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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues esterolytisches Enzym,
neues genetisches Material, das für dieses Enzym codiert, sowie
daraus entwickelte esterolytische Proteine. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung eine von Aspergillus abgeleitete Esterase,
eine DNA, die für
diese codiert, Vektoren, die diese DNA umfassen, Wirtszellen, die
mit dieser DNA transformiert sind, und ein Proteinprodukt, das von
diesen Wirtszellen produziert worden ist, bereit.
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Neben
Cellulose stellt Xylan das häufigste
erneuerbare Polysaccharid in der Natur dar. Es handelt sich um die
bedeutendste Hemicellulosekomponente in Pflanzen und wird vorwiegend
in den Sekundärzellwänden von
Angiospermen und Gymnospermen gefunden. Die Zusammensetzung und
die Struktur von Xylan sind komplizierter als jene von Cellulose
und können
quantitativ und qualitativ in verschiedenen Spezies von holzigen
Pflanzen, Gräsern
und Getreide variieren. Bei Xylan handelt es sich um ein Heteropolymer,
in welchem die Bestandteile nicht nur mittels glycosidischer Bindungen,
sondern auch mittels Esterbindungen miteinander verbunden sind.
Die Ferulasäure
ist die häufigste
Hydroxyzimtsäure,
die in Pflanzen gefunden wird, und es ist bekannt, dass sie mit
Arabinose in Weizenkleie, Weizenmehl, Gerste, Mais, Zuckerrohr,
Reisstroh und weiteren Monokotyledonen verestert ist, und sie wurde
ferner in Pektinen von Zuckerrübe,
Spinat und weiteren Dikotyledonen mit Galactoseresten verestert
gefunden. p-Cumarsäure
ist ebenfalls auf ähnliche
Art und Weise in Monokotyledonen verknüpft. Es hat sich gezeigt, dass
das Vorliegen dieser Phenolsäuren
den Zellwandabbau einschränkt
und wichtige Funktionen bei der Zellwandausdehnung und Stabilisierung
durch Quervernetzung von Heteroxylanketten durch Bildung von Phenoldimeren über Pflanzenperoxidasen
und/oder Photodimerisierung, initiiert durch Sonnenlicht, hat. Ferner
konnte gezeigt werden, dass die Phenolsäuren eine Funktion als Quervernetzer
zwischen Zellwandpolysacchariden und dem Phenylpropanoid-Ligninpolymer
aufweisen. Die kovalente Bindung von Lignin an Zellwandpolysaccharide
und die Quervernetzung von Xylanketten innerhalb von Hemicellulose
schränken
die Gesamt-Polysaccharid-Bioverfügbarkeit
ein, was zu erheblichen Mengen an unverdauten Fasern in Tierfutter,
einer schlechten Bioumwandlung von landwirtschaftlichen Reststoffen
zu sinnvollen Produkten und einer unvollständigen Verarbeitung von Körnern führt.
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Die
Enzymhydrolyse von Xylan in dessen Monomere erfordert die Beteiligung
von mehreren Enzymen mit unterschiedlichen Funktionen. Diese werden
auf der Basis der Natur der Bindung, welche sie spalten, in zwei
Gruppen eingeteilt. Bei der ersten Gruppe von Enzymen handelt es
sich um Hydrolasen (EC 3.2.1), die an der Hydrolyse der glycosidischen
Bindungen von Xylan beteiligt sind. Diese umfassen Endo-Xylanasen (EC 3.2.1.8),
die das Xylan-Rückgrat
zufällig
in kürzere
Xylooligosaccharide zerlegt; β-Xylosidase
(EC 3.2.1.37), die die Xylooligosaccharide nach exo-Art spaltet,
wobei Xylose produziert wird; α-L-Arabinofuraosidase
(EC 3.2.1.55); und α-Glucuronidase (EC
3.2.1.1), die jeweils die Arabinose-und 4-O-Methylglucuronsäure-Substituenten vom
Xylan-Rückgrat
entfernt. Die zweite Gruppe umfasst Enzyme, die die Esterbindungen
hydrolysieren (Esterase, EC 3.1.1) zwischen Xylose-Einheiten des
Xylanpolymers und Acetylgruppen (Acetyl-Xylan-Esterase, EC 3.1.1.6)
oder zwischen Arabinosylgruppen und Phenolbestandteilen wie zum
Beispiel Ferulasäure (Feruloyl-Esterase) und p-Cumarsäure (Cumaroyl-Esterase).
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Faulds
et al. berichteten über
zwei Formen von Ferulasäure-Esterasen,
die aus Aspergillus niger isoliert wurden. Die unterschiedlichen
Esterasen wurden auf der Grundlage von Molekulargewicht und Substratspezifität unterschieden
(Faulds et al., Biotech. Appl. Biochem., Bd. 17, Seiten 349–359 (1993)).
Brezillon et al. offenbarten das Vorliegen von mindestens zwei Cinnamoyl-Esterasen,
von denen angenommen wurde, dass sie von den Ferulasäure-Esterasen
aus dem Stand der Technik verschieden waren (Brezillon et al., Appl. Microb.
Biotechnol., Bd. 45, Seiten 371–376
(1996)). Eine Ferulasäure-Esterase,
die als FAE-III bezeichnet wurde, wurde aus Aspergillus niger CBS
120.49 isoliert, und es konnte gezeigt werden, dass sie zusammen mit
Xylanase wirkt, um im Wesentlichen die gesamte Ferulasäure und
Xylooligosaccharide mit niedrigem Molekulargewicht in einer Weizenkleie-Präparation
zu entfernen; Ferulasäure
wurde auch ohne die Zugabe von Xylanase entfernt, wenn auch in geringerem
Ausmaß.
Faulds et al. isolierten und teilcharakterisierten ferner FAE-III
aus Aspergillus niger CBS 120.49, gewachsen auf Dinkelhaferxylan
(Faulds et al., Microbiology, Bd. 140, Seiten 779–787 (1994))
und es konnte gezeigt werden, dass diese einen pI von 3,3, ein Molekulargewicht von
36 kD (SDS-PAGE) und 14,5 kD (Gelfiltrationsmethode), ein pH-Optimum
von 5 und ein Temperatur-Optimum von 55 bis 60°C aufwies; eine mikrokristalline
Cellulose-Bindung wurde ebenfalls detektiert. Die Autoren stellten
die Theorie auf, dass es sich bei FAE-II um ein proteolytisch modifiziertes
FAE-III handeln könnte.
Vor kurzem wurden die verschiedenen bekannten Ferulasäure-Esterasen,
die von Aspergillus niger abgeleitet sind, auf der Basis ihrer verschiedenen
Substratspezifität
unterschieden werden und es wurde festgestellt, dass FAE-II und
FAE-III nicht fähig
waren, Ferulasäure
aus Zuckerrübenzellstoff
freizusetzen (Brezillon et al., supra).
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Trotz
der auf Esterasen aus Aspergillus niger gerichteten Charakterisierungsarbeit
besteht ein Bedürfnis
nach zusätzlichen
Esterasen für
verschiedene Anwendungszwecke. Ferner waren die Fachleute bisher nicht
in der Lage, eine Nukleotidsequenz zu entdecken, die verwendet werden
kann, um gentechnisch hergestellte Organismen effizienter zu produzieren,
die fähig
sind, solche Esterasen in großen
Mengen zu exprimieren, geeignet für eine industrielle Herstellung.
Es besteht jedoch ein dringender Bedarf für die Entwicklung eines Esterase-Expressionssystems über die
Gentechnik, welches die Reinigung und die Verwendung von brauchbaren
Mengen von relativ reinem Enzym ermöglicht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von
DNA, die für
Esterase-Proteine codiert.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung einer
Methode zur Isolierung von DNA aus verschiedenen Spezies, wobei
die DNA für
ein Protein codiert, das eine Esterase-Aktivität besitzt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Molekül bereit,
wie es im Anspruch 1 definiert ist. Die vorliegende Erfindung umfasst
ferner Vektoren, die die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen
umfassen, sowie Wirtszellen, die mit solcher DNA oder solchen Vektoren
transformiert worden sind. Vorzugsweise liegt die DNA gemäß der vorliegenden
Erfindung in im Wesentlichen gereinigter Form vor und wird zur Herstellung
einer transformierten Wirtszelle verwendet, die fähig ist,
das codierte Proteinprodukt davon zu produzieren.
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Das
Enzym, das durch das DNA-Molekül
gemäß der vorliegenden
Erfindung codiert wird, weist Anwendungsmöglichkeiten als Zusatz zu Tierfutter,
in einem Verfahren zur Behandlung von Stoffen, zur Verbesserung
der mechanischen Eigenschaften von Teig und Endprodukten vom Backen
von Nahrungsmitteln; bei der Modifizierung von Polysacchariden,
um neue Eigenschaften zu ergeben, z. B. Gummis; und bei der Verarbeitung
von Körnern
auf. Ferner kann das Enzym auch bei der Verarbeitung von Pflanzenmaterialien
für die Freisetzung
von freien Phenolgruppen zur Anwendung als Antioxidationsmittel,
als Fotoschutzmittel, als anti-inflammatorisches und/oder antimikrobielles
Mittel, die bei Körperpflegeprodukten
wie zum Beispiel Kosmetika verwendet werden, und als Hilfsmittel
bei der Umsetzung von chemischen Ausgangsmaterialien zu hochwertigen
Spezial-Chemikalien, Nahrungsadditiven und Aromastoffen eingesetzt
werden.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass eine DNA isoliert
worden ist, die die Fähigkeit zur
Isolierung weiterer DNAs bereitstellt, die für Proteine mit einer esterolytischen
Aktivität
codieren.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass
es auf Grund der Bereitstellung einer DNA, die für ein Protein mit einer esterolytischen
Aktivität
codiert möglich
ist, über
Rekombinationstechniken eine Wirtszelle zu produzieren, die fähig ist,
das Protein mit einer esterolytischen Aktivität in relativ großen Menge
zu produzieren.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die
kommerzielle Anwendung von Proteinen mit esterolytischer Aktivität praktisch
durchführbar
geworden ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Die 1 stellt
einen Western-Blot nach SDS-PAGE-Gel dar, der die Fragmentierung
von FAE unter Denaturierungsbedingungen zeigt.
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Die 2 zeigt
die DNA-Sequenz (SEQ. ID NR:25) mit abgeleiteten Introns und die
Aminosäuresequenz
(SEQ. IN NO:26) eines Fragments von 650 Basenpaaren, das dem Gen
entspricht, das für
eine 38 kD-Esterase codiert und welches aus Aspergillus niger isoliert
wurde.
