BRPI9611114B1 - Method for the biotrating with stones, method for the bioaccuration, detergent composition, method for the treatment of textile material containing cellulose fiber and method for the treatment of wood pulp or fiber derived from wood - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>"celulases, os genes codificando-as e os usos das mesmas"<d> . são descritos os genes codificando as celulases, e um gene codificando uma proteína que facilita a ação de tais celulases, as celulases e uma proteína que facilita a ação de tais celulases, e as preparações de enzimas contendo tais proteínas. são também descritos os hospedeiros nativos e o meio de cultivo dos ditos hospedeiros contendo as ditas celulases. estas proteínas são especialmente úteis na indústria têxtil e de detergentes, e na indústria de polpa e papel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR, MICROORGANISMO TRANSFORMADO, MÉTODO PARA O BIOTRATA-MENTO COM PEDRAS, MÉTODO PARA O BIOACABAMENTO, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE MATERIAL TÊXTIL CONTENDO FIBRA CELULÓSICA E MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE POLPA OU FIBRA DERIVADA DE MADEIRA".

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção A presente invenção está relacionada aos genes codificando as novas celulases neutras e às composições contendo as novas celulases neutras. Estas composições são especialmente úteis nas indústrias têxteis, de detergentes e de polpa e papel. Técnica Relacionada A celulose é um polissacarídeo linear de resíduos de glicose conectados por ligações β-1,4. Na natureza, a celulose está normalmente associada com a lignina, juntamente com as hemiceluloses, tais como os xilanos e os glicomananos. O uso prático das celulases tem sido dificultado pela natureza das celulases conhecidas, as quais são frequentemente misturas de celulases tendo uma variedade de atividades e especificidades de substrato. Por aquela razão, é desejável identificar fontes a partir das quais as celulases tendo somente as atividades desejadas possam ser obtidas.

Uma ampla variedade de celulases é conhecida na técnica, a maior parte das quais são celulases ácidas. Entretanto, algumas celulases neutras e alcalinas foram também identificadas. A Celluzyme® é uma preparação de celulase comercialmente disponível a partir de Humicola insolens (Novo Nordisk, A/S). A GB 2.075.028 e a EP 406.314 descrevem o uso de uma celulase de Humicola insolens como um aditivo enzimático em um detergente de lavagem para reduzir a aspereza (dureza) dos tecidos contendo algodão. A clonagem de uma celulase contendo atividade de endoglicanase a partir de Humicola insolens é descrita no WO 93/11249 e na EP 531.372. A EP 510.091 descreve uma celulase a partir do Bacillus spp. NCIMB 40250 que é útil nas composições detergentes. A EP 220.016 descreve celulases que são úteis como agentes de clarificação para tecidos coloridos. O WO 94/07998 descreve celulases modificadas que possuem uma atividade alcalina aperfeiçoada. O WO 95/02675 descreve composições detergentes que contêm duas celulases diferentes: uma primeira celulase que é cataliticamente receptível à remoção da sujeira em partículas, e uma segunda celulase que é cataliticamente receptível à clarificação da cor. O WO 92/18599 descreve uma preparação detergente que contém tanto uma celulase quanto uma protease. As celulases também têm sido usadas industrialmente como um auxiliar para a remoção de espessante de pasta de estampagem e corante em excesso após a estampagem têxtil (EP 576.526). A EP 383 828 descreve composições detergentes granulares, as quais contêm agente ativo na superfície, um material de argila amaciante de tecido, e granulados de celulase contendo carbonato de cálcio. A US 5.433.750 descreve composições detergentes contendo um agente ativo na superfície, um sistema de "builder", uma argila amaciante, um agente de floculação de argila e uma celulase com alta atividade, preferivelmente a celulase de Humicola insolens. A US 5.520.838 descreve composições detergentes granulares, compreendendo agente ativo na superfície, um "builder" e uma celulase, preferivelmente uma celulase de Humicola insolens, as ditas composições estando em uma forma compacta, tendo uma densidade relativamente alta e contendo uma quantidade pequena de sal de carga inorgânico.

As enzimas celulases são usadas em uma ampla variedade de indústrias, além da indústria têxtil. Por exemplo, as celulases são usadas industrialmente para a retirada de tinta de jornais e revistas (EP 521.999), para o aperfeiçoamento da drenagem de polpa (WO 91/14822, WO 91/17243), e como um tratamento para o alimento de animais.

As propriedades únicas de cada celulase tornam algumas mais adequadas para certos propósitos do que outras. Embora as enzimas difiram em diversas formas, uma das diferenças mais importante é o pH ótimo. As celulases neutras têm atividade de celulase útil na faixa de pH de 6-8, as celulases alcalinas têm atividade de celulase útil na faixa de pH de 7,5-10. As celuiases ácidas são ativas na faixa de pH de 4,5-6, porém têm pouca atividade de celuiase nos valores de pH maiores.

As celuiases neutras e ácidas são especialmente úteis na indústria têxtil, Klahorst, S. e col., Textile Chemist and Coforist 26: 13-18, 1994; Nilsson, T.E., Aachen Textile Conference, DWI Reports 114: 85-88 (1995); Videbaek, T. e col., ITB Dyeing/Printing/Finishing, janeiro de 1994, páginas 25-29; Klahorst, S. e col., AATCC Int. Conf & Exhibit, 4-7 de outubro de 1992, pág. 243, Atlanta, GA; Kochavi, D. e col., Am. Dyestuff Resporter, setembro de 1990, páginas 26-28; Tundall, R. Michael, Textile Chemists and Colorist 24:23 (1992); Lange, N.K., em Proc. Second TRICEL Symp. on Trichoderma reesei Ceilulases and Other Hydrolases, Espoo, Finlândia, 1993, ed. P. Suominen e col,, Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research vol. 8, 1993, páginas 263-272. Quando usadas para tratar o tecido, as celuiases atacam as cadeias de moléculas da celulose que formam as fibras de algodão, desse modo afetando as características do tecido.

Tradicionalmente, na "lavagem com pedras", as pédras-pome têm sido usadas para alterar as características do tecido. Gradualmente, as celuiases estão substituindo as pedras-pome, as quais proporcionam ao tecido o seu aspecto final desejado, porém podem causar estrago às máquinas, às roupas e aos equipamento de processamento das águas servidas. As US 4.832.864, US 4.912.056, US 5.006.126, US 5.122.159, US 5.213.581 e EP 307.564 divulaam o uso de celuiases biotratamento com pedras.

As celuiases são especialmente úteis para lavar com pedras o brim tingido com índigo, uma vez que o corante, na maior parte, permanece sobre a superfície do fio e não penetra nas fibras bem. Quando usadas para tratar o tecido de algodão, as celuiases neutras geralmente requerem um tempo de lavagem mais longo do que o fazem as celuiases ácidas. Entretanto, as celuiases neutras disponíveis são menos agressivas (ativas) contra o algodão do que as celuiases ácidas, e são descritas não comprometer a resistência do tecido tão rapidamente quanto as celuiases ácidas. As celulases neutras têm um perfil mais amplo de pH e assim o aumento do pH que ocorre durante o biotratamento com pedras tem pouco efeito sobre a atividade da enzima neutra. O uso de celulases ácidas é dificultado por sua tendência a promover a coloração de volta e um enfraquecimento dos tecidos. Ademais, o pH deve ser ajustado para uma faixa adequada para a função das celulases ácidas. Consequentemente, há uma clara demanda por preparações de enzimas de celulases neutras que não causem a coloração de volta ou o enfraquecimento dos tecidos.

Embora tenha se tornado popular usar celulases na indústria têxtil, simplesmente alterar-se a mistura de celulases que é usada pode produzir um acabamento diferente. Estes problemas têm focado uma atenção crescente sobre a busca por misturas reproduzíveis de celulases com propriedades desejadas. Assim, há uma clara demanda, especialmente na indústria têxtil e de detergentes, por novas celulases ativas nos valores de pH neutros e alcalinos, que não comprometam a resistência dos tecidos, com boas propriedades de limpeza e/ou cuidado dos tecidos e de redução da aspereza.

Sumário da Invenção Reconhecendo a importância de identificar enzimas úteis no bio-acabamento e no biotratamento têxteis, e nas aplicações detergentes, os inventores examinaram espécies fúngicas para celulases neutras e alcalinas com características enzimáticas que seriam úteis em tais tecnologias.

Estes estudos resultaram em novas celulases originando-se dos gêneros Mvceliophthora, Myriococcum, Melanocarpus, Sporotrichum e Chaetomium. A invenção é adicionalmente dirigida ao meio de cultura esgotado ou preparações de enzimas preparadas a partir dos hospedeiros nativos produzindo tais novas celulases. A invenção é adicionalmente dirigida ao uso de tal meio de cultura ou ao uso de tais preparações de enzimas na indústria têxtil e de detergentes, e nas indústrias de polpa e papel.

Estes estudos adicionalmente resultaram na identificação de três novas celulases que são especialmente úteis na indústria têxtil e de detergentes. As preparações purificadas a partir da Melanocarpus sp. ou da Myriococcum sp. revelaram uma celulase de 20 kDa com atividade de endoglicanase (designada aqui como "celulase de 20K"), uma celulase de 50 kDa ("celulase de 50K"), e uma segunda celulase de 50 kDa ("celulase B de 50K"). Um novo produto de gene com alta homologia à família das celulases, aqui chamado "proteína com CBD" (onde CBD significa "domínio de ligação à celulose"), foi também verificado. É um objetivo da invenção proporcionar preparações de enzimas que contenham uma ou mais das novas celulases da invenção, especialmente a celulase de 20K, a celulase de 50K, a celulase B de 50K e/ou a proteína com CBD. É um objetivo adicional desta invenção proporcionar um método para utilizar tais preparações para o acabamento de produtos têxteis, especialmente o biotratamento de brim, para o uso das ditas preparações nas composições detergentes, e especialmente os métodos que usam a celulase de 20K, a celulase de 50K, a celulase B de 50K e/ou a proteína com CBD. A invenção está também dirigida a outras celulases neutras e/ou alcalinas tendo uma ou mais das sequências de aminoácidos conforme descritas aqui. A invenção é adicionalmente dirigida aos genes codificando a celulase de 20K, a celulase de 50K, a celulase B de 50K e a proteína com CBD. A invenção é adicionalmente dirigida aos novos vetores de expressão compreendendo tais genes e aos novos hospedeiros transformados com os vetores, especialmente os hospedeiros que sejam capazes de altos níveis de expressão das proteínas codificadas por tais genes. A invenção é adicionalmente dirigida ao meio de cultura esgotado de tais hospedeiros transformados, ao meio de cultura contendo a celulase de 20K, a celulase de 50K, a celulase B de 50K e/ou a proteína com CBD, ou composições de enzimas (preparações de enzimas) contendo uma ou mais destas proteínas que tenham sido preparadas a partir de tais meios de cultura. A invenção é adicionalmente dirigida ao uso de tal meio de cultura ou ao uso de tais preparações de enzimas na indústria têxtil e de detergentes, e nas indústrias de polpa e papel.

Breve Descrição das Figuras As Figuras 1 (A e B) mostram as dependências do pH (Figura 1A) e da temperatura (Figura 1B) das atividades de endoglicanase de ALK04179, CBS 689.95.

As Figuras 2 (A e B) mostram as dependências do pH (Figura 2A) e da temperatura (Figura 2B) das atividades de endoglicanase de ALK04124, CBS 687.95.

As Figuras 3 (A e B) mostram as dependências do pH (Figura 3A) e da temperatura (Figura 3B) das atividades de endoglicanase de ALK04237, CBS 685.95.

As Figuras 4 (A e B) mostram as dependências do pH (Figura 4A) e da temperatura (Figura 4B) das atividades de endoglicanase de ALK04265, CBS 730.95.

As Figuras 5 (A e B) mostram as dependências do pH (Figura 5A) e da temperatura (Figura 5B) das atividades de endoglicanase de ALK04125, CBS 688.95.

As Figuras 6 (A e B) mostram o efeito da lavagem e da coloração de volta (Figura 6A) e a pigmentação azul (Figura 6B) com as celulases neutras.

As Figuras 7 (A e B) mostram o efeito da lavagem e da coloração de volta (Figura 7A) e a pigmentação azul (Figura 7B) com Ecostone L com dosagens de enzima gradualmente crescentes. 1X corresponde à dosagem de enzima das celulases neutras nas Figuras 6A e 6B. A Figura 8 mostra a purificação da celulase de 20K a partir do Pico II por cromatografia em SP-Sepharose® Uma amostra contendo 11,7 g de proteína e 576.000 ECU foi aplicada a uma coluna de 4,5 x 31 cm, a qual foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 9. As frações de 15 ml foram coletadas. As atividades de endoglicanase no pico nas frações 148 - 161 foram subestimadas porque a cristalização ocorreu antes que a enzima pudesse ser suficientemente diluída para o ensaio. O material cristalino a partir destas frações continha 486.000 ECU.

As Figuras 9 (A e B) mostram a análise por SDS-PAGE da celulase de 20K. As massas moleculares dos padrões são mostradas em kDa. A O material parcialmente cristalino precipitou-se a partir das frações de S-Sepharose® ativa (caminho 1). B Frações da cromatografia do material parcialmente cristalino sobre G50 Sephadex. As frações mostradas nos caminhos 19 e 25 não continham nenhuma atividade de endoglicanase. Para as outras frações, a quantidade de atividade (em ECU) aplicada ao gel foi como se segue; fração 27, 0,4; 29, 2,4 (como 3,0 pg de proteína); 30, 2,1; 31, 1,9; 33, 0,46; e 35, 1,1. A Figura 10 mostra a separação da celulase de 50K e da celulase B de 50K do Pico lll/IV por cromatografia em SP-Sepharose®. Uma amostra contendo 200 mg de proteína e 14.800 ECU foi aplicada à coluna de 2,5 x 11 cm, a qual foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 9. As frações de 6,8 ml foram coletadas. Uma quantidade pequena de celulase de 50K eluiu antes do gradiente de NaCI, ao passo que a maior parte da celulase de 50K eluiu em NaCI em torno de 50 mM. A celulase B de 50K foi encontrada no pico principal de proteína em NaCI em torno de 80 mM. A Figura 11 mostra uma análise por SDS-PAGE da celulase de 50K purificada (11 A) e da celulase B de 50K (11B). Os números dos caminhos indicam as frações (3,3 ml) eluídas de Phenyl-Sepharose. Para as frações 36-41, 2,5 μΙ de cada fração foram aplicados ao gel. Para as outras frações, 2 μΙ foram aplicados. O pico de celulase de 50K foi encontrado nas frações 37-38 (11 A) (contendo 780 e 880 ECU/mi, respectivamente). O pico de ceiulase B de 50K estava nas frações 30 e 31 (11B), as quais continham uma atividade insignificante (menos do que 4 ECU/ml). A Figura 12 mostra a dependência de temperatura da atividade da endoglicanase da ceiulase de 50K em pH 7,0 e um tempo de reação de 60 min. A Figura 13 mostra a dependência de pH da atividade de endoglicanase da ceiulase de 50K a 50°C (-») e 70°C (<). A Figura 14 mostra uma análise de Western usando o anti-soro de ceiulase de 20K como uma sonda. Os caminhos 1, 2 e 3 contêm 25 pg de uma proteína dos picos de DEAE-Sepharose I, III e IV, respectivamente. Os caminhos 4 e 5 contêm 2,0 e 0,2 pg de ceiulase de 50K pura e o caminho 6 contém 0,6 pg de ceiulase B de 50K. Os caminhos 7 e 8 contêm cerca de 25 pg de proteína a partir do meio de crescimento completo de ALK04237 e ALK04124, respectivamente. A Figura 15 mostra a dependência da temperatura da atividade de endoglicanase da ceiulase de 20K em pH 7 (tempos de reação de 10 min.).

As Figuras 16 (A e B) mostram a dependência do pH da atividade de endoglicanase da ceiulase de 20K para o tempo de reação de (a) 10 minutos ou (b) 60 minutos. A Figura 17 mostra os dados da sequência de aminoácidos derivados do seqüênciamento da ceiulase de 20K descrito no material ilustrativo aqui contido. A seqüência 429 é a partir da extremidade com N da proteína e as outras seqüências são a partir dos peptídeos trípticos internos. A Figura 18 mostra os mapas de restrição do DNA de Melanocarpus albomyces nos plasmídios pALK1221, pALK1222 e pALK1223, os quais carregam o gene de ceiulase de 20K. A Figura 19 mostra a seqüência de DNA do gene de ceiulase de 20K. A seta indica o sítio de processamento de peptidase de sinal predito. A Figura 20 mostra os mapas de restrição do DNA de Melanocarpus albomyces nos plasmídios pALK1233, pALK1234 e pALK1235, os quais carregam o gene de celulase de 50K.

As Figuras 21 (A e B) mostram a seqüência de DNA do gene de celulase de 50K. A seta indica o sítio de processamento de peptidase de sinal predito. A Figura 22 mostra os mapas de restrição do DNA de Melanocarpus albomyces nos plasmídios pALK1229 e pALK1236, os quais carregam o gene de celulase B de 50K.

As Figuras 23 (A e B) mostram a seqüência de DNA do gene de celulase B de 50K. A seta indica o sítio de processamento de peptidase de sinal predito. A Figura 24 mostra o mapa de plasmídio de pTTcOi. A Figura 25 mostra o mapa de plasmídio de pMS2, A Figura 26 mostra o mapa de restrição do DNA de Melanocarpus albomyces no plasmídio pALK123Q, o qual carrega o DNA codificando a proteína com CBD. A seqüência apresentada na Figura 27 é marcada com uma seta na Figura 26. A Figura 27 mostra a seqüência de DNA do gene de celulase da proteína com CBD em pALK123Q. A Figura 28 mostra o mapa de plasmídio de pALK1231. A Figura 29 mostra o mapa de plasmídio de pALK1235. A Figura 30 mostra uma análise de Western usando o anti-soro de celulase de 20K como uma sonda. Os caminhos 1 e 2 contêm cerca de 10 pg de proteína a partir do meio de crescimento completo dos transformantes ALKO3620/pALK1235/49 e ALK03620/pALK1235/40. O caminho 3 contém cerca de 10 pg de proteína a partir do meio de crescimento completo de ALKO3620. Os caminhos 4 e 5 contêm cerca de 10 pg de proteína a partir do meio de crescimento completo dos transformantes ALKO3620/pALK1231/16 e ALKO3620/pALK1231/14. O caminho 6 contém 100 g de celulase de 20K pura. A Figura 31 mostra o mapa de plasmídio de pALK1238. A Figura 32 mostra o mapa de plasmídio de pALK1240.

Depósitos ALK04179, Myceliophthora thermophila foi depositado como CBS 689.95 em 12 de outubro de 1995, no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. ALK04124, Myriococcum sp. foi depositado como CBS 687.95 em 12 de outubro de 1995, no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. ALK04237, Melanocarpus albomyces (= Myriococcum albomyces = Thieiavia albomyces; Guarro e col., 1996, Mycol. Res. 100(1):75) foi depositado como CBS 685.95 em 11 de outubro de 1995, no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. ALK04125, Sporotrichum thermophile foi depositado como CBS 688.95 em 12 de outubro de 1995, no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. ALK04265, Chaetomium thermophilum La Touche foi depositado como CBS 730.95 em 8 de novembro de 1995, no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. O plasmídio pALK1221 foi depositado como DSM 11024 em 21 de junho de 1996 e ο X4237/5.1 foi depositado como DSM 11012 em 21 de junho de 1996, no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha. Ambos contêm o gene de celulase de 20K a partir de Melanocarpus albomyces CBS 685.95. O plasmídio pALK1227 foi depositado como DSM 11025 em 21 de junho de 1996 e ο λ4237/35 foi depositado como DSM 11014 em 21 de junho de 1996, no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha. Ambos contêm o gene de celulase de 50K a partir de Melanocarpus albomyces CBS 685.95. O plasmídio pALK1229 foi depositado como DSM 11026 em 21 de junho de 1996 e ο λ4237/3 foi depositado como DSM 11011 em 21 de junho de 1996, e ο X4237/18 foi depositado como DSM 11013 em 21 de junho de 1996, no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha. O pALK1229 contém o DNA codificando para a celulase B de 50K, ο λ4237/3 e ο λ4237/18 contêm o gene de celulase B de 50K a partir do Melanocarpus albomyces CBS 685.95. O plasmídio pALK1230 foi depositado como DSM 11027 em 21 de junho de 1996 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha. O pALK1230 contém o gene de proteína com CBD a partir de Melanocarpus albomyces CBS 685.95.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas Na descrição que se segue, diversos termos usados na tecnologia da indústria têxtil são extensivamente usados. A fim de proporcionar um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as seguintes definições são proporcionadas.

Biotratamento com pedras. O "biotratamento com pedras" do tecido ou peça de roupa significa o uso de enzimas no lugar do, ou além do, uso de pedras-pome para o tratamento do tecido ou peça de roupa, especialmente o brim.

Bio-acabamento. O "bioaeabamento" refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras de celulose a fim de modificar o tecido ou a superfície do fio, em uma forma que impeça a formação de bolas permanente, aperfeiçoe o manuseio do tecido, como a maciez e a lisura, clareie a estrutura da superfície por redução da desfiadura, o que resulta na clarificação das cores, aperfeiçoe a capacidade de conformação do tecido, aperfeiçoe a capacidade de absorção da umidade, e que aperfeiçoe também a capacidade de tingir.

Coloração de volta. O corante liberado tem uma tendência a depositar novamente sobre a superfície das fibras de tecido. Este efeito é chamado "coloração de volta". é dada na Patente Ü,S, N- 5.433.750, uma tista adequada de tensoatívos é dada na Patente U.S. Na 3.664.961, Preparação de enzimas. Por "preparação de enzimas" é significado uma composição contendo enzimas. De preferência, as enzimas foram extraídas a partir de (parcial ou completamente purificadas a partir de) um micróbio ou do meio usado para desenvolver tal micróbio. "Extraídas a partir de" significa que as enzimas desejadas são separadas da massa celular. Isto pode ser efetuado por qualquer método que atinja este objetivo, incluindo rompendo-se as células e também simplesmente removendo-se o meio de cultura das células gastas. Portanto, o termo "preparação de enzimas" inclui as composições contendo o meio previamente usado para cultivar (um) micróbio(s) desejado(s) e quaisquer enzimas que tenham sido liberadas das células microbianas em tal meio durante o cultivo ou as etapas de processamento a jusante.

