JP2023553288A - バクテリオファージに対する低減された感受性を有する細菌 - Google Patents

Abstract

自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されている細菌株であって、バクテリオファージに対する低減された感受性を有する細菌株、細菌株を含む細菌組成物及び株又は組成物の、食品又は飼料製品の製造での使用。

Description

本発明は、バクテリオファージに対する低減された感受性を有する細菌株に関する。本発明は、本発明の少なくとも１つの株を含む組成物及びこの株又は組成物の、乳製品等の食品を製造するか又は飼料を製造するための使用に関する。

細菌のスターター培養は、食品業界において、乳製品（ヨーグルト、バター及びチーズ等）、肉製品、ベーカリー製品、ワイン及び野菜製品を含む発酵製品の製造に広範囲にわたって用いられている。

病原性細菌ウイルス（バクテリオファージ又はファージ）による細菌培養体の攻撃及び増殖は、細菌培養体の産業用途に関する主要な問題の１つであると考えられており、細菌培養体の生成が失敗する原因となっている。商業的発酵の性質に起因して、病原性ファージが産業環境において一般的に見出される。管理されないままであれば、バクテリオファージは、発酵に干渉して、プロセスの中断及び製品の品質ロスをもたらす。バクテリオファージは、業界で用いられる多くの細菌株に見出されており、感染メカニズムが異なる多数の異なる種類のファージが存在する。バクテリオファージの新しい株が出現し続けている。

典型的には、バクテリオファージの溶解感染サイクルは、細菌宿主細胞表面へのファージ吸着、細胞へのファージＤＮＡの注入、ファージＤＮＡ複製、ファージタンパク質発現、ファージアセンブリ及びアセンブルされたファージを放出するための宿主細菌細胞溶解を伴う。細菌のファージ耐性メカニズムは、ファージ複製の溶菌サイクルの１つ以上の工程に関与する宿主因子によって決まり、通常、干渉する感染サイクルの工程に基づいて分類される。

バクテリオファージ感染及びそれによる細菌培養の失敗を最小限に抑えるために業界で用いられている戦略は、完全には有効でない。そのような戦略として、ファージ攻撃に対してある程度のレベルの耐性が存在することを確実にするための混合スターター培養の使用が挙げられる。様々なバクテリオファージに対して感受性である、選択された細菌株のローテーションも用いられている。しかしながら、新しいファージの出現後の細菌株の耐性株との迅速な置き換えは、通常、可能でない。したがって、食品業界においてファージ混入を排除することは、依然として可能でない。

食品業界又は飼料業界で用いられる向上した細菌株、例えばファージ耐性である細菌株を提供することは、当技術分野で必要とされ続けている。したがって、乳酸菌、例えば連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属におけるファージ感染に関与する宿主因子を特定する必要がある。

本発明者らは、驚くべきことに、自己分解酵素をコードする宿主遺伝子がファージ複製に関与すること及びＰ３３５様ファージＤ６８６７等のバクテリオファージにとってその溶菌サイクルを完了するために必須であることを見出した。自己分解酵素遺伝子内の変異は、Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等のバクテリオファージに対する耐性を有する宿主細胞（乳酸菌等）を提供する。変異株の、感受性株の自己分解酵素遺伝子との相補性により、ファージ感受性表現型の復元が生じる。本発明者らは、自己分解酵素内に変異を含む細菌が、商業的に許容可能な乳酸性化動力学を維持して、発酵製品、例えば発酵乳製品等の食品又は飼料を生成する方法での使用に適するようにすることも実証した。

一態様において、本発明は、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されている細菌株であって、バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する低減された感受性を有する細菌株を提供する。

適切には、修飾は、自己分解酵素をファージ感染に関して部分的に又は完全に機能不全にし得る。

適切には、修飾は、終止コドン、挿入、欠失又は変異であり得る。

適切には、修飾は、前記自己分解酵素をコードする核酸配列中又は前記自己分解酵素の発現の制御に寄与する調節領域（プロモーター若しくはエンハンサー等）中に導入され得る。

適切には、細菌株は、自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含むように修飾され得、前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減し、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される。

適切には、細菌株は、修飾についてホモ接合性であり得る。

一態様において、本発明は、バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する細菌株の耐性を増大させる（例えば、付与するか又は増大させる）方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させることによって前記細菌株を修飾することを含む方法を提供する。

一態様において、本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異型株（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７に対する耐性等）を調製する方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させるように親細菌株を修飾することを含む方法を提供する。

適切には、本発明に従う方法は、
ａ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対して感受性の細菌株（ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の乳酸菌株等）を提供することと；
ｂ）自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように前記細菌株を修飾することと；
ｃ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する低減された感受性を有する株を回収することと
を含み得、任意選択的に、少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって判定される。

一態様において、本発明は、本発明に従う方法によって得ることができるか又は得られる細菌株を提供する。

一態様において、本発明は、本明細書中で定義される変異自己分解酵素タンパク質（自己分解酵素^Ｒタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを提供する。

適切には、本発明に従うポリヌクレオチドは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減し得、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される。

一態様において、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチドを含む構築体又はベクターを提供する。

一態様において、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド又は本発明に従う構築体若しくはベクターの、少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する細菌株の感受性を低減するための使用を提供する。

本発明のいずれかの態様において、ファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する感受性の低減は、少なくとも４対数、少なくとも５対数又は少なくとも６対数のＥＯＰ低減によって特徴付けられ得る。

本発明のあらゆる態様において、修飾は、
ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有する自己分解酵素タンパク質；
ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７のＥＯＰを低減しない、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む自己分解酵素変異型タンパク質であって、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、自己分解酵素変異型タンパク質；
ｃ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７の、３対数未満のＥＯＰを低減する、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む自己分解酵素変異型タンパク質であって、前記Ｄ６８６７誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、自己分解酵素変異型タンパク質；
ｄ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７のＥＯＰを低減しない、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２の相同体であって、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、相同体；及び
ｅ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７の、３対数未満のＥＯＰを低減する、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２の相同体であって、前記Ｄ６８６７誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、相同体
からなる群から選択される自己分解酵素タンパク質に対する、アミノ酸の抑制、アミノ酸の付加、アミノ酸の置換又はアミノ酸の抑制及び付加を含む自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードし得る。

本発明のあらゆる態様において、修飾は、自己分解酵素のＹｊｄＢドメインのトランケーションをもたらし得る。

本発明のあらゆる態様において、トランケートされた自己分解酵素タンパク質は、自己分解酵素対立遺伝子内の欠失及び／又は挿入の結果であり得る。

本発明のあらゆる態様において、トランケートされた自己分解酵素タンパク質は、終止コドンに至るヌクレオチド変異の結果であり得る。

本発明のあらゆる態様において、細菌株は、そのｐｉｐ遺伝子内で追加的に変異されており、且つｃ２型ｃ２ファージに対する耐性を有し得る。

本発明のあらゆる態様において、細菌株は、そのｙｊａＥ遺伝子内で追加的に変異されており、且つｂｉｌ６７型ｃ２ファージに対する耐性を有し得る。

本発明のあらゆる態様において、細菌株は、乳酸菌株であり得、適切には、乳酸菌株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属から選択され得、適切には、株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものであり得、適切には、前記株は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｂｉｏｖａｒ．ジアセチラクティス（Ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種であり得る。

一態様において、本発明は、本発明に従う細菌株を含む細菌組成物を提供する。細菌組成物は、任意選択的に、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選択される１つ以上の更なる乳酸菌を更に含み得る。

一態様において、本発明は、本発明に従う細菌株又は本発明に従う細菌組成物を含む食品又は飼料製品を提供する。製品は、乳製品、肉製品又は禾穀類食品若しくは飼料製品、より詳細には発酵乳製品であり得る。

適切には、乳食品又は飼料製品は、発酵乳製品、例えば発酵乳、ヨーグルト、クリーム、熟成クリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳飲料、プロセスチーズ、クリームデザート、カッテージチーズ又は乳児用ミルクであり得る。

一態様において、本発明は、発酵製品を製造する方法であって、
ａ）基質、好ましくは乳基質に、本発明に従う細菌株又は本発明に従う細菌組成物を植菌することと；
ｂ）工程ａ）から得られる植菌された基質を発酵させて、発酵製品、好ましくは発酵乳製品を得ることと
を含む方法を提供する。

一態様において、本発明は、本発明に従う細菌株又は本発明に従う細菌組成物の、食品又は飼料製品を製造するための使用を提供する。製品は、発酵食品であり得る。製品は、発酵乳製品であり得る。

ＳＬ１２６９９のファージ耐性変異型において自己分解酵素タンパク質内に見出される３つの変異の比較を示す。数直線は、自己分解酵素タンパク質のアミノ酸配列を表し、そのバー内のボックスは、タンパク質が今後転写されることのない場所を示す。種々のドメインの位置は、変更されたタンパク質の下に示されている。 自己分解酵素ミュータントＳＬ１２８５２の乳酸性化活性を親ＳＬ１２６９９と比較する。 ＳＬ１２８５２の乳酸性化活性を、種々の感染多重度値（ＭＯＩ）のファージＤ６８６７を加えて示す。 ＳＬ１２６９９の乳酸性化活性を、種々のＭＯＩのファージＤ６８６７を加えて示す。ファージ感受性親株によるこの試験は、図３における試験のための対照の役割を果たす。

一般的な定義
特に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本開示は、本明細書中で開示した例示的な方法及び原材料によって限定されず、本明細書中に記載されるものと類似又は同等のいかなる方法及び原材料も本開示の実施形態の実施又は試験に用いることができる。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。

本明細書中で提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって理解することができる本開示の種々の態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、直下で定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより詳細に定義される。

本明細書中で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、用語「ヌクレオチド配列」及び／又は用語「核酸配列」と同義である。特に示されない限り、いずれの核酸配列も、左から右に向けて５’から３’の向きに記す。

本明細書中で用いられる用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含む。本明細書中で用いられる用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸の名前、アミノ酸残基についての従来型の１文字コード及び３文字コードを用いることができる。ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従って定義されるアミノ酸についての３文字コード。ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重に起因して、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。特に示されない限り、いずれのアミノ酸配列も、左から右に向けてアミノからカルボキシの向きに記す。

本発明において、本発明で用いられる自己分解酵素におけるアミノ酸残基位置の特定のナンバリングが使用され得る。サンプル自己分解酵素のアミノ酸配列の、配列番号２の自己分解酵素とのアラインメントにより、前記サンプル自己分解酵素内のアミノ酸残基位置に、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基位置又はナンバリングに対応する番号を割り当てることが可能である。

用語の他の定義が本明細書の全体にわたって表示され得る。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されないため、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定であることを意図されないことも理解されるべきであり、なぜなら、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。

値の範囲が与えられる場合、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値も下限の単位の少数第一位まで具体的に開示されていると理解される。表示範囲内の任意の表示値又は介在値と、その表示範囲内の任意の他の表示値又は介在値との間のより狭い各範囲が本開示内に包含される。これらのより狭い範囲の上限値及び下限値は、独立して、その範囲内に包含されるか又は除外され得、そのより狭い範囲内に何れか若しくは両方の限界値が含まれるか、又は両方の限界値が含まれない場合の各範囲も、表示範囲から任意の限界値が具体的に除外されることを前提として本開示に包含される。表示範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