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Die 3 zeigt
die Bande, die der 38 kD-Esterase nach Reinigung entspricht.
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Die 4 zeigt
eine Restriktions-Mappe eines DNA-Fragments, das das Gen enthält, welches
für die 38
kD-Esterase codiert.
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Die 5 zeigt die komplette DNA (SEQ. ID NR:27)
mit Hervorhebungen zur Darstellung der Signalsequenz, Intron und
verschiedenen Restriktions-Endonuclease-Stellen, und die vollständige Aminosäuresequenz
(SEQ. ID NR:28), die dem Gen entspricht, welches für die 38
kD-Esterase codiert, die aus Aspergillus niger isoliert worden ist.
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Die 6 zeigt
die DNA-Sequenz des Gens, das für
die 38 kD-Esterase codiert (SEQ. ID NR:29).
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Die 7 zeigt
ein Southern-Blot-Gel, das die Hybridisierung zwischen einer DNA-Sonde, die von der 38
kD-Esterase gemäß der vorliegenden
Erfindung abgeleitet ist, und verschiedenen anderen Fadenpilzen zeigt
("Gel 1").
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Die 8 zeigt
ein Southern-Blot-Gel, das die Hybridisierung zwischen einer DNA-Sonde, die von der 38
kD-Esterase gemäß der vorliegenden
Erfindung abgeleitet ist, und verschiedenen anderen Fadenpilzen zeigt
("Gel 2").
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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"Esterase" oder "esterolytische Aktivität" steht für ein Protein
oder Peptid, welches eine esterolytische Aktivität besitzt, zum Beispiel jene
Enzyme mit einer katalytischen Aktivität, wie sie in der Enzym-Klassifizierung
EC 3.1.1 definiert ist. Die esterolytische Aktivität kann durch
die Fähigkeit
eines Enzyms oder Peptids zur Spaltung von Esterbindungen gezeigt
werden, zum Beispiel Feruloyl-, Cumaroyl- oder Acetylxylan-Gruppen von organischen
Verbindungen, in denen diese bekanntermaßen vorliegen, z. B. primären und
sekundären Zellwänden. Vorzugsweise
umfasst die Esterase eine esterolytische Aktivität, die die Esterbindung von
Phenolestern spaltet, wie zum Beispiel von: [5-O-((E)-Feruloyl)-α-L-arabinofuranosyl]-(1->3)-O-β-D-xylopyranosyl-(1->4)-D-xylopyranose (auch als FAXX bekannt);
[5-O-((E)-Feruloyl)-α-L-arabinofuranosyl]-(1->3)-O-β-D-xylopyranose
(auch als FAX bekannt); O-β-D-Xylopyranosyl-(1->4)-O-[5-O-((E)-feruloyl)-α-arabinofuranosyl-(1->3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1->4)- D-xylopyranose (auch als FAXXX bekannt); [5-O-((E)-p-Cumaroyl)-α-L-arabinofuranosyl]-(1->3)-O-β-D-xylopyranosyl-(1->4)-D-xylopyranose (auch
als PAXX bekannt); [5-O-((E)-p-Cumaroyl)-α-L-arabinofuranosyl]-(1->3)-O-β-D-xylopyranose
(auch als PAX bekannt); O-β-D-Xylopyranosyl-(1->4)-O-[5-O-((E)-p-cumaroyl)-α-arabinofuranosyl-(1->3)]-O-β-D-xylopyranosyl-(1->4)-D-xylopyranose (auch
als PAXXX bekannt) und weiteren Ester-gebundenen Phenololigosacchariden,
die im Stand der Technik bekannt sind. Diese Esterasen werden im
Allgemeinen als Ferulasäure-Esterase (ferulic
acid esterase – FAE)
oder als Enzyme mit einer Feruloyl-Esterase-Aktivität bezeichnet. Es ist überraschend
entdeckt worden, dass eine Esterase mit einer Ferulasäure-Esterase-Aktivität, die aus
Aspergillus niger gereinigt werden kann, wie in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
beschrieben, und die eine Aminosäuresequenz
besitzt, wie sie in der 5 dargestellt
ist, zusätzlich
eine Aktivität
gegenüber
Zuckerrübenzellmaterial
und auch eine proteolytische und lipolytische Aktivität besitzt.
Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung codiert die DNA folglich für eine Esterase,
die eine lipolytische und/oder proteolytische Aktivität besitzt.
Folglich besitzt die Esterase mit einer messbaren, signifikanten
esterolytischen Aktivität
für Feruloyl-
und Cumaroylester auch eine proteolytische und lipolytische Aktivität.
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Vorzugsweise
stammt die DNA, die für
die Esterase codiert, von einem Pilz ab, noch bevorzugter von einem
anaeroben Pilz, und am bevorzugtesten von Aspergillus spp., z. B.
Aspergillus niger. Es ist vorgesehen, dass die Esterase oder die
DNA, die für
die Esterase gemäß der vorliegenden
Erfindung codiert, von den folgenden abstammen kann: Absidia spp.;
Acremonium spp.; Actinomycetes spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.;
Aspergillus spp. einschließlich
A. auculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus,
A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus und A.
versicolor; Aeurobasidium spp.; Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.;
Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp. einschließlich F.
conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F. lini, F. oxysporum
und F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp. einschließlich H.
insolens und H. lanuginosa; Mucor spp.; Neurospora spp. einschließlich N.
crassa und N. sitophila; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.;
Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Piromyces spp.;
Pseudomonas spp.; Rhizopus spp.; Schizophyllum spp.; Streptomyces
spp.; Trametes spp.; und Trichoderma spp. einschließlich T.
reesei, T. longibrachiatum und T. viride; und Zygorhynchus spp. Ähnlich wird
davon ausgegangen, dass eine Esterase und/oder eine DNA, die für eine wie
in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Esterase codiert,
in Bakterien wie zum Beispiel Streptomyces spp. einschließlich S.
olivochromogenes, insbesondere in Faser-abbauenden Pansenbakterien
wie zum Beispiel Fibrobacter succinogenes, und in Hefen einschließlich Candida
torresii; C. parapsilosis; C. sake; C. zeylanoides; Pichia minula;
Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa; und Sporobolomyces holsaticus
gefunden werden kann.
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Die
Esterase kann in einer gereinigten Form vorliegen, d.h. in einer
besonderen Zubereitung in einer höheren oder niedrigeren Konzentration
vorliegen, als jene Konzentration, die in einem natürlich vorkommenden
oder Wildtyp-Organismus auftritt, oder zusammen mit Komponenten
vorliegen, die normalerweise bei der Expression aus einem natürlich vorkommenden
oder Wildtyp-Organismus nicht vorkommen.
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Unter "Expressionsvektor" versteht man ein
DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die an eine geeignete Kontrollsequenz,
die fähig
ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt durchzuführen, funktionsfähig verknüpft ist.
Solche Kontrollsequenzen können
einen Promotor zur Durchführung
der Transkription, eine optionale Operatorsequenz zur Kontrolle
der Transkription, eine Sequenz, die für geeignete Ribosomen-Bindungsstellen
auf der mRNA codiert, und Sequenzen, die die Termination der Transkription
und Translation kontrollieren, umfassen. Verschiedene Zelltypen
werden bevorzugt mit verschiedenen Expressionsvektoren eingesetzt.
Ein bevorzugter Promotor für
Vektoren, die in Bacillus subtilis eingesetzt werden, ist der AprE-Promotor,
ein bevorzugter Promotor, der in E. coli verwendet wird, ist das
Lac-Promotor und
ein bevorzugter Promotor, der in Aspergillus niger verwendet wird,
ist glaA. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Phagenteilchen
oder einfach um ein potentielles genomisches Insert handeln. Nach
Transformation in einen geeigneten Wirt kann der Vektor replizieren
und unabhängig
vom Wirts-Genom funktionieren, oder kann unter geeigneten Bedingungen
in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung
werden die Bezeichnungen Plasmid und Vektor zum Teil abwechselnd
verwendet. Es ist jedoch beabsichtigt, dass die Erfindung weitere
Formen von Expressionsvektoren umfasst, die äquivalenten Funktionen dienen
und die im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden. Folglich
können
eine breite Vielfalt von Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen bei
der Expression der DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Geeignete Expressionsvektoren können beispielsweise
aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen
DNA-Sequenzen wie z. B. verschiedenen bekannten Derivaten von SV40
und bekannten bakteriellen Plasmiden, z. B. Plasmide aus E. coli
einschließlich
col E1,pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 und deren Derivate, Plasmiden
mit einer breiteren Wirtsvariationsbreite, z. B. RP4, Phagen-DNAs,
z. B. die zahlreichen Derivate von Phage λ, z. B. NM989, und weiteren
DNA-Phagen, z. B. M13 und fadenförmige
Einzelstrang-DNA-Phagen, (Hefeplesmiden wie z. B. den 2μ-Plasmid) oder Derivate
davon, Vektoren, die in eukaryotischen Zellen verwendet werden können, wie
zum Beispiel Vektoren, die in Tierzellen brauchbar sind, und Vektoren,
die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind,
wie zum Beispiel Plasmide, die modifiziert worden sind, um Phagen-DNA
oder weitere Expressionskontrolllsequenzen zu verwenden, bestehen.
Die Expressionstechniken, die die Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwenden, sind im Stand der Technik bekannt und sind
allgemein beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press (1989)
beschrieben. Häufig
werden solche Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden
Erfindung enthalten, durch direkte Insertion in das Genom einer
besonderen Spezies über
einen Integrationsvorgang in einen einzelligen Wirt transformiert
(siehe z. B. Bennett & Lasure,
More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, Seiten
70–76
(1991) und darin zitierte Artikel, die die angestrebte genomische
Insertion in Pilzwirte beschreiben, die durch Inbezugnahme in die
vorliegende Anmeldung aufgenommen werden).
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Ein "Wirtsstamm" oder eine "Wirtszelle" steht für einen
geeigneten Wirt für
einen Expressionsvektor, der die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung
umfasst. Wirtszellen, die für
die vorliegende Erfindung brauchbar sind, sind im Allgemeinen prokaryotische
oder eukaryotische Wirte, einschließlich aller transformierbarer Mikroorganismen,
in denen eine Expression erzielt werden kann. Insbesondere kann
es sich bei den Wirtsstämmen
um Bacillus subtilis, Escherichia coli Trichoderma longibrachiatum,
Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger handeln, und bevorzugt
um Aspergillus niger. Die Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert
oder transfiziert, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken
hergestellt wurden. Solche transformierten Wirtszellen sind fähig, sowohl
die Vektoren, die für
eine Esterase codieren, als auch deren Varianten (Mutanten) zu replizieren
oder das gewünschte
Peptidprodukt zu exprimieren.