Por um hospedeiro que seja "substancialmente incapaz" de sintetizar uma ou mais enzimas é significado um hospedeiro em que a atividade de uma ou mais das enzimas listadas ê depreciada, deficiente, ou ausente quando comparadas ao tipo selvagem, Por uma sequência de aminoácídos que seja um "equivalente" de uma sequência de aminoácídos específica é significado uma sequência de aminoácídos que não seja idêntica à sequência de aminoácídos específica, porém, mais exatamente, contenha pelo menos algumas alterações dos aminoácídos (deleções, substituições, inversões, inserções, etc.) que não afetem essencialmente a atividade biológica da proteína em comparação a uma atividade similar da seqüência de aminoácidos específica, quando usada para um propósito desejado. A atividade biológica de uma celutase ê sua atividade catalítica, e/ou sua capacidade de iigar-se ao material celulósico. A atividade biológica da cetulase B de 50K adicionalmente inclui a sua capacidade de atuar de forma sinérgica com as ceiulases. De preferência, uma seqüência de aminoácídos equivalente contém pelo menos 80%-99% de identidade, no nível de aminoácido, à seqüência de aminoácídos específica, mais preferivelmente pelo menos 90% de uma celulase é sua atividade catalítica, e/ou sua capacidade de ligar-se ao material celulósico. A atividade biológica da celulase B de 50K adicionaimente inclui a sua capacidade de atuar de forma sinérgica com as celulases. De preferência, uma sequência de aminoácidos equivalente contém pelo menos 80%-99% de identidade, no nível de aminoácido, à seqüência de aminoácidos específica, mais preferivelmente pelo menos 90% e em uma modalidade especial e altamente preferível, pelo menos 95% de identidade, no nível de aminoácido.

Veículo de clonagem. Um veículo de clonagem é um DNA de plasmídio ou de fago ou outra seqüência de DNA (tal como um DNA linear) que proporcione um meio carregador de ácido nucléico apropriado para a transferência de um gene de interesse para uma célula hospedeira. Os veículos de clonagem da invenção podem ser projetados para replicar de forma autônoma em hospedeiros procarióticos e eucarióticos. Nos hospedeiros fúngicos, tais como Trichoderma, os veículos de clonagem geralmente não replicam-se de forma autônoma e, ao invés disso, meramente proporcionam um veículo para o transporte do gene de interesse para o hospedeiro de Trichoderma para uma inserção subsequente no genoma do Trichoderma. O veículo de clonagem pode ser adicional mente caracterizado por um ou um pequeno número de sítios de identificação de endonuclease, nos quais tais sequências de DNA possam ser cortadas em uma forma determinável sem perda de uma função biológica essencial do veículo, e nos quais o DNA possa ser unido a fim de efetuar a replicação e a clonagem de tal DNA. O veículo de clonagem pode, além disso, conter um marcador adequado para uso na identificação de células transformadas com o veículo de clonagem. Os marcadores, por exemplo, são a resistência ao antibiótico. Alternativamente, tais marcadores podem ser proporcionados em um veículo de clonagem que seja separado daquele fornecendo o gene de interesse. A palavra "vetor" é algumas vezes usada para "veículo de clonagem".

Veículo de expressão. Um veículo de expressão é um veículo de clonagem ou vetor similar a um veículo de clonagem, porém que seja capaz de expressar um gene de interesse, após a transformação em um hospedeiro desejado, Quando um hospedeiro fúngico for usado, o gene de interesse é preferivelmente proporcionado a um hospedeiro fúngico como parte de um veículo de clonagem ou de expressão que integre-se no cromossomo fúngico, ou permita que o gene de interesse integre-se no cromossomo hospedeiro. As sequências que são parte do veículo de clonagem ou do veículo de expressão podem também estar integradas com o gene de interesse durante o processo de integração. No T. reesei, os sítios de integração, para os quais o gene de interesse pode ser orientado, incluem os locais cbh e/ou egl. Mais preferivelmente, o gene de interesse é orientado para substituir um ou mais genes codificando as características desejadas. O gene de interesse é também preferivelmente colocado sob o controle de (isto é, ligado de forma operável à) certas sequências de controle, tais como as seqüências promotoras proporcionadas pelo vetor (que integram-se com o gene de interesse). Alternativamente, as seqüências de controle podem ser aquelas no sítio de inserção.

As seqüências de controle da expressão de um vetor de expressão variarão, dependendo de se o vetor é projetado para expressar um certo gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico (por exemplo, um vetor em vaivém pode proporcionar um gene para a seleção em hospedeiros bacterianos. As seqüências de controle da expressão podem conter elementos reguladores transcricionais, tais como, promotores, elementos intensificadores, e seqüências de terminação transcricional, e/ou elementos reguladores da tradução, tais como, por exemplo, os sítios de iniciação e terminação de tradução.

De acordo com a invenção, são proporcionados celulases neutras e alcalinas, e métodos para a produção de tais celulases neutras e alcalinas úteis, que são desejáveis para o tratamento de materiais têxteis.

Os hospedeiros nativos que produzem as proteínas da invenção são: X 1) ALK04179, Myceliophthora thermophila; depositado como CBS 689.95 no Centraalbureau voor Schimmelcultures, Caixa Postal 273.3740 AG BAARN. 2) ALK04124, Myriococcum sp.; depositado como CBS 687.95;

3) ALK04237, Melanocarpus albomyces, depositado como CBS 685.95;

4) ALK04125, Sporotríchum thermophile, depositado como CBS 688.95; e 5) ALK04265, Chaetomium thermophilum La Touche, depositado como CBS 730.95 Uma modalidade específica preferida da invenção é o meio de cultura esgotado dos hospedeiros nativos ou das preparações de enzimas preparadas a partir do meio de cultura.

Nas modalidades preferidas específicas da invenção, a celulase de 20K, a celulase de 50K, a celulase B de 50K e/ou a proteína com CBD purificadas são proporcionadas. Estas proteínas podem ser obtidas, por exemplo, a partir de Melanocarpus sp. ou Myriococcum sp., conforme descrito aqui, e especialmente no Exemplo 9.

Os dados da sequência de aminoácidos foram gerados a partir das celulases descritas aqui. Assim, a invenção está também dirigida às celulases neutras ou alcalinas contendo uma ou mais das sequências de aminoácidos mostradas aqui. Assim, a invenção é pretendida ser dirigida à qualquer celulase neutra ou alcalina que seja um equivalente funcional da celulase de 20K, da celulase de 50K, da celulase B de 50K e/ou da proteína com CBD, e tendo uma ou mais das seqüências de aminoácidos descritas aqui, ou substancialmente a mesma sequência. Tais celulases neutras ou alcalinas podem ser derivadas de outras cepas da mesma espécie ou de organismos divergentes.

Nas modalidades adicionais preferidas, a celulase de 20K é proporcionada com o material de picos separados formados durante os procedimentos de purificação exemplificados (por exemplo, as Combinações de DEAE-Sepharose I, III, ou IV na Tabela VIII aqui contida). Nas modalidades ainda adicionais, outras proteínas no meio com Melanocarpus albomyces ALKO 4237 podem ser usadas, sozinhas ou em combinação com outras tais proteínas.

Nas modalidades adicionais preferidas, a celulase de 50K é proporcionada com o material de picos separados formados durante os procedimentos de purificação exemplificados. Nas modalidades ainda adicionais, outras proteínas no meio com ALKO 4237 podem ser usadas, sozinhas ou em combinação com outras tais proteínas.

Nas modalidades adicionais preferidas, a celulase B de 50K é proporcionada com o material de picos separados formados durante os procedimentos de purificação exemplificados. Nas modalidades ainda adicionais, outras proteínas no meio com ALKO 4237 podem ser usadas, sozinhas ou em combinação com outras tais proteínas.

Conforme descrito aqui, o ALKO 4265, Chaetomium thermophilum La Touche, depositado como CBS 730.95, é usado aqui como um exemplo de uma celulase neutra que não é preferida no método de biotratamento com pedras da invenção, porque ele causa a coloração de volta. Entretanto, há evidência que ele é útil em outras aplicações (por exemplo, nos detergentes). O processo para manipular geneticamente os hospedeiros da invenção é facilitado através da clonagem de sequências genéticas que codificam a proteína desejada, e através da expressão de tais seqüências genéticas. Conforme usado aqui, o termo "seqüências genéticas" é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucléico (preferivelmente o DNA). As seqüências genéticas que codificam a proteína desejada são derivadas a partir de uma variedade de fontes. Estas fontes incluem o DNA genômico, o cDNA, o DNA sintético e as suas combinações. Os sistemas de vetores podem ser usados para produzir hospedeiros para a produção das preparações de enzimas da invenção. Tal construção de vetores (a) pode adicionalmente proporcionar uma construção de vetores separada (b) que codifique pelo menos um gene desejado a ser integrado ao genoma do conectada a uma seqüêncía (ou sequências) reguladora em urna forma tal de modo a colocar a expressão da sequência sob a influência ou o controle da sequência reguladora. Duas sequências de DNA (tais como uma sequência de codificação de proteína e uma seqüêncía da região promotora ligada à extremidade 5' da sequência de codificação) são ditas serem ligadas de forma operávet se a indução da função promotora resulte na transcrição do mRNA da sequência de codificação da proteína, e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulte na introdução de uma mutação com mudança do quadro, (2) interfira com a capacidade das sequências reguladoras da expressão de orientar a expressão do mRNA, do RNA sem sentido, ou da proteína, ou (3) interfira com a capacidade do molde de ser transcrito pela sequência da região promotora. Assim, uma região promotora seria ligada de forma operável a uma sequência de DNA se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição daquela seqüêncía de DNA. A natureza precisa das regiões reguladoras, necessárias para a expressão do gene, pode variar entre as espécies ou os tipos celulares, porém, em geral, incluirá, conforme necessário, as sequências de não transcrição em 5’ e de não tradução (não codificação) em 5' envolvidas com o início da transcrição e da tradução, respectivamente. A expressão da proteína nos hospedeiros transformados requer o uso de regiões reguladoras funcionais em tais hospedeiros. Uma ampla variedade de sequências reguladoras transcricíonais e de tradução pode ser empregada. Nos eucariotos, onde a transcrição não está ligada à tradução, tais regiões de controle podem ou não proporcionar um códon de metionina iniciador (AUG), dependendo de se a seqüêncía clonada contém uma tal metionina. Tais regiões incluirão, em geral, uma região promotora suficiente para orientar a iniciação da síntese de RNA na célula hospedeira.

Conforme é amplamente sabido, a tradução do mRNA eucariótico é iniciada no códon que codifica a primeira metionina. Por esta razão, é preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariótico e uma seqüêncía de DNA que codifica a proteína, ou um derivado funcional da de controle podem ou não proporcionar um códon de metionina iniciador (AUG), dependendo de se a seqüência clonada contém uma tal metionina. Tais regiões incluirão, em geral, uma região promotora suficiente para orientar a iniciação da síntese de RNA na célula hospedeira.

Conforme é amplamente sabido, a tradução do mRNA eucariótico é iniciada no códon que codifica a primeira metionina. Por esta razão, é preferível assegurar que a ligação entre um promotor eucariótico e uma seqüência de DNA que codifica a proteína, ou um derivado funcional da mesma, não contenha nenhum códon interveniente que seja capaz de codificar uma metionina. A presença de tais códons resulta em uma formação de uma proteína de fusão (se o códon de AUG estiver no mesmo quadro de leitura que a seqüência de DNA de codificação da proteína) ou uma mutação com alteração do quadro (se o códon de AUG não estiver no mesmo quadro de leitura que a seqüência de codificação da proteína).

Em uma modalidade preferida, uma proteína desejada é secretada no meio circundante devido à presença de uma seqüência de sinal de secreção. Se uma proteína desejada não possuir sua própria seqüência de sinal, ou se tal seqüência de sinal não funcionar bem no hospedeiro, então a seqüência de codificação da proteína pode ser ligada de forma operável a uma seqüência de sinal homóloga ou heteróloga ao hospedeiro. A seqüência de codificação desejada pode ser ligada por qualquer seqüência de sinal que permitirá a secreção da proteína a partir do hospedeiro. Tais seqüências de sinal podem ser projetadas com ou sem sítios específicos de protease, tal que a seqüência de peptídeo de sinal seja receptível à remoção subseqüente. Alternativamente, um hospedeiro que disperse a proteína no meio pode ser usado, por exemplo, um hospedeiro com uma mutação em sua membrana.

Se desejado, as regiões não transcritas e/ou não traduzidas em 3' para a seqüência codificando para uma proteína podem ser obtidas pelos métodos de clonagem acima descritos. A região não transcrita em 3' pode ser retida por seus elementos da seqüência reguladora de terminação transcricional; a região não traduzida em 3 pode ser retida por seus elementos da seqüência reguladora de terminação de tradução, ou por aqueles elementos que orientam a poliadenilação nas células eucarióticas.

Os vetores da invenção podem adicionalmente compreender outros elementos reguladores ligados de forma operável, tais como as seqüências intensificadoras.

Em uma modalidade preferida, os transformantes geneticamente estáveis são construídos, com o que um DNA da proteína desejada é integrado no cromossomo do hospedeiro. A seqüência de codificação para a proteína desejada pode ser de qualquer fonte adequada. Tal integração pode ocorrer de novo dentro da célula ou, em uma modalidade mais preferida, ser auxiliada pela transformação com um vetor, o qual insere-se, numa forma funcionai, no cromossomo do hospedeiro, por exemplo, os elementos do DNA que promovem a integração das seqüências de DNA nos cromossomos.

As células que integraram estavelmente o DNA introduzido em seus cromossomos são selecionadas também íntroduzindo-se um ou mais marcadores que permitam a seleção de células hospedeiras, as quais contêm o vetor de expressão no cromossomo, por exemplo, o marcador pode proporcionar resistência ao biocida, por exemplo, resistência aos antibióticos, ou metais pesados, tais como o cobre, ou similares. O gene de marcador selecionável pode ser diretamente ligado às seqüências de gene de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por co-transformação.

Os fatores de importância na seleção de um plasmídio ou vetor virótico particular incluem: a facilidade com a qual as células receptoras que contêm o vetor podem ser identificadas e selecionadas a partir daquelas células receptoras, as quais não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em um hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de "mover em vaivém" o vetor entre as células hospedeiras de diferentes espécies.

Assim que o vetor ou a seqüência de DNA contendo a(s) construção(ões) for preparada para a expressão, a(s) construção(ões) de DNA é(são) introduzida(s) em uma célula hospedeira apropriada por quaisquer de uma variedade de meios adequados, incluindo a transformação conforme acima descrito. Após a introdução do vetor, as células receptoras são desenvolvidas em um meio seletivo, o qual seleciona o desenvolvimento das células transformadas. A expressão da(s) seqüência(s) de gene clonado resulta na produção da proteína desejada, ou na produção de um fragmento desta proteína. Esta expressão pode ocorrer em uma forma contínua nas células transformadas, ou em uma forma controlada. . Assim, as sequências de codificação da proteína descritas aqui podem ser ligadas de forma operável a qualquer vetor desejado e transformadas em um vetor selecionado, de forma a proporcionar a expressão de tais proteínas naquele hospedeiro. O assunto da invenção são também as moléculas de ácido nucléico codificando para proteínas tendo a atividade biológica de uma celulase e que hibridizam para quaisquer das moléculas de ácido nucléico descritas acima ou que são definidas no que se segue: Uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo a atividade enzimática de uma celulase, selecionada do grupo consistindo em: (a) moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos conforme representada na Figura 19 ou 21; (b) moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos conforme representada na Figura 23 ou 27; (c) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação da seqüência de nucleotídeos conforme representada na Figura 19 ou 21; (d) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação da seqüência de nucleotídeos conforme representada na Figura 23 ou 27; (e) moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos codificada pelo inserto de DNA contido em DSM 11024, DSM 11012, DSM 11025ouDSM 11014; (f) moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos codificada pelo inserto de DNA contido em DSM 11026, DSM 11011, DSM 11013 ou DSM 11027; (g) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação do inserto de DNA contido em DSM 11024, DSM 11012, DSM 11025 ou DSM 11014; (h) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação do inserto de DNA contido em DSM 11026, DSM 11011, DSM 11013 ou DSM 11027; (i) moléculas de ácido nucléico hibridizando para uma molécula de qualquer um de (a), (c), (e) ou (g); e (j) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de codificação difere da seqüência de codificação de uma molécula de ácido nucléico de qualquer um de (a) até (i) devido à degeneração do código genético. (k) moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo atividade de celulase, e tendo uma seqüência de aminoácidos que mostra pelo menos 80% de identidade a uma seqüência conforme representada na Figura 19, 21, 23 ou 27. O termo "hibridação" neste contexto significa a hibridação sob condições de hibridação convencionais, preferivelmente sob condições severas, tais como descritas por, por exemplo, Sambrook e col. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2~ Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas moléculas de ácido nucléico que hibridizam para as moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, em princípio, podem ser derivadas de qualquer organismo que possua tais moléculas de ácido nucléico. De preferência, elas são derivadas de fungos, a saber, daqueles dos gêneros Melanocarpus, Myriococcum, Sporotrichum, Myceliophthora e Chaetomium. As moléculas de ácido nucléico hibridizando para as moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser isoladas, por exemplo, das bibliotecas genômicas ou das bibliotecas de cDNA de diversos organismos, a saber, os fungos.

Tais moléculas de ácido nucléico podem ser identificadas e isoladas utilizando-se as moléculas de ácido nucléico da presente invenção ou fragmentos destas moléculas ou os complementos contrários destas moléculas, por exemplo, por hibridação de acordo com as técnicas padrão (ver Sambrook e col. (1989)).

Como sonda de hibridação, por exemplo, as moléculas de ácido nucléico podem ser usadas, as quais têm exata ou substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos indicada nas Figuras ou fragmentos da dita sequência. Os fragmentos usados como sondas de hibridação podem também ser fragmentos sintéticos obtidos por técnicas de síntese convencionais, e cuja sequência é substancialmente idêntica àquela das moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção. Assim que os genes hibridizando para as moléculas de ácido nucléico da invenção tiverem sido identificados e isolados, é necessário determinar a sequência e analisar as propriedades das proteínas codificadas pela dita sequência. O termo "molécula de DNA de hibridação" inclui os fragmentos, os derivados e as variantes alélicas das moléculas de ácido nucléico acima descritas, os quais codificam para a proteína acima descrita ou um seu fragmento biologicamente ativo. Os fragmentos são entendidos serem partes de moléculas de ácido nucléico grandes o suficiente para codificar para a proteína descrita ou um seu fragmento biologicamente ativo. O termo "derivado" significa neste contexto que as sequências de nucleotídeos destas moléculas diferem das seqüências das moléculas de ácido nucléico acima descritas em uma ou mais posições e são altamente homólogas à dita seqüência. A homologia é entendida referir-se a uma identidade de sequência de pelo menos 40%, particularmente uma identidade de pelo menos 60%, preferivelmente mais do que 80%, e ainda mais preferivelmente mais do que 90%. Os desvios das moléculas de ácido nucléico descritas acima podem ser o resultado de deleção, substituição, inserção, adição ou combinação. A homologia, além disso, significa que as sequências de nucleotídeos respectivas ou as proteínas codificadas são funcional e/ou estruturalmente equivalentes. As moléculas de ácido nucléico que são homólogas às moléculas de ácido nucléico descritas acima, e que são derivadas das ditas moléculas de ácido nucléico, são regularmente variações das ditas moléculas que representam modificações tendo a mesma função biológica. Elas podem ser variações de ocorrência natural, tais como as sequências de outros organismos ou mutações. Estas mutações podem ocorrer naturalmente ou podem ser obtidas por mutagênese específica. Ademais, estas variações podem ser sequências sinteticamente produzidas. As variantes alélicas podem ser variantes de ocorrência natural, bem como variantes sinteticamente produzidas ou geneticamente manipuladas.

As proteínas codificadas pelas diversas variantes das moléculas de ácidos nuciéicos da invenção compartilham características comuns específicas, tais como atividade enzimática, peso molecular, reatividade imunológica, conformação, etc., bem como propriedades físicas, tais como mobilidade eletroforética, comportamento cromatográfico, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, estabilidade, pH ótimo, temperatura ótima, etc. A atividade enzimática da celulase pode ser detectada, por exemplo, conforme descrito na página 11 e nos Exemplos 1 e 25. A presente invenção adicionalmente refere-se às moléculas de ácido nucléico, cujas sequências diferem das sequências das moléculas acima identificadas devido à degradação do código genético, e as quais codificam para uma proteína tendo a atividade biológica de uma celulase.

As moléculas de ácido nucléico da invenção são preferivelmente as moléculas de RNA ou de DNA, mais preferivelmente o DNA genômico ou o cDNA. A presente invenção também refere-se aos antibióticos que especificamente identificam uma das proteínas acima descritas de acordo com a invenção, bem como aos fragmentos de anticorpos que têm esta propriedade. Estes anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Os métodos para a sua produção são bem conhecidos na técnica e são descritos em detalhe, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual·', CSH Press, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Ademais, a presente invenção refere-se aos oligonucleotídeos que especificamente hibridizam com uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção, ou com a fita complementar de uma tal molécula de ácido nucléico. Neste aspecto, o termo "especificamente hibridizam" significa que um tal oligonucleotídeo hibridiza sob condições de hibridação severas especificamente para uma molécula de ácido nucléico da invenção e não mostra, sob tais condições, uma hibridação cruzada com as seqüências codificando para outros polipeptídeos. De preferência, tais oligonucleotídeos têm um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 15 nucleotídeos, e mais preferivelmente ainda de pelo menos 30 nucleotídeos. Eles são preferivelmente não maiores do que 100 nucleotídeos, mais preferivelmente não maiores do que 80 nucleotídeos, e mais preferivelmente ainda não maiores do que 60 nucleotídeos. A fim de assegurar que eles hibridizem especificamente para uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, tais oligonucleotídeos mostram sobre o seu comprimento total uma identidade de pelo menos 80%, preferivelmente de pelo menos 95%, e mais preferivelmente de pelo menos 99% com uma sequência de nucleotídeos correspondente de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. Estes oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como sondas para o exame quanto às seqüências codificando as celulases nas bibliotecas genômicas ou de cDNA, ou como primers por PCR.