本明細書中で、且つ添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、前後関係が明らかに特に指示しない限り、複数形指示対象を含むことが留意されなければならない。

本明細書中で用いられる用語「含んでいる」、「含む」及び「構成される」は、「包含している」、「包含する」又は「含有している」、「含有する」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、列挙されていない追加の部材、要素又は方法工程を除外しない。用語「含んでいる」、「含む」及び「構成される」は、用語「からなる」も含む。

本明細書中で考察される刊行物は専ら、その開示について、本出願の出願日よりも前に提供されている。本明細書中では、そのような刊行物は何れも、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈されるべきでない。

自己分解酵素
本発明者らは、驚くべきことに、自己分解酵素をコードする宿主遺伝子が、例えば、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の乳酸菌等の細菌株におけるバクテリオファージ増殖に関与する細菌宿主因子であることを見出した。

一態様において、本発明は、バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ等）に対する細菌株の耐性を増大させる（例えば、付与するか又は増大させる）方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させる（又は阻害する）ことにより、前記細菌株を修飾することを含む方法を提供する。

用語「バクテリオファージに対する耐性の増大」は、以下に記載されるアッセイ「プラーク形成効率アッセイＩ」等のプラークアッセイで試験した場合の細菌株の、少なくとも１つのファージに対するファージ耐性が向上していることを表す。

一態様において、本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異型株（少なくとも１つのＰ３３５様ファージに対する耐性等）を調製する方法であって、親細菌株を、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させる（又は阻害する）ように修飾することを含む方法を提供する。細菌耐性変異型株は、親の株と比較した場合、少なくとも１つのファージに対するファージ耐性が増大している。

換言すると、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する（又は阻害する）修飾が細菌株に導入されている。適切には、前記自己分解酵素の活性又は発現は、完全に除外され得る。

自己分解酵素の「発現」は、自己分解酵素の転写又は翻訳のレベルを指し得る。遺伝子発現は、ＲＮＡレベル及びタンパク質コード遺伝子についてタンパク質レベルにおいて測定され得る。例えば、ＲＮＡレベルは、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、ノーザンブロッティング、ＤＮＡマイクロアレイによって測定することができ、タンパク質レベルは、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び質量分析によって測定することができる。

自己分解酵素の「活性」は、ファージ感染に関連して、自己分解酵素の活性を指す。

修飾は、自己分解酵素をファージ感染に関して部分的に又は完全に機能不全にし得る。

本明細書中で用いられる用語「機能不全」は、本発明の目的に関連して理解されるべきである。目的は、自己分解酵素タンパク質が、対応する野生型株におけるよりも有効でない株を製造することである。例えば、自己分解酵素遺伝子内に、自己分解酵素タンパク質を発現することができない機能不全遺伝子を与えるか、又は部分的な長さの不活性自己分解酵素タンパク質を発現することができる終止コドン又はフレームシフト挿入を導入することによる。代わりに、例えば、変異型が発現される自己分解酵素タンパク質変異を生成することができるが、本明細書中の全ての目的について活性でない変異を遺伝子内で形成することができる。自己分解酵素タンパク質の活性を測定する一方法は、代表的なファージ、例えばＤ６８６７等のＰ３３５様ファージに対する耐性の増大について細菌株を分析するものである。細菌株の、代表的なファージに対する耐性が増大している場合、自己分解酵素タンパク質は、少なくとも部分的に不活性であるか又は完全に不活性であることが理解される。一態様において、自己分解酵素タンパク質は、完全に不活性とされる。

修飾は、終止コドン、挿入（例えば、フレームシフトを引き起こす）、欠失又は変異であり得る。換言すると、自己分解酵素の活性及び／又は発現は、終止コドン、挿入（例えば、フレームシフトを引き起こす）、欠失又は変異の導入によって低減される。

修飾（例えば、変異）は、前記自己分解酵素をコードする核酸配列中又は前記自己分解酵素の発現の制御に寄与する調節領域（プロモーター若しくはエンハンサー等）中に導入され得る。

本明細書中で用いられる「自己分解酵素」は、それを生成する細菌の細胞壁ペプチドグリカンを分解する内因性溶解酵素を指す。自己分解酵素は、ペプチドグリカンヒドロラーゼと分類される。

自己分解酵素は、細胞増殖、細胞壁代謝、細胞分裂及び分離並びにペプチドグリカンターンオーバーに関与する。一部のバクテリオファージ（肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等）は、遍在する宿主自己分解酵素を利用して、最適な宿主細胞溶解を達成すると考えられている。

乳酸菌の自己分解活性は、細胞内に位置決めされた酵素の、凝乳中への放出及びその風味成熟に及ぼす作用に起因する、乳製品の生産、例えばチーズ熟成における重要な因子である。チーズ生産における自動溶解細胞の主な結果は、ペプチド分解反応を促進することである一方、無傷細胞は、ラクトース発酵及び酸素除去等の生理学的反応に必須である。

ＳＬ１２６９９自己分解酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号１の相同体である。

一態様において、相同体は、ＹｊｄＢドメインを含む。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つＹｊｄＢドメインを含む。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列によってコードされる。一態様において、自己分解酵素は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列によってコードされ、且つＹｊｄＢドメインを含む。一態様において、自己分解酵素は、ＧＨ２５ムラミダーゼスーパーファミリードメインを追加的に含む。一態様において、自己分解酵素は、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。

一態様において、細菌株は、株ＳＬ１２６９９のアミノ酸配列の配列番号２を有する自己分解酵素に対応する（又はそれに等しい）自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されている。

ＳＬ１２６９９自己分解酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号２の相同体である。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列を含む。

一態様において、相同体はＹｊｄＢドメインを含む。

一態様において、自己分解酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を有する配列及びＹｊｄＢドメインを含む。

本明細書中で用いられる「ＹｊｄＢ」ドメインは、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを有する、保存された特徴のないドメインを指す。ＹｊｄＢドメインを含むタンパク質は、ＹｊｄＢスーパーファミリーとの比較によって特定され得る；例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０２０ Ｊａｎ ８；４８（Ｄ１）：Ｄ２６５－Ｄ２６８）を用いる。ＹｊｄＢドメインは、ｃｌ３５００７スーパーファミリーのメンバーである。

適切には、自己分解酵素は、配列番号２由来のＹｊｄＢドメインを含み得る。

一態様において、ＹｊｄＢドメインは、配列番号２の約アミノ酸３９４～約アミノ酸６７０に対応するアミノ酸配列又はその部分、例えば少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸若しくは少なくとも２７０アミノ酸を含み得るか又はそれからなり得る。一態様において、ＹｊｄＢドメインは、配列番号２の約アミノ酸３９４～約アミノ酸６７０に対応するアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％）の同一性を有する配列を含み得るか又はそれからなり得る。一態様において、ＹｊｄＢドメインは、配列番号２のアミノ酸３９４～アミノ酸６７０に対応するアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％）の同一性を有する配列を含み得るか又はそれからなり得る。

一態様において、自己分解酵素は、ＧＨ２５ムラミダーゼスーパーファミリードメインを含む。

本明細書中で用いられる「ＧＨ２５ムラミニダーゼドメイン」は、グリコシルヒドロラーゼ２５ドメインを指す。ＧＨ２５ファミリーは、細菌ペプチドグリカン（ＰＧ）の糖部分に作用して、グリカン鎖のＭｕｒＮＡｃ（Ｎ－アセチルムラミン酸）残基とＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルＤ－グルコサミン）残基との間のβ－１－４グリコシド結合を切断する一群のヒドロラーゼを含む。ＧＨ２５ドメインを含むタンパク質は、オリゴ糖及び多糖をアセンブル、修飾、且つ分解する酵素の分類を提供するＴｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓのデータベースｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ ＧＨ２５（Ｌｏｍｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４２，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，１ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４，Ｐａｇｅｓ Ｄ４９０－Ｄ４９５）内のドメインとの比較によって特定され得る。

一態様において、ＧＨ２５ドメインは、配列番号２の約アミノ酸９０～約アミノ酸３１１に対応するアミノ酸配列又はその部分、例えば少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸又は少なくとも２２０アミノ酸を含み得るか又はそれからなり得る。一態様において、ＧＨ２５ドメインは、配列番号２の約アミノ酸９０～約アミノ酸３１１に対応するアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％）の同一性を有する配列を含み得るか又はそれからなり得る。一態様において、ＧＨ２５ドメインは、配列番号２のアミノ酸９０～アミノ酸３１１に対応するアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％）の同一性を有する配列を含み得るか又はそれからなり得る。

一態様において、本発明に従う細菌株は、自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含むように修飾されており、前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減し、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、自己分解酵素対立遺伝子が前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、本明細書中に記載されるプラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される。

本発明者らは、驚くべきことに、自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードするような自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子がＰ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等の少なくとも１つのファージに対する細菌株（例えば乳酸菌）の感受性を低減することを見出した。

一態様において、本発明は、自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を特定する方法であって、
ａ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９の自己分解酵素遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験される自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子（候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子）を導入して、ＳＬ１２６９９誘導株を得ることと；
ｂ）工程ａ）のＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めることと
を含み、少なくとも４対数のＥＯＰ低減は、自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子である自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を示す、方法を提供する。

本明細書中で用いられる表現「自己分解酵素^Ｒ遺伝子の対立遺伝子」は、特定の細菌において見出される自己分解酵素遺伝子のバージョンを意味する。ほとんどの細菌遺伝子について、遺伝子のヌクレオチド配列は変動し得、対立遺伝子は、同じ遺伝子の異なる配列を表す。そのため、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９の自己分解酵素遺伝子の対立遺伝子は、配列番号１に示される通りである。配列番号１に定義されるこの対立遺伝子は、配列番号２に示される自己分解酵素タンパク質をコードする。

本発明者らは、特定の自己分解酵素対立遺伝子が、ＳＬ１２６９９の自己分解酵素遺伝子（配列番号１）の元の（すなわち天然の）対立遺伝子の代わりに挿入されている場合、ファージＤ６８６７に対するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９の感受性を低減できることを示した。これらの対立遺伝子は、「自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子」として本明細書中で定義される。これらの自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書中で「自己分解酵素^Ｒタンパク質」と称される。

そのため、ファージＤ６８６７（本明細書中で定義される）に対するＳＬ１２６９９株の感受性を低減するあらゆる自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子（自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする）は、本発明の一部である。換言すると、自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減する自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子として定義され、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その元の自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株である。

用語「感受性を低減する」は、「耐性を増大させる」、「耐性を向上させる」、「耐性を増強する」、「耐性を付与する」及び「抵抗力を向上させる」を含み得る。

一態様において、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する修飾は、欠失であり得る。欠失は、自己分解酵素遺伝子の全て又は一部の欠失をもたらし得る。換言すると、自己分解酵素遺伝子は、ノックアウトされている。適切には、欠失は、株ＳＬ１２６９９において、アミノ酸配列の配列番号２を有する自己分解酵素に対応する（又はそれに等しい）自己分解酵素遺伝子の全て又は一部の欠失をもたらし得る。

