Launder-O-meter)
LU Liquiphon unit LU Liquiphon unit
MW 分子量(molecular weight) MW molecular weight (molecular weight)
MWU 修飾ウォルゲムス単位(modified Wohlgemuth unit) MWU qualified Worugemusu unit (modified Wohlgemuth unit)
NOBS ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩 (nonanoyloxybenzenesulfonate) NOBS Nonanoyloxybenzene sulfonate (nonanoyloxybenzenesulfonate)
NTA ニトリロ三酢酸(nitrilotriacetic acid) NTA nitrilotriacetic acid (nitrilotriacetic acid)
PCR ポリメラーゼチェーン反応(polymerase chain reaction) PCR polymerase chain reaction (polymerase chain reaction)
PEG ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol) PEG polyethylene glycol (polyethyleneglycol)
PVA ポリ(ビニル アルコール)(poly(vinyl alcohol)) PVA Poly (vinyl alcohol) (poly (vinyl alcohol))
PVP ポリ(ビニルピロリドン)(poly(vinylpyrrolidone)) PVP poly (vinylpyrrolidone) (poly (vinylpyrrolidone))
RNA リボ核酸(ribonucleic acid) RNA ribonucleic acid (ribonucleic acid)
SAS 第二級アルカンスルホン酸塩(secondary alkane sulfonates) SAS secondary alkane sulfonates (secondary alkane sulfonates)
TAED テトラアセチルエチレンジアミン(tetraacetylethylenediamine) TAED tetraacetylethylenediamine (tetraacetylethylenediamine)
TCA トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid) TCA trichloroacetic acid (trichloroacetic acid)
TSB トリプティックソイブロス(tryptic soy broth) TSB tryptic soy broth (tryptic soy broth)
UFC 限外ろ過濃縮(ultrafiltration concentrate) UFC ultrafiltration concentration (Ultrafiltration concentrate)
w/v 質量/体積(weight/volume) w / v weight / volume (weight / volume)
w/w 質量/質量(weight/weight) w / w weight / weight (weight / weight)
wt 野生型(wild−type) wt wild-type (wild-type)

1.3 命名法 本明細書及び特許請求の範囲において、従来のアミノ酸残基用の1文字及び3文字コードを用いる。 In 1.3 nomenclature the following specification and the claims, use of one-letter and three-letter codes for conventional amino acid residues. 見やすいように、本発明のアルファ‐アミラーゼ変異体は次の命名法を用いて記載する。 For clarity, the alpha of the present invention - amylase variant are described using the following nomenclature.

原型のアミノ酸:位置:置換されるアミノ酸 この命名法に従って、例えば242位のアラニンによるセリンの置換を次のように示し、 Original amino acid: Position: according to the amino acid this nomenclature is substituted, for example, the substitution of serine by 242 alanine illustrated as follows,
Ser242Ala又はS242A Ser242Ala or S242A
30位でのアラニンの欠損を次のように示し、 It shows the loss of alanine at position 30, as follows:
Ala30*又はA30*又はΔA30 Ala30 * or A30 * or ΔA30
及びリジンのような追加するアミノ酸残基の挿入を次のように示す Shows and insertion of an additional amino acid residue such as lysine, as follows
Ala30AlaLys又はA30AK。 Ala30AlaLys or A30AK.

アミノ酸残基30−33のようなアミノ酸残基の連続ストレッチの欠損を(30-33)*又は Δ(A30-N33)又はΔ30-33のように示す。 Defects contiguous stretch of amino acid residues, such as amino acid residues 30-33 (30-33) * or Δ represented as (A30-N33) or Deruta30-33. アミノ酸残基R18O-S181のような二つの連続するアミノ酸の欠損をΔRS又はΔ18O-181のように示す。 It shows the loss of two consecutive amino acids such as amino acid residues R18O-S181 as ΔRS or Δ18O-181.

具体的なアルファ‐アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼと比較して「欠損」を含む及びそのような位置に挿入される場合次のように示す例えば36位にアスパラギン酸を挿入する場合 Specific alpha - When inserting the aspartic acid shown for example 36 position as in the following as compared to the amylase to be inserted into containing and such a position the "missing" - amylase other alpha
*36Asp又は*36D。 * 36Asp or * 36D.

複数の変異はプラス記号によって分離され、言い換えると、 Multiple mutations are separated by plus signs, in other words,
Ala30Asp+Glu34Ser又はA30N+E34S Ala30Asp + Glu34Ser or A30N + E34S
であり、30及び34位にてそれぞれアラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンへ置換する変異を表す。 , And the representative of each mutation for substitution of alanine and glutamic acid for asparagine and serine at 30 and 34 positions.

一以上の改変アミノ酸残基が与えられる位置に挿入される場合それは次のように示す It shows as follows if the one or more modified amino acid residues are inserted into a given position
A30N,E又は A30N, E or
A30N又はA30E。 A30N or A30E.

さらに、修飾に有用な位置が任意の具体的修飾が示唆されずに本明細書にて同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置でそのアミノ酸残基に置換されてよいことが理解される。 Furthermore, useful location may be identified herein without suggesting any particular modifications, it is understood that any amino acid residue may be substituted on its amino acid residue at that position in the modified that. すなわち、例えば、これに特定されないが、30位でアラニンの修飾が意図される場合、アラニンが欠損又は他のアミノ酸、言い換えると、 That is, for example, but not specified thereto, if the modification of an alanine is intended position 30, alanine deleted or another amino acid, in other words,
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V
の任意のひとつに置換されてよいことが理解される。 Substituted to any one thing may be understood.

さらに、「A30X」は次の置換のいずれか一つを意味する In addition, "A30X" means any one of the following substitutions:
A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y,又はA30V; A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, or A30V;
又は略した場合、A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,Vとなる。 Or an abbreviation, consisting A30R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, and V.

親酵素が、ナンバリングを用いて、その位置での置換を示唆される問題のアミノ酸残基をすでに有する場合、次の命名法を用いる例えば、N又はVが野生型に存在する場合 「X30N」又は「X30N,V」 Parent enzymes, using the numbering, if already having amino acid residue substituted with suggested problems in that position, for example, a following nomenclature, if N or V is present in the wild-type "X30N" or "X30N, V"
つまり、親酵素に相当する他のものは30位にて「Asn」又は「Val」に置換される。 That is, other equivalent to the parent enzyme is substituted to "Asn" or "Val" at 30-position.

1.4アミノ酸残基の特徴 1.4 features of the amino acid residues
荷電アミノ酸、 Charged amino acids,
Asp, Glu, Arg, Lys, His Asp, Glu, Arg, Lys, His
負の電荷を持つアミノ酸(最も負に帯電している残基を最初に) Amino acids with a negative charge (first the most negatively charged and are residues)
Asp, Glu Asp, Glu
正の電荷を持つアミノ酸(最も正に帯電している残基を最初に) Amino acids having a positive charge (first the most positively charged and residue)
Arg, Lys, His Arg, Lys, His
中性アミノ酸 Neutral amino acid
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro
疎水性アミノ酸残基(最も疎水性が高い残基を最後に記載して) Hydrophobic amino acid residues (the most hydrophobic describes a high residue at the end)
Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp
親水性アミノ酸残基(最も親水性が高い残基を最後に記載して) Hydrophilic amino acid residues (the most hydrophilic describes a high residue at the end)
Thr, Ser, Cys, Gln, Asn Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

1.5相同性(同一性) 1.5 homology (identity)
整列後に別の配列に対して特定のパーセント(例えば、80%、83%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%)の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは塩基又はアミノ酸残基の割合が二つの配列を比較して同じである。 Certain percentage to another sequence after alignment (e.g., 80%, 83%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%) a polynucleotide having a sequence homology of or polypeptide percentage of bases or amino acid residues are the same in comparing the two sequences. このアライメント及びパーセント相同性又は同一性は周知の任意の適切なソフトウエアプログラムを用いて決定できる。 This alignment and the percent homology or identity can be determined using any known suitable software program. 例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel他、(eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18)に記載される。 For example CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY described (FM Ausubel other, (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18). 好ましいプログラムはthe Vector NTI Advance TM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup program, FASTA (Pearson 他 (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)、及びBLAST (BLAST Manual, Altschul 他, Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md.及びAltschul他, (1997) NAR 25:3389-3402)を含む。 Preferred program the Vector NTI Advance TM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), GCG Pileup program, FASTA (Pearson other (1988) Proc Natl, Acad Sci USA 85:.. 2444-2448), and BLAST (BLAST Manual, ...... Altschul other, Natl Cent Biotechnol Inf, Natl Lib Med (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md, and Altschul et al, (1997) NAR 25: including 3389-3402). 他の好ましいアライメントプログラムはALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)であり、好ましくはデフォルトパラメータを用いる。 Other preferred alignment program is ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), preferably using default parameters. 使用に適した別の配列ソフトウエアプログラムはthe Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)で入手できるTFASTA Data Searching Programである。 Another sequence software program that is suitable for use is the TFASTA Data Searching Program available in the Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).

相同性は第二から第一配列の導出を示す二つの配列間の相同性割合として決定されてよい。 Homology may be determined as a percent homology between two sequences indicating a derivation of the first sequence from the second. 相同性はGCGプログラムパッケージ(上述)が提供するGAPのような周知のコンピュータープログラム手段により適切に決定されてよい。 Homology may be properly determined by computer programs well known means such as GAP which provides GCG program package (described above) is. つまり、Gap GCG v8は相同性用デフォルトスコアリングマトリックス及び次のデフォルトパラメータを用いてよい。 That, Gap, GCG v8 may be used with default scoring matrix and the following default parameters for homology. それは、核酸配列比較のためにそれぞれ5.0のGAPクリエーションペナルティー及び0.3のエクステンションペナルティー及び蛋白質配列比較のためにそれぞれ3.0のGAPクリエーションペナルティー及び0.1のエクステンションペナルティーである。 It is respectively 3.0 GAP creation penalty of 0.1 extension penalty of for extension penalty and protein sequence comparisons GAP creation penalty of 0.3, respectively 5.0 for nucleic acid sequence comparisons. アライメントを作り、相同性を計算するためにGAPはNeedleman and Wunsch, (1970), J.Mol. Biol. 48:443-453の方法を用いる。 Making alignment, homology GAP to calculate the Needleman and Wunsch, (1970), J.Mol Biol 48:.. 443-453 Using the method of.

Amy707(配列番号1)及び例えば、別のアルファ‐アミラーゼの間の構造アライメントはAmy707と高い相同性、例えば、80%、85%、90%、95%、97%又は99%を有する他のアルファ‐アミラーゼにおける同等/相当の位置を同定するために用いてよい。 Amy707 (SEQ ID NO: 1) and, for example, another alpha - structural alignment as high as Amy707 homology between amylase, for example, 80%, 85%, 90%, other alpha with 95%, 97% or 99% - it may be used to identify the location of the same / equivalent in amylase. 前記構造アライメントを得る一つの方法はギャップペナルティーのデフォルト値、言い換えると、3.0のギャップクリエーションペナルティー及び0.1のエクステンションペナルティーを用いるGCGパッケージからのPile Up プログラムを用いることである。 The default value of the one way gap penalty of obtaining said structural alignment, in other words, is to use the Pile Up program from the GCG package using extension penalty gap creation penalty and 0.1 3.0. 他の構造アライメント方法は疎水性クラスター分析(Gaboriaud他, (1987), FEBS LETTERS 224, pp.149-155)及びリバーススリーディング(reverse threading)(Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No.1 pp. 142-149 (1998))を含む。 Other structural alignment methods hydrophobic cluster analysis (Gaboriaud other, (1987), FEBS LETTERS 224, pp.149-155) and reverse scan reading (reverse threading) (Huber, T;. Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol 7 , including No.1 pp. 142-149 (1998)).

1.6ハイブリダイゼーション 1.6 Hybridization
上記Amy707の特徴を用いたオリゴヌクレオチドは問題とするアルファ‐アミラーゼの完全又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列の基礎として適切に調製される。 Oligonucleotides with features of the Amy707 alpha in question - is suitably prepared as a basis for full or partial nucleotide or amino acid sequence of the amylase.

ハイブリダイゼーションを試験するために適した条件は5XSSCに予浸及び20%ホルムアミド、5Xデンハート液(Denhardt's solution)、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、及び50mgの変性超音波処理仔牛胸腺DNAに40℃で1時間予ハイブリダイゼーションを伴い、引き続き、100mMATPを補給した同様の溶液に40℃にて18時間ハイブリダイゼーションをし、それから2XSSC、0.2%SDS中40℃で30分間(低いストリンジェンシー)好ましくは50℃(中程度のストリンジェンシー)で、より好ましくは65℃(高いストリンジェンシー)でさらに好ましくは75℃(より高いストリンジェンシー)で三回のフィルター洗浄を行う。 Presoaked and 20% formamide suitable conditions in 5XSSC for testing hybridization, 5X Denhardt's solution (Denhardt's solution), 50mM sodium phosphate, pH 6.8, and 40 ° C. in denatured, sonicated calf thymus DNA 50mg in with a 1 hour pre-hybridization, subsequently, the 18 hour hybridization at 40 ° C. in the same solution supplemented with 100MMATP, then 2XSSC, 30 minutes at 40 ° C. in a 0.2% SDS (low stringency) preferably in 50 ° C. (medium stringency), even more preferably preferably at 65 ° C. (high stringency) performs three times of the filter washed with 75 ° C. (higher stringency). より詳しいハイブリダイゼーション方法についてはSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989に記載される。 More Sambrook et for hybridization method, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd Ed, is described in Cold Spring Harbor, 1989.

本明細書の文脈で、「から由来する」はアルファ‐アミラーゼの生産又は問題となる生物の菌種による生産だけでなくそのような菌種から単離される及び宿主生物中に生産されるDNA配列によってコードするアルファ‐アミラーゼも示す。 In the present context, "derived from" alpha - amylase productivity or problems become organism the DNA sequences produced from such species as well produced by species in the isolated are and host organism alpha encoded by - amylase is also shown. 最後に、その用語は合成の及び/又はcDNA由来のDNA配列によりコードされ、問題とするアルファ‐アミラーゼの同定される特徴を有しているアルファ‐アミラーゼ示すと意図される。 Finally, the term is encoded by and / or cDNA derived DNA sequence of the synthetic alpha in question - is intended to indicate amylase - alpha has a feature to be identified in the amylase. また、その用語は親アルファ‐アミラーゼが自然に発生するアルファ‐アミラーゼの変異体、言い換えると、自然に発生するアルファ‐アミラーゼの一以上のアミノ酸残基修飾(挿入、置換、欠損)の結果である変異体でもよいことを示すと考えられる。 Further, the term parent alpha - alpha amylase occurs naturally - mutant amylase, in other words, the alpha occur naturally - one or more amino acid residue modification of amylase (insertion, substitution, deletion) is the result of It would indicate that it may be a mutant.

また、本発明により含まれる配列が例示するamy707(イタリック体表示)配列(例えば、図3に示す配列番号3)を伴うストリンジェントハイブリダイゼーション条件下ハイブリダイゼーションする能力によって明らかとなることを当業者は理解できる。 Also, Amy707 the sequences included by the present invention is exemplified (italics Display) sequence (e.g., SEQ ID NO: 3 shown in FIG. 3) by those skilled in the art that will become apparent by stringent hybridization conditions hybridizing ability involving the Understandable. 核酸の一本鎖の形態が温度及びイオン強度の溶液の適切な条件下他の核酸にアニールできる場合、核酸は別の核酸配列とハイブリダイゼーションできる。 If single stranded form of the nucleic acid can anneal under suitable conditions other nucleic acid solution of temperature and ionic strength, the nucleic acid can further nucleic acid sequences hybridize. ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知である(例えば、Sambrook (1989)上述、特に 9章及び11章を参照願いたい)。 Hybridization and washing conditions are well known (e.g., Sambrook (1989) described above, Hopefully particularly to chapters 9 and 11). いくつかの実施態様においては、ストリンジェントな条件は65℃のTm及び0.1xSSC、0.1%SDSに相当する。 In some embodiments, stringent conditions 65 ° C. of Tm and 0.1 × SSC, equivalent to 0.1% SDS.

1.7親アルファ‐アミラーゼ 1.7 parent alpha - amylase
本明細書によれば、任意のAmy707アルファ‐アミラーゼは、上記に明らかにするように、親(言い換えると、バックボーン)アルファ‐アミラーゼとして用いてよい。 According to this specification, any Amy707 alpha - amylase, to reveal to the parent (in other words, backbone) alpha - may be used as amylase. 好ましい実施態様においては、親アルファ‐アミラーゼは、例えば、上記に参照されるものの一つ、配列番号1(図1参照)に示すアミノ酸配列を有する707アルファ‐アミラーゼのようなバシルス種(Bacillus sp.)707菌株の由来である。 In a preferred embodiment the parent alpha - amylase, for example, one of those referred to above, SEQ ID NO: 1 707 Alpha having the amino acid sequence shown in (see FIG. 1) - Bacillus species such as amylase (Bacillus sp. ) 707 is derived from the strain.

1.8改変される特徴 1.8 features to be modified
次のセクションは本明細書にて記載する変異体中に存在する改変及びそれらから得られる特徴(親707アルファ‐アミラーゼの特徴と相対的に)についての所望の改変との関係を記載する。 The following sections modifications and features derived therefrom present in the variant in which described herein - describes the relationship between the desired modification of the (parent 707 alpha relatively characterized amylase).

上述のように、本発明はバシルス種(Bacillus sp.)707番及び改変される特徴を有するその変異体由来のアルファ‐アミラーゼに関する。 As described above, the present invention is a variant derived from alpha having the features Bacillus species 707 and modification - about amylase (Bacillus sp.).

特に、具体的に意図される改変特徴に関して考えられる親707アルファ‐アミラーゼは上述の親707アルファ‐アミラーゼ及び少なくとも707アルファ‐アミラーゼの一部を含む親ハイブリッドアルファ‐アミラーゼである。 In particular, the parent 707 alpha believed regard specifically intended modified features - amylase aforementioned parent 707 alpha - amylase - parent hybrid alpha containing a portion of the amylase - amylase and at least 707 alpha.

バシルス種(Bacillus sp.)の菌株707アルファ‐アミラーゼ(配列番号1)が開始点として用いられるが、高い相同性を有する他のバシルス(Bacillus)アルファ‐アミラーゼにおける相当する位置も開示され、具体的にも開始点として考えられるとして理解されるべきである。 Strain 707 alpha Bacillus species (Bacillus sp.) - amylase (SEQ ID NO: 1) is used as a starting point, other Bacillus (Bacillus) alpha with high homology - also discloses the corresponding position in the amylase, specifically also it is to be understood as considered as a starting point.

実施態様においては、本発明は上述のように改変特徴を有する変異体に関する。 In embodiments, the present invention relates to variants with altered characteristics, as described above.

最初の実施態様においては、親バシルス種(Bacillus sp.)菌種アルファ‐アミラーゼの変異体であって、次の改変を少なくとも一つ又は少なくとも二つ含む。 In the first embodiment, the parent Bacillus species strains alpha (Bacillus sp.) - a variant amylase, comprising at least one or at least two of the following modifications. それは、 that is,
(a)C末端の欠損 (b)配列番号1のナンバリングを用いてアミノ酸202(言い換えると、M202)の置換、又は (c)配列番号1のナンバリングを用いてR181、Gl82、H182およびG184からなる群から選択される少なくとも二つの残基の欠損、及び前記変異体がアルファ‐アミラーゼ活性を有することを特徴とする。 (A) (in other words, M202) amino 202 using numbering of defect (b) SEQ ID NO: 1 of the C-terminal consists of R181, Gl82, H182 and G184 using substitutions, or (c) the numbering of SEQ ID NO: 1 deficiency of at least two residues selected from the group, and the mutant alpha - and having amylase activity.

1.8.1安定性 1.8.1 stability
本明細書にて記載する変異体の文脈において、改変される安定性(言い換えると、より高い又はより低い安定性)、特に、安定性の改善、特に高い温度(言い換えると、70−120℃)及び/又は極端なpH(言い換えると、低い又は高いpH、言い換えると、それぞれpH4−6又はpH8−11)、特に、60pp以下の遊離(言い換えると、溶液中のその非結合)カルシウム濃度での安定性を達成することについて重要な変異(アミノ酸置換及び欠損を含む)は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。 In the context of the variants described herein, (in other words, higher or lower stability) stability to be modified, in particular, improved stability, particularly high temperature (in other words, 70-120 ° C.) and / or extreme pH (in other words, low or high pH, ​​in other words, each pH4-6 or PH8-11), in particular, the following free (in other words, the non-binding in solution) 60Pp stability in calcium concentration (including amino acid substitutions and deletions) important mutation for achieving gender include any of the mutations listed in the section "altered Properties". 安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。 Stability may be determined as described in the "Methods" section below.


1.8.2Ca 2+ 安定性 1.8.2Ca 2+ stability
改変されるCa 2+安定性はCa 2+減少下酵素の安定性が改善される、言い換えると、より高い又はより低い安定性を意味する。 Ca 2+ stability to be modified stability Ca 2+ reduced under enzyme is improved, in other words, means a higher or lower stability. 本明細書に記載する変異体の文脈において、改変されるCa 2+安定性、特に、Ca 2+安定性の改善、言い換えるとより高い又はより低い安定性、特に、高いpH(言い換えると、pH8−10.5)の安定性を達成することについて重要な変異(アミノ酸置換及び欠損を含む)は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。 In the context of the variants described herein, Ca 2+ stability to be modified, in particular, Ca 2+ stability improved, in other words higher or lower stability, especially high pH (in other words, pH 8-10 .5 important mutation for achieving stability) (including amino acid substitutions and deletions) may include any of the mutations listed in the section "altered properties".

1.8.3特異的活性 1.8.3 specific activity
さらなる実施態様においては、改変される特異的活性、特に特異的活性の増減、特に、10から60℃までの温度、好ましくは20から50℃、特に30から40℃の温度で特異的活性を有する変異体を得ることに関して重要な変異(アミノ酸置換及び欠損を含む)は、「改変される特徴」セクションに記載される変異のいずれかを含む。 In a further embodiment, the specific activity to be modified, in particular increased or decreased specific activity, especially temperature from 10 to 60 ° C., preferably have a specific activity at a temperature of from 20 to 50 ° C., in particular from 30 40 ° C. important mutations with respect to obtaining variants (including amino acid substitutions and deletions) may include any of the mutations listed in the section "altered Properties". 特異的活性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。 Specific activity may be determined as described in the "Methods" section below.

1.8.4酸化安定性 1.8.4 oxidation stability
本明細書にて記載される変異体は、親アルファ‐アミラーゼと比較して、改変される酸化安定性、特に高い酸化安定性を有してよい。 Variants described herein, the parent alpha - compared to amylases, oxidation stability to be modified, may in particular have a high oxidative stability. 増加される酸化安定性は例えば、洗剤組成物において有利であり、減少される酸化安定性はデンプン液状化用組成物において有利である。 The oxidation stability to be increased for example, be advantageous in the detergent composition, oxidative stability is reduced is advantageous in starch liquefaction composition. 酸化安定性は下記の「方法」のセクションにて記載されるように決定されてよい。 It may be determined as described in oxidation stability in the "Methods" section below.

1.8.5改変されるpHプロファイル 1.8.5 pH profile to be modified
改変されるpHプロファイル、特に高いpH(言い換えると、pH8−10.5)又は低いpH(言い換えると、pH4−6)で活性を改善されるプロファイルを有する重要な位置及び変異体は活性部位残基のそばに位置するアミノ酸残基の変異を含む。 pH profile to be modified, (in other words, PH8-10.5) particularly high pH or low pH (in other words, pH 4-6) key positions and variants active site residues have a profile that is improve the activity in It contains a mutation of the amino acid residues located near.

好ましい具体的変異/置換は問題とする位置について「改変される特徴」セクションにおいて上述したもののひとつである。 Preferred specific mutations / substitutions is one of those described above in "Altered" section for the position in question. 適切な試験は下記の「方法」のセクションにて記載される。 Suitable tests are described in the "Methods" section below.

1.8.6洗浄能力 1.8.6 cleaning ability
改善される洗浄能力、特に高いpH(言い換えると、pH8.5−11)での洗浄能力を有する変異体を得ることに関して重要な位置及び変異は、問題とする位置について「改変される特徴」セクションにおいて上述する具体的な変異体/置換を含む。 Improved the cleaning ability, (in other words, PH8.5-11) particularly high pH important position and mutations with respect to obtaining variants with cleaning capacity of the "Altered" section for the position in question It includes specific mutants / substitutions described above in. 洗浄能力は下記の「方法」のセクションにて記載されるように試験される。 Wash performance is tested as described in the "Methods" section below.

2. 2. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ、その変異体、及びそれらの生産方法 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase, variants thereof, and methods for their production
すなわち、ある実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼの変異体を生産するために、すでに決定されているアミノ酸の置換、欠損、トランスバージョン、挿入、及びそれらの組み合わせを含む組み換え体を創るバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ配列の提供である。 That is, in some embodiments, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - to produce variants of amylases, amino acids that have been determined previously substitutions, deletions, transversions, insertions, and combinations thereof Bacillus species to create a recombinant, including 707 alpha (Bacillus sp.) - is the provision of amylase array. これらの変異体はさらに生産増強する、pH安定性の増加、温度安定性の増加、Ca 2+の要求性の低減、特異的活性の増加、食器洗浄又は洗浄能力の増加、可溶性の増加、保存安定性の増加、又はこれらの組み合わせを有することができる。 These variants further increase production, increased pH stability, increased temperature stability, reduced requirement for Ca 2+, an increase in specific activity, increased dishwashing or washing performance, increased solubility, storage stability increase in sex, or may have a combination of these. 変異体を遺伝子組み換えで生産する方法は提供される配列及びベクターを用いて実施され、又は他の周知の方法で実施された。 Variants method for producing genetically modified is carried out using sequences and vectors are provided, or were performed by other known methods.

2.1アルファ‐アミラーゼをコードするDNA配列のクローニング 2.1 alpha - cloning of the DNA sequence encoding the amylase
親アルファ‐アミラーゼをコードするDNA配列は、周知の多様な方法を用いて、問題とするアルファ‐アミラーゼを生産する任意の細胞又は微生物から単離されてよい。 Parent alpha - DNA sequence encoding the amylase, using any of a variety of procedures, alpha question - may be isolated from any cell or microorganism producing the amylase. まず、DNA及び/又はcDNAライブラリーは、研究されるべきアルファ‐アミラーゼを生産する生物由来の遺伝子染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築される。 First, DNA and / or cDNA library, alpha to be studied - is constructed using gene chromosomal DNA or messenger RNA from the organism producing the amylase. それから、アルファ‐アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、問題とする生物から調製する遺伝子ライブラリーからのアルファ‐アミラーゼをコードするクローンを同定するために相同体、ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを合成しそして用いる。 Then, alpha - when an amino acid sequence of the amylase is known, alpha from a gene library prepared from the organism in question - homologue to identify clones encoding the amylase, to synthesize labeled oligonucleotide probes and used. あるいは、知られているアルファ‐アミラーゼ遺伝子に相同性のある配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーション及び低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのプローブとして用いることができる。 Alternatively, known alpha - using hybridization labeled oligonucleotide probe comprising a sequence homologous to amylase gene and low stringency washing conditions, alpha - used as a probe to identify the amylase encoding clone be able to.

アルファ‐アミラーゼコードクローンを同定するためのさらに別の方法はプラスミドのような発現ベクターに遺伝子DNAのフラグメントを挿入し、アルファ‐アミラーゼ陰性細菌を得られる遺伝子DNAライブラリーと形質転換し、及びそれからアルファ‐アミラーゼに対する基質を含む寒天培地の上に形質転換細菌を置き、それによってアルファ‐アミラーゼを発現するクローンを同定できる。 Alpha - amylase encoding clones Yet another method for identifying inserts a fragment of the expression vector gene DNA such as a plasmid, alpha - amylase-negative bacteria transformed with a gene DNA libraries obtained by, and alpha therefrom - Place the transformed bacteria onto agar containing a substrate for amylase, thereby alpha - can identify clones expressing amylase.

あるいは、酵素をコードするDNA配列を例えば、SL Beaucage及びMH Caruthers (1981)により記載されるフォスフォアミダイト(phosphoamidite)法又はMatthes他(1984)により記載される方法のような確立した標準方法により合成的に調製してもよい。 Alternatively, a DNA sequence encoding an enzyme for example, synthesized by standard methods established such as the method described by phosphoramidite (phosphoamidite) method or Matthes other described (1984) by SL Beaucage and MH Caruthers (1981) to may be prepared. フォスフォアミダイト(phosphoamidite)法において、オリゴヌクレオチドを例えば、自動DNA合成機で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、及び適切なベクターへクローニングする。 In phosphoramidite (phosphoamidite) method, the oligonucleotide for example, synthesized by an automatic DNA synthesizer, purified, annealed, ligated, and cloned into a suitable vector.

最後にDNA配列は、標準的な方法に従って、合成、遺伝子、又はcDNA原型(必要に応じて、完全なDNA配列の多様な一部に相当するフラグメント)のフラグメントをライゲーションにより調製される遺伝子及び合成の原型の混合、合成の及びcDNAの原型の混合又は遺伝子及びcDNA原型の混合でよい。 Finally DNA sequence according to standard methods, synthetic, genetic, or cDNA prototype fragment genes and synthetic prepared by ligation of the (if necessary, complete diverse part corresponding fragment of the DNA sequence) mixing the original, it may be mixed in mixing or genes and cDNA prototype prototype synthesis of and cDNA. また、DNA配列を例えば、US Pat. No. 4,683,202又はRK Saiki他(1988)に記載されるように、特異的なプローブを用いるポリメラーゼチェーン反応(PCR)により調製してよい。 Further, the DNA sequence for example, US by Pat. No. 4,683,202 or RK Saiki as described elsewhere (1988), may be prepared by polymerase chain reaction (PCR) using specific probes.

2.2部位特異的突然変異誘発法 2.2 site-directed mutagenesis
一度アルファ‐アミラーゼコードDNA配列を単離し、変異のための必要な部位を同定すると、変異を合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してよい。 Once alpha - Release the amylase coding DNA sequence single and identifying the necessary sites for mutation may be introduced using the mutant synthetic oligonucleotides. これらのオリゴヌクレオチドは必要な変異部位を攻撃するヌクレオチド配列を含む。 These oligonucleotides contain nucleotide sequences to attack the required mutation site. すなわち、オリゴヌクレオチドを合成する間に変異ヌクレオチドを挿入する。 That is, to insert a mutated nucleotide during the synthesis of oligonucleotides. 具体的方法において、アルファ‐アミラーゼコード配列をブリッジングするDNAの一本鎖ギャップをアルファ‐アミラーゼ遺伝子を保持するベクター中に創製する。 In a specific method, the alpha - is created in a vector that holds the amylase gene - a single-stranded gap of DNA, bridging the amylase coding sequence alpha. それから、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖DNAの相同性のある部分にアニーリングする。 Then, to anneal to portions of the homologous single-stranded DNA a synthetic nucleotide, bearing the desired mutation. それから、残されるギャップをDNAポリメラーゼI(クレノウ断片(Klenow fragment))で満たし、構築体をT4リガーゼを用いてライゲーションする。 Then, filled with a gap left DNA polymerase I (Klenow fragment (Klenow fragment)), the construct is ligated using T4 ligase. Morinaga他(1984)US Pat. No. 4,760,025に記載のこの方法の具体例は、カセットのマイナー改変を実施することにより多数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。 Specific examples of the method according to Morinaga other (1984) US Pat. No. 4,760,025 discloses the introduction of oligonucleotides encoding multiple mutations by performing minor alterations of the cassette. しかしながら、多数の、種々の長さのオリゴヌクレオチドが導入できるので、多くの変異でさえもMorinagaの方法によって一度で導入できる。 However, a large number, so can be introduced of oligonucleotides, of various lengths, can be introduced at once by Morinaga method even many mutations.

アルファ‐アミラーゼコードDNA配列に変異の導入の別の方法がNelson及びLong (1989)に記載される。 Alpha - Another method of introducing mutations into amylase coding DNA sequence is described in Nelson and Long (1989). それはPCR反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成されるDNA鎖を用いることによって導入される所望の変異を含むPCRフラグメントの3段階の配列性を含む。 It comprises a sequence of three steps of PCR fragment containing the desired mutation introduced by using a DNA strand is chemically synthesized as one of the primers in the PCR reactions. PCR生産フラグメントから変異を有するDNAフラグメントを制限エンドヌクレアーゼの切断により単離し、発現プラスミドへ再挿入してよい。 The DNA fragment carrying the mutation from PCR product fragment was isolated by cleavage of the restriction endonuclease, it may be reinserted into an expression plasmid.

3. 3. アルファ‐アミラーゼ変異体の生産 Alpha - production of amylase variant
本明細書に記載する方法により又は任意の別の周知の方法により生産するバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするDNA配列を適切なプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意に抑制遺伝子及び/又は種々の活性遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現できる。 Bacillus species produced by another known method or any by the methods described herein 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or an appropriate promoter DNA sequence encoding that variant, operator, ribosome binding site , translation initiation signal, and with an expression vector comprising any suppression genes and / or various control sequences encoding active gene can be expressed in the form of the enzyme.

アルファ‐アミラーゼ変異体をコードDNA配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えDNA手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。 Alpha - recombinant expression vector carrying the DNA sequence encoding the amylase variant may be any vector that is conveniently subjected to recombinant DNA procedures, and the choice of vector will often it is determined by the host cell into which they are introduced. つまり、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、言い換えると、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。 In other words, the vector may be a vector may be an autonomously replicating, in other words, may be a vector that exists extrachromosomally, the replication of a plasmid, a bacteriophage or an extrachromosomal element, of chromosomal replication, such as a small chromosome, or an artificial chromosome it may be one which is independent replication. あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。 Alternatively, the vector, when introduced into a host cell, is integrated into the host cell chromosome, and with built-in I chromosomes or a vector is replicated. また、組み込まれる遺伝子を、促進される増幅可能な構築体の使用により、抗体選別又は必須調節遺伝子のような他の選別圧によって、又は必須代謝経路遺伝子の効果を通じて相補性によって染色体内に遺伝子の複製コピーを創製するために増幅してもよい。 Furthermore, the gene is incorporated, the use of amplifiable construct promoted by other selection pressure such as an antibody screening or essential regulatory genes, or essential metabolic pathway gene effects through gene into chromosome by complementation of it may be amplified in order to create a duplicate copy.

ベクターにおいて、DNA配列は適切なプロモーター配列に作動的に連結する。 In the vector, DNA sequences are operably linked to a suitable promoter sequence. プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のDNA配列でよく、宿主細胞に相同のまたは異種のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子由来でもよい。 The promoter may be any DNA sequence which shows transcriptional activity in the chosen host cell and may be derived from genes encoding proteins either homologous to or heterologous to the host cell. アルファ‐アミラーゼ変異体をコードするDNA配列の転写を方向付ける典型的なプロモーターは、特に細菌の宿主において、大腸菌(E. coli)のlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス セリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子dagA、又はcelAプロモーター、バシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルファ‐アミラーゼ遺伝子(amyL)のプロモーター、バシルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)麦芽アミラーゼ(maltogenic amylase)遺伝子(amyM)のプロモーター、バシルス アミロリケファシエンス(Bacillus amylolique Alpha - Exemplary promoters for directing the transcription of the DNA sequence encoding the amylase variant, especially in a host bacteria, E. coli promoter of the lac operon of (E. coli), Streptomyces coelicolor (Streptomyces coelicolor) agarase gene dagA, or celA promoter, Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) alpha - promoter of the amylase gene (amyL), the promoter of the Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) malt amylase (maltogenic amylase) gene (amyM), Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amylolique faciens)アルファ‐アミラーゼ(amyQ)のプロモーター、バシルス ズブチリス(Bacillus subtilis)xylA及びxylB遺伝子のプロモーター等である。 faciens) alpha - promoter of amylase (amyQ), is a promoter such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) xylA and xylB gene. 菌における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス オリザエ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)、アスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー(A. niger)酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス ニガー(A. niger)グルコアミラーゼ、リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、アスペルギルス オリザエ(A. oryzae)アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス オリザエ(A. oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス ニドゥラン(A. ni For transcription in bacteria, examples of useful promoters are the Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) TAKA amylase, Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei), aspartic proteinase, Aspergillus niger (Aspergillus niger) neutral alpha - amylase, Aspergillus niger (A . niger) acid stable alpha - amylase, Aspergillus niger (A. niger) glucoamylase, Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei) lipase, Aspergillus oryzae (A. oryzae) alkaline protease, Aspergillus oryzae (A. oryzae) triose phosphate isomerase or Aspergillus Niduran (A. ni dulans)アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。 dulans) acetamidase is a promoter from a gene encoding. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする遺伝子が大腸菌(E. coli)のような細菌類に発現する場合、適切なプロモーターは、例えば、T7プロモーターを含むバクテリオファージプロモーター及びファージラムダプロモーターから選択される。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - If the gene encoding the amylase or variant thereof is expressed in bacteria such as E. coli (E. coli), suitable promoters are, for example, a bacteriophage containing a T7 promoter It is selected from the promoter and a phage lambda promoter. 酵母菌で発現のために適したプロモーターの例は、サッカロミセス セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)のGal1及びGal10プロモーター、ピキア パストリス(Pichia pastoris)AOXl又はAOX2プロモーターを含むが、これらに限定されない。 Examples of suitable promoters for expression in yeast, Gal1 and Gal10 promoter Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), including Pichia pastoris (Pichia pastoris) AOXl or AOX2 promoters, without limitation. トリコデルマ レーシ(Trichoderma reesei)における発現のために、CBHII(セロビオヒドロラーゼ II(cellobiohydrolase II))プロモーターを用いてよい。 For expression in Trichoderma Reshi (Trichoderma reesei), CBHII (cellobiohydrolase II (cellobiohydrolase II)) may be used promoter.

発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするDNA配列に作動的に連結するポリアデニル化配列を含んでもよい。 Expression vectors also include a suitable transcription terminator and, in eukaryotes, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - it may include a polyadenylation sequence operably linked to a DNA sequence encoding an amylase or variant thereof . ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に、しかし必ずではないが、由来してもよい。 Suitably from the same source as the termination and polyadenylation sequences of the promoter, but not necessarily, be derived from.

さらに、ベクターは宿主細胞でベクターが複製可能なDNA配列でもよい。 Furthermore, the vector may be a DNA sequence enabling the vector to replicate in the host cell. そのような配列の例は、プラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH(図4、ジェネンコア インターナショナル社(Genencor International, Inc.))pHPLT、及びpIJ702の複製の原型や当業者が周知の必須要素から構築されるベクターである。 Examples of such sequences, plasmids pBR322, pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pICatH (FIG. 4, Genencor International, Inc. (Genencor International, Inc.)) PHPLT, and replication of the original and those skilled in pIJ702 is known is a vector that is built from the essential elements of the.

ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。 The vector may also comprise a selectable marker. 例えば、バシルス ズブチリス(B. subtilis)又はバシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)由来dal遺伝子のような、単離される宿主細胞中の欠点を補完する遺伝子産物、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を有する遺伝子である。 For example, Bacillus subtilis (B. subtilis) or Bacillus licheniformis (B. licheniformis), such as the dal genes from the gene product complements a defect in the host cell to be isolated, or, for example, ampicillin, kanamycin, Kuroramu it is a gene having antibiotic resistance such as chloramphenicol, or tetracycline resistance. さらに、ベクターは、ハイグロマイシン耐性を増加するマーカーで、amdS、argB、niaD、及びxxsCのようなアスペルギルス(Aspergillus)選択マーカーを含んでよく、選択は、周知の技術のような同時形質転換によって行われてよい。 Furthermore, the vector line markers to increase the hygromycin resistance, amdS, argB, niaD, and may include Aspergillus (Aspergillus) selectable marker such as XxsC, selection is by co-transformation, such as the well-known technique it may be cracking. 例えば、国際PCT出願WO 91/17243を参照願いたい。 For example, I want to refer to international PCT application WO 91/17243.

例えば、ある細菌又は菌類を宿主細胞として用いる場合、細胞外発現又は固形発酵がある点では有利であるので、一般的に酵素の発現は細胞外及び培養培地である。 For example, when using certain bacteria or fungi as host cells, since at some point extracellular expression or solid fermentation is advantageous, expression generally enzyme is extracellular and culture media. 一般的に本明細書にて記載するバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼおよびその変異体は、培地への発現酵素の分泌を可能とするシグナルポリペプチド型を含む。 Generally Bacillus species described herein 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase and variants thereof, comprising a signal polypeptide type to allow secretion of the expressed enzyme into the culture medium. 必要ならば、シグナルポリペプチドを、個別のシグナルポリペプチドをコードするDNA配列の置換によって便利に行われる異なる配列により置換してもよい。 If necessary, the signal polypeptide, may be replaced by a different sequence conveniently accomplished by substitution of the DNA sequences encoding the individual signal polypeptide. 一般的にシグナルポリペプチドは、3つの領域、N‐末端領域、H‐領域、及びC‐末端領域及び通常18から35残基の範囲の長さで特徴づけられる。 Generally signal polypeptide comprises three regions, N- terminal region, H- region and C- from the distal region and the normal 18 in the range of 35 residues characterized in length. これらは任意の野生型シグナルアルファ‐アミラーゼ又は細菌類又は真核細胞由来の他の分泌蛋白質由来でもよい。 These optional wildtype signal alpha - may be derived from amylase or bacterial or other secretory proteins from eukaryotic cells.

発現ベクターは、例えば、選択宿主生物中ベクターの自律複製を可能とする要素及び選択目的に対して表現的に検出可能な一以上のマーカーのようなクローニングベクターの成分を一般的に含む。 Expression vectors may include, for example, typically includes the components of a cloning vector such as expression detectable one or more markers against possible the elements and selection purposes autonomous replication of selected host organism the vector. 発現ベクターは通常プロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意的に、抑制遺伝子又は一以上の活性化遺伝子のような、ヌクレオチド制御配列を通常含む。 Expression vectors usually promoter, operator, ribosome binding site, translation initiation signal, and optionally, such as suppressing gene or one or more activating gene, usually comprising a nucleotide control sequences. 一般的に、容易に酵素を回収し、及び該当する場合、精製するために用いるすべてのシグナル配列は細胞培養培地への原料に標的を絞る。 Generally, easily enzyme it was collected, and if applicable, all the signal sequences used to purify squeeze the targets feed to the cell culture medium.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の必要な要素をそれぞれコードするDNA構築体をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている(例えば、Sambrook他、 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989、 and 3 rd ed.,2001を参照)。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase variant, the promoter, ligated terminator, and a DNA construct respectively encoding other necessary elements, insert them into suitable vectors containing the information necessary for replication the method used to are well known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook other, MOLECULAR CLONING:.. a LABORATORY MANUAL, 2nd ed, Cold Spring Harbor, 1989, and 3 rd ed, see 2001).

DNA構築体又は発現ベクターのいずれかを含む単離される細胞は、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の組み換えの生産における宿主細胞として有効に用いられる。 Cells isolated include any of the DNA construct or expression vector, Bacillus species 707 alpha - effectively used as host cells in the production of recombinant amylase or variant thereof (Bacillus sp.). 宿主染色体にDNA構築体(一以上のコピー)を都合よく組み込むことにより、細胞は変異体をコードするDNA構築体で形質転換される。 By incorporating good DNA construct of (one or more copies) convenient for the host chromosome, cells are transformed with a DNA construct encoding the variant. DNA配列が細胞で安定的に維持される可能性が高い場合、この組み込みは有効であると一般的に考えられる。 If there is a high possibility that DNA sequence is stably maintained in the cell, the integration is generally considered to be effective. 宿主染色体へのDNA構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。 Integration of the DNA constructs into the host chromosome, for example, by recombinant homologous to or heterologous carried out by conventional methods. あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型では上述のように発現ベクターで形質転換されてもよい。 Alternatively, cells may be transformed with an expression vector as described above in different types of host cells.

適切な細菌宿主生物の例は、バシルス ズブチリス(Bacillus subtilis)、バシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシルス レンツス(Bacillus lentus)、バシルス ブレビス(Bacillus brevis)、バシルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バシルス アルカロフィリス(Bacillus alkalophilus)、バシルス アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシルス コアグランス(Bacillus coagulans)バシルス ランツス(Bacillus lautus)、バシルス メガテリウム(Bacillus meg Examples of suitable bacterial host organism, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus lentus (Bacillus lentus), Bacillus brevis (Bacillus brevis), Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus), Bacillus Al Caro Phyllis (Bacillus alkalophilus), Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliquefaciens), Bacillus coagulans (Bacillus coagulans) Bacillus Rantsusu (Bacillus lautus), Bacillus megaterium (Bacillus meg terium)、及び バシルス ツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)を含むバシラス属(Bacillaceae); ストレプトミセス ムリナス(Streptomyces murinus)のようなストレプトミセス(Streptomyces)種;ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)のようなラクトコッカス種(Lactococcus spp);ラクトバシルス ロイテリ(Lactobacillus reuteri)を含むラクトバシルス種(Lactobacillus spp.)リューコノストック種(Leuconostoc spp.)ペディオコッカス種(Pediococcus spp.)を含む乳酸菌属;及びストレプトコッカス種(Strept Terium), and Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis) Bacillus species including (Bacillaceae); Streptomyces murinus (Streptomyces murinus Streptomyces (Streptomyces), such as a) species; Lactococcus species, such as Lactococcus lactis (Lactococcus lactis) (Lactococcus spp); (. Lactobacillus spp) (. Leuconostoc spp) (. Pediococcus spp) Lactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) Lactobacillus species including Leuconostoc species Pediococcus species Lactobacillus genus including, and Streptococcus species (Strept coccus spp.)のようなグラム陽性細菌種である。 coccus spp.) is a Gram-positive bacterial species such as. あるいは、グラム陰性菌種の菌は大腸菌(E. coli)を含むエンテロバクテリア科(Enterobacteriaceae)又はシュードモナス科(Pseudomonadaceae)に属する。 Alternatively, a gram-negative bacterial species of bacteria belonging to the Escherichia coli (E. coli) Enterobacteriaceae family, including (Enterobacteriaceae) or Pseudomonas family (Pseudomonadaceae). 適切な酵母宿主生物は、ピキア種(Pichia sp.)ハンセヌラ種(Hansenula sp.)、又はクリベロミセス(Kluyveromyces)、ヤロウィニア(Yarrowinia)、又はサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を含むサッカロミセス(Saccharomyces)の種または、例えばシゾサッカロミセス ポンベ(S. pombe)種のようなシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)に属する種のようなバイオテクノロジー的に関係のある酵母の種から選択されてよいが、これらに限定されない。 Suitable yeast host organisms, Pichia species (Pichia sp.) Hansenula species (Hansenula sp.), Or Kluyveromyces (Kluyveromyces), species Yarowinia (Yarrowinia), or Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces containing (Saccharomyces cerevisiae) (Saccharomyces) or, for example it may be selected from Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) species such Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) belonging of biotechnologically relevant yeasts such as species species, but is not limited thereto. メタノール資化酵母である、ピキア パストリス(Pichia pastoris)の菌株を宿主生物として用いてよい。 Methanol assimilating yeasts, the strain of Pichia pastoris (Pichia pastoris) may be used as the host organism. あるいは、宿主生物は、ハンセヌラ(Hansenula)種でもよい。 Alternatively, the host organism can be a Hansenula (Hansenula) species. 糸状菌の間で適切な宿主生物は、例えば、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス ツビゲンシス(Aspergillus tubigensis)、アスペルギルス アワモリ(Aspergillus awamori)、又はアスペルギルス ニドゥラン(Aspergillus nidulans)のようなアスペルギルス(Aspergillus)種を含む。 Suitable host organisms among filamentous fungi, for example, Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), Aspergillus tubigensis (Aspergillus tubigensis), Aspergillus awamori (Aspergillus awamori), or as Aspergillus Niduran (Aspergillus nidulans) such including Aspergillus (Aspergillus) species. あるいは、例えばフザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のようなフザリウム(Fusarium)種の菌株又はリゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)のようなリゾムコール(Rhizomucor)種の菌株が宿主生物として用いられる。 Alternatively, for example, Fusarium oxysporum Rhizomucor (Rhizomucor) strains of the species such as Fusarium (Fusarium) strains of the species or Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei), such as (Fusarium oxysporum) is used as the host organism. 他の適切な菌株はテルモミセス(Thermomyces)及びムコール(Mucor)種を含む。 Other suitable strains include the Terumomisesu (Thermomyces) and Mucor (Mucor) species.