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Unter "Derivat" versteht man ein
Protein, das von einem Vorläuferprotein
(z. B. dem nativen Protein) durch Addition von einer oder mehreren
Aminosäuren
entweder am C- oder N-terminalen Ende oder an beiden, Substitution
von einer oder mehreren Aminosäuren
an einer oder einer Anzahl von verschiedenen Stellen in der Aminosäuresequenz,
Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an entweder einem oder
beiden Enden des Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in
der Aminosäuresequenz,
oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren
Stellen in der Aminosäuresequenz
abgeleitet ist. Die Herstellung von einem Enzymderivat wird vorzugsweise
durch Modifizieren einer DNA-Sequenz, die für das native Protein codiert,
Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt, und
Expression der modifizierten DNA-Sequenz zur Bildung des Derivatenzyms
hergestellt. Derivate umfassen Peptide, welche veränderte Aminosäuresequenzen
im Vergleich mit einer Vorläuferenzym-Aminosäure-Sequenz
(z. B. ein Wildtyp-Enzym oder ein Enzym in nativem Zustand) enthalten,
wobei die Peptide eine charakteristische Enzymeigenschaft des Vorläuferenzyms
beibehalten, jedoch in gewissen spezifischen Aspekten veränderte Eigenschaften
aufweisen. Ein "Derivat" im Umfang dieser
Definition wird im Allgemeinen die charakteristische esterolytische
Aktivität
beibehal ten, die in der nativen Form oder der Vorläuferform
beobachtet wird, in einem Ausmaß,
dass das Derivat für ähnliche
Verwendungszwecke wie die native Form oder die Vorläuferform
geeignet ist. Es ist jedoch ferner vorgesehen, dass solche Derivate
eine veränderte
Substratspezifität
aufweisen können,
zum Beispiel eine höhere
oder geringere Affinität
für ein
spezifisches Substrat wie zum Beispiel Feruloyl-, Cinnamoyl- oder Cumaroyl-Gruppen,
oder eine modifizierte pH-, Temperaturstabilität oder oxidative Stabilität. Das Derivat
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ferner über
eine chemische Modifikation des Vorläuferenzyms zur Veränderung
von dessen Eigenschaften hergestellt werden.
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In
der vorliegenden Beschreibung wird eine Hybridisierung verwendet,
um zu analysieren, ob ein gegebenes Fragment oder Gen der in der
vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen beschriebenen Esterase
entspricht, und somit in den Umfang der vorliegenden Erfindung fällt. Der
Hybridisierungs-Assay ist im Wesentlichen wie folgt: Genomische
DNA aus einer besonderen Zielquelle wird durch Verdauung mit einem Restriktions-Enzym
bzw. Restriktions-Enzymen, z. B. EcoR I, Hind III, PinA I, Miu I,
SpeI, Bgl II, Ppu10 I, Mfe I, Nco I, Bin I, Eag I und Xma I (erhältlich bei
New England Biolabs, Inc., Beverly, MA und Boehringer Mannheim)
in Übereinstimmung
mit den Herstelleranweisungen fragmentiert. Die Proben werden anschließend durch
ein Agarose-Gel elektrophoretisch behandelt (wie zum Beispiel 0,7
% Agarose), so dass die Auftrennung von DNA-Fragmenten größenmäßig sichtbar
wird. Das Gel kann kurz in destilliertem H2O
gespült
werden und anschließend
in einer geeigneten Lösung
(wie zum Beispiel 0,25M HCl) mit leichtem Schütteln für 30 Minuten depuriniert werden,
gefolgt von einer Denaturierung für 30 Minuten (in zum Beispiel
0,4 M NaOH) unter leichtem Schütteln.
Die DNA sollte anschließend
auf eine geeignete positiv geladene Membran transferiert werden, zum
Beispiel die Membran Maximum Strength Nytran Plus (Schleicher & Schuell, Keene,
N.H.), unter Verwendung einer Transferlösung (wie zum Beispiel 0,4
M NaOH). Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, im Allgemeinen
nach etwa 2 Stunden oder mehr, wird die Membran gespült und bei
Raumtemperatur luftgetrocknet nach Verwendung einer Spüllösung (wie
zum Beispiel 2X SSC [2X SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]).
Die Membran sollte anschließend
prähybridisiert
werden (für
etwa 2 Stunden oder mehr) in einer geeigneten Prähybridisierungslösung (wie
zum Beispiel einer wässrigen
Lösung,
enthalten pro 100 ml: 20 bis 50 ml Formamid, 25 ml 20X SSPE (1X
SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7,7), 2,5 ml 20 % SDS, 1 ml 10 mg/ml
geschleuderter Heringsperma-DNA (sheared hering sperm DNA) und 21,5
ml destilliertes H2O. Wie dem Fachmann bekannt,
kann die Menge an Formamid in der Prähybridisierungslösung in
Abhängigkeit
der Art der erhaltenen Reaktion gemäß Routinemethoden variiert
werden. So kann eine niedrigere Menge an Formamid zu einem kompletteren
Gel im Hinblick auf die Identifizierung von hybridisierenden Molekülen führen als
das gleiche Verfahren unter Verwendung einer größeren Menge an Formamid. Andererseits
kann eine stärkere
Hybridisierungsbande durch Verwendung von mehr Formamid leichter
visuell identifiziert werden.
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Die
DNA-Sonde (DNA probe), die von der Sequenz in den 5 oder 6 abgeleitet
ist, sollte mittels Elektrophorese in 1 % Agarose isoliert, das
Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und aus der ausgeschnittenen
Agarose zurückgewonnen
werden. Dieses gereinigte Fragment von DNA wird dann statistisch
Prime-32P-markiert (unter Verwendung von
zum Beispiel dem Markierungssystem Megaprime in Übereinstimmung mit den Herstelleranweisungen
(Amersham International plc, Buckinghamshire, England)). Die markierte Sonde
wird anschließend
durch Erwärmen
auf 95°C
für 5 Minuten
denaturiert und unmittelbar zu der vorstehend beschriebenen Prähybridisierungslösung gegeben,
die die Membran enthält.
Die Hybridisierungsreaktion sollte für einen geeigneten Zeitraum
und unter geeigneten Bedingungen vorgenommen werden, zum Beispiel für 18 Stunden
bei 37°C
mit leichtem Schütteln.
Die Membran wird gespült
(zum Beispiel in 2X SSC/0,3 % SDS) und anschließend mit einer geeigneten Waschlösung und
unter leichtem Schütteln
gewaschen. Die geforderte Stringenz ist eine Abbildung der Bedingungen,
unter denen die Membran (Filter) gewaschen wird.
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Genauer
gesagt hängt
die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d.h. der Grad der Homologie,
die für eine
erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) von den Waschbedingungen
ab, denen der Filter aus dem Southern-Blot nach der Hybridisierung
un terworfen wird. "Niedrig-stringente" Bedingungen (low-stringency), wie
sie in der vorliegenden Beschreibung definiert werden, umfassen
das Waschen eines Filters aus einem Southern-Blot mit einer Lösung von
0,2X SSC/0,1 % SDS bei 20°C
für 15
Minuten. "Standard-stringente" Bedingungen umfassen
einen weiteren Waschschritt umfassend das Waschen des Filters aus
dem Southern-Blot ein zweites Mal mit einer Lösung von 0,2X SSC/0,1 % SDS
bei 37°C
für 30
Minuten.
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Die 5 und 6 zeigen
die Aminosäuresequenz
und die DNA-Sequenz einer neuen Esterase, die von Aspergillus niger
abgeleitet ist. Die isolierte Esterase besitzt ein Molekulargewicht
von etwa 38 kD (gezeigt mittels SDS-PAGE), einen pI von etwa 2,8
(gezeigt mit IEF), ein pH-Optimum von etwa 5,1 auf Methylferulat, ein
Temperaturoptimum von etwa 55°C
und einer Aktivität
auf Cumaroyl- und Feruloyl-Ester und Zuckerrübenzellmaterial. Das FAE-Gen,
das in der 5 dargestellt ist (SEQ
ID NR:27), weist eine Länge
von ungefähr 2436
Basenpaaren auf, einschließlich
abgeleiteter Intron-Sequenz, und codiert bei Expression für die in
der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen identifizierte Esterase
aus Aspergillus niger (in der vorliegenden Beschreibung als die "38 kD-Esterase" bezeichnet). Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung steht die Bezeichnung "38 kD-Esterase" für eine Esterase,
die von Aspergillus niger abgeleitet ist, welche der in der vorliegenden
Beschreibung spezifisch als Beispiel angegebenen Esterase entspricht.
Die DNA, die in den 5 oder 6 bereitgestellt
ist, ist geeignet zum Erhalten von homologen Fragmenten von DNA
aus anderen Spezies, und insbesondere aus anaeroben Pilzen, welche
für ein
Enzym mit einer esterolytischen Aktivität codiert.
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Die
DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
exprimiert werden, indem sie an eine Expressionskontrollsequenz
in einem geeigneten Expressionsvektor funktionstüchtig verknüpft werden und in diesem Expressionsvektor
verwendet werden, um einen geeigneten mikrobiellen Wirt nach im
Stand der Technik wohlbekannten Techniken zu transformieren. Die
Polypeptide, die bei der Expression der DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung
produziert werden, können
aus der Fermentation von Tierzellkulturen isoliert und auf eine
Vielzahl von Arten nach im Stand der Technik wohlbekannten Techniken
gereinigt werden. Der Fachmann ist in der Lage, die geeignetesten
Isolier- und Reinigungstechniken auszuwählen.