一態様において、欠失は、ＹｊｄＢドメインの少なくとも一部を除去する。一態様において、欠失は、ＹｊｄＢドメインの全てを除去する。一態様において、欠失は、単一のヌクレオチド欠失である。一態様において、欠失は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも２００ヌクレオチドの欠失である。一態様において、本明細書中に記載されるＹｊｄＢドメインの少なくとも一部の欠失は、自己分解酵素の活性及び／又は発現の低減並びにバクテリオファージに対する耐性の増大をもたらす。一態様において、本明細書中に記載されるＹｊｄＢドメインの少なくとも一部の欠失は、自己分解酵素の活性及び／又は発現の低減並びにバクテリオファージに対する耐性の増大をもたらす。

好ましい態様において、欠失は、配列番号１によってコードされる自己分解酵素遺伝子の位置１，２２５から始まる約１５３ヌクレオチドの欠失に対応する。

一態様において、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する修飾は、早期終止コドンを導入する変異であり得る。適切には、早期終止コドンは、自己分解酵素^Ｒタンパク質であるトランケートされた自己分解酵素タンパク質の発現をもたらし得る。例えば、早期終止コドンは、タンパク質のＣ末端から少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００又はそれを超えるアミノ酸のトランケーションをもたらし得る。好ましい態様において、トランケーションは、ＹｊｄＢドメインの少なくとも一部又は全ての欠失をもたらす。

好ましい態様において、修飾は、配列番号２によってコードされる自己分解酵素の約アミノ酸位置６２８の早期終止コドンに対応する。

好ましい態様において、修飾は、配列番号２によってコードされる自己分解酵素の約アミノ酸位置４１０の早期終止コドンに対応する。

細菌株
一態様において、本発明に従う細菌株は、乳酸菌株である。

本明細書中で用いられる用語「乳酸菌」又は「ＬＡＢ」は、糖を発酵させて乳酸を排他的又は支配的に産生するグラム陽性菌を指す。

産業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の中で見出される。したがって、一実施形態において、乳酸菌は、この属群から選択されることが好ましい。

一態様において、細菌株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する。

ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属亜種は、バクテリオファージ感染によって最も影響を受ける乳酸菌に含まれる。

一態様において、細菌株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種であり、適切には、株は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種由来であり得る。

適切には、細菌株は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｂｉｏｖａｒ．ジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）から選択され得る。

一部の好ましい実施形態において、本発明の細菌株は、感受性が低減されているか、又は少なくとも１つのファージに対して耐性である。一実施形態において、少なくとも１つのファージは、Ｐ３３５様ファージである。好ましい実施形態において、少なくとも１つのファージは、Ｄ６８６７である。

細菌のバクテリオファージ感受性を測定する一方法は、適切なバクテリオファージ又はバクテリオファージのパネルを用いる標準的なＥＯＰアッセイによるものである。したがって、一実施形態において、本発明の細菌株のバクテリオファージ感受性（又は耐性）は、標準的なＥＯＰアッセイにより判定される。好ましい実施形態において、本発明の乳酸菌のバクテリオファージ感受性（又は耐性）は、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩにより判定される。

一実施形態において、本発明の細菌株は、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されていない対応する細菌株と比較して、少なくとも１つのファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する低減された感受性を有する。

一態様において、細菌株は、ＹｊｄＢドメインを含む自己分解酵素をコードする自己分解酵素遺伝子を含む。一態様において、細菌株は、ＹｊｄＢドメイン及びＧＨ２５ドメインを含む自己分解酵素をコードする自己分解酵素遺伝子を含む。

一態様において、修飾前の細菌株は、ＹｊｄＢドメイン又はＹｊｄＢドメイン及びＧＨ２５ドメインの両方を含む自己分解酵素をコードする自己分解酵素遺伝子を含む。一部の態様において、親株は、ＹｊｄＢドメイン又はＹｊｄＢドメイン及びＧＨ２５ドメインの両方を含む自己分解酵素をコードする自己分解酵素遺伝子を含む。

一態様において、本発明に従う細菌株は、商業的に許容可能な乳酸性化速度を維持する。換言すると、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する修飾は、細菌株の乳酸性化速度を大幅に損なわない。

乳酸性化速度を測定する方法は、当技術分野で知られている。例えば、国際公開第２００６０４２８６２号パンフレットである。乳酸性化速度は、本明細書中の実施例に記載されるように測定され得る。

乳酸性化アッセイは、
株を１１％脱脂乳（ＮＦＤＭ）中で一晩増殖させることと；
増殖物をＭ１７－Ｌａｃ中に移すことと；
培養体が約０．６５のＯＤ_６００に達すると、０．７５％で活性乳（市販の１％脂肪Ｋｅｍｐ）中に植菌することと；
培養体を３０℃水浴内において、ｐＨプローブと共に一晩維持して、約２分毎に各株の酸性化を監視することと
を含み得る。

バクテリオファージ
本明細書中で用いられる用語「バクテリオファージ」は、当技術分野で理解される従来の意味を有し、すなわち細菌に感染するウイルスである。多くのバクテリオファージは、細菌の特定の属、種又は株に特異的である。用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と同義である。

３つの種、Ｐ３３５、９３６及びｃ２のファージは、主に全世界の乳発酵の失敗の原因である。

一態様において、本発明に従う細菌株は、Ｐ３３５型ファージ、Ｐ３３５様ファージ、９３６型ファージ、９３６様ファージ、ｃ２型ファージ又はｃ２様ファージから選択されるバクテリオファージに対する低減された感受性を有する。

「様」と記載されるファージは、特定のファミリーのメンバーとの構造的且つ／又は機能的又は機械学的類似性を共有するファージを指す。

ファージＰ３３５は、サイフォウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属しており、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種に対する病原性型ファージである。Ｐ３３５ファージは以前に、４つのサブグループ（Ｉ～ＩＶ）に分類されている。Ｐ３３５ファージのファミリーは、参照ファージＰ３３５、Ｔｕｃ２００９、ＲＰ９０１－１、ＢＫ５－Ｔ、ｒｌｔ、ＬＣ３ ｕｌ３６及び４２６８を含む。これらのファージに、このグループアサインメントをサザンハイブリダイゼーション及び形態学的分析（比較配列分析によってその後確認）に基づいて与えた。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ゲノムプロジェクトは、一部のラクトコッカス株におけるプロファージ及びプロファージレムナントの存在も実証している。

一態様において、バクテリオファージは、Ｐ３３５様バクテリオファージである。

本明細書中で用いられる「Ｐ３３５様」ファージは、Ｐ３３５ファミリーのメンバーとの構造的且つ／又は機能的類似性を共有するファージを指す。

乳酸菌、例えばラクトコッカス属の株が挙げられる細菌の種に感染するＰ３３５型ファージが知られており、その機能又は遺伝分析若しくはゲノム分析に基づいて特定することができる。

Ｐ３３５型ファージが挙げられる多数のファージの配列が知られており、公開データベースにおいて入手可能であり、例えば、いくつかのＰ３３５ファージについてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、以下の通りである：Ｔｕｃ２００９（ＮＣ＿００２７０３．１）；ＴＰ９０１－１（ＮＣ＿００２７４７．１）；ＬＣ３（ＮＣ＿００５８２２．１）；Ｐ３３５（Ｑ８３８７２８．１）；ｕｌ３６（ＮＣ＿００４０６６．１）；Ｑ３３（ＪＸ５６４２４２．１）；ＢＫ５－Ｔ（ＮＣ＿００２７９６．１）；ｒ１ｔ（ＮＣ＿００４３０２．１）及びＢＭ１３（ＮＣ＿０２１８６１．１）。

一態様において、Ｐ３３５様ファージは、上述のＰ３３５ファージのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。一態様において、Ｐ３３５様ファージは、上述のＰ３３５ファージのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。

Ｍａｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，（Ｍａｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１７）１８：１４６）も、Ｐ３３５ファージを分類するマルチプレックスＰＣＲ法を記載している。サブグループに属するファージのＲＢＰコード遺伝子及び受容体結合タンパク質（ＲＢＰ）関連配列に基づいて、新進のＰ３３５ファージ単離体の検出及び分類を容易にする７対のプライマーを設計した。

ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌等のＬＡＢ細菌等の細菌に感染するＰ３３５様ファージの例として、ファージＤ６８６７がある。Ｄ６８６７ファージは、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて受託番号：ＤＳＭ ３３５９６に従って入手可能であった。このファージの宿主株は、Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌにおいて受託番号：ＤＳＭ ３３６０に従って入手可能であるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９である。

一態様において、Ｐ３３５様ファージは、Ｄ６８６７のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。一態様において、Ｐ３３５様ファージは、Ｄ６８６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。

好ましい態様において、バクテリオファージは、Ｄ６８６７である。

したがって、この好ましいファージを用いて、例えば本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩにより、本発明の修飾（変異又は自己分解性^Ｒ等）によって与えられるバクテリオファージに対する耐性（又は感受性）を判定することができる。

ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌等のＬＡＢ細菌等の細菌に感染するＰ３３５様ファージの別の例として、ファージＤ７１３８がある。

Ｄ６８６７及びＤ７１３８は、ＳＬ１２６９９において、プロファージに対する類似性が高い（それぞれ８５．１％及び９５．８％のペアワイズ同一性）。

一態様において、バクテリオファージは、細菌株において、Ｐ３３５様又はＰ３３５プロファージに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。換言すると、バクテリオファージは、細菌株からそれ自体以前に切り出された病原性プロファージである。

ポリヌクレオチド
一態様において、本発明は、細菌株における自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するポリヌクレオチド配列を提供する。

一態様において、本発明は、本発明の自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供する。一態様において、ポリヌクレオチドは、本発明の自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子である。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明の自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする。

本発明に関する用語「ポリヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含む。好ましくは、ＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味する。一実施形態において、用語「ポリヌクレオチド」は、ｃＤＮＡを意味する。

典型的には、本発明の範囲によって包含されるポリヌクレオチドは、組換え型であり、本明細書中に記載される組換えＤＮＡ技術（すなわち組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかしながら、本発明の代替の実施形態において、ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の化学的方法を用いて全て又は一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５－２３及びＨｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５－２３２を参照されたい）。

本明細書中で定義される特定の特性を有する、本発明に従うポリヌクレオチド又は修飾に適したタンパク質は、前記タンパク質を産生するあらゆる細胞又は生物から特定且つ／又は単離且つ／又は精製することができる。ポリヌクレオチドの特定及び／又は単離及び／又は精製について、種々の方法が当技術分野で周知である。

一例として、適切なポリヌクレオチドが特定且つ／又は単離且つ／又は精製されると、より多くのポリヌクレオチドを調製するＰＣＲ増幅技術が用いられ得る。更なる例として、タンパク質を産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。タンパク質のアミノ酸配列が知られていれば、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成且つ使用して、生物から調製されたゲノムライブラリーからタンパク質コードクローンを特定することができる。代わりに、別の知られているタンパク質遺伝子と相同の配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、タンパク質コードクローンを特定することができる。後者の場合、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いる。