As seqüências de codificação de proteína descritas aqui podem ser fundidas em quadro a outras seqüências, de modo a construir um DNA codificando uma proteína de fusão. Por exemplo, um vetor recombinante codificando uma celulase de 50K, uma celulase de 20K, uma celulase B de 50K ou o gene da proteína com CBD, pode ser preparado conforme acima descrito, exceto que a sequência de codificação de proteína é fundida com a seqüência de uma celulase, hemicelulase ou mananase de T. reesei, ou pelo menos um domínio funcional de tais celulase, hemicelulase, ou mananase, conforme descrito na US 5.298.405, no WO 93/24622 e na submissão de GenBank L25310, cada um incorporado aqui por referência. Especialmente, a celulase, a hemicelulase, ou a mananase é selecionada do grupo consistindo em CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII e MANI, ou um seu domínio, tal como o sinal de secreção ou a seqüência de núcleo. A mananase tem a mesma estrutura de domínio que aquela das celulases: um domínio de núcleo, contendo o sítio ativo, um domínio de articulação contendo uma região rica em serina-treonina, e uma extremidade, contendo o domínio de ligação.

Peptídeos de fusão podem ser construídos que contenham um domínio de núcleo de mananase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase, ou de xilanase, ou o núcleo e os domínios de articulação a partir das mesmas, fundido à seqüência de codificação de proteína desejada da invenção. O resultado é uma proteína que contém núcleo de mananase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase, ou de xilanase, ou as regiões de núcleo e articulação, e uma seqüência de celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou de proteína com CBD. A proteína de fusão contém tanto a mananase ou a celobiohidrolase ou a endoglicanase ou a xilanase, quanto as atividades de celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou da proteína com CBD dos diversos domínios conforme proporcionados na construção de fusão.

As proteínas de fusão podem também ser construídas de modo tal que a extremidade de mananase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase, ou de xilanase, ou um seu fragmento desejado, seja incluída, colocada antes da seqüência de celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou da proteína com CBD, especialmente de modo a permitir o uso de um sítio não específico de protease na extremidade como um sítio de protease, para a recuperação da sequência da celuiase de 50K, celulase de 20K, celuiase B de 50K ou da proteína com CBD a partir da proteína de fusão expressa. Alternativamente, as proteínas de fusão podem ser construídas de modo que proporcionem um sítio de protease em um ligador que seja colocado antes da sequência de celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou da proteína com CBD, com ou sem as sequências da extremidade.

Novas propriedades para as celulases de 20K e de 50K e para a celulase B de 50K podem ser criadas por fusão de domínios, tais como um domínio de ligação à celulose (CBD), preferivelmente com seu ligador, às proteínas da invenção. De preferência, tais CBD's e ligadores são o CBD e os domínios de ligador correspondentes de uma celulase, mananase de Tríchoderma, ou da proteína com CBD de Melanocarpus albomyces. A invenção proporciona métodos para a produção de preparações de enzimas que sejam parcial ou completamente deficientes em uma atividade celulolítica indesejável (ou seja, na capacidade de degradar a celulose), e enriquecidas na proteína de celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou da proteína com CBD, conforme desejado para a indústria têxtil ou de detergentes, ou para o processamento de polpa e papel. Por "deficiente na atividade celulolítica" é significado uma capacidade reduzida, diminuída ou reprimida de degradar a celulose em oligossacarídeos menores. Tais preparações deficientes em atividade celulolítica, e a fabricação das mesmas por métodos de DNA recombinante, são descritas na US 5.298.405, incorporada aqui por referência. De preferência, a preparação é deficiente em atividades de EG, e/ou atividade de CBH1.

Conforme descrito aqui, a celulase de 50K, a celulase de 20K, a celulase B de 50K ou a proteína com CBD pode ser proporcionada diretamente pelos hospedeiros da invenção. Alternativamente, o meio esgotado a partir do desenvolvimento dos hospedeiros, ou a celulase de 50K, a celulase de 20K, a celulase B de 50K ou a proteína com CBD purificada a partir dos mesmos, pode ser usada. Ademais, se as atividades desejadas estiverem presentes em mais do que um hospedeiro recombinante, tais preparações podem ser isoladas dos hospedeiros apropriados e combinadas antes do uso no método da invenção.

Para obter as preparações de enzima da invenção, os hospedeiros nativos ou recombinantes descritos acima, tendo as propriedades desejadas (ou seja, hospedeiros capazes de expressar economicamente quantidades viáveis da celulase de 50K, celulase de 20K, celulase B de 50K ou proteína com CBD desejada, e opcionalmente, aqueles que sejam substancialmente incapazes de expressar uma ou mais outras enzimas celulases não desejadas) são cultivados sob condições adequadas, as enzimas desejadas são secretadas a partir dos hospedeiros para o meio de cultivo, e a preparação de enzimas é recuperada a partir do dito meio de cultura por métodos conhecidos na técnica.

As preparações de enzimas da invenção podem ser produzidas por cultivo dos hospedeiros recombinantes ou cepas nativas em um fermentador, sobre um meio de desenvolvimento adequado (tal como, por exemplo, mostrado no Exemplo 1 ou no Exemplo 30). A preparação de enzimas pode ser o meio de cultura sem ou com as células hospedeiras nativas ou transformadas, ou é recuperada a partir do mesmo pela aplicação de métodos bem conhecidos na técnica. Entretanto, porque a celulase de 50K, a celulase de 20K ou a celulase B de 50 K são secretadas nos meios de cultura e mostram atividade nas condições ambientes do líquido celulolítico, é uma vantagem da invenção que as preparações de enzima da invenção possam ser utilizadas diretamente a partir do meio de cultura sem nenhuma purificação adicional. Se desejado, tais preparações podem ser liofilizadas ou a atividade enzimática de outra forma concentrada e/ou estabilizada para armazenagem. As preparações de enzima da invenção são muito econômicas de proporcionar e utilizar porque (1) as enzimas podem ser usadas em uma forma bruta; o isolamento de uma enzima específica do meio de cultura é desnecessário, e, (2) porque as enzimas são secretadas no meio de cultura, somente o meio de cultura precisa ser recuperado para obter a preparação de enzimas desejada; não há nenhuma necessidade de extrair uma enzima dos hospedeiros. De preferência, o hospedeiro para tal produção é o Tríchoderma, e especialmente o T. reesei.

As preparações de enzima da invenção podem ser proporcionadas como um líquido ou como um sólido, por exemplo, em uma forma de pó seco, ou granular, ou líquida, especialmente os grânulos de não pulverização, ou um líquido estabilizado, ou a preparação de enzimas pode ser, de outra forma, concentrada ou estabilizada para armazenagem ou uso. Imagina-se que as preparações de enzima, contendo uma ou mais das celulases neutras da invenção, possam ser adicional mente enriquecidas ou tornadas parcial ou completamente deficientes em atividades enzimáticas específicas, de modo a satisfazer as exigências de uma utilidade específica em diversas aplicações, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades de enzimas secretadas por um hospedeiro, e especialmente um fungo, pode ser escolhida ser vantajosa em uma aplicação industrial particular, por exemplo, o biotratamento com pedras.

As preparações de enzimas da invenção podem ser ajustadas para satisfazer as exigências de necessidades específicas em diversas aplicações na indústria têxtil, de detergentes ou de polpa e papel.

As combinações podem ser preparadas com outras macromoléculas que não sejam todas secretadas do mesmo hospedeiro (por exemplo, outras enzimas, tais como as endoglicanases, as proteases, as lipases, as peroxidases, as oxidases ou as amilases), ou substâncias químicas que possam aumentar o desempenho, a estabilidade, ou o tamponamento da preparação de enzimas desejada. Os grânulos de não pulverização podem ser revestidos. As preparações de enzimas líquidas podem ser estabilizadas por adição de um poliol, tal como o propileno glicol, um açúcar ou o álcool de açúcar, o ácido lático ou o ácido bórico, de acordo com métodos estabelecidos. Os detergentes líquidos geralmente contêm até 90% de água e 0-20% de solvente orgânico. As formas protegidas das enzimas da invenção podem ser preparadas conforme descrito na EP 238.216.

As preparações de enzimas da invenção podem conter um tensoativo, o qual pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfotérico ou uma mistura destes tipos, especialmente quando usadas como uma composição detergente. As composições detergentes úteis são descritas, por exemplo, na WO 94/07998, na Patente U.S. Na 5,443.750 e na Patente U.S. Ns 3.664.961.

Se requerido, uma enzima desejada pode ser adicional mente purificada de acordo com as condições convencionais, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia por afinidade, eletroforese, ou similares.

As preparações de enzimas desta invenção são especialmente úteis na indústria têxtil, preferivelmente na indústria de biotratamento com pedras e na de bioacabamento, ou na de detergentes. As outras áreas úteis são na indústria de polpa e papel. A lavagem com pedras não enzimática tem três etapas: desengomagem, desgaste e pós-tratamento. A primeira etapa, a desengomagem, envolve a remoção do revestimento de amido, ou daquele de seus derivados, por amilases. A segunda etapa, o desgaste, quando efetuada sem celulase, é geralmente realizada por lavagem do brim com pedras-pome, e, quando o branqueamento for desejado, alvejante. O efeito de desgaste é o resultado não somente do efeito das pedras, como também da esfregação junto do tecido de brim. O desgaste é geralmente seguido pela terceira etapa, uma etapa de lavagem para remover o corante em excesso, durante a qual podem ser adicionados os amaciantes ou os avivadores óticos.

Na lavagem com pedras enzimática, ou biotratamento com pedras, o desgaste com pedras-pome é completa ou parcialmente eliminado e a celulase é adicionada para facilitar o desgaste do corante índigo da superfície da fibra. Após este tratamento, a celulase é removida através de uma lavagem com detergente, para assegurar que a resistência mecânica da fibra não seja adicionalmente comprometida pela presença continuada da enzima. O tratamento com (uma) celulase(s) pode completamente substituir o tratamento com as pedras-pome (por exemplo, 1 kg de enzima comercial por 100 kg de pedras). Entretanto, o tratamento com celulase pode ser combinado com o tratamento com pedras-pome quando for desejado produzir uma acabamento fortemente desgastado. Um efeito de revestimento de cor de pêssego, no qual uma fina cobertura semelhante ao pêlo, saliente, é criada, é também obtido por uma combinação por lavagem de uma celulase neutra com as pedras-pome. As celulases desta invenção são úteis especialmente para minimizar a coloração de volta e intensificar o branqueamento (desgaste) no biotratamento com pedras. O biotratamento com pedras é preferivelmente efetuado de cerca de pH 4,5-9,5, e mais preferivelmente entre pH 6,0-8,5. A temperatura da reação pode variar de cerca de 40-80°C, preferivelmente entre 50-70°C, e mais preferivelmente entre 50-60°C. A razão de liquido (a razão do volume de líquido por peso de tecido) pode variar de cerca de 2:1 - 20:1, preferivelmente 4:1 -10:1, e mais preferivelmente 4:1 - 7:1. A dosagem de enzima pode variar de cerca de 25-1500 nkat/g de tecido, preferivelmente 50-500 nkat/g de tecido e mais preferivelmente 75-300 nkat/g de tecido.

As celulases da invenção são úteis na indústria têxtil para o bio-acabamento de tecidos ou roupas, por exemplo, o impedimento de formação de bolas, a não formação de felpo, a clarificação da cor, a redução da aspereza, a criação de diferentes acabamentos (por exemplo, um efeito de 'revestimento de cor de pêssego', de 'usado', de 'lavado com pedras' ou de 'aspecto antigo'), e o bio-acabamento do fio (por exemplo, a redução da pilosidade, aperfeiçoamento da maciez). As celulases desta invenção podem ser usadas no bio-acabamento nas condições acídicas e nas neutras.

As celulases desta invenção são úteis nas composições , detergentes para aperfeiçoar o efeito de limpeza dos produtos têxteis, por exemplo, a remoção de sujeiras, para aperfeiçoar as propriedades de cuidado com o tecido por redução da aspereza dos produtos têxteis, as celulases tendo também efeitos de impedimento de formação de felpo e de clarificação da cor e de restauração. O material têxtil que é tratado com as preparações de enzimas da invenção pode ser fabricado de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose feitas pelo homem, ou de suas misturas. Os exemplos de celulósicos naturais são o algodão, o linho, o cânhamo, a juta e o rami. Os exemplos de celulósicos feitos pelo homem são a viscose, o acetato de celulose, o triacetato de celulose, o raiom, o "cupro" e o "lyocell". Os celulósicos acima mencionados podem também ser empregados como combinações de fibras sintéticas, tais como o poliéster, a poliamida ou as fibras acrílicas. O material têxtil pode ser um fio, ou tricotado, ou tecido, ou formado por outro meio.

As celulases da invenção, além de serem especialmente úteis para o tratamento de tecido, são úteis, em geral, em qualquer área que requeira atividade de celulase. Na indústria de polpa e papel, as celulases neutras podem ser usadas, por exemplo, na retirada de tinta de diferentes papéis e papelões reciclados tendo pH neutro ou alcalino, no aperfeiçoamento da qualidade da fibra, ou no aumento da drenagem na fabricação de papéis. Os outros exemplos incluem a remoção do espessante de pasta de estampagem e do corante em excesso após a estampagem têxtil, e como um tratamento para o alimento de animais. Por exemplo, se a aplicação pretendida for o aperfeiçoamento da resistência da polpa mecânica, então as preparações de celulase de 50k, de celulase de 20K, de celulase B de 50K ou da proteína com CBD da invenção podem proporcionar uma ou mais destas proteínas, de modo a aumentar ou facilitar a capacidade das fibras de celulose de se ligarem juntas. Em uma forma similar, na aplicação de refino de polpa, as preparações de celulase de 50k, de celulase de 20K, de celulase B de 50K ou da proteína com CBD da invenção podem proporcionar uma ou mais destas proteínas em um nível que aumente ou facilite tal intumescimento. A invenção é descrita em mais detalhe nos seguintes exemplos. Estes exemplos mostram somente algumas aplicações concretas da invenção. É auto-evidente para alguém versado na técnica criar diversas aplicações similares. Por conseguinte, os exemplos não devem ser interpretados para estreitar o escopo da invenção, somente para clarificar o uso da invenção.

Exemplos Exemplo 1 Cultivos em Frasco com Agitação e em Fermentador Para a conservação, as cepas ALK04179, ALK04124, ALK04237, ALK04265 e ALK04125 foram riscadas sobre ágar de esporulação (meio de ATCC 5, American Type Culture Collection ("Coleta de Cultura do Tipo Americano"), Catálogo de Fungos Filamentosos, 18a edição, eds., S.C. Jong e M.J, Edwards, (1991): 1 litro contém 1 g de extrato de levedura, 1 g de extrato de carne de boi, 2 g de triptose, uma quantidade em traço de FeS04, 10 g de glicose e 15 g de ágar; o pH era 7,2. As inclinações de ágar foram incubadas a 45° por 3-6 dias.

Para os testes de aplicações de ALK04237 (Exemplos 3 e 4), uma colônia foi inoculada em 500 ml do seguinte meio mineral (Moloney, A.P. e col., Biotechnol, Bioeng. 25:1169 (1983)): 1 litro contém 15 g de KH2P04, 15 g de (NH4)2S04, 2,4 ml de MgSCXptfFfeO a 1 M, 5,4 ml de CaCI2 a 1 M, 20 g de flóculo Solka, 15 g de pó de maceração de milho, 1 g de extrato de levedura e 10 ml de 100 x solução de elemento em traço 1, onde 1 litro de 100 x solução de elemento em traço 1 contém 0,5 g de FeS04x7H20, 0,156 g de MnSO^HzO, 0,14 g de ZnSO^HaO e 0,49 g de CoSO^FkO; o pH foi ajustado para pH 6,5. O cultivo foi efetuado a 45°C por 3 dias em um agitador rotativo (250 rpm). A atividade de endoglicanase de cerca de 20-25 nkat/ml foi obtida. A atividade de celulase foi rotineiramente medida como atividade de endoglicanase, de acordo com Bailey, M.J. e col., Enzyme Microb. Technol. 3:153 (1981), usando-se hidroxietilcelulose a 1% (p/v), HEC (Fluka AG #54290) como um substrato. As condições do ensaio eram, se não estabelecido de outra forma, pH 7,0 e 50°C, com um tempo de reação de 10 minutos. Uma unidade de endoglicanase (1 nkat = 1 ECU) é definida como a quantidade de enzima que produz carboidratos de redução tendo um poder de redução correspondendo a um nanomol de glicose, em um segundo, a partir de HEC, sob as condições de ensaio. Entretanto, com as enzimas purificadas descritas nos Exemplos 9-12, as condições de ensaio de Bailey e col., Enzyme Microb. Technol. 3:153 (1981) excederam a faixa linear, e o ensaio foi, portanto, modificado conforme descrito no Exemplo 10. Com cada cepa, o ensaio da atividade em papel de filtro (que mede a hidrólise total de celulose e indica a presença de atividade de celobiohidrolase) estava sob o limite de detecção seguro ou era muito baixo.

Para a determinação da dependência de pH e de temperatura (Exemplo 2), bem como para os testes de aplicação das cepas ALK04179, ALK04124, ALK04265 e ALK04125 (Exemplos 3 e 4), as colônias foram inoculadas em 500 ml do termomeio B modificado (G. Szakacs, Technical Uníversity of Budapest, Hungria): 1 litro continha 6 g de flóculo Solka, 6 g de grão de trigo esgotado do destilador, 3 g de xilano de espelta de aveia, 2 g de CaC02, 1,5 g de farinha grossa de soja, 1,5 g de (NH4)2HP04, 1 g de farelo de cevada, 0,5 g de KH2P04, 0,5 g de MgSO^HaO, 0,5 g de NaCI, 0,5 ml de solução de elemento em traço 1 (1 litro contém: 1,6 g de MnS02, 3,45 g de ZnSCXtxTHaO, e 2,0 g de CoCUxeHaO) e 0,5 ml de solução de elemento em traço 2 (1 litro contém: 5,0 g de FeS04x7H20 e duas gotas de H2S04 concentrado); o pH foi ajustado para pH 6,5. Os cultivos foram efetuados a 45°C por 3 dias em um agitador rotativo (250 rpm). Por causa do termomeio B, as atividades de endoglicanase das cepas ALK04179, ALK04124, e ALK04237 foram cerca de 5 nkat/ml, os filtrados das culturas foram concentrados cerca de 10 vezes em um concentrador Amicon usando um corte de 30 kDa. A atividade de endoglicanase obtida com ALKO 4265 foi cerca de 20 nkat/ml e com ALKO 4125 30-40 nkat/ml. O cultivo no fermentador de 1 litro de ALK04179 foi efetuado no seguinte meio: 1 litro continha 10 g de flóculo Solka, 3 g de celobiose, 4 g de pó de maceração de milho, 1,5 g de (NH4)2P04, 0,3 g de MgSO^^O, 0,5 g de NaCI, 2 g de CaC03, 0,5 ml de solução de elemento em traço 1 e 0,5 ml de solução de elemento em traço 2, 0,5 g de KN03, 0,3 g de CaCI2, 1 g de Tween 80; o pH foi ajustado para pH 6,5. O cultivo no fermentador de 1 litro de ALK04124 foi efetuado no termomeio B modificado: 1 litro continha: 10 g de flóculo Solka, 1 g de xilano de Roth, 40 g de soro de leite, 40 g de farinha grossa de soja, 2 g de CaC03, 5 g de (NH4)2S04, 0,5 g de KH2P04, 1,0 g de MgS04x7H20, 1,0 g de NaCI, 1 g de antiespuma, 0,5 ml de solução de elemento em traço 1 e 0,5 ml de solução de elemento em traço 2. O cultivo no fermentador de 1 litro de ALK04237 foi efetuado no meio mineral mencionado acima. Inóculo a 10% (v/v) foi usado. O pH foi mantido em pH 6,5 ± 0,4 pela adição de amônia [12,5% (v/v)] e ácido fosfórico [17% (v/v)]. A temperatura de fermentação era 45°C. O fermentador (Biostat Μ, B. Braun, Melsungen, Alemanha) foi agitado à 400 rpm e o fluxo de ar como 1 vvm. As atividades de endoglicanase obtidas eram as seguintes: ALK04179 cerca de 40 nkat/mi, ALK04124 cerca de 90 nkat/ml e ALK04237 cerca de 30 nkat/ml. O ALK04265 e o ALK04125 não foram cultivados em um fermentador. ALK04179, ALK04124, ALK04237 e ALK04125 foram cultivados em um fermentador piloto de 100 litros nos meios e nas condições descritos acima. As atividades de endoglicanase obtidas foram cerca de 40 nkat/m com ALK04179 e ALK04237, cerca de 90 nkat/ml com ALK04124 e cerca de 100 nkat/ml com ALK04125. Os filtrados das culturas foram concentrados 10-20 vezes em um ultra filtro Millipore PUF100 e um concentrador de cassete Pellicon Us usando um corte de 10 kDa.

Exemplo 2 Determinação da dependência do pH e da temperatura das atividades de endoglicanase nos filtrados das culturas Para a determinação da dependência de pH e temperatura, as cepas ALK04179, ALK04124, ALK04237, ALK04265 e ALK04125 foram desenvolvidas no termomeio B modificado. As amostras dos cultivos no frasco com agitação (filtrados das culturas) foram diluídas em tampões de Mcllvain a 50 mM (ácido cítrico a 50 mM-Na2HP04 a 100 mM) de faixa de pH 4,5-8,5. Os valores finais do pH das misturas de tampões com filtrados da cultura era, 4,3, 5,4, 6,3, 7,3, 8,1 e 8,7 para a cepa ALK04179; 4,3, 5,4, 6,4, 7.3, 8,1 e 8,5 para a cepa ALK04124; 4,4, 5,3, 6,2, 7,1, 8,0 e 8,5 para a cepa ALK04237; 4,3, 5,4, 6,3, 7,2, 8,1 e 8,5 para a cepa ALK04265 e 4,3, 5.4, 6,4, 7,3, 8,1 e 8,5 para a cepa ALK04125. O BSA foi adicionado como um carreador de proteína até a concentração de 100 pg/ml. A pepstatina A e o fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) foram adicionados como inibidores de protease a 10 pg/ml e 174 pg/ml, respectivamente. A atividade de endoglicanase foi medida em cada pH a 50°C, com tempo de reação de 60 minutos. A atividade de endoglicanase de ALK04179 exibiu mais do que 90% de seu máximo na faixa de pH de cerca de 4,5-7,5, a atividade máxima foi detectada em pH 5,4-6,3 (Figura 1A). A atividade de endoglicanase de ALK04124 exibiu mais do que 80% de sua atividade máxima na faixa de pH de cerca de 5,5-7,5, a atividade máxima foi detectada em torno de pH 6,4 (Figura 2A). A atividade de endoglicanase de ALK04265 exibiu mais do que 80% de sua atividade na faixa de pH de cerca de 4,5-7,0, a atividade máxima foi detectada em torno de pH 5,5-6,5 (Figura 4A). A atividade de endoglicanase de ALK04237 exibiu mais do que 80% de sua atividade na faixa de pH de cerca de 4,5-6,0, a atividade máxima foi detectada em torno de pH 5,3 (Figura 3A). A atividade de endoglicanase de ALK04125 exibiu cerca de 90% de seu máximo na faixa de pH de cerca de 4,5-7,5, a atividade máxima foi detectada em torno de pH 6,5 (Figura 5A).

