JP2023520312A - 炭水化物結合モジュールバリアント - Google Patents

炭水化物結合モジュールバリアント Download PDF

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Abstract

炭水化物結合モジュールバリアント、及び炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼのバリアントが開示される。炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントは、プロテアーゼの存在下で改善された安定性を有し、洗濯又は食器洗浄などの洗剤適用において有用である。

Description

配列表の参照
本出願には、コンピュータ可読形式の配列表が含まれる。このコンピュータ可読形式は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、炭水化物結合モジュールバリアント、より好ましくはファミリー１の炭水化物結合モジュールバリアントに関する。
セルラーゼなどのグリコシドヒドロラーゼは一般に、リンカー領域によって結合される触媒ドメイン及び１つ以上の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含有する。
セルラーゼは長年、色の清澄化、再付着の防止、毛玉防止／毛玉除去及び白色度の改善などの洗濯プロセスにおけるそれらの観察される利点のために洗剤において使用されており、セルロース分子において１，４－ベータ－グリコシド結合を切断してより小さい分子にするそれらの能力によって特徴付けられる。
いくつかの適用において、複合セルラーゼ酵素組成物が使用され、ここで、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びベータ－グルコシダーゼの中から選択される２種以上のセルロース分解酵素を含む組成物が使用される一方で、他の適用は、主に１種以上のエンドグルカナーゼを含む酵素組成物を使用する。
国際公開第１９９６／０２９３９７号パンフレットは、洗剤用途のためのファミリー４５のエンドグルカナーゼを開示する。大部分の市販の洗剤組成物は、多くの一般的な汚れの除去を改善するプロテアーゼを含む。しかしながら、プロテアーゼはまた、セルラーゼ及び他のグリコシドヒドロラーゼなどの他の酵素を含む水性反応混合物において利用可能な他のタンパク質を分解する。したがって、プロテアーゼの存在下で安定性の増大を有するセルラーゼ及びそのバリアントなどのグリコシドヒドロラーゼを提供することが望ましい。
本発明は、炭水化物結合モジュールバリアント、より好ましくはファミリー１の炭水化物結合モジュールバリアントに関する。本発明はまた、炭水化物結合モジュールバリアントを含む改変されたグリコシドヒドロラーゼ酵素に関する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む発現構築物；ポリヌクレオチド又は発現構築物を含む宿主細胞並びに炭水化物結合モジュールバリアント及び本発明の炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ酵素を生成するためのそのような宿主細胞の使用に関する。
組成物、特に、炭水化物結合モジュールバリアント及び炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ酵素を含む液体洗剤組成物などの洗剤組成物、並びに織物を洗濯するためのそのような組成物の使用もまた開示される。
定義
本発明を記載する文脈において使用される「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び同様の指示対象は、別段の指示がない限り又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されることになる。
対立遺伝子バリアント：「対立遺伝子バリアント」という用語は、同一の染色体上の遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の代替型のいずれかを意味する。対立遺伝子のバリエーションは、変異により天然に生じ、集団内で多型を生じる場合がある。遺伝子変異は、サイレントであり得る（コードされたポリペプチドでは変化がない）か、又はアミノ酸配列が変更されているポリペプチドをコードする場合がある。ポリペプチドの対立遺伝子バリアントは、遺伝子の対立遺伝子バリアントによりコードされるポリペプチドである。
毛玉防止：用語「毛玉防止」は、織物表面からの毛玉の除去及び／又は織物表面上での毛玉の形成の防止を意味する。
炭水化物結合モジュール：用語「炭水化物結合モジュール」は、炭水化物結合親和性をもたらす炭水化物活性酵素内の領域を意味する（Ｂｏｒａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８３：７６９－７８１）。既知の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）の大部分は、別々の折り畳みを有する連続したアミノ酸配列である。炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）は通常、酵素のＮ末端又はＣ末端のいずれかで見出される。一部のＣＢＭは、セルロースに対する特異性を有することが知られる。
本発明に従って有用な例示的なＣＢＭファミリーは、ＣＢＭファミリー１、４、１７、２８、３０、４４、７２及び７９のものである。また、ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ｂｉｎｄｉｎｇ－Ｍｏｄｕｌｅｓを参照すると、ＣＢＭファミリー１は、真菌においてほとんど独占的に見出されるおよそ４０個の残基のモジュールを含む。セルロース結合機能は、多くの場合において実証されており、約１０．４オングストロームによって隔てられ且つ平らな表面を形成する３つの芳香族残基によって媒介されるように見える。ＣＢＭファミリー４は、細菌酵素において見出されるおよそ１５０個の残基のモジュールを含む。これらのモジュールのキシラン、ベータ－１，３－グルカン、ベータ－１，３－１，４－グルカン、ベータ－１，６－グルカン及び非結晶との結合は実証されているが、結晶セルロースとの結合は実証されていない。ＣＭＢファミリー１７は、およそ２００個の残基のモジュールを含む。非結晶セルロース、セロオリゴ糖及び誘導体化されたセルロースに対する結合が実証されている。ＣＢＭファミリー２８に関して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）１１３９のエンド－１，４－グルカナーゼに由来するモジュールは、非結晶セルロース、セロオリゴ糖、及びβ－（１，３）（１，４）－グルカンに結合する。ＣＢＭファミリー３０に関して、セルロースに対する結合は、フィブロバクター・サクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＣｅｌＦのＮ末端モジュールについて実証されている。クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）酵素のＣ末端ＣＢＭ４４モジュールは、セルロース及びキシログルカンに同等に十分に結合することが実証されている。ＣＢＭファミリー７２は、場合によりタンデムリピートとして、様々なファミリー由来のＣ末端グリコシドヒドロラーゼで見出される１３０～１８０個の残基のモジュールを含む。培養されていない微生物に由来するエンドグルカナーゼ上で見出されるＣＢＭ７２は、可溶性並びに不溶性セルロース、ベータ－１，３／１，４－混合型結合グルカン、キシラン、及びベータ－マンナンを含む広範囲の多糖に結合することが見出された。ＣＢＭファミリー７９は、今までルミノコッカス属タンパク質においてのみ見出されるおよそ１３０個の残基のモジュールを含む。様々なベータ－グルカンに対する結合が、Ｒ．フラベファシエンス（Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＨ９酵素について示された。
「ＣＢＭ１」とも称されるＣＢＭファミリー１が最も好ましい。
触媒ドメイン：「触媒ドメイン」という用語は、酵素の触媒機構を含有する酵素の領域を意味する。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞又は原核細胞から得られた成熟してスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製され得るＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟してスプライシングされたｍＲＮＡとして現れる前にスプライシングを含む一連の工程により処理されているｍＲＮＡの前駆体である。
セルロース分解酵素又はセルラーゼ：用語「セルロース分解酵素」又は「セルラーゼ」は、セルロース由来材料を加水分解する１種以上の（例えば、いくつかの）酵素を意味する。そのような酵素は、エンドグルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、又はその組み合わせを含む。セルロース分解酵素活性を測定するための基本的なアプローチとして、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２４：４５２－４８１で概説されているように、下記の２つが挙げられる：（１）総セルロース分解酵素活性を測定すること、及び（２）個々のセルロース分解酵素活性（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びベータ－グルコシダーゼ）を測定すること。全体的なセルロース分解酵素活性は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１濾紙、結晶セルロース、細菌性セルロース、藻類のセルロース、綿、前処理されたリグノセルロースなど含む不溶性基質を使用して測定され得る。最も一般的な全体的なセルロース分解活性アッセイは、基質としてＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１濾紙を使用する濾紙アッセイである。このアッセイは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）により確立された（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７－６８）。
セルロース由来材料：用語「セルロース由来材料」は、セルロースを含有する任意の材料を意味する。バイオマスの一次細胞壁における支配的な多糖はセルロースであり、２番目に豊富なものは、ヘミセルロースであり、３番目はペクチンである。細胞が増殖を停止した後に生成される二次細胞壁はまた、多糖を含有し、ヘミセルロースに共有結合的に架橋されたポリマーリグニンによって強化される。セルロースは、無水セロビオースのホモポリマー、したがって、線状ベータ－（１－４）－Ｄ－グルカンである一方、ヘミセルロースは、一連の置換基を有する複合分岐構造におけるキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、及びマンナンなどの様々な化合物を含む。一般にセルロースは多形であるが、植物組織中では主にグルカン鎖が並列した不溶性の結晶性マトリックスとして見出される。ヘミセルロースは通常、セルロース、及び他のヘミセルロースに水素結合し、細胞壁マトリックスを安定化するのに役立つ。
コード配列：「コード配列」という用語は、バリアントのアミノ酸配列を直接的に指定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般的に、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなどの開始コドンで始まり且つＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなどの終止コドンで終わるオープンリーディングフレームにより決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はこれらの組み合わせであり得る。
色の清澄化：洗浄及び着用の間、ゆるんだ又は壊れた繊維が布地の表面に蓄積する場合がある。その結果、表面の汚れのために、布地の色が明るくなくなったり、濃くなくなったりすることがある。織物からのゆるんだ又は壊れた繊維の除去は、織物の元の色及び外観を部分的に回復させることになる。本明細書で使用する場合、用語「色の清澄化」は、織物の最初の色の部分的な回復を意味する。
洗剤構成成分：用語「洗剤構成成分」は、洗剤組成物において使用され得る化学物質の種類を意味するように本明細書で定義される。洗剤構成成分の例は、界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルダー、コビルダー、キレーター又はキレート剤、漂白系又は漂白構成成分、ポリマー、布地色調剤、布地柔軟仕上げ剤、起泡促進剤、起泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光増白剤、香料、光学的光沢剤、殺菌剤、殺真菌剤、汚れ懸濁剤、汚れ遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素阻害剤又は安定剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、及び可溶化剤である。洗剤構成成分は、洗剤構成成分のいずれかの種類の１つ以上のものを含み得る。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチドの発現に必要となる核酸配列を意味する。それぞれの制御配列は、バリアントをコードするポリヌクレオチドに対して天然（すなわち、同一の遺伝子に由来する）若しくは外来性（すなわち、異なる遺伝子に由来する）のものであってよいか、又は互いに天然若しくは外来性のものであってよい。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列としては、プロモーター並びに転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルが挙げられる。制御配列には、バリアントをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーが設けられていてもよい。
洗剤組成物：用語「洗剤組成物」は、クリーニングされる物品、例えば、織物、食器類、及び硬質表面からの望ましくない化合物の除去に用途が見出される組成物を指す。洗剤組成物は、例えば、家庭でのクリーニング及び工業的なクリーニング並びに／又は布地ケアの両方に関する織物、食器類及び硬質表面をクリーニングするために使用され得る。本用語は、特定のタイプの所望のクリーニング組成物及び製品の形態（例えば、液体、ゲル、粉末、顆粒、ペースト、又はスプレー組成物）のために選択されるあらゆる材料／化合物を包含し、限定されないが、洗剤組成物（例えば、液体及び／又は固体洗濯洗剤並びに微細な布地用洗剤；硬質表面用のクリーニング配合物、例えば、ガラス、木材、プラスチック、セラミック及び金属のカウンタートップ及び窓；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地用柔軟剤；並びに織物及び洗濯プレスポッター、並びに食器洗浄洗剤）を含む。本発明の酵素を含有することに加えて、洗剤配合物は、１種以上の追加の酵素（アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、ベータグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、アルファ－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラゲナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド－ベータ－マンナナーゼ、エキソ－ベータ－マンナナーゼ（ＧＨ５及び／又はＧＨ２６）、リケニナナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、ヌクレアーゼ、及びその組み合わせ、又はその任意の混合物など）、並びに／又は界面活性剤、ビルダー、キレーター若しくはキレート剤、漂白系若しくは漂白構成成分、ポリマー、布地色調剤、起泡促進剤、起泡抑制剤、染料、香料、黄褐色阻害剤、光学的光沢剤、殺菌剤、殺真菌剤、汚れ懸濁剤、抗腐食剤、酵素阻害剤若しくは安定剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、オキシドレダクターゼ、青み付け剤及び蛍光色素、抗酸化剤、及び可溶化剤などの構成成分を含有し得る。
食器洗浄：用語「食器洗浄」は、例えば、手動食器洗浄（ＨＤＷ）の又は自動食器洗浄（ＡＤＷ）によって食器を洗浄する全ての形態を指す。食器類を洗浄することは、プレート、カップ、ガラス、ボウルなどの陶器の全ての形態、スプーン、ナイフ、フォーク及び配膳用具などの食卓用金物類の全ての形態並びにセラミックス、プラスチック、金属、陶磁器類、ガラス及びアクリル樹脂のクリーニングを含むが、これらに限定されない。
食器洗浄組成物：用語「食器洗浄組成物」は、食器類、テーブルウェア、ポット、パン、食卓用金物類をクリーニングすることを目的とした組成物及びキッチンの硬質表面領域をクリーニングするための組成物の全ての形態を指す。本発明は、食器洗浄組成物の任意の特定の種類又は任意の特定の洗剤に限定されない。
エンドグルカナーゼ：用語「エンドグルカナーゼ」は、セルロース、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースなど）、リケニン、穀物のベータ－Ｄ－グルカン又はキシログルカンなどの混合ベータ－１，３－ベータ－１，４グルカン中のベータ－１，４結合、及びセルロース系構成成分を含有する他の植物材料中の１，４－ベータ－Ｄ－グリコシド結合のエンド加水分解を触媒する酵素を意味する。本発明の目的のために、Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７－２６８の手順に従ってカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を使用して、エンドグルカナーゼ活性が決定される。エンドグルカナーゼ活性の１つの単位は、５０℃、ｐＨ４．８にて１分で生成される還元糖の１．０μモルとして定義される。
エンドグルカナーゼの１つの特に好ましいクラスは、「ファミリーＧＨ４５」のものであり、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９－３１６（１９９１）、及びｃａｚｙ．ｏｒｇで利用可能なＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓデータベースの用語法に従ってグリコシドヒドロラーゼファミリー４５として分類される。ＧＨ４５酵素は、ＥＣ３．２．１．４のエンドグルカナーゼである。
発現：用語「発現」は、バリアントの産生に関与するあらゆる工程（例えば、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌）を含む。
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、バリアントをコードするポリヌクレオチドを含む直鎖状又は環状のＤＮＡ分子であって、その発現をもたらす制御配列に作動可能に連結されている直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。
布地ケア：織物ケアとしても称される用語「布地ケア」は、例えば、色の清澄化、毛玉防止又は織物表面上での毛玉の形成の防止によって、織物の特性を保持するか又は部分的に若しくは完全に回復させる処理を指す。
断片：用語「断片」は、成熟したポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端に存在しない１つ以上の（例えば、いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドを意味しており；この断片は、全長ポリペプチドの酵素活性を保持する。
操作された：用語「操作された」は、合成構築物を意味する。
グリコシドヒドロラーゼ：用語「グリコシドヒドロラーゼ」（ＧＨ）は、２つ以上の炭水化物間又は炭水化物部分と非炭水化物部分の間のグリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を意味する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ．，“Ａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９－３１６（１９９１）、及びｃａｚｙ．ｏｒｇで利用可能なＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓデータベースを参照されたい。一部のグリコシドヒドロラーゼは、１つ以上の触媒ドメイン及び１つ以上の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含有し、これらは、これらのドメインを連結する１つ以上のリンカー領域によって結合される。
本開示に従って有用な報告されたセルラーゼ活性を有する例示的なグリコシドヒドロラーゼファミリーは、ファミリーＧＨ５、ＧＨ６、ＧＨ７、ＧＨ８、ＧＨ９、ＧＨ１２、ＧＨ４４、ＧＨ４５、ＧＨ４８、ＧＨ５１、ＧＨ１２４のものを含み、ファミリーＧ４５が特に好ましい。
硬質表面クリーニング：用語「硬質表面クリーニング」は硬質表面のクリーニングとして本明細書で定義され、ここで、硬質表面は、床、机、壁、屋根など、並びに自動車（自動車洗浄）及び食器類（食器洗浄）などの硬質の物体の表面を含み得る。食器洗浄は、これらに限定されないが、プレート、カップ、グラス、ボウル、スプーン、ナイフ、フォークなどのカトラリー、配膳用具、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラス及びアクリルのクリーニングを含む。
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、トランスダクションなどを受けやすい任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じる変異に起因して親細胞と同一ではない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。
ハイブリッドポリペプチド：用語「ハイブリッドポリペプチド」は、異なる供給源（起源）由来の２種以上のポリペプチド由来のドメイン、例えば、あるポリペプチド由来の結合モジュール及び別のポリペプチド由来の触媒ドメインを含むポリペプチドを意味する。ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端で融合され得る。あるポリペプチド（天然に存在し得るか又はさらに改変され得る）由来の結合モジュール、合成構築物であるプロリンリッチリンカー領域などの操作されたリンカー領域、及び別のポリペプチド（天然に存在し得るか又はさらに改変され得る）由来の触媒ドメインを含むポリペプチドが、本明細書における特別な興味の対象である。
ハイブリダイゼーション：「ハイブリダイゼーション」という用語は、標準的なサザンブロッティング手順を使用して、核酸の相補鎖を実質的に対合させることを意味する。ハイブリダイゼーションは、中程度、中程度～高い、高い又は非常に高いストリンジェンシー条件下で実施され得る。中程度のストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理済みの変性サケ精子ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミド中において４２℃で１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに続いて０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを使用して５５℃でそれぞれ１５分間の３回の洗浄を行うことを意味する。中程度～高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理済みの変性サケ精子ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミド中において４２℃で１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに続いて０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを使用して６０℃でそれぞれ１５分間の３回の洗浄を行うことを意味する。高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理済みの変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミド中において４２℃で１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに続いて０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを使用して６５℃でそれぞれ１５分間の３回の洗浄を行うことを意味する。非常に高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理済みの変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミド中において４２℃で１２～２４時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに続いて０．２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳを使用して７０℃でそれぞれ１５分間の３回の洗浄を行うことを意味する。
改善された特性：用語「改善された特性」は、参照酵素／親酵素と比較して改善されたバリアントに関連する特徴を意味する。本発明のいくつかの態様は、バリアントが適切なアッセイにおいて目的の特性について試験されるとき、１を超える改善係数を有するバリアントに関し、参照酵素／親酵素の特性は、１の値が与えられる。
改善された安定性：用語「改善された安定性」は、参照酵素／親酵素の安定性と比較してプロテアーゼの存在下でより良好な安定性を有する酵素を意味し、例えば、タンパク分解安定性、洗剤中での保管の安定性、洗剤組成物の生成中の改善された安定性、及び洗浄中の安定性を含む。安定性の改善は、本明細書の実施例２（プロテアーゼの存在下でのリンカー安定性アッセイ）、及び／又は実施例７（プロテアーゼを伴う洗浄中のリンカー安定性アッセイ）に記載されるアッセイに従って安定性を決定することによって定量化され得る。
改善された洗浄性能：用語「改善された洗浄性能」は、参照酵素／親酵素の洗浄性能と比較して、洗剤組成物中で洗浄性能の増大、例えば、新鮮な試料を評価するとき及び／又は試料が同じ条件下で保管されているとき、色の清澄化及び／又は毛玉防止効果の増大を示す酵素として本明細書で定義される。用語「改善された洗浄性能」は、洗濯中の洗浄性能だけでなく、例えば、自動食器洗浄（ＡＤＷ）などの硬質表面クリーニングにおける洗浄性能も含む。
単離された：「単離された」という用語は、自然界に存在することのない形態又は環境における物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）任意の天然に存在しない物質、（２）それが自然界で結合する天然に存在する成分のうち１つ以上又はその全てを少なくとも部分的に除去した任意の酵素、バリアント、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子が挙げられるが、これらに限定されない任意の物質；（３）自然界で見られる物質に対してヒトの手で改変された任意の物質；又は（４）それと天然に結合する他の構成成分と比較して物質の量を増大させることによって改変された任意の物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数コピー、物質をコードする遺伝子と自然に結合するプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロス試料中に存在してもよい。
成熟したポリペプチド：用語「成熟したポリペプチド」は、Ｎ末端プロセシング（例えば、シグナルペプチドの除去）後のその成熟した形態のポリペプチドを意味する。
成熟したポリペプチドコード配列：用語「成熟したポリペプチドコード配列」は、エンドグルカナーゼ活性などのセルラーゼを有する成熟したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
変異体：用語「変異体」は、バリアントをコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離した、又は普通では自然界に存在することのない方法で核酸のセグメントを含有するように改変させた、又は１つ以上の制御配列を含む合成物である、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。
作動可能に連結された：用語「作動可能に連結された」は、制御配列がコード配列の発現を指示するように制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置されている構成を意味する。
親又は親セルラーゼ：用語「親」又は「親セルラーゼ」は、グリコシドヒドロラーゼ活性、特に、セルロース分解性又はさらにエンドグルカナーゼ活性を有する任意のポリペプチドを意味し、それに対して本発明の炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼバリアントを生成するための改変がなされる。
プロリンリッチリンカー：用語「プロリンリッチリンカー」は、１つ以上のＰｒｏ－Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－Ｘａａ（又はＸａａ－Ｐｒｏ）、Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ又はＸａａ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（又はＰｒｏ－Ｘａａ－Ｘａａ）単位を含む配列を意味し、Ｐｒｏは、アミノ酸プロリンの三文字表現であり、Ｘａａは、任意のアミノ酸に関する三文字表現である。好ましくは、プロリンリッチリンカーは、上記の繰り返し単位、例えば、ＰＰ、ＰＰＰ、ＰＰＰＰ（配列番号２７）、ＰＸ、ＰＸＰ、ＰＳ、ＰＳＰ、ＰＸＰＸ（配列番号９８）、ＸＰ、ＸＰＸ、ＳＰ、ＳＰＳ、ＸＰＸＰ（配列番号９９）、ＸＰＸＸＰＸ（配列番号１００）、ＸＸＰＸＸＰ（配列番号１０１）を含み、組み合わせて及び／又は連続して記載される。
一態様では、プロリンリッチリンカーは、以下の任意選択による繰り返しのモチーフのうちの１つ以上を含む：［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ及びＰ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］（配列番号１０２）。一態様では、プロリンリッチリンカーは、以下の任意選択による繰り返しのモチーフを含む：［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］、［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ、及び／又はＰ［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］。一態様では、プロリンリッチリンカーは、示されるとおりの角括弧内の同じ、又は異なるアミノ酸の任意選択による繰り返しのモチーフを含む：［Ｐ／Ｓ／Ｔ］Ｐ及びＰ［Ｓ／Ｅ］ＰＴ（配列番号１０９）。
一態様では、プロリンリッチリンカーは、（ａ）（ＳＰ）ａ、ａ＝２～１０；（ｂ）（ＰＳ）ａ、ａ＝２～１０；（ｃ）Ｐｂ、ｂ＝４～２０、好ましくは、４～１５；（ｄ）（ＰＥＰＴ（配列番号１２５））ｃ、ｃ＝２～５；（ｅ）（ＰＳＰＴ（配列番号１０４））ｄ、ｄ＝２～５；（ｆ）（Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］（配列番号１０２））ｅ、ｅ＝２～５；（ｇ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ）ｆ、ｆ＝２～１０、好ましくは、２～５；（ｈ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］）ｇ、ｇ＝２～６；（ｉ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ）ｈ、ｈ＝２～５；（ｊ）（ＴＰ）ｉ、ｉ＝２～１０；（ｋ）（［Ｓ／Ｔ／Ｐ］［Ｓ／Ｔ／Ｐ］［Ｓ／Ｔ／Ｐ］）ｊ、ｊ＝２～１１；（ｌ）及び／又はその組み合わせを含み、それぞれの単量体単位の組み合わせが企図される。
一態様では、プロリンリッチリンカーは、ＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号３１）、ＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３０）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号５８）又はＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ（配列番号２５）などの下の表Ａにおけるリンカーを含む。
好ましくは、プロリンリッチリンカーは、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％のプロリンなどの、少なくとも２５％のプロリン、例えば、少なくとも２８％のプロリン、少なくとも３０％のプロリン、少なくとも３５％のプロリン、少なくとも４０％のプロリン、少なくとも５０％のプロリンを含む。好ましくは、プロリンリッチリンカーは、４～２８個のアミノ酸などの少なくとも４個のアミノ酸及び３０個以下のアミノ酸、好ましくは４～２０個のアミノ酸、或いは４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸又は１０個のアミノ酸などの４～１０個のアミノ酸を含む。
さらに、本明細書で定義されるとおりのリンカー領域は、触媒ドメイン及び／又は炭水化物結合モジュールへの結合点で追加の１～２個のアミノ酸の界面を含むことができる。
精製された：「精製された」という用語は、当該技術分野においてよく知られた分析技術によって測定したときに、他の構成成分を実質的に含まない核酸又はポリペプチドを意味する（例えば、精製されたポリペプチド又は核酸は、電気泳動ゲル中で、クロマトグラフ溶出液中で、及び／又は密度勾配遠心分離を施した媒体中で分離したバンドを形成し得る）。精製された核酸又はポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％以上純粋である（例えば、モル基準の重量パーセント）。関連する意味では、精製又は濃縮手法を適用した後に分子の濃度が実質的に増加した場合、組成物は分子が濃縮されている。「濃縮された」という用語は、出発組成物よりも高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在する化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは構成成分を指す。
組み換え：「組み換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用する場合、天然の状態から改変されていることを意味する。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然形態内に見られない（非組み換え型）遺伝子を発現するか、又は自然界に見られるものと異なるレベル若しくは異なる条件下で天然の遺伝子を発現する。組み換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドで天然配列とは異なっており、及び／又は異種配列、例えば、発現ベクターの異種プロモーターに作動可能に連結されている。組み換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸で天然配列とは異なっていてもよく、及び／又は異種配列と融合している。ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。「組み換え」という用語は、「遺伝子改変された」及び「遺伝子導入」と同義である。
配列同一性：２つのアミノ酸配列の間又は２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、「配列同一性」というパラメータにより説明される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列相同性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ；Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６；２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているような、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、前掲）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているようなニードルマン－ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，前掲）を使用して決定される。使用されるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、次のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
織物：用語「織物」は、織り糸、織り糸中間物、繊維、不織材料、天然材料、合成材料及び任意の他の織物材料を含む任意の織物材料、これらの材料から作られた布地及び布地から作られた製品（例えば、衣服及び他の物品）を意味する。織物又は布地は、ニット、織布、デニム、不織布、フェルト、織り糸及びタオルの形態であり得る。織物は、綿、亜麻／リネン、ジュート、カラムシ、サイザル又はコイアを含む天然セルロース、又はビスコース／レーヨン、酢酸セルロース繊維（ｔｒｉｃｅｌｌ）、リオセル又はそのブレンドを含む人工セルロース（例えば、木材パルプ由来のもの）などのセルロース系のものであり得る。織物又は布地はまた、ウール、ラクダ、カシミヤ、モヘア、ウサギ及び絹などの天然ポリアミド、若しくはナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレン及びスパンデックス／エラスタンなどの合成ポリマーなどの非セルロース系のもの、又はそのブレンド、並びにセルロース系繊維及び非セルロース系繊維のブレンドであり得る。ブレンドの例は、綿及び／又はレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及び／又はセルロース－含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、カラムシ、亜麻／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１種以上の随伴材料のブレンドである。布地は、例えば汚れのついた家庭洗濯物といった従来の洗濯のきく洗濯物であり得る。布地又は衣服という用語が用いられる場合、より幅広い用語としての織物をも含むことが意図されている。
バリアント：用語「バリアント」は、１つ以上の（例えば、いくつかの）位置で置換を含み且つ親の活性を保持するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味する。本発明の炭水化物結合モジュールバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドなどの親ＣＢＭのセルロース結合活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。ＣＢＭバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４のポリペプチドなどの親のグリコシドヒドロラーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。「バリアント」はまた、本明細書で使用する場合、ハイブリッドポリペプチドも含み得る。
洗浄液：用語「洗浄液」は、洗濯プロセスにおける洗浄液などの希釈された形態で洗濯洗剤組成物を含有する洗剤溶液などであるがこれに限定されない、希釈された形態で洗剤組成物を含有する水溶液を指す。
白色度：用語「白色度」は、異なる地域及び異なる消費者で異なる意味を有する広範な用語として本明細書で定義される。白色度の低下は、例えば、灰色化、黄色化、又は光学的光沢剤／色調剤の除去に起因し得る。灰色化及び黄色化は、汚れの再付着、身体の汚れ、例えば鉄イオン及び銅イオンからの着色又は移染に起因する場合がある。白色度は、以下のリストからの１つ又は複数の問題点を含み得る：着色料又は染料作用；不完全な汚れの除去（例えば、身体の汚れ、皮脂など）；再付着（物体の灰色化、黄色化、又はその他の変色）（除去した汚れが、汚れた、又は汚れていない織物の他の部分に再結合したもの）；使用中の織物における化学変化；並びに色の清澄化又は明化。
野生型：アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語「野生型」は、アミノ酸配列又は核酸配列が天然の配列又は天然に存在する配列であることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「天然に存在する」は、天然に見出されるもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）を指す。逆に、用語「天然に存在しない」は、天然に見出されないもの（例えば、研究室で生成された組み換え核酸及びタンパク質配列又は野生型配列の改変）を指す。
バリアントの表記に関する従来法
本発明の目的のために、配列番号１７３の炭水化物結合モジュールを使用して、別の炭水化物結合モジュール内の対応するアミノ酸残基を決定する。別の炭水化物結合モジュールのアミノ酸配列を、配列番号１７３に開示されるポリペプチドとアラインメントさせ、このアラインメントに基づいて、配列番号１７３に開示されるポリペプチド内の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ；Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６；２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているような、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