代わりに、本発明に従うポリヌクレオチドは、確立された標準的な方法、例えばＢｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９－１８６９によって記載されるホスホラミダイト法又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：８０１－８０５によって記載される方法によって合成的に調製される合成ポリヌクレオチドであり得る。ホスホラミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製されて、アニールされ、ライゲートされ、且つ適切なベクター中にクローニングされる。

ポリヌクレオチドは、標準的な技術に従い、合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源（適宜）の断片をライゲートすることによって調製される混合のゲノム及び合成起源、混合の合成及びｃＤＮＡ起源又は混合のゲノム及びｃＤＮＡ起源のものであり得る。ライゲートされた各断片は、ポリヌクレオチド全体の種々の部分に対応する。ポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書又はＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１に記載される特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても調製され得る。

本発明によって包含されるポリヌクレオチドは、単離され得るか又は実質的に精製され得る。「単離された」又は「実質的に精製された」は、ポリヌクレオチドが、天然の状態でポリヌクレオチドと関連して通常見出される構成要素から実質的に又は本質的に遊離していることが意図される。そのような構成要素として、他の細胞物質、組換え生産由来の培地及び核酸を化学的に合成する際に用いられる種々の化学物質が挙げられる。

「単離された」ポリヌクレオチド又は核酸は、典型的に、核酸が由来した生物のゲノムＤＮＡ中の注目する核酸の側面に位置する核酸配列（５’末端又は３’末端に存在するコード配列等）から遊離している。しかしながら、分子は、組成物の基本的な特徴に悪影響を与えない、一部の追加の塩基又は部分を含み得る。

ベクター及び構築体
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、ベクター中に存在し得る。ポリヌクレオチド配列は、調節配列が適切な宿主生物によってポリヌクレオチド配列の発現を実現することができるように、調節配列に作動可能に連結され得、すなわち、ベクターは、発現ベクターであり得る。

用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロで発現することができる構築体を意味する。好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノム中に組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくは、ゲノム中への安定した組込みをカバーする。

ベクターは、適切な細菌宿主細胞中に形質転換されて、本明細書中で定義される特定の特性を有するポリペプチドの発現を実現し得る。

ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、導入される宿主細胞に依存することが多い。

ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含有し得る。代わりに、選択は、同時形質転換（国際公開第９１／１７２４３号パンフレットに記載）によって達成され得る。

ベクターは、問題となっている宿主細胞内でのベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を更に含み得る。そのような配列の例として、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢｌ １０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢｌ及びｐＩＪ７０２の複製起源がある。

用語「構築体」（「カセット」等の用語と同義）は、プロモーターに直接的又は間接的に付着しているポリヌクレオチド配列を含む。

間接的付着の一例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との中間にある、イントロン配列、例えばＳｈ１－イントロン又はＡＤＨイントロン等の適切なスペーサー群の提供である。一部の場合、その用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常結合する、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の天然の組合せを、両方が天然の環境に存在する場合にはカバーしない。

構築体は、遺伝子構築体の選択を可能とするマーカーを含有又は発現し得る。

一態様において、本発明は、本発明に従うポリヌクレオチド配列を含むベクター又は構築体を提供する。一態様において、本発明は、細菌株における自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するポリヌクレオチド配列を含むベクター又は構築体を提供する。一態様において、本発明は、本発明の自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含むベクター又は構築体を提供する。別の実施形態において、ベクター又は構築体は、本発明の自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。

一態様において、本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する細菌株の感受性を低減するための、本発明のポリヌクレオチド、構築体又はベクターの使用に関する。

細菌組成物
本発明は、少なくとも１つの、本発明の細菌株を含むか又はそれからなる細菌組成物にも関する。一態様において、細菌株は、乳酸菌株である。一実施形態において、細菌組成物は、純粋な培養体であり、すなわち単一の細菌株を含むか又はそれからなる。別の実施形態において、細菌組成物は、混合培養体であり、すなわち本発明の少なくとも１つの細菌株及び少なくとも１つの他の細菌株を含むか又はそれらからなる。「少なくとも」１つの他の細菌株とは、１つ以上、特に１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの株を意味する。

一態様において、本発明に従う細菌株は、以下のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｃｏｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カーノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｒｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、テトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のいずれかに由来する。

一実施形態において、本発明の細菌組成物は、本発明の少なくとも１つの細菌株並びにラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｃｏｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カーノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｒｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、テトラジェノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選択される種の１つ以上の更なる細菌を含むか又はそれからなる。

一実施形態において、本発明の細菌組成物は、本発明の少なくとも１つの細菌株並びにラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及びオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される種の１つ以上の更なる細菌を含むか又はそれらからなる。

一実施形態において、本発明の細菌組成物は、本発明の少なくとも１つの細菌株及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の１つ以上の更なる細菌を含むか又はそれらからなる。

ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種として、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｂｉｏｖａｒ．ジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種として、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、特にビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）亜種ｌａｃｔｉｓが挙げられる。他の乳酸菌種として、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）が挙げられる。

本明細書中で定義されるあらゆる細菌組成物の特定の実施形態において、純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、細菌組成物は、少なくとも１つのプロバイオティック株、例えばビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）を更に含む。

特定の態様において、細菌組成物は、先で定義される純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、凍結、乾燥、凍結乾燥、液体若しくは固体フォーマット、ペレット若しくは凍結ペレットの形態又は粉末若しくは乾燥粉末である。特定の態様において、本発明の細菌組成物は、特に１つ以上のボックス又はサシェ中に含有されている、凍結フォーマット又はペレット若しくは凍結ペレットの形態である。別の態様において、本明細書中で定義される細菌組成物は、特に１つ以上のボックス又はサシェ中に含有されている粉末形態、例えば乾燥粉末又は凍結乾燥粉末である。

特定の態様において、本発明の細菌組成物は、先で定義される純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、且つフォーマット（凍結、乾燥、凍結乾燥、液体若しくは固体フォーマット、ペレット若しくは凍結ペレットの形態又は粉末若しくは乾燥粉末）が何であれ、本発明の細菌株を、細菌組成物の１グラムあたり１０^５～１０^１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の範囲内に含まれる濃度で含む。特定の態様において、本発明の細菌組成物内の細菌株の濃度は、細菌組成物の１グラムあたり１０^７～１０^１２ｃｆｕの範囲内、特に少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０又は少なくとも１０^１１ＣＦＵ／細菌組成物ｇである。特定の態様において、凍結濃縮物又は乾燥濃縮物の形態である場合、細菌組成物内の（純粋培養体又は混合培養体としての）本発明の細菌株の濃度は、１０^８～１０^１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇの範囲内、より好ましくは少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１又は少なくとも１０^１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇである。

一態様において、本発明に従う細菌組成物は、スターター培養体である。多くの発酵乳、チーズ及びバター製品の製造に用いられるスターター培養体として、通常乳酸菌として分類される細菌の培養体が挙げられる。そのような細菌スターター培養体は、特定の特徴を、いくつかの機能を実行することによって種々の乳製品に与える。

細菌の市販の非濃縮培養体は、業界において「母培養体」と称され、生産場所、例えば乳業会社において発酵のための食用の出発材料、例えば乳に加えられる前に増殖される。

スターター培養体は、いくつかの細菌株を含み得、すなわち定義された混合培養体であり得る。したがって、スターター培養体は、本発明の細菌株及び更なる細菌株を含み得る。

例えば、スターター培養体は、乳業界での使用に適し得る。乳業界で用いられる場合、スターター培養体は、乳酸菌種、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種及び／又はプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種を追加的に含み得る。乳酸菌の培養体は、一般的に、発酵乳製品（バターミルク、ヨーグルト又はサワークリーム等）の製造並びにバター及びチーズ、例えばＢｒｉｅ又はＨａｒｖａｔｉの製造に用いられる。

適切な乳酸菌として、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種及びオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種又はそれらの組合せの一般的に用いられる株が挙げられる。

ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種として、広く用いられているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｂｉｏｖａｒ．ジアセチラクティス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）が挙げられる。

他の乳酸菌種として、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）が挙げられる。乳酸菌の中温菌培養体は、バターミルク、ヨーグルト又はサワークリーム等の発酵乳製品の製造並びにバター及びチーズ、例えばＢｒｉｅ又はＨａｒｖａｔｉの製造に一般的に用いられる。加えて、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）等のプロバイオティック株は、前記製造中、風味を増強するか又は健康を促進するために加えられ得る。

チェダーチーズ及びモンテレージャックチーズの製造に一般的に用いられる乳酸菌の培養体として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）又はそれらの組合せが挙げられる。

パスタフィラータ又はパルメザン等のイタリアンチーズの製造に一般的に用いられる乳酸菌の好熱培養体として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが挙げられる。他のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）等）は、所望の風味を得るために製造中に加えられ得る。本発明のスターター培養体についての生物の選択は、調製且つ処理される特定のタイプの生成物に依存する。そのため、例えばチーズ及びバターの製造には、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種の中温培養体が広く用いられるが、ヨーグルト及び他の発酵乳製品には、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種の好熱株が典型的に用いられる。

スターター培養体は、米国特許第４，６２１，０５８号明細書に開示されるもの等、当技術分野で周知の技術によって調製され得る。一例として、スターター培養体は、植菌原、例えば細菌を増殖培地に導入して、植菌された培地を生成して、植菌された培地を熟成させてスターター培養体を生成することによって調製され得る。

乾燥スターター培養体は、米国特許第４，４２３，０７９号明細書及び米国特許第４，１４０，８００号明細書において考察されるもの等、当技術分野で周知の技術によって調製され得る。

製品
本発明の細菌又は細菌組成物から調製されるか、それを含有するか又はそれを含むあらゆる製品が本発明に従って意図される。適切な製品として、以下に限定されないが、食品又は飼料製品が挙げられる。

これらとして、以下に限定されないが、果物、豆類、飼料作物及び野菜が挙げられ、派生製品、穀物及び穀物由来製品、乳食品及び乳食品由来製品、肉、鳥肉並びに海産食品が挙げられる。好ましくは、食品又は飼料製品は、乳製品、肉製品又は禾穀類製品である。

用語「食品」は、広義に用いられており、飼料、食材、食物成分、食物補助食品及び機能性食品が挙げられる。本明細書では、用語「食品」は、広義に用いられており、ヒトのための食品及び動物のための食品（すなわち飼料）を包含する。好ましい態様において、食品は、ヒト食用である。

本明細書中で用いられる用語「食物成分」は、製剤を含み、これは、食品に加えられるか又は加えることができ、例えば酸性化又は乳化を必要とする多種多様な製品に低いレベルで用いることができる製剤が挙げられる。

本明細書中で用いられる用語「機能性食品」は、栄養学的効果及び／又は味覚の満足感を提供することができるだけでなく、消費者に更なる有益な効果を届けることもできる食品を意味する。機能性食品の法的な定義は、存在しないが、この分野において関心があるほとんどの団体は、特定の健康効果を有するものとして市販されている食品が存在することに同意している。