Para a determinação da dependência da temperatura da atividade de endoglicanase, as amostras dos filtrados das culturas foram diluídas em tampão de Mcllvain à 50 mM, pH 7,0, O BSA foi adicionado como um carreador de proteína até a concentração de 100 pg/ml. A pepstatina A e o fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) foram adicionados como inibidores de protease para 10 pg/ml e 174 pg/ml, respectivamente. Os valores finais do pH das misturas de tampões com filtrados das culturas eram 7,3 (ALK04179, ALK04124, e ALK04125) e 7,2 (ALK04237 e ALK04265). As amostras foram incubadas a 40°C, 50°C e 60°C por 60 minutos. A atividade de endoglicanase máxima de ALK04179 foi detectada a 50°C e 60°C, cerca de 30% da atividade foi mantida a 40°C (Figura 1B). A atividade de endoglicanase máxima de ALK04124 foi detectada à 60°C, cerca de 70% da atividade foi mantida a 50°C e 30% a 40°C (Figura 2B). A atividade de endoglicanase máxima de ALK04237 foi detectada a 60°C, cerca de 60% da atividade foi mantida a 50°C e 40% a 40°C (Figura 3B). A atividade de endoglicanase máxima de ALK04265 foi detectada a 60°C, cerca de 50% da atividade foi mantida a 50°C e 30% a 40°C (Figura 4B). A atividade de endoglicanase máxima de ALK04125 foi detectada à 60°C, cerca de 80% da atividade foi mantida a 50°C e 70% a 40°C (Figura 5B). Exemplo 3 Liberação do Corante índigo nas Condições Neutras As preparações de celulase derivadas das cepas ALK04179, ALK04124, ALK04237, ALK04265 e ALK04125 (Exemplos 1 e 2) foram testadas quanto à sua capacidade de liberar o corante, nas condições neutras, a partir de tecido de brim contendo algodão tingido com índigo para proporcionar um aspecto de lavado com pedras. O produto de celulase ácida comercial Ecostone L (Primalco Ltd, Biotec, Finlândia) foi usado como um controle. O tecido de brim foi obtido da Lauffenmuehl (Alemanha). O tecido de teste foi pré-lavado 10 min. a 60°C com Ecostone A 200 (1 ml/litro, Primalco Ltd, Biotec, Finlândia). O tecido foi então cortado em amostras de 12x12 cm. A cor de ambos os lados das amostras de tecido foi medida como valores de reflecância com o sistema Medidor de Intensidade da Cor CM 1000R L*a*b* da Minolta (Osaka, Japão).

Os tratamentos com celulase foram efetuados no Launder-Ometer LP-2 (Atlas, Illinois, EUA) como segue. Cerca de 7 g de amostras de brim foram carregados para o recipiente de 1,2 litro que continha 200 ml de tampão de citrato/fosfato à 0,05 M em pH 7, ou, tampão de citrato à 0,05 M em pH 5,2. 0,06 ml de Berol 08 à 10% (Berol Nobel AS, Suécia) foi adicionado como um tensoativo.

Uma quantidade de esferas de aço foi adicionada em cada recipiente para auxiliar na remoção da fibra. Finalmente, as soluções de celulase foram adicionadas ao recipiente como unidades de atividade de endoglicanase (Exemplo 1). Os recipientes foram então fechados e carregados para um banho de Launder-Ometer à 50°C. O Launder-Ometer foi corrido a 42 rpm por 2 horas.

Após a remoção das amostras dos recipientes, elas foram embebidas por 10 min em 200 ml de NaOH à 0,01, e enxaguadas por 10 min com água gelada. As amostras foram então secas por 1 hora à 105°C e secas ao ar durante a noite. A cor de ambos os lados das amostras foi medida com o Medidor de Intensidade da Cor da Minolta. Os resultados das medições da cor dos tecidos de brim tratados são mostrados na Tabela I. Tabela I. Medição da Cor de Tecidos de Brim Tratados com Diferentes Preparações de Celulase Tabela I - continuação _____________________________________________ Para comparar o aspecto final dos tecidos de brim após a lavagem com as diferentes preparações de celulases, a cor de ambos os lados (avesso e lado direito) foi medida. A partir dos resultados mostrados na Tabela I, pode ser visto que as unidades de branqueamento e de pigmentação azul são claramente aumentadas sobre o lado direito das roupas lavadas com as preparações de celulases ALK04179, ALK04124, ALK04237 e ALK04125, mostrando um bom efeito de lavado com pedras. A unidade de pigmentação azul foi também aumentada sobre o lado direito do tecido lavado com a preparação de ALK04265, porém não houve nenhum aumento na unidade de branqueamento. Isto é provavelmente porque a enzima não funciona neste pH, porém ao mesmo tempo causa muita coloração de volta. Não houve nenhum efeito de lavagem com pedras sobre o tecido com o produto ácido comercial Ecostone L em pH 7, nesta atividade de ECU.

Neste estudo, a coloração de volta sobre o avesso do tecido é usada como uma indicação do grau de coloração de volta sobre o lado direito do tecido. Para quantificar o nível de coloração de volta, a cor foi medida sobre o avesso do tecido antes e após o tratamento com a celulase. Conforme mostrado na Tabela I, quando as quantidades de ECU são as mesmas, não houve praticamente nenhuma coloração de volta nos tecidos tratados com as preparações de ALK04179, ALK04124, ALK04237 e ALK04125 quando comparados aos tecidos tratados com as preparações de ALK04265 e Ecostone L (pH 5,2 e 7).

Exemplo 4 Liberação do Corante em Condições Neutras, Sem Berol A determinação experimental foi conforme descrita no Exemplo 3, exceto que nenhum Berol foi usado. Os resultados a partir das medições de cor dos tecidos de brim tratados são mostrados na Tabela II.

Tabela II. Medição da Cor de Tecidos de Brim Tratados com Diferentes Preparações de Celulase - sem Berol continuação da tabela !1 _____________________________________________ Quando comparados com os resultados obtidos com a inclusão de Berol (Exemplo 3), os dados na Tabela II mostram que quase o mesmo efeito de lavagem com pedras pode ser obtido com as preparações de celulase de ALK04179, ALK04124, ALK04237 e ALK04125 na ausência do agente auxiliar Berol.

Exemplo 5 Coloração de volta na lavagem do brim com diferentes celulases Na literatura, é descrito que a coloração de volta é dependente do pH e/ou do tipo de enzima. Entretanto, conforme mostrado aqui, foi verificado que a coloração de volta depende somente indiretamente do pH (Figuras 6A e 6B e 7A e 7B).

Duas preparações de celulase neutra a partir de ALK04237 e a partir de ALK04265 e o produto de celulase ácida Ecostone L foram estudados na lavagem de brim em pequena escala com uma dosagem igual de enzima em pH 5 e pH 7. 0 efeito de lavagem com pedras foi determinado por medição do aumento do branqueamento e da pigmentação azul como unidades de reflecância sobre o lado direito do tecido, e a coloração de volta (deposição novamente de índigo sobre a superfície das fibras) foi determinada como o aumento da pigmentação azul e a diminuição do branqueamento sobre o avesso. Em pH 7, as celulases neutras a partir de ALK04237 causaram um claro aumento na pigmentação azul e no branqueamento sobre o lado direito, e nenhuma coloração de volta foi observada (Figuras 6A e 6B). Um efeito de lavagem com pedras similar foi verificado em pH 5, porém com uma ligeira coloração de volta. Em pH 7, a outra celulase neutra, ALK04265, avivou a pigmentação azul sobre o lado direito, porém coloriu de volta intensivamente sobre o avesso. Em pH 5, efeitos similares foram obtidos com ambas as preparações de ALK04265 e ALK04237. Em pH 7, a celulase ácida não coloriu de volta ou conferiu um branqueamento sobre o lado direito (quando usando-se dosagens similares de atividade de endoglicanase, como com o ALK04265 e o ALK04237, Figuras 7A e 7B, 1 x dosagem), provavelmente porque ela não funciona neste pH. Por outro lado, em pH 5, o branqueamento e a pigmentação azul foram aumentados sobre o lado direito e a coloração de volta estava claramente perceptível sobre o avesso. Com base nestes resultados, a coloração de volta pode ocorrer em ambos os valores de pH, dependendo da preparação de celulase usada.

Exemplo 6 Uso das Preparações de Enzimas Contendo Celulases Neutras no Bio~ Acabamento de Tecido Urdido Contendo Algodão O tecido urdido com 100% de algodão foi submetido ao tratamento com as celulases de ALK04237 (Exemplo 1) e ALK04467 no Launder-Ometer. O ALK04467 é um mutante por UV com maior atividade de celulase derivado de ALK04125. O tecido urdido com 100% de algodão (obtido da Pirkanmaan Uusi Várjããmõ Ltd) foi pré-tratado como no Exemplo 7. As condições de tratamento com celulase eram conforme descritas no Exemplo 3, exceto que •nenhum Berol foi usado e que a razão de líquido era 1:15 (volume de líquido por peso de tecido). As celulases foram dosadas como unidades de atividade de ECU (Exemplo 1).

Os seguintes métodos foram usados para a avaliação do efeito das preparações de enzimas no bio-acabamento do tecido de algodão: A perda de peso dos tecidos tratados foi definida como a percentagem a partir do peso do tecido antes e após o teste (antes de pesar, os tecidos foram condicionados em uma atmosfera de 21+2°C e 50+5% de UR). A avaliação do efeito de limpeza da superfície dos tecidos tratados com a enzima foi efetuada por um júri consistindo em três pessoas. Os tecidos foram classificados em uma classificação de 1 a 5, onde 5 proporcionou uma superfície limpa. O método de Esfregação de Martindale (SFS-4328) foi usado para a avaliação de formação de bolas. A formação de bolas foi avaliada por um júri após 200 e 2000 ciclos de desgaste (1 = muitas bolas, 5 = nenhuma bola).

Na Tabela III é mostrado que o tratamento do tecido de algodão com as preparações de celulase de ALK04237 e ALK04467 resulta em uma boa limpeza da superfície e em uma redução acentuada na tendência à formação de bolas em ambos os pH's 5 e 7.

Tabela III. Perda de peso, efeito da limpeza da superfície e tendência à formação de bolas dos tecidos de algodão tratados com as celulases neutras no Launder-Ometer. ο *2 § Q Ο OD CD t Tj-_ Ο Τ- CO 0D Φ 0_ ΙΟ Ο CO Τ- Ο CM JD τ-" <θ" CO~ CO CO τ— Tf" Tf" CO Ο τ-" CO CO CO CO r~ Tf" Φ XJ

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Exemplo 7 Uso das Preparações de Enzimas Contendo Ceiulases Neutras da Invenção no Bio-Acabamento 7a. Uso das preparações de enzimas no bio-acabamento de tecido urdido e malha.

Um tecido urdido com 100% de algodão ou uma malha com 100% de algodão é submetido ao tratamento com as ceiulases da invenção (Exemplo 1), em uma lavadora com tambor, semi-industrial (Esteri 20 HS-P). As condições de tratamento são como seguem; A. Pré-tratamento (somente para os tecidos urdidos) 60°C, 10 minutos, Ecostone A200 (Primalco Ltd, Biotec, Finlândia) 1 ml/l de água. B. Tratamento com a enzima temperatura de 50-6Q°C, pH 7; razão de líquido de 5-20:1 (volume de líquido por peso de tecido); tempo de tratamento de 20-90 minutos, preferivelmente 30-60 minutos; e dosagem da enzima de 50-900 nkat/g de tecido ou malha, preferivelmente 200-600 nkat/g de tecido ou malha. C. Tratamento "Após a Lavagem" 40°C, 10 minutos, detergente alcalino D. Tratamento de Secagem Os seguintes métodos padrão são usados para a avaliação do efeito de limpeza da superfície das preparações de enzimas; Método de Esfregação de Martindale (SFS-4328) e o Teste da Durabilidade da Lavagem de Roupas (SFS-3378), O tratamento com as preparações de celulase da invenção resulta em um efeito de limpeza da superfície, em um aperfeiçoamento na maciez e na suavidade do tecido e da malha, e em uma redução na tendência à formação de bolas. 7b. Uso das preparações de enzimas no acabamento de tecidos e malhas de "lyoceir.

As preparações de celulase da invenção podem ser usadas no controle da fibrilação e nos diferentes processos de acabamentos de tecidos e malhas com 100% de "lyocell" e as suas combinações. As seguintes condições de tratamento em uma lavadora com tambor, semi-industrial (Esteri 20 HS-P), são usadas a fim de criar o efeito de cor de pêssego sobre o tecido de "lyocell": A. 2,5 g/l de carbonato de sódio; 60°C, tempo de tratamento de 60 minutos; B. Enxaguadura; C. Tratamento com enzima: temperatura de 50-60°C, pH 7, razão de líquido de 5-20:1, tempo de tratamento de 40-120 minutos, preferivelmente 45-90 minutos, e uma dosagem de enzima de 100-1500 nkat/g de tecido, preferivelmente 400-800 nkat/g de tecido; D. Pós-tratamento: Lavagem com detergente alcalino a 40°C por 10 minutos; E. Enxaguadura; e F. Secagem. O resultado é um efeito de revestimento de cor de pêssego.

Exemplo 8 Uso das Preparações de Enzimas no Biotratamento com pedras As roupas de brim foram submetidas ao tratamento com as preparações de celulase neutra (Exemplo 1) em uma lavadora com tambor, semi-industrial (Esteri 20 HS-P), para dar às roupas um aspecto de lavadas com pedras. Cerca de 1,0 kg de roupas de brim (continham dois tipos diferentes de tecido) foi usado por carga da máquina.

As condições de tratamento eram como seguem: A. Desengomagem. 100 litros de água, 60°C, 10 minutos; 100 ml de Ecostone A200 (Primalco Ltd, Biotec, Finlândia). B. Tratamento com Celulase. 100 litros de água, 50°C, 45 minutos; 10 g de Berol 08 (Berol Nobel AS, Suécia); 30 g de ácido cítrico + 128 g de Na2HP04 x 2 H20 para proporcionar um pH 7.

As preparações de celulase neutra foram dosadas como unidades de atividade de endoglicanase (ECU, Exemplo 1): 1. ALK04237, 260 ECU/g de peça de roupa 2. ALK04179, 260 ECU/g de peça de roupa 3. ALK04124, 300 ECU/g de peça de roupa 4. ALK04125, 250 ECU/g de peça de roupa C. Pós-lavagem. Lavagem com detergente alcalino, 40°C, 10 minutos. D. Secagem.

Os resultados foram avaliados por aspecto visual das roupas, e por medição da cor como valores de reflecância com o sistema Medidor de Intensidade da Cor CM 1000R L*a*b da Minolta (Tabela IV). Um bom efeito de lavado com pedras foi obtido com todas estas roupas tratadas com celulase. Nenhuma coloração de volta (examinada sobre o lado de dentro da peça de roupa) pode ser vista visualmente em quaisquer destas peças de roupas tratadas com celulase. A partir dos resultados das medições da cor mostradas na Tabela IV, pode ser visto que as unidades de branqueamento e pigmentação azul são claramente aumentadas sobre o lado de fora das peças de roupas lavadas com as preparações de celulase neutra, mostrando um bom efeito de lavadas com pedras.

Tabela IV. Medição da Cor das Roupas de Brim com Diferentes Preparações de Celulase Tabela IV - continuação_______________________________________________ L = Unidade de branqueamento da peça de roupa após o tratamento (quanto maior o valor, mais clara a peça de roupa), b = Unidade de pigmentação azul após o tratamento (quanto mais negativo o valor, mais pigmentação azul na peça de roupa).

Exemplo 9 Purificação das Celulases Neutras O meio de desenvolvimento concentrado a partir de ALK04237 foi fracionado a 7°C sobre DEAE Sepharose CL6B com um gradiente linear de NaCI de zero a 0,5 M em Tris/HCI a 25 mM, pH 7,2. Quatro picos de atividade de endoglicanase em pH 4,8 foram encontrados. O Pico I, contendo cerca de 10 % da ECU recuperada, eluiu em NaCI à cerca de 150 mM, o Pico II (cerca e 30 % de ECU) em NaCI a 230 mM, o Pico III (cerca de 20% de ECU) em NaCI a 270 mM e o Pico IV (cerca de 40 % de ECU) em NaCI à 320 mM. A Tabela V mostra os resultados quando estes picos foram testados quanto a sua utilidade no biotratamento com pedras em pH neutro e 50°C.

Estes resultados mostram que tanto em uma base de ECU quanto em uma base de proteína total, o Pico II era mais efetivo do que qualquer outro pico ou do que o concentrado não-fracionado. Uma mistura dos Picos I e II contendo 70 ECU de cada/g de brim foi também testada. Isto resultou em um valor de L (direito) de 7,3 e b (avesso) de 2,5. Assim, esta mistura era mais efetiva do que qualquer pico sozinho. O procedimento de purificação foi escalonado para obter amostras homogêneas de algumas das proteínas desejadas nestes picos. 0 meio de desenvolvimento de ALK04237 concentrado (4,5 litros) foi fracionado com sulfato de amônio. As proteínas que se precipitaram entre 17 g e 42 g de sulfato de amônio por 100 ml de concentrado foram suspensas em 0,9 litro de Tris/HCI a 25 mM, pH 7,2, contendo EDTA a 0,25 mM, e então diluídas com água até uma condutividade de 4 mS/cm, e ajustadas com NaOH a 1M para pH 8,0. A solução resultante (cerca de 45 litros) foi bombeada a 150 ml/min através de uma coluna de 6,3 litros de DEAE-Sepharose FF® à temperatura ambiente. A atividade de endoglicanase no Pico I não se ligou sob estas condições. As proteínas ligadas foram eluídas à 110 ml/min com um gradiente linear de NaCI de 0,0 até 0,5 M, em 20 litros de Tris/HCI a 25 mM, pH 7,7, contendo EDTA à 0,25 mM. A endoglicanase no Pico II eluiu em torno de 14 mS/cm. Em vez dos Picos III e IV separados, vistos com as preparações em pequena escala em DEAE no espaço frio, um pico único, chamado Pico lll/IV, eluiu em torno de 25 mS/cm. ο Φ õ > ό υ í | -5 k ® ■§ 8 | σ- -ο V) Ο ® ιφ *Ρ 2 I 5 Π 3 2 ο | ° ® c a ω Ζ c ο ο 5δ (/) C ο ο> (1) Ο) Ο φ τ— '8, '0-0 0 Γ .ϊί _ Χ3 -Ο W Τ3 ® S (0 Ό Λ ο S I S φ ε ^ 32 /ι Ο Ο k c c ο 4= η xj £ '© — <η ® 3* c 2 ® -σ @Φ ω φ I rv: ° δ ε γ-- c -C λ 3 ο φ Cl -Ο J c > Ο (¾ Φ & I I α LLI ω φ D -σ 5 8 I σ I g ° ε ? 2 φ „ ω ·! φ 8 g 2 8 ο § φ ο: 8 '& ο 5 co ΐδ 2 a 2 ο ο I g £ φ C ο. ε ο F XJ ο ο ^ £ _ ό φ <3 F δ τϊ S m s 1 » s * ο " : ® ο — c r5 tj Φ η Β ο ^ Ο) ο 2 ο V S 3 ~ ® '0 8 Q m ? Ε φ % L- ω J= φ Ζ. φ ° φ ® ο 8 >, ε -S 2. Ε ο C (Τ ^ V- |s^ ο 2 £ φ 2 τ- ο br G3 ±ί C 31 ϋ ο k ο ο Q- c ο ° φ - 5= « ■ο Φ -D 3 i % Ο φ Ο Õ ο Φ 6 -Ό ,§ C Ο £ m C ο, ϊ5 — Φ 2 φ <2 '© Ο Φ θ' Ο Φ Φ 2 3 ! 8 I I '1 > Η- φ ο == φ 2 _ι hd « S φ •φ 2 ο m ο ο Η φ I | φ ^ S w <2 Ο to Ο- Φ Φ Φ φ Ο φ 1 § Ê As proteínas no Pico II (3,5 litros) foram precipitadas com sulfato de amônio (450 g/litro) e suspensas em 170 ml de PIPES/KOH a 25 mM, pH 6,0, contendo EDTA a 1 mM. As porções deste material foram transferidas para acetato de sódio a 25 mM, pH 4,0, contendo EDTA a 1 mM, por filtração em gel sobre uma coluna de 5 x 29 cm de G25 Sephadex® (grosseira), e então fracionadas sobre SP-Sepharose® A Figura 8 mostra o resultado que foi obtido quando 11,7 g destas proteínas foram aplicados a uma coluna de 4,5 x 31 cm de SP-Sepharose® em acetato de sódio a 25 mM, pH 4,0,contendo EDTA a 1 mM em 150 ml/h, e a coluna desenvolveu-se a 75 ml/h com um gradiente linear de NaCI de 0,0 à 0,4 M em 3,4 litros do mesmo tampão. A maior parte da endoglicanase eluiu em NaCI à 0,2 M. O ensaio modificado descrito no Exemplo 10 foi usado. Quando as frações ativas foram armazenadas a 7°C, um precipitado cristalino surgiu nelas e continha quase toda a atividade de endoglicanase. As frações ativas (15 ml), nas quais a cristalização era lenta, foram induzidas para formar cristais por semeadura com 30 μΙ de suspensão de frações já contendo os cristais. Após 2 a 3 dias, os cristais foram coletados por centrifugação, lavados com PIPES/KOH a 25 mM, pH 6,0, contendo EDTA a 1 mM, e dissolvidos em Tris/HCI a 25 mM, pH 7,2, contendo EDTA a 0,25 mM. A análise por SDS-PAGE mostrou que os cristais lavados continham uma proteína virtualmente homogênea, com uma massa molecular aparente próxima a 20 kDa (o erro nas estimativas de SDS-PAGE da massa molecular é pelo menos ± 10%, e pode ser muito maior para as proteínas não usuais). Esta proteína é chamada a celulase de 20K. A proteína de contaminação podería também ser removida por filtração em gel sobre G50 Sephadex® em PIPES/KOH a 50 mM, pH 6,0, contendo EDTA a 1 mM. Um exemplo disto é mostrado na Figura 9, onde os cristais não lavados foram purificados por filtração em gel. A atividade de endoglicanase co-eluiu com a proteína de 20 kDa bem após o volume de citocromo c (11,2 kDa), mostrando que esta proteína de 20 kDa é retardada de maneira anormal por interação com o Sephadex®.