典型的な酵母の種は、例えばサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のようなサッカロミセス(Saccharomyces)又はシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)の種を含む。 Species typical yeasts include species of Saccharomyces (Saccharomyces) or Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces), such as Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae). 糸状菌は、例えば、アスペルギルス オリザエ(A.oryzae)又はアスペルギルス ニガー(A. niger)のようなアスペルギルス(Aspergillus)の種に有利に属する。 Filamentous fungi, for example, advantageously belong to a species of Aspergillus (Aspergillus), such as Aspergillus oryzae (A. oryzae) or Aspergillus niger (A. niger). 菌細胞をプロトプラスト形成及びそれ自体知られている方法の細胞壁の再生を伴うプロトプラストの形質転換/トランスフェクションを含むプロセスにより形質転換してよい。 The bacterial cells may be transformed by a process comprising transforming / transfecting protoplasts with regeneration of the cell wall in a manner known protoplast formation and themselves. アスペルギルス(Aspergillus)宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、EP238023の記載を含む。 Suitable methods according to transformation of Aspergillus (Aspergillus) host cell, for example, includes a description of EP 238 023.

さらなる実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を生産する方法は、変異体の生産をもたらす条件下、上述のように、宿主細胞を培養すること細胞及び/又は培養培地から変異体を回収する方法を含んでいる。 In a further embodiment, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - a method of producing amylase or variant thereof, under conditions which result in the production of the variant, as described above, and cell culturing a host cell / or includes a method for recovering mutant from the culture medium.

細胞を培養のために用いる培地は、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の発現が得られ、問題となる宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。 The medium used for cell culture, the Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - Expression of amylase or variant thereof is obtained, it may be any conventional medium suitable for growing the host cell in question. 適切な培地及び培地成分は業者(例えばDifco(商標))から入手可能であり、又は出版された手順(例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関(the American Type Culture Collection)のカタログに記載された手順)に従って調製してもよい。 Suitable media and media components are skilled (e.g. Difco (TM)) available from, or published procedures (e.g., American Type Culture Collection (the American Type Culture Collection) procedure described in the catalog of) it may be prepared in accordance with. 用いる培地は用いる宿主細胞に最も適するものである。 The medium used are those most suitable for the host cell used. 例えば、バシルス リチェニフォルミス(Bacillus licheniformis)培養について下記に述べる培地である。 For example, Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis) a medium described below for the culture. この場合培養培地は、ナトリウム、カリウム、リン酸、マグネシウム及び硫酸の供給源や微量元素の供給源としての無機塩を伴う有機化合物の供給源として浸トウモロコシ固体及び大豆粉からなってよい。 In this case the culture medium, sodium, potassium, phosphate, may consist of magnesium and corn solids and soy flour immersion as a source of supply and an organic compound with an inorganic salt as a source of trace elements sulfate. また、一般的にグルコースのような炭水化物供給源は初期の培地の一部である。 Further, the carbohydrate source, such as a generally glucose is part of the initial medium. 一度培養がそれ自身で確立し、培養が開始すると、炭水化物は、周知の技術により、培養を維持するためタンクで測定される。 Once established culture itself, the culture is started, carbohydrates, by known techniques, is measured in the tank to maintain the culture. 例えば、比色分析法を用いて酵素の力価を測定するために一定間隔で発酵槽からサンプルを採集する。 For example, to collect samples from the fermentor at regular intervals to measure the titer of the enzyme using a colorimetric assay. 酵素生産速度が測定に従って増加が止まる時発酵プロセスは中止される。 Enzyme production rate fermentation process when the increase stops in accordance with the measurement is stopped.

宿主細胞から分泌されるバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地の蛋白質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、又はそれと類似のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。 Bacillus species secreted from the host cell 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof by methods well known, may conveniently be recovered from the culture medium, separating the cells from the medium by centrifugation or filtration , and by using a salt such as ammonium sulfate to precipitate the protein components of the medium, subsequently, comprising separating using ion exchange chromatography, affinity chromatography, or it how similar such chromatography.

宿主細胞を、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現させる適切な条件下にて培養してよい。 The host cell, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - may be cultured under suitable conditions to express the amylase or variant thereof. 蛋白質の発現は、酵素が連続的に生産されるように、又は発現開始のため刺激を誘導するように構成してもよい。 Expression of proteins, as enzymes are continuously produced, or may be configured to induce for expression stimulus onset. 誘導発現の場合、例えば、蛋白質の生産は、デキサメタゾン又はIPTG又はセファロースのような誘導物質が、培養培地へ添加されることによって要求されるとき、開始される。 For inducible expression, for example, the production of protein, inducer such as dexamethasone or IPTG, or Sepharose, when requested by being added to the culture medium is initiated. また、ポリペプチドを、TnT(商標)(プロメガ(Promega))ウサギ網赤血球システムのようなインビトロ、無細胞システムで組み換え的に生産できる。 Further, a polypeptide, TnT (TM) (Promega (Promega)) in vitro, such as a rabbit reticulocyte system, can be produced recombinantly in a cell-free system.

また、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現する宿主を好気状態の下、宿主に適切な培地で培養する。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha - cultured with amylase or under the host aerobic conditions expressing the mutant host in an appropriate medium (Bacillus sp.). 振盪及び攪拌と給気の組み合わせを、例えば、約30℃から約75℃のような宿主の必要とする条件及び所望の酵素の生産に応じた宿主の適切な温度で生産が得られるように提供する。 Provide a combination of shaking and stirring and air supply, for example, as production is obtained in a host suitable temperature depending on the production conditions and the desired enzymes that require from about 30 ° C. of hosts such as about 75 ° C. to. 培養は、約12から約100時間(及びそれらの間任意の時間)またはそれ以上又は例えば24から72時間、あるいは、75から約120時間まで行う。 Cultures, from about 12 to about 100 hours (and any time between them) or more, or for example 24 to 72 hours, or carried out from 75 to about 120 hours. 典型的に、培養培地は、酵素の生産に関与する宿主の必要とする培養条件に応じて、再びpH約5.5から約8.0とする。 Typically, culture media, depending on culture conditions that require the host to be involved in the production of the enzyme, and approximately 8.0 to about pH 5.5 again.

活性測定用の試験は周知である。 Test for activity measurements is well known. 例えば、US Patent No. 6,297,037を参照願いたい。 For example, I want to refer to US Patent No. 6,297,037. 例えば、変異体の活性を測定するために可溶性基質試験を実施できる。 For example, it is possible to carry out the soluble substrate tested to determine the activity of the mutant. 例えば、これはMegazyme(Aust.) Pty. Ltdにより供給されるエンドポイント試験キットに基づいて開発される速度試験を用いて実施される。 For example, this is performed using the speed test is developed based on the endpoint test kit supplied by Megazyme (Aust.) Pty. Ltd. 基質(p−ニトロフェニル マルトヘプタオシド(p−nitrophenyl maltoheptaoside)、BPNPG7)を10mLの滅菌水に溶解し、引き続き、試験用緩衝液(50 mM マレイン酸エステル緩衝液pH 6.7、5 mM塩化カルシウム、0.002% Tween 20)に1から4倍に希釈する。 Substrate (p- nitrophenyl maltoheptaoside (p-nitrophenyl maltoheptaoside), BPNPG7) was dissolved in sterile water 10 mL, subsequently, test buffer (50 mM maleate buffer pH 6.7,5 mM calcium chloride, dilute 1 to 4 times 0.002% Tween 20). 試験を25℃でキュベット中に10μLのアルファ‐アミラーゼを790μLの基質に添加することにより実施する。 Alpha 10μL test in a cuvette at 25 ° C. - carried out by adding amylase to the substrate 790MyuL. 75秒遅れて、加水分解速度を410nmで吸収の変化速度として測定する。 75 seconds later, measuring the rate of hydrolysis as a change rate of absorption at 410 nm. 一般的に試験は0.4吸収unit/minの速度まで直線状である。 Generally the test is linear to the speed of 0.4 absorption Unit / min. 例えば、酵素濃度をM. Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976)の方法に基づき及びウシ血清アルブミン標準曲線を用いてBio-Rad assay (Bio-Rad Laboratories) 測定できる。 For example, the enzyme concentration M. Bradford, Anal Biochem 72:.. 248 (1976) based on the method and bovine serum albumin standard curve using Bio-Rad assay (Bio-Rad Laboratories) can be measured.

変異体活性を評価するために実施する別の試験はデンプン加水分解試験である。 Another test performed to evaluate the variant activity is a starch hydrolysis test. 例えば、これは次に用に行う。 For example, this is done use next. Spezyme(商標)AA20のアルファ‐アミラーゼ活性を試験するための標準的な方法を用いることができ、又は他の代替的な周知の方法でもよい。 Spezyme (TM) AA20 alpha - standard method for testing the amylase activity can be used, or may be another alternative known methods. Spezyme(商標)AA20試験は、参照により本明細書に取り込まれるUS Application No. 07/785,624の実施例1の実験例に記載される。 Spezyme (TM) AA20 test is described in the experimental example of the first embodiment of US Application No. 07 / 785,624 which is incorporated herein by reference. 天然デンプンはヨウ素で青色となるが、短いデキストリン分子に加水分解されるとそうならない。 Although native starch becomes blue with iodine, not the case when it is hydrolyzed into shorter dextrin molecules. 基質はリン酸緩衝液、pH 6.2 (42.5 gm/literリン酸2水素カリウム、3.16 gm/liter水酸化ナトリウム) に5 g/Lリントナー(Lintner)デンプンを溶解する。 Substrates phosphate buffer, (2 potassium hydrogen 42.5 gm / liter phosphoric acid, 3.16 gm / liter sodium hydroxide) pH 6.2 to dissolve the 5 g / L Lintner (Lintner) starch. サンプルに25mM塩化カルシウムを加え、30℃でインキュベーション中陰性よう素テスト与える時間として活性を測定する。 The 25mM calcium chloride was added to the sample, measuring the activity as the time which gives incubation in negative iodine test at 30 ° C.. 活性は、次の式に従って計算されるliquefons/gram又はmL(LU)として記録される。 Activity is recorded as liquefons / gram or mL is calculated according to the following equation (LU).

LU/mL又はLU/g= (570) X D LU / mL or LU / g = (570) X D
Vxt Vxt
ここでLU=liquefon unit;V=サンプル体積(5mL);t=デキストリニゼーション(dextrinization)(分);D=希釈ファクター=希釈体積/添加酵素のmL又はg。 Here LU = liquefon unit; V = sample volume (5 mL); t = De Kiss trinitrate internalized (dextrinization) (min); D = mL or g of dilution factor = dilution volume / addition of the enzyme.

4. 4. アルファ‐アミラーゼ変異体の精製 Alpha - purification of the amylase variant
発酵、分離、及び濃縮方法は周知であり、溶液を含む濃縮バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を調製するために従来の方法を用いてよい。 Fermentation, separation, and concentration processes are well known, concentrated Bacillus species including the solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - may be used conventional methods to prepare amylase or variant thereof.

発酵後、発酵培地を得て、原発酵材料残渣を含む微生物細胞及び種々の懸濁した固体物は、溶液含有酵素を得るために従来の分離方法によって除かる。 After fermentation, to obtain a fermentation medium solids were microbial cells and various suspended containing raw fermentation materials residue Nozokaru by conventional separation methods to obtain a solution containing the enzyme. アミラーゼ溶液を得る。 Obtain an amylase solution. ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、抽出、又はクロマトグラフィー、又は同類の方法が、一般的に用いられる。 Filtration, centrifugation, microfiltration, rotary drum vacuum filtration, ultrafiltration, extraction or chromatography, or similar methods are generally used.

回収の最適化を図るために溶液を含む酵素を濃縮することが望ましい。 It is desirable to concentrate the enzyme containing solution in order to optimize the recovery. 非濃縮溶液を使用すると、沈殿を含む精製酵素を集めるためにインキュベーション時間の増加が必要となる。 With non-concentrated solution, it is necessary to increase the incubation time in order to collect the purified enzyme containing precipitate.

所望の酵素レベルが得られるまで、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含む溶液を従来の濃縮方法を用いて濃縮する。 Until the desired enzyme level is obtained, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylases or solution containing variant thereof is concentrated using conventional concentration methods. 例えば、酵素含有溶液の濃縮は本明細書に記載される任意の方法により行うことができる。 For example, concentration of the enzyme-containing solution may be achieved by any of the methods described herein. 例えば、回転式真空ろ過及び/又は限外ろ過又は限外ろ過単独を用いることができる。 For example, it is possible to use a rotary vacuum filtration and / or ultrafiltration or ultrafiltration alone.

精製の目的において「沈殿剤」は、濃縮酵素溶液からバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を、自然の形は結晶、非結晶、これらの両者の混合のいずれでもよい固体形態で沈殿するために効果的な化合物を意味する。 "Precipitating agent" for the purposes of purification, the concentrated enzyme solution Bacillus species from the 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof, natural form crystal, amorphous, may be any mix of these two It means a compound effective to precipitate in solid form.

沈殿は例えば、金属ハロゲン沈殿剤を用いて行われる。 Precipitation is done, for example, using a metal halide precipitation agent. 金属ハロゲン沈殿剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含むがこれらに限定されない。 Metal halide precipitation agent is an alkali metal chlorides, alkali metal bromides, and including mixtures of two or more of these metal halides are not limited to. 典型的な金属ハロゲン化物は塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含む。 Typical metal halides include sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, potassium bromide, and two or more mixing of these metal halides. 又は、金属ハロゲン化物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムの中から選択できる。 Or metal halides can be selected from among sodium chloride and potassium chloride. 塩化ナトリウムは金属ハロゲン沈殿剤及び保存料として両方に用いられる。 Sodium chloride is used in both as a metal halide precipitation agent and preservatives.

金属ハロゲン沈殿剤はバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を沈殿するために効果的な量を用いる。 Metal halide precipitation agents Bacillus species 707 alpha - using an amount effective to precipitate the amylase or variant thereof (Bacillus sp.). 少なくとも、効果的な量及び酵素の沈殿をさせるのに効果的な金属ハロゲン化物の最適量の選択も、インキュベーション時間、pH、温度、及び酵素の濃度を含む最大量の回収のための沈殿条件も、通常の試験後、当業者にとって容易に明らかである。 At least, the selection of an effective amount and an optimum amount of effective metal halide to cause the precipitation of enzymes, incubation time, pH, temperature, and also the precipitation conditions for the maximum amount of recovery, including the concentration of enzyme after routine testing, it is readily apparent to those skilled in the art.

一般的に金属ハロゲン化物の少なくとも約5%w/v(重量/体積)から約25%w/vが濃縮酵素溶液に添加され、通常少なくとも8%w/vである。 Generally at least about 5% w / v (weight / volume) of more than about 25% w / v of metal halide is added to the concentrated enzyme solution, usually at least 8% w / v. 一般的に、約25%w/v以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加され、普通約20%w/v以下である。 Generally, about 25% w / v of metal halide is added to the concentrated enzyme solution, or less common about 20% w / v. 金属ハロゲン沈殿剤の最適濃度は他の間ではバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ変異体の性質及びその濃度によって決まる。 The optimal concentration of the metal halide precipitation agent is Bacillus species 707 alpha among others - depends on the nature and concentration of amylase variant (Bacillus sp.).

酵素の効果的な沈殿の別の代替方法は濃縮酵素溶液に添加できる有機化合物を用いることである。 Another alternative effective precipitation of the enzyme is to use an organic compound which can be added to the concentrated enzyme solution. 有機化合物沈殿剤は4‐ヒドロキシ安息香酸、4‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、4‐ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合を含む。 The organic compound precipitation agent comprises 4-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxy-alkali metal salts of benzoic acid, alkyl esters of 4-hydroxybenzoic acid, and mixtures of these organic compounds of two or more. 前記有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン沈殿剤の添加、及び有機化合物及び金属ハロゲン化物の両者の沈殿剤の添加の前に、同時に、又は続いて行うことが可能であり、それは、連続、又は同時に行われてもよい。 The addition of the organic compound precipitation agent, the addition of the metal halide precipitation agent, and prior to the organic compounds and the addition of both precipitation agents metal halide, it is possible to perform simultaneously, or subsequently, it is continuous, or it may be carried out at the same time.

さらなる記載は、例えば、米国特許第5、281、526を参照願いたい。 Further description may, for example, want to refer to US Patent No. 5,281,526. 一般的に、有機沈殿剤は、ナトリウム又はカリウム塩、及び4‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖のようなアルキルエステルであって、ここでアルキル基は1から12の炭素原子を含み、二以上のこれらの有機化合物の混合のような4‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される。 Generally, the organic precipitant, linear sodium or potassium salt, and 4-hydroxybenzoic acid, an alkyl ester such as branched-chain, wherein the alkyl group contains from 1 to 12 carbon atoms, the two It is selected from the group consisting of more alkali metal salts of 4-hydroxybenzoic acid, such as mixing of these organic compounds. 例えば、有機化合物沈殿剤は、4‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は1から10炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。 For example, the organic compound precipitation agent, linear 4-hydroxybenzoic acid, a branched chain alkyl ester, wherein the alkyl group contains from 1 to 10 carbon atoms, and may be a mixture of these organic compounds of two or more. 例えば、有機化合物沈殿剤は、4‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエステルであり、ここでアルキル基は1から6炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。 For example, the organic compound precipitation agent, 4-hydroxy-a linear alkyl esters of benzoic acid wherein the alkyl group contains from 1 to 6 carbon atoms, and may be a mixture of these organic compounds of two or more. 4‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、4‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、4‐ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、4‐ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合もまた用いることができる。 Methyl ester of 4-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxy-propyl ester of benzoic acid, 4-hydroxybutyl esters of benzoic acid, 4-hydroxy ethyl ester of benzoic acid, and also be used a mixture of these organic compounds of two or more can. またさらなる有機化合物は4‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル(メチルパラベン(methylPARABEN)と名づける)、4‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル(プロピルパラベン(propylPARABEN)と名づける)を含むがこれらに限定されない。 The further organic compounds methyl ester of 4-hydroxybenzoic acid (methylparaben (Methylparaben) and named), including propyl esters of 4-hydroxybenzoic acid (termed propylparaben (PropylPARABEN)) not limited thereto. この両者はアミラーゼ保存剤でもある。 The two are also amylase preservative.

有機化合物沈殿剤の添加によって、pH、温度、酵素の濃縮、沈殿剤の濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に対して高い柔軟性という有益性をもたらす。 Resulting in the addition of the organic compound precipitation agent, pH, temperature, concentration of the enzyme, the concentration of the precipitating agent, and the benefits of high flexibility relative to the precipitation conditions regarding time of incubation.

有機化合物沈殿剤は金属ハロゲン沈殿剤の手段により酵素の沈殿を改善するのに効果的な量を用いる。 The organic compound precipitation agent is used in an amount effective to improve precipitation of the enzyme by means of the metal halide precipitation agent. 有機化合物沈殿剤の少なくとも効果的な量及び最適量の選択も、インキュベーション時間、pH、温度、及び酵素の濃度を含む最大回収のための沈殿条件の選択も、規定の試験後、本発明の開示の点から、当業者に容易に明らかとなる。 At least an effective amount and an optimum amount selection of the organic compound precipitation agents are also incubation time, pH, temperature, and also the selection of precipitation conditions for maximum recovery including enzyme concentration, after the test provisions, disclosure of the present invention in terms of, it will be readily apparent to those skilled in the art.

一般的に少なくとも約0.01%w/v(重量/体積)の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素の種々の溶液に加えられ、通常少なくとも約0.02%w/vである。 Generally the organic compound precipitation agent of at least about 0.01% w / v (weight / volume) is added to various solutions of concentrated enzyme, usually at least about 0.02% w / v. 一般的に、約0.3%w/v(重量/体積)以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素溶液に加えられ、通常約0.2%w/v以下である。 Generally, from about 0.3% w / v (weight / volume) of organic compound precipitation agent is added to the concentrated enzyme solution, usually not more than about 0.2% w / v.

濃縮酵素溶液は、金属ハロゲン沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有し、精製すべき酵素に応じて、必要があれば、pHを調製してもよい。 Concentrated enzyme solution containing a metal halide precipitation agent and the organic compound precipitation agent, depending on the enzyme to be purified, if necessary, may be prepared pH. 一般的にpHはバシルス種(Bacillus sp.)707番アミラーゼ又はその変異体の等電点に近いレベルに調整する。 Generally pH is adjusted to a level close to the isoelectric point of the Bacillus species (Bacillus sp.) 707 number amylase or variant thereof. 一般的に、pHは、等電点(pI)下約2.5pHから等電点の上2.5pHまでの範囲のpHに調整する。 Generally, pH is adjusted to a pH in the range from about the bottom isoelectric point (pI) 2.5 pH to 2.5 pH over the isoelectric point. 説明の目的のために、濃縮酵素溶液を約5.5及び9.7の間のpH又は約6.5及び9.0の間のpHに調整できる。 For purposes of illustration, it can be adjusted to a pH between pH or about 6.5 and 9.0 during the concentrated enzyme solution of about 5.5 and 9.7. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に対するpHの変化は同様に調整できる。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - pH change in the relative amylase or variant thereof can be adjusted as well.

精製酵素沈殿を得るために必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質、酵素濃度、及び特定の沈殿剤とその濃度によって決まる。 Incubation time necessary to obtain a purified enzyme precipitate depends on the nature of the specific enzyme, determined by enzyme concentration, and the specific precipitation agent concentration. 一般的に酵素を沈殿するのに効果的な時間は約1時間から30時間の間である。 Generally effective time to precipitate the enzyme is between about 1 hour to 30 hours. 通常、約25時間を超えない。 Normally, no more than about 25 hours. 有機化合物沈殿剤存在下、インキュベーション時間は、約10時間以下に減少し、多くの場合は約6時間である。 The organic compound precipitation agent presence, the incubation time was reduced to less than about 10 hours, in most cases is about 6 hours.

一般的に、インキュベーション間の温度は約4℃から約50℃の間である。 Generally, temperatures between incubation is between about 4 ° C. to about 50 ° C.. 通常、その方法は、例えば、約10℃と45℃又は約20℃と約40℃の間の温度で行う。 Usually, the method, for example, carried out at a temperature between about 10 ° C. and 45 ° C. or about 20 ° C. and about 40 ° C.. 沈殿を誘発する最適温度は溶液条件、酵素又は用いた沈殿剤に応じて変化する。 Optimal temperature for inducing precipitation varies according to the solution conditions, the enzyme or precipitation agent used.

精製酵素沈殿の全量回収、及び実施過程での効率は酵素、添加金属ハロゲン化物及び添加有機化合物含有溶液を攪拌によって改善される。 Total amount recovered in purified enzyme precipitate, and the efficiency in the implementation process is enzyme, the added metal halide and added organic compound-containing solution is improved by stirring. 攪拌段階は金属ハロゲン化物と有機化合物両方の添加の間及びその後のインキュベーションの間に行われる。 Stirring step is performed during the during and after incubation addition of both metal halide and the organic compound. 適切な攪拌方法は機械的な攪拌、振盪、激しい給気、又は任意の同様な方法を含む。 Suitable agitation methods include mechanical stirring, shaking, vigorous air supply, or any similar method.

インキュベーション期間を終えて、精製酵素を、解離色素と他の不純物から分離され、ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、加圧ろ過、クロスメンブラン(cross membrane)マイクロろ過、クロスフローメンブラン(cross flow membrane)マイクロろ過、又は同様のもののような、従来の分離方法により集める。 Beyond the incubation period, the purified enzyme, isolated from dissociated pigment and other impurities, filtration, centrifugation, microfiltration, rotary drum vacuum filtration, ultrafiltration, press filtration, cross membrane (cross membrane) microfiltration , cross-flow membrane (cross flow membrane) microfiltration, or the like, such as, collected by conventional separation methods. さらに、精製酵素沈殿物の精製は水で沈殿物を洗浄することで得られる。 Furthermore, purification of the purified enzyme precipitate can be obtained by washing the precipitate with water. 例えば、精製酵素沈殿物を金属ハロゲン沈殿剤含有水で、又は金属ハロゲン及び有機化合物沈殿剤含有水で洗浄する。 For example, washing the purified enzyme precipitate with metal halide precipitation agent-containing water, or with a metal halide and the organic compound precipitation agent containing water.

発酵の間アルファ‐アミラーゼは培養培地中細胞外に蓄積する。 During fermentation alpha - amylase accumulates extracellularly in the culture medium. 所望のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の単離及び精製のために、培養培地は細胞を除くために、遠心分離又はろ過され、得られた細胞のない溶液は酵素精製のために用いる。 Desired Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - For the isolation and purification of amylase or variant thereof, for the culture medium excluding cells are centrifuged or filtered and the resulting free solution cells used for enzyme purification. ある実施態様おいては、細胞のない溶液で約70%飽和硫酸アンモニウムを用いる塩析を行う。 There Keep embodiment performs salting out using 70% saturated ammonium sulfate by no cell solution. それから、70%飽和沈殿分画を緩衝液に溶解し、セファデックス(Sephadex)G−100カラムのようなカラムにて処理し、酵素活性分画を回収するために溶出する。 Then, a 70% saturation precipitated fraction was dissolved in a buffer, and treated with Sephadex (Sephadex) column, such as G-100 column and eluted to recover the enzyme active fraction. さらに、精製のために、イオン交換クロマトグラフィーのような従来の方法が用いられてよい。 Furthermore, for purification, conventional methods may be employed, such as ion-exchange chromatography. あるいは、ろ過又は遠心分離によって細胞又は細胞くずを除くために有機凝集剤を細胞又は細胞くずを凝集するために用いる。 Alternatively, an organic flocculant to remove cells or cell debris by filtration or centrifugation in order to flocculate the cell or cell debris. 凝集剤を単独で又は金属ハロゲン化物と組み合わせて又は本明細書に記載する任意の方法で用いてよい。 It may be used in any of the methods described alone or herein, or in combination with a metal halide coagulant. 一般的に、酵素濃度は適用に応じて4g/L以上のオーダーであり、特定の適用にあっては25g/L以上である。 Generally, the enzyme concentration is more on the order 4g / L depending on the application, in the specific application is 25 g / L or more.

精製酵素は酵素が一般的に利用されるすべての適用に有用である。 Purified enzyme is useful for all applications in which the enzyme are generally utilized. 例えば、洗濯洗剤及び染み取り剤中に、食品業界にて、デンプン処理及びパンの焼成、及び消化剤として薬品組成物中に用いられる。 For example, in laundry detergents and spot removers agent at the food industry, starch processing and bread baking, and used in the pharmaceutical compositions as digestive aids. それらは、液体(液状、スラリー)又は固体(粒状、粉状)のいずれかで最終製品に用いられてよい。 They liquid (liquid, slurry) or solid (granular, powder) may be used in the final product in either. 精製バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の製剤処方を本明細書にて記載する。 Purification Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - The pharmaceutical formulation of amylase or variants thereof described herein.

すなわち、酵素は一般的に本明細書に記載のように部分的に精製してよい。 That is, the enzyme is partially may be purified as generally described herein. これはポリマーを用いる凝集により又は濃縮、膜及び入手可能な材料を用いる限外ろ過により細胞を除くことからなる。 This agglomeration or by concentration using a polymer consists in excluding the cells by ultrafiltration using membranes and available materials. いくつかの適用のために、酵素を精製する必要はなく、培養培地全体を溶解しさらなる処置なしで用い又は粒子又は微粒子に処理してよい。 For some applications, it is not necessary to purify the enzyme, it may be treated with or particles or microparticles without further treatment to dissolve the entire culture medium.

5. 5. 洗浄及び食器洗浄組成物及び使用 Washing and dishwashing compositions and uses
本明細書に記載されるバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を食器の洗浄における使用のための洗剤組成物又は他の洗浄組成物のための洗剤組成物中に製剤設計する。 Bacillus species described herein 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or formulated into detergent compositions for detergent compositions, or other cleaning compositions for use variants thereof in the cleaning of tableware design. これらは粉又は液体でよい。 It may be powder or liquid. 例えば、組成物は粒子又は微粒子の形態である。 For example, the composition is in the form of particles or particulate. さらに、ポリペプチドを周知の方法に従って安定化する。 Further, stabilized according to methods well known polypeptides. 組成物はバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を単独、他の蛋白質分解酵素、他の洗浄酵素、及び洗浄組成物と共通する他の成分を含んでよい。 Composition Bacillus species 707 alpha - it may include amylase or other components common variant thereof alone, other proteolytic enzymes, other cleaning enzymes, and the cleaning composition (Bacillus sp.).

組成物は、主要な酵素成分、例えば、単一成分組成物として、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。 Composition, the major enzymatic component, e.g., as a single component composition, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - may comprise amylase or variant thereof. あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような複合酵素活性を含んでもよい。 Alternatively, the composition aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, may include a complex enzyme activity, such as transglutaminase, or xylanase, . 添加酵素はアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコーラ(Humicola)及びフザリウム(Fusarium)属に属する微生物の手段により生産されてよい。 Adding enzyme Aspergillus (Aspergillus), Trichoderma (Trichoderma), may be produced by Humicola (Humicola) and Fusarium (Fusarium) means of a microorganism belonging to the genus. アスペルギルス(Aspergillus)属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌(A. aculeatus)、アスペルギルス アワモリ(A. awamori)、アスペルギルス ニガー(A. niger)、又はアスペルギルス オリザエ(A. oryzae)を含む。 Typical fellow Aspergillus (Aspergillus) genus comprising cellulose high decomposition fungi (A. aculeatus), Aspergillus awamori (A. awamori), Aspergillus niger (A. niger), or Aspergillus oryzae (A. oryzae). フミコーラ(Humicola)属の典型的な仲間はフミコーラ インソレンス(H. insolens)を含む。 Humicola (Humicola) typical companion genera including Humicola insolens (H. insolens). フザリウム(Fusarium)属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス(F. bactridioides)、フザリウム セレアリス(F. cerealis)、フザリウム クロオクウェレンセ(F. crookwellense)、フザリウム クルモルム(F. culmorum)、フザリウム グラミネアルム(F. graminearum),フザリウム グラミナム(F. graminum)、フザリウム ヘテロスポラム(F. heterosporum)、フザリウム ネガンディニス(F. negundinis)、フザリウム オキシスポラム(F. oxysporum), フザリウム レティクラタム(F. reticulatum)、フザリウム ロゼウム(F. roseum)、フザリウム サンブシヌム Fusarium (Fusarium) genus typical companion Fusarium bacterin lysine OY Death (F. bactridioides), Fusarium Serearisu (F. cerealis), Fusarium black Ok web Len cell (F. crookwellense), Fusarium Kurumorumu (F. culmorum), Fusarium graminearum (F. graminearum), Fusarium Guraminamu (F. graminum), Fusarium heterosporum (F. heterosporum), Fusarium Negandinisu (F. negundinis), Fusarium oxysporum (F. oxysporum), Fusarium Retikuratamu (F. reticulatum), Fusarium roseum (F . roseum), Fusarium Sanbushinumu F. sambucinum)、フザリウム サルコクロウム(F. sarcochroum)、フザリウム スルフリューム(F. sulphureum)、フザリウム トルローサム(F. torulosum)、フザリウム トリコテキオイデス(F. trichothecioides)及び、フザリウム ベネナツム(F. venenatum)である。 F. sambucinum), Fusarium Sarukokuroumu (F. sarcochroum), Fusarium Sul flumes (F. sulphureum), Fusarium Torurosamu (F. torulosum), Fusarium Trichoderma text Oy Death (F. trichothecioides) and, is a Fusarium venenatum (F. venenatum) .

すなわち、食器洗浄洗剤組成物は界面活性剤を含んでよい。 That is, dishwashing detergent composition may contain a surface active agent. 界面活性剤は陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオン又はこれらのタイプの混合でよい。 Surfactants anionic, nonionic, cationic, or a mixture of zwitterionic or these types. 洗剤は、低から非発泡エトキシレートポリオキシレート直鎖アルコールのような0%から約90%の非イオン界面活性剤を含むことができる。 The detergent may contain a low to non-foaming ethoxylated polyoxypropylene rate linear nonionic surfactant 0% to about 90%, such as alcohol.

洗剤の適用において、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、プロピレングリコールを含む水溶性組成物中に用いてよい。 In the application of the detergent, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof, may be used in a water-soluble composition comprising a propylene glycol. 例えば、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を10%塩化カルシウム含有25%体積/体積プロピレングリコール溶液中に循環することによってプロピレングリコールに溶解する。 For example, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - To amylase or dissolving the variant in propylene glycol by circulating 10% calcium chloride containing 25% v / v propylene glycol solution.

洗剤組成物は無機及び/又は有機タイプの洗剤ビルダー塩を含んでよい。 The detergent composition may contain detergent builder salts of inorganic and / or organic types. 洗剤ビルダーは、リン酸を含む及びリン酸を含まないタイプに細分化される。 Detergent builders are subdivided into types that do not contain and phosphate containing phosphoric acid. 洗剤組成物は通常約1%から約90%の洗剤ビルダーを含む。 The detergent composition usually contains about 1% to about 90% of a detergent builder. リン酸を含む無機アルカリ性洗剤ビルダーの例は、本発明の場合、水溶性塩、特に、アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、及びポリリン酸塩を含む。 Examples of inorganic alkaline detergent builder containing phosphoric acid, including the case of the present invention, water-soluble salts, especially alkali metal pyrophosphates, orthophosphates, and polyphosphates. リン酸を含む有機アルカリ性洗剤ビルダーの例は、本発明の場合、ホスホン酸塩の水溶性塩である。 Examples of organic alkaline detergent builder containing phosphoric acid in the case of the present invention are water-soluble salts of phosphonates. リン酸を含まない無機ビルダーの例は、本発明の場合、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸、及びケイ酸塩も非水溶性結晶又はゼオライトがよく知られている典型例であるが、非結晶性のアルミノケイ酸塩をも含む。 Examples of inorganic builders that do not contain phosphate, in the present invention, water-soluble alkali metal carbonates, boric acid, and silicates also a typical example of water-insoluble crystalline or zeolites is well known, non crystalline aluminosilicates also containing.

適切な有機ビルダーの例はアルカリ金属、アンモニウムや置換アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩、及びポリヒドロキシスルホン酸塩を含む。 Examples of suitable organic builders are alkali metal, ammonium and substituted ammonium, citrates, succinates, malonates, fatty acid sulfonates, carboxymethoxy succinates, ammonium polyacetates, carboxylates, polycarboxylates includes amino polycarboxylates, polyacetyl carboxylates, and polyhydroxy sulfonates.

他の適切な有機ビルダーは、ビルダーの特徴を有している周知の高分子量ポリマーとコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル/ポリマレイン酸コポリマー及びそれらの塩を含む。 Other suitable organic builders include the known high molecular weight polymers and copolymers having the characteristics of builders, for example, a suitable polyacrylic acid, polymaleic acid, and polyacrylic / polymaleic acid copolymers and their salts.

洗浄組成物は塩素/ホウ素タイプ又は酸素タイプの漂白剤を含んでもよい。 The cleaning composition may contain bleaching agents of the chlorine / boron type or oxygen type. 無機塩素/ホウ素タイプ漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム、又はカルシウム次亜塩素酸塩、及び次亜臭素酸塩も塩化リン酸三ナトリウムもある。 Examples of inorganic chlorine / boron type bleaches are lithium, sodium, or calcium hypochlorite, and hypobromite both trisodium chloride phosphate. 有機塩素/ホウ素タイプ漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸、及びジクロロイソシアヌル酸、及びカリウム及びナトリウムのような水溶性陽イオンを伴うそれらの塩のような複素環N‐ブロモ‐及びN‐クロロ‐イミド類である。 Examples of organic chlorine / boron type bleaches are trichloroisocyanuric acid, tribromoisocyanuric acid, heterocycles such as dibromoisocyanuric acid and dichloroisocyanurate, and potassium and their salts with water-soluble cation such as sodium a imides - N- bromo - and N- chloro. ヒダントイン化合物もまた有用である。 Hydantoin compounds are also useful.

洗浄組成物は酸素漂白剤を含み、例えば、無機過酸基塩(persalt)の形態、さらに、任意に漂白前駆体又は過酸化合物としての漂白前駆体を含む。 Cleaning composition comprises an oxygen bleaching agent, including for example, the form of the inorganic peroxygen Sanmotoshio (persalt), further, the bleach precursor as optionally bleach precursor or peracid compound. 一般的な、適切な過酸漂白化合物の例は、アルカリ金属過ホウ酸塩、四水和物及び一水和物の両方、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩、及び過リン酸塩である。 Examples of common, suitable peracid bleach compounds are alkali metal perborates, four both hydrate and monohydrate, alkali metal percarbonates, in persilicate, and perphosphates is there. 典型的な活性原料はTAED及びグリセロールトリアセテートを含む。 Typical active ingredients containing TAED and glycerol triacetate.

洗浄組成物は、酵素に適した従来の安定化剤を用いて安定化してよく、例えば、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体(例えば、芳香族ホウ酸エステル)である。 Cleaning composition may be stabilized using conventional stabilizing agents suitable for the enzyme, e.g., a polyol such as propylene glycol, a sugar, sugar alcohol, lactic acid, boric acid or boric acid derivatives (e.g., an aromatic borate it is an acid ester).

また、洗浄組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、解膠剤、賦形剤、泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗泥再堆積剤、脱水剤、染料、抗菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料を含んでよい。 The cleaning compositions may also contain other conventional detergent ingredients, e.g., deflocculant, excipients, suds suppressors, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, sequestering agents, anti-mud redeposition agents , dehydrating agents, dyes, antibacterial agents, fluorescent agents, thickening agents, and perfumes.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体が例えば任意のバシルス(Bacillus)アルファ‐アミラーゼ由来の単一配列を含むことができると考えられるのでいずれかの次の特許公報に記載の任意の洗剤のような従来の食器洗浄洗剤中に用いてよいバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は例えば次の特許及び特許公報に記載されている。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - according to any of the following patent publications so could comprise a single sequence derived from amylase - amylase or variant thereof, for example, any Bacillus (Bacillus) alpha any conventional dishwashing detergents Bacillus species may be used in such detergent 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof is disclosed, for example, the following patents and patent. 即ち、CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、 EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197、US Patent No. 5,112,518、US Patent No. 5,141,664、及びUS Patent No. 5,240,632である。 In other words, CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92 / 06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, US Patent No. 5,112,518, US Patent No. 5,141,664, and US Patent No. is 5,240,632.

これらの組成物は手作業及び自動両方の食器洗浄条件で用いることができる。 These compositions can be used in dishwashing conditions both manual and automatic. 典型的な製剤処方は次を含むがこれらに限定されない。 A typical pharmaceutical formulation comprises the following but not limited to.

1)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤0.4‐2.5%、メタケイ酸ナトリウム 0‐20%、ソジウムヂシリケート(sodium disilicate)3‐20%、3リン酸ナトリウム20‐40%、炭酸ナトリウム0‐20%、過ホウ酸ナトリウム2‐9%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)1‐4%、硫酸ナトリウム5‐33%及び酵素0.0001‐0.1%。 1) powdered automatic dishwashing composition: nonionic surfactant 0.4-2.5%, sodium metasilicate 0-20%, sodium diethylene silicate (sodium disilicate) 3-20%, 3 sodium phosphate 20 -40%, sodium carbonate 0-20%, sodium 2-9% perborate, tetraacetyl ethylene diamine (TAED) 1-4%, 5-33% and 0.0001-0.1% enzyme sodium sulfate.

2)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤(例アルコールエトキシレート)1‐2%、 ソジウムヂシリケート(sodium disilicate)2‐30%、炭酸ナトリウム10‐50%、リン酸ナトリウム0‐5%、クエン酸3ナトリウム2水和9‐30%、ニトリロトリソジウム酢酸(nitrilotrisodium acetate)(NTA)0‐20%、過ホウ酸ナトリウム一水和物5‐10%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)1‐2%、ポリアクリル酸塩ポリマー (例えば、マレイン酸/アクリル酸6‐25%コポリマー)、酵素 0.0001‐0.1%、香料0.1‐0.5%、及び水5%‐10%。 2) powdered automatic dishwashing composition: nonionic surfactant (e.g. alcohol ethoxylate) 1-2%, sodium diethylene silicate (sodium disilicate) 2-30%, sodium carbonate 10-50%, sodium phosphate 0 -5%, trisodium citrate hydrate 9-30%, nitrilotriacetic sodium acetate (nitrilotrisodium acetate) (NTA) 0-20%, sodium perborate monohydrate 5-10%, tetra ethylene diamine (TAED ) 1-2%, polyacrylate polymers (e.g., maleic acid / acrylic acid 6-25% copolymer), 0.0001-0.1% enzyme, 0.1-0.5% perfume, and water 5% -10%.

3)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤(例アルコールエトキシレート)1‐2%、 ソジウムヂシリケート(sodium disilicate)2‐30%、炭酸ナトリウム10‐50%、リン酸ナトリウム0‐5%、クエン酸3ナトリウム2水和9‐30%、ニトリロトリソジウム酢酸(nitrilotrisodium acetate)(NTA)0‐20%、過ホウ酸ナトリウム一水和物5‐10%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)、1‐2% ポリアクリル酸塩ポリマー (例えば、マレイン酸/アクリル酸6‐25%cコポリマー)、酵素 0.0001‐0.1%、香料0.1‐0.5%、及び水5%‐10%。 3) powdered automatic dishwashing composition: nonionic surfactant (e.g. alcohol ethoxylate) 1-2%, sodium diethylene silicate (sodium disilicate) 2-30%, sodium carbonate 10-50%, sodium phosphate 0 -5%, trisodium citrate hydrate 9-30%, nitrilotriacetic sodium acetate (nitrilotrisodium acetate) (NTA) 0-20%, sodium perborate monohydrate 5-10%, tetra ethylene diamine (TAED ), 1-2% polyacrylate polymer (e.g., maleic acid / acrylic acid 6-25% c copolymers), 0.0001-0.1% enzyme, 0.1-0.5% perfume, and water 5 % -10%.

4)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤1‐2%、ゼオライト MAP15‐42%、ソジウムヂシリケート(sodium disilicate)30‐34%、クエン酸ナトリウム0‐12%、炭酸ナトリウム0‐20%、過ホウ酸ナトリウム一水和物7‐15%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)0‐3%、ポリマー0‐4%、 マレイン酸/アクリル酸コポリマー0‐5%、有機ホスホン酸塩(organic phosphonate)0‐4%、泥1‐2%、酵素0.0001‐0.1%、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。 4) powdered automatic dishwashing composition: 1-2% nonionic surfactant, zeolite MAP15-42%, sodium diethylene silicate (sodium disilicate) 30-34%, 0-12% sodium citrate, sodium carbonate 0 -20%, 7-15% sodium perborate monohydrate, tetraacetylethylenediamine (TAED) 0-3%, 0-4% polymer, 0-5% maleic acid / acrylic acid copolymer, an organic phosphonate ( organic phosphonate) 0-4%, 1-2% mud, 0.0001-0.1% enzyme, sodium sulfate formulation balance.

5)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤1‐2%、ゼオライト MAP15‐42%、ソジウムジシリケート(sodium disilicate)30‐34%、クエン酸ナトリウム0‐12%、炭酸ナトリウム0‐20%、過ホウ酸ナトリウム一水和物7‐15%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)0‐3%、ポリマー0‐4%、 マレイン酸/アクリル酸コポリマー0‐5%、有機ホスホン酸塩(organic phosphonate)0‐4%、泥1‐2%、酵素0.0001‐0.1%、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。 5) powdered automatic dishwashing composition: 1-2% nonionic surfactant, zeolite MAP15-42% sodium disilicate (sodium disilicate) 30-34%, sodium citrate 0-12%, sodium carbonate 0 -20%, 7-15% sodium perborate monohydrate, tetraacetylethylenediamine (TAED) 0-3%, 0-4% polymer, 0-5% maleic acid / acrylic acid copolymer, an organic phosphonate ( organic phosphonate) 0-4%, 1-2% mud, 0.0001-0.1% enzyme, sodium sulfate formulation balance.