本発明の細菌株又は細菌組成物は、食物成分、食物補助食品又は機能性食品であり得るか又はそれに加えられ得る。

食品は、用途、及び／又は使用モード、及び／又は投与モードに応じて溶液の形態又は固体としてのものであり得る。

本発明の細菌株又は細菌組成物は、食品、例えば菓子製品、乳製品、肉製品、鳥肉製品、魚製品及びベーカリー製品の１つ以上の調製に用いることができる。

一例として、細菌株又は細菌組成物は、ソフトドリンク、フルーツジュース又はホエータンパク質を含む飲料、茶、ココア飲料、乳飲料及び乳酸菌飲料、ヨーグルト、飲用ヨーグルト及びワインを調製する成分として用いることができる。

好ましくは、本明細書中に記載される食品は、乳製品である。より好ましくは、本明細書中に記載される乳製品は、以下の１つ以上である：ヨーグルト、チーズ（酸凝乳チーズ、ハードチーズ、セミハードチーズ、カッテージチーズ等）、バターミルク、クワルク、サワークリーム、ケフィア、発酵ホエーベースの飲料、クミス、乳飲料、ヨーグルト飲料、発酵乳、マチュアクリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳、乳製品リテンテート、プロセスチーズ、クリームデザート又は乳児用ミルク。

好ましくは、本明細書中に記載される食品は、発酵食品である。より好ましくは、本明細書中に記載される食品は、発酵乳製品、例えば発酵乳、ヨーグルト、クリーム、熟成クリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳飲料、プロセスチーズ、クリームデザート、カッテージチーズ、ヨーグルト飲料、乳製品リテンテート又は乳児用ミルクである。好ましくは、本発明に従う乳製品は、動物起源及び／又は植物起源の乳を含む。

乳は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ又はラクダ等の動物起源のものを意味することが理解される。乳という用語は、植物性ミルクと一般的に呼ばれているもの、すなわち処理された植物材料又はそうでなければ例えばマメ科植物（ダイズ、ヒヨコマメ、レンズマメ等）又は油糧種子（ナタネ、ダイズ、ゴマ、ワタ等）の抽出液にも当てはまり、その抽出液は、溶液中又はコロイド懸濁液中にタンパク質を含有し、そのタンパク質は、化学作用、酸発酵及び／又は熱によって凝固可能である。乳という文言は、動物性ミルク及び植物性ミルクの混合液も表す。

乳は、天然の状態の乳、還元乳、脱脂乳又は細菌の増殖若しくは発酵乳の以降のプロセシングに必須の化合物（例えば、脂肪、酵母抽出物のタンパク質、ペプトン及び／又は界面活性剤）が補充された乳であり得る。

一実施形態において、用語「乳」は、１０分±１分間の９０℃±０．２℃での加熱によって低温殺菌した３％（ｗ／ｗ）の半脱脂粉乳を補充した市販のＵＨＴ乳を意味する。

更なる態様において、発酵製品を製造する方法であって、ａ）基質に、本発明に従う細菌株又は本発明に従う細菌組成物を植菌することと、ｂ）植菌された基質を発酵させて、発酵製品を得ることとを含む方法が提供される。特定の実施形態において、本発明の細菌株は、本発明に従う細菌組成物、例えば純粋培養体又は混合培養体として植菌される。好ましくは、基質は、乳基質、より好ましくは乳である。「乳基質」とは、動物起源及び／又は植物起源の乳を意味する。特定の実施形態において、乳基質は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ又はラクダ等の動物起源のものである。乳は、天然の状態、還元乳、脱脂乳又は細菌の増殖若しくは発酵乳の以降のプロセシングに必須の化合物が補充された乳であり得る。好ましくは、乳基質は、固体の品目を含む。好ましくは、固体の品目は、果物、チョコレート製品又は禾穀類を含むか又はそれからなる。好ましくは、発酵製品は、発酵乳製品である。

本発明は、更なる態様において、食品又は飼料製品、好ましくは発酵食品、より好ましくは発酵乳製品を製造するための、本発明に従う細菌株又は細菌組成物の使用も提供する。本発明は、本発明の細菌株又は細菌組成物を用いて得られる、特に本発明の方法によって得られるか又は得ることができる発酵乳製品にも関する。そのため、本発明は、本発明の細菌株又は細菌組成物を含む発酵乳製品に関する。

特定の実施形態において、本発明の発酵乳食品は、フレッシュな発酵乳である。

少なくとも１つのファージに対する低減された感受性を有する細菌株の調製
一態様において、本発明は、バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ等）に対する細菌株の耐性を増大させる（例えば、付与するか又は増大させる）方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させることにより、前記細菌株を修飾することを含む方法を提供する。

適切には、前記細菌株は、商業的に許容可能な乳酸性化動力学を維持し得る。適切には、前記株は、食品／飼料生産、特に発酵乳製品等の発酵製品の生産に用いられる。

一態様において、本発明は、少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異型株（少なくとも１つのＰ３３５様ファージに対する耐性等）を調製する方法であって、親細菌株を修飾して、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させることを含む方法を提供する。

適切には、前記細菌株は、商業的に許容可能な乳酸性化動力学を維持し得る。適切には、前記株は、食品／飼料生産、特に発酵乳製品等の発酵製品の生産に用いられる。

一態様において、本発明に従う方法は、
ａ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対して感受性の細菌株（ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株等）を提供することと；
ｂ）前記細菌株を修飾して、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減することと；
ｃ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する低減された感受性を有する株を回収することと
を含み、任意選択的に、少なくとも１つのバクテリオファージ（例えばＰ３３５様ファージ）に対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって判定される。

一例として、本方法は、以下を含み得る：
・自己分解酵素タンパク質、例えば配列番号２として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、それに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するアミノ酸配列若しくは配列番号２の相同体を含むタンパク質をコードする核酸配列内に変異を与えること；
・自己分解酵素タンパク質、例えば配列番号２として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくはそれに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するアミノ酸配列若しくは配列番号２の相同体を含むタンパク質をコードする核酸配列のプロモーター内に変異を与えること；
・自己分解酵素遺伝子、例えば配列番号１又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくはそれに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列若しくは配列番号１の相同体を含む遺伝子の核酸配列内に変異を与えること；
・自己分解酵素遺伝子、例えば配列番号１又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくはそれに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列若しくは配列番号１の相同体を含む遺伝子の核酸配列のプロモーター内に変異を与えること；
・自己分解酵素タンパク質、例えば配列番号２として示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくはそれに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するアミノ酸配列若しくは配列番号２の相同体を含むタンパク質をコードする核酸配列のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供すること；
・自己分解酵素核酸配列、例えば配列番号１として示されるヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性（好ましくはそれに対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性）を有するヌクレオチド配列若しくは配列番号１の相同体を含む自己分解酵素遺伝子のレベルを低減するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを提供すること。

一実施形態において、本発明に従う細菌株は、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されている。一態様において、修飾は、自己分解酵素をファージ感染に関して部分的に又は完全に機能不全にし得る。

一態様において、修飾は、終止コドン、挿入、欠失又は変異である。換言すると、細菌株は、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する終止コドン、挿入、欠失又は変異を導入するように修飾されている。

一態様において、修飾は、前記自己分解酵素をコードする核酸配列中又は前記自己分解酵素の発現の制御に寄与する調節領域（プロモーター、オペロン又はエンハンサー等）中に導入されている。換言すると、自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減する修飾（例えば、変異、終止コドン、挿入又は欠失）は、コード領域又は調節領域中に導入されている。

更なる態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることができるか又は得られる細菌に関する。

配列同一性
本明細書中で言及される特定のアミノ酸配列及びポリヌクレオチドに加えて、本発明は、その変異体、相同体、誘導体及び断片を包含する。

用語「変異体」は、野生型配列と異なる、天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味するために用いられる。

用語「相同体」は、対象ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同じであると見なすことができる。

これに関連して、相同配列は、対象配列と少なくとも８０、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり得るアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、例えば、対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は、類似性（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明に関連して配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。

一態様において、自己分解酵素遺伝子の相同配列は、配列番号１及びＹｊｄＢドメインと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一態様において、自己分解酵素遺伝子の相同配列は、配列番号１、ＹｊｄＢドメイン及びＧＨ２５ドメインと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。

一態様において、自己分解酵素タンパク質の相同配列は、配列番号２及びＹｊｄＢドメインと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一態様において、自己分解酵素タンパク質の相同配列は、配列番号２、ＹｊｄＢドメイン及びＧＨ２５ドメインと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

一態様において、相同配列は、対象配列と比較して１つ又はいくつかの付加、欠失及び／又は置換を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むと解釈される。

相同性の比較は、目視によって又はより一般的には容易に利用可能な配列比較プログラムを使用して行うことができる。この市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性％を算出することができる。

相同性％は、連続配列の全体にわたって算出され得、すなわち一方の配列を他方の配列とアラインして、一方の配列内の各アミノ酸を他方の配列内の対応するアミノ酸と１回１残基、直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基の全体にわたってのみ実行される。

これは、非常に簡易且つ一貫した方法であるが、例えば配列の通常同一の対において、ある挿入又は欠失により、後続のアミノ酸残基がアラインメントから外されることを考慮し得ないため、グローバルアラインメントを実施する場合に相同性％の大きい低減を潜在的にもたらす。結果的に、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体を過度にペナルティ化せずに、考えられる挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントを作成するように設計される。これは、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入して、局所相同性の最大化を試みることによって達成される。

しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント（２つの比較配列間のより高い関係性を反映する）が、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、そのアラインメント内で生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを、且つそのギャップ内の後続の残基毎により小さいペナルティを課す「アファインギャップコスト」が用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながら、ギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティが変更されることを許容する。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いることが好ましい。

したがって、最大相同性％又は同一性％の算出は、最初に、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントの作成を必要とする。そのようなアラインメントの実行に適したコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実行し得るソフトウェアの例として、以下に限定されないが、例えばＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ－Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＢＬＡＳＴ２（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９９，１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９９，１７７（１）：１８７－８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３－４１０）及びＡｌｉｇｎＸが挙げられる。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＦＡＳＴＡは、例えば、ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔサーチツール（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ）等においてオフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｐａｇｅｓ ７－５８～７－６０を参照されたい）。

最終相同性％を同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセスそれ自体は、典型的には、オールオアナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる数値換算類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。一般に用いられるそのようなマトリックスの例として、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルトマトリックス）がある。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値又は供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を用いる（更なる詳細について、ユーザマニュアルを参照されたい）。一部の用途については、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージのためのデフォルト値を用いることが好ましい。

代わりに、相同性パーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７－２４４）と類似するアルゴリズムに基づくＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）における多重アラインメント特徴を用いて算出され得る。

ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することが可能である。ソフトウェアは、典型的に、それを配列比較の一部として実行して数的結果を生成する。

配列同一性を求める場合、ギャップペナルティが用いられ得る。ペアワイズアラインメントに用いられるパラメータの例は、以下の通りである。

一実施形態において、ギャップペナルティ及びギャップエクステンションが先の定義の通り設定されたＣＬＵＳＴＡＬを用いることができる。

適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも３０個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも４０個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも６０個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも１００個の連続ヌクレオチドの全体にわたって求められる。

適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも３００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも４００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも５００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも６００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも７００個の連続ヌクレオチドの全体、好ましくは少なくとも８００個の連続ヌクレオチドの全体にわたって求められる。