As proteínas no Pico lll/IV foram precipitadas com sulfato de amônio e transferidas para acetato de sódio a 25 mM, pH 4,0, contendo EDTA à 1 mM, na mesma forma que a descrita para as proteínas no Pico II. Com a transferência para o acetato de sódio a 25 mM, pH 4,0, um grande precipitado formou-se e foi descartado. O sobrenadante ativo foi fracionado sobre SP-Sepharose®. Na baixa carga de proteína (por exemplo, 200 mg de proteína para uma coluna de 2,5 x 11 cm conforme mostrado na Figura 10, a maior parte da atividade de endoglicanase ligou-se à coluna e foi eluída com um gradiente de NaCI em torno de NaCI a 50 mM. Este pico ativo foi seguido por um segundo pico de proteína inativa. A análise por SDS-PAGE mostrou que os picos ativos e inativos ambos continham diversas proteínas, incluindo as proteínas com massas moleculares aparentes próximas a 50 kDa, que poderíam não ser distinguidas umas das outras por SDS-PAGE. Ambos os picos foram adicionalmente purificados por cromatografia sobre Phenyl Sepharose®, As frações ativas (frações 15 a 18 na Figura 10) foram combinadas, ajustadas para PIPES/KOH a 50 mM, pH 6,0 (por adição de PIPES/KOH a 0,25 M,pH 6,0) e 15 g % de sulfato de amônio (por adição de sulfato de amônio sólido), e aplicadas a uma coluna de 1,5 x 8,5 cm de Phenyl Sepharose® equilibrada com PIPES/KOH a 25 mM, pH 6,0, contendo EDTA a 1 mM e 15 g % de sulfato de amônio. A coluna foi desenvolvida com um gradiente linear de 15 a 0 g % de sulfato de amônio em 104 ml de PIPES/KOH a 25 mM, pH 6,0. Após o final do gradiente, a coluna foi adicionalmente lavada com PIPES/KOH a 25 mM pH 6,0. Dois picos de proteínas eluíram sobre o gradiente, primeiramente um pequeno pico de proteína inativa, e então um pico maior contendo a maior parte da atividade de endoglicanase. A análise por SDS-PAGE (Figuras 11A e B) mostrou que ambos os picos continham essencialmente proteínas homogêneas, com massas moleculares aparentes próximas à 50 kDa (isto é, elas migraram ligeiramente mais devagar do que o padrão de ovalbumina pré-tingido da BioRad, que tem uma massa molecular aparente de 47 kDa). Estas duas proteínas não puderam ser distinguidas pelas análises por SDS-PAGE dos inventores, mesmo quando elas foram corridas juntas como misturas. A proteína no pico ativo foi chamada celulase de 50K e a proteína no pico inativo foi chamada de proteína B de 50K, Maiores quantidades de celulase B de 50K foram obtidas por fracionamento do segundo (e inativo) pico eluído a partir de SP-Sepharose® (frações 19 a 23 na Figura 10) sobre Phenyl Sepharose® exatamente na mesma forma que a descrita acima para as frações ativas. A produção de quantidades ainda maiores de celulase de 50K e de celulase B de 50K foi facilitada pela sobrecarga da coluna de SP-Sepharose® Por exemplo, quando 15 g de proteína foram aplicados a uma coluna de 4,5 x 31 cm de SP-Sepharose®, em vez de ligar-se à coluna, a celulase de 50K foi aparentemente deslocada por proteínas mais fortemente ligadas, e eluiu antes do gradiente de NaCI. Este material já estava altamente purificado, e a celulase de 50K homogênea foi isolada dele por cromatografia sobre Phenyl Sepharose® conforme descrito acima. A fim de acelerar a purificação de maiores quantidades de celulase de 50K, as colunas de SP-Sepharose e Phenyl Sepharose foram invertidas. Após ajuste da concentração de sulfato de amônio para cerca de 15g%, as proteínas precipitadas no Pico lll/IV foram aplicadas na Phenyl Sepharose conforme descrito antes. Com a alta sobrecarga (por exemplo, 17 g de proteína aplicados a uma coluna de 3,2 x 25 cm de Phenyl Sepharose), a maior parte da proteína total correu através da coluna, porém a celulase de 50K (contendo a maioria da atividade de endoglicanase) foi ligada e eluída no final do gradiente linear de 15 a 0 g% de sulfato de amônio em PIPES/KOH a 25 mM, pH 6,0. A análise de Western com um anti-soro de coelho identificando a celulase B de 50K mostrou que a celulase B de 50K eluiu exatamente antes da celulase de 50K. A purificação adicional foi obtida por fracionamento sobre SP-Sepharose, conforme descrito anteriormente. Nesta ordem invertida de SP-Sepharose e Phenyl Sepharose, as proteínas no Pico lll/IV precipitadas com o sulfato de amônio puderam ser aplicadas diretamente à etapa de purificação seguinte sem a remoção do sal. O grande precipitado de proteínas, o qual apareceu com a transferência das proteínas concentradas no Pico lll/IV diretamente para o acetato de sódio a 25 mM, pH 4,0, para a SP-Sepharose, pode também ser evitado desta forma. Uma vez que a celulase de 50K somente liga-se exatamente à SP-Sepharose, o fracionamento precedente sobre a Phenyl Sepharose reduziu de maneira acentuada a carga de proteína total aparentemente interferindo sobre a SP-Sepharose. A celulase de 50K e a celulase B de 50K foram, cada uma, testadas no Launder-Ometer para ver se elas são responsáveis pelos efeitos benéficos do Pico IV descrito no Exemplo 10. Ambas as proteínas foram verificadas ter efeitos benéficos (Tabela VI). Nas baixas concentrações usadas nesta experiência, elas próprias não aumentaram a liberação do corante índigo da face externa do brim (isto é, Ldir0ito não aumentou), porém elas efetivamente diminuíram a coloração de volta do corante para a face interna do brim (UveSS0 tornou-se mais positivo e bavesso tornou-se menor), especialmente quando usadas juntamente com a celulase de20K. A celulase de 20K funcionou bem nos testes no Launder-Ometer em pH 5, bem como no pH 7. No pH 5, 0,2 mg de celulase de 20K por g de brim diminuiu o Ldlreito de 3,2 para 5,2. A adição de celulase de 50K a 0,1 mg por grama de brim juntamente com a celulase de 20K também diminuiu a coloração de volta no pH 5 (Lavesso e bavesso alteraram de 0,0 e 2,6 com a celulase de 20K sozinha para 1,3 e 1,5, respectivamente, com a mistura de celulases de 20K e de 50K).

Tabela VI. Liberação do Corante índigo pela celulase de 20K, pela celulase de 50K e pela celulase B de 50K

As condições eram as mesmas que na Tabela V. A dose é mostrada como mg de proteína por grama de brim.

Amostra Doss (mQ/Q) Ldireito Lavesso baVesso Tampão sozinho - 2,8 -0,6 1,6 Celulase de 20K 0,18 5,6 -1,0 4,0 0,09 4,8 -1,5 3,3 Celulase de 50K 0,15 2,6 -0,3 1,0 0,075 3,0 0,4 1,3 Celulase B de 50K 0,31 2,8 1,3 0,8 0,15 2,7 1,5 0,5 Celulase de 20K+ 0,18 + 0,075 5,6 0,3 2,5 Celulase de 50K 0,09 + 0,075 5,1 0,3 2,1 Celulase de 20K+ 0,18 + 0,15 4,7 0,0 3,0 Celulase B de 50K Exemplo 10 Propriedades da celulase de 20K

Embora os anticorpos policlonais preparados contra as celulases purificadas a partir de Tríchoderma reesei (designados anticorpos anti-EGI, anti-CBHI e anti-CBHII) identificassem as proteínas no meio de desenvolvimento de ALK04237, houve somente uma reação cruzada muito fraca com a celulase de 20K pura sob as mesmas condições da análise de Western blot.

Quando o meio de desenvolvimento a partir de ALKQ4237 foi sondado na análise de Western com o anti-soro produzido nos coelhos contra a celulase de 20K pura, uma forte banda em torno de 35 kDa foi observada, além da banda à 20 kDa. Nenhuma atividade de endoglicanase aparente pode ser detectada para esta proteína de 35 kDa. Também, uma banda mais fraca foi vista imediatamente à frente da banda a 20 kDa (Figura 14). O ALK04124 proporcionou um padrão quase idêntico ao ALK04237, indicando que este e outros fungos provavelmente contêm celulases muito similares à celulase de 20K da presente invenção.

As sequências de aminoácidos de peptídeos trípticos derivados das celulases de 20K são mostradas na Figura 17. A celulase de 20K purificada funcionou bem no biotratamento com pedras em pH neutro sem a adição de outras atividades de enzima, conforme mostrado na Tabela VII.

Tabela VII. Biotratamento com Pedras pela Celulase de 20K Purificada As condições foram como na experiência mostrada na Tabela V. A dosagem é mostrada como mg de proteína/g de tecido de brim. "Meio completo" indica o meio de desenvolvimento concentrado de ALK04237 não-fracionado.

Comparada ao meio não-fracionado, a celulase de 20K resultou no mesmo grau de branqueamento (U*·» = 6,0-6,1) em 1/80 da dosagem da proteína. Ademais, houve menos coloração de volta sobre a face do avesso do tecido (LaVoSSo = -0,5 em comparação com -2,9, e bavesso = 3,6 comparado à 5,5). O tecido tratado com a celulase de 20K tinha uma textura macia aceitável.

Embora a celulase de 20K funcionasse surpreendentemente bem sem outras adições, um aspecto e uma textura do tecido ainda melhores resultaram quando a 20K foi usada juntamente com as combinações de DEAE-Sepharose I, III ou IV (Tabela VIII): Tabela VIII. Sinergia no Biotratamento com Pedras Entre a Celulase de 20K e as Combinações de Endoglicanase Eluídas de DEAE-Sepharose As condições foram como na Tabela V.

As misturas de celulase de 20K com as Combinações I, III e IV causaram mais branqueamento ((.^ο aumentado) do que qualquer componente sozinho. Pelo menos para a combinação da celulase de 20K com a Combinação IV, está claro que isto é por causa da sinergia e não meramente um efeito aditivo. Ademais, a coloração de volta com todas as misturas foi realmente menor (LavesSo mais positivo, bavesso menor) do que a coloração de volta observada com a celulase de 20K sozinha. A combinação da 20K com a Combinação IV foi particularmente efetiva. A Combinação IV contém muitas proteínas, uma das quais (um polipeptídeo de 50 kDa) co-purifica-se com a atividade de endoglicanase durante a cromatografia da Combinação IV sobre Sephadex G100 e S-Sefarose. Embora um bom biotratamento com pedras seja obtido com a celulase de 20K sozinha, melhores resultados são possíveis com a celulase de 20K mais uma ou mais proteínas purificadas a partir da Combinação IV. O biotratamento com pedras com as misturas da celulase de 20K e a celulase de 50K e a celulase B de 50K purificadas da Combinação lll/IV já foi apresentado (Tabela VI no Exemplo 9). Portanto, a presente invenção não está limitada ao uso de somente a celulase de 20K. Outras proteínas no meio de ALK04237 são úteis sozinhas ou em combinações adequadas.

No ensaio padrão de endoglicanase descrito por Baiiey e col. (1981, loc. cit), a quantidade de enzima é escolhida de modo que produza, em 10 min. e pH 4,8 (tampão de citrato de Na a 0,05 M), cerca de 0,6 mM equivalentes de redução a partir da hídroxietilcelulose a 1%, resultando em uma alteração de absorbância (ΔΑ540) de entre 0,2 e 0,25. Isto de longe excede a faixa na qual a ΔΑ540 é proporcional à quantidade de celulase de 20K.

Portanto, o procedimento foi modificado como se segue. Enzima suficiente foi usada para produzir cerca de 0,2 mM equivalentes de redução em 10 min. em um tampão HEPES a 0,05 M (pH 7,0). Para atingir a concentração de início de equivalentes de redução acima da qual a cor é formada no sistema de DNS, a glicose a 0,12 mM foi recentemente adicionada ao reagente de DNS de estoque. Este método (chamado 0 método "modificado") foi usado quando caracterizando a atividade de endoglicanase da celulase de 20K e também da celulase de 50K. Com a hídroxietilcelulose a 1 % como substrato, a faixa na qual a ΔΑ540 é proporcional à quantidade de celulase de 20 e de 50K é relativamente estreita, e assim a carboximetilcelulose a 2% foi tomada como um substrato alternativo. Com a carboximetilcelulose a 2%, a faixa de correlação linear entre a ΔΑ540 e a quantidade de celulase de 20K e de 50K foi mais ampla do que com a hídroxietilcelulose a 1%. A atividade de endoglicanase determinada com a carboximetilcelulose a 2% era cerca de 8-10 vezes para a celulase de 20K e cerca de 50 vezes para a celulase de 50K em comparação com aquela determinada com a hídroxietilcelulose a 1 %.

Nenhuma atividade de celulase de 20K foi detectável para o 4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo, um substrato característico de celobiohidrolases. A atividade em relação ao papel de filtro foi também muito baixa, porém detectável. A celulase de 20K era relativamente estável ao calor. Ela foi incubada a 7 pg/ml e 100°C em Tris-HCI a 25 mM, EDTA a 0,2 mM, por 30 ou 60 min., e então testada em pH 7,0 e 50°C. 52% e 35%, respectivamente, da atividade de endoglicanase permaneceram no pH 7,2. 40% e 22%, respectivamente, permaneceram no pH 8,8. (Estes valores de pH foram medidos à temperatura ambiente; o pH real à 100°C é algo menor.) À 80°C, pH 7,2, 70% da atividade permaneceram por 60 min.

Estes resultados indicam que a enzima é adequada para aplicações em que ela possa ser (por exemplo, acidentalmente) exposta a temperaturas elevadas. Assim como era resistente à inativação reversível em altas temperaturas, a enzima exibiu uma temperatura ótima de 70°C durante 10 min. testada em pH 7,0 (Figura 15). A atividade diminuída observada acima de 70°C foi principalmente devida a uma alteração reversível na conformação da enzima: a enzima recuperou a maior parte de sua atividade quando retornou para 50°C. A 5Q°C, a celulase de 20K exibiu 80% ou mais de sua atividade máxima por toda a faixa de pH de 4 a 9, e aproximadamente 50% em pH 10. Este foi o caso em ambos os ensaios por 10 min. (Figura 16A) e por 60 min. (Figura 16B). Estas figuras também mostram a dependência do pH da enzima a 70°C. Com os ensaios por 10 min., a enzima era mais ativa à 70°C do que ela era a 50°C sobre a faixa de pH 4,5 a 8, e cerca de igualmente ativa em pH 10 (Figura 16A). Com os ensaios por 60 min. (isto é, as condições comerciais de abordagem), a enzima era mais ativa a 70°C do que ela era a 50°C entre o pH 5,5 e 7,5. Entretanto, ela era somente ligeiramente menos ativa a 70°C do que a 50°C até o pH 10. Na prática, isto significa que a enzima pode ser usada igualmente bem sobre uma ampla faixa de pH e em temperaturas até pelo menos 70°C.

Exemplo 11 Propriedades da celulase de SOK A celulase de SOK pura tinha tanto a atividade de endoglicanase (contra a hidroxietilcelulose), quanto a atividade de celobiohidrolase (contra o 4-metiiumbeliferil-p-D-laetosídeo, testada essencialmente conforme descrito por van Tilbeurgh e col., em Methods in Enzymology [1988] vol. 160, páginas 45-59). Uma amostra da enzima pura com uma A2eo de 1,8 continha 2030 ECU/ml e 300 PCU/ml em pH 7,0 e 50°C (uma PCU é a quantidade de atividade que libera 1 nmol de metilumbeliferona por segundo).

Nas análises de Western, a celulase de 50K foi fortemente identificada pelo anti-soro (KH 1057) produzido contra a endoglicanase I de T. reesei, porém somente fracamente pelos anti-soros (KH 1050 e KH 1053, respectivamente) contra as celobiohidrolases I e II de T. reesei. Ela não foi identificada pelo anti-soro produzido contra a celulase de 20K (Figura 14). Quando o meio de desenvolvimento de ALK04237 foi sondado nas análises de Western com o anti-soro de coelho produzido contra a própria celulase de 50K, somente uma banda óbvia (que tinha uma massa molecular entre 33 e 47 kDa) foi vista além da banda muito forte à cerca de 50 kDa. A massa molecular aparente da celulase de 50K por SDS-PAGE diminuiu em cerca de 2 a 5 kDa quando a proteína foi tratada com a endoglicosidase Hf, indicando que a enzima contém carboidrato removível por esta endoglicosidase. A celulase de 50K era extraordinariamente resistente à digestão tríptica, indicando que ela tem uma estrutura extraordinariamente estável. Entretanto, ela foi clivada por tratamento com o brometo de cianogênio, e os fragmentos resultantes puderam então ser digeridos com a tripsina ou com a lisilendopeptidase C. As sequências de alguns dos peptídeos assim obtidos são mostradas na Tabela IX.

Tabela IX

Seqüências de peptídeos isolados da celulase de 50K (resíduos incertos na ocorrência menor) n2 507 VYLLDETEHR

n2 509 XXLNPGGAYYGT

n2 563 MsEGAECEYDGVCDKDG

n2 565 NPYRVXITDYYGNS

n2 603 DPTGARSELNPGGAYYGTGYXDAQ ne 605 XXVPDYhQHGVda n2610 NEMDIXEANSRA

ne 611 LPXGMNSALYLSEMDPTGARSELNP

n5 612 VEPSPEVTYSNLRXGEIXgXF

n- 619 DGCGWNPYRVvITtDYYnN

ns 620 LPCGMXSALY

ns 621 ADGCQPRTNYlVLDdLIHPXXQ A celulase de 50K é uma enzima estável que exibe atividade de endoglicanase sobre uma ampla faixa de valores de pH e em altas temperaturas, assim ela pode ser adequada para uso em muitas condições industriais. Em pH 7,0 e com tempos de reação de 60 min., ela tem uma temperatura ótima entre 65 e 70®C, e mesmo com este longo tempo de reação ainda exibe, a 75°C, 50% da atividade observada a 50°C (Figura 12).

Com tempos de reação de 60 min., o pH ótimo era muito amplo a 50°C, com atividade essencialmente constante entre pH 4,4 e 7,0, e atividades em pH 9 e 10 iguais a 50% e 30%, respectivamente, daquela em pH 7,0. A 70°C, houve um ótimo nítido em pH 6, e, entre pH 5 e 7, a atividade (com tempos de reação de 60 min.) era 3 vezes, ou mais, maior do que aquela a 50°C. Entretanto, em pH 4,4 e em valores de pH acima de 8, a atividade era maior a 50°C do que a 70°C (em ensaios por 60 min ), sugerindo que a estabilidade da enzima diminui a 70°C, lado direito, a faixa de pH 5 a 7,5. A dependência do pH é ilustrada na Figura 13.

Exemplo 12 Propriedades da celulase B de S0K

Nenhuma atividade de endoglicanase detectável pode ser medida para a celulase B de 50k (anteriormente chamada proteína B de 50K) com a hidroxietilcelulose ou com a carboximetilcelulose. No pH acídico, a celulase B de 50K tinha uma atividade de celobiohidrolase baixa, a qual (medida com 4-metilumbeliferil-3-D-lactosídeo), em pH 5, era menos do que 0,1% daquela da celulase de 50K. Ademais, a celulase B de 50K tinha uma atividade detectável com relação ao papel de filtro em pH 4,8 e celulose Solca Floc amórfica, entumecida, ácida, em pH 5 e 7, usada nas determinações da atividade de enzima.

Nas análises de Western, a celulase B de 50K foi fortemente identificada pelo anti-soro (KH1Q50) produzido contra a celobiohidrolase I de T. reesei, porém somente fracamente pelos anti-soros contra a celobiohidrolase II ou a endoglicanase I de T. reesei, ou contra a celulase de 50K. Ela não foi identificada pelo anti-soro produzido contra a celulase de 20K (Figura 14). A Tabela X mostra as sequências de peptídeos isolados da celulase B de 50K.

Tabela IX

Seqüências de peptídeos isolados da celulase de 50K (resíduos incertos na ocorrência menor) n® 534 vGNPDFYGK

ns 535 FGPIGSTY

n® 631 LSQYFIQDGeRK

n® 632 FTWSRFEENK

n® 636 HEYGTNVGSRFYLMNGPDK

Exemplo 13 Estabilidade das celulases neutras em diferentes detergentes A estabilidade das preparações de celulases neutras foi testada em três soluções detergentes diferentes. As soluções detergentes eram 0M0® Total (ou OMO® Neste, Lever UK), OMO® Color (Lever S.A.) ê Líquido Detergente de Cor (Unilever, Os Países Baixos). As preparações de celulases testadas foram os filtrados da cultura concentrados de ALK04125, ALK04179, ALK04237 e ALK04265 (Exemplo 1) e as celulases de 20K e de 50K purificadas da cepa ALK04237 (Exemplo 9).

As preparações de celulases foram incubadas a 40°C em soluções detergentes a 0,25 %. A atividade contra a hidroxietilcelulose (ECU/ml, Exemplo 1) foi medida (pH 7, 50°C) a partir das amostras tiradas após 5-30 minutos de incubação.

As preparações testadas eram como se segue: Filtrados da cultura: ALK04125: 780 ECU/ml (pH 7, 50°C) ALK04179: 830 ECU/m! ALK04265: 760 ECU/ml ALK04237: 650 ECU/ml Proteínas purificadas: celulase de 20K: 9423 ECU/ml celulase de 50K: 10100 ECU/ml Os resultados são mostrados nas Tabelas XI - XIII

As preparações de celulases de ALK04179, ALK04265 e ALK04237 e as celulases de 20K e de 50K permaneceram quase 100 % estáveis por 30 minutos à 40°C em todos os três detergentes testados. O ALK04125 permanece estável por 30 minutos à 40°C no Líquido Detergente de Cor e no OMO® Neste, Tabela XI. Estabilidade de diferentes celulases no Líquido Detergente de Cor à 0,25% (pH 7,5 - 7,9).