別の炭水化物結合モジュール中の対応するアミノ酸残基の同定を、それぞれのデフォルトパラメータを使用していくつかのコンピュータプログラムを使用して、複数のポリペプチド配列のアラインメントにより決定することができ、このプログラムとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＵＳＣＬＥ（対数予測による複数配列比較；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２－１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９－３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１－５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２－３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９－６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９－１９００）、及びＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３－４６８０）。
他の炭水化物結合モジュールが配列番号１７３のポリペプチドから分岐して、その結果、従来の配列ベースの比較をしてもそれらの関係性を検出しない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３－６１５）、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムが使用され得る。配列ベースの検索でのより高い感度を、データベースを検索するためにポリペプチドファミリ（プロファイル）の確率的表現を用いる検索プログラムを使用して達成し得る。例えば、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴプログラムによって反復データベース検索プロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することができる（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造データベース中に１つ以上の代表を有する場合、さらに高い感度が達成され得る。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７；７９７－８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９；８７４－８８１）などのプログラムは、様々なソース（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造的アラインメントプロファイル、及び溶媒和ポテンシャル）からの情報を、問い合わせ配列の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへのインプットとして利用するものである。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３－９１９の方法を使用して、構造が未知の配列と、ＳＣＯＰデータベース中に存在するスーパーファミリーモデルとをアラインメントすることができる。次に、これらのラインメントを使用してポリペプチドの相同性モデルを作成することができ、そのようなモデルを、この目的のために開発された様々なツールを使用して精度に関して評価することができる。
構造が既知のタンパク質の場合、構造アラインメントを検索及び作成するために、いくつかのツール及びリソースが利用可能である。例えば、ＳＣＯＰスーパーファミリーのタンパク質が構造的にアラインされており、このアラインメントにアクセスしてダウンロードすることが可能である。２つ以上のタンパク質構造を、距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８－９６）又は組み合わせ拡張（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９－７４７）などの様々なアルゴリズムを使用してアラインメントすることができ、これらのアルゴリズムの実装をさらに利用して、可能な構造相同体を発見するために、目的の構造で構造データベースを検索することができる（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６－５６７）。
本発明のバリアントの説明では、言及を容易にするために、下記で説明する命名法が適応される。認められているＩＵＰＡＣ一文字又は三文字アミノ酸略語が採用される。
置換。アミノ酸置換の場合、下記の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸。したがって、２２６位でのスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と指定される。複数の変異は、加算記号（「＋」又は「，」）によって隔てられ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」又は「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ，Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ，Ｓ４１１Ｆ」は、２０５位のグリシン（Ｇ）をアルギニンＩで、及び４１１位のセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）でそれぞれ置換することを表す。
欠失。アミノ酸欠失の場合、下記の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、＊。したがって、１９５位のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と指定される。複数の欠失は、加算記号（「＋」又は「，」）によって隔てられ、例えば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」又は「Ｇｌｙ１９５＊，Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊、Ｓ４１１＊」である。
挿入。アミノ酸挿入の場合、下記の命名法が使用される：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸。したがって、１９５位でのグリシンの後のリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入アミノ酸＃１、挿入アミノ酸＃２など］と指定される。例えば、１９５位のグリシンの後のリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基は、この挿入されたアミノ酸残基に先行するアミノ酸残基の位置番号への小文字の追加により付番される。上記の例では、配列は下記のようになる。
Figure 2023520312000001
複数の改変。複数の改変を含むバリアントは、加算記号「＋」によって隔てられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」又は「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ，Ｇ１９５Ｅ」は、１７０位及び１９５位のアルギニン及びグリシンを、それぞれチロシン及びグルタミン酸で置換することを表す。
異なる改変。ある位置で異なる改変が導入され得る場合、異なる改変がカンマによって隔てられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、１７０位でのアルギニンのチロシン又はグルタミン酸への置換を表す。そのため、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、下記のバリアントを指定する：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
命名法
本発明の目的のために、角括弧を使用して、配列中の特定の位置での代替的なアミノ酸を示す（それらの一文字コードを使用して）。例えば、命名法［Ｓ／Ｅ］は、この位置のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）であり得ることを意味する。同様に、命名法［Ｐ／Ｓ／Ｔ］は、この位置のアミノ酸が、本明細書に記載されるとおりの他の組み合わせのためにプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）などであり得ることを意味する。この命名法を使用して角括弧内に示されるアミノ酸は、鉛直線によって隔てられ得るか又はいくつかの場合において線を伴わず、例えば、［Ｐ／Ｓ／Ｔ］はまた［ＰＳＴ］と指定され得る。
いくつかの場合において、配列モチーフは、角括弧の２つ以上のセットを含み、その各々は独立して、配列中の位置を表す。したがって、Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］（配列番号１０２）は、Ｐ、保存的アミノ酸が、１番目の位置にあり；Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、又はＱのいずれかが２番目の位置にあり；Ｐ、保存的アミノ酸が、３番目の位置にあり；Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、又はＥのいずれかが、４番目の位置にあることを意味する。次に、この指定によって表されるモチーフは、ＰＳＰＳ（配列番号１０３）、ＰＳＰＴ（配列番号１０４）、ＰＳＰＲ（配列番号１０５）、ＰＳＰＫ（配列番号１０６）、ＰＳＰＤ（配列番号１０７）、ＰＳＰＥ（配列番号１０８）などのいずれかであり得る。
さらなる別段の限定がない限り、アミノ酸Ｘ（又はＸａａ）は、２０種の天然アミノ酸のいずれかを表すために本明細書で使用される。
多くのタンパク質は、リンカーによって連結される構造化されたドメインで構成される。例えば、セルラーゼ及び他のグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）は、多くの場合、１つ以上の触媒ドメインを有するモジュラー酵素として見出され、これは、リンカーとして知られるペプチドを介して１つ以上のＣＢＭに連結される場合があり、場合により、部分的にグリコシル化される。触媒ドメインは、セルロースの加水分解性の分解に関与するが、ＣＢＭは、存在する場合、基質表面の近傍での酵素の効果的な濃縮を増大させることによって機能する。対照的に、リンカーは一般に、構造化されたドメイン間で結合性を提供する柔軟なコネクターであるが、それらの機能的役割はほとんど知られていない。
セルラーゼは、特に、多くの場合、露出した領域で切断される（切れ目を入れられる）か又は液体洗剤中のプロテアーゼによって部分的に若しくは完全に分解される。最も一般的には、プロテアーゼは、セルラーゼの構造化されていないリンカー領域において切断し、例えば、洗剤適用において、それにより、セルラーゼが不溶性セルロース基質に結合する能力を低減することによって、綿毛及び毛玉を除去し、織物の色を維持するか又は回復させる能力を低減する。結合親和性の低下は、セルラーゼの性能に強く影響するため、プロテアーゼ安定分子は洗濯／食器用液体洗剤分野、及び柔軟剤において非常に有用である。
同様に、ＣＢＭモジュール中のペプチド結合のタンパク分解性の切断は、セルラーゼの不溶性セルロース基質に結合する能力の低下をもたらし、それによりその性能に影響を及ぼし得る。
本発明は、セルロース結合活性を有する炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。本発明はまた、本発明の炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ酵素、特に、リンカーを介して１つ以上の炭水化物結合モジュールに連結された１つ以上の触媒ドメインを有する３つのドメイン構造を有するグリコシドヒドロラーゼのバリアントに関する。驚いたことに、本発明者らは、炭水化物結合モジュールバリアントが炭水化物結合モジュールバリアントを含む結果として生じるグリコシドヒドロラーゼ酵素の安定性の改善をもたらすことができ、グリコシドヒドロラーゼ酵素をより安定にし、すなわち、タンパク質分解性の切断に影響されにくくすることができることを見出した。
いくつかの実施形態では、炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼバリアントはまた、天然のリンカーをより安定にする、すなわち、タンパク質分解性の切断に影響されにくくする一続きのペプチドを含む。好ましくは、グリコシドヒドロラーゼバリアントは、炭水化物結合モジュールバリアントに加えて、本明細書に記載されるとおりのプロリンリッチリンカーなどの操作されたリンカー領域であるリンカーを含む。
しかしながら、本研究の前に、グリコシドヒドロラーゼの炭水化物結合モジュールにおける改変は、結果として生じるグリコシドヒドロラーゼをより安定にし、すなわち、タンパク質分解性の切断に影響されにくくすることができることが知られていなかった。
ファミリー１ＣＢＭは、真菌においてほとんど独占的に見出されるおよそ４０個の残基のモジュールを含む。セルロース結合機能は、多くの場合において実証されており、約１０．４オングストロームによって隔てられ且つ平らな表面を形成する３つの芳香族残基によって媒介されるように見える。ファミリー１ＣＢＭはまた、結合親和性のために重要であると考えられる保存されたＣ末端ＳＱＣＬ（配列番号２０１）を有する。驚いたことに、本発明者らは、Ｃ末端ＳＱＣＬ（配列番号２０１）のＳｅｒ及び／又はＬｅｕに対応する改変を含む炭水化物結合モジュールにおける改変が、セルロース結合活性を犠牲にすることなく安定性の改善をもたらすことを見出した。
本発明者らはまた、驚いたことに、Ｃ末端ＳＱＣＬ（配列番号２０１）のＳｅｒ及び／又はＬｅｕに対応する改変を含む炭水化物結合モジュールにおける改変が、ポリペプチドのグリコシドヒドロラーゼ活性を犠牲にすることなく炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ酵素に対する安定性の改善をもたらすことを見出した。
炭水化物結合モジュールバリアント
本発明は、配列番号１７３のポリペプチドの１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、３７位に対応する１つ以上の位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。
本発明によるバリアントをもたらす改変に有用な例示的な開始ＣＢＭは、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、又は配列番号２００のいずれかにおいて提供されるものである。したがって、一実施形態では、炭水化物結合モジュールのバリアントは、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、又は配列番号２００のポリペプチドと少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するが、１００％未満の配列同一性を有する。
一態様では、本発明のバリアントにおける改変の数は、１～２０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変などの１～１０個及び１～５個である。
別の態様では、バリアントは、配列番号１７３の１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する１個以上の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位のいずれかに対応する２個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位のいずれかに対応する３個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する４個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する５個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する６個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する７個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する８個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する９個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する１０個の位置で置換を含む。別の態様では、バリアントは、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４、及び３７位に対応する各位置で置換を含む。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの３４及び３７位に対応する１個以上の位置、好ましくは両方の位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの１４位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、１４位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｔｒｐで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｙ１４Ｗを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの１８位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、１８位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ａｒｇで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｔ１８Ｋ又はＴ１８Ｒを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２１位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２１位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｇｌｕで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｖ２１Ｅを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２２位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２２位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ａ２２Ｅ又はＡ２２Ｎ又はＡ２２Ｐを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２５位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２５位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｇｌｕで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｔ２５Ｅを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２７位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２７位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｉｌｅで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｔ２７Ｉを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２８位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２８位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｐｒｏで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｑ２８Ｐを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの２９位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、２９位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｐｒｏで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｌ２９Ｐを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの３４位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、３４位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｓ３４Ｈ、Ｓ３４Ｙ、Ｓ３４Ｋ、Ｓ３４Ｒを含むか又はそれからなる。
本発明はまた、配列番号１７３のポリペプチドの３７位に対応する位置で置換を含む炭水化物結合モジュールのバリアントに関する。ＣＢＭのバリアントは、配列番号１７３のポリペプチドと約６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、セルロース結合活性を有する。ある実施形態では、別の態様において、３７位に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌ、好ましくは、Ａｒｇで置換される。別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドの置換Ｌ３７Ｒを含むか又はそれからなる。
別の態様では、バリアントは、配列番号１７３のポリペプチドのＹ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｔ１８Ｒ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｅ、Ａ２２Ｎ、Ａ２２Ｐ、Ｔ２５Ｅ、Ｔ２７Ｉ、Ｑ２８Ｐ、Ｌ２９Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｓ３４Ｙ、Ｓ３４Ｋ、Ｓ３４Ｒ、及びＬ３７Ｒからなる群から選択される１つ以上の置換を含むか又はそれらからなる。
好ましいＣＢＭバリアントは、配列番号１７３の
Ｓ３４Ｈ、
Ｓ３４Ｙ、
Ｓ３４Ｋ、
Ｓ３４Ｒ、
Ｙ１４Ｗ、
Ｔ１８Ｋ、
Ｌ３７Ｒ、
Ｓ３４Ｙ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｓ３４Ｈ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｓ３４Ｙ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｒ、
Ｖ２１Ｅ、
Ａ２２Ｅ、
Ａ２２Ｐ、
Ａ２２Ｎ、
Ｔ２５Ｅ、
Ｔ２７Ｉ、
Ｑ２８Ｐ、
Ｌ２９Ｐ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｙ１４Ｗ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｔ１８Ｋ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｔ１８Ｒ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｖ２１Ｅ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ａ２２Ｅ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ａ２２Ｐ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ａ２２Ｎ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｑ２８Ｐ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｌ２９Ｐ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｔ２５Ｅ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｔ２７Ｉ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｅ、
Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｎ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｒ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｖ２１Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ａ２２Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｑ１８Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｌ２９Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ２５Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ２７Ｉ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｖ２１Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｑ２８Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｌ２９Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｔ２５Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｔ２７Ｉ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｔ１８Ｋ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｖ２１Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｑ２８Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｌ２９Ｐ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｔ２５Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｔ２７Ｉ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ｖ２１Ｅ＋Ａ２２Ｅ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ、
Ｙ１４Ｗ＋Ｔ１８Ｋ＋Ａ２１Ｅ＋Ａ２２Ｎ＋Ｓ３４Ｈ＋Ｌ３７Ｒ
からなる群から選択される置換を有する。
炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド
本発明はまた、１つ以上のリンカーによって結合される、上記のとおりのグリコシドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド由来の１つ以上の触媒ドメイン及び炭水化物結合モジュールバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドに関する。グリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドは、プロテアーゼを含む水性組成物において親と比較してリンカー安定性の改善及び／又はＣＢＭ安定性の改善を示す。
上記のとおり、グリコシドヒドロラーゼは、１つ以上の触媒ドメイン及び１つ以上の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含有し、これらは、これらのドメインを連結する１つ以上のリンカー領域によって結合される。
特に好ましい酵素は、エンドグルカナーゼ活性などのセルラーゼを有するものである。特に、関連する触媒ドメインは、ｃａｚｙ．ｏｒｇで利用可能なＣＡＺＹデータベース上で概説されるＨｅｎｒｉｓｓａｔらの命名法を使用して、グリコシドヒドロラーゼファミリー４５（ＧＨ４５）の酵素に由来する。
触媒ドメインは、野生型又はそのバリアントを含み得る。
ある実施形態では、触媒ドメインは、配列番号１の１～２１２位に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、触媒ドメインは、配列番号２の１～２１１位に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、触媒ドメインは、配列番号３の１～２１０位に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、触媒ドメインは、配列番号４の１～２１０位に示されるとおりのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一態様では、触媒ドメインはさらに、本発明のバリアントにおいていくつかの置換を含み、２～２０個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換などの２～１０個及び２～５個である。
別の態様では、バリアントは、配列番号１における２５、３２、４１、４４、５６、７７、１０４、１３２、１３４、１４６、１４７、１５６、１６２、１６９、１８３、１８６、１９４、又は２０１に対応する位置の中で選択される位置で２個の置換を含むか又はそれらからなる。別の態様では、この位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌで置換される。
好ましい触媒ドメインは、変異Ａ３２Ｓ Ｓ５６Ａ Ｎ１３４Ｄ Ａ１４６Ｄ Ｑ１４７Ｒ Ｑ１６９Ｙ Ｆ１８３Ｖを有する配列番号５を含む。
本発明によるグリコシドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、天然のリンカーを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明によるグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドは、ＣＢＭ１バリアントと１つ以上の触媒コアを連結するプロリンリッチアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるとおりのプロリンリッチリンカーは、１つ以上のＰｒｏ－Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－Ｘａａ（又はＸａａ－Ｐｒｏ）、Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ又はＸａａ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（又はＰｒｏ－Ｘａａ－Ｘａａ）単位、例えば、ＰＰＰＰ（配列番号２７）、ＰＸＰＸ（配列番号９８）、ＸＰＸＰ（配列番号９９）、ＸＰＸＸＰＸ（配列番号１００）、ＸＸＰＸＸＰ（配列番号１０１）などを含み、任意選択によりさらなる繰り返しを含む。
例えば、リンカー領域は、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％のプロリンなどの少なくとも２５％のプロリン、例えば、少なくとも２８％のプロリン、少なくとも３０％のプロリン、少なくとも４０％のプロリン、少なくとも５０％のプロリンを含み得る。他の実施形態では、リンカーは、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％などの少なくとも５０％のプロリンを含み、全体的に負の電荷を有する。例えば、リンカー領域は、酸性の性質のアミノ酸を含む。
好ましくは、リンカー領域は、４～２８個のアミノ酸などの少なくとも４個及び３０個以下のアミノ酸、好ましくは４～２０個のアミノ酸、或いは４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸又は１０個のアミノ酸などの４～１０個のアミノ酸の長さを有する。
例示的なリンカー領域は、以下の任意選択による繰り返しモチーフ：
［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ及び
Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］（配列番号１０２）
のうちの１つ以上を含む。
他の好ましいリンカー領域は、以下の任意選択による繰り返しモチーフ：
［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］
［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ、及び／又は
Ｐ［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］［Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］
を含む。
特に好ましいリンカーは、示されるとおりの角括弧内の同じ、又は異なるアミノ酸の任意選択による繰り返しのモチーフを含む：
［Ｐ／Ｓ／Ｔ］Ｐ及び
Ｐ［Ｓ／Ｅ］ＰＴ（配列番号１０９）。
又はより具体的には、［Ｐ／Ｓ／Ｔ］Ｐによって表される任意選択による繰り返しモチーフは、ＰＰＰＰＰＰ（配列番号２９）、及びＰＰＳＰＴＰ（配列番号１１０）、ＰＰＴＰＴＰ（配列番号１１１）、ＰＰＳＰＳＰ（配列番号１１２）、ＳＰＰＰＴＰ（配列番号１１３）、ＳＰＴＰＰＰ（配列番号１１４）、ＳＰＰＰＰＰ（配列番号１１５）、ＳＰＴＰＴＰ（配列番号１１６）、ＴＰＰＰＳＰ（配列番号１１７）、ＴＰＳＰＰＰ（配列番号１１８）、ＴＰＰＰＰＰ（配列番号１１９）、ＴＰＳＰＳＰ（配列番号１２０）を含み、Ｐ［Ｓ／Ｅ］ＰＴ（配列番号１０９）によって表される任意選択による繰り返しモチーフは、ＰＳＰＴＰＥＰＴ（配列番号１２１）、ＰＳＰＴＰＥＰＴＰＳＰＴＰＥＰＴ（配列番号１２２）、ＰＥＰＴＰＳＰＴ（配列番号１２３）、ＰＥＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴ（配列番号１２４）などを含むことになる。
例示的なリンカーはさらに、
（ａ）（ＳＰ）ａ、ａ＝２～１０；
（ｂ）（ＰＳ）ａ、ａ＝２～１０；
（ｃ）Ｐｂ、ｂ＝４～２０、好ましくは４～１５；
（ｄ）（ＰＥＰＴ（配列番号１２５））ｃ、ｃ＝２～５；
（ｅ）（ＰＳＰＴ（配列番号１０４））ｄ、ｄ＝２～５；
（ｆ）（Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］（配列番号１０２））ｅ、ｅ＝２～５；
（ｇ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］Ｐ）ｆ、ｆ＝２～１０、好ましくは２～５；
（ｈ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ］）ｇ、ｇ＝２～６；
（ｉ）（［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］［Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ］Ｐ）ｈ、ｈ＝２～５；
（ｊ）（ＴＰ）ｉ、ｉ＝２～１０；
（ｋ）（［Ｓ／Ｔ／Ｐ］［Ｓ／Ｔ／Ｐ］［Ｓ／Ｔ／Ｐ］）ｊ、ｊ＝２～１１；
（ｌ）及び／又はその組み合わせを含み、それぞれの単量体単位の組み合わせが企図される。
これらのモチーフの組み合わせが含まれるとき、最小の繰り返し単位は、単量体単位である。例えば、リンカーは、ＳＰＰＥＰＴ（配列番号１２６）、ＳＰＰＳＰＴ（配列番号１２７）、ＰＳＰＥＰＴ（配列番号１２８）、ＰＳＰＳＰＴ（配列番号１２９）を含む。
追加の例示的なリンカーとしては、ＳＰＳＰ（配列番号１３０）、ＳＰＳＰＳＰ（配列番号１３１）、ＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号１３２）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号５８）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号１３３）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号１３４）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号１３５）、ＰＰＰＰ（配列番号２７）、ＰＰＰＰＰ（配列番号２８）、ＰＰＰＰＰＰ（配列番号２９）、ＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号３１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３６）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３７）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３８）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３９）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４２）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４３）、ＰＥＰＴＰＥＰＴ（配列番号１４４）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴ（配列番号１４５）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴ（配列番号１４６）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴ（配列番号７９）、ＰＳＰＴＰＳＰＴ（配列番号１４７）、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴ（配列番号１４８）、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴ（配列番号１４９）、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴ（配列番号１５０）、ＳＰＳＳＰＳ（配列番号１５１）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳ（配列番号１５２）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳ（配列番号１５３）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳ（配列番号１５４）、ＴＰＴＴＰＴ（配列番号１５５）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴ（配列番号１５６）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴ（配列番号１５７）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴ（配列番号１５８）、ＰＥＰＴＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴ（配列番号１５９）、ＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴ（配列番号１６０）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴ（配列番号１６１）、ＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴ（配列番号１６２）、ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴ（配列番号１６３）、ＰＥＰＴＰＱＰＴ（配列番号１６４）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴ（配列番号１６５）、ＰＥＰＴＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ（配列番号８５）、ＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ（配列番号８７）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ（配列番号８８）、ＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ（配列番号８９）、ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ（配列番号９０）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＧ（配列番号９１）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号９２）、ＰＰＰＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ（配列番号８２）、ＴＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰ（配列番号１６６）；ＴＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰ（配列番号１６７）、ＴＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰ（配列番号１６８）、ＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰ（配列番号１６９）が挙げられる。