好ましくは、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体、例えば本明細書中で開示される配列番号２又は配列番号１の全体にわたって求められ得る。適切には、タンパク質（アミノ酸）配列に関する同一性の程度は、少なくとも１００個の連続アミノ酸の全体、好ましくは少なくとも２００個の連続アミノ酸の全体、好ましくは少なくとも３００個の連続アミノ酸の全体にわたって求められる。

好ましくは、アミノ酸又はタンパク質配列に関する同一性の程度は、本明細書中で教示される配列全体、例えば本明細書中で開示される配列番号２又は配列番号１の全体にわたって求められ得る。

これに関連して、用語「クエリー配列」は、それが本発明の範囲内に入るかを把握するために対象配列とアラインされる相同配列又は外来配列を意味する。したがって、そのようなクエリー配列は、例えば、先行技術配列又は第３のパーティ配列であり得る。

好ましい一実施形態において、配列は、グローバルアラインメントプログラムによってアラインされて、配列同一性は、プログラムによって特定される正確なマッチの数を特定することにより、対象配列の長さで割って算出される。

一実施形態において、クエリー配列と対象配列間の配列同一性の程度は、１）デフォルトスコアリング行列及びデフォルトギャップペナルティを用いて適切なあらゆるアラインメントプログラムによって２つの配列をアラインし、２）正確なマッチの数を特定し（正確なマッチは、アラインメントプログラムがアラインメント内の所与の位置上の２つのアラインされる配列内の同一のアミノ酸又はヌクレオチドを特定した場合である）、且つ３）対象配列長との正確なマッチの数を割ることによって求められる。

更に好ましい実施形態において、グローバルアラインメントプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬ及びＢＬＡＳＴ（好ましくはＢＬＡＳＴ）からなる群から選択されて、配列同一性は、プログラムによって特定される正確なマッチの数を特定することにより、対象配列の長さで割って算出される。

配列は、サイレント変化をもたらし、且つ機能的に等しい物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有し得る。物質の二次的結合活性が保持される限り、意図的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負荷電アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正荷電アミノ酸として、リシン及びアルギニンが挙げられ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。

保存的置換は、例えば、以下の表に従ってなされ得る。第２列の同じブロック内の、好ましくは、第３列の同じ行内のアミノ酸を互いに置換することができる。

本発明は、起こり得る相同置換（置換及び置き換えは、本明細書中において、両方とも既存のアミノ酸残基を代替の残基と交換することを意味するために用いられる）、すなわち塩基性のものと塩基性のもの、酸性のものと酸性のもの、極性のものと極性のもの等の同種置換も包含する。非相同置換は、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基に起こり得るか、又は代わりにオルニチン（以降、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと称する）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシン等の非天然アミノ酸の包含を伴う。

置換は、合成アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）によってもなされ得、これとして、アルファ^＊及びアルファ二置換^＊アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸^＊、乳酸^＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン^＊、ｐ－Ｃｌ－フェニルアラニン^＊、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン^＊、ｐ－Ｉ－フェニルアラニン^＊、Ｌ－アリル－グリシン^＊、β－アラニン^＊、Ｌ－α－アミノ酪酸^＊、Ｌ－γ－アミノ酪酸^＊、Ｌ－α－アミノイソ酪酸^＊、Ｌ－ε－アミノカプロン酸^＃、７－アミノヘプタン酸^＊、Ｌ－メチオニンスルホン^＃＊、Ｌ－ノルロイシン^＊、Ｌ－ノルバリン^＊、ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン^＊、Ｌ－ヒドロキシプロリン^＃、Ｌ－チオプロリン^＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４－メチル－Ｐｈｅ^＊、ペンタメチル－Ｐｈｅ^＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）^＃、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）^＊、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）^＊、Ｌ－Ｔｉｃ（１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸）^＊、Ｌ－ジアミノプロピオン酸^＃及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）^＊が挙げられる。記号^＊は、誘導体の疎水性を示すために先の考察の目的（相同又は非相同置換に関する）で利用されている一方、＃は、誘導体の親水性を示すために利用されており、＃^＊は、両親媒性の特徴を示す。

変異型アミノ酸配列は、配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る適切なスペーサー基を含み得、例として、アミノ酸スペーサー、例えばグリシン又はβ－アラニン残基に加えて、アルキル基、例えばメチル基、エチル基又はプロピル基が挙げられる。変異の更なる形態は、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者であれば十分に理解されるであろう。疑義を回避するため、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基が、α炭素ではなく、残基の窒素原子上に存在する変異型アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製するプロセスは、当技術分野で知られており、例えばＳｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７－９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２－１３４がある。

本発明に用いられるヌクレオチド配列は、その中に合成又は修飾ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で知られている。これらとして、メチルホスホナート骨格及びホスホロチオアート骨格並びに／又は分子の３’末端及び／若しくは５’末端でのアクリジン鎖若しくはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は、当技術分野で利用可能なあらゆる方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増強するように実行され得る。

本発明は、本明細書中に提示される配列に対して相補的なヌクレオチド配列の使用も包含する。

本明細書中に記載される配列の他の変異体は、例えば、広範な個体、例えば様々な集団由来の個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることによって得ることができる。加えて、他の相同体を得ることができ、そのような相同体及びその断片は、一般に、本明細書中の配列表に示される配列に選択的にハイブリダイズし得る。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリー又は他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングして、そのようなライブラリーを、添付の配列表の配列のいずれか１つの全て又は一部を含むプローブにより、中～高ストリンジェンシーの条件下でプロービングすることによって得ることができる。類似の考えは、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得ることにも当てはまる。

変異体及び株／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体由来のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当技術分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて実行することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。

縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含有し、既知の配列に対する単一配列プライマーによる配列のクローニングに用いられるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。

代わりに、そのようなポリヌクレオチドは、特徴付けされた配列の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてのコドン選好性を最適化するためにサイレントコドン配列変化が要求される場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するか、又はポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を変更するような他の配列変化が望まれることがある。

アミノ酸ナンバリング
本発明において、本発明に用いられる配列内のアミノ酸残基位置の特定のナンバリングが使用され得る。候補自己分解酵素のアミノ酸配列の、配列番号２に定義される自己分解酵素とのアラインメントにより、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基位置又はナンバリングと対応する前記候補自己分解酵素内のアミノ酸残基位置に番号を割り当てることが可能である。

本出願で用いられるアミノ酸ナンバリングを説明する別の方法は、アミノ酸位置が、配列番号２に示されるアミノ酸配列内の特定の位置に「対応する」アミノ酸位置によって特定されると言うものである。当業者であれば、自己分解酵素配列が様々な細菌株間で異なることを容易に認識するであろう。配列番号２に示されるアミノ酸配列への言及は、単に特定のあらゆる自己分解酵素タンパク質内の特定のアミノ酸位置の特定を可能にするために用いられる。そのようなアミノ酸位置は、その使用が当技術分野で周知である配列アラインメントプログラムを用いてルーチン的に特定することができる。

一般的な組換えＤＮＡ方法論の技術
本発明は、特に示されない限り、当業者の能力の範囲内である生化学、分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する。そのような技術は、文献中に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ，Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的なテキストは、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。

ここで、本発明を実施例によって更に説明する。実施例は、本発明を実行する際に当業者を補助するのに役立つはずであり、決して本発明の範囲を限定することを意図されない。

バクテリオファージ感受性をアッセイする方法
先に記載されるように、本発明に従う修飾又は候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって付与されるバクテリオファージに対する耐性（又は感受性）を判定する一方法は、ファージに対して感受性の細菌株（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）（参照株）及び本発明の候補修飾又は自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子が挿入されている対応する誘導細菌株（誘導株）の両方の耐性を判定するものである。そのため、本発明の修飾又は候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって付与されるバクテリオファージに対する耐性（又は感受性）は、参照株及び対応する誘導細菌株の両方の耐性を判定することによって判定することができる。２つの細菌株のバクテリオファージ耐性は、適切なバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）又はバクテリオファージのパネルを用いて、プラーク形成効率（ＥＯＰ）を、プラーク形成アッセイの標準的な効率又は本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩにより算出することによって判定することができる。上述のプロトコールは、相同体等の本発明の候補自己分解酵素遺伝子の有無に関してスクリーニングするために用いることもできる。

分子生物学における従来の技術を用いる、バクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対して感受性の細菌株の自己分解酵素遺伝子の代わりの、本発明の修飾又は候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子の導入は、当業者の能力の範囲内である。一般的に言えば、適切な常法として、注目する適切な遺伝子又はポリヌクレオチドの、天然の遺伝子配列への相同組換えを介した特異的変異誘発又は置換が挙げられる。先で詳述されるように、標準的なプラーク形成効率アッセイ又は本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩを用いて、本発明の細菌株のバクテリオファージ耐性（又は感受性）を判定することもできる。本発明の細菌株のバクテリオファージ感受性は、自己分解酵素遺伝子の代わりに本発明の修飾、候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子又はポリヌクレオチドを含まない対応する細菌株（参照株）と比較して判定することができる。

プラーク形成効率アッセイＩ
感染性ファージ粒子の数え方は、Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００９によって記載される、本明細書中で「プラーク形成効率アッセイＩ」の名の二重アガーオーバレイプラークアッセイを用いて実行される。この方法は、ソフトアガー栄養培地において表面上に増殖する細菌のローンに感染させることからなる。ファージによる感染により、細菌が死滅しているか又は増殖していない領域に対応する、局在化されたクリア又は半透明である、プラークと称されるゾーンが生じる。そのため、感染性ファージ単位は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）と称される。このアッセイを用いたファージの数え方は、１プレートあたり最大３０～３００ｐｆｕを必要とするため、ファージ懸濁液は、希釈を必要とする場合がある。この目的のために、一次ファージ懸濁液は、５ｇ／Ｌラクトース（ｖ／ｖ）を含有する１０ｍＬのＭ１７培地中で１０倍段階希釈される。プラーク形成効率アッセイＩは、以下の工程を含む：
ｉ．５ｇ／Ｌのラクトース（ｖ／ｖ）を含有するＭ１７培地中で試験される各株を３７℃で一晩前培養する工程；
ｉｉ．各前培養体を別々に用いて、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ_２及び５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有する５ｍＬの溶融Ｍ１７－ＣａＣｌ_２ソフトアガー培地（水浴中で４７℃において維持されている）中１％（ｖ／ｖ）において播種する工程；
ｉｉｉ．試験される１００μＬのファージ希釈液を、播種された各培地に加える工程；
ｉｖ．混合後、各混合液を、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ_２及び１５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有するＭ１７－ＣａＣｌ_２固体アガー培地の表面上に注ぐ工程；
ｖ．オーバレイの固化後、逆さにしたプレートを３７℃で４８時間インキュベートする工程；及び
ｖｉ．（３０～３００プラークを示すプレート上の）プラークを数え上げる工程。

プラーク形成効率（ＥＯＰ）を算出するために、病原性ファージの力価を：プラークの数×１０×希釈率の逆数として算出してｐｆｕ／ｍＬで表し、細菌株上のファージのＥＯＰを株上のファージの力価として参照株上のファージの力価によって割って算出し、参照株のＥＯＰを１として固定する。