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Die
isolierte Esterase gemäß der vorliegenden
Erfindung ist für
Anwendungen geeignet, in denen es gewünscht wird, Phenolbestandteile
von Xylan-Oligosacchariden zu entfernen. Zum Beispiel können die
Esterasen verwendet werden, um Tiernahrung und gegebenenfalls humane
Ernährung
zu verbessern, da die Verdaubarkeit von Futterzellwänden von
dem Phenolgehalt des Futters abzuhängen scheint. Ferner könnten die
Esterasen in der Zellstoff- und Papierindustrie eingesetzt werden,
da die Hydrolyse von Phenolester-gebundenen Bestandteilen von Lignin
zur Solubilisierung des Lignins beitragen kann und ferner auch zur
Hydrolyse von Lignin/Hemicellulose-Bindungen beitragen kann. Die Esterasen
können
bei der Synthese von Kohlehydratderivaten und bei der Bioumwandlung
von landwirtschaftlichen Rückständen zu
fermentierbaren Zuckern und freier Phenolsäure von Nutzen sein, die als
ein Antioxidationsmittel, Photoschutzmittel und/oder antimikrobielles
Mittel in Nahrungsmitteln und Körperpflegeprodukten
brauchbar ist; und als Ausgangsmaterial für eine Umsetzung zu Aromastoffen
(zum Beispiel Vanillin), Biopolymeren, und hochwertigen Chemikalien. Esterasen
sind auch mit der Nachbearbeitung von Textilfasern in Zusammenhang
gebracht worden (siehe z. B. PCT-Anmeldung Nr. 96/16136). Die Aktivität von Esterasen
für mehrere
Substrate, die in vielen Schmutzflecken auftreten, ihre Aktivierung
durch oberflächenaktive
Mittel und die Spezifität
für Phenole
legt nahe, dass die Esterasen auch in Waschmitteln von Wert sein
können.
Die Verfügbarkeit
von relativ großen
Mengen an Esterase, die durch die vorliegende Erfindung ermöglicht wird,
wird die Entwicklung von zusätzlichen
nützlichen
Anwendungszwecken eröffnen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden in den beiliegenden Beispielen
erläutert,
die zum Zwecke der Darstellung bereitgestellt werden und nicht als
Beschränkung
der Erfindung anzusehen sind.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Reinigung
und Isolierung von Peptiden umfassend Ferulasäure-Esterase-Aktivität und Design
von degenerierten DNA-Fragmenten für PCR
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Eine
Fermentationsbrühe
aus Aspergillus niger wurde filtriert (0,8 μm) und 10 ml wurden in ein Zentrifugenröhrchen (50
ml) bei Raumtemperatur überführt. Es
wurde gesättigtes
(NH4)2SO4 zugegeben, um eine Endkonzentration von
60 % zu ergeben.
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Die
Lösung
wurde gemischt und für
ungefähr
1 Stunde bei 4°C
gelagert, und anschließend
bei 1500 × g
für 20
Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt und das Pellet wurde in destilliertem Wasser re-suspendiert.
Vier wie vorstehend hergestellte Röhrchen wurden vereinigt und
auf ungefähr
200 ml mit Ammoniumsulfat (2 M) verdünnt, um eine Endkonzentration
von 1,2 M Ammoniumsulfat zu ergeben, der pH wurde auf einen pH 7,4
durch Zugabe von Tris-HCl (200 mM) eingestellt.
-
Die
Enzymprobe wurde mittels einer hydrophoben Chromatographie chromatographiert
(Poros(R)HPEM Phenylether, Perseptive BioSystems,
Perfusionschromatographie, 12 × 30
cm). Die Säule
wurde an eine BioCad(R) Perfusionschromatographie-Arbeitsstation
(Perseptive BioSystems) angeschlossen und mit 5 Säulenvolumen
Tris-HCl (50 mM, pH 7,4) plus 1,2 M Ammoniumsulfat äquilibriert.
Die Probe (205 ml) wurde auf die Säule aufgetragen und mit einer
Durchflussgeschwindigkeit von 30 ml/min mit einem linearen Gradienten
von 1,2 M zu 200 mM Ammoniumsulfat über 20 Säulenvolumen aufgetrennt. Es
wurden Fraktionen (15 ml) während
der Gradientenphase der Trennung gesammelt und im Hinblick auf die
FAE-Aktivität
mit Methylferulat nach dem Verfahren von Faulds und Williamson untersucht
(1994, Microbiology 140: 779–787).
Vier Fraktionen, die bei 750 mM Ammoniumsulfat eluierten, enthielten
83 % der anfänglichen
FAE-Aktivität.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt (60 ml), mittels Ultrafiltration
in den Startpuffer für
den nächsten
chromatographischen Schritt dialysiert (10 kDa Membran, 20 l von
25 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0). Die Probe wurde in Vorbereitung
auf die Ionenaustauschchromatographie auf 10 ml konzentriert.
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Die
Ionenaustauschchromatographie wurde unter Verwendung eines starken
Anionenaustauschers MonoQ durchgeführt (MonoQ(R),
HR 10/10, Pharmacia Biotechnology), angeschlossen an eine BioCAD-Perfusionschromatographie-Arbeitsstation
und äquilibriert
mit 25 mM Natriumacetat (pH 5,0). Die Probe (10 ml) wurde auf die
Säule aufgetragen
und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min mit einem linearen NaCl-Gradienten
(0 – 500
mM) über
15 Säulenvolumen
eluiert. Es wurden Fraktionen (5 ml) während dem Gradienten gesammelt
und auf die FAE-Aktivität
untersucht (Aktivität
gegen Feruloylester). Die FAE-Aktivität eluierte als ein einzelner
Peak bei 155 mM NaCl und wurde in einer Fraktion gesammelt. Die
Probe wurde auf 1,5 ml konzentriert (Centricon, 10 kDa).
-
Eine
Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie
(high performance size exclusion chromatography, HPSEC) wurde unter
Verwendung von zwei Superdex 75-Säulen (10/30
HR, Pharmacia Biotechnology), in Tandem angeschlossen, auf einer
BioCad-Perfusionschromatographie-Arbeitsstation durchgeführt. Die Säulen wurden
mit 10 Säulenvolumen
Natriumacetatpuffer (25 mM, pH 5,0), enthaltend 125 mM NaCl und
0,01 % Triton X-100, äquilibriert.
Die Säulen
wurden unter Verwendung von Proteinstandards mit einem bekannten Molekulargewicht
für die
Bestimmung kalibriert (Bio-RAD-Gelfiltrationsstandards, und Sigma-Gelfiltrationsstandards).
Es wurden Proben (500 μl)
aufgetragen und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 750 μl/min getrennt.
Die Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt. Die FAE-Aktivität eluierte
als ein einziger Peak, der einer Molekularmasse von etwa 32 kDa
entsprach.
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Bei
einem nativen PAGE einer entsalzten aktiven Fraktion aus der HPSEC
wurde eine einzige Proteinbande beobachtet. Der isoelektrische Punkt
der FAE wurde unter Verwendung von Phast Gel Dry IEF bestimmt, äquilibriert
mit einem Lösungsampholyten
(20 % Endkonzentration, enthaltend eine Mischung von pI 2 – 4, 80
%, pI 3 – 10
20 %) Glycerol (10 %) für
1 Stunde. Die Auftrennung wurde in Übereinstimmung mit den Herstelleranweisungen
durchgeführt
(Pharmacia Biotechnology, Dry IEF-Anleitung) und mit Coomassie R-250 gefärbt. Die
Probe wanderte als eine einzige Proteinbande mit einem isoelektrischen
Punkt von etwa 2,8.
-
Western-Blots
der HPSEC FAE-Probe wurden unter Verwendung von PVDF-Membranen (0,2 μm Porengröße) durchgeführt, mit
einem Novex-Minigel-Apparat zum Erhalten der N-terminalen Aminosäuresequenz
nach vom Hersteller empfohlenen Methoden. Eine Probe der FAE dialysierte
in den Puffer (5 mM MES pH 5,8).
-
Das
resultierende gereinigte Protein wurde in eine wässrige Lösung für eine Peptidsequenzanalyse nach
Standardmethoden eingeführt.
Kurz gesagt, wurden die Peptide in Lösung mit den folgenden Proteasen (sequencing
grade) verdaut:
Lys-C – 200 μl Reaktionspuffer,
umfassend 100 mM Ammoniumbicarbonat und 2–4 μg Enzym, pH 8,0, über Nacht
bei 37°C;
Arg-C – 200 μl Reaktionspuffer,
umfassend 20 mM Tris und 4 μg
Enzym, pH 7,5 + 1,5 mM CaCl2 + 2 mM DTT über Nacht
bei 37°C;
Glu-C – Verdaupuffer
für on-Blot-Verdauungen
war 50 mM Ammoniumbicarbonat mit 4 μg Enzym, 10 % Acetonitril und
1 % reduziertes Triton X-100;
CNBr-Spaltung – wurde
durchgeführt
durch Lösen
der Enzymprobe in 200 μl
70 %iger Ameisensäure
in Wasser und die CNBr-Kristalle wurden in ausreichender Menge zugegeben,
um eine Methioninspaltung zu ergeben.
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Die
verdauten Peptide wurden anschließend auf ungefähr 100 μl konzentriert
und direkt auf eine Umkehrphasen-HPLC aufgetragen (Phenomenex Primesphere
C18-Säule, 250 × 2,0 mm).
Die Umkehrphasenauftrennungen wurden unter Verwendung eines Applied
Biosystems 140A-Lösungstransportsystems
durchgeführt.
Die verwendeten Puffer waren 0,1 % TFA in Wasser (A), 70 % Acetonitril
in Wasser + 0,070 % TFA (B); Durchflussgeschwindigkeit betrug 150 μl pro Minute
mit einem Gradienten wie folgt: 0 Minuten – 5 % Puffer B, 10 Minuten – 10 % Puffer
B, 80 Minuten – 80
% Puffer B, 85 Minuten – 100
% Puffer B, 90 Minuten – 100
% Puffer B.
-
Die
CNBr-Verdauungen wurden wie folgt behandelt: Wasser wird zu der
Lösung
zugegeben und das gesamte Volumen wird in einem Geschwindigkeits-Vac
auf 100 μl
konzentriert. Weiteres Wasser wird auf ungefähr 1 ml zugegeben und dieses
wird wiederum auf etwa 100 μl
eingetrocknet. Dies entfernt den größten Teil von Ameisensäure/CNBr.
-
Verschiedene
wie vorstehend beschrieben erhaltene Peptidfragmente wurden analysiert,
um deren Struktur zu bestimmen, und für eine nachfolgende Entwicklung
von degenerierten Sonden zur Anwendung beim Klonen des Gens, das
für die
38 kD-Esterase codiert,
aus dem Genom des Donororganismus. Die Peptidsequenzanalyse der
38 kD-Esterase war schwierig, da Zyklen gemischte Signale enthielten,
die das Vorliegen von mehreren Polypeptiden in der analysierten
Probe anzeigten. Die Proteinsequenzierung führte zu einer N-terminalen
Sequenz und verschiedenen zusätzlichen
Peptidfragmenten, wie folgt:
| ASTQGISEDLYSRLVEMA
TISQAAYXDLLINIP | (SEQ.
ID NO:1) |
| XTVGFGPY | (SEQ.
ID NO:2) |
| FGLHLXQXM | (SEQ.