追加の例示的なリンカーは、上記のリンカー、及びＣ末端グリシンを含み、例えば、ＳＰＳＰＧ（配列番号２４）、ＳＰＳＰＳＰＧ、ＳＰＳＰＳＰＳＰＧ、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ（配列番号２５）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ、ＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３２）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３３）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３４）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３５）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３６）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７２）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号３７）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号３８）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号３９）、ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号４０）、ＰＳＰＴＰＳＰＴＧ、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ（配列番号４１）、ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ（配列番号４２）、ＳＰＳＳＰＳＧ（配列番号９４）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ（配列番号９５）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ（配列番号１９）、ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ（配列番号２０）、ＴＰＴＴＰＴＧ（配列番号９６）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ（配列番号９７）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ（配列番号１７）、ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ、ＰＥＰＴＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ（配列番号８５）、ＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ（配列番号８７）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ（配列番号８８）、ＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ（配列番号８９）、ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ（配列番号９０）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＧ（配列番号９１）、ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ（配列番号９２）、ＰＰＰＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ（配列番号８２）、ＴＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ（配列番号１２）；ＴＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ（配列番号１３）、ＴＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ（配列番号１４）、ＴＴＰＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ（配列番号１５）、ＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＧ（配列番号１６）である。
特に好ましいリンカーは、主に又は独占的にプロリンを含むものであり、例えば、ＰＰＰＰ（配列番号２７）、ＰＰＰＰＰ（配列番号２８）、ＰＰＰＰＰＰ（配列番号２９）、ＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号３１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３６）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３７）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３８）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１３９）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４２）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１４３）、ＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＧ、ＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３２）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３３）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３４）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３５）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７０）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３６）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７１）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号１７２）である。
上で考えられる実施形態に関して、当業者は、目的がさらなる安定性をもたらす本明細書のプロリンリッチリンカーで目的の親のリンカーを置き換えることであることを理解するであろう。
代替的な実施形態では、リンカーは、プロリンへの変異を含む、安定化点変異を有する親分子のリンカーのバリアントとして考えられ得る。
特に好ましい実施形態では、リンカーは、表Ａにおける以下のいずれかから選択される。
表Ａ．好ましいリンカー
ＴＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１２）
ＴＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１３）
ＴＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１４）
ＴＴＰＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１５）
ＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＧ （配列番号１６）
ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号１７）
ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号１８）
ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号１９）
ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号２０）
ＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＧ （配列番号２１）
ＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＧ （配列番号２２）
ＰＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号２３）
ＳＰＳＰＧ （配列番号２４）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ （配列番号２５）
ＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号２６）
ＰＰＰＰ （配列番号２７）
ＰＰＰＰＰ （配列番号２８）
ＰＰＰＰＰＰ （配列番号２９）
ＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３０）
ＰＰＰＰＰＰＰ （配列番号３１）
ＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３２）
ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３３）
ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３４）
ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３５）
ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３６）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３７）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３８）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３９）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４０）
ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号４１）
ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号４２）
ＰＱＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号４３）
ＰＤＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号４４）
ＰＲＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４５）
ＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４６）
ＰＳＰＮＳＰＮＳＰＮＧ （配列番号４７）
ＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号４８）
ＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号４９）
ＰＤＰＴＰＤＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号５０）
ＰＱＰＴＰＱＰＴＰＱＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号５１）
ＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号５２）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＰＰＧ （配列番号５３）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＤＰＧ （配列番号５４）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＫＰＧ （配列番号５５）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＡＰＧ （配列番号５６）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＧ （配列番号５７）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ （配列番号５８）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳ （配列番号５９）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＰ （配列番号６０）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＥ （配列番号６１）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＮ （配列番号６２）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧＧ （配列番号６３）
ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＫ （配列番号６４）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰ （配列番号６５）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＲ （配列番号６６）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰ （配列番号６７）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号６８）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＴＰＴＧ （配列番号６９）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＧＰＴＧ （配列番号７０）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号７１）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＴＧ （配列番号７２）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＤ （配列番号７３）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＥ （配列番号７４）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰ （配列番号７５）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＳＰＴ （配列番号７６）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＴ （配列番号７７）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＴ （配列番号７８）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴ （配列番号７９）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＳ （配列番号８０）
ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＲ （配列番号８１）
ＰＰＰＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８２）
ＰＰＰＧＧＰＧＧＴＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８３）
ＰＰＳＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８４）
ＰＥＰＴＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号８５）
ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号８６）
ＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ （配列番号８７）
ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号８８）
ＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号８９）
ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ （配列番号９０）
ＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号９１）
ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号９２）
ＴＰＰＴＰＰＧ （配列番号９３）
ＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号９４）
ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号９５）
ＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号９６）
ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号９７）
特定の実施形態では、リンカーは、ＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号３１）、ＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３０）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号５８）又はＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ（配列番号２５）である。
いくつかの態様では、本発明のバリアントは、参照酵素／親酵素に対して特性の改善を有する。
一態様では、特性の改善は、安定性の増大、例えば、タンパク質分解安定性の改善、洗剤安定性の改善、洗浄中の安定性の改善又は熱安定性の改善である。別の態様では、特性の改善は、同様の条件で保管された親分子の性能に対する洗剤組成物の生成中の安定性の増大又は洗剤組成物中での保管後の性能の上昇である。本発明のいくつかの態様は、セルラーゼバリアントが適切なアッセイにおいて目的の特性について試験されるとき、１を超える改善係数を有するセルラーゼバリアントに関し、参照酵素／親酵素の特性は、１の値が与えられる。いくつかの態様では、特性は、タンパク質分解安定性の改善などの安定性である。本発明のいくつかの態様は、セルラーゼバリアントが実施例２に記載されるアッセイにおいて目的の特性について試験されるとき、１を超える改善係数を有するセルラーゼバリアントに関し、参照酵素／親酵素の特性は、１の値が与えられる。いくつかの態様では、特性は、タンパク質分解安定性などの安定性である。
いくつかの態様では、特性の改善は、安定性の増大、例えば、洗剤安定性の改善、洗浄中の安定性の改善及び熱安定性の改善である。本発明のいくつかの態様は、セルラーゼバリアントが適切なアッセイにおいて目的の特性について試験されるとき、１を超える改善係数を有するセルラーゼバリアントに関し、参照酵素／親酵素の特性は、セルラーゼバリアントが実施例７に記載されるアッセイにおいて目的の特性について試験されるときなど、１の値が与えられる。
いくつかの態様では、特性の改善は、熱安定性の改善である。
いくつかの態様では、特性の改善は、洗剤中の安定性の改善である。
いくつかの態様では、特性の改善は、タンパク分解安定性の改善である。
いくつかの態様では、特性の改善は、熱安定性の改善、洗剤安定性の改善、タンパク質分解安定性の改善の１つ以上又は全てである。
本発明によるバリアントは、残存活性比（ＲＡＲ）＝（ＲＡ、バリアント）／（ＲＡ、参照）として定義される残存活性比が、参照セルラーゼと比較して１．０を超えるとき、測定される条件下で改善される。
特定の好ましい態様では、本発明によるバリアントは、安定性（例えば、熱安定性、洗剤安定性、タンパク質分解安定性、又はこれらの２つ以上又は全て）の改善をもたらし、ＲＡＲ＞１．０である。いくつかの態様では、本発明によるバリアントは、親又は参照酵素と比較して、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のセルラーゼと比較して、少なくとも１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．１；２．２；２．３；２．４；２．５；２．６；２．７、２．８；２．９；３．０、３．１；３．２；３．３；３．４；３．５、３．６、３．７、３．８、３．９；４．０、４．１；４．２；４．３；４．４；４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１；５．２；５．３；５．４；５．５、５．６、５．７、５．８、５．９；３．０、６．１；６．２；６．３；６．４；６．５、６．６、６．７、６．８、６．９；７．０、７．１；７．２；７．３；７．４；７．５、７．６、７．７、７．８、７．９；８．０、８．１；８．２；８．３；８．４；８．５、８．６、８．７、８．８、８．９；９．０、９．１；９．２；９．３；９．４；９．５、９．６、９．７、９．８、９．９；１０．０、１０．１；１０．２；１０．３；１０．４；１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９；１２、１５、１６、２０、２５又は３０である残存活性比（ＲＡＲ）を有する。
１つの好ましい実施形態は、安定性の改善を有するセルラーゼバリアントに関し、配列番号１と比較してＲＡＲ＞１．０である。１つの好ましい実施形態は、安定性の改善を有するセルラーゼバリアントに関し、残存活性比（ＲＡＲ）は、実施例２に記載されるとおりに測定されるとき、配列番号１と比較して、少なくとも１．５である。
バリアントはさらに、１つ以上の（例えば、いくつかの）他の位置に１つ以上の追加の改変を含み得る。
アミノ酸の変化は、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に著しく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換又は挿入；典型的には１～３０アミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端伸長；最大２０～２５残基の小さいリンカーペプチド；又は正味の電荷又は別の機能を変えることにより精製を容易にする、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープ又は結合ドメインなどの小規模な伸長である軽微なものであり得る。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群に含まれる。概して比活性を変えないアミノ酸置換は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換としては、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
或いは、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変えられるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改善する場合があり、基質特異性を変える場合があり、至適ｐＨを変える場合などがある。
ポリペプチドにおいて必須のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当該技術分野で知られる手順に従って同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５）。後者の技術では、分子の活性に極めて重要なアミノ酸残基を同定するために、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入して、結果として生じる変異体分子をセルロース分解活性について試験する。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９－４７０８も参照されたい。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用は、推定される接触部位アミノ酸の変異との組み合わせにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折又は光親和性標識などの技術によって測定される構造の物理的分析によって判定することもできる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９－６４を参照されたい。必須アミノ酸の同一性はまた、関連ポリペプチドとのアラインメントから推測され得る。
表Ｂ．は、本発明によるＣＢＭバリアントを組み込む例示的な好ましいグリコシドヒドロラーゼバリアントを提供し、比較での参照の容易さから表の形式で提供される。本明細書の表において使用されるとおり、バリアントは、ＮからＣ末端の順に全体として表され、それぞれの列で指定される配列間に追加のリンカー又はさらなる修飾を有しない。したがって、以下の表で表されるバリアント１は、以下の配列として同等に表され得る。
Figure 2023520312000002
Figure 2023520312000003
Figure 2023520312000004
Figure 2023520312000005
Figure 2023520312000006
Figure 2023520312000007
プロテアーゼの存在下での安定性
ある実施形態では、ＣＢＭバリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントは、親酵素と比較してプロテアーゼの存在下での安定性の改善を有する。好ましくは、バリアントは、親セルラーゼと比較して、プロテアーゼ及び洗剤組成物などの界面活性剤の存在下での安定性の改善を有する。
プロテアーゼの存在下での安定性は、セルラーゼが機能的であり、活性であり、且つそれらが意図された機能を発揮し得る時間を延長するため、例えば、プロテアーゼが存在する条件下で使用されるセルラーゼにとって有益である。
本発明のバリアントの１つの好ましい使用は、プロテアーゼが典型的に洗剤を改善するために含まれる洗剤中におけるものである。本発明のバリアントの安定性の改善は、バリアントが、親セルラーゼと比較して洗濯プロセス中により長い時間セルロース分解活性を発揮することができ、それにより親セルラーゼと比較して改善された洗浄性能の利点をもたらすことができることを意味する。
液体洗剤組成物に関して、本発明のバリアントはさらに、プロテアーゼの存在下での安定性の改善は、プロテアーゼを含み、且つ本発明のバリアントをさらに含む液体洗剤組成物が、親セルラーゼを含む同じ液体洗剤組成物と比較してより長い貯蔵寿命を有することを意味するという利点を有する。
プロテアーゼの存在下での安定性は、プロテアーゼの存在下での規定された条件下で所与のセルラーゼをインキュベートし、インキュベーション後のセルロース分解活性を測定し、それをプロテアーゼとインキュベートされていないセルラーゼの試料と比較することによって決定され得る。
プロテアーゼの存在下での安定性を決定するための別の方法は、プロテアーゼを含む規定された溶液中で試験されることになる所与のセルラーゼを含む２つの同一の試験チューブを調製して、高温下で、例えば、３０～９０℃（負荷）の範囲において一方の試験チューブをインキュベートする一方で、他方のチューブは、低温、例えば、０～５℃（非負荷）の範囲においてインキュベートされる。チューブは、既定の時間、例えば、１～２４時間、典型的には１６時間インキュベートされる。インキュベーション後、両方の試料は、セルロース分解活性について分析され、残存活性は、
残存活性（％）＝（活性、負荷／活性、非負荷）＊１００
として決定される。
例えば、０．１６６ｖ／ｖ－％プロテアーゼを含有する５０％の液体洗剤Ａ中で残存活性を決定することが可能であり、試料は、活性が決定される前に高温（負荷）及び５℃（非負荷）で１６時間インキュベートされる。温度は、親分子の残存活性が１０～５０％の範囲にあるように選択されるべきである。
この中心的な安定性の方法は、実施例１においてより詳細に示される。
本発明のバリアントは、親セルラーゼより高い残存活性を有する。一実施形態では、本発明のバリアントは、親セルラーゼと比較して少なくとも１０％高い残存活性、例えば、親と比較して、少なくとも２０％高い残存活性、例えば、少なくとも３０％高い残存活性、例えば、少なくとも４０％高い残存活性、例えば、少なくとも５０％高い残存活性、例えば、少なくとも６０％高い残存活性、例えば、少なくとも７０％高い残存活性、例えば、少なくとも８０％高い残存活性、例えば、少なくとも９０％高い残存活性又は少なくとも１００％高い残存活性を有する。
しかしながら、熱安定性を試験するために使用される従来の酵素安定性アッセイにおいて、負荷された試料及び負荷されていない試料の活性測定は通常、例えば、４－メチルウンベリフェリル－β－セロペンタオシド又は可溶性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの小さい合成基質を使用することによって、酵素分子の触媒部位に影響を及ぼす変化を測定することに着目した。
しかしながら、重要なことに、負荷による目的の酵素の他の特性（酵素の活性部位に直接的に影響を及ぼさないが、用途上酵素の機能にとって重要な特性）の変化は、必ずしもこれらのアッセイにおいて検出されない。１つのそのような例は、例えば、洗濯洗剤及び織物ケア製品において綿毛及び毛玉を除去するために使用されるセルラーゼの場合のような、リンカーによって結合される別々の触媒ドメイン及びＣＢＭを有するグリコシルヒドロラーゼである。負荷が、触媒ドメイン部分ではない分子のリンカー及び／又はＣＢＭ部分にのみ影響を及ぼす場合、これらの変化は、上記及び／又は実施例１に記載されるとおりの従来のアッセイによって検出されないことになる。ＣＭＣ又は４－メチルウンベリフェリル－β－セロペンタオシドなどの試料基質を使用するとき、活性は、負荷の間に維持されるように見えるが、酵素分子のＣＢＭ部分が、処理されることになる織物の適切な位置に酵素を導く際に重要な役割を果たすため、性能は著しく影響を及ぼされる。
代替として、性能に関するＣＢＭの重要性は、触媒ドメインの性能を、インタクトなリンカー及びＣＢＭを有する触媒ドメインのものと比較することによって試験され得る。
負荷された条件下での保管後のリンカー及び／又はＣＢＭにおける変化を検出するために、負荷が酵素の性能に影響を及ぼしている場合、試験しているときに特別な測定がなされなければならない。これは、負荷の前及び後に酵素の性能を比較することによってなされ得る。或いは、それは、酵素の綿リンターなどのその天然の不溶性基質への結合が、安定性を試験し、且つ／又は結晶セルロース又は綿リンターへの酵素の結合に対して第１のプロービングを行い、続いて全体活性と比較してセルロースへのそれらの結合能を喪失した酵素の活性を測定するために使用されるアッセイの一部として含まれることを確実にすることによって試験され得る。
したがって、リンカー及び／又はＣＢＭの安定性は、プロテアーゼを含有する洗剤中でセルラーゼをインキュベートした後、インキュベートされたセルラーゼのセルロース繊維に結合する能力を決定することによって測定される。リンカー又はセルロース結合ドメインがプロテアーゼによって影響を及ぼされる場合、セルロース繊維に対するセルラーゼの結合親和性は低減されることになる。
このリンカー及びＣＢＭに特異的なアッセイは、実施例２に記載される条件によって示される。
親ポリペプチドは、一方のポリペプチドの領域がもう一方のポリペプチドの領域のＮ末端又はＣ末端で融合されているハイブリッドポリペプチドであり得る。
親は、別のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合されている融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、当該技術分野で知られており、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがインフレームであり、且つ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるように結合することを含む。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に作製されるインテイン技術を使用して構築され得る（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５－２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６－７７９）。
融合ポリペプチドはさらに、２つのポリペプチド間の切断部位を含むことができる。融合タンパク質が分泌されると、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離する。開裂部位の例としては、下記で開示されている部位が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８－５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５－２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ－Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８－３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８－５０３；及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８－３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５－５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ－Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２－９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０－２４８；及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５－４８。
親は、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的のために、「から得られる」という用語は、所与の供給源に関連して本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドによりコードされる親が、供給源により産生されているか又は供給源からのポリヌクレオチドが挿入されている株により産生されていることと意味する。一態様では、親は細胞外に分泌される。親は、細菌のセルラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、若しくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のセルラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、若しくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）のセルラーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
一態様では、親は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のセルラーゼである。
別の態様では、親は、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、又はストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）のセルラーゼである。
別の態様では、親は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）のセルラーゼである。
親は、真菌のセルラーゼであり得る。例えば、親は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、若しくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のセルラーゼなどの酵母セルラーゼ；又はアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシヂウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスパエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、カエトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ディプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシディウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスティゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピラス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニンファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スシタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポカラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、若しくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）のセルラーゼなどの糸状真菌セルラーゼであり得る。
別の態様では、親は、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）のセルラーゼである。
別の態様では、親は、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコーラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・へテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボマイセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピローサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルバナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・サブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のセルラーゼである。
別の態様では、親は、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）のセルラーゼ、例えば、配列番号１のセルラーゼ又はその成熟したポリペプチドである。
前述の種に関して、本発明は、完全及び不完全な状態の両方並びにそれらが知られている種の名称にかかわらず、他の分類学上の均等物、例えば、アナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかのカルチャーコレクションにおいて公的に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然界（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離される微生物又は天然の物質（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られるＤＮＡ試料を含む他の供給源から同定され且つ得られてもよい。自然の生育地から微生物及びＤＮＡを直接単離するための手法は、当該技術分野においてよく知られている。次に、親をコードするポリヌクレオチドを、別の微生物のゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡライブラリー又は混合ＤＮＡ試料を同様にスクリーニングすることによって得てもよい。１つ又は複数のプローブを用いて親をコードするポリヌクレオチドを検出してから、当業者に知られる技術を利用することにより、ポリヌクレオチドを単離又はクローン化することができる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
バリアントの調製
本発明はまた、グリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントを得るための方法であって、（ａ）親グリコシドヒドロラーゼに、アラインメントのために配列番号１７３を使用してＣＢＭ１の１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９、３４及び／又は３７位に対応する位置で親ポリペプチドの成熟したポリペプチドの１つ以上の置換を導入すること；並びに（ｂ）バリアントを回収することを含む方法に関する。
バリアントは、部位特異的変異誘発、合成的遺伝子構築、半合成的遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャッフリングなどの当該技術分野で知られる任意の変異誘発手順を使用して調製され得る。
部位特異的変異誘発は、１つ以上の（例えば、いくつかの）変異が親をコードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の定義された部位で導入される手法である。
部位特異的変異誘発は、所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによってインビトロで達成され得る。部位特異的変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中の部位での制限酵素による開裂、及びその後のこのポリヌクレオチド中の変異を含むオリゴヌクレオチドのライゲーションを含むカセット変異誘発によってもインビトロで実施され得る。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミド及びインサートの付着末端が互いにライゲートされ得る。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９－４９５５；及びＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９－４９６６を参照されたい。
部位特異的変異誘発はまた、当該技術分野で知られる方法によってインビボで達成され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３－７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５－２９０；及びＣａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５－１６を参照されたい。
任意の部位特異的変異誘発手順が、本発明において使用され得る。バリアントを調製するために使用され得る利用可能なキットが多数市販されている。