6)粉状自動食器洗浄組成物:非イオン界面活性剤1‐2%、ゼオライト MAP15‐42%、ソジウムジシリケート(sodium disilicate)30‐34%、クエン酸ナトリウム0‐12%、炭酸ナトリウム0‐20%、過ホウ酸ナトリウム一水和物7‐15%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)0‐3%、ポリマー0‐4%、 マレイン酸/アクリル酸コポリマー0‐5%、有機ホスホン酸塩(organic phosphonate)0‐4%、泥1‐2%、酵素0.0001‐0.1%、製剤バランス用の硫酸ナトリウム。 6) powdered automatic dishwashing composition: 1-2% nonionic surfactant, zeolite MAP15-42%, sodium disilicate (sodium disilicate) 30-34%, 0-12% sodium citrate, sodium carbonate 0 -20%, 7-15% sodium perborate monohydrate, tetraacetylethylenediamine (TAED) 0-3%, 0-4% polymer, 0-5% maleic acid / acrylic acid copolymer, an organic phosphonate ( organic phosphonate) 0-4%, 1-2% mud, 0.0001-0.1% enzyme, sodium sulfate formulation balance.

7)非水溶性液状自動食器洗浄組成物:液状非イオン界面活性剤(例えば、アルコールエトキシレート)2.0‐10.0%、アルカリ金属ケイ酸塩3.0‐15.0%、アルカリ金属リン酸塩 20.0‐40.0%、高グリコール(higher glycols)、ポリグリコールから選択される液状担体25.0‐45.0%、ポリオキシド、グリコールエーテル安定剤(例えば、リン酸エステルの一部及び0.5‐7.0%C 16 −C 18アルカノール)、泡抑制剤(例えば、シリコーン) 0‐1.5%及び酵素0.0001‐0.1%。 7) non-water soluble liquid automatic dishwashing composition: Liquid nonionic surfactant (e.g., alcohol ethoxylates) 2.0-10.0%, 3.0-15.0% alkali metal silicate, an alkali metal phosphate 20.0-40.0%, high glycol (higher glycols), liquid carrier 25.0-45.0% that is selected from polyglycols, polyoxides, glycol ether stabilizer (e.g., phosphate ester one parts and 0.5-7.0% C 16 -C 18 alkanol), suds suppressors (e.g., silicone) 0-1.5% and 0.0001-0.1% enzyme.

8)非水溶性液状食器洗浄組成物:液状非イオン界面活性剤(例えば、アルコールエトキシレート)2.0‐40.0%、ケイ酸ナトリウム3.0‐15.0%、アルカリ金属炭酸塩7.0‐20.0%、クエン酸ナトリウム0.0‐1.5%、 、安定化システム(例えば、微粉化0.5‐7.0%シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合)低分子量ポリアクリレートポリマー5.0‐15.0%、粘度ゲル増粘剤(clay gel thickener)(例えば、ベントナイト)0.0‐10.0%、ヒドロキシプロピルセルロースポリマー(hydroxypropyl cellulose polymer)0.0‐0.6%、酵素0.0001‐0.1%、及び高グリコール(higher glycols)、 8) water-insoluble liquid dishwashing composition: Liquid nonionic surfactant (e.g., alcohol ethoxylates) 2.0-40.0%, sodium silicate 3.0-15.0%, an alkali metal carbonate 7 .0-20.0%, sodium citrate 0.0-1.5%, the stabilization system (e.g., mixing micronized 0.5-7.0% silicone and low molecular weight dialkyl polyglycol ethers) low molecular weight polyacrylate polymers 5.0-15.0%, viscosity gel thickener (clay gel thickener) (e.g., bentonite) 0.0-10.0%, hydroxypropyl cellulose polymers (hydroxypropyl cellulose polymer) 0.0-0 .6%, 0.0001-0.1% enzymes, and high glycol (higher glycols), ポリ‐バランスグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエーテルから選択される液状担体。 Poly - balance glycols, polyoxides, and liquid carrier selected from glycol ether.

9)非水溶性液状食器洗浄組成物:液状非イオン界面活性剤(例えば、アルコールエトキシレート)2.0‐40.0%、ケイ酸ナトリウム3.0‐15.0%、アルカリ金属炭酸塩7.0‐20.0%、クエン酸ナトリウム0.0‐1.5%、 、安定化システム(例えば、微粉化0.5‐7.0%シリコーン及び低分子量ジアルキルポリグリコールエーテルの混合)低分子量ポリアクリレートポリマー5.0‐15.0%、粘度ゲル増粘剤(clay gel thickener)(例えば、ベントナイト)0.0‐10.0%、ヒドロキシプロピルセルロースポリマー(hydroxypropyl cellulose polymer)0.0‐0.6%、酵素0.0001‐0.1%、及び高グリコール(higher glycols)、ポリ‐バランスグリコール、ポリオキシド、及びグリコールエ 9) a water-insoluble liquid dishwashing composition: Liquid nonionic surfactant (e.g., alcohol ethoxylates) 2.0-40.0%, sodium silicate 3.0-15.0%, an alkali metal carbonate 7 .0-20.0%, sodium citrate 0.0-1.5%, the stabilization system (e.g., mixing micronized 0.5-7.0% silicone and low molecular weight dialkyl polyglycol ethers) low molecular weight polyacrylate polymers 5.0-15.0%, viscosity gel thickener (clay gel thickener) (e.g., bentonite) 0.0-10.0%, hydroxypropyl cellulose polymers (hydroxypropyl cellulose polymer) 0.0-0 .6%, 0.0001-0.1% enzymes, and high glycol (higher glycols), poly - balance glycols, polyoxides, and glycol et ーテルから選択される液状担体。 Liquid carrier selected from ether.

10)液状自動食器洗浄組成物:アルコールエトキシレート0‐20%、脂肪酸エステルスルホン酸塩0‐30%、ドデシル硫酸ナトリウム0‐20%、アルキル ポリグリコシド0‐21%、オレイン酸0‐10%、ソジウムジシリケート(sodium disilicate)一水和物18‐33%、クエン酸ナトリウム二水和物18‐33%、ステアリン酸ナトリウム0‐2.5%、過ホウ酸ナトリウム一水和物0‐13%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)0‐8%、 マレイン酸/アクリル酸コポリマー4‐8%、及び酵素0.0001‐0.1%。 10) Liquid automatic dishwashing composition: Alcohol ethoxylate 0-20%, 0-30% fatty acid ester sulfonate, sodium dodecyl sulfate 0-20% alkyl polyglycoside 0-21%, 0-10% oleic acid, sodium disilicate (sodium disilicate) monohydrate 18-33%, sodium citrate dihydrate 18-33%, sodium stearate 0-2.5%, sodium perborate monohydrate 0-13 %, tetraacetylethylenediamine (TAED) 0-8%, maleic acid / acrylic acid copolymer 4-8%, and 0.0001-0.1% enzyme.

11)液状自動食器洗浄組成物:アルコールエトキシレート0‐20%、脂肪酸エステルスルホン酸塩0‐30%、ドデシル硫酸ナトリウム0‐20%、アルキル ポリグリコシド0‐21%オレイン酸0‐10%、ソジウムジシリケート(sodium disilicate)一水和物18‐33%、クエン酸ナトリウム二水和物18‐33%、ステアリン酸ナトリウム0‐2.5%、過ホウ酸ナトリウム一水和物0‐13%、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)0‐8%、 マレイン酸/アクリル酸コポリマー4‐8%、及び酵素0.0001‐0.1%。 11) Liquid automatic dishwashing composition: Alcohol ethoxylate 0-20%, 0-30% fatty acid ester sulfonate, sodium dodecyl sulfate 0-20% alkyl polyglycoside 0-21% 0-10% oleic acid, Seo indium disilicate (sodium disilicate) monohydrate 18-33%, sodium citrate dihydrate 18-33%, sodium stearate 0-2.5%, sodium perborate monohydrate 0-13% tetraacetylethylenediamine (TAED) 0-8%, maleic acid / acrylic acid copolymer 4-8%, and 0.0001-0.1% enzyme.

12)過ホウ酸が過炭酸塩によって置き換えられる1)、2)、3)、4)、6)及び10)記載の自動食器組成物。 12) 1 perborate is replaced by percarbonate), 2), 3), 4), 6) and 10) Automatic dishwashing compositions as described.

13)さらにマンガン触媒を含む1)‐6)に記載の自動食器洗浄組成物。 13) further automatic dishwashing composition according to 1) -6) containing manganese catalyst.

6. 6. 洗濯洗剤組成物及び使用 Laundry detergent composition and use
実施態様によれば、一以上のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、一般的に、洗濯洗剤組成物の成分としてよい。 According to an embodiment, one or more Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof is generally good as a component of a laundry detergent composition. そのような場合、非粉塵化(dusting)粒子、安定化した液体、又は保護された酵素の形態での洗浄組成物を含んでもよい。 In such cases, non-dusting (dusting) particles may comprise a cleaning composition in the form of a stabilized liquid, or protected enzyme. ドライ用の製剤は粒子又は微粒子の形態でもよい。 Formulations for dry may be in the form of particles or microparticles. 非粉塵化(dusting)粒子は例えば米国特許第4,106,991、及び4,661,452に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。 Non dusting (dusting) the particles may be produced as described, for example, in U.S. Patent 4,106,991, and 4,661,452, it may cover the surface in any manner known methods. ワックスのコーティング原料の例は、平均分子量1、000から20、000であるポリ(エチレンオキシド)産物(ポリエチレングリコール、PEG)、16から50のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、12から20炭素原子及び15から80のエチレンオキシド単位を含有するアルコールであるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、モノ、ジ、トリグリセリドの脂肪酸である。 Examples of the coating material of the wax, 20,000 average molecular weight of 1,000 poly (ethylene oxide) products (polyethylene glycol, PEG), ethoxylated nonylphenol having units from 16 to 50 ethylene oxide, 12 to 20 carbon atoms and an alcohol containing ethylene oxide units 15 to 80 ethoxylated fatty alcohols, fatty alcohols, fatty acids, mono-, di-, triglycerides of fatty acids. 流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばGB 1483591に記載される。 Examples of useful film-coating material for application by fluid bed techniques are described, for example, GB 1,483,591. 例えば、液体酵素の調製は、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。 For example, the preparation of liquid enzyme, according to established methods, are stabilized by adding a polyol such as propylene glycol, a sugar, sugar alcohol, lactic acid or boric acid. 他の酵素の安定化剤は周知の技術である。 Other enzyme stabilizers are well known in the art. 被保護酵素を例えばEP Appln. The protected enzyme, for example, EP Appln. 238、216に記載される方法に従って調製してよい。 It may be prepared according to the method described in 238,216. ポリオールは蛋白質の安定化剤としても、蛋白質溶解性の改善としても長い間認められている。 Polyol as a stabilizer of proteins, long been recognized as improving protein solubility. 例えば、J. For example, J. K. K. Kaushik他、「Why is trehalose an exceptional protein stabilizer?」、J. Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer?", J. Biol. Biol. Chem. Chem. 278: 26458−65 (2003)及び そこに引用されている文献Monica Conti他、「Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility」、J. 278: 26458-65 (2003) and literature Monica Conti other cited therein, "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility", J. Chromatography A 757: 237−245 (1997)を参照願いたい。 Chromatography A 757: Hopefully see 237-245 (1997).

組成物は、主要な酵素成分、例えば、単一成分組成物として、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。 Composition, the major enzymatic component, e.g., as a single component composition, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - may comprise amylase or variant thereof. あるいは、組成物はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼのような複合酵素活性も以下に記載の他の酵素も含んでもよ Alternatively, the composition aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, described below also complex enzyme activity, such as transglutaminase, or xylanase, also also include other enzymes い。 There. 添加酵素はアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコーラ(Humicola)(例、フミコーラ インソレンス(H. insolens))及びフザリウム(Fusarium)属に属する微生物の手段により生産されてよい。 Adding enzyme Aspergillus (Aspergillus), Trichoderma (Trichoderma), Humicola (Humicola) may be produced by (e.g., Humicola insolens (H. insolens)) and Fusarium (Fusarium) means of a microorganism belonging to the genus. フザリウム(Fusarium)属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス(F. bactridioide)、フザリウム セレアリス(F. cerealis)、フザリウム クロオクウェレンセ(F. crookwellense)、フザリウム クルモルム(F. culmorum)、フザリウム グラミネアルム(F. graminearum),フザリウム グラミナム(F. graminum)、フザリウム ヘテロスポラム(F. heterosporum)、フザリウム ネガンディニス(F. negundinis)、フザリウム オキシスポラム(F. oxysporum), フザリウム レティクラタム(F. reticulatum)、フザリウム ロゼウム(F. roseum)、フザリウム サンブシヌム( Fusarium (Fusarium) genus typical companion Fusarium bacterin lysine OY Death (F. bactridioide), Fusarium Serearisu (F. cerealis), Fusarium black Ok web Len cell (F. crookwellense), Fusarium Kurumorumu (F. culmorum), Fusarium graminearum (F. graminearum), Fusarium Guraminamu (F. graminum), Fusarium heterosporum (F. heterosporum), Fusarium Negandinisu (F. negundinis), Fusarium oxysporum (F. oxysporum), Fusarium Retikuratamu (F. reticulatum), Fusarium roseum (F . roseum), Fusarium Sanbushinumu ( . sambucinum)、フザリウム サルコクロウム(F. sarcochroum)、フザリウム スルフリューム(F. sulphureum)、フザリウム トルローサム(F. torulosum)、フザリウム トリコテキオイデス(F. trichothecioides)及び、フザリウム ベネナツム(F. venenatum)。 . Sambucinum), Fusarium Sarukokuroumu (F. sarcochroum), Fusarium Sul flumes (F. sulphureum), Fusarium Torurosamu (F. torulosum), Fusarium Trichoderma text Oy Death (F. trichothecioides) and, Fusarium venenatum (F. venenatum).

洗剤組成物は例えば、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。 The detergent composition may, for example, powders, granules, pastes, or as a liquid may be any useful form. 一般的に、液体洗剤は、最大約70%の水及び0%から約30%の有機溶剤を含有する液体でよい。 Generally, liquid detergent can be a liquid containing about 30% of the organic solvent from up to about 70% water and 0%. また、約30%の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態でもよい。 Further, it may be in the form of a compact gel type containing only about 30% water. 酵素は酵素の安定性に適合する任意の洗剤組成物を用いてよい。 Enzyme may use any detergent composition compatible with the stability of the enzyme. 一般的に、酵素は、カプセル化という周知の形態によって有害な成分から保護される。 Generally, the enzyme is protected from harmful components by known forms of encapsulation. 例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。 For example, a granulation and encapsulation in hydrogel. 酵素及び特定のアルファ‐アミラーゼは、洗濯及び食器洗浄に適用に限定されず、また、表面洗浄剤、デンプン又はバイオマスからのエタノール産物でも用いられる。 Enzymes and certain alpha - amylase is not limited in its application to laundry and dishwashing, and surface cleaners are also used in the ethanol product from starch or biomass.

洗剤組成物は一以上のそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンである界面活性剤を含む。 The detergent composition comprises one or more respective anionic, nonionic, cationic, surfactants are zwitterionic. 洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(LAS)、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩(α‐olefinsulfonate)(AOS)、アルキル硫酸塩(alkyl sulfate)(脂肪アルコール硫酸塩(fatty alcohol sulfate))(AS)、アルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate)(AEOS又はAES)第二級アルカンスルホネート(secondary alkanesulfonates)(SAS)、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル(α‐sulfo fatty acid methyl esters)、アルキル‐又はアルケニルコハク酸(alkyl‐ or alkenyl The detergent is typically linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (LAS), alpha - olefin sulfonate (α-olefinsulfonate) (AOS), alkyl sulfate (alkyl sulfate) (fatty alcohol sulfate (fatty alcohol sulfate) ) (AS), alcohol ethoxy sulfates (alcohol ethoxysulfate) (AEOS or AES) secondary alkane sulfonates (secondary alkanesulfonates) (SAS), alpha - sulfo fatty acid methyl ester (α-sulfo fatty acid methyl esters), alkyl - or alkenylsuccinic acid (alkyl- or alkenyl succinic acid)又は石鹸のような0%から50%の陰イオン界面活性剤を含む。 0%, such as Succinic acid) or soap containing 50% of the anionic surfactant. また、組成物は、アルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate) (AEO又はAE)、カルボキシル化アルコール エトキシレート(carboxylated alcohol ethoxylates)、ノニルフェノールエトキシレート(nonylphenol ethoxylate)、アルキルポリグリコシド(alkylpolyglycoside), アルキルジメチルアミンオキシド(alkyldimethylamineoxide)、 エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸モノエタノールアミド(fatty acid monoethanolamide)、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミ Further, the composition, alcohol ethoxylates (alcohol ethoxylate) (AEO or AE), carboxylated alcohol ethoxylates (carboxylated alcohol ethoxylates), nonylphenol ethoxylate (nonylphenol ethoxylate), alkyl polyglycosides (Alkylpolyglycoside), alkyl dimethyl amine oxide ( alkyldimethylamineoxide), ethoxylated fatty acid monoethanolamide (ethoxylated fatty acid monoethanolamide), fatty acid monoethanolamide (fatty acid monoethanolamide), or polyhydroxy alkyl fatty acid ami (polyhydroxy alkyl fatty acid amide) (例えばWO 92/06154に記載されるように)のような0%から約40%の非イオン界面活性剤を含んでもよい。 (Polyhydroxy alkyl fatty acid amide) 0% may comprise about 40% of non-ionic surfactants such as (for example, as described in WO 92/06154).

さらに、洗剤組成物は、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び/又は任意の組み合わせのラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。 Furthermore, the detergent compositions are lipase, cutinase, protease, cellulase, peroxidase, and / or may include one or more enzymes, such as any combination of laccase.

洗剤は、任意に、約1%から約65%の洗剤ビルダー又はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTMPA)、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩(layered silicates)(例えば、ヘキストからSKS−6)のような錯化剤を含んでよい。 Detergent, optionally, from about 1% to about 65% of a detergent builder or a zeolite, diphosphate, triphosphate, phosphonate, citrate, nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) , diethylenetriaminepentaacetic acid (DTMPA), alkyl- or alkenylsuccinic acid, soluble silicates or layered silicates (layered silicates) (e.g., SKS-6 from Hoechst) may contain complexing agents such as. また、洗剤は、アンビルト(unbuilt)でもよい。 In addition, detergent, may be Anbiruto (unbuilt). 言い換えると、本質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。 In other words, it may be essentially no detergent builder.

洗剤は、任意に、一以上のポリマーを含んでよい。 Detergent may optionally comprise one or more polymers. 例えば、カルボキシメチルセルロース(CMC),ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(ビニル アルコール)(PVA)、ポリアクリレート、マレイン/アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリレート/アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。 For example, carboxymethylcellulose (CMC), poly (vinylpyrrolidone) (PVP), polyethylene glycol (PEG), poly (vinyl alcohol) (PVA), polyacrylates, maleic / acrylic acid copolymers and lauryl methacrylate / acrylic acid copolymer including the poly-carboxylic acid salt, such as.

洗剤は、任意に、漂白システムを含んでよく、それは、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート(NOBS)のような過酸形成漂白活性化剤と結合する過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなH 供給源を含む。 Detergent, optionally, may contain a bleaching system, which, perborate binding peracid formation bleach activator such as tetra-acetyl ethylene diamine (TAED) or nonanoyloxybenzenesulfonate (NOBS), percarbonate containing H 2 O 2 source such as a salt. あるいは、漂白システムは、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでよい。 Alternatively, the bleaching system may, for example, amides may include imide, or sulfone type peroxyacids. また、漂白システムは、例えば、国際PCT出願WO 2005/056783に記載されるような、ペルヒドロラーゼが過酸を活性化する酵素的漂白システムでもよい。 Moreover, the bleaching system, for example, as described in International PCT Application WO 2005/056783, perhydrolase may be enzymatic bleaching system to activate the peracid.

洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が例えばWO 92/19709及びWO 92/19708に記載のように製剤設計されてもよい。 Enzymes of the detergent composition, e.g., a polyol such as propylene glycol or glycerol, a sugar or sugar alcohol, lactic acid, boric acid or e.g., a conventional stabilizer such as boric acid derivative such as an aromatic borate ester may be stabilized using, it may be formulated designed as described in the composition, for example, WO 92/19709 and WO 92/19708.

また、洗剤は、泥、発泡剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗汚染剤、染料、抗菌剤、曇り防止剤、蛍光増白剤、又は香料を含む例えば繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。 Also, detergent, mud, blowing agents, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-staining agents, dyes, antibacterial agents, anti-fogging agents, optical brighteners, or such as fibers conditioners including perfume it may contain other conventional detergent ingredients such as.

pH(用いる濃度での水溶液で測定)は通常中性又はpH約7.0から約11.0のアルカリ性である。 pH (measured in aqueous solution at concentrations employed) is about 11.0 alkaline usually neutral or pH about 7.0.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有洗剤組成物の特定の形態は次を含むように製剤設計される。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - particular form of amylase or variant-containing detergent composition that is formulated designed to include the following.

1)約7%から約12%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約1%から約4%のアルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate)(例えば、C 12−18アルコール、1−2エチレンオキシド(EO))、又はアルキル硫酸塩(alkyl sulfate)(例えば、C 16−18 )、約5%から約9%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 14−15アルコール、7EO)、約14%から約20%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約2から約6%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約15%から約22%のゼオライト(例、NaAlSiO 1) calculated from about 7 percent to about 12 percent of the linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (acid), from about 1% to about 4% of an alcohol ethoxy sulfate (alcohol ethoxysulfate) (e.g., C 12-18 alcohols, 1-2 ethylene oxide (EO)), or alkyl sulfates (alkyl sulfate) (e.g., C 16-18), from about 5% to about 9% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 14-15 alcohols, 7 EO), from about 14% to about 20% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 2 to about 6% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , from about 15% to about 22% of zeolite (for example, NaAlSiO 4 )、0%から約6%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、0%から約15%のクエン酸ナトリウム/クエン酸(例、C Na /C )、約11%から約18%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、約2%から約6%のTAED、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、0−3%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、PVP、PEG)、0.0001から0.1%の蛋白質の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 ), Sodium sulfate 0% to about 6% (e.g., Na 2 SO 4), 0% to about 15% sodium citrate / citric acid (e.g., C 6 H 5 Na 3 O 7 / C 6 H 8 O 7), sodium from about 11% to about 18% of the perborate (e.g., NaBO 3 H 2 O), from about 2% to about 6% TAED, 0% to about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC) , 0-3% of polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymer, PVP, PEG), (calculated as pure enzyme protein) 0.0001 to 0.1% of the protein of the enzyme, and 0-5% of minor ingredients (eg, soap suds suppressors, perfume, optical brighteners, photobleaching) a detergent composition formulated designed as particles having a bulk density of at least 600 g / L.

2)約6%から約11%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約1%から約3%のアルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate)(例えば、C 12−18アルコール、1−2EO)、又はアルキル硫酸塩(alkyl sulfate)(例えば、C 16−18 )、約5%から約9%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 14−15アルコール、7EO)、約15%から約21%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約24%から約34%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約4%から約1 2) calculated from about 6 percent to about 11 percent of a linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (acid), from about 1% to about 3% of alcohol ethoxy sulfate (alcohol ethoxysulfate) (e.g., C 12-18 alcohols, 1-2EO), or alkyl sulfates (alkyl sulfate) (e.g., C 16-18), from about 5% to about 9% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 14-15 alcohols, 7 EO), about from 15% to about 21% sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 1% to about 4% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , from about 24% to about 34% of zeolite ( example, NaAlSiO 4), from about 4% to about 1 0%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、0%から約15%のクエン酸ナトリウム/クエン酸(例、C Na /C )、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、1−6%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、PVP、PEG)、0.0001から0.1%の蛋白質の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、石鹸泡抑制剤、香料、)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗浄組成物。 0% Sodium sulfate (e.g., Na 2 SO 4), 0% to about 15% sodium citrate / citric acid (e.g., C 6 H 5 Na 3 O 7 / C 6 H 8 O 7), from 0% about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC), 1-6% of polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymer, PVP, PEG), as 0.0001 0.1% protein enzyme (pure enzyme protein calculation), and 0-5% of minor component (e.g., suds suppressing agents, perfumes,) wherein the cleaning composition is formulated designed as particles having a bulk density of at least 600 g / L.

3)約5%から約9%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約7%から約14%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO)、約1から約3%脂肪酸(例、C 16−22脂肪酸)としての石鹸、約10%から約17%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約3%から約9%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約23%から約33%のゼオライト(例、NaAlSiO )、0%から約4%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、約8%から約16%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、約2%から約8%のTAED、0%から約1% 3) from about 5% to about 9% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (calculated as acid) about 7% to about 14% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO ), from about 1 to about 3% fatty acids (e.g., C 16-22 fatty acid) as soap, from about 10% to about 17% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), soluble silicate about 3% to about 9% salt (example, Na 2 O, 2SiO 2) , zeolite from about 23% to about 33% (e.g., NaAlSiO 4), 0% to about 4% of sodium sulphate (e.g., Na 2 SO 4), about 8% sodium perborate about 16 percent (e.g., NaBO 3 H 2 O), from about 2% to about 8% TAED, 0% to about 1% のホスホン酸塩(例、EDTMPA)、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、0−3%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、PVP、PEG)、0.0001から0.1%の蛋白質の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 Phosphonate (e.g., EDTMPA), 0% to about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC), 0-3% of polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymer, PVP, PEG), 0.0001 0.1% of the protein of the enzyme (calculated as pure enzyme protein), and includes minor component of 0-5% (e.g., suds suppressing agents, perfumes, fluorescent whitening agent), bulk density of at least 600 g / L detergent compositions formulated designed as a particle having a.

4)約8%から約12%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約10%から約25%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO)、約14%から約22%の炭酸ナトリウム(Na CO として)、約1%から約5%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約25%から約35%のゼオライト(例、NaAlSiO )、0%から約10%の硫酸ナトリウム(Na SO )、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、1−3%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、PVP 4) about 8% to about 12% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (calculated as acid) about 10% to about 25% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO ), about a 22% sodium carbonate from 14% (Na 2 CO 3) , from about 1% to about 5% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2), from about 25% to about 35% zeolite (e.g., NaAlSiO 4), 0% to about 10% sodium sulfate (Na 2 SO 4), 0% to about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC), 1-3 % of polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymer, PVP 、PEG)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、石鹸泡抑制剤、香料)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 , PEG), calculated as 0.1% of the enzyme (pure enzyme protein from 0.0001), and 0-5% of minor component (e.g., suds suppressing agents, perfuming), the bulk of at least 600 g / L detergent compositions formulated designed as particles having a density.

5)約15%から約21%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約12%から約18%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO又はC 12−15アルコール、5EO)、約3%から約13%脂肪酸(例、オレイン酸)としての石鹸、0%から約13%のアルケニルコハク酸(alkenylsuccinic acid)(C 12−14 )、約8%から約18%のアミノエタノール、約2%から約8%のクエン酸、0%から約3%のホスホン酸塩、0から約3%のポリマー(例、PVP、PEG)、0から約2%のホウ酸塩(B )、0から約3%のエタノール、約8 5) from about 15% calculated as about 21% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (acid), from about 12% to about 18% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO or C 12-15 alcohols, 5 EO) about 3% to about 13% fatty acid (eg, soap as oleic acid), from 0% to about 13% of the alkenyl succinic acid (alkenylsuccinic acid) (C 12-14) , about 8% to about 18% amino ethanol, about 2% to about 8% citric acid, about 3% of the phosphonate from 0% 0 to about 3% polymer (e.g., PVP, PEG), from 0 to about 2% borate (B 4 O 7), ethanol from 0 to about 3%, about 8 から約14%のプロピレングリコール、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤)を含む水性液体洗剤組成物。 About 14% propylene glycol from 0.0001 to 0.1% of the enzyme (calculated as pure enzyme protein), and small amounts of component (examples 0-5% dispersing agent, suds suppressing agents, perfumes, optical brighteners white agent) aqueous liquid detergent composition comprising a.

6)約15%から約21%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、3−9%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO又はC 12−15アルコール、5EO)、約3%から約10%脂肪酸(例、オレイン酸)としての石鹸、約14%から約22%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約9%から約18%のクエン酸カリウム、0から約2%のホウ酸塩(B )、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、0から約3%のポリマー(例、PVP、PEG)、0から約3%の例えば、ラウリルメタク 6) about 15% to about 21% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (calculated as acid), 3-9% of alcohol ethoxylates (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO or C 12 -15 alcohol, 5 EO) about 3% to about 10% fatty acid (eg, soap as oleic acid), from about 14% to about 22% zeolite (eg, NaAlSiO 4), citric from about 9% to about 18% potassium acid, 0 to about 2% borate (B 4 O 7), from 0% to about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC), 0 to about 3% polymer (e.g., PVP, PEG), for example, from 0 to about 3%, Raurirumetaku レート/アクリル酸コポリマー;モル比25:1、分子量3800のような固着用ポリマー、0%から約5%のグリセロール、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、分散剤、石鹸泡抑制剤、香料、蛍光増白剤)を含む液体洗剤組成物を製剤設計する水溶液。 Rate / acrylic acid copolymer; molar ratio 25: 1, anchoring polymer such as molecular weight 3800, glycerol from 0% to about 5%, (calculated as pure enzyme protein) 0.0001 to 0.1% of the enzyme, and 0 -5% of minor component (e.g., dispersants, suds suppressing agents, perfumes, fluorescent whitening agents) aqueous solution formulation designing a liquid detergent composition comprising a.

7)約5%から約10%の脂肪アルコール硫酸塩、約3%から約9%のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、0−3%脂肪酸としての石鹸、約5%から約10%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約20%から約40%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約2%から約8%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、約12%から約18%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、約2%から約7%のTAED、約1%から約5%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、PEG)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質とし 7) about 5% to about 10% of fatty alcohol sulfates, from about 3% to about 9% of an ethoxylated fatty acid monoethanolamide (ethoxylated fatty acid monoethanolamide), soap as 0-3% fatty acid, about 5% to about 10% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 1% to about 4% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , from about 20% to about 40% zeolite (eg, NaAlSiO 4 ), about 2% to about 8% sodium sulfate (e.g., Na 2 SO 4), from about 12% to about 18% of sodium perborate (e.g., NaBO 3 H 2 O), from about 2% to about 7% of TAED, from about 1% to about 5% of the polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymer, PEG), and 0.0001 to 0.1% of the enzyme (pure enzyme protein 計算)、及び0−5%の少量の成分(例、蛍光増白剤、石鹸泡抑制剤、香料)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 Calculation), and 0-5% of minor component (e.g., optical brighteners, suds suppressing agents, perfuming), detergent compositions formulated designed as particles having a bulk density of at least 600 g / L.

8)約8%から約14%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約5%から約11%のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、0%から約3%脂肪酸としての石鹸、約4%から約10%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約1%から約4%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約30%から約50%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約3%から約11%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、約5%から約12%のクエン酸ナトリウム(例、C Na )、約1%から約5%のポリマー(例、PVP、マレイン/ア 8) from about 8% to about 14% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (calculated as acid) about 5% to about 11% of ethoxylated fatty acid monoethanolamide (ethoxylated fatty acid monoethanolamide), 0% to about soap as 3% fatty acids from about 4% to about 10% sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 1% to about 4% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , about 30 about 50% zeolite from% (eg, NaAlSiO 4), from about 3% to about 11% sodium sulfate (e.g., Na 2 SO 4), sodium from about 5% to about 12% of citric acid (eg, C 6 H 5 Na 3 O 7), from about 1% to about 5% of the polymer (e.g., PVP, maleic / a クリル酸コポリマー、PEG)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、石鹸泡抑制剤、香料)を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。 Acrylic copolymer, PEG), calculated as 0.0001 0.1% of enzyme (pure enzyme protein), and 0-5% of minor component (e.g., suds suppressing agents, perfumes) formulation designed as particles comprising detergent compositions.

9)約6%から約12%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約1%から約4%の非イオン界面活性剤、約2%から約6%脂肪酸としての石鹸、約14%から約22%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約18%から約32%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約5%から約20%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、約3%から約8%のクエン酸ナトリウム(例、C Na )、約4%から約9%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、約1%から約5%の漂白活性剤(例、NOBS又はTAED)、0%から約2%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose 9) from about 6% to about 12% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (calculated as acid) about 1% to about 4% of nonionic surface active agents, soap about 2 percent as about 6% fatty acids from about 14% to about 22% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 18% to about 32% of zeolite (eg, NaAlSiO 4) from about 5% to about 20% sodium sulfate (e.g., Na 2 SO 4), sodium citrate from about 3% to about 8% (e.g., C 6 H 5 Na 3 O 7), sodium from about 4% to about 9% of the perborate (e.g., NaBO 3 H 2 O), from about 1% to about 5% of the bleach activator (e.g., NOBS or TAED), 0% to about 2% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose (CMC)、約1%から約5%のポリマー(例、ポリカルボン酸塩、PEG)、 0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、蛍光増白剤、香料)を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。 (CMC), from about 1% to about 5% of the polymer (e.g., polycarboxylate, PEG), (calculated as pure enzyme protein) 0.0001 to 0.1% of the enzyme, and 0-5% of a small amount of component (e.g., optical brightener, perfume) detergent composition formulated designed as particles comprising.

10)約15%から約23%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、約8%から約15%のアルコール エトキシ硫酸塩(alcohol ethoxysulfate)(例えば、C 12−15アルコール、2−3EO)、約3%から約9%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO又はC 12−15アルコール、5EO)、0%から約3%脂肪酸(例、ラウリン酸)としての石鹸、約1%から約5%のアミノエタノール、約5%から約10%のクエン酸ナトリウム、約2%から約6%のハイドロトロープ(hydrotrope)(例トルエンスルホン酸ナトリウム(sodi 10) to about 15% calculated as about 23% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (acid), from about 8% to about 15% alcohol ethoxy sulfate (alcohol ethoxysulfate) (e.g., C 12-15 alcohols, 2-3EO), about 3% to about 9% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO or C 12-15 alcohol, 5 EO), 0% to about 3% fatty acids (e.g., soap as lauric acid), from about 1% to about 5% aminoethanol, sodium citrate from about 5% to about 10%, about 2% to about 6% of the hydrotrope (hydrotrope) (example sodium toluene sulfonate ( sodi m toluensulfonate))、0から約2%のホウ酸塩(B )、0%から約1%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)、約1%から約3%のエタノール、約2%から約5%のプロピレングリコール、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤)を含む水性液体洗剤組成物。 m toluensulfonate)), 0 to about 2% borate (B 4 O 7), from 0% to about 1% carboxymethylcellulose (carboxymethylcellulose), from about 1% to about 3% ethanol, from about 2% to about 5 % of propylene glycol, 0.0001 to 0.1% of the enzyme (calculated as pure enzyme protein), and small amounts of ingredients 0-5% (e.g., polymers, dispersants, perfume, optical brightener) aqueous containing liquid detergent compositions.

11)約20%から約32%のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)(酸として計算)、6−12%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)(例えば、C 12−15アルコール、7EO又はC 12−15アルコール、5EO)、約2%から約6%のアミノエタノール、約8%から約14%のクエン酸、約1%から約3%のホウ酸塩(B )、0%から約3%のポリマー(例、マレイン/アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー)、約3%から約8%のグリセロール、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、ヒ 11) about calculated 20% as about 32% of linear alkyl benzene sulfonate (linear alkylbenzenesulfonate) (acid), 6-12% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate) (e.g., C 12-15 alcohols, 7 EO or C 12 -15 alcohol, 5 EO), about 2% to about 6% aminoethanol, from about 8% to about 14% of citric acid, from about 1% to about 3% borate (B 4 O 7), from 0% about 3% polymer (e.g., maleic / acrylic acid copolymers, for example, anchoring polymer such as lauryl methacrylate / acrylic acid copolymer), glycerol about 3% to about 8%, 0.0001 to 0.1% of the enzyme (calculated as pure enzyme protein), and 0-5% of minor component (e.g., human ロトロープ(hydrotrope)、分散剤、香料、蛍光増白剤)を含む水性液体洗剤組成物。 Rotoropu (Hydrotrope), dispersing agents, perfume, optical brightener) aqueous liquid detergent composition comprising a.

12)約25%から約40%の陰イオン界面活性剤(リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkylbenzenesulfonate)、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸)、約1%から約10%の非イオン界面活性剤(例、アルコールエトキシレート)、約8%から約25%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、約5%から約15%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、0%から約5%の硫酸ナトリウム(例、Na SO )、約15%から約28%のゼオライト(例、NaAlSiO )、0%から約20%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、0%から約5%の漂白活性剤(例、TAED 12) about 25% to about 40% of anionic surfactant (linear alkylbenzenesulfonate (linear alkylbenzenesulfonate), alkyl sulfate, alpha - olefin sulfonate, alpha - fatty acid methyl ester, alkane sulfonic acids, soaps), about 1% to about 10% nonionic surfactant (e.g., alcohol ethoxylate), from about 8% to about 25% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), from about 5% to about 15% soluble silicate salts (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , about 5% of sodium sulfate from 0% (example, Na 2 SO 4), from about 15% to about 28% zeolite (eg, NaAlSiO 4), 0% to about 20% sodium perborate (e.g., NaBO 3 H 2 O), 0% to about 5% of the bleach activator (e.g., TAED はNOBS)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−3%の少量の成分(例、香料、蛍光増白剤)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 The NOBS), 0.0001 0.1% of enzyme (calculated as pure enzyme protein), and comprises 0-3% of minor component (e.g., perfume, optical brightener), the bulk of at least 600 g / L detergent compositions formulated designed as particles having a density.

13)上記組成物1)−12)に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が(C 12 −C 18 )アルキルスルホン酸塩により置換される洗剤組成物。 13) are the above compositions 1) -12 detergent composition according to) all or part of the linear alkylbenzenesulfonate is (C 12 -C 18) Detergent compositions substituted by alkyl sulfonates.

14)約9%から約15%の(C 12 −C 18 )アルキルスルホン酸塩、約3%から約6%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)、約1%から約5%のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド(polyhydroxy alkyl fatty acid amide)、約10%から約20%のゼオライト(例、NaAlSiO )、約10%から約20%層状ジケイ酸塩(layered disilicates)(ヘキストからSK56)、約3%から約12%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、0%から約6%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約4%から約8%のクエン酸ナトリウム、13%から約22%の過ホウ酸ナトリウム(例、NaBO O)、約3%から 14) about 9% to about 15% (C 12 -C 18) alkyl sulfonates, about 3 to about 6%% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate), from about 1% to about 5% of a polyhydroxy alkyl fatty acid amide (polyhydroxy alkyl fatty acid amide), about 10% to about 20% zeolite (eg, NaAlSiO 4) from about 10% to about 20% layered disilicate salt (layered disilicates) (SK56 from Hoechst), about 3% about 12% sodium carbonate (example Na 2 CO 3), 0% to about 6% of soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , from about 4% to about 8% sodium citrate, 13% sodium perborate about 22 percent (e.g., NaBO 3 H 2 O), from about 3% 8%のTAED、0%から約5%のポリマー(例、ポリカルボン酸塩、PVP)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−5%の少量の成分(例、蛍光増白剤、光退色、香料、石鹸泡抑制剤)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 8% TAED, 0% to about 5% of the polymer (e.g., polycarboxylate, PVP), (calculated as pure enzyme protein) 0.0001 to 0.1% of the enzyme, and 0-5% of a small amount of component comprises (e.g., optical brightener, photobleach, perfume, suds suppressing agent), the detergent compositions formulated designed as particles having a bulk density of at least 600 g / L.

15)約4%から約8%の(C 12 −C 18 )アルキル硫酸塩、約11%から約15%のアルコール エトキシレート(alcohol ethoxylate)、約1%から約4%の石鹸、約35%から約45%のゼオライトMAP又はゼオライトA、約2%から約8%の炭酸ナトリウム(例Na CO )、0%から約4%の可溶性ケイ酸塩(例、Na O, 2SiO )、約13%から約22%の過炭酸ナトリウム、1―8%のTAED、0%から約3%のカルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose)(CMC)、0%から約3%のポリマー(例、ポリカルボン酸塩、及びPVP)、0.0001から0.1%の酵素(純粋酵素蛋白質として計算)、及び0−3%の少量の成分(例、蛍光増白 15) about 4% from about 8% (C 12 -C 18) alkyl sulfates, from about 11% to about 15% alcohol ethoxylate (alcohol ethoxylate), from about 1% to about 4% soap, about 35% from about 45% zeolite MAP or zeolite a, from about 2% to about 8% of sodium carbonate (example Na 2 CO 3), 0% to about 4% soluble silicate (e.g., Na 2 O, 2SiO 2) , sodium percarbonate about 13% to about 22%, 1-8% of TAED, from 0% to about 3% of carboxymethyl cellulose (carboxymethylcellulose) (CMC), from 0% to about 3% polymer (e.g., polycarboxylic acid salts and PVP), calculated as 0.0001 0.1% of enzyme (pure enzyme protein), and 0-3% of minor component (e.g., a fluorescent brightener, 剤、ホスホン酸塩、香料、)を含み、少なくとも600g/Lのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。 Agents include phosphonates, perfumes,), detergent compositions formulated designed as particles having a bulk density of at least 600 g / L.

16)追加的成分か又はすでに特定された漂白系に置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述1)から15)に記載の洗剤製剤。 16) as either one or substituting additional ingredients or already identified the bleaching system, characterized in that it comprises a stabilized or encapsulated peracid, detergent formulation according to 15) above 1).

17)過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、1)、3)、7)、9)、及び12)に上述するような洗剤製剤。 17) perborate is characterized in that it is replaced by percarbonate, 1), 3), 7), 9), and detergent formulations such as those described above in 12).

18)マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、1)、3)、7)、9)、12)、14)、及び15)に上述するような洗剤製剤。 18) characterized in that it additionally contains a manganese catalyst, 1), 3), 7), 9), 12), 14), and 15 detergent formulations such as those described above). 例えば、該マンガン触媒は、「Efficient manganese catalysts for low‐temperature bleaching」、Nature 369:637‐639 (1994)に記載の化合物の一つである。 For example, the manganese catalyst "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369: is one of the compounds described 637-639 (1994).

19)例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダーシステム(例、リン酸塩)、酵素、及びアルカリのような液体非イオン界面活性剤を含む非水性洗剤液として製剤設計される洗剤組成物。 19) For example, primary alcohols linear alkoxylated, builder system (eg phosphate), enzyme, and a liquid nonionic surfactant detergent composition is formulated designed as a non-aqueous liquid detergent containing such as an alkali . 洗剤は陰イオン界面活性剤及び/又は漂白システムを含んでもよい。 The detergent may comprise anionic surface active agents and / or bleaching systems.

20)A)陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性イオン(zwitterionic)界面活性剤、両性イオン(amphoteric)界面活性剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つ界面活性剤、B)シリコン材料の混合物の液滴であって、i)機能性ポリシロキサン材料を含むアミン又はアンモニウム基であり、a)生産される機能性ポリシロキサン材料中本質的に硬化性/反応性基を放出するプロセスにより調製され、b)硬化性/反応性基を含有しないケイ素末端に対するケイ素原子含有硬化性/反応性基モル比が約30%以下であり、c)重量で約0.05%から約0.30%の窒素含有量を有し、d)20℃で0.00002m;2;/sから約0.2m;2;/sの範囲の粘度を有す 20) A) an anionic surfactant, nonionic surfactant, zwitterionic (zwitterionic) surfactants, zwitterionic (amphoteric) surfactant and at least one surfactant selected from the group consisting of combinations thereof , B) a droplet of the mixture of silicon material, i) functional polysiloxane material is an amine or ammonium group containing, a) produced is functional polysiloxane material essentially curable / reactive group is prepared by a process that releases, b) curing / silicon atom-containing curable / reactive groups to silicon-ends that do not contain reactive groups of not more than about 30%, c) from about 0.05% by weight has approximately 0.30% of the nitrogen content from, d) at 20 ℃ 0.00002m; have a viscosity in the range of / s; the / s to about 0.2 m;; 2 2 アミン又はアンモニウム基、及びii)窒素の無い、非機能性ポリシロキサン材料であって、0.01m;2;/sから約2.0m;2;/sの粘度を有し及び該混合物内で機能性ポリシロキサン材料対非機能性ポリシロキサン材料の重量比が約100:1から約1:100の範囲で存在するポリシロキサン材料を含有するシリコン材料混合物液滴、及びC)色移り阻害剤、蛍光増白剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つ追加的非ケイ素洗濯添加物を含む水溶性液体洗濯洗剤組成物。 Amine or ammonium group, and ii) no nitrogen, a non-functional polysiloxane materials, 0.01m; 2; / s to about 2.0m; 2; / s have a viscosity and in the mixture functional polysiloxane material to non-functional polysiloxane materials that the weight ratio of about 100: 1 to about 1: silicon material mixture droplets containing polysiloxane material present in the 100 range, and C) color transfer inhibitors, fluorescent whitening agent and at least one additional non-silicon laundry additives soluble liquid laundry detergent composition comprising a selected from the group consisting of a combination thereof.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗剤中に従来使用される濃度で含まれてよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be included in concentrations conventionally employed in detergents. 本発明において、洗剤組成物中バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は洗浄液のリットル当たり0.00001‐1.0mg(純粋酵素蛋白質として計算)に相当する量を加えることを意図する。 In the present invention, the detergent composition Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof able to make an amount corresponding to 0.00001-1.0mg per liter wash solution (calculated as pure enzyme protein) intended to.

他の実施態様においては、2,6‐β−D−フルクタンヒドロラーゼ(2,6‐β−D−fructan hydrolase)は洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び/又は産業用の繊維/洗濯に存在するバイオフィルムの除去/洗浄に用いてよい。 In another embodiment, 2, 6-beta-D-fructan hydrolase (2,6-β-D-fructan hydrolase) may be included in the detergent composition, fiber / wash for household and / or industrial it may be used to remove / cleaning of biofilm present on.

例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業、又は機械用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手作業又は機械食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。 For example, detergent compositions, hand comprises a fabric softener composition is added to the laundry additive composition and rinsed suitable pretreatment stains with fabric, or formulator as a laundry detergent composition for machine it may be, or may be formulated designed for general household detergent compositions for use in hard surface cleaning treatment of a well formulated design or hand or machine dishwashing process.

特定の実施態様においては、洗剤組成物はバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及びプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び/又はペルオキシダーゼ、及び/又はこれ等の組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素に加えて2,6‐β−D−フルクタンヒドロラーゼ(2,6‐β−D−fructan hydrolase)、一以上のアルファ‐アミラーゼをさらに含んでもよい。 In certain embodiments, the detergent composition comprises Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof and a protease, a lipase, a cutinase, a carbohydrase, a cellulase, pectinase, mannanase, arabinase, galactanase, xylanase, oxidase , laccase, and / or peroxidase, and / or which like in addition to one or more other cleaning enzymes, such as a combination of 2,6-β-D- fructan hydrolase (2,6-β-D-fructan hydrolase) , one or more alpha - may further comprise an amylase.