ID NO:3) |
| XISEDLYS | (SEQ.
ID NO:4) |
| YIGWSFYNA | (SEQ.
ID NO:5) |
| GISEDLYXXQ | (SEQ.
ID NO:6) |
| XISESLYXXR | (SEQ.
ID NO:7) |
| GISEDLY | (SEQ.
ID NO:8) |
| LEPPYTG | (SEQ.
ID NO:9) |
| XANDGIPNLPPVEQ | (SEQ.
ID NO:10) |
| YPDYALYK | (SEQ.
ID NO:11) |
-
Aus
diesen Fragmenten wurden geeignete degenerierte Sonden für die Hybridisierung
und zur Verwendung als PCR-Primer produziert, und es wurden Fragmente
erhalten, von denen angenommen wird, dass sie von dem Gen abgeleitet
sind, welches für
die 38 kD-Esterase codiert. Jedoch zeigte die Sequenzierung der auf
diese Art und Weise erhaltenen Fragmente (550 und 100 Basenpaare),
dass es sich bei den Fragmenten im Wesentlichen um Artefakte der
PCR handelte und dass diese nicht zum Klonen der 38 kD-Esterase
geeignet waren. Eine zusätzliche
Analyse von 2 unterschiedlichen Sonden, die von 2 Proteinsequenzen
abstammten, welche wie vorstehend beschrieben isoliert worden waren,
führte
zu einem ähnlichen
Misserfolg. Aus diesen Ergebnissen wurde bestimmt, dass eine routinemäßige Proteinreinigung
und übliche
Peptidsequenzverfahren nicht ausreichten, um geeignete Peptidfragmente
für die
Herstellung von degenerierten DNA-Sonden zu ergeben.
-
Die
vorliegenden Erfinder stellten die Hypothese auf, dass eine spezifische
Eigenschaft des Proteins oder der gereinigten Proteinzusammensetzung
verhinderte, dass ein gereinigtes repräsentatives Protein erhalten
wurde. Um diese Theorie zu überprüfen, wurde
das wie vorstehend erhaltene Produktprotein mit Hilfe eines isoelektrischen
Fokussierungsgel bei pH 2 – 4
unter verschiedenen Bedingungen analysiert. Wie in der 3 dargestellt,
scheinen die Proteinproben, die den Reinigungsschritten entlang
der vorstehend beschriebenen Reinigungsmethode entnommen wurden,
eine einzige Bande von hochgereinigtem Protein darzustellen. Es
wurde eine zweite Analyse durchgeführt, in der das gereinigte
Protein Denaturierungsbedingungen auf einem SDS-PAGE unterworfen
wurde, und die Ergebnisse wurden einem Western-Blot unterworfen.
Wie in der 1 dargestellt, zeigte das resultierende
Protein eine Reihe von Banden, was entweder auf einige Degenerierung
des Proteins oder auf andere Verbindungen, die während dem IEF-Gel versteckt
sind, hindeutet. Die Sequenzierung von jeder der zahlreichen Banden
zeigte, dass jede eine identische N-terminale Sequenz besaß und dass
die Proteolyse anscheinend ausgehend vom Carboxy-Terminus stattfand.
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Aus
den Daten stellten die Erfinder in der vorliegenden Beschreibung
die Hypothese auf, dass zahlreiche Fragmente aufgrund eines Carboxy-terminalen
proteolytischen Clippings innerhalb des Moleküls selbst beim Entfalten des
Proteins in reduziertem SDS-Puffer auftreten könnten. Die Entfaltung der 38
kD-Esterase könnte
bis dahin im Inneren gelegene hydrophobe Reste exponieren, z. B.
Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin, wodurch ein strukturell ähnliches
Substrat zur Ester-gebundenen Feruloylgruppe bereitgestellt wird,
welche in der aktiven Stelle der 38 kD-Esterase erkannt werden würde, wodurch
die Hydrolyse des Peptids ermöglicht
würde.
Aufgrund der Tatsache, dass die bisher beobachtete enzymatische
Wirkung des isolierten Proteins esterolytisch und nicht proteolytisch
war, war dieses Ergebnis in keinster Weise vorhersehbar. Auf jeden Fall
stellten die vorliegenden Erfinder die Hypothese auf, dass wenn
Protein-Denaturierungsbedingungen vermieden werden (d.h. die Entfaltung
der Peptidkette), ein internes Clipping vermieden werden könnte. Um
dies auszuführen,
wurde das gereinigte Protein aus dem Anionenaustausch-Chromatographieschritt
weiter chromatographiert, wobei eine Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie
verwendet wurde (HPSEC, wie vorstehend ausführlich beschrieben).
-
Die
HPSEC-gereinigte 38 kD-Esterase wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt
und ein Western-Blot auf einer PVDF-Membran wurde zum Sequenzieren "on-Blot" durchgeführt. Die
Verdauprodukte direkt aus den Blots wurden wie folgt hergestellt:
reine TFA wurde zu der Blot-enthaltenden Lösung zugegeben, um ein Endvolumen
zu ergeben, das 50 % TFA enthielt. Diese Lösung wird anschließend für 5 Minuten
Ultraschall-behandelt. Die Flüssigkeit
(jedoch nicht die Blot-Teile) wird entfernt und eine Lösung von
50 % Acetonitril in 0,1 % TFA wird zugegeben. Die Probe wird erneut
für 5 Minuten
Ultraschall-behandelt. Die Flüssigkeit
wurde entfernt und durch eine finale Waschlösung aus 0,1 % TFA in Wasser
und eine finale 5-minütige
Ultraschallbehandlung ersetzt. Alle Waschlösungen wurden gesammelt und
auf etwa 100 μl
konzentriert. Diese Methode ermöglicht es,
die Polypeptide, die aus den enzymatischen Verdauungen stammen,
ohne weitere Proteolyse mittels der 38 kD-Esterase, die auf der
Membran immobilisiert ist, zu sammeln. Da die 38 kD-Esterase auf dem
PVDF immobilisiert ist, wodurch das Carboxy-terminate proteolytische
Clipping und das Vorliegen von gemischten Aminosäuresignalen während jedem
Sequenzzyklus vermieden werden, konnten auf diese Art und Weise
einzelne Polypeptide erhalten werden, die für eine Sequenzanalyse geeignet
sind.
-
Unter
Befolgung dieses Verfahrens wurden eine Reihe von Fragmenten produziert,
die für
das Design von degenerierten DNA-Fragmenten brauchbar waren.
-
BEISPIEL 2
-
Isolierung eines 650 Basenpaar-Fragments,
entsprechend dem FAE-Gen
-
Auf
der Grundlage der Peptidfragmente, die im Beispiel 1 erhalten wurden,
nachdem das Problem mit dem Proteinclipping gelöst worden war, wurde das Gen,
das für
die 38 kD-Esterase codiert, durch Amplifizierung des Gens aus dessen
Genom unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und geeignet
entwickelten degenerierten Oligonukleotid-Primern geklont. Die Primer
wurden auf der Basis von partiellen Aminosäuresequenzen des fragmentierten
38 kD-Esteraseproteins designed. Die Amplifizierung von drei Fragmenten aus
dem 38 kD-Esterasegen wurde unter Verwendung der folgenden vier
Oligonukleotid-Primer erhalten (die Oligonukleotid-Primer wurden
auf der Basis der unterstrichenen Peptidsequenz im Anschluss an
die Oligonukleotid-Primer
designed). Es wurden die folgenden Abkürzungen verwendet, um die Wobbel-Positionsalternativen
zu identifizieren: I = Inosin, W = A/T, S = C/G, R = A/G, Y = T/C,
H = A/T/C, D = A/G/T, X = A/T/G/C.
Sense-Primer 11: CGGGAATTCGCIWSIACICARGGXAT
(SEQ ID. NO:12)
abgeleitet Von: ASTQGISEDLYSRLVEMATISQAAYADLLNIP
(SEQ ID. NO:13)
Sense-Primer 7: CGGGAATTCTAYTAYATHGGITGGGT
(SEQ. ID NO:14)
abgeleitet von: VHGGYYIGWVSVQDQV (SEQ. ID NO:15)
Sense-Primer
8: CGGGAATTCACCCAICCDATRTARTA (SEQ. ID NO:16)
abgeleitet von:
VHGGYYIGWVSVQDQV (SEQ. ID NO:17)
Antisense-Primer
2: CGGGAATTCTTIGGIATICCRTCRTT (SEQ. ID NO:18)
abgeleitet von:
TDAFQASSPDTTQYFRVTHANDGIPNL
(SEQ. ID NO:19)
-
Zwei
Primer ermöglichten
die Ableitung von möglichen
amplifizierten DNA-Fragmenten,
die für
die 38 kD-Esterase codieren:
Antisense-Primer 3: CGGGAATTCATICCRTCRTTIGCRTG
(SEQ. ID NO:20)
abgeleitet von: TDAFQASSPDTTQYFRVTHANDGIPNL (SEQ. ID NO:21)
Antisense-Primer
12: CGGGAATTCGCYTGRAAIGCRTCIGTCAT (SEQ. ID NO:22)
abgeleitet
von: (M)TDAFQASSPDTTQYFRVTHANDGIPNL
(SEQ. ID NO:23)
-
Es
wurde eine EcoR I-Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstelle und
eine "GC"-Klammer (clamp) am 5'-Ende von allen Primern eingeführt, um
das Klonen von amplifizierten Fragmenten in den Plasmidvektor pUC18
zu erleichtern. Die PCR-Reaktion
umfasste das Einführen
der folgenden Substanzen in "Hot Start"-Röhrchen (Molecular
BioProducts, Inc., San Diego, CA) in der aufgeführten Reihenfolge:
1 μl 500 ng/μl Sense-Primr
1 μl 500 ng/μl anti-Antisense-Primer
2 μl Nukleotid-Mix
(10 mM pro dNTP)
5 μl
10x PCR-Puffer
41 μl
destilliertes Wasser
Erwärmt
bei 95°C
für 90
Sekunden, für
5 Minuten auf Eis gelegt
5 μl
10x PCR-Puffer
43 μl
destilliertes Wasser
1 μl
Aspergillus niger genomische DNA
1 μl Taq-DNA-Polymerase (Boehringer
Mannheim, 5 U/μl)
-
Die
Amplifizierung wurde in einem Minicycler Modell PTC-150 durchgeführt (MJ
Research Inc., Watertown, Mass). Die Amplifizierungsbedingungen
folgten einem sequentiellen Schema: 95°C für 5 Minuten; 40°C für 90 Sekunden;
72°C für 3 Minuten;
und 28 Zyklen bei 94°C
für 1 Minute;
40°C für 90 Sekunden;
und 72°C für 3 Minuten
für 28
Zyklen. Ein finaler Extensions-Schritt bei 72°C für 2 Minuten wurde eingeführt.