合成遺伝子構築法は、目的のポリペプチドをコードするために設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成を、Ｔｉａｎら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０－１０５４）により説明されている多重マイクロチップベース技術、及びオリゴヌクレオチドが合成されて光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で組み立てられる同様の技術等の多くの技術を利用して実施し得る。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、既知の変異誘発、組み換え及び／又はシャッフリングの方法、続いてＲｅｉｄｈａａｒ－Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３－５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６；２１５２－２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットに開示されているものなどの関連するスクリーニング手順を使用してなされ、試験され得る。使用され得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０；１０８３２－１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６；１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７；１２７）が挙げられる。
変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されるクローン化された変異誘発ポリペプチドの活性を検出するためのハイスループットの自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３－８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異が誘発されたＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当該技術分野における標準的な方法を使用して容易に配列決定することができる。この方法により、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定が可能になる。
半合成的遺伝子構築は、合成的遺伝子構築、及び／又は部位特異的変異誘発、及び／又はランダム変異誘発、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。したがって、遺伝子の規定された領域は、新規に合成されてもよいが、他の領域は、部位特異的変異誘発プライマーを使用して増幅されてもよく、さらに他の領域は、エラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅にかけられてもよい。次に、ポリヌクレオチド部分配列は、シャッフリングされてもよい。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチドに関する。
核酸構築物
本発明はまた、本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドが、制御配列と適合する条件下で好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、バリアントの発現をもたらす様々な方法において操作され得る。ベクターに挿入する前に、発現ベクターに応じてポリヌクレオチドを操作することが望ましいか、又は必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用した、ポリヌクレオチドを改変するための技法は、当該技術分野においてよく知られている。
制御配列は、プロモーター（ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチド）であってもよい。プロモーターは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含んでいる。プロモーターは、変異体、短縮型及びハイブリッドプロモーターを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、宿主と同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
細菌性宿主細胞内で本発明の核酸構築物の転写を誘導する好適なプロモーターの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３；９７－１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｃプロモーター（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９；３０１－３１５）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原核生物のβ－ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１）から得られるプロモーター、並びにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）である。さらなるプロモーターは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４－９４中の”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、上掲に記載される。国際公開第９９／４３８３５号パンフレットでは、タンデムプロモーターの例が開示されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を誘導するための好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アルファ－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の酸安定性アルファ－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のダリア（Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のクイン（Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－キシロシダーゼ、及びから得られるプロモーター、並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（非翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の中性アルファ－アミラーゼ遺伝子に由来する改変プロモーターであり；非限定的な例としては、非翻訳リーダーが、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置き換えられたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アルファ－アミラーゼ遺伝子に由来する改変プロモーターが挙げられる）；並びにその変異体、短縮型及びハイブリッドプロモーターが挙げられる。
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のメタロチオネイン（ＣＵＰ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８によって記載される。
制御配列はまた、転写を終了するために宿主細胞によって認識される転写ターミネーターであってもよい。ターミネーター配列は、バリアントをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞中で機能的な任意のターミネーターが使用され得る。
細菌性宿主細胞のための好ましいターミネーターは、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）のアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα－アミラーゼ（ａｍｙＬ）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
糸状真菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のアルファ－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主のための好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素に関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、上掲によって記載される。
制御配列は、プロモーターの下流及び遺伝子の発現を増大させる遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域でもあり得る。
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５－３４７１）から得られる。
制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡのリーダー非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、バリアントをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能的な任意のリーダーを使用してもよい。
糸状真菌宿主細胞のために好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼに関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
制御配列はまた、バリアントコード配列の３’末端に作動可能に連結された配列であり、転写されるとき、宿主細胞によってシグナルとして認識され、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞内で機能的な任意のポリアデニル化配列を使用してもよい。
糸状真菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のα－グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母菌宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３－５９９０によって記載される。
制御配列はまた、バリアントのＮ末端に連結されるシグナルペプチドをコードし、且つバリアントを細胞の分泌経路に導くシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、バリアントをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠において本来連結されるシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。或いは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード配列を含み得る。外来シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要とされる場合がある。或いは、外来シグナルペプチドコード配列により、バリアントの分泌を増強するために天然のシグナルペプチドコード配列を単に置き換えてもよい。しかしながら、発現されたバリアントを宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード配列が使用され得る。
細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のサブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のベータ－ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアルファ－アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９－１３７によって記載される。
糸状真菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のセルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のエンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）のリパーゼ及びリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
酵母菌宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、上掲によって記載される。
制御配列はまた、バリアントのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするポリペプチドコード配列であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によっては酵素前駆体）として知られる。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、このプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的な開裂により、活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子の遺伝子から得られてもよい。
シグナルペプチド及びプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は、バリアントのＮ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
宿主細胞の増殖に対してバリアントの発現を制御する制御配列を加えることが望ましい場合もある。制御系の例は、制御化合物の存在を含む化学的刺激又は物理的刺激に反応して遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。原核生物系での制御系としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系、及びｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用され得る。糸状真菌において、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼプロモーターが使用され得る。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの制御配列として、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、バリアントをコードするポリヌクレオチドは、制御配列に作動可能に連結されているであろう。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチド、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。１つ以上の都合のよい制限部位を含み、そのような部位でバリアントをコードするポリヌクレオチドを挿入又は置換することを可能にし得る組み換え発現ベクターを作製するために、様々なヌクレオチド及び制御配列を共に連結してもよい。或いは、発現に適切なベクターにポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を挿入することによってポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを作製する際に、コード配列が発現に適切な制御配列に作動可能に連結されるように、コード配列をベクター内に配置する。
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順を好都合に施すことができ、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能な任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得る。このベクターの選択は、典型的には、このベクターと、このベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存することになる。このベクターは、直鎖状又は閉環状のプラスミドであり得る。
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは独立した染色体外のエレメントとして存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、微小染色体、又は人工染色体であり得る。このベクターは、確実に自己複製するための任意の手段を含み得る。代わりに、このベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを一緒に含む単一のベクター若しくはプラスミド又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドが使用され得る。
ベクターは、好ましくは、形質転換されたか、トランスフェクトされたか、形質導入されたか、又は同類の細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、遺伝子であって、その産物が、殺生物剤又はウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性、及び同類のものをもたらす、遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例には、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性、スペクチノマイシン耐性、又はテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーがある。酵母宿主細胞に好適なマーカーとして、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにそれらの均等物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞中での使用に好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込み又はゲノムと独立して細胞内でのベクターの自己複製を可能にするエレメントを含有する。
宿主細胞ゲノム中への組み込みに関して、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中への組み込みのために、バリアントをコードするポリヌクレオチドの配列又はベクターの任意の他のエレメントに依拠し得る。代わりに、ベクターは、染色体中の正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同組み換えによる組み込みを指示するための追加のポリヌクレオチドを含む場合がある。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込みエレメントは、十分な数の核酸（例えば、１００～１０，０００個の塩基対、４００～１０，０００個の塩基対、及び８００～１０，０００個の塩基対）を含有するべきであり、この核酸は、相同組み換えの可能性を高めるために、対応する標的配列に対する配列同一性が高い。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、ポリヌクレオチドをコードしていなくてもよいし、コードしていてもよい。一方、ベクターは、非相同組み換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律的な複製の場合、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターが自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。複製起点は、細胞中で機能する自律的な複製を媒介する任意のプラスミド複製開始点であり得る。「複製起点」又は「プラスミド複製開始点」という用語は、プラスミド又はベクターがインビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で複製可能なｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４プラスミド、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）で複製可能なｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１プラスミドの複製起点がある。
酵母菌宿主細胞に使用される複製起点の例には、２ミクロンの複製起点であるＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１及びＣＥＮ３の組み合わせ、並びにＡＲＳ４及びＣＥＮ６の組み合わせがある。
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例には、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１がある（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８；６１－６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３－９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離並びにこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットで開示されている方法に従って達成され得る。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞内に挿入して、バリアントの生成を増加させ得る。ポリヌクレオチドのコピー数を増大させることは、配列の少なくとも１つのさらなるコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことによって、又はポリヌクレオチドに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることによって達成することができ、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することにより、増幅されたコピーの選択マーカー遺伝子を含む細胞、したがってさらなるコピーのポリヌクレオチドを含む細胞を選択することができる。
上記のエレメントを連結して本発明の組み換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、上掲）。
宿主細胞
本発明はまた、組み換え宿主細胞であって、本発明のバリアントの生成を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている本発明のバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、構築物又はベクターが染色体組み込み体として又は先に記載される自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞中に導入される。「宿主細胞」という用語は、親細胞の任意の子孫であって、複製中に生じた変異に起因して親細胞と同一ではない子孫を包含する。宿主細胞の選択は、バリアントをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存することになる。
宿主細胞は、バリアントの組み換え産生において有用な任意の細胞、例えば、原核生物又は真核生物であり得る。
原核生物の宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、及びウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞を含む任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の細胞を含む任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でもあり得る。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞を含む任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞でもあり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１－１１５を参照されたい）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３－８２９、又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ－Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９－２２１を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２－７５１を参照されたい）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１－５２７８を参照されたい）によって行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７－５８０を参照されたい）、又はエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７－６１４５を参照されたい）によって行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９－４０５を参照されたい）、コンジュゲーション（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３－３５８５を参照されたい）、又は形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９－６２９４を参照されたい）によって行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７を参照されたい）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１－５７を参照されたい）によって行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、自然形質転換能（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５－１２９７を参照されたい）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９－２０７を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００－３８０４を参照されたい）、又はコンジュゲーション（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９－４３６を参照されたい）によって行われ得る。しかしながら、宿主細胞にＤＮＡを導入するための当該技術分野で知られる任意の方法が使用され得る。
宿主細胞はまた、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞などの真核生物であり得る。
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「真菌」としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、並びに卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫで定義される）が挙げられる。
真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「酵母」としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母、及び不完全菌類（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が挙げられる。酵母の分類は将来変更される場合があるため、本発明の目的上、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるとおりに定義されるものとする。
酵母宿主細胞は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞、例えば、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞であり得る。
真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞であり得る。「糸状真菌」は、真菌類及び卵菌類の亜門の全ての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記参照で定義されている）。糸状真菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複雑な多糖で構成されている菌糸体の壁を特徴としている。栄養生長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養生長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞であり得る。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノンシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・サブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオラス・ハースタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体知られている方法において、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４、及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換のための好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７－１５６、及び国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載される。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２－１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０により記載される手順を使用して形質転換され得る。
生成方法
本発明は、バリアントを生成する方法であって、（ａ）このバリアントの発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；及び（ｂ）バリアントを回収することを含む方法にも関する。
宿主細胞は、当該技術分野において知られる方法を使用してバリアントの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中において並びにバリアントの発現及び／又は単離が可能になる条件下で実施される実験用又は工業用発酵槽におけるフラスコ振盪培養、又は小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体状態の発酵を含む）により培養され得る。この培養を、当該技術分野で知られる手順を使用して、炭素源及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行う。好適な培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、又は公開されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログで公開されている組成）に従って調製され得る。バリアントが栄養培地に分泌される場合、バリアントは、培地から直接的に回収することができる。バリアントが分泌されない場合、それは、細胞可溶化物から回収することができる。
バリアントは、バリアントに特異的である当該技術分野において知られる方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、特異抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵素アッセイを使用して、このバリアントの活性を決定してもよい。
バリアントは、当該技術分野において知られる方法を使用して回収され得る。例えば、バリアントは、採取、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されない従来の手順によって栄養培地から回収され得る。
バリアントは、実質的に純粋なバリアントを得るための、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、溶解度の相違（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において知られる様々な手順によって精製され得る。
代替的な態様では、バリアントは回収されず、むしろバリアントを発現する本発明の宿主細胞がバリアントの供給源として使用される。
洗剤組成物
一実施形態では、本発明は、１種以上の追加のクリーニング組成物構成成分と組み合わせて本発明の酵素を含む洗剤組成物に関する。追加の構成成分の選択は、当業者の技術の範囲内であり、下記の例示的な非限定的な構成成分を含む従来の成分を含む。
構成成分の選択は、織物ケアのために、クリーニングされる織物の種類、汚れの種類及び／又は程度、クリーニングが行われる温度、並びに洗剤製品の配合の検討を含み得る。下記の構成成分は、特定の機能性に従って一般的な見出しにより分類されているが、これは、当業者に理解されるように、構成成分が追加の機能性を含み得るため、限定として解釈されるべきではない。
一実施形態では、本発明は、１種以上の追加の洗濯洗剤組成物構成成分、特に、プロテアーゼと組み合わせて本発明の酵素を含む液体洗濯洗剤組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、プレスポッター又は汚れ除去促進剤などの洗濯において使用される補助的な製品を含む。本発明はまた、１種以上の追加のＡＤＷ組成物構成成分と組み合わせて本発明の酵素を含むＡＤＷ（自動食器洗浄）組成物に関する。追加の構成成分の選択は、当業者の技術の範囲内であり、下記の例示的な非限定的な構成成分を含む従来の成分を含む。
本発明の一実施形態では、本発明のＣＢＭ１バリアントを含むグリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアントは、洗浄液の１リットル当たり０．００５～１００ｍｇのタンパク質、好ましくは、０．０１～５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは、０．０５～２０ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．１～１０ｍｇのタンパク質などの、０．００１～２００ｍｇのタンパク質に対応する量において洗剤組成物に加えられ得る。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えば、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又は４－ホルミルフェニルホウ酸などのフェニルホウ酸誘導体を使用して安定化されてもよく、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレット及び国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されるとおりに配合され得る。
本発明のポリペプチドはまた、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９７／０７２０２号パンフレットで開示される洗剤配合物に組み込まれ得る。
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性及び／若しくはカチオン性及び／若しくは非イオン性及び／若しくは半極性及び／若しくは双性イオン性、又はこれらの混合物であり得る１種以上の界面活性剤を含んでもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種以上の非イオン性界面活性剤及び１種以上のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は通常、約５％～約５０％、又は約１０％～約５０％、又は約２０％～約５０％などの約５重量％～６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、当該技術分野において知られる任意の従来の界面活性剤を含み得る。
含まれる場合、洗剤は通常、約１０％～約２５％を含む、約５％～約４０％などの約５重量％～約６０重量％の１種以上のアニオン性界面活性剤を含有することになり、アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩及びスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、アルファ－オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン－２，３－ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネート及びジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキルスルフェート（ＡＳ）、脂肪族アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第１級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェート又は脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても知られるＡＥＳ又はＡＥＯＳ又はＦＥＳ）、第２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα－スルホ脂肪酸メチルエステル（α－ＳＦＭｅ又はＳＥＳ）、アルキル－又はアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸又は脂肪酸の塩（石鹸）又は脂肪酸のジエステル及びモノエステル、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は通常、約０．１重量％～約１０重量％のカチオン性界面活性剤、例えば、約０．１％～約５％を含有することになり、カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ＡＤＭＥＡＱ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化ジメチルジステアリルアンモニウム（ＤＳＤＭＡＣ）、及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルコキシル化第４級アンモニウム（ＡＱＡ）化合物、第４級エステル類、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は通常、約０．２重量％～約６０重量％の非イオン性界面活性剤、例えば、約１％～約４０％、特に、約５％～約２０％、約３％～約１５％を含有することになり、非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥ又はＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（ＰＦＡ）、アルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、例えばエトキシル化脂肪酸アルキルエステル及び／又はプロポキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ－アシルＮ－アルキル誘導体（グルコサミド、ＧＡ又は脂肪酸グルカミド、ＦＡＧＡ）、メチルエステルエトキシレート（ＭＥＥ）、並びに商標名ＳＰＡＮ及びＴＷＥＥＮの下で入手可能な製品、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は通常、約０．１重量％～約１０重量％の半極性界面活性剤を含有することになる。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ－（ココアルキル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド及びＮ－（牛脂－アルキル）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（ＡＯ）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は通常、約０．１重量％～約１０重量％の双性イオン性界面活性剤を含有することになる。双性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルベタイン、スルホベタイン、及びこれらの組み合わせなどのベタインが挙げられる。
溶媒系：界面活性剤及び他の洗剤成分の溶解のために、溶媒系が必要とされる。溶媒は通常、水、アルコール、ポリオール、糖及び／又はその混合物である。好ましい溶媒は、水、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ、１，２－プロパンジオール又は１，３－プロパンジオール）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ポリエチレングリコールファミリー（ＰＥＧ３００－６００）、ヘキシレングリコール、イノシトール、マンニトール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－ブトキシプロポキシプロパノール、エタノールアミン（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミン）、スクロース、デキストロース、グルコース、リボース、キシロース、並びに関連するモノピラノシド及びジピラノシド及びモノフラノシド及びジフラノシドである。
溶媒系は、典型的には全体として５～９０重量％、５～６０重量％、５～４０重量％、１０～３０重量％で存在する。
ＰＶＡフィルム中に包まれる単位用量に関する水含量は通常、１～１５％、２～１２％、３～１０％、５～１０％の範囲である。
ＰＶＡフィルム中に包まれる単位用量に関するポリオール含量は通常、５～５０％、１０～４０％又は２０～３０％の範囲である。
ある実施形態では、界面活性剤は、天然に存在しない界面活性剤である。
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、水溶液（又は非極性環境中の反対の極性の物質）中で疎水性化合物を可溶化する化合物である。通常、ヒドロトロープは、親水性及び疎水性の両方の特徴（界面活性剤から知られるとおりの、いわゆる両親媒性特性）を有するが、ヒドロトロープの分子構造は通常、自然発生的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ ａｎｄ Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２：１２１－１２８による概説を参照されたい。ヒドロトロープは、ミセル相、ラメラ相又は他の明確なメソ相を形成する界面活性剤及び脂質に関して見出されるとおり、自己凝集が起こる臨界濃度を示さない。実際に、多くのヒドロトロープは、濃度が増大するにつれて凝集体のサイズが大きくなる持続型凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、油、界面活性剤、及びポリマーの混合物を含む、極性及び非極性の物質を含有する系の相挙動、安定性、及びコロイド特性を変化させる。ヒドロトロープは、製薬、パーソナルケア、食品から技術用途に至る産業全体で、古典的に使用される。洗剤組成物中のヒドロトロープの使用は、相分離又は高粘度などの望まれない現象を誘発することなく、（水を除去することによって液体洗剤を濃縮するプロセスの場合のように）例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物を可能にする。