一般的に選択される酵素の特徴は、選択される洗剤(例えば、最適pH、他の酵素及び非酵素成分等との適合性)と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。 Generally characteristics enzyme selected, the detergent is selected (e.g., optimum pH, compatibility with other enzymatic and non-enzymatic ingredients, etc.) should be compatible with the enzyme, present in an amount effective Should.

プロテアーゼ:適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。 Proteases: Suitable proteases include animal, vegetable, or those of microorganisms. 自然的に処理されたプロテアーゼ同様、化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。 Similarly protease treated natural manner, it is chemically modified, or a protein engineered treated are variants. プロテアーゼはアルカリ微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼのような、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよい。 Protease is an alkaline microbial protease, a trypsin-like protease, such as chymotrypsin-like protease may be a serine protease or a metalloprotease. アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えばサブチリシンノボ(subtilisin Novo)、サブチリシンカールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、サブチリシン309、サブチリシン147、及びサブチリシン168 (参照、例えば、WO 89/06279)のようなバシルス(Bacillus)由来のものである。 Examples of alkaline proteases are subtilisins, especially, for example Sabuchirishin'nobo (subtilisin Novo), subtilisin Carlsberg (subtilisin Carlsberg), subtilisin 309, subtilisin 147, and subtilisin 168 (see, e.g., WO 89/06279), such as Bacillus (Bacillus) is derived from. トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン(例、豚又は牛由来の)、及びフザリウム(Fusarium)プロテアーゼ(例えば、WO 89/06270及びWO 94/25583を参照)である。 Examples of trypsin-like proteases are trypsin (e.g., of porcine or bovine), and Fusarium (Fusarium) protease (see, e.g., WO 89/06270 and WO 94/25583). また、有用なプロテアーゼの例はWO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、及びWO 98/34946に記載される変異体を含むが、これらに限定されない。 Also, examples of useful proteases are WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, and including variants described WO 98/34946, but are not limited to. 商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はアルカラーゼ(商標)(Alcalase)、サビナーゼ(商標)(Savinase)、プリマーゼ(商標)(Primase)、ドゥララーゼ(商標)(Duralase)、エスペラーゼ(商標)(Esperase)、及びカンナーゼ(商標)(Kannase)(ノボ ノルディスク(Novo Nordisk A/S))、マキサターゼ(商標)(Maxatase)、マキサカール(商標)(Maxacal)、マキサペム(商標)(Maxapem)、プロペラーゼ(商標)(Properase)、プラフェクト(商標)(Purafect)、プラフェクトO P(商標)(Purafect OxP)、FN2(商標)、及びFN3(商標)(ジェネンコ インターナショナル社 (G Commercially available protease enzymes Alcalase (TM) (Alcalase), Savinase (TM) (Savinase), Purimaze (TM) (Primase), Duraraze (TM) (Duralase), Esperase (TM) (Esperase), and Kannase (TM) (Kannase) (Novo Nordisk (Novo Nordisk A / S)), Makisataze (TM) (Maxatase), Makisakaru (TM) (Maxacal), Makisapemu (TM) (Maxapem), Puroperaze (TM) (Properase ), Purafekuto (TM) (Purafect), Purafekuto O X P (TM) (Purafect OxP), FN2 (TM), and FN3 (TM) (Jenenko International Inc. (G nencor International, Inc.))を含むが、これらに限定されない。 nencor International, including Inc.)), but are not limited to.

リパーゼ:適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。 Lipase: Suitable lipases include those of bacterial or fungal origin. 化学的に修飾され、蛋白質分解的に修飾され又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。 Chemically modified, include proteolytically modified or protein engineered treated are variants. 有用なリパーゼの例は、例えば、フミコーラ ラヌギノサ(H. lanuginosa (T. lanuginosus))(例えば、EP 258068及びEP 305216を参照)由来、フミコーラ インソレンス(H. insolens)(例えばWO 96/13580を参照)由来のようなフミコーラ(Humicola)(同義語 サーモミセス(Thermomyces))由来のリパーゼ、又はシュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ(例えば、シュードモナス アルカリゲネス(P. alcaligenes)又はシュードモナス シュードアルカリゲネス(P. pseudoalcaligenes)由来(例えばEP 218 272を参照)、 シュードモナス セパシア(P. cepacia)(例えばEP 331 Examples of useful lipases include, for example, Humicola lanuginosa (H. lanuginosa (T. lanuginosus)) (see, for example, EP two hundred fifty-eight thousand and sixty-eight and EP 305216) derived from Humicola insolens (H. insolens) (see, e.g., WO 96/13580) Humicola such as those derived from (Humicola) (synonym thermo Mrs (Thermomyces)) lipase or Pseudomonas (Pseudomonas) lipase (e.g., Pseudomonas alcaligenes (P. alcaligenes) or Pseudomonas pseudotyped alkali monocytogenes (P. pseudoalcaligenes) derived (e.g. EP 218 refers to the 272), Pseudomonas cepacia (P. cepacia) (for example EP 331 76を参照)、シュードモナス スタッチェリ(P. stutzeri)(例えば、GB 1,372,034を参照)、シュードモナス フルオレッセンス(P.fluorescens)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)の菌株SD 705(例えば、WO 95/06720及びWO 96/27002を参照)、シュードモナス ウィスコンシネンシス(P. wisconsinensis)(例えば、WO 96/12012を参照)由来)、又は バシルス (Bacillus)リパーゼ(例えば、バシルス スブチリス由来(B. subtilis)例えばDartois他、Biochemica et Biophysica Acta, 1131 : 253−360 (1993)を参照)、バシルス ステアロテル See 76), referring to the Pseudomonas Sutatcheri (P. stutzeri) (for example, GB 1,372,034), Pseudomonas fluorescens (P.fluorescens), strain SD 705 of Pseudomonas species (Pseudomonas sp.) (For example, WO 95 / see 06720 and WO 96/27002), Pseudomonas Wisuko Nshi Nene cis (P. Wisconsinensis) (e.g., see WO 96/12012) derived), or Bacillus (Bacillus) lipase (e.g., from Bacillus subtilis (B. subtilis) for example Dartois other, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: see 253-360 of the (1993)), Bacillus Sutearoteru モフィルス(B. stearothermophilus)、(例えばJP 64/744992を参照)、又はバシルス プミルス(B.pumilus(例えばWO 91/16422を参照)由来)を含むが、これらに限定されない。 Mofirusu (B. stearothermophilus), (see, for example, JP 64/744992), or Bacillus pumilus including (B.pumilus (e.g. see WO 91/16422) from), and the like. 製剤設計の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体は、例えば WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225、及びEP 260105に記載のものも含む。 Additional lipase variants contemplated for use in the formulation design, for example, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, and also include those described in EP two hundred sixty thousand one hundred and five. 商業的に入手可能なリパーゼ酵素はリポラーゼ(商標)(Lipolase)及びリポラーゼウルトラ(商標)(Lipolase Ultra TM )(ノボ ノルディスク (Novo Nordisk A/S))である。 Commercially available lipase enzymes are Lipolase (TM) (Lipolase) and lipoic hydrolase Ultra (TM) (Lipolase Ultra TM) (Novo Nordisk (Novo Nordisk A / S)) .

ポリエステラーゼ:適切なポリエステラーゼを組成物に含むことができる。 Polyesterases: can be included in suitable poly esterase composition. 適切なポリエステラーゼは、例えば、WO 01/34899及びWO 01/14629に記載のものを含む。 Suitable polyesterases include for example those described in WO 01/34899 and WO 01/14629.

アミラーゼ:組成物は、非生産増強アルファ‐アミラーゼのような他のアミラーゼとの組み合わせでもよい。 Amylase: composition, non-production enhancement alpha - or in combination with other amylases, such as amylase. これらは、デュラミル(商標)(Duramyl)、ターマミル(商標)(Termamyl)、ファンガミル(商標)(Fungamyl)、及びバン(商標)(BAN)(ノボ ノルディスク(Novo Nordisk A/S))又はラピダーゼ(商標)(Rapidase)、及びプラスター(商標)(Purastar)(ジェネンコ インターナショナル社から(Genencor International, Inc.))のような商業的に入手可能なアミラーゼを含むがこれらに限定されない。 These are Duramyl (TM) (Duramyl), Termamyl (TM) (Termamyl), Fangamiru (TM) (Fungamyl), and vans (TM) (BAN) (Novo Nordisk (Novo Nordisk A / S)) or Rapidaze ( TM) (Rapidase), and plaster (TM) (Purastar) (Jenenko International Inc. from (Genencor International, Inc.)) including commercially available amylases, such as but not limited to.

セルラーゼ:セルラーゼを組成物に添加してよい。 Cellulases: may be added to the cellulase composition. 適切なセルラーゼは細菌又は菌類由来のものを含む。 Suitable cellulases include those of bacterial or fungal origin. 化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。 Chemically modified or include protein engineered treated are variants. 適切なセルラーゼは、バシルス 属(Bacillus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、フミコーラ属(Humicola)、フザリウム属(Fusarium)、チエラビア属(Thielavia)、アクレモニウム属(Acremonium)由来のセルラーゼを含む。 Suitable cellulases include the genus Bacillus (Bacillus), Pseudomonas (Pseudomonas), genus Humicola (Humicola), Fusarium (Fusarium), Thielavia genus (Thielavia), Acremonium (Acremonium) derived cellulase. 例えば、米国特許第4,435,307、5,648,263、5,691,178、5,776,757、及び国際PCT出願 WO 89/09259に開示されるフミコーラ インソレンス(Humicola insolens)、ミセリオフトラ サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、フザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)から生産される菌類のセルラーゼである。 For example, U.S. Patent No. 4,435,307,5,648,263,5,691,178,5,776,757, and Humicola insolens (Humicola insolens) disclosed in International PCT Application WO 89/09259, Myceliophthora Thermo filler (Myceliophthora thermophila), cellulases fungi produced from Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum). 一般的に使用を意図するセルラーゼは繊維に有益な色のケアを有している。 Cellulase intended for general use has a beneficial color care to the fibers. そのようなセルラーゼの例は、例えば、EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、及びWO 98/08940に記載のセルラーゼである。 Examples of such cellulases are for example, a cellulase according to EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, and WO 98/08940. 他の例では、WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、米国特許第5,457,046、5,686,593、及び5,763,254に記載のようなセルラーゼ変異体である。 In another example, WO 94/07998, WO 98/12307, WO 95/24471, PCT / DK98 / 00299, EP 531315, U.S. Patent No. 5,457,046,5,686,593, and 5,763,254 a cellulase variants such as those described. 商業的に入手可能なセルラーゼはセルザイム(商標)(elluzyme)及びケアザイム(商標)(Carezyme)(ノボ ノルディスク (Novo Nordisk A/S))又はクラジネース(商標)(Clazinase)及びプラダックス HA(商標)(Puradax HA)(ジェネンコ インターナショナル社 (Genencor International, Inc.))及びKAC−500(B)(商標)(花王社)を含む。 Commercially available cellulases Seruzaimu (TM) (Elluzyme) and Keazaimu (TM) (Carezyme) (Novo Nordisk (Novo Nordisk A / S)) or Kurajinesu (TM) (Clazinase) and Plastic Dax HA (TM) comprising (Puradax HA) (Jenenko International Inc. (Genencor International, Inc.)) and KAC-500 a (B) (TM) (Kao Corporation).

ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ:組成物での使用が意図される適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。 Peroxidases / oxidases: Suitable peroxidases / oxidases contemplated for use in the compositions include those of plant, bacterial or fungal origin. 化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。 Chemically modified or include protein engineered treated are variants. 有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス シネレウス(C. cinereus)由来のようなコプリナス属(Coprinus)由来のペルオキシダーゼ及びWO 93/24618、WO 95/10602、及びWO 98/15257に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。 Useful peroxidases example, Coprinus cinereus (C. cinereus) Coprinus genus, such as from (Coprinus) derived peroxidase and WO 93/24618, WO 95/10602, and variants thereof as described in WO 98/15257 including a peroxidase derived from. 商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム(商標)(Guardzyme)(ノボ ノルディスク (Novo Nordisk A/S))を含む。 Commercially available peroxidases include, for example, Gadozaimu (TM) (Guardzyme) (Novo Nordisk (Novo Nordisk A / S)).

洗剤酵素を一以上の酵素を含む個別の添加物を加えることによって、又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。 By adding separate additives containing one or more enzymes detergent enzyme, or may be contained in the detergent composition by adding a combined additive comprising all of these enzymes. 洗剤添加物、すなわち、個別の添加物又は組合せ添加物は、例えば粒子、液体、スラリー等として製剤設計される。 Detergent additive, i.e. a separate additive or a combined additive, is formulated designed eg particles, liquid, a slurry, or the like. 一般的に洗剤添加物製剤は、粒子、特に非粉塵化(dusting)粒子、液体、特に安定化液体又はスラリーを含むが、これらに限定されない。 Generally detergent additive formulations are particles, especially non-dusting (dusting) particles, liquids, in particular stabilized liquids, or slurries, and the like.

非粉塵化(dusting)粒子を、米国特許第4,106,991及び4,661,452に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。 The non dusting (dusting) particles, may be prepared as described in U.S. Patent 4,106,991 and 4,661,452, it may be coated in a known manner as desired. ワックスコーティング材の例は、平均分子量1、000から20、000を有するポリ(エチレンオキシド)製品(例えば、ポリエチレングリコール、PEG)、16から50のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、12から20炭素原子を含むアルコール及び15から80のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。 Examples of the wax coating material, poly average molecular weight of 1,000 having a 20,000 (ethylene oxide) products (e.g., polyethylene glycol, PEG), ethoxylated nonylphenol with ethylene oxide units 16 to 50, from 12 to 20 carbon atoms ethoxylated fatty alcohols are ethylene oxide units 80 alcohols and 15 include, mono-fatty alcohols, fatty acids, and fatty acid -, di -, tri glycerol. 流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティング材の例は、例えば、GB 1483591に記載される。 Examples of useful film-shaped coating material for application by fluid bed techniques are described, for example, in GB 1,483,591. 例えば、液体酵素の調製は、プロピレングリコール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸のようなポリオールを確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。 For example, the preparation of liquid enzyme, propylene glycol, a sugar, sugar alcohol, lactic acid, by adding according to the method established a polyol such as boric acid, it may be stabilized. 被保護酵素はEP238,216に記載の方法に従って調製されてよい。 The protected enzyme may be prepared according to the method described in EP238,216.

一般的に、洗剤組成物は例えば棒状、錠剤、粉、粒子、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。 Typically, detergent compositions, for example, a bar, a tablet, a powder, particles, pastes, or any or a convenient form such as a liquid. 液体洗剤は水性、典型的には、約70%水分まで、及び0%から約30%の有機溶剤まで含んでよい。 Liquid detergent aqueous, typically may comprise up to about 70% moisture, and from 0% to about 30% organic solvent. 例えば、約30%以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルである。 For example, a compact detergent gels containing 30% or less moisture.

洗剤組成物は一以上の界面活性剤を含み、それは、半極性及び/又は陰イオン性及び/又は陽イオン性及び/又は両性イオン性を含む非イオン性でもよい。 The detergent composition comprises one or more surfactants, which may be non-ionic including semi-polar and / or anionic and / or cationic and / or zwitterionic. 界面活性剤は一般的に、約0.1%から約60%重量の広い範囲に存在する。 Surfactants are typically present in a wide range from about 0.1% to a about 60% by weight.

界面活性剤が含まれる場合、洗剤は通常約1%から約40%の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩(脂肪アルコール硫酸塩)、アルコール エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。 If they contain surfactants, detergents usually contain from about 1% to about 40% anionic surfactant, for example, linear alkyl benzene sulfonates, alpha - olefin sulfonate, alkyl sulfate (fatty alcohol sulfate salt), alcohol ethoxy sulfates, secondary alkane sulfonates, alpha - sulfo fatty acid methyl esters, alkyl - or alkenylsuccinic acid or soap.

界面活性剤を含む場合、一般的に、洗剤は約0.2%から約40%の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、 エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミン(「グルカミド」)のN‐アシル‐N‐アルキル誘導体である。 When containing a surface active agent, generally, the detergent contains from about 0.2% to about 40% of non-ionic surfactant such as alcohol ethoxylate chelate, nonylphenol ethoxylate, alkylpolyglycoside, alkyldimethylamine oxide , ethoxylated fatty acid monoethanolamide, fatty acid monoethanolamide, N- acyl -N- alkyl derivatives of polyhydroxy alkyl fatty acid amide, or glucosamine ( "glucamides").

洗剤はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩(例、ヘキスト社製SKS−6)のような0%から約65%の洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよい。 Detergent zeolite, diphosphate, triphosphate, phosphonate, carbonate, citrate, nitrilotriacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid, alkyl or alkenylsuccinic acid, soluble silicates or layered silicates (eg, Hoechst SKS-6) 0% may contain about 65% of a detergent builder or complexing agent such as.

洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。 The detergent may comprise one or more polymers. ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース(CMC),ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(エチレン グリコール)(PEG)、ポリ(ビニル アルコール)(PVA)、ポリ(ビニルピリジン‐N‐オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリアクリレート、マレイン/アクリル酸コポリマー、及びラウリル メタアクリレート/アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。 Examples of polymers include carboxymethyl cellulose (CMC), poly (vinylpyrrolidone) (PVP), poly (ethylene glycol) (PEG), poly (vinyl alcohol) (PVA), poly (vinyl pyridine -N- oxide), poly ( vinylimidazole), including polyacrylates, maleic / acrylic acid copolymer, and a polycarboxylate such as lauryl methacrylate / acrylic acid copolymer.

洗剤は、過酸形成漂白活性化剤(例えば、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート)と結合する過ホウ酸塩又は過炭酸塩のようなH 供給源を含む漂白システムを含んでよい。 Detergent, peracid formation bleach activator (e.g., tetraacetylethylenediamine or nonanoyloxybenzenesulfonate) comprise a bleaching system containing H 2 O 2 source such as a perborate or percarbonate binds good. あるいは、漂白システムは、ペルオキシ酸(例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸)を含んでよい。 Alternatively, the bleaching system, peroxyacids (e.g., the amide, imide, or sulfone type peroxyacids) may contain. また、漂白システムは、酵素的漂白システムでもよい。 Moreover, the bleaching system may be enzymatically bleaching system.

洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤を用いて安定化してよい。 The enzyme of the detergent composition may be stabilized using conventional stabilizing agents. 例えば、ポリオール(例、プロピレングリコール又はグリセロール)として、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体(例、芳香族ホウ酸エステル)、又はフェニルホウ酸誘導体(例、4−フォルミルフェニルホウ酸)である。 For example, polyol (e.g., propylene glycol or glycerol) as a sugar, sugar alcohol, lactic acid, boric acid, or boric acid derivative (e.g., an aromatic borate ester), or a phenyl boronic acid derivative (e.g., 4-formylphenyl boronic it is an acid). 組成物はWO 92/19709及びWO 92/19708に記載のように製剤設計されてよい。 The composition may be formulated designed as described in WO 92/19709 and WO 92/19708.

また、洗浄組成物は他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば、クレー、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、蛍光増白剤、ヒドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む布地コンディショナーンである。 The cleaning compositions may also contain other conventional detergent ingredients, e.g., clays, foam boosters, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, fluorescent brightening agents, hydrotropes, is a fabric conditioner emissions containing antifogging agents, and perfumes.

洗剤組成物として、特にバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を洗浄液1リットル当たり0.01から100mgの酵素蛋白質に相当する量を添加してよいことが本発明にて意図される。 As a detergent composition, particularly Bacillus species 707 alpha - in the present invention that the amylase or variant thereof may be added in an amount corresponding to the enzyme protein 100mg from the washing liquid per liter 0.01 (Bacillus sp.) It is intended. 例えば、洗浄液1リットル当たり約0.05から約5.0mgの酵素蛋白質、又は洗浄液1リットル当たり約0.1から約1.0mgの酵素蛋白質である。 For example, the cleaning solution per liter to about 0.05 to about 5.0mg of enzyme protein, or from the washing solution per liter to about 0.1 is an enzyme protein of about 1.0 mg.

7. 7. 方法 Method
7.1 フィルタースクリーニング試験 7.1 filter screening test
下記に説明する試験を親アルファ‐アミラーゼ酵素に比してCa 2+消耗条件下高い又は低いpHで改変される安定性を有するAmy707アルファ‐アミラーゼ変異体のスクリーニング中に用いてよい。 The test described below parent alpha - may be used in screening for amylase variant - Amy707 alpha having stability that is modified by Ca 2+ depletion conditions high or low pH compared to the amylase enzyme.

7.2 高いpHフィルター試験 7.2 high pH filter test
バシルス(Bacillus)ライブラリーを少なくとも21時間、37℃で10μg/mlカナマイシン含有TY寒天プレート上にセルロースアセテート(OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)及びニトロセルロースフィルター(Protran−Ba 85, Schleicher & Schuell,Dassel, Germany)のサンドイッチ上に固定する。 Bacillus (Bacillus) a library of at least 21 hours, 10 [mu] g / ml kanamycin-containing TY agar plates cellulose acetate at 37 ℃ (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) and nitrocellulose filters (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, fixed on the sandwich of Germany). セルロースアセテート膜はTY寒天プレートに置かれる。 Cellulose acetate membranes are placed on TY agar plates.

変異体を結合しているフィルター及びニトロセルロースフィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように各フィルターサンドイッチは、特に、インキュベーション前であって、固定後、針で印を入れ、pH8.6−10.6のグリシン‐NaOH緩衝液を有する容器へ移し、15分間室温(10‐60℃変化できる)でインキュベーションする。 Each filter sandwich so be able to localize positive variants on the filter and the nitrocellulose filter are bound variants is particularly a pre-incubation, after fixing, put a mark with a needle, PH8.6- transferred to a container with glycine -NaOH buffer 10.6, incubated for 15 minutes at room temperature (10-60 ° C. may vary). コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてTYプレート上に保管できる。 The cellulose acetate filters with colonies are stored on the TY-plates at room temperature until use. インキュベーション後、残りの活性を1%寒天、pH8.6−10.6のグリシン‐NaOH緩衝液中0.2%デンプン含有プレートで検出する。 After incubation, detecting the remaining active 1% agar, 0.2% starch-containing plates glycine -NaOH buffer PH8.6-10.6. ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて2時間インキュベーションする。 The assay plates with nitrocellulose filters are marked the same way as the filter sandwich and incubated for 2 hours at room temperature. フィルターの除去後、試験プレートを10%ルゴール液で染色する。 After removal of the filters the assay plates are stained with 10% Lugol solution. デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出する。 To detect the starch degradation mutant as white spots on dark blue background. 陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。 Under the same conditions as the first screening of the positive variants are twice re-screening.

7.3 低いカルシウムフィルター試験 7.3 low calcium filter test
バシルス(Bacillus)ライブラリーを少なくとも21時間、37℃で例えば、カナマイシン又はクロラムフェニコールのような関連抗生物質含有TY寒天プレート上のセルロースアセテート (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)及びニトロセルロースフィルター(Protran−Ba 85, Schleicher & Schuell,Dassel, Germany)のサンドイッチ上に固定する。 Bacillus (Bacillus) a library of at least 21 hours, for example at 37 ° C., related antibiotics containing TY agar plates of cellulose acetate such as kanamycin or chloramphenicol (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) and nitro cellulose filters (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) is fixed on a sandwich. セルロースアセテート膜をTY寒天プレートに置く。 Placing the cellulose acetate layer is located on the TY agar plate.

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは特に針で印を入れ、固定化変異体を有するニトロセルロース膜をpH8.5−10の炭酸/重炭酸緩衝液及び異なるEDTA濃度(0.001mM‐100mM)を有する容器へ移す。 Each filter sandwich postfixed but before incubation in order to be able to localize positive variants on the filter places the mark in particular a needle, carbonate / bicarbonate pH8.5-10 nitrocellulose membrane with immobilized mutant buffers and different EDTA concentrations transfer (0.001 mM-100 mM) into a container having a. フィルターを1時間室温でインキュベーションする。 Incubating the filter at room temperature for 1 hour. コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてTYプレート上に保管できる。 The cellulose acetate filters with colonies are stored on the TY-plates at room temperature until use. インキュベーション後、残りの活性を1%寒天、pH8.5−10の炭酸/重炭酸緩衝液中0.2%デンプン含有プレートで検出する。 After incubation, detecting the remaining active 1% agar, 0.2% starch-containing plates carbonate / bicarbonate buffer PH8.5-10. ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、室温にて2時間インキュベーションする。 The assay plates with nitrocellulose filters are marked the same way as the filter sandwich and incubated for 2 hours at room temperature. フィルターの除去後、試験プレートを10%ルゴール液で染色する。 After removal of the filters the assay plates are stained with 10% Lugol solution. デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。 Starch degrading variants are detected as white spots on dark blue background and then identified on the storage plates. 陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。 Under the same conditions as the first screening of the positive variants are twice re-screening.

7.4 低いpHフィルター試験 7.4 low pH filter test
バシルス(Bacillus)ライブラリーを少なくとも21時間、37℃で例えば、10μg/mlクロラムフェニコール含有TY寒天プレート上のセルロースアセテート (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)及びニトロセルロースフィルター(Protran−Ba 85, Schleicher & Schuell,Dassel, Germany)のサンドイッチ上に固定する。 Bacillus (Bacillus) a library of at least 21 hours, for example at 37 ° C., 10 [mu] g / ml chloramphenicol containing TY agar plates of cellulose acetate (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) and nitrocellulose filters (Protran- Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, fixed on the sandwich of Germany). セルロースアセテート膜をTY寒天プレートに置く。 Placing the cellulose acetate layer is located on the TY agar plate.

フィルター上に陽性変異体を位置づけることができるように固定後しかしインキュベーション前に各フィルターサンドイッチは特に針で印を入れ、固定化変異体を有するニトロセルロース膜をpH4.5のクエン酸を有する容器へ移し、フィルターを20分間80℃(野生型バックボーン中変異体をスクリーニングする場合)又は、60分間85℃(親型アルファ‐アミラーゼ変異体をスクリーニングする場合)でインキュベーションする。 Each filter sandwich postfixed but before incubation in order to be able to localize positive variants on the filter places the mark in particular with a needle, the nitrocellulose membranes with immobilized variant into a container having a citrate pH4.5 Transfer the filter (if screening wild type backbone in mutant) 20 min 80 ° C. or 60 minutes 85 ° C. - incubated with (parent form alpha when screening for amylase variant). コロニーを有するセルロースアセテートフィルターは使用するまで室温にてTYプレート上に保管できる。 The cellulose acetate filters with colonies are stored on the TY-plates at room temperature until use. インキュベーション後、残りの活性を1%寒天、pH6.0のクエン酸緩衝液中0.2%デンプン含有プレートで検出する。 After incubation, it detects the remaining activity at 1% agar, 0.2% starch-containing plates citrate buffer pH 6.0. ニトロセルロースフィルターを有する試験プレートは、フィルターサンドイッチと同様に印を入れ、50℃にて2時間インキュベーションする。 The assay plates with nitrocellulose filters are marked the same way as the filter sandwich and incubated for 2 hours at 50 ° C.. フィルターの除去後、試験プレートを10%ルゴール液で染色する。 After removal of the filters the assay plates are stained with 10% Lugol solution. デンプン分解変異体をダークブルーの背景上白いスポットとして検出し、それから保管プレートで同定する。 Starch degrading variants are detected as white spots on dark blue background and then identified on the storage plates. 陽性変異体を最初のスクリーニングと同様の条件下、二回再スクリーニングする。 Under the same conditions as the first screening of the positive variants are twice re-screening.

7.5 第二次スクリーニング 7.5 second screening
再スクリーニング後、陽性形質転換体を保管プレートから拾い、第二次プレート試験を実施する。 After rescreening, picked positive transformants from storage plate, to implement the second plate test. 陽性形質転換体を5mlのLB+クロラムフェニコール中37℃で22時間培養する。 Positive transformants to 22 hours at 37 ° C. in LB + chloramphenicol 5 ml. 各陽性形質転換体及びコントロールとして対応するバックボーンを発現するクローンのバシルス (Bacillus)培養物を90℃クエン酸緩衝液pH4.5中インキュベーションし、サンプルを0、10、20、30、40、60、及び80分にて採取する。 The corresponding clones Bacillus expressing backbone (Bacillus) culture as the positive transformants and control were incubated in 90 ° C. citrate buffer pH 4.5, the samples 0,10,20,30,40,60, and it is collected at 80 minutes. 3マイクロリットルのサンプルを試験用プレートに付ける。 3 give a sample of micro liter to the test plate. 試験用プレートを10%ルゴール液で染色する。 The test plates are stained with 10% Lugol solution. 改善変異体がバックボーンより高い残留活性(試験用プレート上ハローとして検出される)を有する変異体として得らる。 Tokuraru as variants improved mutants have a higher residual activity than the backbone (which is detected as plates halo test). 改善変異体はヌクレオチドスクリーニングによって決定される。 Improved variants are determined by nucleotide screening.

7.6 未精製変異体の安定性試験 7.6 Stability Test crude variants
変異体の安定性を次のように試験できる。 The stability of the variants can be tested as follows. それは、分析すべき変異体を発現するバシルス (Bacillus)培養物を10mlのLB+クロラムフェニコール中37℃21時間で培養する。 It a Bacillus (Bacillus) cultures expressing mutant to be analyzed is incubated at 37 ° C. 21 hours in LB + chloramphenicol 10 ml. 800マイクロリットル培養物を200マイクロリットルのクエン酸緩衝液pH4.5で混合する。 800 microliters culture is mixed with 200 microliters citrate buffer pH 4.5. サンプリング時点の数に相当する70マイクロリットルのサンプルの一部をPCR試験管に入れ、種々の時間(一般的に5、10、15、20、25、及び30分)70℃又は90℃にてインキュベーションする。 A portion of the sample of 70 microliters which corresponds to the number of sampling points placed in PCR tubes at various times (typically 10, 15, 20, 25, and 30 min) 70 ° C. or 90 ° C. incubation. 0分サンプルは高い温度でインキュベーションしていない。 0 min sample is not incubated at high temperature. サンプル中の活性を「アルファ‐アミラーゼ活性用試験」の下、下記に記載のように20マイクロリットルを200マイクロリットルのアルファ‐アミラーゼPNP−G 基質MPR3 ((Boehringer Mannheimカタログ番号1660730)に移すことにより測定する。結果を時間に対して活性率(0時点と比較して)としてグラフに表す、又は特定の時間のインキュベーション後の残留活性率として表す。 The activity in the sample - under "alpha-amylase activity test", alpha 20 microliters 200 microliters as described below - be transferred to amylase PNP-G 7 substrate MPR3 ((Boehringer Mannheim Cat. No. 1660730) measured by. results are expressed in the graph as the active factor (compared to time 0) with respect to time, or expressed as residual activity ratio after a certain time of incubation.

7.7 アルファ‐アミラーゼ変異体の発酵及び精製 7.7 alpha - fermentation and purification of the amylase variant
関連する発現プラスミドを保持しているバシルス ズブチリス(B. subtilis)菌株を次のように発酵及び精製する。 Bacillus subtilis that retain the relevant expression plasmid (B. subtilis) strain fermented and purified as follows. 菌株を−80℃にて保管される10μg/mlのカナマイシン含有LB寒天プレート上にストリークし、37℃で一晩培養する。 Was streaked strains kept preserved 10 [mu] g / ml kanamycin-containing LB agar plates at -80 ° C., and cultured overnight at 37 ° C.. コロニーを500ml振盪フラスコ中10μg/mlのクロラムフェニコール含有100mlのPS−1培地に移す。 The colonies transferred to PS-1 medium containing chloramphenicol 100ml of 500ml shake flask 10 [mu] g / ml.

PS−1培地の組成物 PS-1 medium composition
パールシュガー(Pearl sugar) 100g/l Pearl sugar (Pearl sugar) 100g / l
大豆ミール(Soy Bean Meal) 40g/l Soybean meal (Soy Bean Meal) 40g / l
Na HPO ,12H O 10g/l Na 2 HPO 4, 12H 2 O 10g / l
Pluronic(商標)PE6100 0.1g/l Pluronic (trademark) PE6100 0.1g / l
CaCO 5g/l。 CaCO 3 5g / l.

培養物を5日間270rpmで37℃にて振盪培養する。 Shaking cultured at 37 ℃ culture for 5 days 270rpm.

細胞及び細胞かすを20から25分間4500rpmで遠心分離することにより培養培地から除く。 Excluding cells and cell cake from the culture medium by centrifugation at 20 to 25 min 4500 rpm. 後で、完全に透明な溶液を得るために上清をろ過する。 Later, filtering the supernatant to obtain a completely clear solution. ろ過物を濃縮しUF−フィルター(10000カットオフ膜)上で洗浄し、緩衝液を20mM酢酸pH5.5に変える。 The filtrate was concentrated UF- washed on the filter (10000 cut off membrane), the buffer is changed to 20mM acetate pH 5.5. UF−ろ過物をS−セファロースF. UF- filtrate the S- Sepharose F. F. F. に注入し同じ緩衝液で0.2MNaCl溶出ステップを用いて溶出を行う。 Elution being carried out with the implanted 0.2MNaCl eluting step in the same buffer. 溶出物を10mMトリスpH9.0にて透析し、Q−セファロースF. The eluate was dialyzed against 10mM Tris pH 9.0, Q-Sepharose F. F. F. に注入し6カラム体積以上、0から0.3MNaClの直線勾配で溶出する。 It injected 6 column volumes above, eluted from 0 with a linear gradient of 0.3 M NaCl. 活性(ファデバス(Phadebas)試験により測定)を含む分画を集め、pHをpH7.5に調整し、着色を5分間、0.5%W/volの活性炭素で処理することにより除く。 Activity Fractions containing (Phadebas (Phadebas) measured by the test), the pH was adjusted to pH 7.5, colored for 5 minutes, removed by treatment with activated carbon 0.5% W / vol.

7.8 特異的活性の検出 7.8 Detection of specific activity
特異的活性を活性/mg酵素(activity/mg enzyme)としてファデバス(商標)(Phadebas(商標)試験(ファルマシア(Pharmacia))を用いて検出する。取扱説明書は次に示す(また下記「アルファ‐アミラーゼ活性試験」を参照)。 . Detected using specific Phadebas activity as the activity / mg enzyme (activity / mg enzyme) (TM) (Phadebas (R) Test (Pharmacia (Pharmacia)) manual below (also below "alpha - reference amylase activity test ").

7.9 等電点の検出 7.9 detection of the isoelectric point
pIを等電点電気泳動法 (例:Pharmacia,Ampholine,pH 3.5−9.3)にて検出する。 The pI isoelectric focusing (eg: Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3) for detecting at.

7.10 促進される安定性試験 7.10 Stability test promoted
50mlのプロプレン試験管に、10mlの対象となる洗剤を加えた。 The Puropuren tubes 50 ml, was added detergent to be 10 ml. 適切な希釈をAmy707t及びAmy707tΔRS両者に行い、各180ppmをピペットで洗剤を含む別々の試験管に移し測定した。 Make the appropriate dilution Amy707t and Amy707tΔRS both were measured and transferred each 180ppm into separate tubes containing the detergent with a pipette. 各変異体酵素を含む洗剤を30秒間ボルテックスし、それから10分間RotaMix (ATR RKVS Model)に固定した。 Vortexed for 30 seconds detergent containing each mutant enzyme, then fixed for 10 minutes RotaMix (ATR RKVS Model). 変異体酵素を有する100マイクロリットルの洗剤をピペットで測定し、1:651に希釈した。 100 microliters of the detergent with the mutant enzyme were measured with a pipette, 1: 651 diluted. 変異体の初期の活性をブロック化P‐ニトロ‐フェニル‐マルトヘパトース(Blocked P−Nitro−Phenyl−Maltoheptaose)(Blocked PBNPG7) 基質を用いてKonelab, Model 20XTにて試験をした。 Blocking the initial activity of the mutant P- nitro - phenyl - Marutohepatosu (Blocked P-Nitro-Phenyl-Maltoheptaose) (Blocked PBNPG7) Konelab with the substrate was tested at Model 20XT. 洗剤サンプルをそれから37℃にセットした一定温度のインキュベーターでインキュベーションした。 The detergent samples were incubated at a constant temperature of incubator set therefrom to 37 ° C.. サンプルを1、2、4、7、及び17日で採取し、酵素活性を測定した。 Samples 1, 2, 4, 7, and were taken at 17 days, the enzyme activity was measured.

7.11 アルファ‐アミラーゼ活性試験 7.11 alpha - amylase activity test
7.11.1 ファデバス(Phadebas)試験 7.11.1 Phadebas (Phadebas) test
アルファ‐アミラーゼ活性をファデバス(商標)(Phadebas(商標))錠剤を基質として用いる方法によって検出する。 Alpha - Phadebas amylase activity (TM) (Phadebas (R)) is detected by a method using tablets as substrate. ファデバス錠剤(ファデバス(商標)(Phadebas(商標))アミラーゼ試験、Pharmacia Diagnosticより供給)は、架橋された不溶性青色デンプンポリマーを含み、このポリマーは、ウシ血清アルブミン及び緩衝基質と混合され、錠剤化される。 Phadebas tablets (Phadebas (R) (Phadebas (R)) Amylase Test, supplied by Pharmacia Diagnostic) comprises a cross-linked insoluble blue starch polymer, the polymer is mixed with bovine serum albumin and a buffer substrate, it is tabletted that.

一つの測定ごとに、ひとつの錠剤を5mlの50mMブリトン‐ロビンソン(Britton-Robinson)緩衝液(50mM酢酸、50mMリン酸、50mMホウ酸、0.1mMCaCl ,pHをNaOHを用いて対象となる値に調整)含有試験管に懸濁する。 Each one measurement, 50 mM Britton of one tablet 5 ml - Robinson (Britton-Robinson) buffer (50 mM acetate, 50 mM phosphate, 50 mM boric acid, 0.1mMCaCl 2, pH value of interest with NaOH adjustment) are suspended in tubes containing. 試験を対象となる温度にて水浴中で行う。 Carried out in a water bath at the test becomes a target temperature. 試験すべきアルファ‐アミラーゼをxmlの50mMブリトン‐ロビンソン(Britton-Robinson)緩衝液で希釈する。 Alpha be tested - amylase of xml 50 mM Britton - Robinson (Britton-Robinson) diluted with buffer. 1mlのこのアルファ‐アミラーゼ溶液を5mlの50mMブリトン‐ロビンソン(Britton-Robinson)緩衝液に加える。 This alpha 1 ml - amylase solution of 5 ml 50 mM Britton - Robinson (Britton-Robinson) is added to the buffer. デンプンを可溶性青色フラグメントを与えるアルファ‐アミラーゼによって加水分解する。 Alpha give starch soluble blue fragments - hydrolysed by amylase. 得られる青色溶液の吸光度を620nmで分光光度的に測定し、アルファ‐アミラーゼ活性の作用とする。 The absorbance of the resulting blue solution spectrophotometrically measured at 620 nm, the alpha - and the action of amylase activity.

10分又は15分(試験時間)のインキュベーション後、測定された620nm吸光度は620nmで0.2から2.0単位の範囲であることが重要である。 After incubation for 10 min or 15 min (test time), the measured 620nm absorbance is important in the range of 0.2 to 2.0 units 620nm. この吸収範囲において活性と吸光度(ランベルトベールの法則)の間に直線性がある。 There is linearity between activity and absorbance (Lambert-Beer law) in the absorption range. それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するように調整すべきである。 Therefore, dilution of the enzyme should be adjusted to fit this criterion. 具体的な設定条件(温度、pH、反応時間、緩衝液の条件)下、1mgの得られるアルファ‐アミラーゼは特定量の基質を加水分解し、青色を生じる。 Specific setting conditions (temperature, pH, reaction time, buffer conditions) under alpha obtained with 1 mg - amylase certain amount of substrate hydrolyzed, resulting in blue. 色の強さを620nmで測定する。 The intensity of the color is measured at 620nm. 測定吸光度は、与えられる設定条件下、問題とするアルファ‐アミラーゼの特異的活性(純粋アルファ‐アミラーゼ蛋白質のactivity/mg)に正比例する。 Measurements absorbance set given conditions, the alpha in question - is directly proportional to - (activity / mg of amylase protein pure alpha) amylases specific activity.

7.11.2 代替方法 7.11.2 alternative method
アルファ‐アミラーゼ活性をPNP‐G 基質を用いる方法で検出する。 Alpha - detecting amylase activity by the method using the PNP-G 7 substrate. (p−ニトロフェニル‐アルファ‐D‐マルトヘプタオシド(p−nitrophenyl‐alpha‐D‐maltoheptaoside)の略語であるPNP‐G はエンドアミラーゼにより切断できるブロック化オリゴサッカライドである。切断に続き、黄色を有する遊離PNP分子を放出するためにキット中のアルファグルコシダーゼが基質を消化し、即ち、λ=405nm(400‐420nm)での可視分光光度法により測定する。PNP‐G 基質及びアルファ‐グルコシダーゼを含むキットはBoehringer-Mannheim(カタログ番号1054635)にて作られる。 (P- nitrophenyl -. PNP-G 7 is an abbreviation of alpha -D- maltoheptaoside (p-nitrophenyl-alpha-D -maltoheptaoside) is a blocked oligosaccharide which can be cleaved by endoamylase Following cutting, free alpha glucosidase in the kit in order to release the PNP molecule digest the substrate, i.e., λ = 405nm .PNP-G 7 substrate and alpha measured by visible spectrophotometry at (400-420nm) with a yellow - kit, including a-glucosidase is made by Boehringer-Mannheim (Cat. No. 1054635).

試薬液を調整するために10mlの基質/緩衝液を当業者によって推奨される50mlの酵素/緩衝液に追加する。 The substrate / buffer solution 10ml to adjust the reagent solution is added to the enzyme / buffer recommended 50ml by those skilled in the art. 20マイクロリットルのサンプルを96穴マイクロプレートに移し、25℃でインキュベーションすることにより試験を実施する。 Samples of 20 microliters were transferred to 96-well microtiter plates, performing tests by incubation at 25 ° C.. 25℃に前もって平衡化する200マイクロリットルの試薬液を加える。 Add reagent solution of 200 microliters of pre-equilibrated to 25 ° C.. 溶液を混合し、一分間インキュベーションし、吸収をELISAリーダーでOD405nmにて4分以上30秒ごとに測定する。 The solution was mixed and incubated for one minute, measured every 30 seconds over 4 minutes at OD405nm in ELISA reader absorption.

吸収曲線に依存する時間の勾配は与えられる設定条件下問題とするアルファ‐アミラーゼの活性に正比例する。 Alpha and set conditions problem gradients of time depending on the absorption curve is given - directly proportional to amylase activity.

7.12 洗剤組成物中の酵素性能の検出 7.12 Detection of enzyme performance in detergent compositions
7.12.1 US条件 7.12.1 US conditions
Terg‐o‐tometerの使用、ユーナイテッド・ステーツ・テスティング(United States Testing)、Hoboken、N.J.-US洗浄条件下洗浄試験をシミュレートするために、対象となる変異体酵素の検量効率曲線(dose efficiency curve)(DEC)を蛍光増白剤及び/又は粉AATCC 1993 (American Association of Textile Chemists and Colorists)を含まないLiquid AATCC 2003のような標準的な洗剤を用いて20℃で導入した。 Use of Terg-o-tometer, Yunaiteddo States Testing (United States Testing), Hoboken, in order to simulate N. J.-US washing conditions wash test, calibration efficiency of the mutant enzyme of interest curves using (dose efficiency curve) (DEC) standard detergents such as Liquid AATCC 2003 without the optical brightener and / or flour AATCC 1993 (American Association of Textile Chemists and Colorists) were introduced at 20 ° C. . 比較アルファ‐アミラーゼの相当するDECを本発明の変異体酵素の汚れ除去能力を比較するために導入した。 Comparing alpha - a DEC the corresponding amylase was introduced to compare the stain removal ability of the mutant enzymes of the present invention. このプロセスを40℃で繰り返した。 This process was repeated at 40 ℃. 一般的に、CS-28米デンプン汚れ(オランダのCFT)の4つの見本を1リットルのDI水及び1.5gの液体AATCCで満たしたTerg‐o‐tometerのスチール製容器へ移した。 Generally, it transferred to steel container Terg-o-tometer for four swatches were filled with the liquid AATCC 1 liter of DI water and 1.5g of CS-28 rice starch stain (Netherlands CFT). 粉AATCCを用いる場合、1.5gの洗剤粉を化学天秤(Model PM4800, Mettler Instrument Corp., Highstown, NJ. 08520)で重量測定後、Terg‐o‐tometerへ加えた。 When using a powder AATCC, detergent powder 1.5g analytical balance (Model PM4800, Mettler Instrument Corp., Highstown, NJ. 08520) after weighing, were added to the Terg-o-tometer. 二回の再現を同時に行った。 Twice of reproduction was carried out at the same time. 他に述べていない限り、試験を12分間で行い、3分間すすいだ。 Unless stated otherwise, the test carried out for 12 minutes, rinsed for three minutes. 洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をコニカミノルタ製Chroma Meter Model CR-410で測定した。 After washing, samples were measured reflectance of the air dried swatch Konica Minolta Chroma Meter Model CR-410. 集めたデータを適切な統計分析で処理した。 The data collected were treated with appropriate statistical analysis.