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Die
Primer wurden für
die PCR-Amplifizierung in den folgenden gepaarten Kombinationen
verwendet: 11 – 2,
11 – 3,
11 – 8,
11 – 12,
7 – 2,
7 – 3
und 7 – 12.
Jede Primer-Kombination
produzierte multiple DNA-Banden bei der Agarose-Elektrophorese.
Die Haupt-DNA-Banden für
die PCR-Produkte der Primer-Paare 7 – 2, 7 – 3 und 7 – 12 lagen bei etwa 350, 350
und 300 Basenpaaren, sichtbar gemacht auf einem 3 % NuSieve (FMC Corp.)
Agarose-Elektrophoresegel. Die Antisense-Primer 2, 3 und 12 wurden
gegen das gleiche kontinuierliche Peptidfragment designed: (M)TDAFQASSPDTTQYFRVTHANDGIPNL
(SEQ. ID NR:24). Die Antisense-Primer 2 und 3 codieren für nahezu
den gleichen DNA-Teil, wobei ihre 3'-Enden um lediglich 6 Basen versetzt
sind. Da der Antisense-Primer 12 den Aminosäuren entspricht, die aufwärts der
Primer 2 und 3 liegen, ist das 3'-Ende
des Antisense-Primers 12 um etwa 60 Basenpaare von den Primern 2
und 3 versetzt. Folglich waren die Längen der PCR-Banden ungefähr im Einklang
mit einem kontinuierlichen Bereich von DNA, die für die 38
kD-Esterase codiert. Zusätzlich
produzierten die Primer-Paare 11 –2, 11 – 3 und 11 – 12 Banden von jeweils ungefähr 650,
650 und 600 Basenpaaren. Diese Längen
waren ungefähr
im Einklang mit der Amplifizierung eines Stücks von DNA, die für die 38
kD-Esterase codiert.
-
Die
PCR-Amplifizierungsprodukte wurden mit EcoR I verdaut, in den Klonierungsvektor
pUC18 ligiert und anschließend
in E. coli transformiert. Die geklonten PCR-Produkte wurden sequenziert. Das Sequenzieren des
Produkts der Primer 11 – 2
zeigte eine DNA-Sequenz von 650 Basenpaaren, die in der 2 dargestellt ist
(SEQ. ID NR:25), die nach Translation für 197 Aminosäuren codiert.
Eine Gesamtzahl von 155 Resten entsprach neun sequenzierten Peptidfragmenten
des 38 kD-Esteraseproteins. Es existiert ein mögliches Intron aus 57 Basenpaaren,
enthaltend Spleißsequenzen
von GTATGC an der 5'-Stelle,
eine interne Lariat-Sequenz von CACTAACT, und einen TAG an der 3'-Spleißstelle.
Ferner zeigt ein Produkt der Primer 11 – 8, wenn es sequenziert wird,
ungefähr
die ersten 314 Basen (5'-3') des 11 – 2-Fragments von 650
Basenpaaren. Ein 350 Basenpaar-Produkt der Primer 7 – 2 zeigte
DNA, die in der Sequenz der zweiten Hälfte des 11 – 2-Fragments von
650 Basenpaaren entsprach.
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BEISPIEL 3
-
Erhalten von genomischer
DNA aus Aspergillus niger zum Klonen
-
Eine
konservierte Kultur von Aspergillus niger wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agar
(PDA = Potato Dextrose Agar) bei 30°C gezüchtet. Ungefähr 2 cm2 der auf PDA gezüchteten Pilze wurden in 50
ml Hefeextrakt-Glucosemedium in einem 250 ml Kolben mit Schikane
eingeimpft und bei 33°C
in einem Drehschüttler
mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM für 24 Stunden inkubiert. Das
Mycelium wurde mittels einem Mirocloth geerntet, trocken gepresst,
unmittelbar in flüssigem
Stickstoff eingefroren und mit 1/2 Teelöffel Sand in einem Mörser mit
Stößel für ungefähr zwei
Minuten gerieben. Die genomische DNA wurde aus dem geriebenen Mycelium
extrahiert, wobei eine Modifizierung von dem Easy-DNA-Genomic Isolation-Kit
von Invitrogen angewendet wurde. Das geriebene, gefrorene Mycelium
wurde unmittelbar in ein Zentrifugenröhrchen übertragen, zu welchem 3,5 ml
der Lösung
A zugegeben wurde, gefolgt von Vortexen und einer 10-minütigen Inkubation bei
65°C. Anschließend wurden
1,5 ml der Lösung
B zugegeben, gefolgt von Vortexen. 5 ml Chloroform wur den zugegeben,
gefolgt von Vortexen, bis die Viskosität abnahm und die Mischung homogen
wurde. Die Mischung wurde bei 15 000 × G bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert.
Die obere Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und anschließend mit
2 Volumen 95 % Ethanol ausgefällt.
Die Ausfällungreaktion
wurde auf Eis für
30 Minuten inkubiert. Die Ausfällungs-DNA
wurde mittels Zentrifugieren bei 15 000 × G bei 4°C für 15 Minuten pelletisiert.
Das Ethanol wurde entfernt. Das DNA-Pellet wurde mit 25 ml 70 %
Ethanol gewaschen und die Mischung wurde bei 15 000 × G bei
4°C für 5 Minuten
zentrifugiert. Das 70 % Ethanol wurde entfernt und man ließ das Pellet
an der Luft für
5 Minuten trocknen. Die extrahierte DNA wurde in einem Volumen von
500 μl TE
suspendiert, und RNase wurde in einer Endkonzentration von 4 μg/ml zugegeben.
Diese extrahierte genomische DNA wurde in der PCR-Amplifizierung der
DNA-Fragmente, die für
die 38 kD-Esterase codieren, verwendet.
-
BEISPIEL 4
-
Verwendung des erhaltenen
650 Basenpaar-Fragments zur Isolierung von DNA, codierend für homologe
Enzyme aus Aspergillus oder anderen Spezies
-
Eine
besonders wirksame Methode zum Erhalten von Klonen homologer genomischer
DNA stellt die Konstruktion und das Screening von einer subgenomischen
Bibliothek dar. In Kürze,
und wie im Folgenden ausführlich
beschrieben, umfasst diese Methode das Schneiden der genomischen
DNA zur Vollendung (to Completion) mit geeigneten Restriktionsendonukleasen,
Durchführung
einer Southern-Hybridisierung mit dem 650 Basenpaar-Fragment als
Sonde, Ligieren der geeignet geschnittenen Fragmente in einen Plasmidvektor, Transformieren
des Plasmids in E. coli und anschließend Southern-Untersuchen der
Kolonien mit dem Fragment aus 650 Basenpaaren, um einen genomischen
Klon zu erhalten. Diese Techniken sind im Stand der Technik bekannt
und sind in "Current
Protocols in Molecular Biology",
supra, beschrieben.
-
Um
Klone eines Vektors zu erhalten, der das Gen umfasst, welches für das gesamte
38 kD-Esteraseprotein codiert, wurde genomische DNA von Aspergillus
niger wie in Beispiel 3 hergestellt. Die genomische DNA wurde mittels
Verdauung mit einer Reihe von Restriktionsenzymen fragmentiert:
EcoR I, Hind III, PinA I, Mlu I, Spe I, Bgl II, Ppu10 I, Mfe I,
Nco I, Bin I, Eag I und Xma I (erhältlich von New England Biolabs,
Inc., Beverly, MA und Boehringer Mannheim). Die Reaktionsbedingungen
mischten 3 μl
genomischer DNA, 2 μl
des geeigneten 10X Restriktions-Endonucleasepuffers (gemäß den Herstelleranweisungen),
2 μl Restriktionsenzym
(mit 10 Einheiten/μl),
13 μl destilliertes
Wasser; die Reaktion wurde bei 37°C
für 6 Stunden
durchgeführt. Die
Proben wurden anschließend
durch ein 0,7 % Agarosegel elektrophoretisch behandelt, so dass
die Auftrennung von DNA-Fragmenten zwischen einer Größe von 1
kb bis > 12 kb sichtbar
gemacht werden konnte. Das Gel wurde kurz in destilliertem H2O gespült
und anschließend
für 30
Minuten in einer Lösung
von 0,25 M HCl unter leichtem Schütteln depuriniert, gefolgt
von einer Denaturierung für
30 Minuten in einer Lösung
von 0,4 M NaOH unter leichtem Schütteln. Die DNA wurde anschließend auf
eine positiv geladene Membran Maximum Strength Nytran Plus (Schleicher
und Schuell, Keene, N.H.) unter Verwendung einer Lösung von
0,4 M NaOH als Transferlösung übertragen.
Nachdem der Transfer abgeschlossen war, > 2 Stunden, wurde die Membran in 2X SSC
gespült
und luftgetrocknet. Die Membran wurde anschließend für 8 Stunden in einer Prähybridisierungslösung prähybridisiert,
welche folgendes pro 100 ml enthielt: 50 ml Formamid, 25 ml 20X SSPE
(1X SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7,7), 2,5 ml 20 % SDS, 1 ml von 10
mg/ml gescherte Heringsperma-DNA und 21,5 ml destilliertes H2O.
-
Das
geklonte Fragment mit 650 Basenpaaren aus Beispiel 2 wurde als Hybridisierungssonde
der Membran verwendet. Das Fragment wurde aus dem pUC 18-Plasmid
mittels Restriktions-Verdau mit EcoR I, Elektrophorese in 1 % Agarose,
Ausschneiden des Fragments aus dem Gel und Rückgewinnung des Fragments aus
der ausgeschnittenen Agarose isoliert. Dieses gereinigte 650 Basenpaar-Fragment
von DNA wurde statistisch mit 32P markiert
unter Verwendung des Markierungssystems Megaprime in Übereinstimmung
mit den Herstelleranweisungen (Amersham International plc, Buckinghamshire,
England). Die markierte Sonde wurde mittels Erhitzen auf 100°C für 5 Minuten
denaturiert und unmittelbar zu der Prähybridisierungslösung zugegeben,
welche die Membran enthielt. Die Hybridisierungsreaktion lief für 18 Stunden bei
37°C unter
leichtem Schütteln
ab. Die Membran wurde in einer Lösung
von 2X SSC/0,3 % SDS gespült
und anschließend
für 15
Minuten in der gleichen Lösung
bei 37°C
unter Schütteln
gewaschen. Die Membran wurde zusätzlich
mit einer Lösung
von 0,2X SSC/0,1 % SDS bei 37°C
für 30
Minuten gewaschen. Die Membran wurde dann auf einen X-Omat AR-Film
(Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.) für 3 Stunden exponiert und entwickelt.