洗剤は、０～１０重量％、例えば、約０～５重量％、例えば、約０．５～約５％、又は約３％～５％のヒドロトロープを含有し得る。洗剤における使用のための当該技術分野で知られる任意のヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ－トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム、シメンスルホン酸ナトリウム、アミン酸化物、アルコール及びポリグリコールエーテル、ナトリウムヒドロキシナフトエート、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムエチルヘキシル、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
ビルダー及びコビルダー
洗剤組成物は、約０～６５％、０～２０％；又は０．５～５％の洗剤ビルダー若しくはコビルダー、又はその組み合わせを含有し得る。食器洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは通常、１０～６５％、特に、２０～４０％である。ビルダー及び／又はコビルダーは、特に、Ｃａ及びＭｇとの水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。洗濯洗剤における使用のための当該技術分野知られる任意のビルダー及び／又はコビルダーが利用され得る。非限定的な例は、クエン酸塩、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及びクエン酸ナトリウムであり、ホスホネートの例としては、１－ヒドロキシエチリデン－１，１－ジホスホン酸（ＨＥＤＰ、エチドロン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ニトリロトリメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、２－アミノエチルホスホン酸（ＡＥＰｎ）、ジメチルメチルホスホネート（ＤＭＰＰ）、テトラメチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＴＤＴＭＰ）、ヘキサメチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＨＤＴＭＰ）、ホスホノブタン－トリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、Ｎ－（ホスホノメチル）イミノジ酢酸（ＰＭＩＤＡ）、２－カルボキシエチルホスホン酸（ＣＥＰＡ）、２－ヒドロキシホスホノカルボン酸（ＨＰＡＡ）及びアミノ－トリス－（メチレン－ホスホン酸）（ＡＭＰ）が挙げられる。Ｌ－グルタミン酸Ｎ，Ｎ－ジ酢酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、メチルグリシンジ酢酸（ＭＧＤＡ）。ビルダーの非限定的な例としては、ポリアクリレートのホモポリマー又はそのコポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）又はコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）が挙げられる。さらなる非限定的な例としては、シトレート、キレート化剤、例えば、アミノカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、及びホスホネート、並びにアルキル又はアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の具体例としては、２，２’，２’’－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＧＬＤＡ）、１－ヒドロキシエタン－１，１－ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチレンホスホン酸）（ＤＴＭＰＡ又はＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸－Ｎ－一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸－Ｎ－モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ－（２－スルホメチル）－アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ－（２－スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ－（２－スルホメチル）－グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ－（２－スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ－メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α－アラニン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（α－ＡＬＤＡ）、セリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＴＵＤＡ）、及びスルホメチル－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－エチリデンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、並びにこれらの組み合せ及び塩が挙げられる。さらなる例示的ビルダー及び／又はコビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に記載されている。
ある実施形態では、ビルダー又はコビルダーは、天然に存在しないビルダー又はコビルダーである。
漂白系
洗剤は、０～３０重量％、例えば、約１％～約２０％の漂白系を含有し得る。洗濯洗剤における使用のための当該技術分野で知られる任意の漂白系が利用され得る。好適な漂白系構成成分としては、漂白触媒、光脱色剤、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、過ホウ酸ナトリウム及び過酸化水素－尿素（１：１）、予め形成された過酸及びその混合物が挙げられる。好適な予め形成された過酸としては、ペルオキシカルボン酸及び塩、ジペルオキシカルボン酸、過イミド酸及び塩、ペルオキシモノ硫酸及び塩、例えば、オキソン（Ｒ）、並びにその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。漂白系の非限定的な例としては、ペルオキシド系漂白系が挙げられ、過酸形成漂白活性化剤と組み合わせて、例えば、過ホウ酸のナトリウム塩（通常、一又は四水和物）、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を含み得る。漂白活性化剤という用語は、本明細書では、過酸化水素と反応して過加水分解を介して過酸を形成する化合物を意味する。そのように形成される過酸は、活性化された漂白をなす。本明細書で使用されることになる好適な漂白活性化剤としては、エステル、アミド、イミド又は無水物のクラスに属するものが挙げられる。好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、４－［（３，５，５－トリメチルヘキサノイル）オキシ］ベンゼン－１－スルホン酸ナトリウム（ＩＳＯＮＯＢＳ）、４－（ドデカノイルオキシ）ベンゼン－１－スルホン酸塩（ＬＯＢＳ）、４－（デカノイルオキシ）ベンゼン－１－スルホン酸塩、４－（デカノイルオキシ）安息香酸塩（ＤＯＢＳ又はＤＯＢＡ）、４－（ノナノイルオキシ）ベンゼン－１－スルホン酸塩（ＮＯＢＳ）、及び／又は国際公開第９８／１７７６７号パンフレットに開示されるものである。目的の漂白活性化剤の特定のファミリーが欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、そのファミリーの中でも、クエン酸アセチルトリエチル（ＡＴＣ）が特に好ましい。ＡＴＣ又は短鎖トリグリセリド様トリアセチンは、それが環境に優しいという利点を有する。さらに、クエン酸アセチルトリエチル及びトリアセチンは、保管時の製品において良好な加水分解安定性を有し、効率的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは、過加水分解反応中に放出されたクエン酸塩がビルダーとして機能し得るため、多機能性である。或いは、漂白系は、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。漂白系はまた、６－（フタリミド）ペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含み得る。いくつかの実施形態では、漂白構成成分は、以下の式を有する有機触媒からなる群から選択される有機触媒であり得る。
Figure 2023520312000008
（ｉｉｉ）及びその混合物
（式中、各Ｒ１は、独立して、９～２４個の炭素を含有する分岐アルキル基又は１１～２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ１は、独立して、９～１８個の炭素を含有する分岐アルキル基又は１１～１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは、各Ｒ１は、独立して、２－プロピルヘプチル、２－ブチルオクチル、２－ペンチルノニル、２－ヘキシルデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イソノニル、イソデシル、イソトリデシル及びイソペンタデシルからなる群から選択される）。他の例示的な漂白剤系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、欧州特許第１８６７７０８号明細書（ビタミンＫ）及び国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白剤は、例えば、スルホン化亜鉛又はアルミニウムフタロシアニンであってもよい。
好ましくは、漂白構成成分は、漂白触媒、特に、有機漂白触媒に加えて過酸の供給源を含む。過酸の供給源は、（ａ）予め形成された過酸；（ｂ）好ましくは漂白活性化剤と組み合わせた過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩（過酸化水素供給源）；及び（ｃ）織物又は硬質表面処理工程において水の存在下にてインサイチュで過酸を形成するためのペルヒドロラーゼ酵素及びエステルから選択され得る。
ある実施形態では、漂白系は、天然に存在しない漂白系である。
ポリマー
洗剤は、０～１０重量％、例えば、０．５～５％、２～５％、０．５～２％又は０．２～１％のポリマーを含有し得る。洗剤における使用のために当該技術分野で知られる任意のポリマーを利用してもよい。ポリマーは、上記のコビルダーとして機能するものでもよいし、或いは、再付着防止、繊維保護、汚れ遊離、移染防止、油脂のクリーニング及び／又は消泡性を付与するものであってもよい。一部のポリマーは、上記の特性の２つ以上及び／又は下記のモチーフの２つ以上を有し得る。例示的ポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）又はポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、及びＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸コポリマーなどのポリカルボキシレート、疎水的に改変されたＣＭＣ（ＨＭ－ＣＭＣ）及びシリコーン、テレフタル酸とオリゴマーグリコールのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）とポリ（オキシエチレンテレフタレート）のコポリマー（ＰＥＴ－ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン－Ｎ－オキシド）（ＰＶＰＯ若しくはＰＶＰＮＯ）及びポリビニルピロリドン－ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ－ＰＰＯ）並びにジクオタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。その他の例示的ポリマーは、例えば、国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。また、上記ポリマーの塩も検討される。
ある実施形態では、ポリマーは、天然に存在しないポリマーである。
布地色調剤
本発明の洗剤組成物はまた、染料又は顔料などの布地色調剤を含んでもよく、これが洗剤組成物に配合される場合、前記洗剤組成物を含む洗浄液と前記布地が接触するときに布地上に沈積することができ、これによって、可視光の吸収／反射による前記布地の色合いを改変する。蛍光増白剤は、少なくとも一部の可視光を放射する。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを改変する。好適な布地色調剤としては、染料及び染料－粘土コンジュゲートが挙げられ、顔料を含んでもよい。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。好適な小分子染料としては、例えば、国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレット及び欧州特許第１８７６２２６号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおり、ダイレクトブルー（Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌｕｅ）、ダイレクトレッド（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ）、ダイレクトバイオレット（Ｄｉｒｅｃｔ Ｖｉｏｌｅｔ）、アシッドブルー（Ａｃｉｄ Ｂｌｕｅ）、アシッドレッド（Ａｃｉｄ Ｒｅｄ）、アシッドバイオレット（Ａｃｉｄ Ｖｉｏｌｅｔ）、ベーシックブルー（Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ）、ベーシックバイオレット（Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ）及びベーシックレッド（Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ）のカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に分類される染料からなる群から選択される小分子染料、又はそれらの混合物が挙げられる。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３ｗｔ％～約０．２ｗｔ％、約０．００００８ｗｔ％～約０．０５ｗｔ％、或いは約０．０００１ｗｔ％～約０．０４ｗｔ％の布地色調剤を含む。本組成物は、０．０００１ｗｔ％～約０．２ｗｔ％の布地色調剤を含んでもよく、これは、組成物が、単位用量パウチの形態である場合、特に好ましいことがある。好適な色調剤については、例えば、国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレット及び国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットにも開示されている。
追加の酵素
洗剤添加剤及び洗剤組成物は、エステル結合に作用するヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．－．－）、グリコシダーゼ（ＥＣ３．２．－．－）、及びペプチド結合に作用するヒドロラーゼ（ＥＣ３．４．－．－）などのヒドロラーゼ（ＥＣ３．－．－．－）、ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．－．－）若しくはペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．－．－）などのオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．－．－．－）又は炭素－酸素リアーゼ（ＥＣ４．２．－．－）などのリアーゼ（ＥＣ４．－．－．－）などの１種以上の［追加の］酵素を含み得る。特定の実施形態では、洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼなどの１種以上の［追加の］酵素を含み得る。
一般に、選択された酵素の特性は、選択された洗剤と適合すべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素成分及び非酵素成分との適合性など）、また、酵素は有効量で存在すべきである。
セルラーゼ
好適なセルラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に修飾された変異体又はタンパク質を操作した変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書及び国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される真菌セルラーゼといった、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。
特に好適なセルラーゼは、白色度を提供するか又は維持し且つ再付着を防止するか又は色の保護に関して利点を有するアルカリ性又は中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号明細書、欧州特許第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０５３１３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレット及び国際公開第９９／００１５４４号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼバリアントである。
他のセルラーゼは、国際公開第２００２／０９９０９１号パンフレットの配列番号２の１位～７７３位のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一性の配列を有するエンド－β－１，４－グルカナーゼ酵素、又はファミリー４４キシログルカナーゼであり、キシログルカナーゼ酵素は、国際公開第２００１／０６２９０３号パンフレットの配列番号２の４０～５５９位と少なくとも６０％の同一性の配列を有する。
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、及びＣａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃａｒｅｚｙｍｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ Ｃｌａｓｓｉｃ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｓｏｆｔ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｗｈｉｔｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、及びＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、及びＫＡＣ－５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
マンナナーゼ
好適なマンナナーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝的に改変した変異体が含まれる。マンナナーゼは、ファミリー５又は２６のアルカリマンナナーゼであり得る。それは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、特に、Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．クラウシー（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、又はＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来する野生型であってもよい。好適なマンナナーゼは、国際公開第１９９９／０６４６１９号パンフレットに記載されている。市販のマンナナーゼは、Ｍａｎｎａｗａｙ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）である。
プロテアーゼ
好適なプロテアーゼとしては、細菌、真菌、植物、ウイルス又は動物起源、例えば、植物又は微生物起源のものが挙げられる。微生物起源のものが好ましい。化学的に修飾された変異体又はタンパク質を操作した変異体が含まれる。それは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼなどのアルカリプロテアーゼであってもよい。セリンプロテアーゼは、例えば、トリプシンなどのＳ１ファミリー、又はサブチリシンなどのＳ８ファミリーであってもよい。メタロプロテアーゼプロテアーゼは、例えば、Ｍ４ファミリー由来のサーモリシン又はＭ５、Ｍ７若しくはＭ８ファミリー由来のものなどの他のメタロプロテアーゼであってもよい。
用語「サブチラーゼ」は、Ｓｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（１９９１）７１９－７３７及びＳｉｅｚｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７）５０１－５２３によるセリンプロテアーゼのサブグループを指す。セリンプロテアーゼは、基質と共有結合性の付加体を形成する活性部位においてセリンを有することを特徴とするプロテアーゼのサブグループである。サブチラーゼは、６つの下位区分、すなわち、サブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックなペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリー、及びピロリシンファミリーに分類され得る。
サブチラーゼの例は、米国特許第７２６２０４２号明細書及び国際公開第０９／０２１８６７号パンフレットに記載されているバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）及びバチルス・ギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、並びに国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載のサブチリシン・レンタス、サブチリシン・ノボ、サブチリシン・カールスバーグ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８並びに（国際公開第９３／１８１４０号パンフレット）に記載のプロテアーゼＰＤ１３８などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。他の有用なプロテアーゼは、国際公開第９２／１７５１７７号パンフレット、国際公開第０１／０１６２８５号パンフレット、国際公開第０２／０２６０２４号パンフレット、及び国際公開第０２／０１６５４７号パンフレットに記載のものであってもよい。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）及び国際公開第８９／０６２７０号パンフレット、国際公開第９４／２５５８３号パンフレット及び国際公開第０５／０４０３７２号パンフレットに記載のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ、並びに国際公開第０５／０５２１６１号パンフレット及び国際公開第０５／０５２１４６号パンフレットに記載のセルモナス（Ｃｅｌｌｕｍｏｎａｓ）由来のキモトリプシンプロテアーゼである。
さらに好ましいプロテアーゼは、例えば、国際公開第９５／２３２２１号パンフレットに記載されているようなバチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ ５４８３由来のアルカリプロテアーゼ、並びに国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、欧州特許第１９２１１４７号明細書及び欧州特許第１９２１１４８号明細書に記載されているそのバリアントである。
メタロプロテアーゼの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のものなど、国際公開第０７／０４４９９３号パンフレット（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔ．）に記載のような中性メタロプロテアーゼである。
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９６／０３４９４６号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレット、国際公開第９９／０１１７６８号パンフレット、国際公開第０１／４４４５２号パンフレット、国際公開第０３／００６６０２号パンフレット、国際公開第０４／０３１８６号パンフレット、国際公開第０４／０４１９７９号パンフレット、国際公開第０７／００６３０５号パンフレット、国際公開第１１／０３６２６３号パンフレット、国際公開第１１／０３６２６４号パンフレットに記載されるバリアントであって、特に、ＢＰＮ’付番を使用する以下の位置：３、４、９、１５、２７、３６、５７、６８、７６、８７、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１１８、１２０、１２３、１２８、１２９、１３０、１６０、１６７、１７０、１９４、１９５、１９９、２０５、２０６、２１７、２１８、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２及び２７４の１つ以上において置換を有するバリアントである。より好ましいサブチラーゼバリアントは、変異：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｋ２７Ｒ、＊３６Ｄ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ８７Ｓ，Ｒ、＊９７Ｅ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ，Ｄ，Ａ、Ｓ９９ＡＤ、Ｓ１０１Ｇ，Ｍ，Ｒ Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ，Ｙ，Ｎ、Ｓ１０６Ａ、Ｇ１１８Ｖ，Ｒ、Ｈ１２０Ｄ，Ｎ、Ｎ１２３Ｓ、Ｓ１２８Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ａ、Ｇ１６０Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｇ１９５Ｅ、Ｖ１９９Ｍ、Ｖ２０５Ｉ、Ｌ２１７Ｄ、Ｎ２１８Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２５２Ｋ、Ｔ２７４Ａ（ＢＰＮ’付番を使用する）を含み得る。
好適な市販のプロテアーゼ酵素としては、商標名Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）Ｅｖｉｔｙ（登録商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、及びＰｒｏｇｒｅｓｓ Ｕｎｏ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）の下で販売されるもの、商標名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＭＡ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（登録商標）、Ｐｕｒａｍａｘ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ－Ｂｒｏｃａｓｅｓ Ｎ．Ｖ．）の下で販売されるもの、ＢＬＡＰ（米国特許第５３５２６０４号明細書の図２９に示される配列）及びこれに関するバリアント（Ｈｅｎｋｅｌ ＡＧ）並びにＫａｏからのＫＡＰ（バチルス・アルカロフィル（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）サブチリシン）が挙げられる。
リパーゼ及びクチナーゼ：
好適なリパーゼ及びクチナーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に修飾された変異体酵素又はタンパク質を操作した変異体酵素が含まれる。例としては、欧州特許第２５８０６８号明細書及び欧州特許第３０５２１６号明細書に記載されている、テルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来、例えば、Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（以前はフミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）と命名されていた）由来のリパーゼ、例えば、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ（国際公開第９６／１３５８０号パンフレット）、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．ｓｐ．株ＳＤ７０５（国際公開第９５／０６７２０号パンフレット及び国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）といったシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（これらの一部は、現在、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）と改名されている）の株由来のリパーゼ、ＧＤＳＬタイプのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）リパーゼ（国際公開第１０／０６５４５５号パンフレット）、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（国際公開第１０／１０７５６０号パンフレット）由来のクチナーゼ、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ（米国特許第５，３８９，５３６号明細書）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４４１２号パンフレット）、ジェオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第１１／０８４４１７号パンフレット）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４５９９号パンフレット）、並びにストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）（国際公開第１１／１５０１５７号パンフレット）及びＳ．プリスチナエスピラリス（Ｓ．ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）（国際公開第１２／１３７１４７号パンフレット）由来のリパーゼが挙げられる。
他の例は、欧州特許第４０７２２５号明細書、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレット、国際公開第９７／０７２０２号パンフレット、国際公開第００／３４４５０号パンフレット、国際公開第００／６００６３号パンフレット、国際公開第０１／９２５０２号パンフレット、国際公開第０７／８７５０８号パンフレット及び国際公開第０９／１０９５００号パンフレットに記載のものなどのリパーゼバリアントである。
好ましい市販されているリパーゼ製品としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）；Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）及びＬｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｌｕｍａｆａｓｔ（当初はＧｅｎｅｎｃｏｒから）及びＬｉｐｏｍａｘ（当初はＧｉｓｔ－Ｂｒｏｃａｄｅｓから）が挙げられる。
さらに他の例は、アシルトランスフェラーゼ又はペルヒドロラーゼと呼ばれこともあるリパーゼ、例えば、カンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡとの相同性を有するアシルトランスフェラーゼ（国際公開第１０／１１１１４３号パンフレット）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のアシルトランスフェラーゼ（国際公開第０５／５６７８２号パンフレット）、ＣＥ ７ファミリー由来のペルヒドロラーゼ（国際公開第０９／６７２７９号パンフレット）、並びにＭ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼのバリアント、特に、Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ製の製品Ｇｅｎｔｌｅ Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｅａｃｈに使用されているＳ５４Ｖバリアント（国際公開第１０／１０００２８号パンフレット）である。
アミラーゼ：
本発明のバリアントとともに使用され得る好適なアミラーゼは、アルファ－アミラーゼ又はグルコアミラーゼであってもよく、細菌又は真菌起源のものであってもよい。化学的に修飾された変異体又はタンパク質を操作した変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば英国特許第１，２９６，８３９号明細書にさらに詳細に記載されているバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊な系統から得られるα－アミラーゼが挙げられる。
好適なアミラーゼとしては、国際公開第９５／１０６０３号パンフレットにおける配列番号２を有するアミラーゼ又はその配列番号３と９０％の配列同一性を有するバリアントが挙げられる。好ましいバリアントは、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９７／４３４２４号パンフレット及び国際公開第９９／０１９４６７号パンフレットの配列番号４に記載され、例えば、以下の位置の１つ以上における置換を有するバリアントである：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４。
異なる好適なアミラーゼとしては、国際公開第０２／０１０３５５号パンフレットにおける配列番号６を有するアミラーゼ又はその配列番号６と９０％の配列同一性を有するそのバリアントが挙げられる。配列番号６の好ましいバリアントは、１８１及び１８２位における欠失及び１９３位における置換を有するものである。
好適な他のアミラーゼは、国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するアルファ－アミラーゼの残基１～３３及び国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４に示されるＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ－アミラーゼの残基３６～４８３を含むハイブリッドアルファ－アミラーゼ又はそれと９０％の配列同一性を有するバリアントである。このハイブリッドアルファ－アミラーゼの好ましいバリアントは、以下の位置の１つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである：Ｇ４８、Ｔ４９、Ｇ１０７、Ｈ１５６、Ａ１８１、Ｎ１９０、Ｍ１９７、Ｉ２０１、Ａ２０９及びＱ２６４。国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するアルファ－アミラーゼの残基１～３３及び配列番号４の残基３６～４８３を含むハイブリッドアルファ－アミラーゼの最も好ましいバリアントは、置換：
Ｍ１９７Ｔ；
Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；又は
Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ
を有するものである。
好適であるさらなるアミラーゼは、国際公開第９９／０１９４６７号パンフレットにおける配列番号６を有するアミラーゼ又は配列番号６と９０％の配列同一性を有するそのバリアントである。配列番号６の好ましいバリアントは、以下の位置の１つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである：Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｈ１８３、Ｇ１８４、Ｎ１９５、Ｉ２０６、Ｅ２１２、Ｅ２１６及びＫ２６９。特に好ましいアミラーゼは、Ｒ１８１位及びＧ１８２位、又はＨ１８３位及びＧ１８４位に欠失を有するものである。
使用され得る追加のアミラーゼは、国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号３、配列番号２若しくは配列番号７を有するもの又は配列番号１、配列番号２、配列番号３若しくは配列番号７と９０％の配列同一性を有するそのバリアントである。配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号７の好ましいバリアントは、付番のために国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号２を使用する、以下の位置の１つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである：１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２１２、２４３、２６０、２６９、３０４及び４７６。より好ましいバリアントは、１８１、１８２、１８３及び１８４から選択される２つの位置、例えば、１８１及び１８２、１８２及び１８３、又は１８３位及び１８４位に欠失を有するものである。配列番号１、配列番号２又は配列番号７の最も好ましいアミラーゼバリアントは、１８３位及び１８４位における欠失並びに１４０位、１９５位、２０６位、２４３位、２６０位、３０４位及び４７６位の１つ以上における置換を有するものである。
使用され得る他のアミラーゼは、国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０を有するアミラーゼ又は国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２と９０％の配列同一性若しくは国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０と９０％の配列同一性を有するそのバリアントである。国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０の好ましいバリアントは、以下の位置の１つ以上における置換、欠失又は挿入を有するものである：１７６、１７７、１７８、１７９、１９０、２０１、２０７、２１１及び２６４。
さらなる好適なアミラーゼは、国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２を有するアミラーゼ又はその配列番号２と９０％の配列同一性を有するバリアントである。配列番号２の好ましいバリアントは、Ｃ末端の短縮化及び／又は以下の位置の１つ以上において置換、欠失又は挿入を有するものである：Ｑ８７、Ｑ９８、Ｓ１２５、Ｎ１２８、Ｔ１３１、Ｔ１６５、Ｋ１７８、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、Ｇ１８３、Ｍ２０１、Ｆ２０２、Ｎ２２５、Ｓ２４３、Ｎ２７２、Ｎ２８２、Ｙ３０５、Ｒ３０９、Ｄ３１９、Ｑ３２０、Ｑ３５９、Ｋ４４４及びＧ４７５。配列番号２のより好ましいバリアントは、以下の位置：Ｑ８７Ｅ，Ｒ、Ｑ９８Ｒ、Ｓ１２５Ａ、Ｎ１２８Ｃ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、Ｍ２０１Ｌ、Ｆ２０２Ｙ、Ｎ２２５Ｅ，Ｒ、Ｎ２７２Ｅ，Ｒ、Ｓ２４３Ｑ，Ａ，Ｅ，Ｄ、Ｙ３０５Ｒ、Ｒ３０９Ａ、Ｑ３２０Ｒ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ４４４Ｅ及びＧ４７５Ｋの１つ以上における置換、並びに／又はＲ１８０位及び／若しくはＳ１８１位又はＴ１８２位及び／若しくはＧ１８３位における欠失を有するものである。配列番号２の最も好ましいアミラーゼバリアントは、置換：
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ；
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ；
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ；又は
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋを有するものであり、バリアントは、Ｃ末端が短縮化されており、任意選択により、２４３位の置換並びに／又は１８０位及び／若しくは１８１位の欠失をさらに含む。
他の好適なアミラーゼは、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１２を有するアルファ－アミラーゼ又は配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアントである。好ましいアミラーゼバリアントは、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットにおける配列番号１２の以下の位置の１つ以上における置換、欠失又は挿入を有するものである：Ｒ２８、Ｒ１１８、Ｎ１７４；Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ｇ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｋ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３１０、Ｎ３１４；Ｒ３２０、Ｈ３２４、Ｅ３４５、Ｙ３９６、Ｒ４００、Ｗ４３９、Ｒ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｒ４５８、Ｎ４７１、Ｎ４８４。特定の好ましいアミラーゼとしては、Ｄ１８３及びＧ１８４の欠失を有し、且つ置換Ｒ１１８Ｋ、Ｎ１９５Ｆ、Ｒ３２０Ｋ及びＲ４５８Ｋを有するバリアント、並びに群：Ｍ９、Ｇ１４９、Ｇ１８２、Ｇ１８６、Ｍ２０２、Ｔ２５７、Ｙ２９５、Ｎ２９９、Ｍ３２３、Ｅ３４５及びＡ３３９から選択される１つ以上の位置における置換をさらに有するバリアント、これら全ての位置において置換をさらに有する最も好ましいバリアントが挙げられる。