7.12.2 欧州条件 7.12.2 European conditions
Atlas Company, Atlanta, Georgia製のLaunder‐O‐meterの使用‐欧州洗浄条件下洗浄をシミュレートするために対象となる変異体酵素の検量効率曲線(dose efficiency curve)(DEC)を標準欧州試験洗剤、IECA及び漂白(TAED‐テトラ‐アセチル‐エチレン‐ヂアミンアセテート)及び過ホウ酸ナトリウムを有するIECA洗剤を用いて40℃で導入した。 Atlas Company, Atlanta, use of Georgia made Launder-O-meter - European calibration efficiency curve of the mutant enzyme of interest in order to simulate the washing conditions cleaning (dose efficiency curve) (DEC) standard European testing detergents , IECA and bleaching were introduced at 40 ° C. using a IECA detergent having (TAED- tetra - acetyl - - ethylene diethylene amine acetate) and sodium perborate. 比較変異体酵素の相当するDEC曲線を本発明の変異体酵素汚れ除去能力を比較するために導入した。 The corresponding DEC curve of a comparative mutant enzyme was introduced to compare the mutant enzyme stain removal capability of the present invention. もし必要ならば、このプロセスを高い洗浄温度で繰り返してよい。 If necessary, it may repeat this process at higher wash temperatures. 一般的に、EMPA 161 トウモロコシデンプン(EMPA, Switzerland)の4つの見本を6.8g/LのIEC A洗剤又は漂白洗剤を有する8.0g/LのIEC A50を有する250ミリリットルのDI水をスチール製容器へ移した。 Generally, EMPA 161 corn starch (EMPA, Switzerland) made of steel with 250 ml DI water with IEC A50 of 8.0 g / L with IEC A detergent or bleaching detergents four swatches 6.8 g / L of It was transferred to the container. 二回の再現を同時に実施した。 Twice of reproduction was carried out at the same time. 他に述べていない限り、試験を45分間で行い、5分間すすいだ。 Unless stated otherwise, it carried out a test in 45 minutes, rinsed for 5 minutes. 洗浄後、見本は空気乾燥し試験見本の反射率をChroma Meter Model CR-410で測定した。 After washing, samples were measured reflectance of the air dried swatch with Chroma Meter Model CR-410. 集めたデータを適切な統計分析で処理した。 The data collected were treated with appropriate statistical analysis.

7.12.3 試験洗剤組成物のマイクロスウォッチ方法 7.12.3 microswatch method for testing the detergent composition
多くのアルファ‐アミラーゼ洗浄試験が存在する。 Many of the alpha - amylase cleaning test exists. 洗浄試験の典型的な記載は次を含む。 Typical description of testing cleaning includes the following.

「見本(swatch)」は、布地に着いた染みを有する布地のような材料の一片をいう。 "Sample (swatch)" refers to a piece of material, such as a fabric that has a stain that arrived to the fabric. 例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合から作製してよい。 For example, it may be made of material of cotton, a mixture of polyester or natural and synthetic fibers. さらに、該見本は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスのような固い材料でもよい。 Furthermore, 該見 book, paper such as filter paper or nitrocellulose, or a ceramic, a metal, or a rigid material such as glass. アミラーゼにとって、汚れはデンプンベースであり、血液、牛乳、インク、草、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含むが、これらに限定されない。 For amylase, dirt is starch-based, blood, milk, ink, grass, tea, wine, spinach, gravy, chocolate, egg, cheese, clay, dyes, including mixtures of oils or their compounds, limited to not.

「小さな見本(smaller swatch)」は、一穴式の穴開け器でカットされている見本の切断部であり、又は客のリクエストにより製造された96穴用穴開け器であって、多数の穴が標準96穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされる見本の切断部、又は見本から別な方法で取り出されている部分である。 "Small swatches (Smaller swatch)" is one-hole a of the punch cuts a swatch that has been cut, or a 96 punch holes produced on request of customers, a large number of holes There is a portion which has been removed in the standard 96 cuts the sample from being cut by the punch adapted to correspond to the well microtiter plate, or a different from an example method. 見本は繊維、紙、金属、又は他の適切な材料である。 Swatch can be of textile, paper, metal or other suitable material. 該小さな見本は、その見本が、24‐、48‐、又は96‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。 The small sample, the sample is, 24-, 48-, or stain is attached at either before or after it is placed in a 96-well microtiter plates. 「小さな見本(smaller swatch)」はまた少量の材料に染みを適用して作成してもよい。 "A small sample (smaller swatch)" also may be created by applying a stain to a small amount of material. 例えば、小さな見本は、汚れが付いた直径5/8″又は0.25″の布地のものでよい。 For example, a small sample may be of fabric diameter 5/8 "or 0.25" marked with dirt. 客のリクエストにより製造された穴開け器は96穴プレートのすべてに同時に96個の見本が挿入されるように設計されている。 Punch manufactured on request of customers are designed so that all the time 96 samples of 96-well plates are inserted. 装置は、単に同じ96穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の見本の搬送をさせる。 Apparatus simply by inserting more than once on the same 96 well plate, make the transport of the two or more samples for each hole. 複数穴用穴開け器は、任意の設定プレートに見本の同時挿入をすることができるものであり、24‐、48‐、又は96‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。 Multiple holes for the punch are those capable of simultaneous insertion of samples into any setting plate, 24-, 48-, or including 96-well plates are not limited thereto. 他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズであり、繊維以外材料での洗浄組成物試験に用いるためにコーティングされる。 How other possible, the metal contamination test platform, plastic, glass, a bead made from other suitable materials that are coated with a ceramic or soiling substances, for use in cleaning compositions tested in a material other than fibers It is coated. 一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ96‐、48‐、又は24‐穴プレート又はより大きい穴に挿入される。 BEAD one or more coats containing suitable buffer and enzyme 96-, 48-, or inserted into 24- well plates or larger holes. この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。 In this case, supernatant by the measurement of direct absorbance, or to measure the dirt separated by the secondary colors either way after color reaction. また、分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。 Further, processing by mass spectral analysis and analysis of soils to separate. さらにマイクロスクリーニング試験は、例えばインディゴ染色デニムの見本をマルチウェルプレートの穴に供給し、固定し、砂のような粒子又は例えば6,8、又は9ゲージの粒子を含むふるいで得たガーネットのようなより大きな粒子を加え、添加粒子によって見本を摩耗させるようにプレートを攪拌する。 Furthermore micro screening test, for example a sample of indigo dyed denim was supplied into the holes of the multi-well plates, fixed, particles or for example 6,8, such as sand, or 9 as garnet obtained by sieve comprising particles of the gauge It added Do larger particles, stirring the plate so as to abrade the sample by adding particles. この試験はストーンウォッシング適用におけるセルラーゼの評価に有用である。 This test is useful in the evaluation of the cellulase in the stonewashing apply. 酵素の有効性を、反応液への色の放出(例えば、放出インディゴをジメチルスルホキシドに溶解し、A 600 nmの吸収で測定する。)によって又は摩耗する見本の反射率の測定により判断する。 The effectiveness of the enzyme, the color emission of the reaction solution (e.g., a release indigo is dissolved in dimethylsulfoxide, the measurement is. Absorption of A 600 nm) is determined by measuring the reflectance of swatches to or by abrasion.

例えば、未処理のBMI(血液(blood)/牛乳(milk)/インク(ink))見本を漂白剤のない洗剤で洗浄する場合、インクの大部分はプロテアーゼの助けなしでも除去される。 For example, when cleaning the BMI (blood (blood) / milk (milk) / ink (ink)) samples of unprocessed no bleach detergent, most of the ink is removed without the help of a protease. プロテアーゼの添加によりインクの除去が少し増大する。 Removal of the ink is increased slightly by addition of the protease. これは大きなバックグラウンドにおいては定量化が困難である。 This is difficult to quantify in a large background. 本発明は、染みの固定度合いを制御する処理手順を提供する。 The present invention provides a procedure for controlling a fixed degree of stain. 結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、汚れの量を変えて放出することのできる見本の作製が可能となる。 As a result, for example, when cleaning in the absence of the enzyme to be tested, it is possible to produce swatches that can be released by changing the amount of dirt. 固定化見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の比に劇的な改善が得られる。 The use of immobilized sample, a dramatic improvement is obtained in the ratio of signal to noise in the wash test. さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。 Furthermore, it is possible to provide a change of the fixed degree, various cleaning conditions, the adhesion of stains for optimum results.

種々のタイプの材料の周知の「強度(strength)」の汚れを有する見本は商業的に入手可能であり(EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk-Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; 又はCenter for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands)、専門家(Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280 286 (1982))によっても作成される。 The sample with stains well-known "strength (strength)" of the various types of material are commercially available (EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk-Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; or Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands), professionals (Morris and Prato, Textile Research Journal 52 (4): is also created by 280 286 (1982)). 他の試験用見本は、繊維を含む綿上の血液/牛乳/インク(BMI)染み、繊維を含む綿上のホウレンソウの染み、繊維を含む綿上の草の染み、及び繊維を含む綿上のチョコレート/牛乳/すすを含むがこれらに限定されない。 Other test swatches, blood / milk / ink on cotton containing fibers (BMI) stain, stains of spinach on cotton containing fibers, grass stains on cotton containing fibers, and on cotton containing fibers including chocolate / milk / soot but are not limited to these.

BMI染みは0.0003%から0.3%の過酸化水素で綿に固定される。 BMI stain is fixed to cotton with 0.3% hydrogen peroxide 0.0003%. 他の組み合わせは0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、ゼラチン及び0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定されるクーマシィーブリリアントブルー染色又は0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。 Grass or spinach Other combinations are fixed with 1% glutaraldehyde 0.001% from Coomassie Brilliant blue staining, or 0.001% fixed in 1% glutaraldehyde gelatin and 0.001% 1 % of chocolate is fixed with glutaraldehyde, including milk and soot.

また、見本を酵素及び/又は洗剤製剤でインキュベーションする間、攪拌する。 Also, while incubating the swatch with the enzyme and / or detergent formulation is stirred. 洗浄能力データはウェル、特に96穴プレートにおける見本の方向(水平対垂直)に依存する。 Cleaning performance data is well, in particular depending on the direction of sample (horizontal versus vertical) in 96 well plates. これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示すであろう。 This would indicate that mixing was insufficient incubation period. インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計された。 Although there are many ways to ensure sufficient agitation of the incubation period, the plate holder sandwiching the microtiter plates between the aluminum two plates have been designed. これの設置の仕方は単純で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆い、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで96穴プレートに固定すれば足りる。 This way the installation is simple, for example, the wells are covered with adhesive plate sealer, it is sufficient to fixed 96 well plate two aluminum plates with a commercially available clamps suitable type. それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。 It can be installed in a commercial incubator shaker. 振盪機を約400rpmで設定することによって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。 Very stirred efficient is obtained by setting the shaker at about 400 rpm, whereas leakage or alternate contamination is efficiently prevented by the holder.

トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。 Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) is used to quantify the concentration in the cleaning liquid amino group. これは、見本(例えば、Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184−200 (1997)参照。)から除去された蛋白質の量の測定に役立つ。 This sample (e.g., Cayot and Tainturier, Anal Biochem 249:... 184-200 (1997) refer) serves for determination of the amount of removed protein from. しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片(例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から)を生じる場合、より大きなTNBSシグナル、言い換えると「ノイズ」が生じる。 However, detergent or enzyme sample is very small peptide fragments (for example, from the presence of peptidases in the sample) may occur, and "noise" occurs larger TNBS signal, in other words.

血液/牛乳/インク又は他の染みに対する洗浄能力を測定する他の手段は、インク放出に基づく。 Another means of measuring wash performance on blood / milk / ink or other stain is based on ink release. 見本上の蛋白質の蛋白質分解によって、洗浄液の吸光度を測定することにより定量されるインク粒子の放出が得られる。 By proteolysis of protein on swatches, release of ink particles to be quantified is obtained by measuring the absorbance of the wash liquor. 吸光度を350nmと800nmの間の任意の波長で測定する。 Absorbance is measured at any wavelength between 350nm and 800 nm. 波長を410nm又は620nmで測定する。 The wavelength is measured at 410nm or 620 nm. また洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、クーマシィーブリリアントブルー染色を含む汚れにおける洗浄能力を決定するために試験を行う。 Also carried out using a washing liquid, grass, spinach, gelatin, a test to determine the cleaning capacity in soils containing Coomassie Brilliant Blue staining. これらの染みに対する典型的な波長は、ホウレンソウ、又は草について670nm及びゼラチン又はクーマシィーについては620nmを含む。 Typical wavelengths for these stains, spinach, or the grass about 670nm and gelatin or Coomassie includes 620 nm. 例えば、洗浄液(例えば、一般的に96穴プレートから100‐150μL)の一部を除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。 For example, the cleaning liquid (e.g., typically 100-150μL from 96 well plates), except for some, transferred to a cuvette or multiwell microplate. その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。 Set this to spectrophotometer at that time, the absorbance is measured at a suitable wavelength.

またシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適切な基質上の血液/牛乳/インク染みを用いて食器洗浄用の強化酵素及び/又は洗剤組成物を決定するために用いる。 Also used to determine the system, for example, clothing, plastic, or reinforced enzyme and / or detergent composition for dish washing with appropriate substrate on blood / milk / ink stain, such as ceramics.

ある実施態様においては、0.3%過酸化水素をBMI/綿見本に30分間25℃で処理してBMI染みを綿に固定し、又は0.03%過酸化水素をBMI/綿見本に30分間60℃で処理してBMI染みを綿に固定する。 In some embodiments, the 0.3% hydrogen peroxide BMI stain is fixed to cotton by treatment for 30 minutes at 25 ° C. to BMI / cotton swatch or 0.03% hydrogen peroxide in BMI / cotton swatch 30 the BMI stain is fixed to cotton by treatment with min 60 ° C.. 約0.25″の小さな見本をBMI/綿見本から切り離し、96穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異蛋白質のような酵素の周知の混合を添加する。粘着プレート用シールでマイクロタイタープレートの上に固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約10から60分間、約250rpmでオービタルシェーカー(orbital shaker)で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートに移され、620nmでインクの吸光度を測定する。これは0.01%グルタルアルデヒドをホウレンソウ/綿見本又は草/綿見本に30分間25℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及 About disconnecting 0.25 small swatches "from BMI / cotton swatch and transferred to 96-well microtiter plate wells. Adding known mixing of enzymes such as the well in detergent compositions and mutant proteins. Adhesive plate after fixing onto the microtiter plate seals, sandwiching a microtiter plate in an aluminum plate, about 10 to 60 minutes, stirred on an orbital shaker at about 250rpm (orbital shaker). at the end of this time, the supernatant transferred to a new microtiter plate and measuring the absorbance of the ink at 620 nm. This is a spinach or Kusashimi fixed cotton by treatment with 0.01% glutaraldehyde for 30 minutes at 25 ° C. in spinach / cotton swatch or grass / cotton swatch It is tested in the same manner. Similarly, chocolate, milk, 及 び/又はすすの染みで行われる。さらに血液/牛乳/インク試験及び条件を米国特許第7,122,334 (Genencor International, Inc.)に記載する。 Beauty / or they carried out in stains soot. Further blood / milk / ink test and conditions U.S. Patent No. 7,122,334 (Genencor International, Inc.) described.

7.13 LAS感受性の検出 7.13 Detection of LAS sensitivity
変異体を40℃で10分間、異なる濃度のLAS(リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩(linear alkyl benzene sulfonate);Nansa 1169/P)とインキュベーションする。 10 minutes mutants at 40 ° C., different concentrations of LAS (linear alkyl benzene sulfonate (linear alkyl benzene sulfonate); Nansa 1169 / P) and incubated.

残留活性をファデバス(商標)(Phadebas(商標))試験方法又はPNP−G7基質を用いる代替方法を用いて測定する。 The residual activity is measured using the Phadebas (R) (Phadebas (R)) Test method, or an alternate method of using the PNP-G7 substrate.

LASを0.1Mリン酸緩衝液pH7.5で希釈する。 The LAS is diluted with 0.1M phosphate buffer pH 7.5.

次の濃度を用いる。 Use the following concentration. それは500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm、及び10ppmを含むか、又はLASを含まない。 It does not contain 500ppm, 250ppm, 100ppm, 50ppm, 25ppm, and it contains a 10 ppm, or LAS.

変異体を全体積10ml中0.01‐5mg/lの濃度になるように異なるLAS緩衝液で希釈し、温度を制御する水浴にて10分間インキュベーションする。 Mutants were diluted at different LAS buffers to a concentration of total volume in 10ml 0.01-5 mg / l, incubated for 10 minutes in a water bath to control the temperature. インキュベーションを少量のサンプルの一部を低温の試験緩衝液に移すことにより停止する。 Some of the small sample incubation is stopped by transferring the cold test buffer. 活性測定に影響しないために、活性測定の間LAS濃度を1ppm以下にすることは重要である。 In order not to affect the activity measurement, it is important to between LAS concentration of the active measurement 1ppm or less.

それから残留活性を上記ファデバス(商標)(Phadebas(商標))試験又は代替方法を用いて複数測定する。 Then multiple measured using the Phadebas (R) (Phadebas (R)) assay or alternative method the residual activity.

活性はブランクを除いた後測定する。 Activity is measured after removal of the blank.

LASを含まない活性を100%とする。 Activity without the LAS is 100%.

8. 8. バイオフィルム除去組成物及び使用 Biofilm removal compositions and uses
組成物は主要な酵素成分、例えばバイオフィルムを除去するときに用いるための単一成分として、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含んでよい。 Composition major enzymatic component, e.g., as a single component for use when removing biofilm, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - may comprise amylase or variant thereof. あるいは、組成物は複数の酵素的活性を含んでよく、例えば複数アミラーゼ又は次の任意の組み合わせを含むカクテル酵素であり、それは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ(ベータ‐、又はアルファ‐、又はグルコ‐アミラーゼ)、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ Alternatively, the composition may comprise a plurality of enzymatic activities, for example, a cocktail enzyme containing multiple amylase or any of the following combinations, it is an aminopeptidase, amylase (beta - or alpha - or gluco - amylase) , carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, cellulase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectin-degrading enzymes, peptide transglutaminase, peroxidase, phytase 、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及び/又はキシラナーゼ、又はバイオフィルムを除去用のそれらの組み合わせである。 , Polyphenol oxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, and / or xylanase, or a combination thereof for removing biofilms. 添加酵素はアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコーラ(Humicola)(例、フミコーラ インソレンス(H.insolens)及びフザリウム(Fusarium)属に属する微生物の手段により生産されてよい。アスペルギルス(Aspergillus)属の典型的な仲間はセルロース高分解糸状菌(A. aculeatus)、アスペルギルス アワモリ(A. awamori)、アスペルギルス ニガー(A. niger)、又はアスペルギルス オリザエ(A. oryzae)を含む。フザリウム(Fusarium)属の典型的な仲間はフザリウム バクテリジオイデス(F. bactridioide)、フザリウム セレアリス(F. cerealis)、フ Adding enzyme Aspergillus (Aspergillus), Trichoderma (Trichoderma), Humicola (Humicola) (eg, Humicola insolens (H.insolens) and Fusarium (Fusarium) may be produced by means of a microorganism belonging to the genus. Aspergillus (Aspergillus) genus typical fellow cellulose high decomposition fungi (A. aculeatus), Aspergillus awamori (A. awamori), Aspergillus niger (A. niger), or Aspergillus including oryzae (A. oryzae). Fusarium (Fusarium) genus typical of mates is Fusarium tumefaciens lysine Oy Death (F. bactridioide), Fusarium Serearisu (F. cerealis), off リウム クロオクウェレンセ(F. crookwellense)、フザリウム クルモルム(F. culmorum)、フザリウム グラミネアルム(F. graminearum),フザリウム グラミナム(F. graminum)、フザリウム ヘテロスポラム(F. heterosporum)、フザリウム ネガンディニス(F. negundinis)、フザリウム オキシスポラム(F. oxysporum), フザリウム レティクラタム(F. reticulatum)、フザリウム ロゼウム(F. roseum)、フザリウム サンブシヌム(F. sambucinum)、フザリウム サルコクロウム(F. sarcochroum)、フザリウム スルフリューム(F. sulphureum)、フザリウム トルローサ Potassium chloride Ok web Len cell (F. crookwellense), Fusarium Kurumorumu (F. culmorum), Fusarium graminearum (F. graminearum), Fusarium Guraminamu (F. graminum), Fusarium heterosporum (F. heterosporum), Fusarium Negandinisu (F. negundinis) , Fusarium oxysporum (F. oxysporum), Fusarium Retikuratamu (F. reticulatum), Fusarium roseum (F. roseum), Fusarium Sanbushinumu (F. sambucinum), Fusarium Sarukokuroumu (F. sarcochroum), Fusarium sul flumes (F. sulphureum), Fusarium Torurosa (F. torulosum)、フザリウム トリコテキオイデス(F. trichothecioides)及び、フザリウム ベネナツム(F. venenatum)である。 (F. torulosum), Fusarium Trichoderma text Oy Death (F. trichothecioides) and is a Fusarium venenatum (F. venenatum).

周知の方法に従って調製される組成物を含むバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は液体又は乾燥組成物の形態でよい。 Bacillus species containing composition prepared according to methods well known 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be in the form of a liquid or a dry composition. 例えば、組成物を含むバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は粒子又は微粒子の形態でよい。 For example, Bacillus species including the composition 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be in the form of particles or particulate. 組成物中に含まれるポリペプチドは周知の方法に従って安定化される。 Polypeptide contained in the composition is stabilized according to well known methods.

ポリペプチド組成物の一般的な使用が下記に示す実施例である。 Typical uses of the polypeptide compositions are examples shown below. 組成物及びその組成物が用いられる他の条件下バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の用量は周知の方法を用いて決定してよい。 Composition and the composition are other conditions Bacillus species used 707 [alpha (Bacillus sp.) - a dose of amylase or variant thereof may be determined using known methods.

さらに、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体が2、6‐β‐D‐フルクタンヒドロラーゼ又はその変異体と共に組成物中に用いることも考えられる。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha - it is considered to use in the compositions with amylase or variant thereof is 2,6-β-D- fructan hydrolase or variant thereof (Bacillus sp.).

他の実施態様はバイオフィルムを分解し及び/又は除去するための組成物及び方法を意図する。 Other embodiments are intended to compositions and methods for decomposing the biofilm and / or removed. 本明細書にて用いる用語「分解(disintegration)」はバイオフィルム中の個々の微生物の細胞を一緒に連結及び結合するバイオフィルムマトリックス中のポリサッカライドの加水分解として理解され、それにより、微生物細胞をバイオフィルムから放出及び除去できる。 The term "degradation (disintegration)" as used herein is to be understood as a polysaccharide hydrolysis of the biofilm matrix connecting and binding to cells of the individual microorganisms in the biofilm together, thereby microbial cells It can be released and removed from the biofilm. バイオフィルムは一般的に表面に存在し、バイオフィルムの分解を接触表面を持ってくることにより行う。 Biofilms generally present on the surface is carried out by bringing the contact surface degradation of the biofilm. 例えば、表面をバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又は一以上の例えば2、6‐β‐D‐フルクタンヒドロラーゼであるが、これに限定されないバイオフィルムを破壊することのできる他の酵素を含む水溶性培地で浸し、覆い、濡らすことによる。 For example, the surface of the Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or Its a variant or one or more, for example 2, 6-beta-D-fructan hydrolase of destroying biofilms but not limited to immersed in aqueous medium containing other enzymes that can be covered, due to wetting. 組成物を例えば、パルプ及び製紙産業での白濁した水、スライムを加水分解するのに用いてよい。 The composition for example, may be used turbid water in the pulp and paper industry, a slime to hydrolysis.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は0.0001から10000mg/L、0.001‐1000mg/L、0.01‐100mg/L、又は0.1‐10mg/Lの用量で存在してよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof from 0.0001 10000mg / L, 0.001-1000mg / L, of 0.01-100mg / L, or 0.1-10mg / L it may be present at a dose. 追加酵素及び酵素変異体は同量またはそれ以下で存在してよい。 Additional enzymes and enzyme variants may be present in the same amount or less.

プロセスを室温から約70℃の温度で適切に行う。 Suitably at a temperature of about 70 ° C. from room temperature processes. 一般的な温度範囲は約30℃約60℃を含み、例えば、約40℃から約50℃である。 Typical temperature ranges include from about 30 ° C. to about 60 ° C., for example, from about 40 ° C. to about 50 ° C..

バイオフィルの加水分解に適切なpHは約3.5から約8.5内にある。 Suitable pH for the hydrolysis of the biofilm is from about 3.5 to about 8.5 in. 一般的なpH範囲は約pH5.5から約8を含み、例えば、約6.5から約7.5である。 Typical pH range from about pH5.5 comprises about 8, for example, from about 6.5 to about 7.5. バイオフィルムを効果的に除去するための酵素の接触時間又は反応時間は、バイオフィルムの特徴及び表面を酵素単独又は2、6‐β‐D‐フルクタンヒドロラーゼのような他のバイオフィルム分解酵素との組み合わせに依存し、かなり多様である。 The contact time or reaction time of the enzyme to effectively remove biofilm, biofilm characteristics and surface with other biofilm degrading enzymes, such as enzymes alone or 2,6-β-D- fructan hydrolase Depending on the combination, it is quite diverse. 一般的な反応時間は約0.25時間から約25時間及び約1時間から約10時間内を含むことができ、例えば約2時間である。 Typical reaction times may be from about 0.25 hours to about 25 hours and about 1 hour comprising about 10 hours, such as about 2 hours.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及び2、6‐β‐D‐フルクタンヒドロラーゼと組み合わせできる追加バイオフィルム分解酵素はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、他のアルファ‐アミラーゼを含む他のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及び/又はペクチナーゼを含むが、これらに限定されない。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or added biofilm degrading enzymes that variants and 2,6-β-D- fructan hydrolase can combined with cellulase, hemicellulase, xylanase, other alpha - including amylase other amylases, lipases, proteases, and / or including pectinase, without limitation.

さらに、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は酵素的又は非酵素的バイオサイドのような、抗生剤と組み合わせてよい。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof, such as enzymatic or non-enzymatic biocides may be combined with antibiotics. 酵素的バイオサイド例えば、オキシドレダクターゼを含む組成物、例えばラッカーゼ又はペルオキシダーゼ、特にハロペルオキシダーゼ、及び任意に国際PCT出願WO 97/42825及びDK 97/1273記載のようにアルキルシリンゲート(alkyl syringate)のような増強剤でよい。 Enzymatic biocides example, compositions comprising the oxidoreductase, such as laccases or peroxidases, especially haloperoxidase, and optionally as International PCT Application WO 97/42825 and DK 97/1273 alkyl cylindrical gate as described (alkyl syringate) it may be a Do-enhancing agent.

例えば、バイオフィルムを除き及び/又は洗い流す表面は固い表面であり、任意の表面で実質的に微生物に非透過的な面であると定義できる。 For example, the surface except the biofilm and / or wash are hard surface, can be defined as a non-transparent surface substantially microorganisms any surface. 表面の例は、例えば、ステンレススチール合金のような金属、プラスチック/合成ポリマー、ゴム、板、グラス、木材、紙、繊維、コンクリート、石、大理石、ジプサム及び任意に例えば、ペイント、エナメル、ポリマー及びその類似物のようなセラミック原料でコーティングされるセラミック原料から作られる。 Examples of the surface, for example, a metal such as stainless steel alloys, plastics / synthetic polymers, rubber, board, glass, wood, paper, textiles, concrete, stone, marble, the gypsum and, optionally example, paints, enamels, polymer and made from ceramic material that is coated with a ceramic material, such as the like. 従って、表面はシステム保持、輸送、プロセッシング、又は水供給システムのような水溶液と接触、食品プロセッシングシステム、冷却システム、化学プロセッシングシステム、又は薬剤プロセッシングシステムの一部をなすものでよい。 Accordingly, the surface system holding, transporting, processing, or contact with an aqueous solution such as water supply systems, food processing systems, cooling systems, chemical processing systems, or form part of a drug processing system. パルプ及び/又は製紙産業のような木材プロセッシング産業においてバイオフィルムを除去するための組成物を用いる方法及び組成物である。 A method and composition using the compositions for removing biofilm in the wood processing industry, such as pulp and / or paper industry. 従って、酵素及び酵素を含む組成物は従来の定置洗浄(C‐I‐P)システムに有用である。 Thus, a composition comprising an enzyme and enzyme are useful in conventional cleaning-in-place (C-I-P) system. 表面はパイプ、タンク、ポンプ、膜、フィルター、熱変換機、遠心分離機、蒸発機、ミキサー、噴霧塔、バルブ、及び反応器の一部をなすものである。 Surface are those that form pipes, tanks, pumps, membranes, filters, heat conversion apparatus, centrifuges, evaporators, mixers, spray towers, valves, and a portion of the reactor. また、表面は、汚染内視鏡、人工補装具又は医療用インプラントのような医療科学及び医療産業で用いる器具又は器具の一部である。 The surface is contaminated endoscope is part of the instrument or instruments used in the medical science and medical industries, such as prosthesis or medical implant.

またバイオフィルム除去用の組成物は金属表面、例えばパイプラインが微生物のバイオフィルムによる攻撃される時に起こるいわゆるバイオ腐食をバイオフィルムを分解することにより防ぎ、それによりバイオフィルムの微生物細胞が付着する金属表面を腐食するバイオフィルムの環境を作ることを防止することを意図する。 Metal or composition for biofilm removal to prevent by decomposing biofilm called bio corrosion occurring when a metal surface, for example a pipeline is attacked by microbial biofilm, to thereby adhere microbial cells of the biofilm intended to prevent making an environment biofilm corroding surface.

抗バイオフィルム組成物のための別の適用はオーラルケアである。 Another application for anti-biofilm compositions is oral care. しかしながら、表面は、粘膜、皮膚、歯、毛髪、爪等のような生物由来である。 However, the surface mucosa, skin, teeth, hair, a biological, such as a nail or the like.

例えば、プラークを有する歯は酵素を歯磨き粉に含むことで、汚れたコンタクトレンズは表面として考えられる。 For example, teeth having a plaque that contains an enzyme in toothpaste, contaminated contact lenses are considered as a surface. 従って、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ及びその変異体は人間又は動物の歯に存在するプラークの分解のための薬剤を作るための組成物及びプロセスに用いることができる。 Thus, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase and variants thereof may be used in the compositions and processes for making a medicament for the degradation of plaques present in the teeth of a human or animal. さらに、嚢胞性線維症を発症している患者の肺中のバイオフィルムのような粘膜由来のバイオフィルムの分解の使用である。 Furthermore, the use of the degradation of the mucosa from the biofilm, such as biofilm in lungs in patients developing cystic fibrosis.

従って、さらなる実施態様においては、任意の活性のある汚染物質の実質的にない精製酵素のような組み換え酵素を含むオーラルケア組成物に関する。 Accordingly, in a further embodiment, it relates to oral care compositions comprising a recombinant enzyme, such as a purified enzyme substantially free of contaminants with any activity. オーラルケア組成物は組み換え酵素の量を適切に含有してよい。 Oral care composition may suitably contain an amount of the recombinant enzyme.

オーラルケア組成物に用いる他のバイオフィルム分解酵素はオーラルケア組成物における2、6‐β‐D‐フルクタンヒドロラーゼ活性を含むが、これに限定されない。 Although other biofilm degrading enzymes for use in the oral care composition comprises 2,6-β-D- fructan hydrolase activity in the oral care composition is not limited thereto. 考えられる酵素活性はデキストラナーゼ、ムタナーゼ、グルコースオキシダーゼ、L‐アミノ酸オキシダーゼ、WO 95/10602記載のヒトヨタケ種(Coprinus sp.)ペルオキシダーゼ、又はラクトペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、特に、カーブリア ウェルクロサ(C. verruculosa)及びカーブラリア イナエクアリス(C. inaequalis)のようなカーブラリア種(Curvularia sp.)由来のハロペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、パパイン、酸性プロテアーゼ(例、WO 95/02044記載の酸性プロテアーゼ)、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、AMG(Novo Nordisk A/S)のようなアミログルコシダーゼを含むア Possible enzymatic activity dextranase, mutanase, glucose oxidase, L- amino acid oxidase, WO 95/10602 Coprinus species described (Coprinus sp.) Peroxidase or peroxidase such as lactoperoxidase, haloperoxidase, in particular, Kaburia Werukurosa ( C. Verruculosa) and Curvularia Curvularia species such as inaequalis (C. inaequalis) (Curvularia sp.) peroxidase, such as from a haloperoxidase, laccases, papain, acidic protease (e.g., WO 95/02044, wherein the acid protease), a containing endoglucosidase, lipase, amyloglucosidase, such as AMG (Novo Nordisk a / S) ラーゼのようなプロテアーゼ、抗菌性酵素、及びそれらの混合物を含む酵素の群由来の活性を含む。 Including proteases such as hydrolases, antimicrobial enzymes, and the activity from the group of enzymes comprising a mixture thereof.

オーラルケア組成物は任意の適切な物理的形態(例えば、粉、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等)でよい。 Oral care compositions any suitable physical form (e.g., powder, paste, gel, liquid, ointment, tablet etc.) a. 「オーラルケア組成物(oral care composition)」は、虫歯を防止し、歯のプラーク及び歯石の形成を防止し、歯のプラーク及び歯石を除去し、歯の病気など予防及び/又は治療することにより、人間及び動物の口中の口腔衛生を維持又は改善するために用いてよい組成物を含む。 "Oral care composition (oral care composition)" prevents tooth decay by preventing the formation of plaque and tartar tooth to remove plaque and tartar tooth, preventing and / or treating such dental diseases comprises may composition used to maintain or improve the mouth of oral hygiene in humans and animals. また、少なくともオーラルケア組成物という用語は入れ歯、人工歯及びその類似物を洗浄するための製品を含む。 Also includes products for term least oral care compositions for cleaning dentures, artificial teeth and the like. そのようなオーラルケア組成物の例は練り歯磨き、デンタルクリーム、ゲル又は歯磨き粉、歯科用洗口剤、歯磨き前又は後の漱ぎ製剤、チューインガム、トローチ及びキャンディーを含む。 Examples of such oral care compositions toothpaste, including dental cream, gel or tooth powder, dental mouthwash, toothpaste before or after the rinse formulation, a chewing gum, a lozenge and candies. 一般的な練り歯磨き及びゲルは研磨磨き剤、発泡剤、香料、保湿剤、バインダー、増粘剤、甘味剤、ホワイトニング/漂白/染み除去剤、水、および任意に追加酵素及び酵素の組み合わせを含む。 Common toothpastes and gels abrasive polishing agents, foaming agents, perfumes, humectants, binders, thickeners, sweetening agents, whitening / bleaching / stain removing agents, water, and a combination of any additional enzymes and enzyme .

マウスウォッシュはプラーク除去液を含み、一般的に水/アルコール溶液、香味料、保湿剤、甘味料、発泡剤、着色剤、及び任意に追加の酵素及び酵素組成物を含む。 Mouthwash includes a plaque removing liquids, including generally water / alcohol solution, flavor, humectant, sweetener, foaming agent, colorant, and optionally additional enzymes and enzyme compositions.

また、研磨磨き剤も歯磨き剤のようなオーラルケア組成物へ含まれてよい。 Also it is included into oral care compositions such as dentifrice also abrasive polishes.

従って研磨磨き剤はアルミナ及びその水和物を含み、例えば、アルファアルミナ3水和物、3ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、か焼アルミナケイ酸塩、及びケイ酸アルミニウムのようなアルミノケイ酸塩、炭酸カルシウム、ケイ酸ジリコニウム、及び塩化ポリビニルのような粉状プラスティックも、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノールホルムアルデヒド樹脂、メラミン‐ホルムアルデヒド樹脂、尿素‐ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉状ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル、及びエアロゲル及びその類似物である。 Therefore abrasive polishing agent comprises alumina and hydrates thereof, such as alpha alumina trihydrate, magnesium trisilicate, magnesium carbonate, kaolin, calcined alumina silicate, and aluminosilicates such as aluminum silicate , calcium carbonate, Jirikoniumu silicate, and powdered plastics such as polyvinyl chloride may, polyamide, polymethyl methacrylate, polystyrene, phenol-formaldehyde resins, melamine - formaldehyde resins, urea - formaldehyde resins, epoxy resins, powdered polyethylene, silica xerogels a hydrogel, and aerogels and the like. また、適切な研磨剤はピロリン酸カルシウム、水に不溶のアルカリメタリン酸塩、リン酸二カルシウム、及び/又はその二水和物、オルトリン酸2カルシウム、リン酸トリカルシウム、特にハイドロキシアパタイト及びその類似物である。 Moreover, suitable polishing agent calcium pyrophosphate, water-insoluble alkali meta phosphate, dicalcium phosphate and / or dihydrate thereof, orthophosphoric acid 2 calcium, tricalcium phosphate, in particular hydroxyapatite, and the like it is. また、これらの物質の混合物を用いることができる。 It is also possible to use mixtures of these substances.

オーラルケア組成物次第で、研磨用製品は重量で約0%から約70%、又は約1%から約70%存在してよい。 Depending oral care composition, the abrasive product is from about 0% to about 70% by weight, or from about 1% to be present about 70%. 練り歯磨きにとって、研磨剤は最終練り歯磨き重量で一般的に10%から70%の範囲内にある。 For toothpastes, the abrasive is generally in the range of 10% to 70% in the final toothpaste weight.

保湿剤は例えば歯みがきのペーストから水分の消失を防ぐために使用する。 Humectants are employed to prevent loss of water from e.g. toothpaste paste. オーラルケア組成物に用いる適切な保湿剤は次の化合物及びそれらの混合物を含む。 Suitable humectants for use in oral care compositions include the following compounds and mixtures thereof. それは、グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール(PEG)、プロピレングリコール、1,3‐プロパンジオール、1,4‐ブタンジオール、部分的に水素化加水分解ポリサッカライド及びその類似物である。 It glycerol, polyols, sorbitol, polyethylene glycol (PEG), propylene glycol, 1,3-propanediol, 1,4-butanediol, partially hydrogenated hydrolyzed polysaccharides and the like. 保湿剤は一般的に練り歯磨きの重量で0%から約80%、又は約5%から70%存在する。 Humectants are generally about 0% to 80% by weight of the toothpaste, or present from about 5% to 70%.

シリカ、デンプン、トラガカントゴム、キサンタンゴム、アイリッシュモスの抽出物、アルギン酸塩、ペクチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びヒドロキシプロピルセルロースのようなセルロース誘導体、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロロリドンは有用な増粘剤及びバインダーの例として意味し、歯みがき製品を安定するのに役立つ。 Silica, starch, tragacanth, xanthan gum, extracts of Irish moss, alginates, pectin, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium, and cellulose derivatives such as hydroxypropylcellulose, polyacrylic acid and salts thereof, polyvinyl pyromellitic Lori Don useful refers examples of such thickeners and binders help to stabilize the dentifrice product. 増粘剤は練り歯磨きクリーム及びゲルに重量で約0.1%から約20%の量で存在し、ビルダーは最終製品の重量で約0.01から約10%の範囲で存在してよい。 Thickener is present in an amount from about 0.1% to about 20% by weight in toothpaste creams and gels, builders may be present in a range of about 0.01 to about 10% by weight of the final product.

発泡剤石鹸として、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、両性イオン性(amphoteric)及び/又は両性イオン性(zwitterionic)界面活性剤を用いてよい。 As a foaming agent soap, anionic, cationic, nonionic, zwitterionic (amphoteric) and / or zwitterionic (zwitterionic) or using a surfactant. これらは、最終製品の重量で0%から約15%、約0.1%から約13%又は約0.25%から約10%のレベルで存在してよい。 These are about 15% 0% by weight of the final product, it may be present in from about 0.1% to about 13%, or about 0.25% to about 10% level.

界面活性剤はバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に不活性化の影響を及ぼさない適切な範囲のみである。 Surfactants Bacillus species 707 alpha - only suitable range that does not affect amylase or variant inactivation thereof (Bacillus sp.). 界面活性剤は脂肪アルコール硫酸塩、モノグルセリドスルホン酸塩又は10から20炭素原子を有する脂肪酸、脂肪酸アルブミン濃縮産物、脂肪酸アミド及びタウリンの塩及び/又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩を含む。 Surfactants include fatty alcohol sulfates, fatty acids having from mono-glyceryl de sulfonate or 10 20 carbon atoms, fatty acid albumin condensation products, salts of fatty acid amides and fatty acid esters of salts and / or isethionate of taurine.

適切な甘味料は製剤に用いるサッカリンを含む。 Suitable sweeteners include saccharin for use in the formulation.

通常スペアミントのような香味料は重量で約0.01%から約5%特に約0.1%から約5%のような低い量で存在する。 Flavorings such as a conventional spearmint present in low amounts, such as from about 5% to about 5%, especially about 0.1% to about 0.01% by weight. ホワイトニング/漂白剤はH を含み最終製品の重量で計算して約5%以下又は約0.25%から4%の量で添加してよい。 Whitening / bleaching agents may be added in an amount of about 5% or about 0.25% 4% calculated on the weight of the final product comprises a H 2 O 2. ホワイトニング/漂白剤はオキシドレダクターゼのような酵素でよい。 Whitening / bleaching agents may be an enzyme such as oxidoreductase. 適切な漂白酵素の例はWO 97/06775に記載のものである。 Examples of suitable bleaching enzymes are those described in WO 97/06775.

通常水は例えば、練り歯磨きのように流動性を有する形態を与える量を加える。 Usually water, for example, added in an amount to provide a form having a fluidity as toothpaste.
さらに、水溶性抗菌剤、例えばクロロヘキシジン ジグルコネート(chlorohexidine digluconate)、ヘキセチジン(hexetidine)、アレキシジン(alexidine)、トリクロサン(商標)(Triclosan(商標))、第4級アンモニウム抗菌剤化合物であり、特定の金属イオンの水溶性供給源、例えば、亜鉛、銅、銀、及びスズ(例えば、塩化亜鉛、塩化銅及び塩化スズ、及び硝酸銀)も含んでよい。 Further, water-soluble antimicrobial agents, such as chlorhexidine digluconate (chlorohexidine digluconate), hexetidine (Hexetidine), alexidine (Alexidine), triclosan (TM) (Triclosan (TM)), a quaternary ammonium antimicrobial compounds, specific metal ions water-soluble sources, for example, zinc, copper, silver, and tin (e.g., zinc chloride, copper and tin chloride, and silver nitrate) may also be included.

また、フッ化物供給源、染料/着色剤、保存剤、ビタミン剤、pH調整剤、虫歯予防剤、除痛剤などとして用いることができる化合物の添加を含む。 Also includes a fluoride source, dyes / colorants, preservatives, vitamins, pH-adjusting agents, anticaries agents, the addition of compounds which can be used as such as desensitizing agents.

口腔の洗浄に用いる場合、バイオフィルム分解酵素はいくつかの利点を有する。 When used for cleaning of the oral cavity, biofilm degrading enzymes has several advantages. プロテアーゼは歯の表面に吸着し、菌幕を形成し、プラークに至る最初の層である唾液蛋白質を分解する。 Protease adsorbed to the tooth surface, to form a fungus curtain, degrade salivary proteins which is the first layer that leads to plaque. リパーゼを伴うプロテアーゼは微生物の細胞壁及び細胞膜の構造成分を作る蛋白質及び脂質を溶かすことにより、微生物を分解する。 Protease with lipase by dissolving proteins and lipids making structural components of the cell walls and cell membranes of microorganisms, degrade microorganisms.

デキストラナーゼ及び他のカルボヒドラーゼ、例えば2,6‐β−D−フルクタンヒドロラーゼ(2,6‐β−D−fructan hydrolase)は微生物の接着マトリックスを形成する微生物により生産される有機骨格構造を分解する。 Dextranase and other carbohydrases, such as 2, 6-beta-D-fructan hydrolase (2,6-β-D-fructan hydrolase) degrades organic framework produced by microorganisms form an adhesive matrix of microorganisms . プロテアーゼ及びアミラーゼはプラーク形成を防ぐだけでなく、石化の防止、つまり、カルシウムに結合する炭水化物蛋白質を分解することにより歯石形成も防ぐ。 Protease and amylase are not only prevents plaque formation, prevention of petrochemical, i.e., also calculus formed by decomposing carbohydrates proteins that bind to calcium prevent.

練り歯磨きは一般的に次の成分(最終練り歯磨き組成物の重量%中)を含んでよい。 Toothpaste typically may comprise the following ingredients (in weight% of the final toothpaste composition). それは、研磨剤約70%まで、保湿剤0%から約80%、増粘剤約0.1%から約20%、バインダー約0.01%から約10%、甘味料約0.1%から約5%、発泡剤0%から約15%、増白剤0%から約5%及び酵素約0.0001%から約20%である。 It up to about 70% abrasive, 80% 0% humectant, from about 20% to about 0.1% thickener, from about 0.01% to about 10% binder, from about 0.1% sweetener about 5% to about 15% 0% blowing agent, from about 20% to about 0-5% brightener and enzymes about 0.0001%.

ある実施態様においては、練り歯磨きは約6.0から約8.0の範囲のpHを有してよく、a)研磨剤約10%から約70%、b)保湿剤0%から約80%、c)増粘剤約0.1%から約20%、d)バインダー約0.01%から約10%、e)甘味料約0.1%から約5%、f)発泡剤0%から約15%、g)増白剤0%から約5%i)酵素約0.0001%から約20%を含む。 In some embodiments, toothpaste may have a pH ranging from about 6.0 to about 8.0, a) about 10% to about 70% abrasive, b) a humectant 0% to about 80% , c) a thickening agent from about 0.1% to about 20%, d) from about 0.01% to about 10% binder, e) a sweetener from about 0.1% to about 5%, f) blowing agent 0% about 15%, g) brighteners 0% to about 5% i) enzymatic about 0.0001% to about 20%.

i)で述べた酵素はバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体単独又は2,6‐β−D−フルクタンヒドロラーゼ(2,6‐β−D−fructan hydrolase)のような他のバイオフィルム分解酵素及び練り歯磨き及びその類似物に用いるものとして知られる上記酵素の他の任意のタイプとの組み合わせを含む。 Enzyme Bacillus species mentioned in i) (Bacillus sp) 707 No. alpha -., Such as amylase or variant thereof alone or 2,6-β-D- fructan hydrolase (2,6-β-D-fructan hydrolase) comprising a combination of any other type of the enzyme known as those used in other biofilm degrading enzymes and toothpaste and the like.

一般的に口腔洗浄は次の成分(最終口腔洗浄組成物の重量中)を含む。 Generally mouthwash contain the following ingredients (in weight of the final oral cleaning compositions). それは保湿剤0%から約20%、界面活性剤0%から約2%、酵素0%から約5%、エタノール0%から20%、他の成分(例えば、香味料、甘味料、フッ化物のような活性成分)0%から約2%である。 It about 20% 0% humectant, about 2% 0% surfactant, from 0% enzymatic about 5%, ethanol 0% to 20% other ingredients (e.g., flavors, sweeteners, fluorides active ingredients such as) is from 0% to about 2%. また、組成物は約0%から約70%の水を含んでよい。 Further, the composition may comprise from about 0% to about 70% water.