Preparação % de dosagem pH* % de atividade deixada de enzima (ml) 0' 5' 10' 20' 30' Filtrados da cultura: ALK04125 6 7,3 100 97 98 98 99 ALK04179 6 7,1 100 99 100 100 10 ALK04265 6 7,2 100 100 100 100 100 ALK04237 6 7,1 100 100 82 95 100 Proteínas purificadas de ALK04237: Celulase de 20K 1 7,8 100 98 99 97 100 Celulase de 50K 1 7,6 100 100 100 100 100 * = pH do detergente a 0,25 % + solução de enzima após 30' de incubação) Tabela XII. Estabilidade de diferentes celulases no OMO® Total a 0,25% (ou OMO® Neste, pH 8,5).

Preparação % de dosagem pH* % de atividade deixada de enzima (ml) 0' 5' 10' 20' 30' Filtrados da cultura: ALK04125 6 7,8 100 98 96 86 87 ALK04179 6 7,3 100 98 96 96 99 ALK04265 6 7,1 100 100 100 100 100 ALK04265 4 7,8 100 99 97 100 100 ALK04237 4 7,8 100 100 100 99 100 ALK04237 2 7,3 100 99 97 99 99 Proteínas purificadas de ALK04237: Celulase de 20K 1 8,2 100 100 99 93 100 Celulase de 50K 1 7,8 100 95 92 95 94 * = pH do detergente a 0,25 % + solução de enzima após 30' de incubação) Tabela XIII. Estabilidade de diferentes celulases no OMO® Color à 0,25% (pH 9,6-10).

Preparação % de dosagem pH* % de atividade deixada de enzima (ml) 0' 5' 10' 20' 30' Filtrados da cultura: ALK04125 6 9,6 100 (15) (15) (13) (14) ALK04179 6 8,3 100 97 100 97 99 ALK04265 6 9,1 100 100 100 100 100 ALK04265 4 8,5 100 93 95 99 98 ALK04237 4 8,5 100 98 96 96 99 ALK04237 2 9,1 100 93 95 99 98 Tabela XIII - continuação Preparação % de dosagem pH* % de atividade deixada de enzima (ml) 0' 5' 10' 20' 30' proteínas purificadas de ALK04237: Celulase de 20K 1 9,8 100 99 100 100 100 Celulase de 50K 1 8,9 100 100 100 100 100 * = pH do detergente a 0,25 % + solução de enzima após 30' de incubação) Exemplo 14 Função das celulases neutras nos detergentes em substrato de HEC A função de diferentes celulases neutras nos detergentes foi determinada utilizando-se a hidroxietilcelulose (HEC) como um substrato. As preparações de celulases testadas eram os filtrados da cultura concentrados de ALK04265 e ALK04237 e as celulases de 20K e de 50K purificadas a partir da cepa ALK04237. Os substratos de HEC foram preparados dissolvendo-se a HEC a 1 % em soluções detergentes a 0,25 %. Pela utilização destes substratos, a atividade contra a HEC (ECU/ml) foi medida a 40°C a partir de cada preparação de celulase, conforme descrito no Exemplo 1. Os detergentes e as preparações de celulases usados nestas experiências são descritos no Exemplo 13. pH dos substratos: HEC/tampão pH 7 HEC/Líquido Detergente de Cor pH 7,5 HEC/OMO® Total pH 7,8 HEC/OMO® Color pH 9,7 Tabela XIV. ECU das preparações de celulase em diferentes detergentes (comparada como % a partir da atividade de ECU medida em tampão de pH 7) % de Atividade ECU/líquido ECU/OMO® ECU/OMO® Preparação ECU/tampão det. de cor Total Color filtrados da cultura: ALK04265 100 89 96 59 ALK04237 100 97 95 40 proteínas purificadas: celulase de 20K 100 100 93 81 celulase de 50K 100 92 79 46 As preparações de celulase de ALK04237 e ALK04265 e as celulases de 20K e de 50K funcionam em todos os três detergentes testados quando utiliza-se a HEC como um substrato.

Exemplo 15 Uso de celulases neutras em detergentes sobre tecidos urdidos de algodão Nesta experiência é descrita a capacidade das celulases neutras de funcionar como agentes amaciantes de tecido e de impedir a formação de felpo, e assim, reduzir a tendência à formação de bolas do tecido de algodão após lavagens de roupas repetidas nos detergentes. As preparações de celulases testadas eram o filtrado da cultura concentrado de ALK04237 e as celulases de 20K e de 50K purificadas a partir da cepa ALK04237 (Exemplos 1 e 9). A experiência de lavagem foi efetuada com um Launder-0 meter LP-2 (Atlas, Illinois, EUA). Cerca de 10 g de amostra de tecido urdido de algodão pré-alvejado foram carregados para um recipiente de 1,2 litros que continha 150 ml de solução detergente a 0,25% com ou sem celulase. As dosagens de celulases foram baseadas nas quantidades de proteínas. As soluções detergentes eram o OMO® Total (Lever, UK) e o Líquido Detergente de Cor (Unilever, Os Países Baixos). Uma quantidade de esferas de aço foi adicionada em cada recipiente para aumentar a ação mecânica. 0 Launder-Ometer foi corrido a 42 rpm por 0,5 ou 1 hora a 40°C. 0 material foi lavado 4 vezes com enxaguadura e secagem intermediárias. A perda de peso (ver o Exemplo 6) foi usada para descrever a quantidade de felpo removido da superfície dos tecidos.

Tabela XV. Perda de peso dos tecidos após o tempo da primeira lavagem com celulases neutras nos detergentes. ns da preparação dosagem de en- tempo h % de perda amostra zima como pro- de peso teína/g de tecido No Líquido Detergente de Cor 1 - 1 0,5 2 ALK04237 11 1 0,3 3 ALK04237 22 1 0,7 4 celulase de 20K 2 1 0,1 5 celulase de 20K 5 1 0,5 6 celulase de 20K 8 1 1,0 7 celulase de 50K 2 1 0,1 8 celulase de 50K 5 1 0,2 9 - 0,5 0,2 10 celulase de 20K 8 0,5 0,5 No OMO® Total: 11 - - 1 0,03 12 celulase de 20K 8 1 1,1 13 - - 0,5 0,1 14 celulase de 20K 8 0,5 0,7 Na Tabela XV é mostrado que após a primeira lavagem no Launder-Ometer, a perda de peso dos tecidos foi aumentada claramente mais com os tecidos tratados com celulase do que com os tecidos tratados com o detergente único. Também a perda de peso foi aumentada como uma função da dosagem de celuiase e, adicionaimente, com a celulase de 20K, a perda de peso foi aumentada quando o tempo de lavagem foi aumentado de 0,5 para 1 hora. A celulase de 20K funcionou igualmente bem no Líquido Detergente de Cor e no OMO® Total. Estes resultados indicam que particularmente a celulase de 20K e a preparação de celulase de ALK04237 funcionam nos detergentes como agentes removedores de felpos após já um tempo de lavagem.

Após três tempos de lavagem adicionais com as amostras 1,2, 4 e 7 (Tabela XV), a avaliação dos tecidos foi efetuada por um júri consistindo em três pessoas. Os jurados foram solicitados a avaliar a maciez e o aspecto visual dos tecidos tratados como se segue. A maciez dos tecidos: A. o tecido tratado com a celulase é mais macio do que o tecido tratado sem a celulase. B. o tecido tratado com a celulase é tão macio quanto o tecido tratado sem a celulase. C. O tecido tratado com a celulase é mais áspero do que o tecido tratado sem a celulase.

Os resultados são mostrados na Tabela XVI. O aspecto visual dos tecidos foi avaliado por classificação dos tecidos em uma contagem de 1 a 5. A contagem de 5 não proporcionou nenhum felpo ou bola e a textura do tecido tornou-se mais aparente. A contagem de 1 proporcionou muitas bolas e felpo. A contagem total para cada tecido foi calculada e dividida pelo número dos jurados. A contagem média do aspecto visual de cada tecido é mostrada na Tabela XVI.

Tabela XVI. Maciez e aspecto visual dos tecidos após 4 tempos de lavagem repetidos com celulases neutras nos detergentes. preparação dosagem de enzi- Tempo maciez aspecto zima como pro- h visual teína/g de tecido No Líquido Detergente de Cor: 1 1 ALK04237 11 1 100%: mais macios com 3,2 a celulase celulase de 20K 2 1 100%: mais macios com 3,7 a celulase celulase de 5ÒK 2 1 100%: sem diferença 1,7 Após os 4 tratamentos, os tecidos tratados com a celulase tinham claramente um melhor aspecto visual do que os tecidos que foram tratados com o detergente único. Assim, os tecidos tratados com estas celulases mantiveram o bom aspecto, e a formação de felpo foi evitada após as lavagens repetidas, em comparação com o tecido tratado sem as celulases. Também após 4 tempos de lavagem, os tecidos tratados com ALK04237 e com celulase de 20K eram mais macios do que o tecido tratado com o detergente único.

Exemplo 16 Uso de celulases neutras nos detergentes sobre malhas felpudas de algodão Nesta experiência é descrita a capacidade das celulases neutras de funcionarem como agente amaciante de tecido e evitar a formação de felpo e, assim, reduzir a tendência à formação de bolas da malha felpuda de algodão colorida após lavagens de roupas repetidas nos detergentes. As preparações de celulases testadas eram o filtrado da cultura concentrado de ALK04237 e a celulase de 20K purificada a partir da cepa ALK04237 (Exemplos 1 e 9).

As amostras de malha felpuda de algodão verde foram lavadas no Launder-Ometer, no Detergente Líquido de Cor ou no OMO® Total, por 1 h, 3 ou 10 vezes, com ou sem as celulases, conforme descrito no Exemplo 15. A avaliação das malhas foi efetuada por um júri consistindo em três pessoas. Os jurados foram solicitados a avaliar a maciez e o aspecto visual (tanto o lado direito quanto o avesso) das malhas tratadas, conforme descrito no Exemplo 15. A perda de peso das malhas foi determinada como descrito no Exemplo 15. Os resultados são mostrados na Tabela XVII.

Após 3 tempos de lavagem, as malhas tratadas com celulase de 20K tinham um melhor aspecto visual, tanto no lado direito quanto no avesso, do que as malhas tratadas com o detergente único. As malhas tratadas 10 vezes com a preparação de celulase de ALK04237 tinham claramente um melhor aspecto visual e uma cor verde mais viva do que as malhas tratadas somente com o detergente. O melhor aspecto visual das malhas tratadas com a celulase foi detectado já após 1 tempo de lavagem (especialmente sobre o avesso), e ele foi adicionalmente desenvolvido durante as lavagens adicionais. As malhas tratadas com a celulase eram também mais macias do que as malhas tratadas com o detergente único. ο Οϊ Τ3 h-T φ ω ο. Ό 2 2 ε ® 8> * ω lo > CNI Í5 ο" Φ (0 Ό ν_ (0 ω ο Έ ο Ο ω ο Q- φ Q- « ET? -§α ωοοωο f". κ Β ω Όφ t ® t ο ιο «) ο c ο? Ό ο" ο" Τ-* cm" ο" ν-~ τ- ω 3 Φ Ο 3 ” Q α -ο 2 ω F Ο- % 'Ο g ro ί ® I

$ Ο χ> Ο) ’ί Ο Φ COCN TS W Ω. iS Ν (C 00' Κ 00 οο" 3 (0 Ω. Ό 3 χ ω °- ω ο SZ *5 οο S c φ C φ Χ3 (Λ ^ m C (π t0 η ® 45 > χ ο> 13 Jto c* C0 1õ ω g £ ΟΟ ΟΟ 3¾ jíí JS (Ο « Τ- τ- τ- τ- .W "Q

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Após 10 tratamentos, esta malha envelhecida tinha um aspecto sem atrativo e desbotado com muitos felpos na superfície.

Após estas 10 lavagens repetidas, a malha felpuda foi usada para as experiências de lavagem com ou sem celulase. As amostras de malha foram lavadas no Launder-Ometer, no Detergente Líquido de Cor, por 1 h, 1 a 3 vezes, conforme descrito no exemplo 15, com enxaguadura e secagem intermediárias. As preparações de celulases usadas eram o filtrado da cultura concentrado de ALK04237 e as celulases de 20K e de 50K de ALK04237 (Exemplo 9). A avaliação das malhas foi efetuada por um júri consistindo em três pessoas. Os jurados foram solicitados a avaliar a maciez e o aspecto visual (tanto o lado direito quanto o avesso) das malhas tratadas, conforme descrito no Exemplo 15. A perda de peso das malhas foi determinada como descrito no Exemplo 15. Os resultados são mostrados na Tabela XVIII.

Após um tempo de lavagem, as malhas tratadas com ALK04237 e com a celulase de 20K tinham um aspecto visual ligeiramente melhor do que a malha tratada com o detergente único. O bom aspecto visual e o aspecto mais atrativo foram adicionalmente desenvolvidos para as malhas tratadas com a celulase de 20K após 2 e 3 tempos de lavagem. O aspecto visual foi também aperfeiçoado após dois tempos de lavagem sobre as malhas tratadas com a celulase de 50K em comparação com a malha tratada com o detergente único. Em geral, as malhas tratadas com as celulases tinham um aspecto claramente aperfeiçoado e atrativo, ao passo que as malhas tratadas sem a celulase tinham um aspecto ainda sem atrativo e desbotado. Ε # ω 8 3 ο ~ φ -¾ W. Τ3 ο C0 Ο ο. ® Ε Ό ω α> +mê ·*"■* ΓΟ Φ φ ω £? Έ τ- ® $ ο « Q. £Λ 10 ί m φ *ο Q Β cx τ- ο cd ω ω ·*- ω £- ο ο ω φ- °t « ® ro «Φ SP Τ3 ΟΟΟΟΟΟΟΟΟ C0 Ο . Φ 3 2 Õ Ο 0) φ * £ ^ (0 > -Τ' £ ε c λ '0 φ Φ φ" 05 Φ° χ > QQQCDh-h-COQO

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Exemplo 19 Amplificação, clonagem e seqüenciamento do DNA de celulase de 20K com os primers degenerados Para amplificar o gene de celulase de 20K por reação em cadeia por polimerase (PCR), um par de primers degenerados, com base nas seqüências de peptídeos (Figura 17), foi sintetizado. 0 primer 1 (429-32) foi derivado a partir dos aminoácidos n- 8-14 do peptídeo com N terminal n° 429 (Figura 17), e o primer 2 (fr28-16) foi projetado como a fita sem sentido para os aminoácidos n- 2 - 8 do peptídeo fr28 (Figura 17). Os sítios de restrição de EcoR1 adicionais foram adicionados nas extremidades 5' para facilitar a clonagem do fragmento amplificado.

Primer 1 (429-32) EcoRI

5'- ATA GAATTC TA (C/T) TGG GA (C/T) TG (C/T) AA (A/G) CC Y W D C K P

Primer 2(fr28-16) EcoRi 5'- ATA GAATTC TT (A/G) TC (A/C/G/T) GC (A/G) TT (C/T TG (A/G) AA

N D A N Q F

CCA

W

Na reação por PCR, 1 pg do DNA genômico de ALK04237 purificado (Exemplo 18) foi usado como o molde. A DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes Ltd, Finlândia) foi usada de acordo com as instruções do fornecedor. DNA de molde (0,7pg/pl) 1,4 μΙ Primer 1 (0,5 pg/pi) 1 μΙ Primer 2 (0,5pg/pi) 1 μΙ dNTPs (2 nM) 5 μΙ 10χ tampão de PCR 10 μΙ dH20 82 μΙ Dynamize (2U/pI) 1 μΙ Total 101,4 μΙ A reação por PCR foi efetuada sob as seguintes condições: Etapa 1 95°C 5 min Etapa 2 95°C 1 min Etapa 3 56°C 1 min Etapa 4 72°C 1 min Etapa 5 ir para a "etapa 2" 29 vezes mais Etapa 6 72°C 8 min Etapa 7 4°C sustentar Dez μΙ de mistura de reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose, e uma banda única correspondendo a cerca de 600 bp no comprimento foi detectada. O restante do produto de PCR foi digerido com a endoglicanase de restrição de EcoR1, e corrido por eletroforese em agarose. A seção de agarose contendo o fragmento de DNA foi excisada, e purificada pelo método de Magic PCR Preps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento isolado foi ligado com o plasmídio pBluescript II SK+ (Stratagene, EUA), o qual foi cortado similarmente com £coR1. As células de XL-Blue de Escherichia coli adequadas (Stratagene, EUA) foram transformadas com a mistura de ligação. O DNA do plasmídio a partir de algumas das colônias resultantes foi isolado pelo método de Magic Minipreps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O DNA do plasmídio foi analisado por eletroforese em agarose, e um clone com características esperadas foi designado pALK549. O DNA de Melanocarpus a partir de pALK549 foi seqüenciado utilizando-se os kits ABI (Applied Biosystems, EUA) com base nos primers T3 e T7 marcados com fluorescente, ou nos primers específicos para seqüência com didesoxinucleotídeos marcados com fluorescente, pelo protocolo de seqüênciamento com ciclo de primer com corante de Taq, de acordo com as instruções do fornecedor. Por causa do alto teor de GC do DNA de Melanocarpus, as reações de seqüênciamento foram efetuadas na temperatura de recozimento de 58°C, com DMSO à 5% (v/v). As reações de seqüênciamento foram analisadas no seqüênciador ABI 373A (Applied Biosystems, EUA), e as seqüências obtidas foram caracterizadas pela utilização do Pacote de Software de Análise de Seqüência de Grupo para Computador da Genetics, versão 7.2. O inserto (594 bp) no pALK549 foi verificado codificar a maior parte dos peptídeos derivados da celulase de 20K (Figura 17). O DNA amplificado por PCR (além dos primers) corresponde aos nucleotídeos 175-716 na Figura 19. O DNA cromossômico a partir de Myriococcum sp. ALK04124 foi isolado conforme descrito no Exemplo 18. Uma reação por PCR com os primers 429-32 e fr28-16 e com o DNA cromossômico de ALK04124 como o molde produziu um fragmento de mesmo tamanho que o DNA de ALK04237. Este fragmento foi parcialmente seqüênciado, e era quase idêntico à seqüência de ALK04237. É concluído que o Myriococcum sp. ALK04124 tem uma proteína, a qual é quase idêntica à celulase de 20K de Melanocarpus albomyces ALK04237. Este resultado está também em concordância com a observação de que os anticorpos específicos para a celulase de 20K de ALK04237 também identificam uma banda da proteína de 20K a partir do meio de desenvolvimento de ALK04124 na análise de Western (Figura 14). As enzimas de ambas as cepas proporcionaram bons resultados similares nas experiências de biotratamento com pedras (Exemplos 3 e 4).

Exemplo 20 Clonagem e seqüênciamento do gene de celulase de 20K de Melanocarpus albomyces ALK04237 As células de XL1-Blue MRA (P2) de E. coli (Stratagene, EUA) foram desenvolvidas em LB + maltose a 0,2% + MgS04 à 10 mM, e diluídas para ODeoo = 0,5. As células foram infectadas com a biblioteca genômica de Melanocarpus albomyces ALK04237 (Exemplo 18) por 15 min., a 37°C, e preparadas com ágar sobre a parte de cima de NZY em placas de NZY. As placas foram incubadas a 37°C durante a noite. As placas foram transferidas para um filtro de náilon (Hybond, Amersham, UK) de acordo com as instruções da Stratagene. 0 fragmento de PCR purificado (Exemplo 19) foi marcado com digoxigenina de acordo com a Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Nonradioactive, Manual de Aplicação. A hibridação foi efetuada a 68°C. Os clones positivos foram selecionados em tampão SM/clorofórmio, e purificados com um segundo ciclo de exame.

Foram encontrados 4 clones positivos sob estas condições. O isolamento do DNA de bacteriófago lambda em grande escala, a partir dos clones, foi feito de acordo com Sambrook e col., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os DNAs do fago foram analisados por digestão do DNA com diversas enzimas de restrição, e o DNA digerido foi hibridizado com a sonda de PCR. Três fragmentos de hibridação foram isolados: fragmento de EcoR1-XftoI de cerca de 2,6 kb, fragmento de Xho\ de cerca de 4,9 kb e fragmento de Saci de cerca de 3 kb. Estes foram inseridos no vetor de pBluescript II SK+ similarmente cortado (Stratagene, EUA), criando os plasmídios pALK1221, pALK1222 e pALK1223, respectivamente (Figura 18). O DNA de Melanocarpus albomyces no pALK1221 foi seqüênciado conforme descrito no Exemplo 19. A sequência de DNA codificando a celulase de 20K de Melanocarpus albomyces é mostrada na Figura 19. A sequência é 936 bp de comprimento, e tem um quadro de leitura aberto (OFR) codificando para 235 aminoácidos; o gene tem dois íntrons. O sítio de processamento de peptídeo de sinal putativo está após a alanina 21, e a extremidade com N da proteína madura começa na alanina 22, conforme sugerido pelos resultados do seqüênciamento do peptídeo (Figura 17, peptídeo ns 429). O OFR prediz uma proteína com um peso molecular de 25,0 kDa para a pré-proteína de tamanho natural, e 22,9 kDa para a proteína madura. Isto está em boa concordância com os resultados obtidos a partir do trabalho de purificação da proteína (Exemplo 10). Estes resultados também verificam que a proteína de cerca de 35 kDa, detectada anteriormente com o anti-soro de celulase de 20K (Exemplo 10), é um produto de gene diferente do que a celulase de 20K. A celulase de 20K de Meianocarpus albomyces parece pertencer à família K das celulases e à família 45 das glicosi! hidrolases (Henrissat e Bairoch, Biochem. J. 293:781-788 (1993)). A celulase de 20K mostra homologia (cerca de 76% de identidade na sobreposição dos 235 aminoácidos) em relação à endoglicanase V de Humicola insolens (embl:a23635), porém a celulase de 20K tem a característica surpreendente de que ela não abriga o domínio de ligação à celulose (CBD) e o seu ligador, que são características da endoglicanase V de Humicola insolens e de outras endoglicanases relacionadas (Schülein e col., 1993, Em: Suominen & Reínikaínen (eds), Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Helsinki, vol. 8, 109,; Saloheimo e col., 1994, Mol. Microbiol. 13, 219). Esta característica da celulase de 20K pode ser responsável pelo excelente desempenho da enzima nas experiências de biotratamento com pedras (Exemplo 10).