他の例は、国際公開第２０１１／０９８５３１号パンフレット、国際公開第２０１３／００１０７８号パンフレット及び国際公開第２０１３／００１０８７号パンフレットにおいて記載されるものなどのアミラーゼバリアントである。
市販されているアミラーゼとしては、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製）、並びにＲａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）／Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１０００（商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１１０（商標）及びＰｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１００（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔ製）がある。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：
ペルオキシダーゼは、国際生化学分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会により記載されている酵素分類ＥＣ１．１１．１．７に含まれるペルオキシダーゼ酵素、又はそれから得られる、ペルオキシダーゼ活性を呈する任意の断片である。
好適なペルオキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に修飾された変異体又はタンパク質を操作した変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、ウシグソヒトヨタケ（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅａ）といったヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）由来のペルオキシダーゼ（欧州特許第１７９，４８６号明細書）、並びに国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレット、及び国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのそのバリアントが挙げられる。
ペルオキシダーゼはまた、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼなどのハロペルオキシダーゼ酵素及びクロロペルオキシダーゼ活性又はブロモペルオキシダーゼ活性を呈する化合物を含み得る。ハロペルオキシダーゼは、ハロゲン化物イオンに対するそれらの特異性に従って分類される。クロロペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１０）は、塩化物イオンからの次亜塩素酸塩の形成を触媒する。
ある実施形態では、ハロペルオキシダーゼは、クロロペルオキシダーゼである。好ましくは、ハロペルオキシダーゼは、バナジウムハロペルオキシダーゼ、すなわち、バナジン酸塩含有ハロペルオキシダーゼである。本発明の好ましい方法において、バナジン酸塩含有ハロペルオキシダーゼは、塩化物イオンの供給源と組み合わせられる。
ハロペルオキシダーゼは、多種の真菌、特に、暗色線菌科（ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌群、例えば、Ｃ．フマゴ（Ｃ．ｆｕｍａｇｏ）などのカルダリオマイセス属（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、例えば、Ｃ．ベルクローサ（Ｃ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）及びＣ．イナエクアリス（Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）などのクルブラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）、ドレクスレラ属（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ウロクラジウム属（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）及びボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）から単離されている。
ハロペルオキシダーゼはまた、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、Ｐ．ピロシニア（Ｐ．ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、Ｓ．オーレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）などの細菌からも単離されている。
好ましい実施形態では、ハロペルオキシダーゼは、クルブラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．）、特に、クルブラリア・ベルクローサ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）又はクルブラリア・イナエクアリス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、例えば、国際公開第９５／２７０４６号パンフレットに記載されるとおりのＣ．イナエクアリス（Ｃ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）ＣＢＳ １０２．４２；又は国際公開第９７／０４１０２号パンフレットに記載されるとおりのＣ．ベルクローサ（Ｃ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）ＣＢＳ １４７．６３若しくはＣ．ベルクローサ（Ｃ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ）ＣＢＳ ４４４．７０；又は国際公開第０１／７９４５９号パンフレットに記載されるとおりのドレクスレラ・ハルトレビイ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｈａｒｔｌｅｂｉｉ）、国際公開第０１／７９４５８号パンフレットに記載されるとおりのデンドロフィエラ・サリナ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、国際公開第０１／７９４６１号パンフレットに記載されるとおりのファエオトリココニス・クロタラリエ（Ｐｈａｅｏｔｒｉｃｈｏｃｏｎｉｓ ｃｒｏｔａｌａｒｉｅ）、又は国際公開第０１／７９４６０号パンフレットに記載されるとおりのゲニクロスポリウム属（Ｇｅｎｉｃｕｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）から得ることができる。
オキシダーゼとしては、特に、酵素分類ＥＣ１．１０．３．２に含まれる任意のラッカーゼ酵素、又はそれから得られるラッカーゼ活性を呈する任意の断片、又は類似の活性を呈する化合物、例えば、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．１）、ｏ－アミノフェノールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．４）、又はビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．５）が挙げられる。
好ましいラッカーゼ酵素は、細菌起源の酵素である。酵素は、植物、細菌又は真菌（糸状真菌及び酵母を含む）から得てもよい。
真菌由来の好適な例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、例えば、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、ポドスポラ属（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ボトリチス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、コリビア属（Ｃｏｌｌｙｂｉａ）、ツリガネタケ属（Ｆｏｍｅｓ）、レンチヌス属（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、カワラタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、例えば、フルイカワラタケ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）及びカワラタケ（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、例えば、Ｒ．ソラニ（Ｒ．ｓｏｌａｎｉ）、ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、例えば、ウシグソヒトヨタケ（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅａ）、ササクレヒトヨタケ（Ｃ．ｃｏｍａｔｕｓ）、ヒメヒトヨタケ（Ｃ．ｆｒｉｅｓｉｉ）、及びヒメヒガサヒトヨタケ（Ｃ．ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）、ナヨタケ属（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ）、例えば、イタチタケ（Ｐ．ｃｏｎｄｅｌｌｅａｎａ）、ヒカゲタケ属（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）、例えば、ワライタケ（Ｐ．ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅｕｓ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、例えば、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、シタリジウム属（Ｓｃｈｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、例えば、Ｓ．サーモフィルム（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ポリポルス属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、例えばＰ．ピンシツス（Ｐ．ｐｉｎｓｉｔｕｓ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、例えば、Ｐ．ラジアータ（Ｐ．ｒａｄｉａｔａ）（国際公開第９２／０１０４６号パンフレット）、又はコリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、例えば、Ｃ．ヒルスツス（Ｃ．ｈｉｒｓｕｔｕｓ）（日本特許第２２３８８８５号公報）の株から得られるラッカーゼが挙げられる。
細菌由来の好適な例としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株から得られるラッカーゼが挙げられる。
ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）又はミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）から得られるラッカーゼ；特に、国際公開第９７／０８３２５号パンフレットに開示されるウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）から得られるラッカーゼ；又は国際公開第９５／３３８３６号パンフレットに開示されるミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）から得られるラッカーゼが好ましい。
ヌクレアーゼ
好適なヌクレアーゼとしては、それぞれＤＮＡ又はＲＮＡ骨格におけるホスホジエステル結合の加水切断を触媒し、それによりＤＮＡ及びＲＮＡを分解するいずれかの酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）及びリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）が挙げられる。活性の部位に基づいて２つの主要な分類がある。エキソヌクレアーゼは、末端から核酸を消化する。エンドヌクレアーゼは、標的分子の中間の領域に対して作用する。ヌクレアーゼは好ましくはＤＮａｓｅであり、微生物、好ましくは真菌又は細菌から得ることができることが好ましい。特に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種から得ることができるＤＮａｓｅが好ましく；特に、バチルス・シビー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｂｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得ることができるＤＮａｓｅが好ましい。そのようなＤＮａｓｅの例は、国際公開第２０１１／０９８５７９号パンフレット、国際公開第２０１４／０８７０１１号パンフレット及び国際公開第２０１７／０６０４７５号パンフレットに記載される。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種から得ることができるＤＮａｓｅ；特に、国際公開第２０１５／１５５３５０号パンフレットに記載されるＤＮａｓｅなどのアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）から得ることができるＤＮａｓｅも特に好ましい。
リケニナーゼ
好適なリケニナーゼ（リケナーゼ）としては、ベータ－１，４－グルコシド結合の加水分解を触媒してベータ－グルカンを得る酵素が挙げられる。リケニナーゼ（又はリケナーゼ）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）は、（１，３）－及び（１，４）－結合を含有するベータ－Ｄ－グルカンにおける（１，４）－ベータ－Ｄ－グルコシド結合を加水分解し、リケニン及び穀類のベータ－Ｄ－グルカンに対して作用することができるが、１，３－又は１，４－結合のみを含有するベータ－Ｄ－グルカンに対しては作用できない。そのようなリケニナーゼの例は、特許出願国際公開第２０１７／０９７８６６号パンフレット及び国際公開第２０１７／１２９７５４号パンフレットに記載される。
洗剤酵素は、１種以上の酵素を含有する別々の添加剤を添加すること、又はこれらの酵素の全てを含む組み合わせた添加剤を添加することによって洗剤組成物中に含まれ得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち、別々の添加剤又は組み合わせた添加剤は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどとして配合され得る。好ましい洗剤添加剤配合物は、顆粒、特に、非飛散性顆粒、液体、特に、安定化された液体、又はスラリーである。
非飛散性顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書及び同第４，６６１，４５２号明細書に開示される方法によって製造してもよく、任意選択により当該技術分野で知られる方法によってコーティングしてもよい。ワックスコーティング材料の例には、平均モル重量が１０００～２００００のポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６～５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、アルコールが１２～２０個の炭素原子を含有し、１５～８０のエチレンオキシド単位が存在するエトキシ化脂肪族アルコール、脂肪族アルコール、脂肪酸、並びに脂肪酸のモノ及びジ及びトリグリセリドがある。流動層技術によって塗布するのに好適な皮膜形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に示されている。液体酵素の調製物は、例えば、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することによって安定化してもよい。保護酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
補助材料
洗濯洗剤における使用のための当該技術分野で知られる任意の洗剤構成成分もまた利用され得る。他の任意選択の洗剤構成成分としては、単独で又は組み合わせた抗腐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、結合剤、腐食防止剤、崩壊剤／崩壊薬剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、ＣＭＣ、及び／又はプロピレングリコールなどのポリオール）、粘土を含む布地柔軟仕上げ剤、充填剤／加工助剤、蛍光増白剤／光学的光沢剤、起泡促進剤、泡（石鹸泡）調節剤、香料、汚れ懸濁剤、柔軟剤、起泡抑制剤、黄褐色阻害剤、及びウィッキング剤が挙げられる。洗濯洗剤における使用のための当該技術分野で知られる任意の成分が利用され得る。そのような成分の選択は、十分に当業者の技術の範囲内である。
分散剤－本発明の洗剤組成物はまた、分散剤も含有することができる。特に、粉末洗剤は、分散剤を含んでもよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモ－若しくはコポリマー酸又はそれらの塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシル基を含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
移染防止剤－本発明の洗剤組成物はまた、１種以上の移染防止剤を含んでもよい。好適な高分子移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ－オキシドポリマー、Ｎ－ビニルピロリドン及びＮ－ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．０１重量％～約５重量％のレベルで、又は約０．１重量％～約３重量％のレベルでも存在し得る。
蛍光増白剤－本発明の洗剤組成物はまた、蛍光増白剤又は光学的光沢剤などのクリーニングされる物品に色合いを付与し得る追加の構成成分を含有するのが好ましい。存在する場合、光沢剤は、約０．０１％～約０．５％のレベルであることが好ましい。洗濯洗剤組成物での使用に好適な任意の蛍光増白剤が、本発明の組成物において使用されてもよい。最も一般的に用いられる蛍光増白剤は、ジアミノスチルベン－スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体及びビスフェニル－ジスチリル誘導体のクラスに属するものである。ジアミノスチルベン－スルホン酸誘導体タイプの蛍光増白剤の例として、４，４’－ビス－（２－ジエタノールアミノ－４－アニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（２，４－ジアニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２．２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（２－アニリノ－４－（Ｎ－メチル－Ｎ－２－ヒドロキシ－エチルアミノ）－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、４，４’－ビス－（４－フェニル－１，２，３－トリアゾール－２－イル）スチルベン－２，２’－ジスルホネート、及びナトリウム５－（２Ｈ－ナフト［１，２－ｄ］［１，２，３］トリアゾール－２－イル）－２－［（Ｅ）－２－フェニルビニル］ベンゼンスルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光増白剤は、Ｃｉｂａ－Ｇｅｉｇｙ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから市販されているＴｉｎｏｐａｌ ＤＭＳ及びＴｉｎｏｐａｌ ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ ＤＭＳは、４，４’－ビス－（２－モルホリノ－４－アニリノ－ｓ－トリアジン－６－イルアミノ）スチルベン－２，２’－ジスルホネートのジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ ＣＢＳは、２，２’－ビス－（フェニル－スチリル）－ジスルホネートのジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光増白剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｍｉｎｅｒａｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ製の市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ ＫＸである。本発明における使用に好適な他の蛍光剤としては、１－３－ジアリールピラゾリン及び７－アルキルアミノクマリンが挙げられる。
好適な蛍光光沢剤のレベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、或いは約０．２ｗｔ％の下限レベルから、０．５又はさらには０．７５ｗｔ％の上限レベルまでを含む。
汚れ遊離ポリマー－本発明の洗剤組成物はまた、綿及びポリエステル系布地などの布地からの汚れの除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚れの除去を補助する１種以上の汚れ遊離ポリマーを含んでもよい。汚れ遊離ポリマーは、例えば、非イオン性又はアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタム及び関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであってもよく、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ７，Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌｕｍｅ ７１，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照されたい。別のタイプの汚れ遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（本明細書において参照により組み込まれる）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造又はポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚れ遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレット及び国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（本明細書において参照により組み込まれる）において、より詳細に記載されている。他の汚れ遊離ポリマーは、欧州特許第１８６７８０８号明細書又は国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（共に本明細書において参照により組み込まれる）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造といった置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミド及びこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、非イオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、双性イオン性変性セルロース、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース及びこれらの混合物が挙げられる。
再付着防止剤－本発明の洗剤組成物としてはまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレン及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、並びにエトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種以上の再付着防止剤を含んでもよい。前述の汚れ遊離ポリマーの下で、上記セルロース系ポリマーは、再付着防止剤としても機能し得る。
レオロジー改質剤は、粘度降下剤とは異なる、構造化剤又は増粘剤である。レオロジー改質剤は、液体洗剤組成物の水性液体マトリックスにずり流動化特性を付与する、非ポリマー性結晶、ヒドロキシ－機能材料、ポリマー性レオロジー改質剤からなる群から選択される。洗剤のレオロジー及び粘性は、例えば、欧州特許第２１６９０４０号明細書に示されるように、当技術分野で知られる方法により、改変及び調節することができる。
他の好適な補助材料としては、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、結合剤、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地用柔軟剤、充填剤、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、制泡剤、及び溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。
プロテアーゼ阻害剤
プロテアーゼ阻害剤は、洗濯石鹸バー中のプロテアーゼ又は他の酵素が分解されないようにプロテアーゼを安定化するか又は阻害する任意の化合物であり得る。プロテアーゼ阻害剤の例は、アプロチニン、ベスタチン、カルパイン阻害剤Ｉ及びＩＩ、キモスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ砂、ボロン酸、４－ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸（４－ＦＰＢＡ）、ペプチドアルデヒド又はそのハイドロサルファイト付加物若しくはヘミアセタール付加物及びペプチドトリフルオロメチルケトンである。少なくとも１つがペプチドアルデヒド、そのハイドロサルファイト付加物又はヘミアセタール付加物である５、４、３、２又は１つの阻害剤などの１つ以上のプロテアーゼ阻害剤が存在し得る。
ペプチドアルデヒド阻害剤
ペプチドアルデヒドは、式Ｐ－（Ａ）ｙ－Ｌ－（Ｂ）ｘ－Ｂ０－Ｈ又はそのハイドロサルファイト付加物若しくはヘミアセタール付加物（式中、
ｉ．Ｈは、水素であり；
ｉｉ．Ｂ０は、式－ＮＨ－ＣＨ（Ｒ）－Ｃ（＝Ｏ）－のＬ－又はＤ－配置を有する単一アミノ酸残基であり；
ｉｉｉ．ｘは、（Ｂ）ｘに関して１、２又は３であり、且つＢは、独立して、Ｂアミノ酸のＣ末端を介してＢ０に連結された単一アミノ酸であり、
ｉｖ．Ｌは存在しないか又はＬは、独立して、式－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｃ（＝Ｓ）－又は－Ｃ（＝Ｓ）－Ｃ（＝Ｏ）－のリンカー基であり；
ｖ．ｙは、（Ａ）ｙに関して０、１又は２であり、且つＡは、独立して、Ａアミノ酸のＮ末端を介してＬに連結された単一アミノ酸残基であり（ただし、Ｌが存在しない場合、Ａは存在しない）；
ｖｉ．Ｐは、水素及びＮ末端保護基からなる群から選択され（ただし、Ｌが存在しない場合、ＰはＮ末端保護基である）；
ｖｉｉ．Ｒは、独立して、１つ以上の同一の又は異なる置換基Ｒ’で任意選択により置換されたＣ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリール又はＣ７～１０アリールアルキルからなる群から選択され；
ｖｉｉｉ．Ｒ’は、独立して、ハロゲン、－ＯＨ、－ＯＲ’’、－ＳＨ、－ＳＲ’’、－ＮＨ２、－ＮＨＲ’’、－ＮＲ’’２、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＲ’’、－ＣＯＮＲ’’２、－ＮＨＣ（＝Ｎ）ＮＨ２からなる群から選択され；且つ
ｉｘ．Ｒ’’は、Ｃ１～６アルキル基である）を有し得る。
ｘは、１、２又は３であり得るが、したがって、Ｂは、それぞれ１、２又は３つのアミノ酸残基であり得る。したがって、Ｂは、Ｂ１、Ｂ２－Ｂ１又はＢ３－Ｂ２－Ｂ１（式中、Ｂ３、Ｂ２及びＢ１はそれぞれ、１つのアミノ酸残基を表す）を表し得る。ｙは、０、１又は２であり得るが、したがって、Ａは存在し得ないか、又はそれぞれ式Ａ１又はＡ２－Ａ１（式中、Ａ２及びＡ１はそれぞれ、１つのアミノ酸残基を表す）を有する１つ若しくは２つのアミノ酸残基であり得る。
Ｂ０は、Ｌ－又はＤ－配置を有する単一アミノ酸残基であり得るが、そのアミノ酸のＣ末端を介してＨに連結され、式中、Ｒは、Ｃ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリール又はＣ７～１０アリールアルキル側鎖、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル又はベンジルであり、且つＲは、任意選択により、１つ以上の同一の又は異なる置換基Ｒ’で置換され得る。特定の例は、アルギニン（Ａｒｇ）、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ｍ－チロシン、ｐ－チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）のＤ－又はＬ－形態である。特定の実施形態は、Ｂ０が、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、ｐ－チロシン及びバリンであるときである。
Ｂ１アミノ酸のＣ末端を介してＢ０に連結されるＢ１は、脂肪族、疎水性及び／又は中性アミノ酸であり得る。Ｂ１の例は、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）及びバリン（Ｖａｌ）である。Ｂ１の特定の例は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン及びバリンである。特定の実施形態は、Ｂ１が、アラニン、グリシン又はバリンであるときである。
存在する場合、Ｂ２アミノ酸のＣ末端を介してＢ１に連結されるＢ２は、脂肪族、疎水性、中性及び／又は極性アミノ酸であり得る。Ｂ２の例は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、カプレオミシジン（Ｃｐｄ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）である。Ｂ２の特定の例は、アラニン、グリシン、カプレオミシジン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン及びバリンである。特定の実施形態は、Ｂ２が、アルギニン、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン又はバリンであるときである。
存在する場合、Ｂ３アミノ酸のＣ末端を介してＢ２に連結されるＢ３は、大型の脂肪族、芳香族、疎水性及び／又は中性アミノ酸であり得る。Ｂ３の例は、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、フェニルグリシン、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びバリン（Ｖａｌ）である。Ｂ３の特定の例は、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンである。
リンカー基Ｌは、存在し得ないか又は－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｃ（＝Ｓ）－又は－Ｃ（＝Ｓ）－Ｃ（＝Ｏ）－からなる群から選択され得る。特定の実施形態は、Ｌが存在しないか又はＬがカルボニル基－Ｃ（＝Ｏ）－であるときを含む。
存在する場合、アミノ酸のＮ末端を介してＬに連結されるＡ１は、脂肪族、芳香族、疎水性、中性及び／又は極性アミノ酸であり得る。Ａ１の例は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、カプレオミシジン（Ｃｐｄ）、グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びバリン（Ｖａｌ）である。Ａ１の特定の例は、アラニン、アルギニン、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びバリンである。特定の実施形態は、Ｂ２が、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンンであるときである。
存在する場合、アミノ酸のＮ末端を介してＡ１に連結されるＡ２残基は、大型の脂肪族、芳香族、疎水性及び／又は中性アミノ酸であり得る。Ａ２の例は、アルギニン（Ａｒｇ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、フェニルグリシン、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びバリン（Ｖａｌ）である。Ａ２の特定の例は、フェニルアラニン及びチロシンである。
Ｎ末端保護基Ｐ（存在する場合）は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メトキシカルボニル、（フルオロメトキシ）カルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びアダマンチルオキシカルボニル；ｐ－メトキシベンジルカルボニル（Ｍｏｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、ｐ－メトキシフェニル（ＰＭＰ）、メトキシアセチル、メチルアミノカルボニル、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ベンジルスルホニル、メチルホスホラミジル（ＭｅＯＰ（ＯＨ）（＝Ｏ））及びベンジルホスホラミジル（ＰｈＣＨ２ＯＰ（ＯＨ）（＝Ｏ））などのホルミル、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、トリフルオロアセチル、メトキシサクシニル、芳香族及び脂肪族ウレタン保護基から選択され得る。
ペプチドアルデヒドの一般式はまた、以下のとおりに記載され得る：Ｐ－Ａ２－Ａ１－Ｌ－Ｂ３－Ｂ２Ｂ１－Ｂ０－Ｈ（式中、Ｐ、Ａ２、Ａ１、Ｌ、Ｂ３、Ｂ２、Ｂ１及びＢ０は、上で定義されるとおりである）。
保護基を有するトリペプチドアルデヒドの場合（すなわち、ｘ＝２であり、Ｌは存在せず且つＡは存在しない）、Ｐは、好ましくは、アセチル、メトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、メチルアミノカルボニル、メチルスルホニル、ベンジルスルホニル及びベンジルホスホラミジルである。保護基を有するテトラペプチドアルデヒドの場合（すなわち、ｘ＝３であり、Ｌは存在せず且つＡは存在しない）、Ｐは、好ましくは、アセチル、メトキシカルボニル、メチルスルホニル、エチルスルホニル及びメチルホスホラミジルである。
好適なペプチドアルデヒドは、国際公開第９４／０４６５１号パンフレット、国際公開第９５／２５７９１号パンフレット、国際公開第９８／１３４５８号パンフレット、国際公開第９８／１３４５９号パンフレット、国際公開第９８／１３４６０号パンフレット、国際公開第９８／１３４６１号パンフレット、国際公開第９８／１３４６２号パンフレット、国際公開第０７／１４１７３６号パンフレット、国際公開第０７／１４５９６３号パンフレット、国際公開第０９／１１８３７５号パンフレット、国際公開第１０／０５５０５２号パンフレット及び国際公開第１１／０３６１５３号パンフレットに記載される。
より具体的には、ペプチドアルデヒドは、
Ｃｂｚ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ２－［（フェニルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ａｃ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－メチルプロピル］－）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｈ（グリシンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｈ（グリシンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－）、
Ｃｂｚ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［（フェニルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ｃｂｚ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］－Ｌ－ロイシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）
Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－ロイシルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ａｃ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－チロシルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－）
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｍｅｔ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－（メチルチオ）プロピル］－）、
Ａｃ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトフィル－Ｌ－ロイシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（メトキシカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）
ＭｅＮＨＣＯ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（アミノメチルカルボニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（メトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（メトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－）、
ＭｅＳＯ２－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（メチルスルホニル）－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＭｅＳＯ２－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（メチルスルホニル）－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＰｈＣＨ２Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［ヒドロキシ（フェニルメトキシ）ホスフィニル］－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＥｔＳＯ２－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（エチルスルホニル）－Ｌ－フェニルアラニルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＰｈＣＨ２ＳＯ２－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメチル）スルホニル］－Ｌ－バリル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＰｈＣＨ２Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［ヒドロキシ（フェニルメトキシ）ホスフィニル］－Ｌ－ロイシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、
ＰｈＣＨ２Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［ヒドロキシ（フェニルメトキシ）ホスフィニル］－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）、又は
ＭｅＯ－Ｐ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ；（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－（ヒドロキシメトキシホスフィニル）－Ｌ－ロイシルグリシル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－３－メチルブチル］－）であり得る。
好ましい例は、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈである。
そのようなペプチドアルデヒドのさらなる例としては、
α－ＭＡＰＩ（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，６－［３－［（アミノイミノメチル）アミノ］プロピル］－１２－ホルミル－９－（１－メチルエチル）－４，７，１０－トリオキソ－１３－フェニル－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－
Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，［１（Ｓ），２（Ｓ）］－；Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－（９ＣＩ）；ＳＰ－キモスタチンＢ）、