口腔洗浄組成物はクエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウムのような適切な緩衝液で約6.0から約7.5のpH範囲に調整されてよい。 Oral cleaning compositions may be adjusted to a suitable pH ranging from about 6.0 to about 7.5 with a buffer such as sodium phosphate or sodium phosphate citrate. 口腔洗浄は非希釈形態で使用してよい(言い換えると、使用前に希釈してよい。) May be used in the oral cleaning undiluted form (in other words, it may be diluted before use.)
オーラルケア組成物はオーラルケアの任意の周知技術を用いて生産されてよい。 Oral care compositions may be produced using any known art oral care.

9. 9. デンプンプロセス組成物及び使用 Starch process compositions and uses
他の実施態様においては、開示するバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はデンプン液化又は糖化に用いてよい。 In another embodiment, Bacillus species disclosed 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be used in starch liquefaction or saccharification.

ある実施態様は、デンプンから甘味料を生産するための組成物使用及び組成物を含む。 Some embodiments include compositions uses and compositions to produce sweeteners from starch. デンプンをフルクトースシロップへ転換する「伝統的な」プロセスは通常3つの連続的酵素プロセスからなり、つまり、液化プロセス、引き続き、糖化プロセス、及び異性化プロセスからなる。 The "traditional" process for conversion of starch to fructose syrups made from the usual three consecutive enzymatic processes, that is, the liquefaction process, subsequently, consisting saccharification process, and an isomerization process. 液化プロセスの間、デンプンは約2時間の間約5.5と約6.2の間のpHの値及び約95℃から約160℃の温度でバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体によりデキストリンに分解される。 During the liquefaction process, starch is Bacillus species at pH values ​​and about 95 ° C. to about 160 ° C. temperature of between about 5.5 for about 2 hours to about 6.2 707 alpha (Bacillus sp.) - Amylase or it is degraded to dextrins by variants thereof. これらの条件下最適酵素安定性を評価するために、1mMのカルシウムを加える(40ppm遊離カルシウムイオン)。 To assess these conditions optimal enzyme stability, adding calcium of 1 mM (40 ppm free calcium ions). デンプンプロセスはアルコール(例えば、燃料用の穀物液状化及び飲料アルコール、アルコール醸造)、甘味料生産用のデンプン液状化、サトウキビプロセス、及びデンプンプロセスをゴールとする他の関連食品を生産するのに有用である。 Starch process alcohol (e.g., cereal liquefaction and drinking alcohol for fuel, alcohol brewing), starch liquefaction for sweetener production, useful for producing sugar cane process, and other related food and after a starch process it is. 異なるバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体には他の条件を用いることができる。 Different Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - The amylase or variant thereof may be employed other conditions.

液化プロセス後、デキストリンはグルコアミラーゼ(例、AMG(商標))及びイソアミラーゼ又はプルラナーゼ(例、Promozyme(商標))のような脱分岐酵素の添加によりデキストロースへ転換する。 After the liquefaction process, dextrin converted into dextrose by addition of a debranching enzyme, such as glucoamylase (e.g., AMG (TM)) and isoamylase or pullulanase (eg, Promozyme (TM)). この段階の前に、pHは約4.5以下の値に下げられ、高温(95℃以上)に維持され、液化バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の活性は変性される。 Before this stage, pH is lowered to about 4.5 or less of the value is maintained at a high temperature (95 ° C. or higher), liquefied Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or activity of the mutants modified It is. 温度を60℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分岐酵素を加える。 The temperature was lowered to 60 ° C., is added a glucoamylase and a debranching enzyme. 一般的に糖化プロセスは約24時間から約72時間で行う。 Generally saccharification process is carried out at from about 24 hours to about 72 hours.

糖化プロセスの後、pHを約6.0から約8.0の範囲の値、例えば、pH7.5に上げ、カルシウムをイオン交換により除去する。 After the saccharification process, the value in the range of about 6.0 to about 8.0 pH, e.g., up to pH 7.5, and the calcium is removed by ion exchange. デキストロースシロップをそれから例えば、固定化グルコースイソメラーゼ(Sweetzyme(商標)のような)を用いてフルクトースシロップに転換する。 The dextrose syrup then for example, converted to fructose syrup using an immobilized glucose isomerase (such as Sweetzyme (TM)).

このプロセスの少なくとも一つの酵素的改善が行われる。 The at least one enzymatic improvement of the process is carried out. 液化バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のカルシウム依存性の低下である。 Liquefied Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - a reduction in the calcium-dependent amylase or variant thereof. 遊離カルシウムの添加がバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の高い安定性を十分に確保するために必要だが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害し、3‐5ppm以下の遊離カルシウムレベルに低減する範囲まで、高価な単位操作手段で除去する必要がある。 Addition of free calcium is Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - It amylase or required in order to sufficiently ensure the high stability of its variants, but free calcium strongly inhibits the activity of glucose isomerase, 3-5 ppm to the extent of reducing the following free calcium level, it is necessary to remove an expensive unit operation means. もし、そのような操作が避けられ、液化プロセスが遊離カルシウムイオンなしで実行できるならば、節約ができる。 If such an operation is avoided, the liquefaction process can be performed without free calcium ions, it is saved.

例えば、少ないカルシウム依存酵素、つまり、低い遊離カルシウム濃度(<40ppm)で安定及び高い活性である酵素は、組成物及び方法に用いることができる。 For example, less calcium-dependent enzyme, i.e., enzyme is stable and highly active at low free calcium concentration (<40 ppm) can be used in the compositions and methods. そのようなバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は約4.5から約6.5の範囲又は、約4.5から約5.5の範囲のpHで最適pHを有する。 Such Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof in the range of about 4.5 to about 6.5 or the pH optimum at a pH in the range from about 4.5 to about 5.5 a.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はデンプン又は多様な目的のための任意のマルトデキストリン含有化合物加水分解のための実験室及び産業用施設で用いてよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be used in laboratory and industrial facilities for any maltodextrine-comprising compound hydrolysis for starch or a variety of purposes. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は特異的活性を提供するために単独で用いてよく、又は活性の広いスペクトルをもつ「カクテル」を提供するために他のアミラーゼと組み合わせて用いてよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof and specific activity may be used alone to provide, or with a broad spectrum of activity of other in order to provide a "cocktail" Amylase it may be used in combination. 一般的な使用は生物製剤、食品、動物用飼料、薬剤製剤、又は産業用試料からデンプン又は任意のマルトデキストリン含有化合物の除去又は一部又は完全な加水分解を含む。 Common uses include biologics, food, animal feed, pharmaceutical formulations, or removal or partial or complete hydrolysis of the industrial sample starch or any maltodextrine-comprising compound.

他の実施態様においては、組成物及び発酵プロセス中にその組成物を用いる方法を含み、酵母のような発酵生物により発酵産物の転換に有用なグルコース及び/又はマルトースを生産するために、デンプン基質がバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体存在下液化及び/又は糖化することである。 In other embodiments include methods of using the compositions in the compositions and fermentation process, in order to produce a useful glucose and / or maltose in the conversion of fermentation product by a fermenting organism, such as yeast, starch substrate there Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - is amylase or variant presence its liquefaction and / or saccharification to be. そのような発酵プロセスは燃料用エタノール又は飲料用エタノール(飲料用アルコール)を生産するプロセス、飲料水を生産するプロセス、所望の有機化合物(例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような)ケトン、アミノ酸(グルタミン酸、モノグルタミンナトリウムのような)だけでなくより複雑な化合物(例えば、ペニシリン、テトラサイクリンのような抗生物質)、酵素、ビタミン(例えば、リボフラビン、ビタミンB 12 、ベータ‐カロテン)及び合成的に生産するのが困難なホルモンも生産するプロセスを含む。 Such fermentation processes are processes for producing ethanol for fuel ethanol or drinking (potable alcohol), a process for producing drinking water, the desired organic compounds (e.g., citric acid, itaconic acid, lactic acid, gluconic acid, gluconic acid sodium, calcium gluconate, potassium gluconate, glucono such as delta-lactone, or sodium erythorbate) ketone, amino acid (glutamic acid, more complex compounds as well, such) as mono-glutamine sodium (e.g., penicillin, tetracycline including carotene) and synthetically challenging hormone to produce also the production process - antibiotics) such as, enzymes, vitamins (e.g., riboflavin, vitamin B 12, beta.

処理されるデンプンは高度に精製されるデンプン品質でよく、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99.5%の純度である。 Starch to be processed may be a starch quality that is highly purified, for example, at least 90%, at least 95%, at least 97%, or at least 99.5% pure. あるいは、デンプンは、麦芽残留及び繊維のような非デンプン分画を有する粉砕全粒穀物を含む材料を含有する未精製デンプンでよい。 Alternatively, the starch may unrefined starch containing material comprising milled whole grain including non-starch fractions such as germ residues and fibers. 全粒穀物のような生原料の構造を破壊し、さらに処理するために、これを粉砕する。 Destroying the raw material of the structure, such as whole grains, for further processing, grinding it. 二つの粉砕プロセスを用いてよい。 It may be used two milling process. それは湿式及び乾式粉砕である。 It is a wet and dry grinding. 粉砕ひき割りトウモロコシのようなひき割りトウモロコシを用いてよい。 It may be used cornmeal such as grinding cornmeal.

乾式粉砕穀物はデンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含む。 Dry grinding grain in addition to the starch, it contains large amounts of non-starch carbohydrate compounds. そのような異種の材料がバシルス種(Bacillus sp.)707g番を用いるジェットクッキングにより処理される場合、しばしば一部のデンプンゼラチン化のみしか行われない。 Such materials are Bacillus species heterologous (Bacillus sp.) When treated by jet cooking using the number 707 g, not often performed only a portion of the starch gelatinization only. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は非ゼラチン化デンプンへの高い活性を有するので、乾式粉砕デンプンをジェットクッキング処理する液化及び/又は糖化を含むプロセスに積極的に適用してよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - Since amylase or variant thereof has a high activity to non-gelatinized starch, actively applied to a process comprising liquefaction and / or saccharification dry grinding starch processing jet cooked it may be.

さらに、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の優れた加水分解活性のより、糖化段階の間グルコアミラーゼの必要性が大幅に低減する。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - more excellent hydrolytic activity of amylase or variant thereof, the need for between glucoamylase saccharification step is greatly reduced. これにより低いグルコアミラーゼ活性で糖化を実施することができる。 This allows saccharification to be performed at a low glucoamylase activity. グルコアミラーゼ活性は無いか、もし存在するならば0.5AGU/gDS以下又は未満で、又は0.4AGU/gDS以下又は未満で、0.3AGU/gDS以下又は未満で、0.1AGU/gDS未満で、デンプン基質の0.05AGU/gDS以下又は未満のような量で存在する。 Glucoamylase or activity is not, if at if it 0.5AGU / gDS less or less present or 0.4AGU / gDS below or less, in 0.3AGU / gDS less or less, less than 0.1AGU / gDS present in an amount such that the following or less 0.05AGU / gDS of starch substrate. 「DS」は乾燥固体基質の一グラム当たりに加える酵素の単位である。 "DS" is the unit of enzyme added to one gram of dry solid substrate. ミリグラム酵素蛋白質(mg enzyme protein)を表現するとき、グルコアミラーゼ活性を有する酵素が約0.5mgEP/gDS以下又は未満、又は約0.4mgEP/gDS以下又は未満、又は約0.3mgEP/gDS以下又は未満、又は約0.1mgEP/gDS(例えば、デンプン基質の約0.05mgEP/gDS以下又は未満又は約0.02mgEP/gDS以下又は未満)以下又は未満の量で存在するか又は全く存在しない。 When expressed milligrams enzyme protein (mg enzyme protein), the enzyme of about 0.5mgEP / gDS less or less having glucoamylase activity, or about 0.4mgEP / gDS less or less, or about 0.3mgEP / gDS less or less than, or about 0.1mgEP / gDS (e.g., about 0.05mgEP / gDS less or less or about 0.02mgEP / gDS less or less of starch substrate) or no present at all present in the following amounts or less. グルコアミラーゼはアスペルギルス種(Aspergillus sp.)、 タラロミセス種(Talaromyces sp.)、パチキトスポラ種(Pachykytospora sp.)、又はトラメテス種(Trametes sp.)内の菌株由来であり、一般的例はアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、タラロミセス エマーソニー(Talaromyces emersonii)、トラメテス シングラタ(Trametes cingulata)、又はパチキトスポラ パピラケア(Pachykytospora papyracea)である。 Glucoamylase Aspergillus species (Aspergillus sp.), Talaromyces species (Talaromyces sp.), Pachikitosupora species (Pachykytospora sp.), Or Trametes species (Trametes sp.) Is derived from strain in the general example is Aspergillus niger (Aspergillus niger), Talaromyces Emasoni (Talaromyces emersonii), Trametes Shingurata (Trametes cingulata), or Pachikitosupora Papirakea (Pachykytospora papyracea).

プロセスはa)アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチド、を含むバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体とデンプン基質を接触させ、b)少なくとも90%、又は少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%w/wの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するのに十分な時間及び温度で、前記酵素と前記デンプン基質をインキュベーションし、c)発酵産物を生産するために発酵し、及びd)任意に発酵産物を回収することを含む。 The process a) alpha - catalytic module and a carbohydrate binding module having an amylase activity, for example, a first aspect of the polypeptides, Bacillus species (Bacillus sp) 707 No. alpha comprising - contacting the amylase or variant thereof and starch substrate. b) at least 90%, or at least 92%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, fermenting the starch substrate of at least 99.5% w / w sugar time and temperature sufficient to convert to, comprising incubating said starch substrate with said enzyme, and fermented to produce c) fermentation product, and d) recovering any fermentation product. b)及び/又はc)段階の間グルコアミラーゼ活性を有する酵素は0.001から2.0AGU/gDS、0.01から1.5AGU/gDS、0.05から1.0AGU/gDS、0.01から0.5AGU/gDSの量で存在するか又は存在しない。 b) and / or c) from 0.001 enzyme having between glucoamylase activity stage 2.0AGU / GDS, 0.01 from 1.5AGU / gDS, 1.0AGU / gDS 0.05, 0.01 from 0.5AGU / gDS of or not present is present in an amount. グルコアミラーゼ活性を有する酵素は0.5AGU/gDS以下又は未満、又は0.4AGU/gDS以下又は未満、0.3AGU/gDS以下又は未満、0.1AGU/gDS(例えば、デンプン基質の0.05AGU/gDS以下又は未満)、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。 Enzyme having glucoamylase activity 0.5AGU / gDS less or less, or 0.4AGU / gDS less or less, 0.3AGU / gDS less or less, 0.1AGU / gDS (e.g., a starch substrate 0.05AGU / gDS less or less), or not present in an amount of less than or less than. ミリグラム酵素蛋白質(mg enzyme protein)を表現する場合、グルコアミラーゼ活性を有する酵素は0.5mgEP/gDS以下又は未満、又は0.4mgEP/gDS以下又は未満、0.3mgEP/gDS以下又は未満、0.1mgEP/gDS(例えば、デンプン基質の0.05mgEP/gDS以下又は未満又は0.02mgEP/gDS以下又は未満)、以下又は未満の量で存在するか又は存在しない。 When expressing milligrams enzyme protein (mg enzyme protein), an enzyme having glucoamylase activity 0.5mgEP / gDS less or less, or 0.4mgEP / gDS less or less, 0.3mgEP / gDS less or less than, 0. 1mgEP / gDS (e.g., 0.05mgEP / gDS less or less or 0.02mgEP / gDS less or less starch substrate), or not present in an amount of less than or less than. プロセスにおいて段階a)、b)c)及び/又はd)は別々に又は同時に実施される。 Step a) in the process, b) c) and / or d) are carried out separately or simultaneously.

別の実施態様においては、プロセスはa)アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現するために形質転換した酵母細胞とデンプン基質を接触させ、b)少なくとも90%w/wの前記デンプン基質を発酵糖へ転換するために十分な時間及び温度で、前記酵素と前記デンプン基質をインキュベーションし、c)エタノールを生産するために発酵し、d)任意にエタノールを回収することを含む。 Yeast transformed to express the amylase or variant thereof - In another embodiment, the process a) alpha - Bacillus species (Bacillus sp) 707 No. alpha containing the catalyst module and a carbohydrate binding module having an amylase activity. contacting the cell with starch substrate, b) a time and at a temperature sufficient to convert the starch substrate of at least 90% w / w to fermentor, and incubating said starch substrate with said enzyme, c) produce ethanol fermenting to, and recovering ethanol d) optionally. a)、b)及びc)段階は、別に又は同時に実施される。 a), b) and c) are carried out separately or simultaneously.

さらに他の実施態様においては、ゼラチン化又は粒状デンプンのスラリーの加水分解を含むプロセス、特に前記粒状デンプンの初期のゼラチン化温度以下の温度で可溶性デンプン加水分解物へ粒状デンプンを加水分解するプロセスである。 In yet another embodiment, the process comprising a slurry of hydrolysis of gelatinized or granular starch, a granular starch hydrolyzing processes, especially in the initial gelatinization temperature below the temperature of said granular starch to soluble starch hydrolyzate is there. さらに、アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒モジュール及び炭水化物結合モジュールを含むポリペプチドと接触することである。 Furthermore, alpha - is to contact with a polypeptide comprising a catalytic module and a carbohydrate binding module having an amylase activity. デンプンを任意の一以上の菌類のアルファ‐アミラーゼ(EC 3.2.1.1)及び一以上のベータ‐アミラーゼ(EC 3.2.1.2)、及びグルコアミラーゼ (EC 3.2.1.3)と接触させてよい。 Alpha any one or more fungi starch - amylase (EC 3.2.1.1) and one or more beta - amylase (EC 3.2.1.2), and glucoamylase (EC 3.2.1 .3) and may be contacted. さらなる実施態様においては、イソアミラーゼ(EC 3.2.1.68)又はプルラナーゼ(EC 3.2.1.41)のような別のデンプン分解酵素又は脱分岐酵素をバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体に追加してよい。 In a further embodiment, isoamylase (EC 3.2.1.68) or pullulanase (EC 3.2.1.41) another amylolytic enzyme or a debranching enzyme Bacillus species such as (Bacillus sp.) 707 [alpha] - may be added to the amylase or variant thereof.

実施態様においては、プロセスは初期ゼラチン化温度以下の温度で実施される。 In embodiments, the process is conducted at an initial gelatinization temperature or lower. そのようなプロセスをしばしば少なくとも約30℃、少なくとも約31℃、少なくとも約32℃、少なくとも約33℃、少なくとも約34℃、少なくとも約35℃、少なくとも約36℃、少なくとも約37℃、少なくとも約38℃、少なくとも約39℃、少なくとも約40℃、少なくとも約41℃、少なくとも約42℃、少なくとも約43℃、少なくとも約44℃、少なくとも約45℃、少なくとも約46℃、少なくとも約47℃、少なくとも約48℃、少なくとも約49℃、少なくとも約50℃、少なくとも約51℃、少なくとも約52℃、少なくとも約53℃、少なくとも約54℃、少なくとも約55℃、少なくとも約56℃、少なくとも約57℃、少なくとも約58℃、少なくとも約59℃、又は少なくとも約60℃で行う。 Such processes often at least about 30 ° C., at least about 31 ° C., at least about 32 ° C., at least about 33 ° C., at least about 34 ° C., at least about 35 ° C., at least about 36 ° C., at least about 37 ° C., at least about 38 ° C. , at least about 39 ° C., at least about 40 ° C., at least about 41 ° C., at least about 42 ° C., at least about 43 ° C., at least about 44 ° C., at least about 45 ° C., at least about 46 ° C., at least about 47 ° C., at least about 48 ° C. , at least about 49 ° C., at least about 50 ° C., at least about 51 ° C., at least about 52 ° C., at least about 53 ° C., at least about 54 ° C., at least about 55 ° C., at least about 56 ° C., at least about 57 ° C., at least about 58 ° C. It carried out at least about 59 ° C., or at least about 60 ° C.. プロセスを実施するpHは約3.0から約7.0、又は約3.5から約6.0、又は約4.0から約5.0でよい。 pH from about 3.0 to about 7.0 to implement the process, or from about 3.5 to about 6.0, or from about 4.0 or about 5.0. ある実施態様は発酵を含むプロセスを意図し、例えば、エタノール生産のための酵母、例えば、30℃から35℃のような約32℃である。 It intended to process certain embodiments, including fermentation, such as yeast for ethanol production, for example, about 32 ° C., such as 35 ° C. from 30 ° C..

別の実施態様においては、プロセスは同時糖化発酵を含み、例えば、エタノール生産のための酵母、又は所望の有機化合物を生産するための別の適切な発酵生物、例えば、30℃から35℃のような約32℃である。 In another embodiment, the process comprises simultaneous saccharification and fermentation, such as yeast for ethanol production, or the desired organic compound another suitable fermentation organism to produce, for example, as 35 ° C. from 30 ° C. such is about 32 ℃.

上記の発酵プロセスにおいて、エタノール含有量は少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%のようなエタノールに達する。 In the above fermentation processes, the ethanol content reaches at least about 7%, at least about 8%, at least about 9%, at least about 10%, about 11%, at least about 12%, at least about 13%, at least about 14%, at least about 15%, is reached in ethanol, such as at least about 16%.

任意の上記実施態様に用いるデンプンスラリーは約20%から約55%乾燥固体粒状デンプン、約25%から約40%乾燥固体粒状デンプン、又は約30%から約35%乾燥固体粒状デンプンを有する。 Starch slurry to be used in any of the above embodiments have about 20% to about 55% dry solids granular starch, about 25% to about 40% dry solids granular starch, or about 30% to about 35% dry solids granular starch. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触後、酵素は可溶性デンプンを少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の量の粒状デンプンの可溶性デンプン加水分解物へ転換する。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - After contact with amylase or variant thereof, at least 85% soluble starch enzyme, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, is converted at least 98%, or at least 99% of the amount of granular starch into a soluble starch hydrolyzate.

別の実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体はアルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒部位及び炭水化物結合モジュール、例えば第一態様のポリペプチドを含んでよく、液化プロセス、ゼラチンデンプンの糖化に用いられ、例えば、ジェットクッキングによりゼラチン化を含むが、これに限定さない。 In another embodiment, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant alpha - catalytic site and a carbohydrate binding module having an amylase activity, for example, it may include a first aspect of the polypeptide, liquefied process used in saccharification of gelatin starch, for example, including gelatinized by jet cooking, not limited to this. プロセスは発酵産物、例えばエタノールを生産するための発酵を含む。 The process comprises fermentation products, such as fermentation to produce ethanol. 発酵によりデンプン含有材料からエタノールを生産するためのそのようなプロセスはi)アルファ‐アミラーゼ活性を有する触媒部位及び炭水化物結合モジュール、第一態様のポリペプチド、を含むポリペプチドと前記デンプン含有材料を液化させ、ii)得られる液化マッシュを糖化しiii)発酵生物存在下(ii)段階で得られる材料を発酵することを含む。 Such a process for producing ethanol from starch-containing material by fermentation i) alpha - catalytic site and a carbohydrate binding module having an amylase activity, a first aspect of the polypeptide, the polypeptide and the starch-containing material comprising liquefying is allowed, comprising fermenting saccharifying the liquefied mash ii) obtained iii) material obtained by fermenting organism presence step (ii). さらに、プロセスは任意にエタノールを回収することを含む。 Moreover, the process involves optionally recovering ethanol. 糖化及び発酵プロセスは同時糖化発酵プロセス(SSFプロセス)として行ってよい。 Saccharification and fermentation process may be carried out as a simultaneous saccharification and fermentation process (SSF process). 発酵の間、エタノール含有量は少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%のようなエタノールに達する。 During the fermentation, the ethanol content reaches at least about 7%, at least about 8%, at least about 9%, at least about 10%, about 11%, at least about 12%, at least about 13%, at least about 14%, at least about 15 %, it is reached in ethanol, such as at least about 16%.

上記実施態様のプロセスで処理するデンプンは特に塊茎、根、茎、鞘、穀物又は未精白の穀物から得られる。 Starch to be processed in the process of the above embodiment is particularly tubers, roots, stems, pods, obtained from cereals or not refined grains. より具体的には、粒状デンプンはトウモロコシ、トウモロコシの穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、カッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得られる。 More specifically, the granular starch may be obtained from corns, cobs, wheat, barley, rye, milo, cassava, tapioca, sorghum, rice, peas, beans, obtained from banana, or potatoes. また、トウモロコシ及び大麦のろう様又は非ろう様タイプ両方を含む。 Also includes a waxy or non waxy types both corn and barley.

上述の組成物はゼラチン化デンプン又は粒状デンプン及び一部ゼラチン化デンプンを液化及び/又は糖化するために用いてよい。 Compositions described above may be used to liquefy and / or saccharification gelatinized starch or granular starch and partially gelatinized starch. 部分的ゼラチン化デンプンはある程度ゼラチン化しているデンプンで、言い換えると、デンプン部分が不可逆的に膨張及びゼラチン化し、デンプンの一部がまだ粒状の状態で存在している。 Starch partially gelatinized starch that to some extent gelatinized, in other words, the starch portion is irreversibly expandable and gelatinized, some of the starch are present in a still state of the particulate.

上記組成物は0.01から10.0AFAU/gDS、又は0.1から5.0AFAU/gDS、又は0.5から3.0AFAU/gDS、又は0.3から2.0AFAU/gDSの量で存在する酸性アルファ‐アミラーゼ変異体を含んでよい。 Present in an amount of 2.0AFAU / gDS 10.0AFAU / gDS the composition from 0.01, or from 0.1 5.0AFAU / gDS, or 0.5 from 3.0AFAU / gDS, or from 0.3 acidic alpha - may include amylase variants. 組成物は上記任意のデンプンプロセスに適用してよい。 The composition may be applied to the arbitrary starch process.

本明細書にて用いる用語「液化(Liquefaction)」又は「液化する(liquefy)」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。 The term "liquefaction (Liquefaction)" or "liquefy (liquefy)" as used herein refers to the process of starch is converted to dextrins shorter chain and less viscous. 一般的に、このプロセスはバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と同時に又はその後に添加するデンプンのゼラチン化を含む。 Generally, this process is Bacillus species 707 alpha - containing amylase or gelatinization of the starch to be added simultaneously or subsequently and variants thereof (Bacillus sp.). 追加的な液化導入酵素もまた加えてよい。 Additional liquefaction introducing enzymes, may also be added.

本明細書にて用いる用語「第一液化(primary liquefaction)」はスラリーの温度がそのゼラチン化温度に上昇する又は近づいた場合の液化段階をいう。 As used herein, the term "first liquefied (primary Liquefaction)" refers to the liquefaction stage when the temperature of the slurry is approaching or increases its gelatinization temperature. 温度上昇に引き続き、スラリーは熱交換器又はジェットを通して送られ、200°Fから300°F、例えば220‐235°Fの温度となる。 Following the temperature rise, the slurry is passed through a heat exchanger or jet, 200 ° F from 300 ° F, for example, a temperature of 220-235 ° F. 熱交換器又はジェットに投入に引き続き、スラリーを3‐10分間その温度で維持する。 Following charged into the heat exchanger or jet, the slurry 3-10 minutes and maintained at that temperature. スラリーを200°Fから300°Fに維持するこの段階は第一液化である。 The step of maintaining the slurry from 200 ° F to 300 ° F is the first liquefaction.

本明細書にて用いる用語「第二液化(secondary liquefaction)」は第一液化(200°Fから300°Fに加熱)に引き続く液化段階をいい、このときスラリーは室温に冷やされる。 As used herein, the term "second liquefied (secondary- Liquefaction)" refers to a subsequent liquefaction stage (heated to 300 ° F from 200 ° F) first liquefaction, the slurry at this time is cooled to room temperature. この冷却段階は、30分から180分(3時間)であってよく、例えば90分から120分(2時間)である。 This cooling step can be 30 minutes to 180 minutes (3 hours), for example, 90 minutes to 120 minutes (2 hours).

本明細書にて用いる用語「第二液化の時間(minutes of secondary liquefaction)」は第二液化の開始からDEが測定される時間までの経過する時間をいう。 As used herein, the term "second liquefaction time (minutes of secondary liquefaction)" refers to the time that elapses until time DE is measured from the start of the second liquefied.

他の実施態様においては、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有組成物中のベータ‐アミラーゼのさらなる使用を意味する。 In another embodiment, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - beta amylase or variant-containing composition that - means further use of amylases. ベータ‐アミラーゼ(EC 3.2.1.2)はエキソ作用のマルトジェニックアミラーゼ(maltogenic amylases)であり、アミロース、アミロペクチン、及び関連するグルコースポリマー中の1,4‐α‐グルコシド結合の加水分解を触媒し、それにより、マルトースが放出される。 Beta - amylase (EC 3.2.1.2) is a maltogenic amylase exo action (maltogenic amylases), amylose, amylopectin, and related hydrolysis of l, 4-alpha-glucosidic bonds in glucose polymer catalyzed thereby, maltose is released.

ベータ‐アミラーゼは種々の植物及び微生物(WM Fogarty and CT Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol. 15, pp. 112-115, 1979)から単離される。 Beta - amylases various plants and microorganisms (.. WM Fogarty and CT Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, vol 15, pp 112-115, 1979) isolated from. これらのベータ‐アミラーゼは40℃から65℃の範囲の最適温度及び約4.5から約7.0の範囲の最適pHを有することで特徴付けられる。 These beta - amylases are characterized by having optimum pH optimum temperature and ranges from about 4.5 to about 7.0 in the range of 65 ° C. from 40 ° C.. 考えられるベータ‐アミラーゼはオオムギ由来のベータ‐アミラーゼ、Spezyme(商標)BBA 1500、 Spezyme(商標)DBA、Optimalt(商標)ME、Optimal(商標)BBA(Genencor International Inc.)及びNovozym(商標)WBA(Novozymes A/S)を含むがこれらに限定されない。 It is considered beta - amylase is beta derived from barley - amylase, Spezyme (TM) BBA 1500, Spezyme (TM) DBA, Optimalt (TM) ME, Optimal (TM) BBA (Genencor International Inc.) and Novozym (TM) WBA ( including Novozymes a / S) are not limited thereto.

組成物に用いるために考えられる別の酵素はグルコアミラーゼ(EC 3.2.1.3)である。 Another enzyme contemplated for use in the composition is a glucoamylase (EC 3.2.1.3). グルコアミラーゼは微生物又は植物由来である。 Glucoamylase is derived from a microorganism or plant. グルコアミラーゼの例は菌類又は細菌由来である。 Examples of glucoamylase is derived from fungi or bacteria. 細菌のグルコアミラーゼの例は、アスペルギルス(Aspergillus)グルコアミラーゼであり、特に、アスペルギルス ニガー(A. niger)G1又はG2グルコアミラーゼ(Boel 他、EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984))又はWO 92/00381及びWO 00/04136に記載のようなその変異体、アスペルギルス アワモリ(A. awamori)グルコアミラーゼ (WO 84/02921)、アスペルギルス オリザエ(A. oryzae)(Agric. Biol. Chem., 55(4): 941-949 (1991))、又はその変異体又はフラグメントである。 Examples of bacterial glucoamylases are Aspergillus (Aspergillus) glucoamylases, in particular, Aspergillus niger (A. niger) G1 or G2 glucoamylase (Boel other, EMBO J. 3 (5): 1097-1102 (1984)) or variants thereof as described in WO 92/00381 and WO 00/04136, Aspergillus awamori (A. awamori) glucoamylase (WO 84/02921), Aspergillus oryzae (A. oryzae) (Agric. Biol. Chem., 55 (4): 941-949 (1991)), or a variant or fragment.

他の考えられるアスペルギルス(Aspergillus)グルコアミラーゼ変異体は熱安定性を増強する変異体を含み、G137A及びG139A(Chen他、Prot. Eng. 9: 499-505 (1996)); D257E及びD293E/Q (Chen他、Prot. Eng. 8: 575-582 (1995)); N182(Chen他、 Biochem. J. 301: 275- 281 (1994));ジスルフィド結合、A246C (Fierobe他、Biochemistry, 35: 8698-8704 (1996))及びA435 and S436 (Li他、Protein Eng. 10: 1199-1204 (1997))位にPro残基の導入である。 Another possible Aspergillus (Aspergillus) glucoamylase variants include variants to enhance the thermal stability, G137A and G139A (Chen other, Prot Eng 9:.. 499-505 (1996)); D257E and D293E / Q (Chen other, Prot Eng 8:.. 575-582 (1995)); N182 (Chen other, Biochem J. 301:. 275- 281 (1994)); disulfide bonds, A246C (Fierobe other, Biochemistry, 35: 8698 -8704 (1996)) and the A435 and S436 (Li other, Protein Eng 10:. 1199-1204 (1997)) is the introduction of Pro residues in position. 他の考えられるグルコアミラーゼはタラロミセス(Talaromyces)グルコアミラーゼ、特に、タラロミセス エマーソニー(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、タラロミセス レイセタヌス(Talaromyces leycettanus) (U.S. Patent No. RE 32,153)、タラロミセス デュポンチ(Talaromyces duponti)、タラロミセス サーモフィリス(Talaromyces thermophilus)(U.S. Patent No. 4,587,215)由来である。 Other possible glucoamylase Talaromyces (Talaromyces) glucoamylase, in particular, Talaromyces Emasoni (Talaromyces emersonii) (WO 99/28448), Talaromyces Reisetanusu (Talaromyces leycettanus) (U.S. Patent No. RE 32,153), Talaromyces Deyuponchi (Talaromyces duponti), Talaromyces thermo Phyllis (Talaromyces thermophilus) (U.S. Patent No. 4,587,215) is derived from. 考えられる細菌由来グルコアミラーゼはクロストリジウム(Clostridium)属由来のグルコアミラーゼであり、特に、クロストリジウム サーモアミロリティカム(C. thermoamylolyticum)(EP 135138)及びクロストリジウム サーモヒドロスルフリカム(C. thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)である。 Considered bacterial glucoamylases are Clostridium (Clostridium) from the genus glucoamylases, in particular, Clostridium thermo Ami Lori tee cam (C. thermoamylolyticum) (EP 135138) and Clostridium thermo hydro sulfurylase cam (C. thermohydrosulfuricum) (WO 86 / 01831) it is. 一般的に、グルコアミラーゼはアスペルギルス オリザエ(Aspergillus oryzae)由来のグルコアミラーゼを含む。 Generally, glucoamylases include Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) derived glucoamylase. また、商業的に入手可能なグルコアミラーゼはAMG 200L、AMG 300 L、SAN(商標)SUPER及びAMG(商標)E(Novozymes)、 OPTIDEX(商標)300(Genencor International, Inc.製)、 AMIGASE(商標)及びAMIGASE(商標)PLUS (DSM)、G‐ZYME(商標)G900(Enzyme Bio‐Systems)、G‐ZYME(商標)G990 ZR(アスペルギルス ニガー(A. niger)グルコアミラーゼ及び低プロテアーゼ含有量)を含む。 Also, commercially available glucoamylase AMG 200L, AMG 300 L, SAN (TM) SUPER and AMG (TM) E (Novozymes), OPTIDEX (TM) 300 (Genencor International, Ltd. Inc.), AMIGASE (TM ) and AMIGASE (TM) PLUS (DSM), G-ZYME (TM) G900 (Enzyme Bio-Systems), G-ZYME (TM) G990 ZR (A. niger (A. niger) glucoamylase and low protease content) including.

グルコアミラーゼを0.02‐2.0AGU/gDS又は0.1‐1.0AGU/gDS例えば、0.2AGU/gDSの量で加えてよい。 Glucoamylase 0.02-2.0AGU / gDS or 0.1-1.0AGU / gDS example, may be added in an amount of 0.2AGU / gDS.

また、追加酵素及び酵素変異体は組成物中に抱合されると考えられる。 Moreover, additional enzymes and enzyme variants are believed to be conjugated in the composition. 一以上のアルファ‐アミラーゼをバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体又に加えて用いてよく、又は本明細書にて記載の他の酵素を含むことができる。 One or more alpha - amylase Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or may use its addition to or variants, or may include other enzymes described herein.

任意に加える別の酵素はイソアミラーゼ(EC 3.2.1.68)又はプルラナーゼ(EC 3.2.1.41)のような脱分岐酵素である。 Another enzyme added at any a debranching enzyme, such as isoamylase (EC 3.2.1.68) or pullulanase (EC 3.2.1.41). イソアミラーゼはアミロペクチン中のα‐1,6‐D‐グルコシド分岐結合を加水分解し、β‐限界デキストリン及びイソアミラーゼがプルランを攻撃できない点及びα‐限界デキストリンに対する作用が限られている点がプルラナーゼと異なる。 Isoamylase hydrolyses alpha-1, 6-D-glucosidic branch linkages in amylopectin, that β- limit dextrins and isoamylase action on points and α- limit dextrins not attack pullulan is limited pullulanases and different. 脱分岐酵素を当業者が周知の効果的な量で加えてよい。 The debranching enzyme skilled person may be added in known effective amounts.

プロセスの生産物の正確な組成は適用酵素の組み合わせや粒状デンプンプロセスのタイプに依存する。 The exact composition of the process of the product depends on the type of combination and granular starch process applied enzyme. 例えば、可溶性加水分解物は少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95.0%、少なくとも約95.5%、少なくとも約96.0%、少なくとも約96.5%、少なくとも約97.0%、少なくとも約97.5%、少なくとも約98.0%、少なくとも約98.5%、少なくとも約99.0%、又は少なくとも約99.5%の純度を有するマルトースでよい。 For example, the soluble hydrolyzate at least about 85%, at least about 90%, at least about 95.0%, at least about 95.5%, at least about 96.0%, at least about 96.5%, at least about 97.0 %, at least about 97.5%, at least about 98.0%, at least about 98.5%, or maltose having at least about 99.0%, or at least about 99.5% pure. あるいは、可溶性デンプン加水分解は、グルコース又は少なくとも約94.5%、少なくとも約95.0%、少なくとも約95.5%、少なくとも約96.0%、少なくとも約96.5%、少なくとも約97.0%、少なくとも約97.5%、少なくとも約98.0%、少なくとも約98.5%、少なくとも約99.0%、又は少なくとも約99.5%のDX(溶解乾燥固体の総量のグルコースの割合)を有するデンプン加水分解物でよい。 Alternatively, the soluble starch hydrolyzate is glucose, or at least about 94.5%, at least about 95.0%, at least about 95.5%, at least about 96.0%, at least about 96.5%, at least about 97.0 %, at least about 97.5%, at least about 98.0%, at least about 98.5%, at least about 99.0%, or (percentage of glucose of the total amount of dissolved dry solids) of at least about 99.5% of the DX or a starch hydrolyzate having a. プロセスは特製シロップである生産物を含むことができ、例えば、アイスクリーム、ケーキ、キャンディー、缶詰のフルーツの製品に用いるためのグルコース、マルトース、DP3、及びDPnの混合物を含む特製シロップである。 The process can include a product which is specially syrups, for example, a special syrup containing ice cream, cakes, candies, glucose for use in products of canned fruit, maltose, DP3, and mixtures DPn.

二つの粉砕プロセスは湿式及び乾式粉砕である。 Two milling processes are wet and dry grinding. 乾式粉砕において、実全体を粉砕し用いる。 In dry grinding, using grinding the actual total. 湿式粉砕は胚芽と粉末(デンプン粒子及び蛋白質)のよい分離をもたらし、若干の例外はあるが、デンプン加水分解物がシロップの生産に用いられる場所で適用できる。 Wet grinding results in a good separation of germ and powder (starch granules and protein), there are some exceptions, it can be applied in places where the starch hydrolyzate is used in production of syrups. 乾式及び湿式粉砕両方ともデンプン処理の周知の技術であり、開示される組成物及び方法に用いるために均等として考えられる。 It is a well known technique Both dry and wet milling the starch processing, considered as equivalents for use in the compositions and methods disclosed. プロセスは限外ろ過システムで行われ、同システムにおいて、未透過の残留物(retentate)は酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物は可溶性で加水分解物である。 The process is performed by ultrafiltration system, in this system, residue retentate (retentate) is an enzyme, is maintained under recirculation in presence of raw starch and water, the permeate is hydrolyzate soluble. 未透過の残留物(retentate)が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物である限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスは前記プロセスと均等であると考える。 Process residue retentate (retentate) is an enzyme, is maintained under recirculation in presence of raw starch and water, the permeate is continuously introducing membrane reactor with ultrafiltration membrane is a hydrolyzate soluble considered is equivalent to the process. また、未透過の残留物(retentate)が酵素、生デンプン及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が可溶性で加水分解物であるマイクロろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。 Furthermore, residues of retentate (retentate) is an enzyme, is maintained under recirculation in presence of raw starch and water, the permeate is continuously introducing membrane reactor with microfiltration membranes is hydrolyzate soluble the process is also considered to be equivalent.

ある点において、プロセスに用いる可溶性加水分解物は、高フルクトーストウモロコシシロップ(HFCS)のような高フルクトースデンプンベースシロップ(HFSS)に転換される。 At some point, the soluble hydrolyzate used in the process is converted into high fructose starch-based syrup, such as high fructose corn syrup (HFCS) (HFSS). この転換はグルコースイソメラーゼを用いて実施され、固体支持体に坦持する固定化グルコースイソメラーゼにより実施される。 This conversion is carried out using glucose isomerase, it is carried out by immobilized glucose isomerase for carrying the solid support. 考えられるイソメラーゼは市販用製品Sweetzyme(商標)IT(Novozymes AJS)、G‐zyme(商標)IMGI及びG‐zyme(商標)G993, Ketomax(商標)G‐zyme(商標)G993(Rhodia)、G‐zyme(商標)G993 liquid、GenSweet(商標)IGI(Genencor International, Inc.)を含む 。 Isomerases considered are commercial products Sweetzyme (TM) IT (Novozymes AJS), G-zyme (TM) IMGI and G-zyme (TM) G993, Ketomax (TM) G-zyme (TM) G993 (Rhodia), G- zyme (TM) G993 liquid, including the GenSweet (trademark) IGI (Genencor International, Inc.).

他の実施態様においては、これらの方法により生産される可溶性デンプン加水分解物を燃料又は飲料用エタノールの生産に用いてよい。 In other embodiments, it may use these soluble starch hydrolyzate produced by the method for the production of ethanol for fuel or beverage. 第三番目の局面のプロセスにおいて、発酵を粒状デンプンスラリーの加水分解へ同時又は別々に/続けて行ってよい。 In the process of the third aspect, fermentation may be performed by simultaneously or separately / continued to hydrolysis of the granular starch slurry. 発酵を加水分解と同時に行う場合、温度は30℃と35℃の間、又は31℃と34℃の間である。 When performing fermentation hydrolysis simultaneously with temperature is between between 30 ° C. and 35 ° C., or 31 ° C. and 34 ° C.. プロセスは未透過の残留物(retentate)が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体を含むエタノールである限外ろ過システムを導入してよい。 The process is maintained residue retentate (retentate) is an enzyme, raw starch, yeast, under recirculation in presence of nutrients and water of the yeast, the permeate is introduced into the ultrafiltration system is ethanol containing liquid it may be. 未透過の残留物(retentate)が酵素、生デンプン、酵母、酵母の栄養成分及び水の存在下再循環条件で維持され、透過物が液体含有エタノールである限外ろ過膜を有する連続的膜反応器を導入するプロセスも均等であると考える。 Retentate residue (retentate) is an enzyme, raw starch, yeast, kept under recirculation in presence of nutrients and water of the yeast, continuous membrane reactor which permeate has an ultrafiltration membrane is a liquid containing ethanol the process of introducing the vessel also considered to be equivalent.

また、プロセスの可溶性デンプン加水分解物は、クエン酸、グルタミン酸1ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタラクトン、又はエリソルビン酸ナトリウムのような発酵産物へ処理デンプンを発酵することを含む発酵産物の生産のために用いてよい。 Further, soluble starch hydrolyzate of the process, citric acid, monosodium glutamate, gluconic acid, sodium gluconate, calcium gluconate, potassium gluconate, glucono delta-lactone, or the fermentation products treated starch such as sodium erythorbate it may be used for the production of fermentation product comprising fermenting a.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体のデンプン分解活性はジャガイモデンプンを基質として用いて検出してよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or amylolytic activity of the variant may be detected using potato starch as substrate. この方法は酵素による修飾ジャガイモデンプンの分解に基づき、反応はヨウ素液を有するデンプン/酵素液のサンプルを混合することにより行う。 This method is based on the decomposition of modified potato starch by the enzyme, the reaction is carried out by mixing samples of the starch / enzyme solution with an iodine solution. 最初黒っぽい青色になり、しかしデンプン分解の間に青色が薄くなり、次第に赤褐色になり、基準となる着色ガラスで比較する。 Is the first dark blue, but the blue becomes thin during the starch degradation, gradually becomes reddish brown, compared with colored glass as a reference.

10 繊維湯通しのための組成物及び方法 10 compositions and methods for the fiber desizing
また、本発明は、一以上のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を用いる布地の処理(例えば、繊維の湯通し)の組成物及び方法を含む。 Further, the present invention may include one or more Bacillus species 707 alpha - includes compositions and methods amylase or treatment of fabrics using variants thereof (e.g., desizing textile) (Bacillus sp.). 酵素は任意の布地処理方法を用いてよく、それは周知技術であり、例えば、US Patent No. 6,077,316を参照願いたい。 Enzymes may use any fabric treatment method, it is a well known technique, for example, want to refer to US Patent No. 6,077,316. 例えば、ある実施態様においては、布地の手触り及び外観が溶液中布地をバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体と接触することを含む方法により改善される。 For example, in some embodiments, feel and appearance of a fabric is Bacillus species in solution fabrics 707 [alpha] - is improved by a method comprising contacting the amylase or variant thereof (Bacillus sp.). ある実施態様においては、布地を加圧下溶液で処理する。 In some embodiments, treating the fabric under pressure solution.