Exemplo 21 Amplificação, clonagem e seqiiênciamento do DNA de celulase de SOK com os prímers degenerados Os peptídeos derivados a partir da celulase de SOK (Tabela IX) compartilham alguma homologia em relação à endoglicanase I de Humicola grisea (DDBJ:D63516). Para amplificar o gene de celulase de SOK por reação em cadeia por polimerase (PCR), um par dos primers degenerados, baseados nas sequências de peptídeos (Tabela IX), foi sintetizado. O primer 1 (507-128) foi derivado dos aminoácidos n~ 5-10 do peptídeo ns 507 (Tabela IX), e o primer 2 (509-rev) foi projetado como a fita sem sentido para os aminoácidos n- 4 - 9 do peptídeo 509 (Tabela IX). A ordem dos dois peptídeos na proteína - e a natureza de sentido-sem sentido correspondente - foi deduzida a partir de comparação com a endoglicanase I de Humicola grisea.

Primer 1 (507/128) 5’- GA (C/T) GA (A/G) AC (A/C/G/T) GA (A/G) CA (C/T) A/C) G D E T E H R

Primer 2 (509/rev) 5' - TA (A/C)G/T) GC (A/C/G/T) CC (A/CG/T) CC (A/C/G/T) GG (A/G) TT Y A G G P N

Na reação por PCR, 1,5 μg do D NA genômico de ALK04237 purificado (Exemplo 18) foram usados como o molde. A DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes Ltd, Finlândia) foi usada de acordo com as instruções do fornecedor. DNA de molde (0,3 pg/μΙ) 5 μΙ Primer 1 (0,5 pg/μΐ) 1 μΙ Primer 2 (0,5 pg/μΙ) 1 μΙ dNTPs (2 nM) 5 μΙ 10χ tampão de PCR 10 μΙ dH20 79 μΙ Dynamize (2υ/μΙ) 1 μΙ Total 102 A reação por PCR foi efetuada sob as seguintes condições: Etapa 1 95°C 5 min Etapa 2 95°C 1 min Etapa 3 56°C 1 min Etapa 4 72°C 1 min Etapa 5 ir para a "etapa 2" 29 vezes mais Etapa 6 72°C 8 min Etapa 7 4°C sustentar Dez μΙ de mistura de reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose, e uma banda única correspondendo a cerca de 160 bp no comprimento foi detectada. O restante do produto de PCR foi carregado em um gel de agarose que sofreu eletroforese, e a seção de agarose contendo o fragmento de DNA foi excisada, e purificada pelo método de Magic PCR Preps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento isolado foi ligado com o plasmídio pBluescript II SK+ (Stratagene, EUA), o qual tinha sido digerido com a endonuclease de EcoRV, e preso na extremidade por ddT, conforme descrito em Holton e Graham (1990) Nucl. Âcids. Res. 19, 1156. As células de XL-Blue de Escherichia coli adequadas (Stratagene, EUA) foram transformadas com a mistura de ligação. O DNA do plasmídio, a partir de algumas das colônias resultantes, foi isolado pelo método de Magic Minipreps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O DNA do plasmídio foi analisado por eletroforese em agarose, e um clone com características esperadas foi designado pALK1064. O inserto (161 bp) em pALK1G64 foi seqüênciado conforme descrito no Exemplo 19, e foi verificado conter um ORF, o qual predisse um peptídeo homólogo à endoglicanase I de Humicola grisea (DDBJ:D63516). O ORF também codificou o peptídeo n® 612 (Tabela IX) a partir da celulase de 50K purificada. O DNA amplificado por PCR (além dos primers) corresponde aos nucleotídeos 404-530 na Figura 21. A PCR com os primers 507 e 590-rev com o DNA cromossômico de ALK04124 como molde (Exemplo 19) produziu um fragmento de mesmo tamanho que a partir do DNA de ALK04237. Isto sugere que o Myríococcum sp. ALK04124 tem uma proteína muito similar à celulase de 50K de Melanocarpus albomyces ALK04237. Isto é também suportado pelo fato de que as enzimas de ambas as cepas proporcionaram bons resultados nas experiências de biotratamento com pedras.

Exemplo 22 Clonagem e seqüênciamento do gene de celulase de 50K de Melanocarpus albomyces ALK04237 O banco genômico de Melanocarpus albomyces ALK04237 foi preparado por hibridação conforme descrito no Exemplo 20. O fragmento de PCR purificado, carregando parte do gene de celulase de 50K (Exemplo 21), foi marcado com digoxigenina de acordo com Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Nonradioactive, Manual de Aplicação. A hibridação foi efetuada a 68°C. Os clones positivos foram selecionados em tampão SM/clorofórmio, e purificados com um segundo ciclo de exame.

Foram encontrados 10 clones positivos sob estas condições. O isolamento do DNA de bacteriófago lambda em grande escala, a partir dos clones, foi feito de acordo com Sambrook e coi., 1989. Os DNAs do fago foram analisados por digestão do DNA com diversas enzimas de restrição, e o DNA digerido foi hibridizado com a sonda de PCR específica para celulase de 50K. Quatro fragmentos de hibridação foram isolados: fragmento de Sac\-Xho\ de cerca de 2,8 kb, fragmento de Saci de cerca de 5 kb, fragmento de Xho\ de cerca de 3,2 kb, e fragmento de EcoR1 de cerca de 2 kb. Estes foram inseridos no vetor de pBluescript II SK+ similarmente cortado (Stratagene, EUA), criando os plasmídios pALK1234, pALK1233, pALK1226 e pALK1227, respectivamente (Figura 20). O DNA do Melanocarpus albomyces ALK04327 foi seqüenciado a partir dos plasmídios específicos de 50K-celulase mencionados acima. O protocolo seqüenciável foi descrito no exemplo 19. O DNA de Melanocarpus albomyces ALK04237foi seqüênciado a partir dos plasmídios específicos para celulase de 50K mencionados acima. A sequência revela um ORF de cerca de 1363 bp de comprimento, interrompido por um íntron. O OFR codifica para 428 aminoácídos. A proteína predita tem um peso molecular de 46,8 kDa e divagem de peptídeo de sinal posterior de 44,8 kDa. Todos os peptídeos na Tabela IX são encontrados na sequência de proteína predita (Figura 2), embora alguns aminoácidos identificados com incerteza durante o seqüênciamento de peptídeos provaram estar incorretos. A proteína mostra homologia à endoglicanase I de Humicola grísea (DDBJ:D63516).

Exemplo 23 Amplificação, clonagem e seqüênciamento do DNA de celulase B de 50K com os primers degenerados Os peptídeos derivados a partir da celulase B de 50K (Tabela X) compartilham alguma homologia em relação à celobiohidrolase I (DDBJ:D63515). Para amplificar o gene de celulase B de 50K por reação em cadeia por polimerase (PCR), um par dos primers degenerados com base nas seqüências de peptídeos (Tabela X) foi sintetizado. O primer 1 (636) foi derivado a partir dos aminoácidos n- 1 - 5 do peptídeo n9 636 (Tabela X) (o primeiro aminoácido foi imaginado ser a lisina, porque este peptídeo foi isolado após a digestão com uma protease clivando depois as lisinas), e o primer 2 (534-rev) foi projetado como a fita sem sentido para os aminoácidos n~ 3 - 8 do peptídeo ns 534 (Tabela X). A ordem dos dois peptídeos na proteína - e a correspondente natureza sentido-anti-sentido dos iniciadores foi deduzida a partir de comparação com a celobiohidrolase I de Humicola grisea.

Primer 1 (636) 5‘- AA (A/G) CA (C/T) GA(A/G) TA (C/T) GG (A/C/G7T) AC

K Η E Y G T

Primer 2 (534-ver) 5’ -CC (A/G) TA (A/G) AA (A/G) TC (A/C/G/T) GG (A/G) TT

G Y F D P N

Na reação por PCR, 1,5 pg do DNA genõmico de ALK04237 purificado (Exemplo 18) foram usados como o molde. A DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes Ltd, Finlândia) foi usada de acordo com as instruções do fornecedor.

Molde de DNA (0,3 pg/μΙ) 5 μΙ Primer 1 (Q,5μg/μl) 1,7 μΙ Primer 2 (0,3μ§Ιμ\) 1,7 μΙ dNTPs (2 nM) 5 μΙ 10x tampão de PCR 10 μΙ dH20 80 μ| Dynamize (2υ/μΙ) 1 μΙ Total 104,4 μΙ A reação por PCR foi efetuada sob as seguintes condições: Etapa 1 95°C 5 min Etapa 2 95°C 1 min Etapa 3 48°C 1 min Etapa 4 72°C 2 min Etapa 5 ir para a "etapa 2" 34 vezes mais Etapa 6 72°C 8 min Etapa 7 4°C sustentar Vinte μΙ de mistura de reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose, e algumas bandas foram detectadas. Uma das bandas tinha um tamanho aparente de 700 bp, tamanho este que estava em concordância com o tamanho que se esperaria, quando comparando com o gene de celobiohidrolase de Humicola grísea, particularmente, se o fragmento contivesse um ou mais íntrons. Os produtos de PCR foram . purificados pelo método de Magíc PCR Preps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento isolado foi ligado com o plasmídio pBluescript II SK+ (Stratagene, EUA), o qual tinha sido digerido com a endonuclease de EcoRV, e preso na extremidade por ddT, conforme descrito em Holton e Graham, Nucl, Acids. Res. 19, 1156 (1990). As células de XL-Blue de Escheríchia coli adequadas (Stratagene, EUA) foram transformadas com a mistura de ligação. O DNA do plasmídio, a partir de algumas das colônias resultantes, foi isolado pelo método de Magic Minipreps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O DNA do plasmídio foi analisado por eletroforese em agarose, e um clone com um inserto de cerca de 700 bp foi designado pALK1224. O inserto em pALK1224 foi seqüênciado conforme descrito no Exemplo 19, e foi verificado conter um ORF codificando todo o peptídeo r\° 636 a partir da celulase B de 50K (Tabela X). O ORF predisse um peptídeo homólogo à celobiohidrolase I de Humicola grisea (DDBJ:D63515). O DNA amplificado por PCR (além dos primers) corresponde aos nucleotídeos 371-1023 na Figura 23.

Exemplo 24 Clonagem e seqüênciamento do gene de celulase B de 50K de Melanocarpus albomyces ALK04237 0 banco genômico de Melanocarpus albomyces ALK04237 foi preparado por hibridação conforme descrito no Exemplo 20. O inserto em pALK1224 foi removido por digestão do plasmídio com as endoglicanases de restrição EcoRI e HindUl O DNA do plasmídio digerido foi corrido por eletroforese em agarose. A seção de agarose contendo o fragmento de DNA de cerca de 700 bp foi excisada, e purificada pelo método de Magic PCR Preps (Promega, EUA) de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento de PCR purificado a partir de pALK1224, carregando parte do gene de celulase B de 50K (Exemplo 23), foi marcado com digoxigenina de acordo com Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Noradioactive, Manual de Aplicação. A hibridação foi efetuada a 68°C. Os clones positivos foram selecionados em tampão SM/clorofórmio, e purificados com um segundo ciclo de exame.

Foram encontrados 3 clones positivos sob estas condições. O isolamento do DNA de bacteriófago lambda em grande escala, a partir dos clones, foi feito de acordo com Sambrook e col., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os DNAs do fago foram analisados por digestão do DNA com diversas enzimas de restrição, e o DNA digerido foi hibridizado com a sonda de PCR específica para celulase B de 50K. Um fragmento de Not\ de 3,5 kb de hibridação foi isolado, e inserido no vetor de pBluescript II SK+ similarmente cortado (Stratagene, EUA), criando o plasmídio pALK1229 (Figura 22). A extremidade 5' extrema do gene foi encontrada por hibridação dos DNAs do fago com o fragmento de Not\-Pst\ de 0,2 kb a partir de pALK1229. Um fragmento de Psfl de 2,4 kb de hibridação foi isolado e inserido no vetor de pBluescript II SK+ similarmente cortado (Stratagene, EUA), criando o plasmídio pALK1236 (Figura 22).

Parte dos insertos em pALK1229 e pALK1236 foram seqüênciados conforme descrito no Exemplo 19. O DNA codificando a celulase B de 50K de Melanocarpus albomyces é mostrado na Figura 23 (A e B). A sequência revela um ORF de 1734 bp de comprimento interrompido por cinco íntrons. O ORF codifica para 452 aminoácidos. A proteína predita tem um peso molecular de 49,9 kDa e uma divagem de peptídeo de sinal posterior de 47,6 kDa. Todos os peptídeos na Tabela X são encontrados na sequência de proteína predita (Figura 23A e B), embora alguns dos aminoácidos identificados com incerteza durante o seqüênciamento do peptídeo provaram estar incorretos. A proteína predita mostra homologia para a celobiohidrolase I de Humicola grisea (DDBJ:D63515) e outras celobiohidrolases. Entretanto, a celulase B de 50K tem uma característica surpreendente de que ela não abriga o domínio de ligação à celulose (CBD) e o seu ligador, que é característico à celobiohidrolase I de Humicola grisea e à muitas outras celobiohidrolases.

Exemplo 25 Exame da biblioteca genômica de Melanocarpus albomyces ALK04237 com os genes de celulases de Trichoderma reesei O banco genômico de Melanocarpus albomyces ALK04237 foi preparado por hibridação conforme descrito no Exemplo 20. O fragmento de DNA carregando o DNA específico para cbh1 de Trichoderma reesei foi isolado por corte do plasmídio pTTcOl (Figura 24) com a endonuclease de restrição HincM, e isolamento do fragmento de cerca de 1,6 kb do gel de agarose após eletroforese. O fragmento de DNA carregando o DNA específico para eg!2 de Trichoderma reesei foi isolado por corte do plasmídio pMS2 (Figura 25) com as endonucleases de restrição SamHi e EcoRl, e isolamento do fragmento de cerca de 1,5 kb do gel de agarose após a eletroforese. A clonagem do gene de cbh1 é descrita em Teeri e col., Bio/Technology 1: 691-696 (1983). O gene de egl2 (originalmente chamado "eg/3") é descrito por Saloheimo e col., Gene 63:11-21 (1988).

Os fragmentos foram marcados com digoxigenina de acordo com Boehringer, DIG DNA Labeling and Detection Nonradioactive, Manual de Aplicação. A hibridação foi efetuada a 68°C com a sonda de cbh1, e a 60°C com a sonda de egl2. Os clones positivos foram selecionados em tampão SM/clorofórmio, e purificados com um segundo ciclo de exame.

Foram encontrados 13 clones positivos de cbh1 e 6 positivos de egl2 sob estas condições. Um clone hibridizou para ambas as sondas. O DNA de lambda foi isolado dos clones conforme descrito acima. Os DNAs do fago foram analisados por digestão do DNA com diversas enzimas de restrição, e o DNA digerido foi hibridizado com as sondas de cbh1 e egl2. Os clones foram também hibridizados com o fragmento de PCR específico para celulase de 20K (Exemplo 19). Um clone (lambda-16) era claramente positivo, e dois outros clones (lambda-8/1 e lambda-5/2) eram fracamente positivos; todos estes clones foram originalmente selecionados com a sonda de cbh1.

Um fragmento de £*coRI de cerca de 4 kb do lambda-16, o qual hibridizou tanto para a sonda de cbh1 de Trichoderma reesei quanto para o fragmento de PCR específico para celulase de 20K, foi isolado de gel de agarose após a eletroforese, e inserido no pBluescript II SK+ similarmente cortado. O plasmídio resultante foi chamado pALK1230 (Figura 26).

Parte do inserto em pALK1230 foi seqüênciado conforme descrito no Exemplo 19. O DNA parece não codificar a celulase de 20K, porém codifica para uma proteína homóloga às diversas celulases, particularmente na área do domínio de ligação à celulose (CBD). Assim, o produto de gene muito provavelmente tem alta afinidade em relação ao material celulósico, e, portanto, este gene foi designado como proteína com CBD. A seqüência é mostrada na Figura 27.

As reações por PCR com os primers 636 e 534-rev (Exemplo 23) foram efetuadas com o DNA dos 19 clones de lambda como moldes. Um clone de lambda, iambda-3, proporcionou uma banda de cerca de 700 bp de tamanho, similar àquele no Exemplo 23 quando o DNA cromossômico de ALK04237 foi usado como um molde. Este clone tinha sido originalmente selecionado pela sonda de cbh1 de Tríchoderma. O DNA de lambda foi digerido com diversas endonucleases de restrição, e hibridizado com a sonda específica para a celulase B de 50K. O clone mostrou um padrão de enzima de restrição similar aos 3 clones no Exemplo 24. É concluído que o lambda-3 também carrega o gene de celulase B de 50K.

Exemplo 26 Proteínas de fusão Um vetor recombinante codificando a celulase de 20K, a celulase de 50K ou a celulase B de 50K, é preparado fundindo-se a seqüência de codificação da celulase com a sequência de celulase ou de hemicelulase de Tríchoderma reesei, ou pelo menos um domínio funcional das ditas celulase ou hemicelulase, conforme descrito na US 5.298.405, no WO 93/24621 e na submissão de Genbank L25310, incorporados aqui por referência. Especialmente, a enzima é selecionada do grupo consistindo em CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII e MANI, ou um seu domínio, tal como o sinal de secreção ou a seqüência de núcleo.

As proteínas de fusão podem ser construídas de modo que contenham um domínio de núcleo de manase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase com N terminal ou o núcleo e os domínios de articulação a partir das mesmas, fundido a uma das sequências de celulase de Melanocarpus. O resultado é uma proteína que contém um núcleo de manase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase com N terminal ou núcleo e regiões de articulação, e uma celulase de Melanocarpus com C terminal. A proteína de fusão contém tanto a mananase ou a celobiohidrolase ou a endoglicanase de Tríchoderma, quanto as atividades de celulases dos diversos domínios conforme proporcionados na construção de fusão. Alternativamente, as mutações que modificam as atividades da manase, ou da celobiohidrolase, ou da endoglicanase de Tríchoderma, ou as atividades de celulases de Melanocarpus, podem ser incluídas nas construções. Neste caso, as proteínas de fusão contêm tanto a atividade de enzima de Tríchoderma quanto a atividade de celulase de Melanocarpus dos diversos domínios conforme proporcionados na construção de fusão.

As proteínas de fusão podem também ser construídas de modo tal que a extremidade de mananase, ou de celobiohidrolase, ou de endoglicanase, ou um seu fragmento desejado, seja colocada antes de uma das seqüências de ceiulase de Melanocarpus, especialmente de modo a permitir o uso de um sítio não-específico de protease na extremidade como um sítio de protease, para a recuperação da parte de ceiulase de Melanocarpus a partir da proteína de fusão expressa. Alternativamente, as proteínas de fusão podem ser construídas de modo que proporcionem um sítio de protease em um ligador sintético que seja colocado antes das celulases de Melanocarpus, com ou sem as seqüências da extremidade. Exemplo 27 Hospedeiros A construção recombinante, codificando as proteínas de fusão ou as proteínas de Melanocarpus desejadas, é preparada conforme acima descrito, e transformada em um fungo filamentoso, tal como o Aspergillus spp., preferivelmente o Trichoderma spp.

Exemplo 28 Meio de Trichoderma para a produção de ceiulase de 20K

Neste exemplo são descritas experiências de lavagem com pedras para determinar o meio mais adequado de celulases de Trichoderma para a produção de ceiulase de 20K. O propósito destas experiências foi determinar quais celulases de Trichoderma causariam a coloração de volta, na lavagem com pedras, em condições neutras. A cepa de Trichoderma reesei ALK03620 (o gene de endoglicanase 2 é deletado) foi escolhida como o hospedeiro para estas experiências. Nos estudos anteriores, a enzima de EGII (endoglicanase II) de Trichoderma mostrou causar efeitos prejudiciais às estruturas de fibras de algodão, e assim enfraquecer as propriedades de resistência dos tecidos contendo algodão (Em: Miettinen-Oinonen e col.: Effects of cellulases on cotton fiber and fabrics. Em: Proceedings of the TIWC96 Conference, 1996, Vol. 1 (2), páginas 197.).

Algumas experiências de lavagem com pedras foram efetuadas em pH 6,5 e 7, conforme descrito no Exemplo 3, exceto que nenhum Berol foi usado.

As preparações de celulase de Tríchoderma testadas eram: ALK03133 (eg/2 e cbh2 deletados) ALK03269 (egl2 e egi 1 deletados) ALK03268 (eg/2 e cb/?1 deletados) A dosagem de preparações de Tríchoderma foi cerca de 2,5 mg (= dosagem baixa, L) ou cerca de 5 mg (= dosagem alta, H) da proteína total por g de tecido. 0,4 mg de celulase de 20K purificada por g de tecido foi usado quando necessitado.

Os resultados das medições de cor dos tecidos de brim testados são mostrados na Tabela XIX.

Os resultados da lavagem com pedras mostram que o meio de ALK03269 (eg/2 e egl 1 deletados) causa menos coloração de volta nas condições neutras do que o meio de ALK03268 (eg/2 e cbh 1 deletados) ou de ALK03133 (eg/2 e cbh2 deletados). Assim, o hospedeiro preferido para a produção de celulase de 20K para o biotratamento com pedras é uma cepa similar ao ALK03269, Embora com concentrações maiores de celulase de 20K, o meio de Tríchoderma tem provavelmente somente uma importância muito pequena. Um meio similar ao ALK03269 é provavelmente tão bom para a produção de celulase de 50K e de celulase B de 50K, para o biotratamento com pedras, quanto ele é para a produção de celulase de 20 K.