-
Der
aus den wie vorstehend beschrieben hergestellten Verdauprodukten
entwickelte Film zeigte lediglich eine Bande von Hybridisierung
pro Restriktions-Enzymverdau, der mit einer Hybridisierung im Einklang stand.
EcoR I-Verdau zeigte eine einzige Bande von Hybridisierung bei etwa
5,5 kb Länge.
Da dieses hybridisierte Fragment einen hervorragenden Fragmentkandidaten
darstellte, um ein Gen zu enthalten, das der gesamten 38 kD-Esterase
entspricht, auf Grund von dessen Länge, welche mit einem Gen,
das für
ein Protein dieser Größe codiert,
im Einklang ist, wurde eine Unter-Bibliothek hergestellt, wobei
EcoR I ausgewählt
wurde, um DNA aus Aspergillus niger zu verdauen, um Fragmentgrößen im Bereich
von etwa 5,5 kb Länge
zu erhalten.
-
Ein
Restriktionsverdau wurde mit genomischer DNA, die wie im Beispiel
3 hergestellt worden war, durchgeführt. Die Reaktion umfasste
50 μl genomischer
DNA, 50 μl
10X Restriktions-Endonucleasepuffer H (Boehringer Mannheim), 25 μl EcoR I
(10 Einheiten/μl,
Boehringer Mannheim), 375 μl
destilliertes Wasser. Die Reaktion lief bei 37°C für 6 Stunden ab. Die Verdauungsmischung
wurde durch 0,8 % Agarose elektrophoretisch behandelt. Die Fragmente
im Bereich von ungefähr
5 kb bis 6 kb wurden aus dem Gel in ungefähr drei gleich großen Stücken ausgeschnitten.
Die drei Pools von DNA-Fragmenten, die innerhalb der drei Gelstücke enthalten
waren, besaßen
jeweils einen leicht unterschiedlichen Bereich der Fragmentlängen. Die
DNA wurde aus den Stücken
von Agarose unter Verwendung der Säulen Q/A-Quick Gel Extraktion
in Übereinstimmung mit
den Herstelleranweisungen zurückgewonnen
(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Ungefähr 1/10 jedes Pools von zurückgewonnener
DNA wurde in 0,8 % Agarose elektrophoretisch behandelt und wie vorstehend
beschrieben an das 650 Basenpaar-Fragment Southern-hybridisiert.
Der Pool von DNA, der das stärkste
Hybridisierungssignal ergab, wurde in einen EcoR I verdauten E.
coli-Vektor ligiert (z. B. pLITMUS 28, New England Biolabs), der
anschließend
in E. coli transformiert wurde. Die E. coli-Transformanten wurden
auf 5 Platten mit einer Konzentration von ungefähr 500 Kolonien pro Platte
(150 mm Durchmesser pro Platte) ausplattiert.
-
"Kolonie-Lifts" wurden auf den Platten
unter Verwendung der Membranen Maximum Strength Nytran Pus durchgeführt. Eine
Southern-Hybridisierung wurde unter Verwendung des 650 Basenpaar-Fragments durchgeführt. Es
wurden vier starke Hybridisierungssignale erhalten. Die Kolonien,
die mutmaßlich
den vier starken Hybridisierungssignalen entsprachen, wurden gezüchtet und
ihre Plasmid-DNA wurde gewonnen. Es wurden Restriktionsverdauungen
mit der Plasmid-DNA unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die
auf der Grundlage von Stellen innerhalb des Fragments aus 650 Basenpaaren
ausgewählt
wurden, durchgeführt. Ein
Plasmid-Restriktionsverdau
ergab Restriktionsfragmente, die mit den bekannten Restriktionsstellen
innerhalb des Fragments aus 650 Basenpaaren im Einklang standen.
Beim DNA-Sequenzieren zeigte sich, dass dieser Klon die Sequenz
aus 650 Basenpaaren enthielt, welche durch die im Beispiel 2 beschriebene
PCR erhalten worden war. Eine Restiktionskartierung dieses Klons
zeigte, dass das Fragment aus 650 Basenpaaren innerhalb der ungefähr 5,5 kb
klonierten genomischen DNA-Sequenz liegt. Auf der Grundlage dieses
Verfahrens wurde DNA, die für
das gesamte Gen der 38 kD-Esterase
codierte, isoliert, wobei diese der Sequenz entsprach, die in der 5 bereitgestellt ist (SEQ. ID NR:27),
codierend für
ein Protein mit der Aminosäuresequenz
aus 5 (SEQ. ID NR:28).
-
Auch
Modifikationen dieser Methode, von denen bekannt ist, dass sie zu ähnlichen
Resultaten führen, wären ebenfalls
zum Erhalten von geeigneter DNA oder zum Klonen nützlich.
Selbstverständlich
ist diese Methode ähnlich
geeignet für
die Identifizierung und das Klonen von homologen Esterase-Enzymen
aus Spezies, die von Aspergillus niger verschieden sind. Zum Beispiel
könnte,
wie vorstehend beschrieben, eine genomische Bibliothek aus einem
geeigneten Mikroorganismus hergestellt werden, indem genomische
DNA erstellt wird und mit einer geeigneten estriktionsendo nuclease
geschnitten wird. Die Bibliothek würde anschließend einer
Southern-Blot-Hybridisierung
mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Fragment aus 650 Basenpaaren
als Sonde unterworfen werden, und geeignete Hybridisierungsfragmente
würden
in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert und in einen geeigneten
Organismus für
die Expression transformiert werden. Geeignete Techniken für solche
Verfahren sind beispielsweise im Europäischen Patent Nr. 215 594 (Genencor)
beschrieben.
-
BEISPIEL 5
-
Konstruktion
eines Expressionssystems für
FAE
-
Die
Herstellung von FAE wurde durch Konstruieren eines Expressionsvektors
und Transformieren dieses Vektors in Aspergillus erzielt. Der transformierte
Aspergillus-Stamm
wird anschließend
in geeigneten Fermentationsmedien gezüchtet. Ein FAE-Expressionsvektor
ist im Folgenden beschrieben. Die Transformation von Aspergillus
ist im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben
in "Cloning, Mapping
and molecular analysis of the pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylate) gene of Aspergillus
nidulans", B. Oakley et
al., Gene, 61 (1987), Seiten 385–399.
-
Ein
FAE-Expressionsvektor kann in verfügbaren E. coli-Plasmiden, wie
zum Beispiel pNEB193 (New England Biolabs, Beverly, MA) konstruiert
werden. Es werden drei Elemente für den Expressionsvektor benötigt. In
Kürze,
handelt es sich bei diesen Elementen um: das FAE-Gen mit dessen
abwärts
liegender Terminator-Sequenz, den A. niger-Glucoamylase-Promotor
und das A. nidulans-pyrG-Gen, das als wählbarer Marker für eine Transformation
verwendet wird. Das pyrG-Gen kann aus Aspergillus nidulans FGSC4
PCR-amplifiziert sein, erhältlich
von dem "Fungal
Genetics Stock Center, Department of Microbiology, University of
Kansas Medical Center, Kansas City, Kansas 66160–7420, USA. Die FAE-Gensequenz
ist in der 6 dargestellt. Der A. niger-Glucoamylase-Promotor
und die A. nidulans-pyrG-DNA-Sequenzen können aus der GenBank-Sequenz-Datenbank
erhalten werden. Die A. nidulans-pyrG-Sequenz ist in Oakley et al.
offenbart. Die DNA-Sequenz des A. niger-Glucoamylase-Promotors ist in "Regulation of the
glaA gene of Aspergillus niger",
Fowler et al., Current Genetics (1990), 18:537–545 beschrieben. Die Elemente
wurden in dem E. coli-Plasmid derart angeordnet, dass der Glucoamylase-Promotor
die Expression des fae1-Gens ausgehend von dem fae1-Start-Methionincodon
betreibt (von Base 519 in dem Gen fae1). Dies ermöglicht es
dem starken Glucoamylase-Promotor, die Expression des FAE-Genprodukts zu betreiben.
-
Verfahren
zur Konstruktion von DNA-Sequenzen in E. coli-Plasmiden sind im
Stand der Technik gut bekannt. Ein mögliches Verfahren zum Konstruieren
eines FAE-Expressionsvektors
in dem Vektor pNEB193 ist im Folgenden angegeben:
- (a)
PCR wird verwendet, um das A. nidulans-pyrG-Gen zu amplifizieren
und diese Sequenz wird in pNEB193 insertiert. Dies könnte mit
zwei Primern und geeigneten Bedingungen vorgenommen werden, um ein
pyrG-Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,0 kb
zu ergeben. Zum Beispiel könnte
es sich bei dem oberen Primer um den folgenden handeln:
5'-GGCCTGCAGCCCCGCAAACTACGGGTACGTCC-3' (SEQ.ID.NO:30)
und
bei dem unteren Primer könnte
es sich um den folgenden handeln:
5'-CGCGCTGCAGGCTGTTTCTGGTAATACTATGCTGG-3' (SEQ.ID.NO:31)
-
Die
Aspergillus nidulans-genomische DNA kann für eine Amplifizierung wie vorstehend
beschrieben hergestellt werden. Die Bedingungen, die zur Amplifizierung
eines 2,0 kb-Fragments benötigt
werden, sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise sind
sie in "Expand High
Fidelity PCR System" (Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN) angegeben. Nach Amplifizierung des Fragments wird
dieses isoliert und anschließend
mit dem Enzym Pst I verdaut. Auch das Plasmid pNEB193 wird mit Pst
I verdaut. Nach dem Verdau werden das Fragment und das Plasmid isoliert
und miteinander ligiert.
- (b) Eine PCR wird
verwendet, um den A. niger-Glucoamylase-Promotor zu amplifizieren
und diese Sequenz wird in das konstruierte Plasmid eingeführt. Dies
könnte
da durch erreicht werden, dass zwei Primer und Bedingungen verwendet
werden, um ein Promotor-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,9 kb
zu ergeben. Als Beispiele für
geeignete Primer könnte
es sich bei dem oberen Primer um den folgenden handeln:
5'-GGCTTAATTAACGTGCTGGTCTCGGATGTTTGGCGG-3' (SEQ.10.NO:32)
und
bei dem unteren Primer könnte
es sich um den folgenden handeln:
5'-GGGGCGCGCCAGATCTAGTACCGATGTTGAGGATGAAGCTC-3' (SEQ.ID.NO:33).