ある実施態様においては、酵素を繊維の製織の間又は後、又は湯通し段階、又は一以上の追加する布地処理段階に適用してよい。 In some embodiments, during or after the enzyme weaving fibers, or desizing stage, or may be applied to the fabric processing steps of adding one or more. 繊維の製織の間、糸に相当な機械的負荷がかかる。 During the weaving of the fiber, considerable mechanical load on the yarn take. 機械織機で製織する前に、伸長強度の増加及び切断防止のために、まかれた毛糸をしばしばサイジングデンプン又はデンプン誘導体でコートする。 Before weaving machine weaving machine, due to increased and cleavage prevent elongation strength, the sown the yarn often coated with sizing starch or starch derivatives. 酵素をこれらのサイジングデンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用する。 The enzyme is applied to remove these sizing starch or starch derivatives. 繊維が織られた後、布地を湯通し段階へ進めてよい。 After the fibers are woven, it may advance the fabric to the blanching stage. これは一以上の布地処理段階を伴う。 This is accompanied by one or more fabric treatment steps. 湯通しは繊維からサイズを除く作用がある。 Blanching has the effect except for the size from the fibers. 製織後、さらに布地を処理する前に相同性及び洗浄効果の結果を評価するためにサイズのコーティングは除かなければならない。 After weaving, it must removed coating sized to evaluate the results of the homology and cleaning effect before further processing the fabric. また、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の作用によりサイズの酵素的加水分解を含む湯通しの方法を提供する。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha - providing blanched method comprising enzymatic hydrolysis of the size by the action of amylase or variant thereof (Bacillus sp.).

酵素を綿素材の布地を含む布地を湯通しするため単独又は他の湯通し用化学試薬及び/又は湯通し用酵素と共に用いてよく、例えば液体組成物中の洗剤添加剤として用いてよい。 Enzymes may be used alone or with other desizing for chemical reagents and / or desizing enzymes to desizing a textile comprising a fabric cotton, for example, it is used as a detergent additive in the liquid composition. また、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をインディゴ染色デニム生地及び衣類に見られるストーンウォッシュを生産する方法に及び組成物として用いてよい。 Furthermore, Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - it may be used as amylase or and compositions in a method of producing a stonewashed seen a variant thereof indigo dyeing denim fabric and garments. 衣類製造のために、布地は衣服及び衣類に裁断及製縫され、その後完成する。 For clothing manufacture, the fabric is cut 及製 sewn into clothing and garments, and then completed. 特に、デニムのジーンズの製造のために異なる酵素的仕上げ方法が開発されている。 In particular, enzymatic finishing methods that are different for the production of denim jeans have been developed. 衣類がデンプン分解酵素の作用を受けている間布地に柔軟性を与え、綿が次の酵素仕上げ段階をより受けやすくするためにデニム衣類の仕上げは通常酵素的湯通し段階で始まる。 Garment provides flexibility while the fabric undergoing the action of amylolytic enzymes, finishing denim garments in order cotton is more susceptible to subsequent enzymatic finishing steps begins with normal enzymatic desizing step. 酵素をデニム衣類の仕上げ(例えば、「バイオ‐ストーン処理(bio‐stoning process)、酵素的湯通し及び布地に柔軟性を与え、及び/又はプロセスの仕上げに用いてよい。アミラーゼの用量はプロセスのタイプで決まり多様である。小用量は大用量の同じ酵素より時間が必要となる。しかしながら、溶液の物理的制約条件によって示す量以外に湯通しアミラーゼ含有量に上限はない。すなわち、酵素の限界量は溶液の溶解できる量でよい。一般的に、アルファ‐アミラーゼのような湯通し酵素は、布地の重量で酵素蛋白質の約0.00001%から約2%の量、又は布地の重量で酵素蛋白質の約0.0001%から約1%の量、又は布地の重量で酵素蛋白質の約0.001%から約0.5%の量で処理組成物に取り込ま Enzymes denim garment finishing (e.g., "Bio -. Stone treatment (bio-stoning process), provides flexibility in enzymatic desizing and fabrics, and / or may be used in the finishing process dose of amylase type of process in rule it is diverse. small doses will be required more time than the same enzyme in large doses. However, there is no upper limit to the desizing amylase content other than that shown by the physical constraints of the solution. that is, the limit amount of enzyme . the amount may generally be capable of dissolving the solution, alpha - desizing enzymes, such as amylases, approximately enzyme protein by weight of the fabric amount from about 0.00001% to about 2% of enzyme protein, or by weight of the fabric taken from 0.0001% to about 1% of the amount, or weight of the fabric in an amount from about 0.001% to about 0.5% enzyme protein treatment composition れるし、他の実施例では布地の重量で酵素蛋白質の約0.01%から約0.2%の量である。 It is, in other embodiments an amount of about 0.01% to about 0.2% enzyme protein by weight of the fabric.

11 焼成及び食品の調製のための組成物及び方法 11 compositions and methods for baking and food preparation
穀粉を焼成及び食品調製ための商業用及び家庭用に使用するには、穀粉中のアルファ‐アミラーゼ活性の適切なレベルを維持することは重要である。 To use flour for commercial and household for baked and food preparation, alpha in the flour - It is important to maintain an appropriate level of amylase activity. あまりに高い活性のレベルは粘性が高く及び/又はたるんだ及び商品にならない製品をもたらすが、不十分なアルファ‐アミラーゼ活性を有する穀粉は適切な酵母機能のための十分な糖を含有せず、その結果乾燥したもろいパンとなる。 Although the level of too high activity results in a product that does not become the high and / or sagging and product viscosity, insufficient alpha - flour having an amylase activity does not contain enough sugar for proper yeast function, its resulting dry, crumbly bread. 穀粉中の内因性アルファ‐アミラーゼ活性のレベルを増加するためにアルファ‐アミラーゼをバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の形態で穀粉に添加してよい。 Bacillus species amylase 707 alpha - alpha in order to increase the level of amylase activity - endogenous alpha in flour (Bacillus sp.) - may be added to flour in the form of amylase or variant thereof. それゆえ、穀粉サンプル中の内因性の(天然の)及び菌類両者のアルファ‐アミラーゼ又は他のアルファ‐アミラーゼの活性のレベルを決定する能力は食品生産プロセスに利益を与え及び食品生産における穀粉のより効率的な使用を促進する。 Therefore, flour samples in endogenous (natural) and fungal both alpha - amylase or other alpha - the ability to determine the level of amylase activity more flour in giving and food production benefits to the food production process to promote the efficient use.

焼成における穀物及び他の植物製品の使用に加えて、オオムギ、オートムギ、小麦、のような穀物や、トウモロコシ、ホップ、及び米のような植物成分は産業用及び家庭用醸造両方の醸造のために用いる。 In addition to the use of grains and other plant products in baking, barley, oats, wheat, grains and as corn, hops, and plant components such as rice for industrial and domestic brewing both brewing used. 醸造にもちいる組成物は麦芽未処理又は麦芽処理されてよく、これは部分的発芽がアルファ‐アミラーゼ含有酵素のレベルを増加をもたらすことを意味する。 Composition used in brewing may be malted untreated or malted, which partially germinated alpha - means to bring increasing the level of amylase-containing enzyme. 連続醸造のために、十分なアルファ‐アミラーゼ酵素活性が発酵のための適切な糖のレベルを確保するのに必要である。 For continuous brewing, adequate alpha - amylase enzyme activity is necessary to ensure the appropriate level of sugars for fermentation.

本明細書にて用いる用語「穀粉(flour)」は粉砕又は製粉された穀物をいう。 As used herein, the term "flour (flour)" refers to a pulverized or milled grain. また、用語「穀粉(flour)」は、粉砕又はつぶされたサゴ又は塊茎産物を意味する。 Also, the term "flour (flour)" means ground or collapsed Sago or tuber products. ある実施態様においては、また、穀粉はさらに、粉砕またはつぶされた穀物または植物以外の成分を含んでよい。 In certain embodiments, also, flour may further comprise a ground or mashed cereal or components other than plants. 追加的成分の例はパン種剤であるが、これに限定されない。 Examples of additional components are leaven agent, but is not limited thereto. 穀類は、小麦、オートムギ、ライ麦、及びオオムギを含む。 Cereals, including wheat, oats, rye, and barley. 塊茎産物はタピオカ粉、キャッサバ粉、及びカスタード粉を含む。 Tuber products include tapioca flour, cassava flour, and custard powder. また、用語「穀粉(flour)」は粉砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粒ミール粉、セルフライジングフラワー、タピオカ粉、キャッサバ粉、粉砕米、補強粉、及びカスタード粉を含む。 In addition, including the terms "flour (flour)" is ground corn flour, corn meal, rice flour, whole grain meal flour, self-rising flour, tapioca flour, cassava flour, ground rice, reinforced flour, and custard powder.

本明細書にて用いる、「原料(stock)」は粉砕又は破壊された穀物及び植物成分をいう。 As used herein, "raw material (stock)" refers to a pulverized or broken grains and plant components. 例えば、ビール生産で用いるオオムギは発酵用につぶしたものを生産するのにふさわしい濃度を生産するために荒く粉砕又はつぶした穀物である。 For example, barley used in beer production is coarsely ground or crushed cereal to produce a concentration suitable to produce those mashed fermentation. 本明細書にて用いる用語「原料(stock)」はつぶされ又は荒く粉砕した形態の植物及び穀物の任意の前述のタイプを含む。 As used herein, the term "raw material (stock)" includes the type of any of the foregoing plants and cereal crushed or coarsely ground forms. 本明細書にて述べる方法は穀粉中又はつぶされた穀物、塊茎、及び他の植物産物の前述するタイプを含む原料中のアルファ‐アミラーゼ活性レベルを検出するために用いてよい。 The methods described herein are alpha in the feed, including the type of the aforementioned flour in or mashed cereal, tubers, and other plant products - may be used to detect the amylase activity levels.

また、本発明は穀粉及び穀物又は塊茎産物及び原料中のアルファ‐アミラーゼ活性を測定する方法を開示する。 Further, the present invention is alpha flour and grain or tuber products and in raw materials - discloses a method for measuring amylase activity. 本明細書にて用いる用語「アルファ‐アミラーゼ(α‐amylase)」は内因性のアルファ‐アミラーゼ(穀粉又は原料に存在する)または穀粉又は原料に添加するバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をいう。 As used herein, the term "alpha - amylase (alpha-amylase)" endogenous alpha - (. Bacillus sp) amylase (present in cereal flour or ingredient) or Bacillus species to be added to flour or raw material 707 [alpha - It refers to an amylase or a variant thereof.

劣化を防ぐためにバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は単独にまたは他のアミラーゼとの組み合わせで添加してよい。 Bacillus species In order to prevent degradation 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof may be added in combination with either alone or in other amylases. 抗劣化アミラーゼはパン製品の劣化(内部硬化)に関して効果的な任意のアミラーゼである。 Anti-staling amylase is an effective optional amylase respect of bakery products staling (curing).

アミラーゼはデンプン存在下例えば30−90℃、50−80℃、55−75℃、60−70℃の範囲の最適温度を有してよい。 Amylase presence for example 30-90 ° C. starch, 50-80 ℃, 55-75 ℃, may have a temperature optimum in the range of 60-70 ° C.. 最適温度はpH5.5で可溶性デンプン1%溶液中にて測定される。 Optimum temperature is measured by soluble starch 1% solution at pH 5.5.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼと組み合わせて用いる追加的抗劣化アミラーゼは例えば、バシルス(Bacillus)由来細菌エンドアミラーゼのような、エンド‐アミラーゼを含む。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - Additional anti-staling amylases used in combination with amylases, for example, such as Bacillus (Bacillus) from bacteria endoamylase end - including amylase. 例えば、さらなるアミラーゼは、例えば、バシルス(Bacillus)由来マルトジェニックアルファ‐アミラーゼ(maltogenic alpha‐amylases)(EC3.2.1.133)でよい。 For example, additional amylase, for example, Bacillus (Bacillus) from the maltogenic alpha - or amylases (maltogenic alpha-amylases) (EC3.2.1.133). Novamyl(商標)は、バシルス ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)菌株NCIB 11837由来のマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ(maltogenic alpha‐amylases)及びC. Christophersen他1997 Starch 50(1): 39-45に記載される。 Novamyl (TM), Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus) strain NCIB 11837 derived from the maltogenic alpha - amylase (maltogenic alpha-amylases) and C. Christophersen other 1997 Starch 50 (1): 39-45 is described in the that.

抗劣化エンドアミラーゼの他の例はバシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)又はバシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)のようなバシルス(Bacillus)由来の細菌類のアルファ‐アミラーゼを含む。 Other examples of anti-staling end amylase Bacillus licheniformis (B. licheniformis) or Bacillus amyloliquefaciens bacteria from Bacillus (Bacillus), such as (B. amyloliquefaciens) alpha - including amylase.

抗劣化アミラーゼは例えば、植物(例えば大豆)又は微生物由来(例えば、バシルス(Bacillus))のベータ‐アミラーゼのようなエキソアミラーゼである。 Anti-staling amylase, for example, beta plants (e.g. soybean) or microbial origin (e.g., Bacillus (Bacillus)) - is a exoamylase, such as amylase.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼはパン製品の劣化(内部硬化)を遅延するために効果的な量で単独に又は他のアミラーゼとの組み合わせで添加してよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase may be added in combination with either alone or in other amylases in an amount effective to delay the bread product staling (curing). 一般的に抗劣化アミラーゼは穀粉1kgあたり0.01−10mgの酵素蛋白質の範囲でよく、例えば、1−10mg/kgである。 Generally anti-staling amylase may range from enzyme protein 0.01-10mg per flour 1 kg, for example, 1-10 mg / kg.

バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼを含む焼成組成物は、さらにフォスフォリパーゼを含んでよい。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - calcined composition comprising amylase may further comprise a phospholipase. フォスフォリパーゼはリン脂質又は溶解リン脂質から脂肪酸を除去するためにA 又はA 活性を有する。 Phospholipase has A 1 or A 2 activity to remove fatty acid from the phospholipid or dissolved phospholipid. それはリパーゼ活性、言い換えるとトリグリセリドに対する活性を有しても有さなくてもよい。 It lipase activity, it may or may not have activity against other words triglycerides. フォスフォリパーゼは30−90℃の範囲、例えば30−70℃の範囲で最適温度を有してよい。 Phospholipase may have a temperature optimum in the range of range of 30-90 ° C., for example 30-70 ° C.. 添加フォスフォリパーゼは動物由来、例えば、膵臓(例えば、ウシ又はブタ膵臓)、ヘビ毒又はハチ毒由来である。 Added phospholipase animal origin, for example, pancreas (e.g., bovine or porcine pancreas), is derived from snake venom or bee venom. あるいは、フォスフォリパーゼは微生物由来、例えば、糸状菌、酵母又は細菌由来でよく、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属又はその種のアスペルギルス ニガー(A. niger)のような、タマホコリカビ(Dictyostelium)属又はその種のキイロタマホコリカビ(D. discoideum)のような、ムコール(Mucor)属又はその種のムコール ジャバニカス(M. javanicus)、ムコール ムセド(M. mucedo)、ムコール サブチリシムス(M. subtilissimus)のような、ニューロスポラ(Neurospora)属又はその種のニューロスポラ クラッサ(N. crassa)のような、リゾムコール(Rhizomucor)属又はその種のリゾムコール プシラ Alternatively, phospholipase derived from a microorganism, such as filamentous fungi may be derived from yeast or bacteria, for example, such as Aspergillus (Aspergillus) genus or species Aspergillus niger (A. niger), Tamahokorikabi (Dictyostelium) genus or such as species of Dictyostelium discoideum (D. discoideum), Mucor (Mucor) genus or species of Mucor Jabanikasu (M. javanicus), Mucor Musedo (M. mucedo), such as Mucor Sabuchirishimusu (M. subtilissimus) , such as Neurospora (Neurospora) genus or species of Neurospora crassa (N. crassa), Rhizomucor (Rhizomucor) genus or species of Rhizomucor Pushira (R. pusillus)、リゾプス(Rhizopus)属又はその種のリゾプス アルヒズス(R. arrhizus)、リゾプス ジャポニカス(R. japonicus)、リゾプス ストロニファー(R. stolonifer)のような、スクレロティニア(Sclerotinia)属又はその種のスクレロティニア リベルチアナ(S. libertiana)のような、トリコフィトン(Trichophyton)属又はその種のトリコフィトン ルブルム(T. rubrum)のような、ウェトゼリニア(Whetzelinia)属又はその種のウェトゼリニア スクレロチニア(W.sclerotiorum)のような、バシルス(Bacillus)属又はその種のバシルス メガトリウム(B. megaterium)、 (R. pusillus), Rhizopus (Rhizopus) genus or the species of Rhizopus Aruhizusu (R. arrhizus), Rhizopus japonicus (R. japonicus), Rhizopus stroke Nifa (R. stolonifer), such as, sclerotinia (Sclerotinia) such as the genus or species sclerotinia Riberuchiana (S. libertiana), such as Trichophyton (Trichophyton) genus or species of Trichophyton rubrum (T. rubrum), Wetozerinia (Whetzelinia) genus or species Wetozerinia such as Sclerotinia (W.sclerotiorum), Bacillus (Bacillus) genus or the species of Bacillus Mega thorium (B. megaterium), シルス ズブチリス(B. subtilis)のような、サイトロバクター(Citrobacter)属又はその種のサイトロバクター フレウンディイ(C. freundii)のような、エンテロバクター(Enterobacter)属又はその種のエンテロバクター アエロゲネス(E. aerogenes)、エンテロバクター クロアカエ(E. cloacae)のような、エドワージエラ(Edwardsiella)属又はその種のエドワージエラ タルダ(E. tarda)のような、エルウィニア(Erwinia)属又はその種のエルウィニア ヘルビコラ(E. herbicola)のような、エシェリキア(Escherichia)属又はその種の大腸菌(E. coli)のような、クレブシエラ(Klebsiell Such as Sils subtilis (B. subtilis), Citrobacter (Citrobacter) genus, or such as the species of Citrobacter Fureundii (C. freundii), Enterobacter (Enterobacter) genus or the species of Enterobacter aerogenes (E . aerogenes), such as Enterobacter cloacae (E. cloacae), Edowajiera (Edwardsiella), such as the genus or species Edowajiera Taruda (E. tarda), Erwinia (Erwinia) genus or species Erwinia herbicola (E. herbicola), such as, such as Escherichia (Escherichia) genus or the species of Escherichia coli (E. coli), Klebsiella (Klebsiell )属又はその種のクレブシエラニューモニアエ(K. pneumoniae)のような、プロテウス(Proteus)属又はその種のプロテウス ブルガリス(P. vulgaris)のような、プロビデンシア(Providencia)属又はその種のプロビデンシア スチュアーティイ(P. stuartii)のような、サルモネラ(Salmonella)属又はその種のサルモネラティフィムリウム(S. typhimurium)のような、セラチア(Serratia)属又はその種のセラチア リクファシエンス(S. liquefasciens)、セラチア マルセッセンス(S. marcescens)のような、シゲラ(Shigella)属又はその種のシゲラ フレクスネリ(S. flexneri)のような、スト ) Genus, or such as the species of Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), such as Proteus (Proteus) genus or the species Proteus vulgaris (P. vulgaris), Providencia (Providencia) genus or the species of Providencia Stu Atii (P. stuartii), such as, Salmonella (Salmonella) genus or like that kind of Salmonella typhimurium (S. typhimurium), Serratia (Serratia) genus or species Serratia Rikufashiensu (S. liquefasciens ), such as Serratia marcescens (S. marcescens), such as Shigella (Shigella) genus or species of Shigella flexneri (S. flexneri), strike プトミセス(Streptomyces)属又はその種のストレプトミセス バイオラセオルバー(S. violeceoruber)のような、エルシニア(Yersinia)属又はその種のエルシニアエンテロコリティカ(Y. enterocolitica)のような、フザリウム(Fusarium)属又はその種のフザリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(例えば、DSM2672菌株)ようなものでよい。 Putomisesu (Streptomyces), such as the genus or species of Streptomyces bio racemate ol bar (S. violeceoruber), such as Yersinia (Yersinia) genus or species of Yersinia Enterobacter coli Tikka (Y. enterocolitica), Fusarium (Fusarium) genus or species of Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum) (e.g., DSM2672 strain) may be such.

フォスフォリパーゼは焼成後初期の期間、特に、最初の24時間パンのやわらかさを改善する量を加えてよい。 Phospholipase firing after the initial period, in particular, may be added an amount that improves the softness of the first 24-hour bread. フォスフォリパーゼの量は一般的に、穀粉(例えば、0.1−5mg/kg)のkg当たり酵素蛋白質の0.01−10mg又は穀粉(例えば、500−2000LEU/kg)の200−5000LEU/kgの範囲でよい。 Phospholipase amount of lipase is generally, 200-5000LEU / kg of flour (e.g., 0.1-5 mg / kg) 0.01-10 mg or flour per kg enzyme protein (e.g., 500-2000LEU / kg) it may be in the range of. リパーゼ活性を有するフォスフォリパーゼは一般的に20−1000LU/kgの穀粉、特に50−500LU/kgのリパーゼ活性に相当する量を加えてよい。 Phospholipase is generally 20-1000LU / kg of flour with a lipase activity, amounts may be added in particular corresponding to a lipase activity of 50-500LU / kg. 1LU(リパーゼ単位)は乳化剤としてアラビアゴム及び基質としてトリブチリンを有し、pH7.0、30℃で1分当たり1μmol酪酸を放出するために必要な酵素の量として定義される。 1LU (Lipase Unit) has tributyrin as gum arabic and substrates as emulsifier, it is defined as the amount of enzyme required to release 1μmol acid per minute at pH7.0,30 ℃.

一般的にパン生地の組成物は小麦全粒粉又は小麦粉及び/又は他の全粒粉、粉、又はトウモロコシ粉、コーンスターチ、ライ麦の全粒粉、ライ麦の粉、エンバク粉、オートミール、大豆粉、ソルガム全粒粉、ソルガム粉、ジャガイモ全粒粉、ジャガイモ粉又はジャガイモデンプンのようなデンプンを含む。 Generally dough compositions wheat meal or wheat flour and / or other whole grain, flour, or corn flour, cornstarch, rye wholemeal, rye flour, oat flour, oatmeal, soy flour, sorghum whole grain flour, sorghum flour, potato whole grains, including starches such as potato flour or potato starch. パン生地は生、冷凍又は標準的焼成(par‐baked)状態でよい。 Dough raw may be frozen or standard firing (par-baked) state.

通常、パン生地は発酵生地又は発酵されるパン生地である。 Typically, the dough is a bread dough is fermented dough or fermentation. パン生地は種々の方法で発酵され、例えば、重層である化学膨張剤の添加により、又はイースト(パン生地を発酵する)を添加により発酵される。 The dough may be fermented in a variety of ways, for example, by the addition of chemical leavening agents are overlaid, or are fermented by adding yeast (fermenting dough). 例えば、パン生地は例えば市場入手可能なサッカロミセス セレビジアエ(S. cerevisiae)の菌株であるサッカロミセス セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)(パン用イースト)のような適切な酵母培養を添加することにより発酵される。 For example, dough is fermented by adding a suitable yeast culture, such as Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) (yeast for bread) is a strain of example market available Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).

また、パン生地は他の従来よりのパン生地成分、例えば、牛乳粉、グルテン、及び大豆、のような蛋白質、卵(全卵、黄卵、又は卵白)、アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカ−ボンアミド(ADA)又は過硫酸アンモニウムのような酸化剤、L‐システインのようなアミノ酸、糖、塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムのような塩を含む。 Also, dough dough ingredients than other conventional, for example, milk powder, gluten, and soy protein such as egg (whole egg, egg yolk or egg white), ascorbic acid, potassium bromate, potassium iodate, Azojika - including Bon'amido (ADA) or an oxidizing agent such as ammonium persulfate, L- amino acids such as cysteine, sugars, sodium chloride, calcium acetate, sodium sulfate, or a salt such as calcium sulfate.

パン生地は粒状脂肪又はショートニングのような脂肪(トリグリセリド)を含んでよい。 The dough may comprise fat (triglyceride) such as granulated fat or shortening.

さらに、パン生地は、モノ‐又はジグリセリド、モノ‐又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル(diacetyl tartaric acid esters)、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート(polyoxyetliylene stearates)、又は、リゾレシチンのような乳化剤を含むが、乳化剤(任意のリン脂質以外)の添加をしていない生地を利用してよい。 Furthermore, dough, mono - or diglycerides, mono - or diacetyl tartaric acid esters of diglycerides (diacetyl tartaric acid esters), sugar esters of fatty acids, polyglycerol esters, lactic acid esters of monoglycerides of fatty acids, acetic acid esters of monoglycerides, polyoxyethylene stearate rate (polyoxyetliylene stearates), or, including emulsifiers such as lysolecithin may utilize dough that is not the addition of emulsifiers (other than optionally phospholipid).

任意に、追加的な酵素を抗劣化アミラーゼ及びフォスフォリパーゼと共に用いてよい。 Optionally, it may be used an additional enzymes with anti-staling amylase and the phospholipase. 追加的な酵素はアミログルコシダーゼ、ベータ‐アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼのような第二のアミラーゼでよく、又は追加的酵素はペプチダーゼ、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、特に、キシラナーゼ、プロテアーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼであって、例えば、WO 95/00636記載のプロテインジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素(1,4‐アルファ‐グルカン分岐酵素)、4‐アルファ‐グルカノトランスフェラーゼ(デキストリン グリコシルトランスフェラーゼ)又は例えば、ペルオキシダーゼであるオキシドレダクターゼのようなペントサナーゼ、ラッカーゼ、グルコース オキ Additional enzymes are amyloglucosidase, beta - amylase may in a second amylase, such as cyclodextrin glucanotransferase, or the additional enzyme may peptidase, in particular, an exopeptidase, a transglutaminase, a lipase, cellulase, hemicellulase, in particular , xylanase, protease, a protein disulfide isomerase, e.g., a protein disulfide isomerase of WO 95/00636 wherein, glycosyltransferase, branching enzyme (1,4-alpha - glucan branching enzyme), 4-alpha - glucanotransferase (dextrin glycosyltransferase) or, for example, pentosanases, laccase, such as oxidoreductases are peroxidases, glucose Oki ダーゼ、ピラノース オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、L‐アミノ酸オキシダーゼ又は炭水化物オキシダーゼでもよい。 Daze, pyranose oxidase, lipoxygenase, or a L- amino acid oxidase or a carbohydrate oxidase.

追加的酵素は哺乳類及び植物由来や微生物(細菌類、酵母、又は菌類)由来を含む任意の原型に由来するものでよく、従来技術により得られる。 Additional enzymes are mammalian and plant origin or microorganisms (bacteria, yeasts, or fungi) may be those derived from any prototype containing from, obtained by the prior art.

キシラナーゼは微生物由来でよく、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)の菌株、特に、セルロース高分解糸状菌(A. aculeatu)、アスペルギルス ニガー(A. niger)(cf. WO 91/19782)、アスペルギルス アワモリ(A. awamori)(WO 91/18977)、又はアスペルギルス ツビゲンシス(A. tubigensis)(WO 92/01793)、例えばトリコデルマ レーシ(T. reesei)のようなトリコデルマ(Trichoderma)菌株、又は例えばフミコーラ インソレンス(H. insolens)(WO 92/17573)のようなフミコーラ(Humicola)の菌株由来の細菌類又は菌類由来でよい。 Xylanase may be derived from microorganisms, for example, strains of Aspergillus (Aspergillus), in particular, cellulose high decomposition fungi (A. aculeatu), Aspergillus niger (A. niger) (cf. WO 91/19782), Aspergillus awamori (A. awamori) (WO 91/18977), or Aspergillus tubigensis (A. tubigensis) (WO 92/01793), for example, Trichoderma Reshi (Trichoderma (Trichoderma) strain such as T. reesei), or such as Humicola insolens (H. insolens) (WO 92/17573) Humicola be a bacterial or fungal origin from strain of (Humicola), such as. Pentopan(商標)及びNovozym 384(商標)はトリコデルマ レーシ(Trichoderma reesei)から生産される商業的に入手可能なキシラナーゼ調製品である。 Pentopan (TM) and Novozym 384 (TM) are commercially available xylanase preparations produced from Trichoderma Reshi (Trichoderma reesei).

アミログルコシダーゼはアスペルギルス ニガー(A. niger)アミログルコシダーゼ(AMG(商標)のような)でよい。 Amyloglucosidase may be an A. niger (A. niger) amyloglucosidase (AMG (TM), such as a). 他の有用なアミラーゼ製品はGrindamyl(商標)A 1000 又はA 5000 (Grindsted Products製, Denmark)及びAmylase(商標)H 又はAmylase(商標)P (DSM Gist Brocades製, The Netherlands)である。 Other useful amylase products Grindamyl (TM) A 1000 or A 5000 (Grindsted Products Ltd., Denmark) and Amylase (TM) H or Amylase (TM) P (DSM Gist Brocades made, The Netherlands) is.

グルコースオキシダーゼは菌のグルコースオキシダーゼ、特にアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)グルコースオキシダーゼ(Gluzyme(商標)のような)でよい。 Glucose oxidase may be a glucose oxidase bacterial, in particular Aspergillus niger (Aspergillus niger) Glucose oxidase (Gluzyme (TM), such as a).

典型的なプロテアーゼはNeutrase(商標) (Novozymes)及びProtex OxG (Genencor International, Inc.)である。 Typical protease is Neutrase (TM) (Novozymes) and Protex OxG (Genencor International, Inc.).

典型的なリパーゼはサーモミセス(Thermomyces) (フミコーラ(Humicola))、リゾムコール(Rhizomucor), カンジダ(Candid、a)、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾプス(Rhizopus)または シュードモナス(Pseudomonas)菌株由来であり、特にサーモミセス ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus) (フミコーラ ラヌギノサ(Humicola lanuginosa))、リゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)、カンジダ アンタルティカ(Candida antarctica)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、リゾプス デレマー(Rhizopus delemar)又はリゾ Typical lipase thermo Mrs (Thermomyces) (Humicola (Humicola)), Rhizomucor (Rhizomucor), Candida (Candid, a), Aspergillus (Aspergillus), is derived from Rhizopus (Rhizopus) or Pseudomonas (Pseudomonas) strains, in particular thermo Mrs. Ranuginosasu (Thermomyces lanuginosus) (Humicola lanuginosa (Humicola lanuginosa)), Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei), Candida Antartica (Candida antarctica), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Rhizopus delemar (Rhizopus delemar) or lyso ス アルヒズス(R. arrhizus)又はシュードモナス セパシア(Pseudomonas cepacia)由来である。 Scan Aruhizusu (R. arrhizus) or Pseudomonas cepacia (Pseudomonas cepacia) is derived from. 特定の実施態様においては、リパーゼは、WO 88/02775記載のカンジダ アンタルティカ(Candida antarctica)リパーゼA又はリパーゼBでよく、又はリパーゼはEP 238,023記載のリゾムコール ミエヘイ(Rhizomucor miehei)又はEP 305,216記載のフミコーラ ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)又はEP 214,761及びWO 89/01032記載のシュードモナス セパシア(Pseudomonas cepacia)由来でよい。 In certain embodiments, the lipase may be a Candida Antartica (Candida antarctica) Lipase A or Lipase B of WO 88/02775 described, or lipase Rhizomucor miehei (Rhizomucor miehei) of EP 238,023 described or EP 305,216 Humicola according lanuginosa (Humicola lanuginosa), or EP 214,761 and WO 89/01032, wherein the Pseudomonas cepacia (Pseudomonas cepacia) may be derived.

本発明のプロセスは白色、ライト、ダークタイプの如何を問わず、ソフトとクリスピーとを問わず、これらのタイプのパン生地から調製される焼成産物の任意の種類に用いてよい。 The process of the present invention is white, light, regardless of dark type, regardless of the software and crisp, may be used for any kind of baked product prepared from these types of dough. 例えば、一般的に一斤のパン又はロール、フレンチバケットタイプのパン、ピタパン、トルチラス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイクラスト、クリスプパン、蒸しパン、ピザ、及びその類似物の形状のパン(特に、白、全粒又はライ麦パン)である。 For example, generally a loaf of bread or rolls, French bucket type bread, pita bread, Toruchirasu, cakes, pancakes, biscuits, cookies, pie crusts, crisp bread, the shape of steamed bread, pizza and the like pan (in particular, white, whole grain or rye bread) is.

別の実施態様においては、小麦粉とともに抗劣化アミラーゼ、フォスファターゼ及びフォスフォリピッドを一緒に含む予混合中におけるバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用を含む。 In another embodiment, the anti-staling amylase with flour, phosphatase and Bacillus species in the premix containing phosphoryl Rapid with 707 [alpha - involves the use of amylase or variant thereof (Bacillus sp.). 予混合は他のパン生地改善及び/又はパン改善添加剤、例えば、上述の酵素を含む任意の添加剤を含んでよい。 Premixing the other dough improving and / or bread improving additive, for example, it may include optional additives, including the aforementioned enzyme.

別の実施態様においては、パン添加剤として用いるために、抗劣化アミラーゼおよびフォスフォリパーゼを含む酵素調製を提供する。 In another embodiment, for use as a bread additive, providing an enzyme preparation comprising an anti-staling amylase and the phospholipase. 酵素調製は粒状又は凝集粉の形態でよい。 Enzyme preparation may be in the form of granules or agglomerated particles. それは25から500μmの範囲で95%(重量で)の粒子以上を有する分布の狭い分子サイズを有する。 It has a narrow molecular size of distribution with more particles 95% in a range of 25 to 500 [mu] m (by weight).

粒状及び凝集粉は従来の方法により、例えば、流動層造粒において担体にアミラーゼをスプレーすることにより、調製してよい。 Granular and agglomerated powder by conventional methods, for example, by spraying the amylase to a carrier in a fluid bed granulation may be prepared. 担体は適切な粒子サイズを有する粒子の核の集合からなってよい。 Carrier may consist set of core particles having an appropriate particle size. 担体は可溶性又は不溶性でもよく、例えば、塩(NaCl又は硫酸ナトリウムのような)、糖(スクロース又はラクトースのような)、糖アルコール(ソルビトールのような)、デンプン、米、ひき割りトウモロコシ、又は大豆でもよい。 The carrier may be soluble or insoluble, for example, salts (such as NaCl or sodium sulfate), sugar (sucrose or such as lactose), sugar alcohols (such as sorbitol), starch, rice, corn grits, or soy good.

別の実施態様は、バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼの被覆を含む。 Another embodiment is Bacillus species 707 [alpha] - containing coating amylase (Bacillus sp.). アルファ‐アミラーゼ粒子膜を調製するために、下記にさらに詳しく述べるようにすべてのアルファ‐アミラーゼ粒子を懸濁するために十分な量で、酵素を食品用の脂質と接触させる。 Alpha - To prepare amylase particle film, all of the alpha as described in more detail below - in an amount sufficient to suspend the amylase particles, contacting the enzyme with the lipid for food.

本明細書にて用いる食用脂質は、水に溶けないが、炭化水素又はジエチルエーテルのような非極性有機溶剤中に溶ける任意の自然の有機化合物でよい。 Edible lipid used herein includes, but is not soluble in water, may be non-polar any natural organic compounds soluble in an organic solvent such as hydrocarbon or diethyl ether. 用いる食用脂質は飽和又は不飽和の脂肪又は油のいずれかの形態であるトリグリセリドを含むがこれに限定されない。 Edible lipids but are not limited to triglycerides in the form of either fat or oil saturated or unsaturated used. 用いる飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、酪酸(乳脂肪由来)、パルミチン酸(動物及び植物脂肪由来)、及び/又はステアリン酸(動物及び植物脂肪由来)を含むが、これに限定されない。 Examples of fatty acids and combinations thereof which make up the saturated triglycerides used are, butyric (derived from milk fat), palmitic (derived from animal and plant fat), and / or including stearic acid (derived from animal and plant fat), limited to not. 用いる不飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例は、パルミトレイン酸(動物及び植物脂肪由来)、オレイン酸(動物及び植物脂肪由来)、 リノール酸(植物油由来)及び/又はリノール酸(亜麻仁油由来)を含むが、これらに限定されない。 Examples of fatty acids and combinations thereof which make up the unsaturated triglycerides used are palmitoleic acid (derived from animal and vegetable fats), oleic acid (derived from animal and vegetable fats), derived linoleic acid (vegetable oil-derived) and / or linoleic acid (linseed oil ) including, but not limited thereto. 本発明に含まれる他の食用脂質は上述するトリグリセリド由来のモノグリセリド及びジグリセリド、リン脂質及びグリコリピッドを含むが、これらに限定されない。 Other edible lipids contained in the present invention monoglycerides and diglycerides from triglycerides above, including phospholipids and glycolipids, but are not limited to.

液体の形態の食用脂質はアルファ‐アミラーゼ粒子の粉状形態と接触し脂質の材料がアルファ‐アミラーゼ粒子表面の少なくとも大半、例えば100%覆うようにされる。 Edible lipid in the form of a liquid alpha - material in contact with the powdered form of amylase particles lipids alpha - is to cover at least a majority, e.g., 100% of the amylase particle surface. すなわち、各アルファ‐アミラーゼ粒子は個別に脂質に包まれる。 That is, each alpha - amylase particles are enveloped in a lipid individually. 例えば、アルファ‐アミラーゼ粒子のすべて、又は実質的にすべては薄く、連続的な脂質のフィルム膜を有する。 For example, alpha - all amylase particles, or substantially all thin, has a film layer of continuous lipid. これは、まず容器に多量の脂質を注ぎ、それから脂質が各アルファ‐アミラーゼ粒子の表面を全面的に濡らすようにアルファ‐アミラーゼをスラリー化することにより実施される。 This first vessel is poured a large amount of lipid, and then the lipid respective alpha - is carried out by slurrying the amylase - alpha as fully wets the surface of the amylase particles. 短時間の撹拌後、被包されるアルファ‐アミラーゼ粒子は表面に相当量の脂質を有するように覆われる。 Brief After stirring, the alpha is encapsulated - amylase particles are coated so as to have a substantial amount of lipid on the surface. コーティングの厚みは、アルファ‐アミラーゼ粒子が用いる脂質のタイプの選択により及び必要ならば、より厚い膜を構築するためにその操作を繰り返すことにより制御できるように適用できる。 The thickness of the coating, alpha - if the selection of the type of lipids amylase particles used and need be applied so as to be controlled by repeating the operation in order to build a thicker film.

封入輸送粒子の貯蔵、取扱い及び混合はパッケージ混合物の方法により実施できる。 Storage of loaded delivery vehicle, handling and mixing can be carried out by the method of the packaged mix. パッケージ混合物は被包アルファ‐アミラーゼを含むことができる。 Package mixture enveloped alpha - can contain amylase. しかしながら、さらに、パッケージ混合物には製造業者又はパン職人が、必要に応じて、追加的な成分を加えることができる。 In addition, however, the packaged mix manufacturer or baker is optionally may be added to additional components. 被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に取り込み後、職人は製パンのための通常の生産工程を続ける。 Encapsulated alpha - after incorporation in the dough amylase, craftsmen continue the normal production process for bread.

被包されるアルファ‐アミラーゼの有利な効果は2点ある。 Encapsulated the alpha - advantages amylase are two points. 第一に、食用脂質は焼成プロセスの間酵素が熱に不安定な場合酵素を熱変性から保護する。 First, the edible lipid between enzyme firing process protects the case enzyme labile heat from heat denaturation. 続いて、アルファ‐アミラーゼはプルーフィング及び焼成段階の間安定化及び保護されている間に、最終焼成産物中に保護コーティングから放出され、ポリグルカンのグルコシド結合を加水分解する。 Subsequently, the alpha - amylase while being stabilized and protected during the proofing and baking stages, are released from the protective coating in the final baked product, hydrolyzes the glucosidic linkages in polyglucans. また、封入輸送粒子によって焼成産物へ活性酵素の多量な放出ができる。 In addition, it is a large amount release of the active enzyme to calcination product by loaded delivery vehicle. つまり、焼成プロセスに続いて、活性アルファ‐アミラーゼが中和する速度で保護膜から連続的に放出され、それ故、劣化作用の割合が低減できる。 That is, following the baking process, active alpha - amylase is continuously released from the protective film at a rate of neutralization, therefore, possible to reduce the rate of degradation effects.

一般的に、アルファ‐アミラーゼ粒子に適用する脂質の量はアルファ‐アミラーゼの全量の数パーセントから重量の何倍までと多様であり、これは脂質の性質、アルファ‐アミラーゼ粒子の適用方法、処理されるパン生地の組成物、及び関係するパン生地混合操作の激しさで決定される。 Generally, alpha - the amount of lipid applied to amylase particles alpha - are diverse from a few percent of the total amount of amylase to many times the weight, this is the nature of the lipid, alpha - method applied amylase particles, processed dough compositions that, and is determined by the severity of the dough mixing operation involved.

封入輸送粒子(言い換えると、脂質で被覆される酵素)は焼成品の保存期間を延長できる効果的な量で焼成品を調製するために用いる成分を加えてよい。 (In other words, enzymes are coated with lipids) loaded delivery vehicle may added components used to prepare the baked good in an effective amount that can extend the shelf life of baked goods. パン職人は上述のように調製する被包される所望の抗劣化効果を得るために必要なアルファ‐アミラーゼの量を計算する。 Baker alpha required to achieve the desired anti-staling effect encapsulated prepared as described above - to calculate the amount of amylase. 被包されるアルファ‐アミラーゼの必要量を包まれる酵素の濃度に基づき及び具体的な穀粉に対するアルファ‐アミラーゼの割合に基づいて計算する。 Encapsulated the alpha - calculated on the basis of the ratio of the amylase - alpha based on the concentration of enzyme enveloped the required amount of amylase and to the specific flour. 広い範囲の濃度が効果を有するが、上述のように、抗劣化に見られる改善はアルファ‐アミラーゼの濃度に正比例しない。 Although a wide range of concentrations has the effect, as discussed above, improvements found in anti-staling alpha - not directly proportional to the concentration of amylase. アルファ‐アミラーゼの濃度の上記の特定の最小限レベルでは大量の増加があるが、それ以上のレベルではアルファ‐アミラーゼを大量に加えても追加的改善はあまりない。 Alpha - although there is an increase in mass in amylase concentration of the specific minimum level, alpha at higher levels - it is not much large amounts added be additionally improved amylase. 職人による不用意な測定誤差に対してパン職人にある程度の保険を与えるために、特定のパン生産にて実際に用いるアルファ‐アミラーゼ濃度は必要最小限よりかなり高くてよい。 In order to provide a degree of insurance to the baker against inadvertent measurement errors by skilled craftsmen, alpha actually used in a particular bread production - amylase concentration may be much higher than the required minimum. 酵素濃度の最低限度はパン職人が望む最小の抗劣化効果によって決定される。 Minimum of enzyme concentration is determined by the minimum anti-staling effect desired by the baker.

本発明の方法に従って焼成品を調製する典型的な方法は、a)脂質でコートされるアルファ‐アミラーゼ粒子の調製であって、実質的にアルファ‐アミラーゼ粒子の100%がコーティングされ、b)小麦粉を含むパン生地を混合し、c)混合が完全になり混合が終了する前に及び脂質膜がアルファ‐アミラーゼを放出する前に脂質コーティングアルファ‐アミラーゼをパン生地に添加し、d)パン生地をプルーフィングし、e)パン生地を焼いて焼成品を提供することであって、アルファ‐アミラーゼが混合、プルーフィング、及び焼成段階で不活化され、焼成品中にて活性であることを含む。 Exemplary methods of preparing the baked good according to the method of the present invention, alpha is coated with a) lipid - a preparation of amylase particles, substantially alpha - 100% of the amylase particles are coated, b) flour mixing the dough comprising, c) a and a lipid membrane before mixing the mixture becomes fully completed alpha - lipid coated alpha prior to releasing the amylase - was added to the dough amylase, d) the dough was proofing , comprising: providing a baked good baked to e) dough, alpha - amylase mixture, proofing, and is inactivated at the firing step includes a activity in in baked products.

つまり、被包アルファ‐アミラーゼを混合サイクルの最終に近い段階の生地に添加してよい。 That enveloper alpha - may be added to the dough stage close to the final of the mixing cycle amylase. 方法の特徴は、被包アルファ‐アミラーゼをパン生地全体に被包アルファ‐アミラーゼが十分に分布できる混合段階のある時点で添加し、保護膜がアルファ‐アミラーゼ粒子から剥がれる前に混合段階を終了する。 Feature of the method is enveloped alpha - added at some point mix stage amylase can be sufficiently distributed, the protective film is alpha - - Amylase the enveloped alpha entire dough exit the mixing stage prior to peeling from amylase particles. パン生地のタイプ及び体積、混合作用及びスピード次第で、1分から6分以上の間が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地に混合するために必要となるが、平均は2分から4分間である。 Dough type and volume, depending on the mixing action and speed, for more than 1 minute to 6 minutes enveloped alpha - it is necessary to mix the dough amylase with an average of 2 minutes to 4 minutes. つまり、正確な手法を決定するいくつかの変数がある。 In other words, there are a number of variables to determine the exact technique. 第一に、被包アルファ‐アミラーゼの量は十分に被包アルファ‐アミラーゼをパン生地混合全体に拡散させる全量を有さなければならない。 First, it enveloped alpha - must have a total volume to be spread throughout the dough mix amylase - amount of amylase is sufficiently encapsulated alpha. 被包アルファ‐アミラーゼの調製品が高い濃度の場合、被包アルファ‐アミラーゼがパン生地に追加される前に、追加油は予混合物に添加される必要性がある。 For amylase preparations a high density, enveloped alpha - - enveloped alpha before amylase is added to the dough, add oil there is a need to be added to the premix. レシピ及び製法プロセスは具体的な改変が必要とされることがある。 Recipe and preparation process may be required specific modifications. しかしながら、パン生地製品の処方に用いられる25%の油をパン生地に加えずに、ほぼ最終の混合サイクルで添加し、濃縮被包アルファ‐アミラーゼ用の担体として用いる場合に一般的に良い結果がもたらされる。 However, 25% of the oil used in the formulation of the dough product without adding to the dough, almost added to a final mixing cycle, concentrated enveloped alpha - generally a good consequences when used as a carrier for amylase . かなり低脂肪含有量(フレンチスタイルのパンのような)を有するパン又は他の焼成品レシピにおいて、約1%乾燥粉末重量の被包アルファ‐アミラーゼ混合物が被包アルファ‐アミラーゼをパン生地と適切に混合するのに十分であることがわかるが、作用するパーセントの範囲はかなり広く製造設計、最終産物、及び周知の制限よりも個別のパン職人が必要する生産方法に依存する。 In bread or other baked products recipe having a fairly low fat content (such as French-style breads), encapsulation alpha of from about 1% dry powder weight - suitably mixed with a dough amylase - amylase mixture enveloped alpha it can be seen that is sufficient to, the range of percentages acts rather broadly manufacturing design, the final product, and than well-known limit depends on the production method of required individual baker. 第二に、パン生地への混合を仕上げるために混合サイクルを維持する十分な時間をかけて、被包アルファ‐アミラーゼ懸濁液を混合物に添加しなければならないが、過度な機械的作用が被包アルファ‐アミラーゼ粒子の大部分から保護脂質膜をはがす前でなければならない。 Secondly, for a time sufficient to keep the mixing cycle in order to finish the mixture to dough, enveloped alpha - must be added to the mixture amylase suspension, excessive mechanical action encapsulation alpha - it must be before peeling off the protective lipid membrane from a large part of the amylase particles.