β－ＭＡＰＩ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｒ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，［１（Ｓ），２（Ｒ）］－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－（９ＣＩ））、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，１２－ホルミル－１３－（４－ヒドロキシフェニル）－４，７，１０－トリオキソ－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，１２－ホルミル－９－メチル－４，７，１０－トリオキソ－１３－フェニル－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，１２－ホルミル－１３－（４－ヒドロキシフェニル）－９－メチル－４，７，１０－トリオキソ－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザペンタデカン酸，１２－ホルミル－９，１４－ジメチル－４，７，１０－トリオキソ－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｎｖａ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザペンタデカン酸，１２－ホルミル－９－メチル－４，７，１０－トリオキソ－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｎｌｅ－Ｈ（３，５，８，１１－テトラアザヘキサデカン酸，１２－ホルミル－９－メチル－４，７，１０－トリオキソ－２－（フェニルメチル）－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｔｙｒ－Ｃ（＝Ｏ）－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］－（９ＣＩ））、
Ｔｙｒ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，１２－ホルミル－１３－（４－ヒドロキシフェニル）－２－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－９－メチル－４，７，１０－トリオキソ－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｓ）－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，６－［３－［（アミノイミノメチル）アミノ］プロピル］－１２－ホルミル－９－（１－メチルエチル）－７，１０－ジオキソ－１３－フェニル－２－（フェニルメチル）－４－チオキソ－，（２Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｓ）－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，６－［３－［（アミノイミノメチル）アミノ］プロピル］－１２－ホルミル－１３－（４－ヒドロキシフェニル）－９－（１－メチルエチル）－７，１０－ジオキソ－２－（フェニルメチル）－４－チオキソ－，（２Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
Ｐｈｅ－Ｃ（＝Ｓ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｈ，（３，５，８，１１－テトラアザトリデカン酸，１２－ホルミル－１３－（４－ヒドロキシフェニル）－９－メチル－７，１０－ジオキソ－２－（フェニルメチル）－４－チオキソ－，（２Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ）－）、
アンチパイン（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［４－［（アミノイミノメチル）アミノ］－１－ホルミルブチル］－）、
ＧＥ２０３７２Ａ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｓ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［１－カルボキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，［１（Ｓ），２（Ｓ）］－）、
ＧＥ２０３７２Ｂ（Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－［（１Ｒ）－１－ホルミル－２－フェニルエチル］－Ｌ－バリンアミド，Ｎ２－［［［１－カルボキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）エチル］アミノ］カルボニル］－Ｌ－アルギニル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，［１（Ｓ），２（Ｒ）］－）、
キモスタチンＡ（Ｌ－ロイシンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－３，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－Ｌ－ロイシンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－（９ＣＩ）；
Ｌ－ロイシンアミド，Ｌ－２－（２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル）－Ｎ－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，立体異性体）、
キモスタチンＢ（Ｌ－バリンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－３，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－Ｌ－バリンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－（９ＣＩ）；
Ｌ－バリンアミド，Ｌ－２－（２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル）－Ｎ－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，立体異性体）、及び
キモスタチンＣ（Ｌ－イソロイシンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－３，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－Ｌ－イソロイシンアミド，（２Ｓ）－２－［（４Ｓ）－２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル］－Ｎ－［［［（１Ｓ）－１－カルボキシ－２－フェニルエチル］アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－（９ＣＩ）；
Ｌ－イソロイシンアミド，Ｌ－２－（２－アミノ－１，４，５，６－テトラヒドロ－４－ピリミジニル）－Ｎ－［［（１－カルボキシ－２－フェニルエチル）アミノ］カルボニル］グリシル－Ｎ－（１－ホルミル－２－フェニルエチル）－，立体異性体）
が挙げられる。
ペプチドアルデヒド付加物
ペプチドアルデヒドの代わりに、プロテアーゼ阻害剤が、ペプチドアルデヒドの付加物であり得る。付加物は、式Ｐ－（Ａ）ｙ－Ｌ－（Ｂ）ｘ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨＲ－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｍ（式中、Ｐ、Ａ、ｙ、Ｌ、Ｂ、ｘ及びＲは、上で定義されるとおりであり、Ｍは、Ｈ又はアルカリ金属、好ましくは、Ｎａ又はＫである）を有するハイドロサルファイト付加物であり得る。或いは、付加物は、式Ｐ－（Ａ）ｙ－Ｌ－（Ｂ）ｘ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨＲ－ＣＨ（ＯＨ）－ＯＲ（式中、Ｐ、Ａ、ｙ、Ｌ、Ｂ、ｘ及びＲは、上で定義されるとおりである）を有するヘミアセタールであり得る。好ましい実施形態は、ハイドロサルファイト付加物であり、Ｐ＝Ｃｂｚ、Ｂ２＝Ｇｌｙ；Ｂ１＝Ａｌａ；Ｂ０＝Ｔｙｒ（そのためＲ＝ＰｈＣＨ２、Ｒ’＝ＯＨ）、ｘ＝２、ｙ＝０、Ｌ＝Ａ＝存在しない及びＭ＝Ｎａ（Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨ（ＣＨ２－ｐ－Ｃ６Ｈ４ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｎａ、Ｌ－アラニンアミド、Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［２－ヒドロキシ－１－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－２－スルホエチル］－、ナトリウム塩（１：１））である。
ペプチドアルデヒドのハイドロサルファイト付加物の一般式はまた、以下のとおりに記載され得る：Ｐ－Ａ２－Ａ１－Ｌ－Ｂ３－Ｂ２－Ｂ１－Ｎ（Ｈ）－ＣＨＲ－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｍ（式中、Ｐ、Ａ２、Ａ１、Ｌ、Ｂ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｒ及びＭは、上で定義されるとおりである）。
或いは、ペプチドアルデヒドの付加物は、Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨ（ＣＨ２－ｐ－Ｃ６Ｈ４ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｎａ（（２Ｓ）－［（Ｎ－｛Ｎ－［（ベンジルオキシ）カルボニル］グリシル｝－Ｌ－アラニニル）アミノ］－１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパン－１－スルホン酸ナトリウム）又はＣｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨ（ＣＨ２Ｐｈ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｎａ（（２Ｓ）－［（Ｎ－｛Ｎ－［（ベンジルオキシ）カルボニル］グリシル｝－Ｌ－アラニニル）アミノ］－１－ヒドロキシ－３－（フェニル）プロパン－１－スルホン酸ナトリウム）又は「ＭｅＯ－ＣＯ＿Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｎ（Ｈ）－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）－ＣＨ（ＯＨ）－ＳＯ３Ｎａ（（２Ｓ）－［（Ｎ－｛Ｎ－［（ベンジルオキシ）カルボニル］グリシル｝－Ｌ－アラニニル）アミノ］－１－ヒドロキシ－３－（２－プロパニル）プロパン－１－スルホン酸ナトリウム）であり得る。
他の好ましいペプチドアルデヒド亜硫酸水素塩は、
Ｃｂｚ－Ａｒｇ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ（Ｌ－アラニンアミド，Ｎ－［（フェニルメトキシ）カルボニル］グリシル－Ｎ－［２－ヒドロキシ－１－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－２－スルホエチル］－，ナトリウム塩（１：１）））、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｐｈ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｐｈ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ｃｂｚ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｐｈ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ，（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
Ａｃ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＮＣＯ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＯ－ＣＯ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｐｈ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＳＯ２－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ，（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＳＯ２－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＰｈＣＨ２Ｏ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＥｔＳＯ２－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＰｈＣＨ２ＳＯ２－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＰｈＣＨ２Ｏ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＰｈＣＨ２Ｏ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、
ＭｅＯ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２））Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）、及び
Ｐｈｅ－ｕｒｅａ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ）Ｃ（ＯＨ）（ＳＯ３Ｍ）－Ｈ（式中、Ｍ＝Ｎａ）である。
塩
バーにおいて使用される塩は、一価カチオン及び有機アニオンの塩である。一価カチオンは、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＮＨ４ ＋であり得る。有機アニオンは、例えば、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩又は乳酸塩であり得る。したがって、一価カチオン及び有機アニオンの塩は、例えば、ギ酸ナトリウム、ギ酸カリウム、ギ酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸アンモニウム、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウムカリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウムなどであり得る。特定の実施形態は、ギ酸ナトリウムである。
洗剤製品の配合
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質錠剤、２層以上を有する錠剤、１つ以上のコンパートメントを有するパウチ、定型的若しくは緻密な粉末、顆粒、ペースト、ゲル、又は定型的、緻密な若しくは濃縮された液体など、任意の好都合な形態であってもよい。
パウチは、単一又は複数のコンパートメントとして構成することができる。これは、組成物を保持するのに好適な任意の形態、形状及び材料であってもよく、例えば、水との接触前に、パウチから組成物が放出できないようにする。パウチは、内容物を封入する水溶性フィルムから作られる。前記内体積は、パウチのコンパートメントに分割することができる。好ましいフィルムは、ポリマー材料、好ましくは、フィルム又はシートに形成されるポリマーである。好ましいポリマー、コポリマー又はその誘導体は、選択されるポリアクリレート、及び水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレートであり、最も好ましくは、ポリビニルアルコールコポリマー及び、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。好ましくは、フィルム中のポリマー、例えば、ＰＶＡのレベルは、少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は通常、約２０，０００～約１５０，０００となる。フィルムはまた、加水分解により分解可能で、水溶性のポリマーブレンド、例えば、ポリラクチド及びポリビニルアルコール（ＭｏｎｏＳｏｌ ＬＬＣ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡから販売される商品名Ｍ８６３０で知られる）と、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール及びこれらの混合物のような可塑剤などを含むブレンドされた組成物であってもよい。パウチは、水溶性フィルムによって分離された固体洗濯クリーニング組成物若しくは一部分の構成成分及び／又は液体クリーニング組成物若しくは一部分の構成成分を含むことができる。液体構成成分用のコンパートメントは、固体を含有するコンパートメントとは、組成が異なり得る：参考文献：（米国特許出願公開第２００９／００１１９７０Ａ１号明細書）。
洗剤成分は、水溶解性パウチ内のコンパートメントによって又は錠剤の様々な層で、互いに物理的に分離することができる。これにより、構成成分間の好ましくない貯蔵時の相互作用を回避することができる。コンパートメントの各々の様々な溶解プロファイルによって、洗浄溶液中の選択した構成成分の溶解遅延を起こすことも可能である。
単位用量ではない液体又はゲル洗剤は、水溶性であってもよく、通常、少なくとも２０重量％、及び最大９５％の水、例えば、最大約７０％の水、最大約６５％の水、最大約５５％の水、最大約４５％の水、最大約３５％の水を含有する。限定されないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテル及びポリオールなどの他のタイプの液体が、水溶性液体又はゲルに含まれてもよい。水溶性液体又はゲル洗剤は、０～３０％の有機溶剤を含有し得る。
液体又はゲル洗剤は、非水溶性であってもよい。
組成物を生成する方法
本発明はまた、組成物を生成する方法に関する。
使用
本発明はまた、その組成物を使用するための方法に関する。
洗剤中での使用。
本発明のポリペプチドが加えられ、それにより洗剤組成物の構成成分になり得る。
本発明の洗剤組成物は、例えば、手による又は機械的洗濯洗剤組成物として、例えば、汚れた布地の前処理又は織物を新品同様にして（例えば、綿毛又は毛玉の除去により）、新しい織物のものに匹敵するように長期間の使用後に布地の視覚的及び手触りの特性の一部を回復させるのに好適な洗濯添加剤組成物、及びすすぎ添加布地用柔軟剤組成物として配合され得るか、或いは一般に家庭の硬質表面クリーニング操作に使用するための洗剤組成物として配合され得るか、或いは手による又は機械的食器洗浄操作のために配合され得る。
特定の態様では、本発明は、本明細書に記載されるとおりの本発明のポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。
材料及び方法
ＰＣＲ、クローニング、ライゲーションヌクレオチドなどの一般的な方法は、当業者によく知られており、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９５）；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ”，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．（１９８５）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ（１９８５）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，（１９８４）において見出され得る。
セルロース分解活性のためのアッセイ
セルロース分解活性は、製造業者の指示書に従って、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ；Ｐｒｏｄｕｃｔ－ｃｏｄｅ：Ｋ－ＣｅｌｌＧ５－４Ｖ）から提供されるセルラーゼアッセイキット（ＣｅｌｌＧ５法）を使用して決定される。エンド－セルラーゼ（エンド－１，４－β－グルカナーゼ）の測定のためのＣｅｌｌＧ５アッセイ試薬は、２種の構成成分を含有する；
１）４，６－Ｏ－（３－ケトブチリデン）－４－ニトロフェニル－β－Ｄ－セロペンタノシド（ＢＰＮＰＧ５）及び２）耐熱性のβ－グルコシダーゼ。ケトンブロッキング基は、ＢＰＮＰＧ５上のβ－グルコシダーゼによっていずれかの加水分解作用を妨げる。エンド－セルラーゼとのインキュベーションは、補助的なβ－グルコシダーゼによって迅速に加水分解されるブロッキングされていない発色オリゴ糖を生成する。したがって、４－ニトロフェノールの形成の速度は、エンド－セルラーゼによるＢＰＮＰＧ５の加水分解と直接的に関連する。
モデル洗剤Ａの組成物（液体）
洗剤Ａの組成物（液体）：成分：１２％ＬＡＳ、１１％ＡＥＯ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｎ２５－７（ＮＩ）、７％ＡＥＯＳ（ＳＬＥＳ）、６％ＭＰＧ（モノプロピレングリコール）、３％エタノール、３％ＴＥＡ、２．７５％ココア石鹸、２．７５％ダイズ石鹸、２％グリセロール、２％水酸化ナトリウム、２％クエン酸ナトリウム、１％ギ酸ナトリウム、０．２％ＤＴＭＰＡ及び０．２％ＰＣＡ、１００％までの水（全てのパーセンテージはｗ／ｗである）。
モデル洗剤Ａ２の組成物（液体）
洗剤Ａ２の組成物（液体）：成分：１２％ＬＡＳ、１２％ＡＥＯ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｎ２５－７（ＮＩ）、４％ＡＥＯＳ（ＳＬＥＳ）、２％ＭＰＧ（モノプロピレングリコール）、３％エタノール、２％ＴＥＡ（トリエチルアミン）、３％石鹸、０．５％水酸化ナトリウム、３．９％クエン酸ナトリウム、１．５％ＤＴＭＰＡ、Ｎａ７（ジエチレントラミンペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）、七ナトリウム塩）、０．５％フェノキシエタノール、１００％までの水（全てのパーセンテージはｗ／ｗである）。
プロテアーゼ
実施例のために使用されるプロテアーゼは、配列番号１０のものである。他のプロテアーゼとしては、配列番号１１のもの、又は変異Ｓ９Ｅ＋Ｎ４２Ｒ＋Ｎ７４Ｄ＋Ｖ１９９Ｉ＋Ｑ２００Ｌ＋Ｙ２０３Ｗ＋Ｓ２５３Ｄ＋Ｎ２５５Ｗ＋Ｌ２５６Ｅを有する配列番号１１のものが挙げられる。
洗浄アッセイ
Ｌａｕｎｄｅｒ－Ｏ－Ｍｅｔｅｒ（ＬＯＭ）モデル洗浄系
Ｌａｕｎｄｅｒ－Ｏ－Ｍｅｔｅｒ（ＬＯＭ）は、最大２０種の異なる洗浄条件を同時に試験するために適用され得る中規模のモデル洗浄系である。ＬＯＭは、基本的には、内部に回転する２０個の密閉された金属ビーカーを伴う大きい温度制御された水浴である。各ビーカーは、１つの小さい洗濯機に相当し、実験の間、各々は、試験される汚れた布地及び汚れていない布地とともに試験されることになる特定の洗剤／酵素系の溶液を含有することになる。機械的負荷は、ビーカーが水浴中で回転されること及びビーカー中に金属球を含むことによって達成される。
ＬＯＭモデル洗浄系は主に、欧州の洗浄条件での洗剤及び酵素の中規模の試験において使用される。ＬＯＭ実験において、バラストと汚れの比及び布地と洗浄液の比などの因子は変動し得る。したがって、ＬＯＭは、ＡＭＳＡ及びミニウォッシュなどの小規模実験と、より時間のかかるフロントローダー洗濯機での実物大の実験の間の接点を提供する。
Ｍｉｎｉ Ｌａｕｎｄｅｒ－Ｏ－Ｍｅｔｅｒ（ＭｉｎｉＬＯＭ）モデル洗浄系
ＭｉｎｉＬＯＭは、Ｌａｕｎｄｅｒ－Ｏ－Ｍｅｔｅｒ（ＬＯＭ）の改造された小型の洗浄系であり、最大２０種の異なる洗浄条件を同時に試験するために適用され得る中規模のモデル洗浄系である。ＬＯＭは、基本的には、内部に回転する２０個の密閉された金属ビーカーを伴う大きい温度制御された水浴である。各ビーカーは、１つの小さい洗濯機に相当し、実験の間、各々は、試験される汚れた布地及び汚れていない布地とともに試験されることになる特定の洗剤／酵素系の溶液を含有することになる。機械的負荷は、ビーカーが水浴中で回転されること及びビーカー中に金属球を含むことによって達成される。
ＬＯＭモデル洗浄系は主に、欧州の洗浄条件での洗剤及び酵素の中規模の試験において使用される。ＬＯＭ実験において、バラストと汚れの比及び布地と洗浄液の比などの因子は変動し得る。したがって、ＬＯＭは、ＡＭＳＡ及びミニウォッシュなどの小規模実験と、より時間のかかるフロントローダー洗濯機での実物大の実験の間の接点を提供する。
ｍｉｎｉＬＯＭにおいて、洗浄は、Ｓｔｕａｒｔローターに置かれた５０ｍｌの試験管において実施される。
Ｔｅｒｇ－Ｏ－Ｔｏｍｅｔｅｒ（ＴＯＭ）洗浄アッセイ
Ｔｅｒｇ－Ｏ－Ｍｅｔｅｒ（ＴＯＭ）は、１２種の異なる洗浄条件を同時に試験するために適用され得る中規模のモデル洗浄系である。ＴＯＭは、基本的には、内部に浸される最大１２個の開放型金属ビーカーを伴う大きい温度制御された水浴である。各ビーカーは、１つの小さいトップローダー式洗濯機に相当し、実験の間、それらの各々は、その性能が試験される特定の洗剤／酵素系の溶液並びに汚れた布地及び汚れていない布地を含有することになる。機械的負荷は、各ビーカー内の液体を撹拌する回転式撹拌アームによって実現される。ＴＯＭビーカーは蓋を有しないため、ＴＯＭ実験中に試料を取り除き、洗浄中にオンラインで情報をアッセイすることが可能である。
ＴＯＭモデル洗浄系は主に、ＵＳ又はＬＡ／ＡＰの洗浄条件での洗剤及び酵素の中規模の試験において使用される。ＴＯＭ実験において、バラストと汚れの比及び布地と洗浄液の比などの因子は変動し得る。したがって、ＴＯＭは小規模実験と、より時間のかかるトップローダー洗濯機での実物大の実験の間の接点を提供する。
実施例１：セルラーゼバリアントの安定性の決定（コア安定性法）
セルラーゼバリアントの安定性は、プロテアーゼを含有する９０％液体洗剤Ａにおいて測定される。洗剤中での安定性は、プロテアーゼを含有する酵素洗剤混合物のインキュベーション後にＣｅｌｌＧ５キットによってバリアントの活性を測定することによって評価される。
９０％洗剤Ａ中の温度／プロテアーゼ負荷条件：
９６ウェルマイクロプレート（ポリスチレン）中において、緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ；０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０；ｐＨ７．５）中で希釈された２０μＬの１０００ｐｐｍの精製されたエンド－セルラーゼが、０．３ｍｇ／ｍＬの活性酵素プロテアーゼタンパク質を含有する１８０μＬの洗剤Ａと混合される。
１５μＬの酵素／洗剤混合物は、２つの新たな３８４ウェルマイクロプレート中に移され、密封される。２つの同一のプレートの一方は５℃（基準）で保管されたが、他方は高温（負荷）で１６又は１７時間インキュベートされた。使用される負荷温度については結果の表を参照されたい。インキュベーションの後、６０μＬのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ；０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０；ｐＨ７．５）が、両方のプレートにおいて試料に加えられ、その後の活性測定のために激しく混合される。
セルロース分解活性のためのアッセイ試料（ＣｅｌｌＧ５キット）：
酵素活性は、ＵＶ透過３８４ウェルマイクロプレート中において２０μＬの希釈された酵素－洗剤混合物を１０μＬのアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ；０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０；ｐＨ７．５）及び１０μＬの新たに調製された基質溶液と混合することによって測定される。ＣｅｌｌＧ５アッセイキットの基質溶液は、１０μＬのボトル＃２を３００μＬのボトル＃１と混合することによって調製される。
ＵＶ吸光度（４０５ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ、Ｍ１０００、ｐｒｏ）を使用して動力学的に測定される（２分おきに４４分間）。一定の吸光度増大を示す曲線の部分を使用して、試料の酵素活性を計算した（ｍＯＤ／分）。その後、残存活性が、５℃で保管された対応する試料における酵素活性に対する高温で１６又は１７時間インキュベートされた試料の酵素活性として計算される。
残存活性（％）＝（活性、高温でインキュベートされた試料／活性、５℃でインキュベートされた試料）＊１００
実施例２：リンカー安定性アッセイ
原理
リンカー安定性は、（Ａ）プロテアーゼを含有する洗剤中でセルラーゼをインキュベートし、続いて（Ｂ）インキュベートされたセルラーゼのセルロース繊維に結合する能力を決定することによって測定される。リンカー又はセルロース結合ドメインがプロテアーゼによって影響を及ぼされる場合、セルロース繊維に対するセルラーゼの結合親和性は低減されることになる。
結合は、インキュベートされたセルラーゼの希釈液をセルロース繊維の懸濁液に加えることによって決定される。５℃でのインキュベーションの後、セルロースに結合されたセルラーゼは、遠心分離によって除去され、セルロースに結合されないセルラーゼの量は、（Ｃ）上清中のセルラーゼの活性を測定することによって決定される。同様の条件であるがセルロースの非存在下でインキュベートされた並行した試料の活性に対するセルロースに結合されないセルラーゼの活性が、リンカー安定性の尺度である。
活性は、可溶性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の加水分解に続く（Ｄ）形成される還元末端の数の検出に基づく。ＣＭＣは、インタクトなセルラーゼ及びセルロース結合ドメインを有しないセルラーゼの両方に対する基質である。
Ａ．プロテアーゼを含有する洗剤におけるインキュベーション
化学物質
洗剤：モデル洗剤Ａ
プロテアーゼ：配列番号１０
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬
希釈緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
プロテアーゼ原液、例えば、配列番号１０のプロテアーゼ
０．３ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼを有する洗剤：モデル洗剤Ａ中で３００ｐｐｍ
上のとおりのモデル洗剤Ａ
手順
１）０．３ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼを有する洗剤を、プロテアーゼ原液を洗剤中の３００ｐｐｍの活性プロテアーゼタンパク質の最終プロテアーゼ濃度まで１００ｍＬの洗剤に加え、室温での磁性撹拌によって１時間混合することによって調製する。
２）セルラーゼを、希釈緩衝液中において３００ｐｐｍに希釈する。
３）（１）からのプロテアーゼを有する２７０μＬの洗剤を、９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）２４９９４４）中にウェル位置Ａ１からＤ１２までピペットで分注する。
４）（２）からの３０μＬの希釈されたセルラーゼを、各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加える。各セルラーゼは、三つ組で試験され、位置Ｄ４～Ｄ６は、ブランクのために使用され、３０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水がセルラーゼの代わりに加えられる。
５）小さい磁石を各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加え、プレートをヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封した後、磁性撹拌によって３０分間混合する。
６）混合した後、プレートを、実施例に示される時間及び温度でインキュベートする。
Ｂ．セルロース繊維に対する結合
化学物質
セルロース繊維：Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、ＰＨ－１０１、（Ｓｉｇｍａ １１３６５）
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬：
結合緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
Ａｖｉｃｅｌ懸濁液：使用前に１時間混合された結合緩衝液中の１．２５ｇ／１００ｍＬ Ａｖｉｃｅｌ
手順：
１）１８０μＬのＡｖｉｃｅｌ懸濁液を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）において位置Ａ１からＤ１２まで加え、１８０μＬの結合緩衝液を位置Ｅ１からＨ１２まで加えた。
２）次に、工程Ａのインキュベートされたプレート中の各ウェルからの２０μＬの試料の一定分量を、それぞれ位置Ａ１からＤ１２まで及び位置Ｅ１からＨ１２までウェルに加えた。
３）プレートを、５℃で１時間懸濁液中においてセルロース繊維を維持するのに十分な速度で振盪して、セルラーゼがセルロースに結合することを可能にする。
４）結合の後、プレートを、１５００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、上清を結合緩衝液（４０μＬの試料＋６０μＬの緩衝液）中において２．５倍希釈する。Ａｖｉｃｅｌからの上清及びＡｖｉｃｅｌを含まない対応するウェルの両方が希釈される。
Ｃ．ＣＭＣ活性アッセイ
化学物質：
ＣＭＣ：ナトリウムカルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃ５６７８）
Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩：Ｍｅｒｃｋ ８０８７
β－グルコシダーゼ ０．１ｍｇ／ｍＬに希釈されたＭｅｇａｚｙｍｅ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）；受入番号Ｑ０８６３８、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ－ＢＧＯＳＴＭ）（比活性７０Ｕ／ｍｇ及び製品中の活性 約４６０Ｕ／ｍＬ－＞６．５７ｍｇ／ｍＬ）
ＰＡＨＢＡＨ ４－ヒドロキシベンズヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ｈ９８８２）
ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ ０４０２．１０００）
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬：
アッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
ＣＭＣ基質：使用前に１時間混合された１．２５ｇ ＣＭＣ／１００ｍＬ アッセイ緩衝液
ＰＡＨＢＡＨ緩衝液：５０ｇ／Ｌ Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩＋２０ｇ／Ｌ ＮａＯＨ
ＰＡＨＢＡＨ試薬：ＰＡＨＢＡＨ緩衝液中の１５ｍｇ／ｍＬ ＰＡＨＢＡＨ
β－グルコシダーゼ溶液：アッセイ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのβ－グルコシダーゼ
手順：
１）１６０μＬのＣＭＣ基質を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）にピペットで分注する
２）工程Ｂからの２０μＬの希釈された上清を、２０μＬのβ－グルコシダーゼ溶液と合わせて加える
３）プレートを、ヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封し、４０℃で４５分間インキュベートした
４）反応後、各ウェルの１００μＬを、ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔ ９６ ｎｏｎ－ｓｋｉｒｔｅｄ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢ－０６００）に移した後、７５μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬を移す
５）次に、（４）のプレートを、密封ホイル（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅプレートシーラー、Ｃａｔ．Ｎｏ．６７６００１）で密封し、９５℃で１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ Ｔ１００（商標）サーマルサイクラーＰＣＲ装置中において１０℃で５分間冷却する
６）冷却した後、１００μＬの一定分量を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）に移し、吸光度を４０５ｎｍ（Ａ４０５ｎｍ）で読み取る。吸光度は、上清中のセルラーゼの活性の表出である。
Ｄ．データ処理
１）工程Ｃの吸光度読み取り値から、Ａｖｉｃｅｌを含まないウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿ｒｅｆ）が計算され（位置Ｈ４－＞Ｈ６）、Ａｖｉｃｅｌを含むウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿Ａｖｉｃｅｌ）が計算される（位置Ｄ４－＞Ｄ６）。
２）次に、セルラーゼ含有ウェルからの吸光度読み取り値が、それらの対応するブランク（すなわち、（１）からのもの）に関して補正される。
３）リンカー安定性が、
１－［Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）／Ａｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）］
（式中、Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）及びＡｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）は、それぞれＡｖｉｃｅｌとのインキュベーションからの上清及びＡｖｉｃｅｌを伴わないインキュベーションからの上清を有するウェル中の活性である（すなわち、ブランクに関して補正された吸光度））として計算される。
４）実施例において報告されるリンカー安定性は、分析された三つ組の平均である。
このアッセイは、下の実施例３によってさらに実証されるとおり、コアが存在する場合及び存在しない場合の結合を明確に区別する。
実施例３：セルロース結合アッセイ－プロテアーゼなし
原理
セルラーゼは、（Ａ）希釈された洗剤溶液中における５℃での６０分間のＡｖｉｃｅｌとのインキュベーションによってセルロースに結合させられる。インキュベーションの後、セルロースに結合されないセルラーゼの活性は、上清（Ｂ）において決定され、セルラーゼの非存在下でインキュベートされた並行したセルラーゼ試料に対して比較される。Ａｖｉｃｅｌとのインキュベーション中の温度は、結合工程中のセルラーゼの触媒活性が、結合アッセイに著しい影響を及ぼさないことを保証するために低く維持される。
Ａ．セルロースに対する結合
化学物質
洗剤：モデル洗剤Ａ
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
セルロース繊維：Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、ＰＨ－１０１、（Ｓｉｇｍａ １１３６５）
試薬
結合緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
Ａｖｉｃｅｌ懸濁液：使用前に１時間混合された結合緩衝液中の１．２５ｇ／１００ｍＬ Ａｖｉｃｅｌ
上のとおりのモデル洗剤Ａ
手順
１）セルラーゼを、結合緩衝液中において３００ｐｐｍに希釈する。
２）２７０μＬの洗剤を、９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）２４９９４４）中にウェル位置Ａ１からＤ１２までピペットで分注する。
３）（１）からの３０μＬの希釈されたセルラーゼを、各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加える。各セルラーゼは、三つ組で試験され、位置Ｄ４～Ｄ６は、ブランクのために使用され、３０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水がセルラーゼの代わりに加えられる。
４）小さい磁石を各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加え、プレートをヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封した後、磁性撹拌によって３０分間混合する。
５）１６０μＬの結合緩衝液を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）９６ウェルポリプロピレンＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）保管プレート）（位置Ａ１～Ｄ１２）中にピペットで分注し、１６０μＬのＡｖｉｃｅｌ懸濁液を、位置Ｅ１～Ｈ１２中にピペットで分注する。
６）２０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水を、全てのウェル（Ａ１～Ｈ１２）に加える。
７）（４）の一定分量の２０μＬのセルラーゼ洗剤試料を、Ａｖｉｃｅｌを含むウェル（Ａ１～Ｄ１２）及びＡｖｉｃｅｌを含まないウェル（Ｅ１～Ｈ１２）に加える。
８）次に、プレートを、５℃の低温室において６０分間インキュベートして、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０１シェーカー中でのセルラーゼのセルロースへの結合を可能にする。振盪速度は、インキュベーション中におけるセルロースの懸濁の維持を保証するために調整される。
９）結合の後、プレートを、１５００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、上清を結合緩衝液（４０μＬの試料＋６０μＬの緩衝液）中において２．５倍希釈する。Ａｖｉｃｅｌからの上清及びＡｖｉｃｅｌを含まない対応するウェルの両方が希釈される。
Ｂ．ＣＭＣ活性アッセイ
化学物質：
ＣＭＣ：ナトリウムカルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃ５６７８）
Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩：Ｍｅｒｃｋ ８０８７
β－グルコシダーゼ ０．１ｍｇ／ｍＬに希釈されたＭｅｇａｚｙｍｅ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）；受入番号Ｑ０８６３８、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ－ＢＧＯＳＴＭ）（比活性７０Ｕ／ｍｇ及び製品中の活性 約４６０Ｕ／ｍＬ－＞６．５７ｍｇ／ｍＬ）
ＰＡＨＢＡＨ ４－ヒドロキシベンズヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ｈ９８８２）
ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ ０４０２．１０００）
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬：
アッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