-
Auch
wenn viele verschiedene Stämme
für eine
Amplifizierung geeignet sind, handelt es sich bei einem besonders
geeigneten Stamm für
eine Amplifizierung um den A. niger-Stamm ATCC 10864 (American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland). Die A. niger-genomische
DNA für
eine Amplifizierung kann wie vorstehend beschrieben isoliert werden.
Nach der Amplifizierung wird das Fragment isoliert und mit den Enzymen
Pac II und Asc I verdaut. Das Plasmid, das vorstehend unter (a)
entwickelt worden ist, wird ebenfalls mit den Enzymen Pac II und
Asc I verdaut. Die Verdauprodukte von sowohl dem amplifizierten
Fragment als auch dem Plasmid würden
miteinander ligiert werden.
- (c) Zwei Fragmente
des FAE-Gens werden in das Plasmid, das in (b) erzeugt worden ist,
vereint, wobei ein 5,5 kb EcoR I-Fragment verwendet wurde, welches
das gesamte FAE-Gen enthielt. Das erste Fragment wird mittels PCR
erzeugt unter Verwendung der folgenden Primer zusammen mit dem 5,5
kb EcoR I-Fragment des FAE-Gens, welches vorstehend beschrieben
worden ist, als zu amplifizierendes Ausgangsmaterial:
Forward-Primer:
5'-GCCCAGATCTCCGCAATGAAGCAATTCTCCGCCAAACAC-3' (SEQ.ID.NO:34)
Reverse-Primer:
5'-AATAGTCGACGGAATGTTGCACAGG-3' (SEQ.ID.NO:35)
-
Dieses
Fragment wird mit Bgl II und Sal I verdaut, um zu einem Fragment
mit einer Länge
von etwa 169 Basenpaaren zu führen.
Das zweite Fragment wird hergestellt, indem das 5,5 kb EcoR I-Fragment
des FAE-Gens mit Sal I und EcoR I inkubiert wird, wobei das resultierende
1,75 kb-Fragment isoliert wird. Das Plasmid, das vorstehend unter
(b) erzeugt worden ist, wird für
eine Insertion des FAE-Gens hergestellt, indem es mit Bgl II und
EcoR I verdaut wird. Die drei Fragmente, das PCR-Produkt mit 169
Basenpaaren, das 1,75 kb-Fragment und das Bgl II/EcoR I-verdaute
Schritt 2-Plasmid werden miteinander ligiert. Bei dem resultierenden
Plasmid würde
es sich um einen Aspergillus-FAE-Gen-Expressionsvektor handeln.
-
Der
vorstehend erzeugte Vektor könnte
verwendet werden, um eine Transformation von Aspergillus durchzuführen.
-
BEISPIEL 6
-
Identifizierung
von homologen Genen in Fadenpilzen
-
Ein
Southern-Hybridisierungsexperiment wurde unter zuvor beschriebenen
Hybridisierungsbedingungen vorgenommen, wobei 25 % Formamid im Hybridisierungspuffer,
wie in der vorliegenden Beschreibung definiert, verwendet wurde.
Das 650 Basenpaar FAE-Gen-Fragment, das in Beispiel 2 isoliert worden
war, wurde als Sonde für
verdaute genomische DNA aus einer Reihe von Gattungen verwendet.
Es wurden Hybridisierungsbande mit genomischer DNA erhalten, welche
aus anderen Pilzen als Aspergillus niger erhalten worden war, was
auf das Vorliegen von homologen Esterase-Genen in diesen anderen
Organismen hindeutet. Auf der Basis der Hybridisierungsdaten wird
davon ausgegangen, dass die in diesem Experiment identifizierte
DNA für eng
miteinander verwandte Enzyme mit esterolytischer Aktivität codiert.
Die Gene für
diese anderen homologen Enzyme werden mittels der beschriebenen
Verfahren kloniert. Diese klonierten Gene werden anschließend in
geeigneten Wirten exprimiert, um die codierten Enzyme zu produzieren.
-
Die
genomische DNA wurde mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, Bgl II
und Ppu10 I, und anschließend
durch 0,7 % Agarose in zwei verschiedenen Gelen elektrophoretisch
behandelt. Die Größen der
genomischen DNA-Fragmente, die auf dem Agarose-Gel aufgetrennt wurden,
lagen im Bereich von etwa 1 kb bis etwa 20 kb. Die Gele wurden depuriniert
und denaturiert und auf Nytran plus Southerngeblottet. Die Membranen
wurden luftgetrocknet und mit dem 32P-markierten
650 Basenpaar-Fragment hybridisiert. Die Membranen wurden unter
Bedingungen niedriger Stringenz gewaschen, gefolgt von Waschen unter
Standard-Stringenzbedingungen. Die Membranen wurden anschließend autoradiografiert.
Die reproduzierten Gele sind in den 7 und 8 dargestellt.
-
-
-
In
den Bahnen 2, 3, 17 und 18 treten Banden auf, die dem geklonten
FAE-Gen entsprechen, das in dem vorliegenden Patent beschrieben
wird. In den Bahnen 2 und 17 Bgl II-Verdau treten Banden auf, die
auf weitere homologe FAE-Enzyme hindeuten könnten, die in dem Aspergillus
niger Stamm vorliegen. Zwei Banden treten in den Bahnen 4 und 5
auf und zwei Banden treten in der Bahn 4 auf, was auf homologe DNA
in dem Aspergillus terrus hindeutet. Eine Bande ist in der Bahn
7 sichtbar, was auf eine homologe DNA in Trichoderma reesei hindeutet.
Eine Bande ist in der Bahn 8 sichtbar, was auf eine homologe DNA
in Acremonium brachypenium hindeutet.
-
Eine
Bande ist in der Bahn 19 sichtbar, was auf homologe DNA in Gliocladium
roseum hindeutet. Zwei Banden treten in den Bahnen 25 und 26 auf,
was auf eine homologe DNA in Penicillium notatum hindeutet.
-
BEISPIEL 7
-
Biochemische Eigenschaften
und Subtratspezifität
von FAE, die gemäß Beispiel
1 gereinigt worden ist
-
Die
38 kD-Esterase, die in Übereinstimmung
mit Beispiel 1 isoliert worden ist, wurde im Hinblick auf biochemische
Eigenschaften analysiert. Es wurde gefunden, dass das Molekulargewicht
etwa 38 kD betrug, wenn auf SDS-PAGE gemessen, und 30–32 kD,
gemessen mittels HPSEL. Der pI, gemessen auf einem isoelektrischen
Fokussierungsgel (IEF), betrug etwa 2,8. Es wurde gefunden, dass
die gereinigte 38 kD-Esterase gegenüber mehreren
natürlichen
Feruloyl- und p-Cumaroyl-Estern, Zellwänden von Weizenkleie und Zuckerrübenzellstoff,
Weizenmehl, der Pentosanfraktion von Weizenmehl, und Ethyl- und
Methylestern von Ferulasäure
und p-Cumarsäure
aktiv war. Die kinetischen Daten für verschiedene Substrate sind
in der Tabelle 1 dargestellt. Die 38 kD-Esterase zeigte ein pH-Optimum
von 5,1 für
Methylferulat mit 83 % und 25 % maximaler Aktivität, die jeweils
bei pH 3 und 8 gefunden wurde. Wenn die 38 kD-Esterase in Puffer
für 30
Minuten ohne Substrat bei pH 5,1 inkubiert wurde, lag das Temperatur-Optimum
bei 55°C.
Bei Vorliegen von 250 μM
Methylferulat stieg das Optimum auf 65°C. Ein niedriges Km des
Trisaccharids FAXX begünstigt
die Verwendung der 38 kD-Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung
in Kombination mit einer Xylanase, welche solche Kohlenhydratoligomere
vorzugsweise unhydrolysiert lässt,
wenn sie Zellwände
abbaut.
-
Die
gereinigte 38 kD-Esterase wurde im Hinblick auf eine Vielzahl von
biochemischen Aktivitäten
mit einem API-20-Enzym-Teststreifen (BioMerieux Vitek) gemäß den Herstelleranweisungen
getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Eine
Aktivität
wurde gegenüber
den folgenden Substraten festgestellt. "+++" steht
für eine
sehr starke Antwort, "++" steht für eine starke
Antwort, und "+" steht für eine Aktivität gegenüber dem
Substrat. "–" bedeutet, dass keine
Aktivität
detektiert wurde.
-
TABELLE
1 Aktivität der 38
kD-Esterase für
verschiedene feruloylierte Oligosaccharide
-
TABELLE
2 Substratspezifität für 38 kD-Esterase
-
BEISPIEL 8
-
Aktivität der 38
kD-Esterase gegenüber
Zuckerrüben-Zellstoffsubstrat
-
Zuckerrüben-Zellstoff
(100 mg SBP, sugar beet pulp) wurde zusammen mit FAE (1,5 FAXX-Einheiten, gemessen
nach dem Verfahren, das in McCallum et al., Analytical Biochemistry,
Bd. 196, Seite 362 (1991) beschrieben ist), allein oder zusammen
mit 50 Einheiten Xylanase aus Trichoderma longibrachiatum (Irgazyme 4X,
kommerziell erhältlich
von Genencor International, Inc.) in Natriumacetatpuffer (100 mM,
pH 5,0) inkubiert. Die Reaktionmischungen wurden kontinuierlich
bei 25°C
während
der Inkubation invertiert. SBP, das mit (i) Puffer allein, (ii)
Xylanase allein, oder (iii) abgekochter FAE inkubiert worden war,
diente als Kontrollen. Die Reaktionen wurden bei 12 und 24 Stunden
durch die Zugabe von 1,1 Äquivalenten
HCl gestoppt. Die Bestimmung des Gesamt-Ferulasäuregehalts von SBP wurde durch
Verseifen mit NaOH nach dem Verfahren von Bornemann et al., Appl.
Microbiol. Biotech., Bd. 33, Seiten 345–351 (1990) bestimmt. Die Ferulasäure, die
durch enzymatische Behandlung freigesetzt wurde, wurde mittels HPLC
unter Verwendung von authetischen Ferulasäurestandards (Aldrich) nach
dem Verfahren von Bornemann et al., Anal. Biochem., Bd. 190, Seiten
129–133 (1990)
bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt.
-
TABELLE
3 Freisetzung
von Ferulasäure
aus Zuckerrüben-Zellstoff
mit Ferulasäure-Esterase