他の実施態様においては、細菌のアルファ‐アミラーゼ(BAA)を脂質コーティング酵素粒子に添加してよい。 In other embodiments, the bacterial alpha - amylase (BAA) may be added to the lipid coating enzyme particles. BAAは過度な耐熱性及び完全に焼いたパンの塊中で残留活性を維持するのでパンの粘着性を低減することが知られている。 BAA is known to reduce bread sticky because they retain excessive heat resistance and fully baked mass in the residual activity of the pans. しかしながら、BAAが保護酵素産物に取り込まれる場合、実質的な追加的抗劣化保護が得られ、極めて低いBAAの用量においてさえもかかる保護が得られることが明らかである。 However, if the BAA is incorporated into the protective enzyme product, substantial additional anti-staling protection is obtained, it is clear that according even at doses of very low BAA protection is obtained. 例えば、小麦粉100パウンド当たり150RAU(アミラーゼ単位参照)のBAA用量は効果的である。 For example, BAA dosages of flour 100 pounds per 150RAU (see amylase unit) is effective. ある実施態様においては、約50から2000RAU間のBAAを脂質コーティング酵素産物に加える。 In some embodiments, addition of about 50 BAA between 2000RAU lipid coating enzyme product. この低いBAA用量レベルは、完全に焼けたパンの塊中で酵素が自由にデンプンと接触することを避ける(水蒸気が酵素をそのコーティングから不規則に放出する場合を除く)ために保護コーティング能力を備えており、BAAの消極的な副作用をもたらさずに抗劣化活性の非常に高いレベルを達成するために役立つ。 This low BAA dosage level, the enzyme in chunks of bread completely burnt avoid free to contact with the starch (except when water vapor randomly releases the enzyme from its coating) protective coatings ability to It includes and helps to achieve very high levels of anti-staling activity without causing negative side effects of BAA.

多様な改変及び多様性は本明細書に記載の組成物及び方法であること及びさらに特許請求の範囲から逸脱せずに下記実施例が実証されることは当業者にとって明らかである。 Various modifications and diversity to the following examples without departing from the scope of it and further claims a composition and method described herein is demonstrated will be apparent to those skilled in the art.

実施例1 Example 1
バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼのコドン最適化 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - codon optimization of amylase
合成バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ遺伝子、preLAT−Amy707はGeneArt (Germany)に発注した。 Synthetic Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase gene, preLAT-Amy707 was ordered to GeneArt (Germany). バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ(A. Tsukamoto他、1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 151(1): 25-31)をコードする遺伝子は、pICatH(図4参照)ベクターに組み込まれ、結果としてpICatH−Amy707(oril)を設計する産物を得る (図5参照)。 Bacillus species 707 alpha - amylase (A. Tsukamoto other, 1988 Biochem Biophys Res Commun 151 (1)....: 25-31) (Bacillus sp.) Genes encoding is the pICatH (see FIG. 4) vector integrated to obtain a product designed pICatH-Amy707 the (Oril) as a result (see FIG. 5). pICatHは次の特徴を含む。 pICatH includes the following features. それは、(1)複製(バシルス(Bacillus)複製用ori pE194)由来の温度感受性、(2)ori pBR322 (大腸菌(E. coli)における増幅用)、(3)選択のためのネオマイシン耐性遺伝子、及び(4)選択、染色体組み込み、及びカセット増幅のための天然バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)である。 It (1) replication (Bacillus (Bacillus) duplication ori pE194) from the temperature-sensitive, (2) ori pBR322 (for amplification in E. coli (E. coli)), (3) the neomycin resistance gene for selection, and (4) selection, chromosomal integration, and a natural Bacillus licheniformis for cassette amplification (B. licheniformis) chloramphenicol resistance gene (cat). pICatH−Amy707(oril)をBML780 (cat−、amyL−、spo−、aprL−、endoGluC−のBRA7誘導体)である宿主菌株へ許容状態の温度(37℃)で形質転換した。 pICatH-Amy707 the (oril) BML780 was transformed with a temperature permissive to the host strain is a (cat-, amyL-, spo-, aprL-, BRA7 derivative endoGluC-) (37 ℃). あるネオマイシン耐性(neoR)及びあるクロラムフェニコール耐性(capR)形質転換体を選択し、BML780 (pICatH−Amy707(oril))を構築した。 To select a neomycin resistance (neoR) and certain chloramphenicol resistance (capR) transformants were constructed BML780 (pICatH-Amy707 (oril)). BML780(pICatH−707(ori))のプラスミドをクロラムフェニコール含有TSB(トリプティックソイブロス)培地中非許容状態温度(言い換えると、〜50℃)で菌株を培養することによりバシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)遺伝子上のcat領域に組み換えた。 BML780 (pICatH-707 (ori)) plasmids containing chloramphenicol TSB (Tryptic Soy Broth) medium nonpermissive state temperature (in other words, to 50 ° C.) of Bacillus licheniformis by culturing strains in ( B. licheniformis) was recombined into a cat region on the gene. あるクロラムフェニコール耐性クローンを選択しBML780−pICatH−Amy707(oril)を構築した。 It was constructed certain black select chloramphenicol resistant clones BML780-pICatH-Amy707 (oril). ベクター配列をループアウトするために選択される菌株を抗生物質を含まないで継代して許容状態の温度で培養し、それからあるネオマイシン感受性(neoS 及びcapR)クローンを選択した。 The strain selected for loop-out vector sequences and passaged without antibiotics and incubated at a temperature permissive to select neomycin sensitive (neoS and capR) clone from it. このクローンにおける染色体上pICatHのベクター配列が切除され、ネオマイシン耐性遺伝子を含み、Amy707−catカセットのみ放出する。 Vector sequence on the chromosome pICatH is excised in this clone, containing a neomycin resistance gene, to release only the Amy707-cat cassette. 用いるcat遺伝子は天然バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)遺伝子であり、Amy707遺伝子は宿主に導入される唯一異種のDNA断片であることに注意されたい。 cat gene used is a native Bacillus licheniformis (B. licheniformis) gene, it should be noted that Amy707 gene is a DNA fragment of only heterologous introduced into the host.

次に染色体上のAmy707−catカセットをクロラムフェニコールの濃度を増加する(言い換えると、5、25、50、及び75μg/mLクロラムフェニコール)状態でTSB培地にて菌株を培養することにより増幅した。 Then the Amy707-cat cassette on the chromosome increasing concentrations of chloramphenicol (in other words, 5,25,50, and 75 [mu] g / mL chloramphenicol) by culturing the strain in a state in TSB medium amplified. 多くの回数の増幅後、二個のクローンが選択(75μg/mLクロラムフェニコールに対する耐性及び可溶性デンプン含有ハートインフィージョン寒天プレート上に培養の際ヨウ素染色後最も大きなハローを形成する)された。 After amplification of the number of times, two clones were selected (to form iodide Motosome Irogo largest halos when cultured in 75 [mu] g / mL chloramphenicol for resistance and soluble starch contained Heart fee John agar plates) . それは、BML780−Amy707−CAP75クローン1及びクローン2である。 It is BML780-Amy707-CAP75 clone 1 and clone 2. 両菌株はデンプン寒天プレート上に大きなハローを形成する。 Both strains form large halos on starch agar plates.

実施例2 Example 2
バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼの精製 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - purification of amylase
BML780−Amy707−CAP75で形質転換する細胞を周知技術を用いて発酵した。 In BML780-Amy707-CAP75 it was fermented using a cell known techniques for transforming. 細胞を培養培地から分離し、UFCを得るために培地をMillipore prep scale TFF−6 10K分子量カットオフ(MWCO)UF膜カートリッジ(Millipore Corp., Bedford, MA; Cat. No. CDUF 006 TG)を用いて濃縮した。 Cells were separated from the culture medium, the medium in order to obtain the UFC Millipore prep scale TFF-6 10K molecular weight cutoff (MWCO) UF membrane cartridge; a (Millipore Corp., Bedford, MA. Cat No. CDUF 006 TG) using It was concentrated Te. 1及び2g/L間のアルファ‐アミラーゼを含有する限外濾過濃縮(UFC)は10K透析(SpecraPor カタログ番号 132119)チューブで20Lの2mM塩化カルシウム含有25mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に対して終夜透析した。 Alpha between 1 and 2 g / L - ultrafiltration concentration (UFC) is overnight dialysis against 10K dialysis (SpecraPor Catalog No. 132119) 2mM calcium chloride 20L in tubes containing 25mM sodium acetate buffer pH5.0 containing amylase did. 透析液を濾過し材料の半分を陽イオン交換カラム(POROS HS 20 83 mL; Applied Biosystems, California)に注入した。 Cation exchange column half of the dialysate was filtered material (POROS HS 20 83 mL; Applied Biosystems, California) was injected into. 陽イオン交換カラムを1mM塩化カルシウム含有25mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0にて前もって平衡化した。 The cation exchange column was previously equilibrated with 1mM calcium chloride containing 25mM sodium acetate buffer pH 5.0. カラムをA280nmでの吸収(A)が0.1OD以下になるまで同様の緩衝液で広く洗浄し、酵素活性を同様の緩衝液で0から100mMの塩化ナトリウムの勾配で溶出した。 Absorption the column with A280 nm (A) is washed extensively with the same buffer until below 0.1 OD, eluted with a 0 to enzymatic activity in the same buffer with a gradient of 100mM sodium chloride. アルファ‐アミラーゼ活性を90mM塩化ナトリウムで溶出した。 Alpha - was eluted amylase activity in 90mM sodium chloride. Megazyme(商標)アルファ‐アミラーゼキット(カタログ番号 K-CERA;Megazyme)用いて測定した際の酵素活性に基づいて活性を有する分画を集めた。 Megazyme (TM) alpha - amylase kit (Cat. No. K-CERA; Megazyme) was Fractions having activity on the basis of the enzyme activity when measured using. 残りのサンプルを同様に処理し第一サンプルとして集めた。 Processing the remaining sample was similarly collected as the first sample. 硫酸アンモニウムをこの集めたサンプルの3分の1量に加え750mMにし、96mLフェニルセファロースカラム(カタログ番号17-0973-10; GE Healthcare)に注入した。 Ammonium sulfate to a 750mM added to 1 volume of 3 minutes of the collected sample, 96 mL phenyl Sepharose column (Cat. No. 17-0973-10; GE Healthcare) was injected into. そのカラムは前もってpH6.8に調整した750mM硫酸アンモニウム、2mM塩化カルシウム含有50mMMES緩衝液(4−モルフォリンエタンスルフォン酸(4- morpholineethanesulfonic acid )緩衝液)で平衡化していた。 The column was equilibrated with 750mM ammonium sulfate was adjusted to advance pH 6.8, 2 mM calcium chloride-containing 50mMMES buffer (4-morpholine ethane sulfonic acid (4-Morpholineethanesulfonic acid) buffer). 同様の緩衝液で洗浄後、アルファ‐アミラーゼ蛋白質を750mMから0mM硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出した。 After washing with the same buffer, the alpha - and eluted with a gradient of 0mM ammonium amylase protein from 750 mM. 酵素活性をこの勾配の最終段階で溶出した。 The enzyme activity was eluted at the final stage of the gradient. 酵素活性を有する分画を集めた。 Fractions were collected with an enzymatic activity. 残りのイオン交換で集めた分画を同様に精製した。 Fractions collected at remaining ion exchange purified similarly. すべてのフェニルセファロース処理で集めたサンプルを合わせて10Kセルロース性膜(Millipore)を有する撹拌アミコンセル(Millipore)で濃縮した。 And concentrated in stirred Amicon cell (Millipore) with a 10K cellulosic membrane (Millipore) combined samples collected at all phenyl sepharose process. 濃縮物を16時間5mM塩化カルシウム含有50mMマレイン酸水素(hydrogen maleate )緩衝液(pH6.8)に対して10K透析チューブを用いて透析した。 It was dialyzed with 10K dialysis tube concentrate against 16 hours 5mM calcium chloride containing 50mM hydrogen maleate (Hydrogen maleate) buffer (pH 6.8). 酵素の溶解性を助けるためにこの透析サンプルを10%ソルビトールで補充した。 The dialyzed sample to aid in the solubility of the enzyme supplemented with 10% sorbitol. 滅菌濾過後、サンプルを含むバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼをゲルデンシトメトリーにより定量し、2.8mg/mLの定量を示した。 After sterile filtration, Bacillus species including sample 707 [alpha (Bacillus sp.) - The amylase was quantified by gel densitometry showed quantification of 2.8 mg / mL.

実施例3 Example 3
能力の特徴 Features of ability
能力試験は米デンプン(Test Fabrics カタログ番号CS-28; TestFabrics Inc.)に結合する指示染料を有する米デンプン汚れ生地見本(fabric swatches)を導入した。 Ability test rice starch (Test the Fabrics Cat. No. CS-28; TestFabrics Inc.) was introduced rice starch stain swatches (fabric swatches) with indicator dye that binds to. 洗浄能力を溶液層への指示染料の放出のより判断した。 The cleaning performance was more determined release of indicator dye into the solution layer. 試験前に、汚れた試験生地を1時間蒸留水で予洗浄し、空気乾燥した。 Before the test, it was pre washed soiled test fabrics 1 hour distilled water and air dried. 試験生地の予洗浄によって試験前に弱く結合する指示染料が除かれた。 Indicator dye that binds weakly prior to testing by precleaning the test fabrics were removed.

4分の1インチの断片を予洗浄生地から切り出し、96穴プレートに移した。 The quarter fragment of an inch cut from precleaning dough was transferred to a 96 well plate. 190μLの洗剤を各ウェル(IEC-A* Base Detergent;カタログ番号88010-1; WFK Testgewebe GmBH, Germany)に加えた。 The detergent 190μL each well (IEC-A * Base Detergent; Cat. No. 88010-1; WFK Testgewebe GmBH, Germany) was added to. 見本及び洗剤を含むプレートを15分間40℃でプレインキュベーションした。 It was preincubated with a plate for 15 minutes 40 ° C. containing swatches and detergent. 反応を各ウェルにつき10μL添加した0から3ppmの実施例2のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はコントロールとして、0から3ppmアルファ‐アミラーゼ(OxAm(Purastar(商標)) Genencor International, Inc.)を添加することにより開始した。 As amylase or control, 0 3ppm alpha - - (. Bacillus sp) and the reaction Bacillus species 707 alpha of Example 2 of 3ppm 0 was added 10μL per well amylase (OxAm (Purastar (TM)) Genencor International, Inc .) it was initiated by the addition of. プレートは750rpmで約40℃で10分間インキュベートした(Eppendorf Thermomix)。 Plates were incubated for 10 minutes at about 40 ° C. at 750rpm (Eppendorf Thermomix). インキュベーション後150μLの上清を新しいプレートに移し、上清(放出指示染料を有する)の吸光度をA488で測定した。 Transfer the supernatant 150μL after incubation to a new plate and the absorbance was measured in the supernatant (with a release indicator dye) in A488.

比較のために同様の試験をStainzyme(商標)(Novozymes) 及びOxAm(Purastar(商標)); Genencor International, Inc.)、バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)アルファ‐アミラーゼ誘導体(Genencor 製品)を用いて行った。 Stainzyme Similar tests for comparison (TM) (Novozymes) and OxAm (Purastar (TM)); Genencor International, Inc.), Bacillus licheniformis (B. licheniformis) alpha - amylase derivative (Genencor product) It was performed using. 上述同様の条件の下、試験において0から3.2ppm(mg/L)を用いた。 Under the above same conditions it was used 3.2ppm (mg / L) from 0 in the test.

IEC「A」標準洗剤pH8.0(洗濯条件)のデータを図1に示す。 The data of IEC "A" standard detergent pH 8.0 (wash conditions) shown in FIG. 吸光度はアルファ‐アミラーゼ濃度を関数として表した。 Absorbance alpha - represents the amylase concentration as a function. この試験によりバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼがこれらの条件下、OxAm(Purastar(商標))より顕著に良く及びStainzyme(商標)と同等であることがわかった。 Bacillus species by the test 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase was found that under these conditions, is equivalent to OxAm (Purastar (R)) from significantly better and Stainzyme (TM).

同様の試験、同量のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ及び同量のOxAm(Purastar(商標))及びStainzyme(商標)を用いて、試験をpH10.1に調整して繰り返した。 Similar tests, the same amount of Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - using the amylase and the same amount of OxAm (Purastar (R)) and Stainzyme (TM), was repeated to adjust the test pH10.1 . これらの条件(言い換えると、pHの上昇)は自動食器洗浄の条件と類似している。 (In other words, increase in the pH) These conditions are similar to conditions for automatic dishwashing. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼの性能はpH10.1にて再度OxAm(Purastar(商標))よりよく、驚くほどStainzyme(商標)よりよかった。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase of the performance is better than again OxAm at pH10.1 (Purastar (TM)), was better than the surprisingly Stainzyme (TM). 図2を参照願いたい。 I want to refer to Figure 2.

実施例4 Example 4
Terg‐o‐tometerを用いた洗剤試験 Detergent test using a Terg-o-tometer
材料及び方法 使用見本 Materials and Methods used sample
CFT 綿上のココア、STC CFT CS-2 (TestFabrics) CFT on cotton cocoa, STC CFT CS-2 (TestFabrics)
CFT 綿上染料を有する全卵、STC CFT CS-37 (TestFabrics) Whole egg with a CFT on cotton dyes, STC CFT CS-37 (TestFabrics)
CFT 綿上着色米デンプン、 STC CFT CS-28 (TestFabrics) CFT on cotton colored rice starch, STC CFT CS-28 (TestFabrics)
2X 各運転ごとに白く漂白済み綿 レギュラーローディング(regular loading)40g/Lを作るために用いるエキストラバラスト(Extra ballast) 2X white bleached cotton regular loading for each operation (regular loading) extra ballast to be used in order to make the 40g / L (Extra ballast)
1LTerg‐o‐tometer中 1LTerg-o-tometer in
5mM HEPES pH8.0, 1.5g/L 5mM HEPES pH8.0, 1.5g / L
AATCC HDL WOB (2003) AATCC HDL WOB (2003)
漂白剤代替手段(不活化)を伴う1.8g/L タイド(Tide) Accompanied bleach alternative (inactivated) 1.8 g / L Tide (Tide)
6gpg 水の硬度, 温度 74°F又は23.3℃ 6gpg water hardness, temperature 74 ° F or 23.3 ° C.
処理:1). AATCC、 2). AATCC + 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ、 3). AATCC + 0.1ppm Stainzyme(商標)、 4). タイド(Tide)、5). タイド不活化、6). タイド不活化+ 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ、7). タイド不活化 + 0.1ppm Stainzyme(商標)、8). タイド不活化 + 0.1ppm 707アルファ‐アミラーゼ+ 0.5ppm Purafect(商標)Prime、タイド不活化 + 0.1ppm Stainzyme(商標)+ 0.5ppm Purafect(商標)Prime (Genencor)。 .. Process:.... 1) AATCC, 2) AATCC + 0.1ppm 707 alpha - amylase, 3) AATCC + 0.1ppm Stainzyme (TM), 4) Tide (Tide), 5) Tide inactivated, 6) Tide inactivated + 0.1 ppm 707 alpha -.. amylases, 7) Tide inactivated + 0.1 ppm Stainzyme (TM), 8) Tide inactivated + 0.1 ppm 707 alpha - amylase + 0.5 ppm Purafect (TM) Prime, Tide inactivated + 0.1ppm Stainzyme (TM) + 0.5ppm Purafect (TM) Prime (Genencor). AATCCを1.5g/L量存在し及び不活化タイドは1.8g/L存在した。 Exist and inactivation Tide amount 1.5 g / L of AATCC was present 1.8 g / L.

結果。 result. 図6にて示すように、洗濯能力における違いがコントロール及びココア及び卵汚れ用処理酵素の間で見られず、両者の汚れに対する洗濯の飽和を示した。 As shown in FIG. 6, difference in wash performance is not observed between the control and cocoa and egg stains for processing enzymes, it showed saturation of washing for both stains. 活性タイドは0.1ppm707アルファ‐アミラーゼを用いる不活化タイドに匹敵する結果であった。 Activity Tide 0.1ppm707 alpha - was a result comparable to inactivate Tide using amylase. 707アルファ‐アミラーゼはStainzyme(商標)より低い効果であった。 707 alpha - amylase was less effective than Stainzyme (TM). Purafect(商標)Primeの追加はStainzyme(商標)又は707アルファ‐アミラーゼのいずれの洗濯能力に変化を与えなかった(図6)。 Purafect (TM) additional Prime is Stainzyme (R) or 707 alpha - gave no change in any of the wash performance of amylase (Figure 6).

実施例5 Example 5
ラウンダー‐O‐メーター(Launder−O−meter)試験を用いるアルファ‐アミラーゼ Launder -O- meter (Launder-O-meter) alpha using the test - amylase
材料及び方法 使用見本、 Materials and Methods used sample,
CFT 綿上のココア、STC CFT CS-2 CFT on cotton cocoa, STC CFT CS-2
CFT 綿上染料を有する全卵、STC CFT CS-37 Whole egg with a CFT on cotton dyes, STC CFT CS-37
綿上着色デンプン、EMPA 161 Cotton on colored starch, EMPA 161
CFT綿上着色コーンスターチ、STC CFT CS-26 CFT on cotton colored corn starch, STC CFT CS-26
CCFT 綿上着色米デンプン、STC CFT CS-28 CCFT on cotton colored rice starch, STC CFT CS-28
ポットへの添加、 Addition to the pot,
2X 白く漂白した綿を各ポットに加えた。 The 2X white bleached cotton was added to each pot. 42g/200mL(漂白綿インターロック)のレギュラーローディング(regular loading)になるようにエキストラバラスト(Extra ballast)を各ポットに加えた。 42g / 200mL (bleached cotton interlock) regular loading (regular loading) to become as extra ballast of the (Extra ballast) was added to each pot. 水は12gpgの硬水を有した。 Water had hard water 12 gpg. 試験を40℃で40分間実施した。 Tests were performed at 40 ° C. 40 min.

処理:8g/L 漂白剤を含むIECA*。 Processing: IECA, including 8g / L bleach *. これらの洗剤組成物は洗剤単独で、洗剤に0.2ppmの707アルファ‐アミラーゼ(4mg/mL)を添加又は洗剤に0.2ppmのStainzyme(商標)を添加したもの存在下いずれかで実施した。 These detergent compositions with detergent alone, 707 alpha 0.2ppm detergent - were performed either in the presence that added amylase (4 mg / mL) of 0.2ppm in addition or detergent Stainzyme (TM). 洗浄を洗浄前後両方で50mmアパーチャーを有するミノルタ反射率計を用いて測定した。 It was measured using a Minolta reflectometer with a 50mm aperture at both the cleaning before and after washing.

結果。 result. 試験よりコントロール及び酵素処理間のココア及び全卵見本洗浄における顕著な効果はみられなかった(図7)。 Significant effect on cocoa and whole eggs swatches washed between control and enzyme treatment than the test was observed (Figure 7). 漂白剤を有するIECA*コントロールはバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼがStainzyme(商標)より良いことを示した。 IECA * control having a bleaching agent Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase showed that better than Stainzyme (TM).

実施例6 Example 6
食器洗剤 Dishwashing liquid
材料及び方法。 Materials and Methods. バシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼを米ミルク汚れにおける自動食器洗浄を用いてStainzyme(商標)及びOxAm(Purastar(商標))と比較して試験した。 (. Bacillus sp) - were tested in comparison with the Stainzyme (TM) and OxAm (Purastar (TM)) using the automatic dishwashing in the rice milk stains amylase Bacillus species of 707 alpha. 図8に示すように、洗剤はWfK C(標準ADDを含むリン酸)及び漂白剤(WFK Testgewebe GmBH, Germany)であった。 As shown in FIG. 8, the detergent was WFK C and bleaching agent (phosphoric acid including standard ADD) (WFK Testgewebe GmBH, Germany). 漂白剤は過ホウ酸塩を用いた。 Bleach with perborate. Stainzyme(商標)は活性酵素に等しい25mg/gの濃度で用いた。 Stainzyme (TM) was used at a concentration equal to the active enzyme 25 mg / g. バシルス種(Bacillus sp.)707番を4mg/gの濃度で用いた。 Bacillus species (Bacillus sp.) The 707 was used at a concentration of 4mg / g. OxAm(Purastar(商標))を3.2mg=0.6%w/wの用量の濃度で用いた。 OxAm the (Purastar (TM)) was used at a concentration of a dose of 3.2mg = 0.6% w / w. 磁製皿をIKW製の混合デンプン及び米ミルク(Genencor International, Inc.)で汚した。 The porcelain dishes soiled with a mixture of starch and rice milk made of IKW (Genencor International, Inc.). ジェネンコア製の米ミルク汚れを140℃で磁製皿上にて焼いた。 Rice milk stains made by Genencor was baked in on a porcelain dish at 140 ℃. 汚れた皿を水硬度21°GHで50℃にてミーレ(Miele)食器洗浄機で洗浄した。 The soiled dishes were washed with Miele (Miele) dishwasher at 50 ° C. with water hardness 21 ° GH. 米ミルク試験の結果を図8に示す。 The results of the rice milk test is shown in Figure 8. 混合デンプン試験の結果を図9に示す。 The results of mixing the starch test is shown in FIG. また、0.8%のプロペラーゼ(properase)4000D洗剤組成物を加えた。 Furthermore, addition of 0.8% Puroperaze (PROPERASE) 4000D detergent composition. アルファ‐アミラーゼを自動食器洗浄の条件中0.4、0.8、1.6、及び3.2mgの総活性酵素の酵素用量で加えた。 Alpha - amylase of automatic dishwashing conditions 0.4,0.8,1.6, and was added at an enzyme dosage of total active enzyme 3.2 mg.

結果。 result. バシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼは自動食器洗浄(ADW)試験の最大値の酵素量でStainzyme(商標)の効果と同じくらいであり、少なくともStainzyme(商標)の実験誤差範囲内である。 (. Bacillus sp) Bacillus species 707 alpha - amylase is the enzyme amount of the maximum value of the automatic dishwashing (ADW) test as much as the effect of Stainzyme (TM), within the experimental error range of at least Stainzyme (TM) it is. 自動食器洗浄条件におけるバシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼはOxAm(Purastar(商標))より高い能力であった。 (. Bacillus sp) Bacillus species in automatic dishwashing conditions 707 of the alpha - amylase had a higher ability than OxAm (Purastar (TM)).

実施例7 Example 7
バシルス種(Bacillus sp.)707番のアルファ‐アミラーゼ及び変異体 (. Bacillus sp) Bacillus species, 707 of alpha - amylase and variants
US Patent Nos. 6,093,562、6,187,576、6,197,565、 6,204,232、6,297,038、6,309,871、6,486,113、6,528,298、6,623,948、6,673,589、6,867,031、及び6,887,986、Published US Application Nos. 20040096952、20040253676、20050059131、20050084937、20050196853、2005025664、及び 20060035323、European Application Nos. EP 1423513及びEP 1538155、International PCT Application Nos.WO 01/64852、WO 0166712、WO 01/88107、WO 01/96537、WO 02/092797、及びWO 02/10355、及びJapanese Application Nos. JP2001520006、JP2001521739、JP2002530072、及びJP2004505606に開示する任意の変異体を含むために上記実施例1−2に記載のコドン最適化変異体をさらに組み換え修飾することができる。 US Patent Nos. 6,093,562,6,187,576,6,197,565, 6,204,232,6,297,038,6,309,871,6,486,113,6,528,298,6,623,948,6,673,589,6,867,031, and 6,887,986, Published US Application Nos. 20040096952,20040253676,20050059131,20050084937,20050196853,2005025664, and 20060035323, European Application Nos. EP 1423513 and EP 1538155, International PCT Application Nos.WO 01/64852, WO 0166712, WO 01/88107, WO 01/96537, WO 02/092797, and WO 02/10355, and Japanese Application Nos. JP2001520006, JP2001521739, JP2002530072, and the codon optimized variant described in examples 1-2 to include any variants disclosed JP2004505606 can be further recombinant modified.

実施例8 Example 8
M202Lアルファ‐アミラーゼ変異体 M202L alpha - amylase variants
M202L変異体を標準的な方法を用いてアルファ‐アミラーゼ配列の202位のメチオニンに変えてロイシンに置換することにより創製した。 Alpha M202L mutants using standard methods - was created by substituting a leucine in place of the 202-position methionine amylase sequence. 追加的な変異体はM208及びM261での異なるアミノ酸の置換及びこれらの3箇所で一以上の置換の組合せを含む。 Additional variants include one or more combinations of substituted with a different substituent, and three of these amino acids in the M208 and M261. 任意の変異体の精製を上記のように調製できる。 Purification of any variant can be prepared as described above.

実施例9 Example 9
Amy707変異体の洗浄能 Amy707 cleaning ability of the mutant
材料及び方法。 Materials and Methods. 上述のようにCS−28米デンプンで汚される見本を表示のアルファ‐アミラーゼ酵素の存在下20℃で漂白剤の有る又は無い状態でインキュベートした。 Were incubated with or without state bleach in the presence 20 ° C. amylase enzyme - CS-28 displays a sample to be soiled with rice starch alpha as described above. IEC“A”標準条件を試験に用いた。 The IEC "A" standard conditions used in the test. 変異体を当業者が周知の方法で調製し、培地上清から精製せずに用いた。 The variants those skilled prepared in a known manner, which was used without purification from the supernatant medium. 変異体の濃度をSDSPAGEゲルの濃度により測定した。 The concentration of the mutants was determined by the concentration of SDSPAGE gel. この実験の洗剤は8g/Lで用いたIEC“A”であった。 The detergent for this experiment was IEC "A" used in 8 g / L. 洗剤存在下、漂白剤が漂白活性システムである過ホウ酸ナトリウム(13.7mM)及びTAED(1.85mM)により供給された。 Presence detergent, bleach was supplied by the sodium perborate which is a bleach activator system (13.7 mM) and TAED (1.85 mM).

結果。 result. バシルス種(Bacillus sp.)707番のM202L変異体は漂白剤の無い溶液に比較して漂白剤存在下高い活性を有した。 Bacillus species (Bacillus sp.) 707 number M202L variants had compared to bleach presence high activity without bleach solution. M202L変異体は野生型バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼで得られた結果と比較して漂白剤存在下活性が増加した。 M202L mutant wild-type Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - compared to the results obtained with amylase bleach presence activity is increased. 図10を参照願いたい。 Hopefully Referring to FIG. 10. 漂白剤非存在下、M202L変異体は野生型の酵素を含む組成物より活性が低下した。 Bleach absence, M202L mutant decreased the activity than the composition containing the wild-type enzyme.

上記に引用するすべての参考文献はすべての目的のためにその全部が参照により本明細書に組み込まれる。 All references cited above are its entirety for all purposes are incorporated herein by reference.

Claims (55)

  1. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体、及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白剤、CaCl 、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - amylase or variant thereof, and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaches, CaCl 2, bleaching system, stabilizer, foam enhancers, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, tarnish agent, and manual or for dishwashing compositions for automatic device comprises a perfume.
  2. 請求項1に記載の手作業用又は自動装置用の食器洗浄組成物を投与することを含む食器を洗浄する方法。 Method of cleaning dishes comprising administering the dishwashing composition for manual use or automatic device according to claim 1.
  3. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗濯洗剤添加剤。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - laundry detergent additive comprising the amylase or variant thereof.
  4. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、CaCl 、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項3記載の洗濯添加剤を含む洗濯洗剤。 Furthermore one or more of the following ones and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaching systems, bleaching agents, CaCl 2, stabilizers, foam boosters, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, clay suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, fluorescent whitening agents, fibers conditioners, and fragrances, laundry detergent containing a wash additive of claim 3, wherein.
  5. 前記CaCl が約0.1mMから約20mMの量で洗剤中に存在することを特徴とする、請求項4記載の洗濯洗剤。 Characterized by the presence in the detergent in an amount of about 20mM from the CaCl 2 is about 0.1 mM, claim 4 laundry detergent according.
  6. バシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードする単離された核酸であって、前記変異体が配列番号3のM202、M208、S255、R172、及び/又はM261の置換からなる群から選択される置換又は欠損残基を有することを特徴とする単離された核酸。 Bacillus species 707 alpha (Bacillus sp.) - A isolated nucleic acid encoding an amylase or variant thereof, substitution of the M202 variants SEQ ID NO: 3, M208, S255, R172, and / or M261 an isolated nucleic acid characterized in that it comprises a substitution or deletion residue selected from the group consisting of.
  7. 前記M202変異体がM202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択される置換変異体、S255置換がS255Nである、及びR172置換がR172Qであることを特徴とする、請求項5記載の単離された核酸。 Wherein the M202 variant M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and substituted variants selected from the group consisting of M202W, S255 substitution is S255N, and R172 substitution is R172Q, 5. the isolated nucleic acid according.
  8. 配列番号3又はその変異体を含むアルファ‐アミラーゼであって、前記変異体が配列番号3のM202、M208、及び/又はM261残基での置換又は欠損残基を含むことを特徴とするアルファ‐アミラーゼ。 Alpha comprising SEQ ID NO: 3 or a variant thereof - a-amylase, alpha said variant which comprises a substitution or deletion residues in M202, M208, and / or M261 residues of SEQ ID NO: 3 - amylase.
  9. 前記変異体が (a) M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b) S255NであるS255変異体;及び/又は (c) R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項8記載のアルファ‐アミラーゼ。 (B) it is a S255N S255 mutant; characterized and / or (c) an R172Q R172 variant of claim 8, alpha - amylase.
  10. 請求項6記載の核酸を含むベクター。 Vector comprising a nucleic acid of claim 6, wherein.
  11. 請求項6記載の核酸を含む単離された宿主細胞。 Isolated host cell comprising the nucleic acid of claim 6.
  12. 請求項10記載のベクターを含む宿主細胞。 A host cell comprising the vector of claim 10, wherein.
  13. 前記細胞が微生物であることを特徴とする、請求項11又は12いずれかの単離された宿主細胞。 Wherein said cell is a microorganism, according to claim 11 or 12 either isolated host cell.
  14. 前記微生物が細菌又は真菌であることを特徴とする、請求項13記載の宿主細胞。 Wherein said microorganism is a bacterium or fungus, according to claim 13, wherein the host cell.
  15. 前記微生物がバシルス ズブチリス(B. subtilis)、バシルス リチェニフォルミス(B. licheniformis)、バシルス レンツス(B. lentus)、 バシルス ブレビス(B. brevis)、バシルス ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)、バシルス アルカロフィリス(B. alkalophilus)、バシルス アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バシルス コアグランス(B. coagulans)、バシルス シルクランス(B. circulans)、バシルス ランツス(B. lautus)、 バシルス ツリンギエンシス(B. thuringiensis)ストレプトミセス リビダンス(Streptomyces l Wherein the microorganism Bacillus subtilis (B. subtilis), Bacillus licheniformis (B. licheniformis), Bacillus lentus (B. lentus), Bacillus brevis (B. brevis), Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus), Bacillus Al Caro Phyllis (B. alkalophilus), Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens), Bacillus coagulans (B. coagulans), Bacillus silk lance (B. circulans), Bacillus Rantsusu (B. lautus), Bacillus thuringiensis ( B. thuringiensis) Streptomyces lividans (Streptomyces l vidans)又はストレプトミセス ムリナス(S. murinus)からなる群から選択されるグラム陽性菌又はグラム陰性菌であって、前記グラム陰性菌が大腸菌(Escherichia coli)又はシュードモナス(Pseudomonas)種であることを特徴とする、請求項14記載の単離された宿主細胞。 Vidans) or a gram positive bacteria or gram negative bacteria is selected from the group consisting of Streptomyces murinus (S. murinus), characterized in that the Gram-negative bacterium is Escherichia coli (Escherichia coli) or Pseudomonas (Pseudomonas) species to claim 14 isolated host cell according.
  16. 洗濯洗浄及び/又は食器洗浄のための請求項8記載のポリペプチドの使用。 Use of a polypeptide according to claim 8, wherein for laundry washing and / or dishwashing.
  17. 洗濯洗浄及び/又は食器洗浄のための請求項8記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用。 Alpha claim 8 for laundry washing and / or dishwashing - the use of amylase or variant thereof.
  18. 任意に非粉塵化(dusting)粒状、マイクロ粒状、被安定化液、又は被保護酵素の形態である請求項8記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤添加剤。 Optionally non-dusting (dusting) particulate, a micro particulate, the stabilized liquid, or alpha according to claim 8, wherein the form of the protected enzyme - amylase or detergent additive comprising a variant thereof.
  19. さらに、前記洗浄添加物がセルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギ Further, the cleaning additive cellulase, protease, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase, haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, pullulanase, isoamylase, Karagi ナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含むことを特徴とする、請求項18に記載の洗剤添加剤。 Kinase, or characterized in that it comprises an enzyme selected from the group consisting of any combination thereof, the detergent additive of claim 18.
  20. 前記アミラーゼが他のアルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、イソアミラーゼ、又はグルコアミラーゼであることを特徴とする、請求項19に記載の洗剤添加剤。 The amylase other alpha - amylase, beta - characterized in that it is a amylase, isoamylase, or glucoamylase, a detergent additive according to claim 19.
  21. 請求項8に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤組成物。 Alpha according to claim 8 - amylase or detergent composition comprising a variant thereof.
  22. 請求項18に記載の洗剤添加物を含む洗剤組成物。 Detergent composition comprising a detergent additive according to claim 18.
  23. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれ Further, cellulase, protease, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase , haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, pullulanase, isoamylase, carrageenase, or らの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項21に記載の洗剤組成物。 The detergent composition of claim 21 comprising an enzyme selected from the group consisting of any combination of al.
  24. 請求項8に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体のポリペプチドを含む手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。 Alpha according to claim 8 - amylase or manually or for dishwashing detergent compositions for automatic device comprising a polypeptide of variant thereof.
  25. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれ Further, cellulase, protease, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase , haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, pullulanase, isoamylase, carrageenase, or らの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項24に記載の手作業又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。 Manually or dishwashing detergent composition for automatic apparatus according to claim 24 comprising an enzyme selected from the group consisting of any combination of al.
  26. さらに、一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白剤、CaCl 、漂白システム、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、曇り防止剤、及び香料を含む請求項24又は22のいずれかの手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。 Additionally, one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaches, CaCl 2, bleaching system, stabilizer, foam enhancers, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, dirt suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, tarnish agent, and either manual or for dishwashing detergent compositions for automatic apparatus according to claim 24 or 22 including flavoring.
  27. 前記CaCl が約0.1mMから約20mMの量で洗剤中に存在することを特徴とする、請求項26記載の手作業用又は自動装置用の食器洗浄洗剤組成物。 Characterized in that said present in the detergent CaCl 2 is in an amount from about 0.1mM to about 20 mM, claim 26 manually or for dishwashing detergent compositions for automatic device according.
  28. 請求項8に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む洗剤添加剤 Alpha according to claim 8 - detergent additive comprising amylase or variant thereof
  29. 請求項28記載の洗剤添加物を含む手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Manually or for laundry cleaning compositions for automatic device comprising a detergent additive according to claim 28, wherein.
  30. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれ Further, cellulase, protease, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase , haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, pullulanase, isoamylase, carrageenase, or らの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項29に記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Manually or for laundry cleaning compositions for automatic apparatus according to claim 29 comprising an enzyme selected from the group consisting of any combination of al.
  31. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、CaCl 、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項29又は30いずれかに記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Furthermore one or more of the following ones and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaching systems, bleaching agents, CaCl 2, stabilizers, foam boosters, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, clay suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, fluorescent whitening agents, fibers conditioners, and fragrances, laundry for manual use or automatic device according to claim 29 or 30 cleaning compositions.
  32. CaCl が約0.1mMから約20mMの量で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項31記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Wherein the CaCl 2 is present in said composition in an amount from about 0.1mM to about 20 mM, claim 31 manually or for laundry cleaning compositions for automatic device according.
  33. 請求項8に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物 Alpha according to claim 8 - amylase or manually or for laundry cleaning compositions for automatic device according to variant thereof
  34. さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ‐ガラクトシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、デンプン分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、カラギナーゼ、又はそれ Further, cellulase, protease, aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxypeptidase, catalase, chitinase, cutinase, cyclodextrin glycotransferase, a deoxyribonuclease, esterase, alpha - galactosidase, beta - galactosidase, glucoamylase, alpha - glucosidase, beta - glucosidase , haloperoxidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, oxidase, pectinolytic enzyme, a peptide glutaminase, peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, amylolytic enzymes, ribonuclease, transglutaminase, xylanase, pullulanase, isoamylase, carrageenase, or らの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素を含む請求項33に記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Manually or for laundry cleaning compositions for automatic apparatus according to claim 33 comprising an enzyme selected from the group consisting of any combination of al.
  35. さらに一以上の次のもの及び一以上の界面活性剤、洗剤ビルダー、錯化剤、ポリマー、漂白システム、漂白剤、CaCl 、安定剤、泡増進剤、石鹸泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗泥再堆積剤、染料、抗菌剤、ハイドロトープ、蛍光増白剤、繊維コンディショナー、及び香料を含む、請求項33又は34いずれかに記載の手作業用又は自動装置用の洗濯洗浄組成物。 Furthermore one or more of the following ones and one or more surfactants, detergent builders, complexing agents, polymers, bleaching systems, bleaching agents, CaCl 2, stabilizers, foam boosters, suds suppressing agents, anti-corrosion agents, clay suspending agents, anti-mud redeposition agents, dyes, antibacterial agents, hydrotropes, fluorescent whitening agents, fibers conditioners, and fragrances, laundry for manual use or automatic device according to claim 33 or 34 cleaning compositions.
  36. 繊維の湯通しのための請求項8に記載のアルファ‐アミラーゼ又はその変異体の使用。 Alpha of claim 8 for desizing textile - using amylase or variant thereof.
  37. 水溶液中請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含む繊維の湯通し組成物及び任意に酵素を含む繊維の湯通し組成物。 Bacillus species according to claim 8 in an aqueous solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or desizing composition of fibers containing enzyme desizing composition and any fibers including variants thereof.
  38. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項37記載の繊維の湯通し組成物。 (B) it is a S255N S255 mutant; characterized and / or (c) an R172Q R172 mutant claim 37 desizing composition of fibers according.
  39. 前記繊維を湯通しするために十分な時間請求項37又は38のいずれかに記載の湯通し組成物を投与することを含む繊維を湯通しする方法。 How to desizing the fiber comprising administering the desizing composition of any of time sufficient to desizing the fiber according to claim 37 or 38.
  40. 水溶液中請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン処理組成物。 Bacillus species according to claim 8 in an aqueous solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or starch processing composition comprising a variant thereof.
  41. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項40記載のデンプン処理組成物。 (B) it is a S255N S255 variant; and / or (c) a R172 variant is R172Q, claim 40 starch processing composition.
  42. さらに、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ又はそれらの組み合わせを含む請求項40に記載のデンプン処理組成物。 Moreover, glucoamylase, isoamylase, pullulanase, phytase or a starch processing composition of claim 40 comprising a combination thereof.
  43. 前記デンプンを処理するために十分な時間請求項40から42のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含むデンプンを処理する方法。 Method of processing a starch comprising administering the composition of any of time sufficient claims 40 42 to process the starch.
  44. 溶液又はゲル中に請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むバイオフィルム加水分解組成物、及びさらに任意にセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、抗菌剤、又はそれらの組み合わせを含むバイオフィルム加水分解組成物。 Bacillus species according to claim 8 in a solution or gel 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or biofilm hydrolyzate composition comprising a variant thereof, and optionally further cellulase, hemicellulase, xylanase, lipase, protease , pectinase, an antimicrobial agent, or a biofilm hydrolyzing composition comprising a combination thereof.
  45. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項44記載のバイオフィルム加水分解組成物。 (B) it is a S255N S255 variant; and / or (c) a R172 variant is R172Q, claim 44 biofilm hydrolyzing composition.
  46. 前記バイオフィルムを処理するために十分な時間請求項44又は45のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含むバイオフィルムを加水分解する方法。 Hydrolyzing a biofilm comprising administering the composition of any of time sufficient to process the biofilm claim 44 or 45.
  47. 溶液中に請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン糖化用組成物。 Bacillus species according to claim 8 in a solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or starch saccharification composition containing the variant.
  48. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項47記載の組成物。 (B) it is a S255N S255 mutant; characterized and / or (c) an R172Q R172 variant composition of claim 47, wherein.
  49. デンプンを糖化するために十分な時間請求項47又は48のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含む前記デンプンを糖化する方法。 How saccharifying the starch comprising administering the composition of any of time sufficient claim 47 or 48 for saccharifying starch.
  50. 溶液中に請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むデンプン液化用組成物。 Bacillus species according to claim 8 in a solution 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or starch liquefying composition comprising a mutant thereof.
  51. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項50に記載の組成物。 (B) it is a S255N S255 mutant; characterized and / or (c) an R172Q R172 variant composition of claim 50.
  52. デンプンを液化するために十分な時間請求項50又は51のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含む前記デンプンを液化する方法。 How liquefying said starch comprising administering the composition of any of time sufficient to liquefy the starch claim 50 or 51.
  53. 溶液又はゲル中に請求項8に記載のバシルス種(Bacillus sp.)707番アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含むパンの焼成組成物。 Bacillus species according to claim 8 in a solution or gel 707 [alpha (Bacillus sp.) - amylase or calcined composition of bread variant thereof.
  54. 前記変異体が (a)M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q、及びM202Wからなる群から選択されるM202変異体; The variants (a) M202L, M202V, M202S, M202T, M202I, M202Q, and M202 variants selected from the group consisting of M202W;
    (b)S255NであるS255変異体;及び/又は (c)R172QであるR172変異体 を特徴とする、請求項53に記載のパンの焼成組成物。 (B) it is a S255N S255 mutant; characterized and / or (c) an R172Q R172 variant, calcined composition pan according to claim 53.
  55. 請求項53又は54のいずれかに記載の前記パンの焼成組成物を投与することを含むパンの焼成方法。 Method for firing pan comprising administering a calcined composition of the pan according to any one of claims 53 or 54.
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