したがって、試験されたバクテリオファージに対して感受性である細菌株のＥＯＰは、１である（すなわち宿主株に付着する全ての粒子が株上にプラークを形成することができる）。例えば、Ｄ６８６７ファージによるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９のＥＯＰは、１である。

試験されるバクテリオファージに対する部分的感受性低減（又は部分的耐性）を示す細菌株は、参照株と比較して、少なくとも４対数、適切には少なくとも５対数のＥＯＰ低減によって特徴付けられる。一実施形態において、試験されたバクテリオファージに対する部分的感受性低減を示す細菌株は、参照株と比較して、ＥＯＰが１０^－４未満、適切には１０^－５未満である。

試験されるバクテリオファージに対して完全な感受性低減を有する（又は耐性である）細菌株は、参照株と比較して、少なくとも６対数（好ましくはアッセイの検出レベル下の、適切には少なくとも７対数、適切には少なくとも８対数）のＥＯＰ低減によって特徴付けられる。一態様において、試験されるバクテリオファージに対して耐性である細菌株は、参照株と比較して、ＥＯＰが１０^－６未満（適切には１０^－７未満、適切には１０^－８未満）である。好ましい態様において、試験されるバクテリオファージに対して耐性である細菌株は、０のＥＯＰ（検出レベル未満、検出不能とも称される）を実現する。

ＥＯＰアッセイＩによる「ファージに対する感受性の低減」とは、少なくとも４対数のＥＯＰ低減を意味する。一実施形態において、ＥＯＰ低減は、少なくとも５対数である。一実施形態において、ＥＯＰ低減は、少なくとも６対数の低減である。一実施形態において、ＥＯＰ低減は、少なくとも７対数の低減である。一実施形態において、ＥＯＰ低減は、少なくとも８対数の低減である。一実施形態において、修飾又は自己分解酵素対立遺伝子は、ＥＯＰ低減が、少なくとも４対数、少なくとも５対数、少なくとも６対数、少なくとも７対数及び少なくとも８対数のＥＯＰ低減からなる群から選択される場合、本発明に従う修飾又は自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子であると考えられ、ファージに対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される。

そのため、候補修飾又は自己分解酵素対立遺伝子は、前記候補自己分解酵素対立遺伝子が、少なくとも４対数のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株のファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する感受性を低減する場合、本発明に従う自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子であると考えられ、前記誘導株は、本発明に従う修飾又は自己分解酵素Ｒ対立遺伝子が導入されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって（すなわちラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株と比較して）判定される。

一態様において、表現「感受性を低減する」又は「ＥＯＰを低減する」は、先のアッセイＩに従い、すなわち誘導株上のファージのＥＯＰを判定して、候補修飾又は候補自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含まない親株上での同じファージＤＴ１のＥＯＰと比較することによって定義される。

緒言
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２８５２（ＤＧＣＣ１２８５２）を、親株ＳＬ１２６９９（ＤＧＣＣ１２６９９）及びＰ３３５様ファージＤ６８６７を用いるファージチャレンジを介して作出した。ＳＬ１２８５２は、Ｄ６８６７に対するバクテリオファージ非感受性ミュータント（ＢＩＭ）であり、ＳＬ１２６９９と等しく酸性になる。ＳＬ１２８５２におけるファージ耐性を担う変異は、最初、未知であった。ＳＬ１２６９９及びＳＬ１２８５２のゲノムを比較した後、２つの間で差異を見出し、試験により、自己分解酵素遺伝子内の１５５ｂｐ欠失が耐性を担うことを確認した。ＳＬ１２６９９由来の野生型自己分解酵素遺伝子をｐＧｈｏｓｔ中にクローニングして（ｐＬｙｓと命名）、ＳＬ１２８５２中にエレクトロポレーションした。ＳＬ１２８５２＋ｐＬｙｓ単離体は、Ｄ６８６７に対して感受性となった。更に、その後、これらの１２８５２＋ｐＬｙｓ単離体のｐＬｙｓを回復させて（ｃｕｒｅ）、Ｄ６８６７に対する耐性を獲得し直した。これは、ＳＬ１２６９９内に見出される完全な野生型自己分解酵素遺伝子がラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属における特定のＰ３３５様ファージ感染にとって不可欠であることを示唆しており、これは、ファージ耐性と関連することが依然として示されていない遺伝子である。

材料及び方法
ＤＮＡ単離、配列決定及びバイオインフォマティクス分析
Ｄ６８６７及びＤ７１３８の高力価溶解液を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。ＤＮＡサンプルの濃度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔを用いて測定した。続いて、各サンプルをゲル上で走らせて、アンプリコンを確認した。サンプルをＮａｎｏｐｏｒｅ配列決定及びゲノムアセンブリのためにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｕｒｂａｎａ－Ｃｈａｍｐａｉｇｎに送った。ファージゲノムを、ＤｕＰｏｎｔのＣｕｌｔｕｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ由来の知られているファージ型のゲノムと比較した。比較を、Ｍａｕｖｅゲノムアラインメントビューアを用いるＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．０．５により行った。

ＳＬ１２６９９及びＳＬ１２８５２の単離コロニーをＭ１７－Ｌブロス中で一晩増殖させた。ＤＮＡ調製を、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて実行した。プロトコールの「細胞サンプル」、「ＤＮＡの沈殿」に従った；用いた試薬の量は、１０を乗算した。Ｎａｎｏｐｏｒｅ及びＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｕｒｂａｎａ－Ｃｈａｍｐａｉｇｎで行った。ＳＬ１２６９９及びＳＬ１２８５２ゲノム比較を、Ｍａｕｖｅゲノムアラインメントビューアを用いるＧｅｎｅｉｏｕｓ １１．０．５により行った。その後、差異が見出された染色体の領域をサンガー配列決定して、その領域に特異的なプライマーを設計することによって変異を確認／変異の誤りを証明した。ＳＬ１２８５２及び他のＢＩＭ由来のＤＮＡをＦＴＡ（Ｆｌｉｎｄｅｒ’ｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）紙上にスポットして、メーカーの指示に従ってクリーニングした。ＰＣＲをＨＦバッファ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｕｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）によるＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで実行し；プライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで設計した。ＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて配列決定するために調製した。配列決定をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）で実行して、結果を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １１．０．５のＭａｐ ｔｏ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅツールを用いて分析した。

自己分解酵素相補性アッセイ
ミュータントＳＬ１２８５２に野生型自己分解酵素を補完した。最初に、野生型自己分解酵素を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＧｈｏｓｔ９（表１を参照されたい）中にクローニングした。ベクターｐＧｈｏｓｔ９をプライマーＶＦ－ｐｇ９及びＶＲ－ｐｇ９と共に線状化した。挿入物をプライマーＣｌｏｎｅＡｕｔｏＦ及びＣｌｏｎｅＡｕｔｏＲによりＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで増幅させた。両方のプライマーは、線状化ベクターの３’末端及び５’末端をそれぞれ補完する約２０ｎｔのヌクレオチド伸長を有した。精製アンプリコンを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｕｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの指示に従ってアセンブルした。組換えベクターｐＬｙｓを、ＴＧ１ＲｅｐＡ内にアセンブルしてから、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてＴＧ１ＲｅｐＡから精製した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のエレクトロポレーションを、以前に記載されるように実行した（Ｈｏｌｏ ａｎｄ Ｎｅｓ，１９８９ Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：３１１９－３１２３）。形質転換体をプライマーＲＳＦ及びＧＣ ｐＧ９ｖＦでＰＣＲして、自己分解酵素を含有するｐＧｈｏｓｔ９の存在についてチェックした。

ｐＬｙｓを、エリスロマイシンの不在下で連続３夜３７℃において乳中で増殖させることにより、ＳＬ１２８５２形質転換体から回復させた。単一のコロニー単離体をエリスロマイシン耐性の消失について試験した。ＰＣＲをプライマーＲＳＦ及びＧＣ ｐＧ９ｖＦにより実行して、プラスミドの不在を確認した。サンガー配列決定を、プライマーＡｕｔｏｌｙｓｉｎ＿Ｆ１、Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ＿Ｆ２及びＡｕｔｏｌｙｓｉｎ＿Ｆ３を用いて行って、染色体自己分解酵素がなおトランケートされていることを確認した；最初の増幅は、プライマーＡｕｔｏｌｙｓｉｎＮｅｓｔｅｄ＿Ｆ及びＡｕｔｏｌｙｓｉｎＮｅｓｔｅｄ＿Ｒを用いて完了した。プライマーの仕様について、表２を参照されたい。

乳酸性化速度の試験
酸性化特性の最初の評価について、一晩の１１％ＮＦＤＭ ＢＩＭ増殖物をＭ１７－Ｌａｃ中に移した。培養体がＯＤ_６００約０．６５に達した後、活性乳（市販の１％脂肪Ｋｅｍｐ）中に０．７５％で植菌した。サンプルを３０℃水浴内でｐＨプローブと共に一晩維持して、Ｃｉｎａｃソフトウェアで２分毎に各株の酸性化を監視した。各株を二反復で走らせた。

結果
ＳＬ１２６９９及びＳＬ１２８５２ゲノムの結果
ＧｅｎｅｉｏｕｓのＳＬ１２６９９ゲノム及びＳＬ１２８５２ゲノムを比較した後、１５３ｂｐの欠失を自己分解酵素遺伝子の位置１，２２５に見出した。この変異は、早期の終止コドンをもたらさないが、タンパク質の後半を５１個のアミノ酸のみをトランケートする。この変異をサンガー配列決定により確認した。

Ｄ６８６７及びＤ７１３８ゲノムの結果
Ｄ６８６７ゲノム及びＤ７１３８ゲノムを、知られているファージ型と比較すると、ゲノムのいくつかの領域は、Ｐ３３５様ファージに対するマッチを示した；Ｄ６８６７及びＤ７１３８は、ｓｍｑ８６型として分類されるファージに対して最も高い類似性を示す。

加えて、ゲノムＤ６８６７及びＤ７１３８は、両方のファージがＳＬ１２６９９内のプロファージに対して高い類似性を有する（それぞれ９５．１％及び９５．８％のペアワイズ同一性）ことを明らかにした。これは、ファージが、ＳＬ１２６９９に由来する切り出されたプロファージであることを示唆している。

サンガー配列決定の結果
サンガー配列決定をＳＬ１２６９９の４つの追加のＢＩＭに行った。結果は、ＢＩＭの２つが、ＳＬ１２８５２内に見出される同じ１５３ｂｐ欠失を有することを示した。ＢＩＭ８は、Ｇのランにおいて、ヌクレオチド１，８０５～１，８０９でのＧ欠失を示した；この欠失は、位置１，８８０での早期終止コドンを生じさせるフレームシフトを引き起こす。ＢＩＭ１９は、ヌクレオチド１，２２９においてＧからＡのＳＮＰを示した。これは、同じコドンを早期終止コドンに変える。図１は、自己分解酵素において見出される３つの異なる変異を示す；これらの変異は、全てタンパク質のｙｊｄＢドメイン内に位置決めされている。