ＣＭＣ基質：使用前に１時間混合された１．２５ｇ ＣＭＣ／１００ｍＬ アッセイ緩衝液
ＰＡＨＢＡＨ緩衝液：５０ｇ／Ｌ Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩＋２０ｇ／Ｌ ＮａＯＨ
ＰＡＨＢＡＨ試薬：ＰＡＨＢＡＨ緩衝液中の１５ｍｇ／ｍＬ ＰＡＨＢＡＨ
β－グルコシダーゼ溶液：アッセイ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのβ－グルコシダーゼ
手順：
１）１６０μＬのＣＭＣ基質を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）にピペットで分注する
２）工程Ａからの２０μＬの希釈された上清を、２０μＬのβ－グルコシダーゼ溶液と合わせて加える
３）プレートを、ヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封し、４０℃で４５分間インキュベートした
４）反応後、各ウェルの１００μＬを、ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔ ９６ ｎｏｎ－ｓｋｉｒｔｅｄ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢ－０６００）に移した後、７５μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬を移す
５）次に、（４）のプレートを、密封ホイル（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅプレートシーラー、Ｃａｔ．Ｎｏ．６７６００１）で密封し、９５℃で１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ Ｔ１００（商標）サーマルサイクラーＰＣＲ装置中において１０℃で５分間冷却する
６）冷却した後、１００μＬの一定分量を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）に移し、吸光度を４０５ｎｍ（Ａ４０５ｎｍ）で読み取る。吸光度は、上清中のセルラーゼの活性の表出である。
Ｃ．データ処理
１）工程Ｂの吸光度読み取り値から、Ａｖｉｃｅｌを含まないウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿ｒｅｆ）が計算され（位置Ｈ４－＞Ｈ６）、Ａｖｉｃｅｌを含むウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿Ａｖｉｃｅｌ）が計算される（位置Ｄ４－＞Ｄ６）。
２）次に、セルラーゼ含有ウェルからの吸光度読み取り値が、それらの対応するブランク（すなわち、（１）からのもの）に関して補正される。
３）結合は、
１－［Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）／Ａｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）］
（式中、Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）及びＡｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）は、それぞれＡｖｉｃｅｌとのインキュベーションからの上清及びＡｖｉｃｅｌを伴わないインキュベーションからの上清を有するウェル中の活性である（すなわち、ブランクに関して補正された吸光度））として計算される。実施例において報告されるリンカー安定性は、分析された三つ組の平均である。
これを実証するために、ＣＢＭの有り無し両方のセルラーゼの試料を、この実施例に記載されるとおりにセルラーゼに対する結合に関して試験した。比は、触媒ドメイン単独のものに対する、インタクトなセルラーゼ、すなわち、触媒ドメイン、リンカー及びＣＢＭを有するセルラーゼの結合として計算される。
Figure 2023520312000009
データは、ＣＢＭの非存在下で、セルラーゼに対する結合が著しく低減されることを明確に実証している。
実施例４：グリコシドヒドロラーゼバリアントの構築
セルラーゼバリアントは、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）セルラーゼ（配列番号１）から構築される。このバリアントを、得られた配列に所望の変異を導入する、適切に設計されたオリゴヌクレオチドと一緒にＰＣＲを使用するＤＮＡ断片の伝統的なクローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９）により作製した。或いは、ＩＤＴＤＮＡのようなベンダーから購入された合成遺伝子断片を使用して、天然のＤＮＡ配列を新規の所望のＤＮＡ配列と置き換えた。
オリゴは、挿入／欠失／置換／合成ＤＮＡ配列を定義するＤＮＡ塩基対によって隔てられた、所望の変異部位又は置き換えられることになる一続きのＤＮＡに隣接するＤＮＡ配列に対応して設計され、ＩＤＴＤＮＡなどのオリゴベンダーから購入される。本発明のバリアントを試験するために、本発明のバリアントを含む変異されたＤＮＡは、相同組み換えによってコンピテントなＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）に組み込まれ、標準的なプロトコル（酵母抽出物に基づく培地、４～５日、３０℃）を使用して発酵させられ、次のとおりに精製される。
培養ブロスを、Ｎａｌｇｅｎｅ ０．２μｍ濾過ユニットに通して濾過して、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞を除去する。濾液中のｐＨを、２０％のＣＨ３ＣＯＯＨでｐＨ４．０に調整し、ｐＨが調整された濾液を、２０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ／ＮａＯＨ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ４．０において平衡化されたＣａｐｔｏ ＭＭＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にアプライした。カラムを平衡化緩衝液で広範に洗浄した後、セルラーゼを、５０ｍＭのＴｒｉｓ－塩基、１ｍＭのＣａＣｌ２、非緩衝で溶出する。カラムからの画分を、セルラーゼ活性について分析する。セルラーゼのピークをプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０中で平衡化されたＱ－セファロースＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にアプライする。カラムを平衡化緩衝液で広範に洗浄した後、セルラーゼを、平衡化緩衝液と５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０の間で３カラム体積にわたって線形ＮａＣｌ勾配で溶出する。カラムからの画分を、セルラーゼ活性について分析し、セルラーゼのピークを、精製された生成物としてプールする。精製されたバリアントを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。セルラーゼバリアントはグリコシル化されるため、それらは、クーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で拡散したバンドをもたらした。精製された生成物は、さらなる特徴付けのために使用される。
実施例５：プロテアーゼによる洗浄中のリンカー安定性アッセイ
原理
リンカー安定性は、（Ａ）プロテアーゼを含有する洗剤洗浄溶液中でセルラーゼをインキュベートし、続いて（Ｂ）インキュベートされたセルラーゼのセルロース繊維に結合する能力を決定することによって測定される。リンカー又はセルロース結合ドメインがプロテアーゼによって影響を及ぼされる場合、セルロース繊維に対するセルラーゼの結合親和性は低減されることになる。
結合は、インキュベートされたセルラーゼの希釈液をセルロース繊維の懸濁液に加えることによって決定される。５℃でのインキュベーションの後、セルロースに結合されたセルラーゼは、遠心分離によって除去され、セルロースに結合されないセルラーゼの量は、（Ｃ）上清中のセルラーゼの活性を測定することによって決定される。同様の条件であるがセルロースの非存在下でインキュベートされた並行した試料の活性に対するセルロースに結合されないセルラーゼの活性が、リンカー安定性の尺度である。
活性は、可溶性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の加水分解に続く（Ｄ）形成される還元末端の数の検出に基づく。ＣＭＣは、インタクトなセルラーゼ及びセルロース結合ドメインを有しないセルラーゼの両方に対する基質である。
Ｅ．プロテアーゼを含有する洗剤におけるインキュベーション
化学物質
洗剤：モデル洗剤Ａ
プロテアーゼ：配列番号１０を有するプロテアーゼ
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬
希釈緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
プロテアーゼを有する洗剤：モデル洗剤Ａ中の０．３μｇ／ｍＬの活性プロテアーゼタンパク質
洗剤洗浄溶液：１５°ｄＨの水硬度を有する水中におけるプロテアーゼを有する３．３ｇ／Ｌの洗剤
手順
７）洗剤洗浄溶液を調製する
８）セルラーゼを、希釈緩衝液中において３００ｐｐｍに希釈する。
９）（１）からの２７０μＬの洗剤洗浄溶液を、９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）２４９９４４）中にウェル位置Ａ１からＤ１２までピペットで分注する。
１０）（２）からの３０μＬの希釈されたセルラーゼを、各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加える。各セルラーゼは、三つ組で試験され、位置Ｄ４～Ｄ６は、ブランクのために使用され、３０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水がセルラーゼの代わりに加えられる。
１１）小さい磁石を各ウェル（位置Ａ１～Ｄ１２）に加え、プレートをヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封した後、磁性撹拌によって３０分間混合する。
１２）混合した後、プレートを、実施例に示される時間及び温度で、例えば、４０℃で２時間インキュベートする。
Ｆ．セルロース繊維に対する結合
化学物質
セルロース繊維：Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、ＰＨ－１０１、（Ｓｉｇｍａ １１３６５）
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬：
結合緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
Ａｖｉｃｅｌ懸濁液：使用前に１時間混合された結合緩衝液中の１．２５ｇ／１００ｍＬ Ａｖｉｃｅｌ
手順：
５）１８０μＬのＡｖｉｃｅｌ懸濁液を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）において位置Ａ１からＤ１２まで加え、１８０μＬの結合緩衝液を位置Ｅ１からＨ１２まで加えた。
６）次に、工程Ａのインキュベートされたプレート中の各ウェルからの２０μＬの試料の一定分量を、それぞれ位置Ａ１からＤ１２まで及び位置Ｅ１からＨ１２までウェルに加えた。
７）プレートを、５℃で１時間懸濁液中においてセルロース繊維を維持するのに十分な速度で振盪して、セルラーゼがセルロースに結合することを可能にする。
８）結合の後、プレートを、１５００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、上清を結合緩衝液（４０μＬの試料＋６０μＬの緩衝液）中において２．５倍希釈する。Ａｖｉｃｅｌからの上清及びＡｖｉｃｅｌを含まない対応するウェルの両方が希釈される。
Ｇ．ＣＭＣ活性アッセイ
化学物質：
ＣＭＣ：ナトリウムカルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｃ５６７８）
Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩：Ｍｅｒｃｋ ８０８７
β－グルコシダーゼ ０．１ｍｇ／ｍＬに希釈されたＭｅｇａｚｙｍｅ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）；受入番号Ｑ０８６３８、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ－ＢＧＯＳＴＭ）（比活性７０Ｕ／ｍｇ及び製品中の活性 約４６０Ｕ／ｍＬ－＞６．５７ｍｇ／ｍＬ）
ＰＡＨＢＡＨ ４－ヒドロキシベンズヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ｈ９８８２）
ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ ０４０２．１０００）
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ Ｈ３３７５
試薬：
アッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８
ＣＭＣ基質：使用前に１時間混合された１．２５ｇ ＣＭＣ／１００ｍＬ アッセイ緩衝液
ＰＡＨＢＡＨ緩衝液：５０ｇ／Ｌ Ｋ－Ｎａ－酒石酸塩＋２０ｇ／Ｌ ＮａＯＨ
ＰＡＨＢＡＨ試薬：ＰＡＨＢＡＨ緩衝液中の１５ｍｇ／ｍＬ ＰＡＨＢＡＨ
β－グルコシダーゼ溶液：アッセイ緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのβ－グルコシダーゼ
手順：
７）１６０μＬのＣＭＣ基質を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）にピペットで分注する
８）工程Ｂからの２０μＬの希釈された上清を、２０μＬのβ－グルコシダーゼ溶液と合わせて加える
９）プレートを、ヒートシール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）接着性ＰＣＲプレートシール ＡＢ０５５８）で密封し、４０℃で４５分間インキュベートした
１０）反応後、各ウェルの１００μＬを、ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔ ９６ ｎｏｎ－ｓｋｉｒｔｅｄ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢ－０６００）に移した後、７５μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬を移す
１１）次に、（４）のプレートを、密封ホイル（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅプレートシーラー、Ｃａｔ．Ｎｏ．６７６００１）で密封し、９５℃で１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ Ｔ１００（商標）サーマルサイクラーＰＣＲ装置中において１０℃で５分間冷却する
１２）冷却した後、１００μＬの一定分量を、新たな９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０）に移し、吸光度を４０５ｎｍ（Ａ４０５ｎｍ）で読み取る。吸光度は、上清中のセルラーゼの活性の表出である。
Ｈ．データ処理
５）工程Ｃの吸光度読み取り値から、Ａｖｉｃｅｌを含まないウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿ｒｅｆ）が計算され（位置Ｈ４－＞Ｈ６）、Ａｖｉｃｅｌを含むウェルの３つのブランクの平均、Ａ４０５ｎｍ（ｂｌａｎｋ＿Ａｖｉｃｅｌ）が計算される（位置Ｄ４－＞Ｄ６）。
６）次に、セルラーゼ含有ウェルからの吸光度読み取り値が、それらの対応するブランク（すなわち、（１）からのもの）に関して補正される。
７）リンカー安定性が、
１－［Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）／Ａｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）］
（式中、Ａｃｔ４０５ｎｍ（＋Ａｖｉｃｅｌ）及びＡｃｔ４０５ｎｍ（－Ａｖｉｃｅｌ）は、それぞれＡｖｉｃｅｌとのインキュベーションからの上清及びＡｖｉｃｅｌを伴わないインキュベーションからの上清を有するウェル中の活性である（すなわち、ブランクに関して補正された吸光度））として計算される。
８）実施例において報告されるリンカー安定性は、分析された三つ組の平均である。
実施例６：Ｐ７Ｇリンカー（配列番号３０）を有するＣＢＭ配列番号１７３のバリアント
バリアントは、以下の改変を伴う実施例２、リンカー安定性アッセイに記載されるとおりに試験された：洗剤は、モデル洗剤Ａ２、プロテアーゼ配列番号１０であった。バリアントを、残存活性及びセルロースに結合する能力について試験する前にプロテアーゼを有する洗剤中において４５℃で３日間インキュベートした。
Figure 2023520312000010
Figure 2023520312000011
Figure 2023520312000012
ＣＢＭに関する表記：配列番号に続く「＋」は、指定の変異が参照される配列に導入されていることを示す。例えば、１７３＋Ｓ３４Ｈは、配列番号１７３の３４位におけるＳがＨで置換されていることを示す。
データは、配列番号７を有するＣＢＭを、配列番号１７３を有するＣＢＭ又は配列番号１７３を有するＣＢＭのバリアントで置換する正の影響を明確に実証している。
実施例７：様々なリンカーを有するＣＢＭ配列番号１７３のバリアント
異なるリンカーを有する配列番号１７３のバリアントは、以下の改変を伴う実施例２、リンカー安定性アッセイに記載されるとおりに試験された：洗剤は、モデル洗剤Ａ２、プロテアーゼ配列番号１０であった。バリアントを、残存活性及びセルロースに結合する能力について試験する前にプロテアーゼを有する洗剤中において４５℃で３日間インキュベートした。
Figure 2023520312000013
Figure 2023520312000014
Figure 2023520312000015
Figure 2023520312000016
Figure 2023520312000017
Figure 2023520312000018
Figure 2023520312000019
Figure 2023520312000020
ＣＢＭに関する表記：配列番号に続く「＋」は、指定の変異が参照される配列に導入されていることを示す。例えば、１７３＋Ｓ３４Ｈ，Ｌ３７Ｒは、配列番号１７３の３４位のＳがＨで置換されており且つ配列番号１７３の３７位のＬがＲによって置換されていることを示す。
結果は、異なるプロリンリッチリンカーが配列番号１７３のバリアントと組み合わせられるとき、改善された安定性を得ることができることを実証している。
実施例８：Ｐ７Ｇリンカー（配列番号３０）を有するＣＢＭ配列番号１７３のバリアント
Ｐ７Ｇリンカー（配列番号３０）とともに変異Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ及び少なくとも１つのさらなる変異を含む配列番号１７３を有するＣＢＭのバリアントは、以下の改変を伴う実施例２、リンカー安定性アッセイに記載されるとおりに試験された：洗剤は、モデル洗剤Ａ２、プロテアーゼ配列番号１０であった。バリアントを、残存活性及びセルロースに結合する能力について試験する前にプロテアーゼを有する洗剤中において４５℃で３日間インキュベートした。
Figure 2023520312000021
Figure 2023520312000022
Figure 2023520312000023
Figure 2023520312000024
Figure 2023520312000025
ＣＢＭに関する表記：配列番号に続く「＋」は、指定の変異が参照される配列に導入されていることを示す。例えば、１７３＋Ａ２２Ｅ，Ｓ３４Ｈ，Ｌ３７Ｒは、配列番号１７３の２２位のＡがＥで置換されており、配列番号１７３の３４位のＳがＨで置換されており且つ配列番号１７３の３７位のＬがＲで置換されていることを示す。
結果は、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、３４、及び３７から選択される位置で配列番号１７３に変異を導入するとき、配列番号７を有するＣＢＭに対して改善された安定性を得ることができることを実証している。

Claims (22)

  1. 炭水化物結合モジュールのバリアントであって、配列番号１７３のポリペプチドの３４、３７、１４、１８、２１、２２、２５、２７、２８、２９位に対応する１つ以上の位置で置換を含み、
    前記バリアントが、配列番号１７３の前記ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有し；
    且つ前記バリアントが、炭水化物結合活性を有する、バリアント。
  2. 炭水化物結合モジュールファミリー１（ＣＢＭ１）のバリアントである、請求項１に記載のバリアント。
  3. ３４位のアミノ酸残基のＨ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、好ましくは、Ｈ、Ｙによる置換；
    ３７位のアミノ酸残基のＲによる置換；
    １４位のアミノ酸残基のＷによる置換；
    １８位のアミノ酸残基のＫ、Ｒによる置換；
    ２１位のアミノ酸残基のＥによる置換；
    ２２位のアミノ酸残基のＥ、Ｎ、Ｐによる置換；
    ２５位のアミノ酸残基のＥによる置換；
    ２７位のアミノ酸残基のＩによる置換；
    ２８位のアミノ酸残基のＰによる置換；及び
    ２９位のアミノ酸残基のＰによる置換
    からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１又は２に記載のバリアント。
  4. Ｓ３４Ｈ；Ｓ３４Ｙ；Ｓ３４Ｋ；Ｓ３４Ｒ；
    Ｌ３７Ｒ；
    Ｙ１４Ｗ；
    Ｔ１８Ｋ；Ｔ１８Ｒ；
    Ｖ２１Ｅ；
    Ａ２２Ｅ；Ａ２２Ｐ；Ａ２２Ｎ；
    Ｔ２５Ｅ；
    Ｔ２７Ｉ；
    Ｑ２８Ｐ；及び
    Ｌ２９Ｐ
    からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のバリアント。
  5. ３４位のアミノ酸残基のＨ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、好ましくは、Ｈ、Ｙによる置換；
    ３７位のアミノ酸残基のＲによる置換；
    １４位のアミノ酸残基のＷによる置換；
    １８位のアミノ酸残基のＫ、Ｒによる置換；
    ２１位のアミノ酸残基のＥによる置換；
    ２２位のアミノ酸残基のＥ、Ｐによる置換；
    ２５位のアミノ酸残基のＥによる置換；
    ２７位のアミノ酸残基のＩによる置換；
    ２８位のアミノ酸残基のＰによる置換；及び
    ２９位のアミノ酸残基のＰによる置換
    からなる群から選択される少なくとも２つの置換を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のバリアント。
  6. Ｓ３４Ｈ；Ｓ３４Ｙ；Ｓ３４Ｋ；Ｓ３４Ｒ；
    Ｌ３７Ｒ；
    Ｙ１４Ｗ；
    Ｔ１８Ｋ；Ｔ１８Ｒ；
    Ｖ２１Ｅ；
    Ａ２２Ｅ；Ａ２２Ｎ；Ａ２２Ｐ；
    Ｔ２５Ｅ；
    Ｔ２７Ｉ；
    Ｑ２８Ｐ；及び
    Ｌ２９Ｐ
    からなる群から選択される少なくとも２つの置換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のバリアント。
  7. Ｓ３４Ｈ
    Ｓ３４Ｙ
    Ｓ３４Ｋ
    Ｓ３４Ｒ
    Ｙ１４Ｗ
    Ｔ１８Ｋ
    Ｌ３７Ｒ
    Ｓ３４Ｙ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｓ３４Ｈ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｓ３４Ｙ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｒ
    Ｖ２１Ｅ
    Ａ２２Ｅ
    Ａ２２Ｐ
    Ａ２２Ｎ
    Ｔ２５Ｅ
    Ｔ２７Ｉ
    Ｑ２８Ｐ
    Ｌ２９Ｐ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｙ１４Ｗ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｔ１８Ｋ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｔ１８Ｒ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｖ２１Ｅ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ａ２２Ｅ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ａ２２Ｐ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ａ２２Ｎ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｑ２８Ｐ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｌ２９Ｐ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｔ２５Ｅ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｔ２７Ｉ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｅ
    Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｎ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｒ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｖ２１Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ａ２２Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｑ１８Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｌ２９Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ２５Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ２７Ｉ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｖ２１Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｑ２８Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｌ２９Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｔ２５Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｔ２７Ｉ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｔ１８Ｋ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｖ２１Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｑ２８Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｌ２９Ｐ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｔ２５Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｔ２７Ｉ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ｖ２１Ｅ、Ａ２２Ｅ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    Ｙ１４Ｗ、Ｔ１８Ｋ、Ａ２１Ｅ、Ａ２２Ｎ、Ｓ３４Ｈ、Ｌ３７Ｒ
    からなる群から選択される置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のバリアント。
  8. グリコシドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド由来の１つ以上の触媒ドメイン及び１つ以上のリンカーをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のバリアント。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＢＭバリアントを含むセルラーゼバリアント。
  10. （ａ）グリコシドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド由来の１つ以上の触媒ドメイン；（ｂ）１つ以上のリンカー；及び（ｃ）請求項１～８のいずれか一項に記載の１つ以上の炭水化物結合モジュールバリアントを含む、グリコシドヒドロラーゼ活性を有するバリアント。
  11. 前記リンカーが、プロリンリッチリンカーである、請求項１０に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  12. 前記プロリンリッチリンカーが、
    ＴＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１２）
    ＴＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１３）
    ＴＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１４）
    ＴＴＰＴＰＴＰＴＰＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号１５）
    ＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＴＰＰＧ （配列番号１６）
    ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号１７）
    ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号１８）
    ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号１９）
    ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号２０）
    ＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＧ （配列番号２１）
    ＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＳＰＰＧ （配列番号２２）
    ＰＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号２３）
    ＳＰＳＰＧ （配列番号２４）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ （配列番号２５）
    ＴＰＴＰＴＰＴＰＴＰＧ （配列番号２６）
    ＰＰＰＰ （配列番号２７）
    ＰＰＰＰＰ （配列番号２８）
    ＰＰＰＰＰＰ （配列番号２９）
    ＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３０）
    ＰＰＰＰＰＰＰ （配列番号３１）
    ＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３２）
    ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３３）
    ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３４）
    ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３５）
    ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＧ （配列番号３６）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３７）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３８）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号３９）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４０）
    ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号４１）
    ＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号４２）
    ＰＱＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号４３）
    ＰＤＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号４４）
    ＰＲＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４５）
    ＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号４６）
    ＰＳＰＮＳＰＮＳＰＮＧ （配列番号４７）
    ＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号４８）
    ＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号４９）
    ＰＤＰＴＰＤＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号５０）
    ＰＱＰＴＰＱＰＴＰＱＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号５１）
    ＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号５２）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＰＰＧ （配列番号５３）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＤＰＧ （配列番号５４）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＫＰＧ （配列番号５５）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＡＰＧ （配列番号５６）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳＧ （配列番号５７）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ （配列番号５８）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＳ （配列番号５９）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＰ （配列番号６０）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＥ （配列番号６１）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＮ （配列番号６２）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧＧ （配列番号６３）
    ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＫ （配列番号６４）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰ （配列番号６５）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＲ （配列番号６６）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰ （配列番号６７）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＳＰＴＧ （配列番号６８）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＴＰＴＧ （配列番号６９）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＧＰＴＧ （配列番号７０）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＤＰＴＧ （配列番号７１）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＴＧ （配列番号７２）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＤ （配列番号７３）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＥ （配列番号７４）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰ （配列番号７５）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＳＰＴ （配列番号７６）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＴ （配列番号７７）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＴ （配列番号７８）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴ （配列番号７９）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＳ （配列番号８０）
    ＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＰＥＰＴＲ （配列番号８１）
    ＰＰＰＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８２）
    ＰＰＰＧＧＰＧＧＴＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８３）
    ＰＰＳＧＧＰＧＧＰＧＴＰＴＳＴＡＰＧＳＧＰＴＳＰＧＧＧＳＧ （配列番号８４）
    ＰＥＰＴＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号８５）
    ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号８６）
    ＰＥＰＴＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ （配列番号８７）
    ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号８８）
    ＰＲＰＴＰＥＰＴＰＲＰＴＧ （配列番号８９）
    ＰＫＰＴＰＥＰＴＰＫＰＴＧ （配列番号９０）
    ＰＥＰＴＰＱＰＴＧ （配列番号９１）
    ＰＥＰＴＰＱＰＴＰＥＰＴＧ （配列番号９２）
    ＴＰＰＴＰＰＧ （配列番号９３）
    ＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号９４）
    ＳＰＳＳＰＳＳＰＳＧ （配列番号９５）
    ＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号９６）
    ＴＰＴＴＰＴＴＰＴＧ （配列番号９７）
    からなる群から選択される、請求項１１に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  13. 前記リンカーが、ＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号３１）、ＰＰＰＰＰＰＰＧ（配列番号３０）、ＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰ（配列番号５８）又はＳＰＳＰＳＰＳＰＳＰＧ（配列番号２５）を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  14. Figure 2023520312000026
    Figure 2023520312000027
    Figure 2023520312000028
    Figure 2023520312000029
    Figure 2023520312000030
     からなる群から選択される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  15. プロテアーゼの存在下などで、親と比較して改善された安定性を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  16. 前記親と比較して改善された特性を有し、好ましくは、前記改善された特性が、プロテアーゼの存在下での改善された熱安定性である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント。
  17. 請求項１０～１６のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアントを含む洗剤組成物。
  18. 請求項１０～１６のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  19. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクター。
  20. 請求項１８に記載のポリヌクレオチドで形質転換される組み換え宿主細胞。
  21. グリコシドヒドロラーゼバリアントのバリアントを生成する方法であって、
    ａ．前記バリアントの発現に好適な条件下で請求項２０に記載の組み換え宿主細胞を培養すること；及び
    ｂ．前記バリアントを回収することを含む方法。
  22. 新しい織物のものに匹敵するように長期間の使用後に布地の視覚的及び手触りの特性を回復させる、汚れた布地の前処理又は織物を新品同様にする（例えば、綿毛又は毛玉の除去により）ためなど、布地又は織物ケアのための、請求項１０～１６のいずれか一項に記載のグリコシドヒドロラーゼバリアント又は請求項１７に記載の洗剤組成物の使用。
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