Tabela XIX. Medições de cor de tecidos de brim tratados com diferentes preparações de celulase de Tríchoderma com (+) ou sem (-) celulase de 20 K.

preparação/ 20k pH Lado direito Avesso deltaE dosagem +/- L b deltaE L b - “ 6^5 2^2 ÃÀ 3/Í ÕJ 0,1 1,4 ALKO3620/L - 6,5 2,2 2,6 3,0 -0,7 2,6 2,9 ALKO3620/L + 6,5 5,5 4,0 7,7 -1,3 5,0 5,5 ALK03133/L - 6,5 1,9 2,2 3,7 0,2 1,6 2,3 ALK03133/H - 6,5 4,2 1,9 4,5 -1,5 3,3 4,8 ALK03133/L + 6,5 5,7 4,3 7,8 0,3 4,5 5,0 ALK03133/H + 6,5 8,5 4,0 9,4 -1,4 5,9 7,8 ALK03269/L - 6,5 2,9 1,9 4,4 0,8 0,8 1,6 ALK03269/H - 6,5 4,3 1,5 4,5 0,6 1,3 2,6 ALK03269/L + 6,5 6,6 4,2 8,7 1,1 4,0 4,3 ALK03269/H + 6,5 7,9 3,9 8,5 0,7 3,7 5,1 ALK03268/L - 6,5 2,9 1,7 3,7 0,1 1,8 3,0 ALK03268/H - 6,5 4,2 2,0 4,3 -0,7 3,4 5,0 ALK03268/L + 6,5 5,9 3,2 7,7 -1,2 4,5 6,0 ALK03268/H + 6,5 7,1 3,7 7,7 -2,0 5,8 7,3 7,0 2,9 0,8 2,6 0,7 0,5 1,5 ALKO3620/L - 7,0 3,3 1,2 1,9 1,7 0,3 1,1 ALKO3620/L + 7,0 6,7 3,4 5,6 1,1 3,2 2,9 ALK03133/L - 7,0 3,2 1,0 1,4 0,6 0,6 0,9 ALK03133/L + 7,0 5,9 3,7 5,5 0,1 4,3 3,1 ALK03369/L - 7,0 3,6 1,2 2,2 1,3 -0,3 1,3 ALK03269/L + 7,0 6,4 3,4 5,9 1,2 3,2 2,8 ALK03268L - 7,0 2,9 1,4 3,9 0,5 0,4 2,5 ALK03268/L + 7,0 8,4 3,1 9,6 1,1 3,5 4,6 Exemplo 29 Produção de celulase de 20K de Melanocarpus albomyces ALK04237 em T. reesei As cepas de Tríchoderma reesei foram construídas para a produção de celulase de 20K de Melanocarpus albomyces ALK04237. As cepas produzem a celulase de 20K de Melanocarpus e são inadequadas para produzir a endoglicanase II e a celobiohidrolase I ou a endoglicanase I de T. reesei. Tais preparações deficientes em atividade ceiulolítica de Trichoderma, e a fabricação das mesmas por métodos de DNA recombinante, são descritas na US 5.298.405 ou em Suominen e col. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. II. Effects of deletions of individual cellulase genes. Mol. Gen. Genet. 241: 523, incorporados aqui por referência.

Na construção das cepas que produzem a celulase de 20K de Melanocarpus albomyces, a cepa de Trichoderma reesei ALKO3620 parental foi transformada com os cassetes de expressão a partir do plasmídio pALK1231 ou pALK1235 (Figuras 28 e 29). Nos cassetes, a celulase de 20K é expressa a partir de um promotor de cbh1 forte. A integração dos cassetes de expressão resultou nas substituições dos genes de cbh 1 (pALK1231) parental ou eg!1 (pALK1235).

Na cepa hospedeira ALK03620, o gene de egl2 foi substituído pelo fragmento de Xba\-Bgl\l de 3,3 kb do gene de ble a partir de Streptoalloteichus hindustanus (Mattern e col. (1988) A vector of Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungai Genet Newslett. 35: 25.; Drocourt e col. (1990) Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucl. Acids Res. 18: 4009) usando os métodos de DNA recombinante descritos na US 5.298.405, incorporada aqui por referência.

Os plasmídios pALK1231 e pALK1235, que foram usados na construção das cepas de produção de celulase de Melanocarpus, são idênticos um ao outro com relação ao promotor de cbh1, ao gene de celulase de 20K e ao terminador de cbh1, os quais são descritos abaixo: * promotor de cbh1 (celobiohidrolase 1) de 7. reesei: O promotor é de VTT-D-80133 de Trichoderma reesei (Teeri e col. (1983) The molecular cloning of the major cellulase gene from Trichoderma reesei. Bio/Technology 1: 696.). O fragmento de EcoRI - Sacll de 2,2 kb (Karhunen e col. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endogiucanasé I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515.) foi usado na construção. A sequência da área do promotor precedendo o ATG foi publicada por Shoemaker e col. (1983) Molecular cloning of exo-celíobiohydrolase from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology 1. 691.). Os últimos 15 nucleotídeos do promotor de cbh1 de T. reesei L27 (o sítio de Sacll está sublinhado) são CCGCGGACTGGCATC (Shoemaker e col. 1983). O promotor de cbh1, a partir da cepa de T. reesei VTT-D-80133, foi seqüênciado no Alko Research Laboratories, e uma diferença de um nucleotídeo na sequência de DNA foi observada dentro da região acima mencionada. Na cepa de T. reesei VTT-D-80133, a sequência precedendo o ATG é CCGCGGACTG/C/GCATC (o sítio de Sacll está sublinhado, a citosina adicional na sequência de DNA está entre os cortes).

Os nucleotídeos ausentes do promotor (10 pbs após o Sacll até o ATG) foram adicionados e a fusão exata do promotor ao primeiro ATG da celulase de 20K de Melanocarpus (ver abaixo) foi feita utilizando-se o método de PCR (reação em cadeia por polimerase). A fusão e o fragmento de PCR foram seqüênciados para assegurar que nenhum erro tivesse ocorrido na reação. No pALK1231, a área do promotor também está funcionando como um DNA homólogo (junto com o fragmento de cbh1 3'; ver abaixo) para objetivar a integração do DNA de transformação ao local de cbh1. * gene de celulase de 20K de Melanocarpus albomyces: A seqüência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos deduzida do gene de celulase de 20K codificando na celulase de 20 kDa é apresentada no Exemplo 20 (Figura 19). Um fragmento de 0,9 kb começando a partir do códon de AT foi usado em ambos os plasmídios. * terminador de cbh1 de T. reesei: O fragmento de Avall de 739 bp (Karhunen e col. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endogiucanasé I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515.) começando 113 bp antes do códon de interrupção do gene de cbh1 foi adicionado após o gene de celulase de 20K para assegurar a terminação da transcrição.

Além do material descrito acima, o plasmídio pALK1231 contém: * gene de amdS: O gene foi isolado do Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 e ele está codificando para a acetamidase (Hynes e col. (1983) Isolation of genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of the structural and regulatory mutations. Mol. Cell. Biol. 3: 1430.). A acetamidase capacita a cepa de desenvolver-se utilizando-se a acetamida como a única fonte de nitrogênio e esta característica tem sido usada para a seleção dos transformantes, O fragmento de 3,1 kb (Spel - Xbal), a partir do plasmídio p3SR2 (Kelly J. e Hynes M. (1985) Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans. EMBO J. 4: 475.), é usado nos plasmídios. O fragmento contém 1007 bps da área do promotor, 1897 bps da região de codificação (íntrons incluídos) ê os 183 bps da área de terminador do gene de amdS. * fragmento de cbh1 3': O fragmento foi isolado de T. reesei ALK02466 por utilização de resgate de plasmídio (1,7 kb, BamHI - EcoRI, começando 1,4 kb após a INTERRUPÇÃO do gene, Suominen e col. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. II. Effects of deletions of individual cellulase genes. Mol. Gen. Genet. 241: 523.). A cepa ALK02466 deriva-se da cepa ALK0233 (Harkki e col. (1991) Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles. Enzyme Microb. Technol. 13: 227.). O fragmento de 3' é usado juntamente com a área de promotor para objetivar o gene de celulase de 20K ao local de cbh1 por recombinação homóloga. O plasmídio pALK1235 contém: * gene de hph: O gene codificando a HmB fosfotransferase é originalmente isolado de JM109 de E. coli K-12 (Yanish-Perron e col. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33: 103.) e ele confere resistência à higromicina B (HmB). A resistência à higromicina (inativada por fosforilação por HmB fosfotransferase) foi usada para a seleção dos transformantes. O gene de hph, juntamente com o promotor de pki e o terminador de cbh2 (ver abaixo), é isolado do plasmídio pRLMex30 (Mach e col. (1994) Transformation of Trichoderma reesei based on hygromycin B resistance using homologous expression signals. Curr. Genet. 25: 567.) como um fragmento de Not\-Pvu\\ de 2,2 kb. * promotor de pki: O promotor de pki (piruvato cinase) de 0,75 kb para a expressão de hph foi sintetizado por PCR usando o DNA de T. reesei QM 9414 como um molde (Schindler e col. (1993) Characterization of the pyruvate kinase-encoding gene (pkii) of Trichoderma reesei. Gene 1301271.). * terminador de cbh2: A sequência de terminador de cbh2 começa imediatamente após o códon de INTERRUPÇÃO do gene de cbh2 (até o sítio de PvuW 0,5 kb a partir do códon de INTERRUPÇÃO; Mach e col. (1994) Transformation of Trichoderma reesei based on hygromycin B resistance using homologous expression signals. Curr. Genet. 25: 567.) e origina-se a partir do plasmídio pRLMex30. * fragmento de egi1 5': O fragmento de egH 5' de 1,8 kb (Seal -Stu\) foi isolado de T. reesei QM 6a (Mandeis e Reese (1957) Induction of cellulase in Trichoderma viridae as influenced by carbon sources and metais. J. Bacteriol. 73: 269.). Este fragmento está situado cerca de 1,35 kb a montante da região de codificação de egH e ele foi usado para objetivar a integração do DNA de transformação no local de egH. ‘fragmento de eg!1 3': O fragmento de egH 3' de 1,6 kb (Seal -Xho\) foi, conforme o fragmento de 5', isolado de T. reesei QM 6a. O fragmento está situado 0,3 kb a jusante da extremidade do gene de eg!1 e é usado para a objetivação do DNA de transformação no local de eg!1.

Os métodos padrões de DNA descritos por Sambrook e col. (1989) Em: Molecular cloning: a laboratory manual, 2~ ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., foram usados na construção dos vetores. As enzimas de restrição, T4 DNA ligase, fragmento de Klenow da DNA polimerase I, T4 DNA polimerase, polinucleotídeo cinase e Taq pofimerase, eram da Boehringer Mannheim, Alemanha) e da New England Biolabs (EUA). Cada enzima foi usada de acordo com as instruções do fabricante. O DNA do plasmídio foi isolado utilizando-se as colunas Qiagen (Qiagen GmbH, Alemanha) ou Promega Magic Minipreps (Promega, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. Os oligonucleotídeos usados nas reações por PCR e nas reações de seqüênciamento foram sintetizados por um Sintetizador de DNA ABI (Applied Biosystems, EUA) 381 A. O seqüênciamento de DNA foi feito conforme descrito no Exemplo 19.

Os fragmentos de DNA para a clonagem ou as transformações foram isolados a partir de géis de agarose de baixo ponto de fusão (FMC Bioproducts, EUA) por tratamento com β-agarose I (New England Biolabs, EUA) ou por utilização do Kit de Extração de Gel QIAEX (Qiagen GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fornecedor. O T, reesei ALK0362Q foi transformado conforme descrito por Penttilã e col. (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155.) com as modificações descritas em Karhunen e col. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei, I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241: 515.). Os transformantes de T. reesei foram transferidos em um meio seletivo e purificados através de conídios. Os transformantes foram estabilizados por cultivo dos mesmos sobre inclinações seletivas por duas gerações antes da esporulação sobre o ágar de dextrose de batata. Exemplo 30 Características dos transformantes que produzem a celulase de 20K de Melanocarpus albomyces ALK04237 Os transformantes purificados foram desenvolvidos em frascos com agitação, em um meio contendo 4 % de soro de leite, 1,5 % de fonte de nitrogênio complexa derivada de grão, 5 % de KH2P04 e 0,5 % de (NH4)2S04. As culturas foram desenvolvidas a 30°C e 250 rpm por 7 dias.

Os sobrenadantes da cultura foram manchados ("blotted") diretamente sobre os filtros de nitroceluiose por uma aparelhagem de manchar com um ponto ("dot-blot"). A CBHI foi detectada por imunotingimento usando um anticorpo monocionai específico para,CBHI Cl-258, e a EGI peio anticorpo monocionai específico EI-2 (Aho e c©I. (1991) Monocionai antibodies against core and ceiluiose-binding domains of Trichoderma reesei cellobiohydrolases I e II and endoglucanase I. Eur. J. Biochem. 200: 643.), e o sistema AP de Western blot ProtoBlot (Promega, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante.

As cepas de T. reesei ALK03620/pALK1231/14, ALK03620/pALK1231/16, ALKO3620/pALK1231/20 e ALKO3620/pALK1231/59 não contêm o gene de cbh1, O gene de cbh1 é substituído pelo gene marcador de amdS e pela construção de celulase de 20K no cassete de expressão de pALK1231. A substituição do gene de cbh1 foi verificada nas hibridações Southern. As cepas de T. reesei SALK0362Q/pALK1235/40 e ALKO3620/pALK1235/49 não contêm o gene de egl1. O gene de eg!1 é substituído pelo gene marcador de hph e pela construção de celulase de 20K nos cassetes de expressão de pALK1235. A substituição do gene de egH foi verificada nas hibridações por Southern. A cepa hospedeira ALKO3620 usada nas transformações é deficiente do gene de eg/2 (substituído pelo gene de ble de Streptoalioteichus hindustanus (Mattern e col., 1988, Drocourt e col., 1990). Assim, as cepas não produzem os componentes de celulase de Trichoderm EGII e CBHI ou EGI.

As amostras a partir dos sobrenadantes da cultura foram corridas sobre géis em lâminas de poliacrilamida contendo 0,1% de SDS no sistema de eletroforese Mini Protean II da Bio-Rad (EUA). O anticorpo policlonal preparado contra a celulase de 20K purificada foi usado para detectar a proteína produzida nos Western blots. Na detecção, o Sistema ProtoBlot® AP da Promega foi usado. O resultado do Western é mostrado na Figura 30. Os transformantes ALKO3620/pALK1235/49, ALK03620/pALK1235/40, ALKO3620/pALK1231/14 e ALKO3620/pALK1231/16 (caminhos 1, 2, 4 e 5) produzem uma proteína que reage com o anti-soro de celulase de 20K policlonal. O tamanho da proteína produzida pelos transformantes é o mesmo do tamanho da celulase de 20K purificada (caminho 6). O ALK0362G (caminho 3) não produz a proteína correspondente.

As atividades de endoglicanase dos transformantes foram determinadas conforme descrito no Exemplo 10. Quando 2% de carboximetilcelulose (CMC) foram usados como um substrato, a temperatura de reação foi alterada até 70 °C, e assim, a atividade de endoglicanase de ALK03620 foi inativada por calor. Quando utiliza-se 1 % de hidroxietilcelulose como um substrato, a inativação por calor foi efetuada antes das medições da atividade enzimática. As amostras do meio de desenvolvimento foram diluídas para o tampão de HEPES à 0,05 M, pH 7,0, e incubadas 20 min em 70 °C. A inativação por calor da endoglicanase I (a principal endoglicanase deixada em ALK03620) era quase completa. A atividade dos transformantes negativos para egl1 caiu cerca de 30% na inativação por calor, o que indica a inativação por calor pequena da celulase de 20K. As atividades de endoglicanase são apresentadas na Tabela XX. Quando a HEC foi o substrato, a atividade de celulase de 20K foi extrapolada para a atividade antes do tratamento térmico dividindo-se a atividade obtida após o tratamento térmico por 0,7.

Tabela XX. As atividades de endoglicanase de transformantes de T. reesei que produzem a celulase de 20K de Melanocarpus albomyces.

Atividade de celulase de 20K

Substrato CMC (unidades artificiais/ml) 70°C, pH 7,0 HEC 50°C, pH 7,0 _______ _ _____ ALKO3620 50*** 38*** ALKO3620/pALK1231/14 2400 350 ALKO3620/pALK1231/16 2600 350 AL KO3620/pAKL1231/20 6500 750 ALK03620/pALK1231/59 6800 750 ALK03620/pALK1231 /40 2400 325 ALKO3620/pALK1235/49 2100 350 * = não medida ** = não inativada por calor, contém também a celulase de 50K, a celulase B de 50K e outras atividades de celulase. *** = atividade devida às celulases de Trichoderma ) As atividades de endoglicanasé da cepa hospedeira de T reesei ALK03620 são quase totalmente inativadas por calor a 70°C. Os transformantes que produzem a celulase de 20K de Melanocarpus albomyces produzem quantidades substanciais de celulase de 20K relativamente estável ao calor. O nível de produção de endoglicanase dos transformantes é diversas vezes maior do que aquele da cepa parental de celulase de 20K ALK04237.

Exemplo 31 Produção de celulase de 50K de Melanocarpus albomyces ALK04237 em T. reesei As cepas de Trichoderma reesei foram construídas para a produção de celulase de 50K de Melanocarpus albomyces ALK04237. As cepas produzem a celulase de 50K de Melanocarpus e são incapazes de produzir a endoglicanase II e a celobiohidrolase I ou a endoglicanase I de Γ. reesei. Na construção das cepas que produzem a celulase de 50K de Melanocarpus albomyces, a cepa de Trichoderma reesei parental ALKO3620 foi transformada com os cassetes de expressão do plasmídio pALK1238 ou pALK1240 (Figuras 31 e 32). Nos cassetes, a celulase de 50K é expressa a partir do promotor de cbh1 forte. A integração dos cassetes de expressão resulta nas substituições do gene de cbh1 parental (pALK1238) ou do egl1 (pALK1240). A clonagem e a transformação foram feitas conforme descritas no Exemplo 29, exceto que o gene de celulase de 20K foi substituído pelo gene de celulase de 50K (fragmento de 1,7 kb começando a partir do códon de ATG) descrito no Exemplo 22. Os transformantes que produzem a celulase de 50K de Melanocarpus albomyces são então caracterizados similares ao exemplo 30, com modificações óbvias para uma pessoa versada na técnica. Os transformantes que produzem a celulase B de 50K de Melanocarpus albomyces e a proteína com CBD podem ser criados similares aos Exemplos 29 e 30, com modificações óbvias para uma pessoa versada na técnica.

Tendo agora completamente descrito a invenção, será entendido por aqueles versados na técnica que a invenção pode ser efetuada dentro de uma faixa ampla e equivalente de condições, parâmetros e similares, sem afetar o espírito ou o escopo da invenção, ou de qualquer modalidade da mesma. Todas as referências citadas aqui são completamente incorporadas por referência.

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RECEBIMENTO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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FORMULÁRIO INTERNACIONAL ESTABELECIMENTO DA VIABILIDADE expedido de acordo com a Regra 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2 (a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável.

Formulário BP/9 primeira página) ’ Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

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expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA

INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Primalco Ltd. Biotec Valta-Akseli FIN-05200 Rajamãki ESTABELECIMENTO DA VIABILIDADE expedido de acordo com a Regra 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na Darte inferior desta Dáaina maicar a aaia ao aeposno originai ou, onae um novo aeposito ou uma transterencia tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

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Valta-Akseli ORIGINAL FIN-05200 Rajamãki expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Valta-Akseli expedido de acordo com a Regra 10.2 pela FIN-05200 Rajamãki AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIO- NAL _____ identificada na parte inferior desta página_ 1 Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

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FIN-05200 Rajamáki ORIGINAL

expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Primalco Ltd. Biotec Valta-Akseli ESTABELECIMENTO DA VIABILIDADE FIN-05200 Rajamáki expedido de acordo com a Regra 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos. i Formulário DSMZ-BP/9 (página única) 0196 INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regra do PCT 13bis) Formulário PCT RO/184 (julho de 1992) TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA OS PROPÓSITOS DE PROCEDIMENTO

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expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA

INTERNACIONAL _____________________________________identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL _________________________________________identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Valta-Akseli expedido de acordo com a Regra 10.2 pela FIN-05200 Rajamãki AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Indicara data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

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FIN-05200 Rajamâki ORIGINAL

expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL ___________identificada na parte inferior desta página_ 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Primalco Ltd. Biotec Valta-Akseli ESTABELECIMENTO DA VIABILIDADE FIN-05200 Rajamãki expedido de acordo com a Regra 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página 1 Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da.transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

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expedido de acordo com a Regra 7.1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL ___________________ identificada na parte inferior desta página 1 Onde a Regra 6.4 (d) aplicar-se, tal data é a data na qual a situação legal da autoridade depositária internacional foi obtida.

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Primalco Ltd. Biotec Valta-Akseli ESTABELECIMENTO DA VIABILIDADE FIN-05200 Rajamáki expedido de acordo com a Regra 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página_ 1 Indicar a data do depósito original ou, onde um novo depósito ou uma transferência tiver sido feita, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou a data da transferência). 2 Nos casos referidos na Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente. 3 Marcar com uma cruz o quadrado aplicável. 4 Preencher se a informação tiver sido requerida e se os resultados do teste forem negativos.

Formulário DSMZ-BP/9 (página única) 0196 REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que contém o DNA genômico de celulase 20K representado pela SEQ ID NO: 30 contendo regiões codifi-cantes de códons 33-115, 187-435 e 506-881 e codificando o polipeptídeo 20K maduro representado pelos aminoácidos 22 a 235 (214 aminoácidos) da SEQ ID NO: 31.

2. Microorganismo transformado, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de expressão contendo tal cDNA de celulase representado pelos códons 33-115, 187-435 e 506-881 da SEQ ID NO: 30 e codificando o polipetídeo maduro.

3. Microorganismo transformado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o cDNA está ligado de forma operável às seqüências de controle da expressão permitindo a expressão no dito microorganismo transformado.

4. Microorganismo transformado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pertence aos fungos filamentosos.

5. Microorganismo transformado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pertence ao gênero Trichoderma ou Asper-gillus.

6. Microorganismo transformado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é o Trichoderma reesei.

7. Método para o biotratamento com pedras, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição da preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo 20K compreendendo a seqüência de aminoáci-do SEQ ID NO: 31 ou um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nu-cleotídeo SEQ ID NO: 30 ao tecido ou roupas contendo algodão.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tecido ou as roupas é o brim.

9. Método para o bioacabamento, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição da preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo 20K compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 31 ou um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 30 aos materiais têxteis como os tecidos ou as roupas ou o fio.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os materiais têxteis são fabricados de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose feitas pelo homem ou são misturas das mesmas.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os materiais têxteis são combinações de fibras sintéticas e fibras contendo celulose.

12. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende a preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo 20K compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 31 ou um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 30 e um agente ativo de superfície ou tensoativo.

13. Método para o tratamento de material têxtil contendo fibra celulósica, caracterizado pelo fato de que compreende misturar o dito material têxtil com a composição detergente como definida na reivindicação 12.

14. Método para o tratamento de polpa ou fibra derivada de madeira, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adicionar a preparação de enzima compreendendo um polipeptídeo 20K compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 31 ou um polipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 30 à polpa ou fibra secundária mecânica ou químicamente derivada de madeira.