ＳＬ１２８５２ ｐＬｙｓ形質転換体
１０個のＳＬ１２８５２＋ｐＬｙｓ単離体及び２つのＳＬ１２８５２＋ｐＧｈｏｓｔ単離体をＤ６８６７及びＤ７１３８とプレーティングし、且つスポットして、ファージ感受性をチェックした。結果は、ｐＬｙｓをＳＬ１２８５２に加えた後、単離体が両方のファージに対して完全に感受性となったことを示した。加えて、結果は、ｐＧｈｏｓｔ９単独ではＳＬ１２８５２においてファージ感受性に影響を与えないことを示した（表３を参照されたい）。

ＳＬ１２６９９をポジティブ（ファージ感受性）対照として用いた。^＊このＥＯＰ低減は、ベクター単独ではいかなるファージ感受性ももたらさない（ＳＬ１２８５２は本来既に耐性であるからである）ことを示す。

ＳＬ１２８５２におけるｐＬｙｓ回復
３７℃増殖後、５つのＳＬ１２８５２＋ｐＬｙｓサンプルをＳＲ Ｌａｃ及びＳｒ Ｌａｃ＋Ｅｒｍ培地の両方の上にプレーティングした。Ｅｒｍ培地上での増殖不能は、ｐＬｙｓの消失を示した。ＳＲ Ｌａｃプレートから採取した単離体の以降のコロニーＰＣＲは、ｐＬｙｓの消失を確認した（ＳＬ１２８５２（－）ｐＬｙｓと称する）。各ＳＬ１２８５２（－）ｐＬｙｓ単離体をＤ６８６７及びＤ７１３８とプレーティングし、且つスポットした。結果は、これらが完全にファージ耐性であったことを示し、これは、補完した野生型自己分解酵素がファージ感受性に必要とされることを更に確認する（表４を参照されたい）。

細菌のローンにおけるプラークの空き地又は単離は、ファージ感受性を示し；中断されていないローンは、耐性を示す。

酸性化及びファージロバスト性
ＳＬ１２８５２の乳酸性化特性を試験した。Ｃｉｎａｃ活性曲線は、ＳＬ１２８５２が親と等しく酸性になったことを示す（図２を参照されたい）。

二次アッセイにおいて、ＳＬ１２８５２の酸性化速度を様々な感染多重度（０．０１、０．１及び１）においてファージＤ６８６７の存在下で試験した。親ＳＬ１２６９９のパラレルアッセイは、ファージ対照の役割を果たした（図３及び４を参照されたい）。結果は、１の最も高いＭＯＩが加わっても、ＳＬ１２８５２の酸性化の減速が依然としてないことを示しており、強いレベルのファージ耐性が示される。

考察
産業的乳発酵に用いられるスターター株について、ファージが一般的に存在しており、問題がある；Ｐ３３５型は、特に問題がある。Ｐ３３５様ファージについて、単一の遺伝子又はタンパク質がＰ３３５様ファージ感染の成功に不可欠であることは、依然として立証されていない。

この研究において、ＳＬ１２６９９において見出される自己分解酵素遺伝子のトランケーションは、Ｐ３３５様ファージに対して完全な耐性をもたらすため、このクラスのファージについての問題に対処するための固有の遺伝的標的を表す。

このプロジェクトにおいて、ファージ耐性株ＳＬ１２８５２を、野生型自己分解酵素遺伝子を含有するプラスミドによりエレクトロポレーションした。これにより、Ｐ３３５様ファージＤ６８６７に対して完全に感受性になった単離体が生じた。更に、このプラスミドがこれらの単離体から取り出された場合、株は、ここでもＤ６８６７に対して完全に耐性になる。当野生型自己分解酵素についての存在／不在を確認するために、そのプラスミドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅を用いた。加えて、プラスミドプロファイリングは、結果として生じる単離体の両方のセットがＳＬ１２８５２に由来することを確認した。最後に、サンガー配列決定は、染色体自己分解酵素がこの実験の全体を通してトランケートされたままであることを確認した。

先の本明細書中で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の記載される方法及びシステムの種々の変更形態及び変形形態が当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学又は関連分野の当業者に明白である、本発明を実行するための記載した様式の種々の修飾形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (27)

1. 自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように修飾されている細菌株であって、バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ等）に対する低減された感受性を有する細菌株。
2. 前記修飾は、自己分解酵素をファージ感染に関して部分的に又は完全に機能不全にする、請求項１に記載の細菌株。
3. 前記修飾は、終止コドン、挿入、欠失又は変異である、請求項１又は２に記載の細菌株。
4. 前記修飾は、前記自己分解酵素をコードする核酸配列中又は前記自己分解酵素の発現の制御に寄与する調節領域（プロモーター若しくはエンハンサー等）中に導入されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の細菌株。
5. 自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子を含むように修飾されており、前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減し、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定され、好ましくは、前記株は、その自己分解酵素遺伝子の唯一の対立遺伝子として前記変異自己分解酵素対立遺伝子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の細菌株。
6. 前記修飾についてホモ接合性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の細菌株。
7. バクテリオファージ（少なくとも１つのＰ３３５様ファージ等）に対する細菌株の耐性を増大させる（例えば、付与するか又は増大させる）方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させることによって前記細菌株を修飾することを含む方法。
8. 少なくとも１つのバクテリオファージ耐性変異型株（少なくとも１つのＰ３３５様ファージに対する耐性等）を調製する方法であって、自己分解酵素の活性及び又は発現を低下させるように親細菌株を修飾することを含む方法。
9. ａ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対して感受性の細菌株（ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株等）を提供することと；
   ｂ）請求項１～５のいずれか一項に記載の自己分解酵素の活性及び／又は発現を低減するように前記細菌株を修飾することと；
   ｃ）少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する低減された感受性を有する前記株を回収することと
   を含み、任意選択的に、少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって判定される、請求項７又は８に記載の方法。
10. 請求項７～９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるか又は得られる細菌株。
11. 請求項１～５のいずれか一項に記載の自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
12. ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株の、ファージＤ６８６７に対する感受性を低減する自己分解酵素対立遺伝子であり、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が前記自己分解酵素^Ｒ対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
13. 請求項１１又は１２に記載のポリヌクレオチドを含む構築体又はベクター。
14. 請求項１１若しくは１２に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３に記載の構築体若しくはベクターの、少なくとも１つのバクテリオファージ（Ｐ３３５様ファージ等）に対する細菌株の感受性を低減するための使用。
15. ファージ（Ｐ３３５様ファージ、例えばＤ６８６７等）に対する感受性の低減は、少なくとも４対数、少なくとも５対数又は少なくとも６対数のＥＯＰ低減によって特徴付けられる、請求項１～６若しくは１０のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１若しくは１２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４に記載の使用。
16. 前記修飾は、
    ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有する自己分解酵素タンパク質；
    ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７のＥＯＰを低減しない、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む自己分解酵素変異型タンパク質であって、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする前記自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、自己分解酵素変異型タンパク質；及び
    ｃ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７の、３対数未満のＥＯＰを低減する、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む自己分解酵素変異型タンパク質であって、前記Ｄ６８６７誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする前記自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、自己分解酵素変異型タンパク質、
    ｄ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７のＥＯＰを低減しない、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２の相同体であって、前記ＳＬ１２６９９誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする前記自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤ６８６７に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、相同体；及び
    ｅ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９誘導株上でのファージＤ６８６７の、３対数未満のＥＯＰを低減する、自己分解酵素対立遺伝子によってコードされる、配列番号２の相同体であって、前記Ｄ６８６７誘導株は、その自己分解酵素対立遺伝子が、前記自己分解酵素変異型タンパク質をコードする前記自己分解酵素対立遺伝子によって置換されているラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＳＬ１２６９９株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって判定される、相同体
    からなる群から選択される自己分解酵素タンパク質に対する、アミノ酸の抑制、アミノ酸の付加、アミノ酸の置換又はアミノ酸の抑制及び付加を含む自己分解酵素^Ｒタンパク質をコードする、請求項１～６、１０若しくは１５のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４若しくは１５に記載の使用。
17. 前記修飾は、自己分解酵素のＹｊｄＢドメインのトランケーションをもたらす、請求項１～６、１０、１５若しくは１６のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９、１５若しくは１６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２、１５若しくは１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３、１５若しくは１６のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～１６のいずれか一項に記載の使用。
18. 前記トランケートされた自己分解酵素タンパク質は、前記自己分解酵素対立遺伝子内の欠失及び／又は挿入の結果である、請求項１～６、１０若しくは１５～１７のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５～１７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５～１７のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
19. 前記トランケートされた自己分解酵素タンパク質は、終止コドンに至るヌクレオチド変異の結果である、請求項１～６、１０若しくは１５～１８のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５～１８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５～１８のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～１８のいずれか一項に記載の使用。
20. 前記株は、そのｐｉｐ遺伝子内で追加的に変異されており、且つｃ２型ｃ２ファージに対する耐性を有する、請求項１～６、１０若しくは１５～１９のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５～１９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５～１９のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 前記株は、そのｙｊａＥ遺伝子内で追加的に変異されており、且つｂｉｌ６７型ｃ２ファージに対する耐性を有する、請求項１～６、１０若しくは１５～２０のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５～２０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５～２０のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～２０のいずれか一項に記載の使用。
22. 前記株は、乳酸菌株であり、適切には、前記乳酸菌株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属から選択され得、適切には、前記株は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものであり得、適切には、前記株は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）種、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｂｉｏｖａｒ．ジアセチラクティス（Ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種であり得る、請求項１～６、１０若しくは１５～２１のいずれか一項に記載の細菌株、請求項７～９若しくは１５～２１のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１１、１２若しくは１５～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１３若しくは１５～２１のいずれか一項に記載の構築体若しくはベクター、又は請求項１４～２１のいずれか一項に記載の使用。
23. 請求項１～６、１０又は１５～２２のいずれか一項に記載の株並びに任意選択的に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選択される１つ以上の更なる乳酸菌を含む細菌組成物。
24. 請求項１～６、１０若しくは１５～２２のいずれか一項に記載の株又は請求項２３に記載の細菌組成物を含む食品又は飼料製品、特に乳製品、肉製品若しくは禾穀類食品又は飼料製品、より詳細には発酵乳製品。
25. 発酵乳製品、例えば発酵乳、ヨーグルト、クリーム、熟成クリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳飲料、プロセスチーズ、クリームデザート、カッテージチーズ又は乳児用ミルクである、請求項２４に記載の乳食品又は飼料製品。
26. 発酵製品を製造する方法であって、
    ａ）基質、好ましくは乳基質に、請求項１～６、１０若しくは１５～２２のいずれか一項に記載の株又は請求項２３に記載の細菌組成物を植菌することと；
    ｂ）工程ａ）から得られる前記植菌された基質を発酵させて、発酵製品、好ましくは発酵乳製品を得ることと
    を含む方法。
27. 請求項１～６、１０若しくは１５～２２のいずれか一項に記載の株又は請求項２３に記載の細菌組成物の、食品又は飼料製品、好ましくは発酵食品、より好ましくは発酵乳製品を製造するための使用。

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