CN117924452B - 一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用 - Google Patents
一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。本发明先对玉米膨胀素基因ExpA17‑corn进行密码子优化，再合成优化后的玉米膨胀素基因ExpA17‑Yeast，然后将其与毕赤酵母分泌性表达载体连接，形成重组质粒。通过化学转化法将重组质粒转化到毕赤酵母中，经检测膨胀素基因通过同源重组整合到毕赤酵母染色体上，成功获得重组菌株。将获得的重组玉米膨胀蛋白协同纤维素酶用于玉米秸秆酶水解实验，结果表明，所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶解速率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及纤维素酶解技术领域，更具体地，涉及一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。
背景技术
木质纤维素是非常丰富的可再生资源可以被纤维素酶水解为葡萄糖、木糖等可发酵糖对其进行有效的利用具有非常重要的社会经济意义。然而由于纤维素链间氢键的作用，自然界中木质纤维多以牢固的结晶状态存在导致纤维素酶催化分解木质纤维素的效率很低，大多数木质纤维素尚难以被有效利用。
膨胀素（expansin，也称作扩张素、扩张蛋白或膨胀蛋白）对植物细胞生长具有重要作用。植物生长过程中会受到细胞壁的限制，在植物细胞生长期间，膨胀素能够使细胞壁软化，伸展。在许多植物中都发现了膨胀素，近年通过对膨胀素的研究发现，膨胀素并不能直接水解纤维素分子的糖苷键，而是把纤维素链间的氢键打断，有效破坏纤维素结构，使其从结晶状态转化为非结晶状态，有效降低纤维素强度，从而提高纤维素的水解程度。
然而膨胀蛋白在细胞分泌物中含量很少，目前主要是通过真核表达系统来体外表达膨胀素蛋白从而对其进行应用。目前微生物来源的膨胀蛋白的体外重组表达表达有较多的研究，例如姚杨等公开了里氏木霉膨胀素基因awol在黑曲霉中表达（姚杨.里氏木霉膨胀素基因swo1在黑曲霉中的表达[D].东北农业大学,2014.），专利CN107488221A公开了真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用，专利CN114561303A公开了通过基因工程手段对里氏木霉RUT-C30进行改造获得了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株，而植物来源的膨胀蛋白的体外异源表达目前还鲜有报道，且植物膨胀素重组蛋白的酵母异源表达存在表达活性不高的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种重组玉米膨胀蛋白的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种利用所述制备方法得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种重组玉米膨胀蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成密码子优化后的玉米膨胀素基因ExpA17；
S2.将步骤S1的玉米膨胀素基因ExpA17插入到毕赤酵母分泌性表达载体的多克隆位点区，得到含玉米膨胀素基因ExpA17的重组质粒；
S3.将步骤S2的重组质粒线性化，再转入到毕赤酵母中，获得重组表达玉米膨胀素基因ExpA17的重组菌株；
S4.将步骤S3的重组菌株进行甲醇诱导表达，分离菌株发酵上清液浓缩后的混合物，得到重组玉米膨胀蛋白粗酶液；
步骤S1所述密码子优化后的玉米膨胀素基因ExpA17的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种新型的植物源重组膨胀蛋白，由玉米膨胀素基因ExpA17编码，由于玉米膨胀素基因ExpA17在酵母中异源表达较难，因此本发明首先对膨胀素基因ExpA17基因编码序列进行密码子优化，使其在酵母中更好地表达，然后再合成优化后的膨胀素基因，然后将其与毕赤酵母分泌性表达载体连接，形成重组质粒。通过化学转化法将重组质粒转化到毕赤酵母中，经检测膨胀素基因通过同源重组整合到毕赤酵母染色体上，成功获得重组菌株。将获得的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶用于玉米秸秆和微晶纤维素酶水解实验，结果表明，所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解速率，而且可以快速获得较高的葡萄糖得率。
进一步地，步骤S2所述毕赤酵母分泌性表达载体为pPICZαA，重组质粒为pPICZαA-ExpA17。
进一步地，步骤S3所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。与毕赤酵母GS115相比，X33的转化率和表达量较高，具有更好的耐受性。
进一步地，步骤S4甲醇诱导表达时，甲醇添加浓度为0.5%～1%。
优选地，甲醇添加浓度为1%。
优选地，甲醇诱导表达时间为96h。
所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶用于玉米秸秆和微晶纤维素酶水解实验，不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解效率，而且可以快速获得较高的葡萄糖产率。因此本发明还提供上述任一所述制备方法得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用。
具体地，重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质的过程为：以预处理后的木质纤维素类生物质为原料，分别添加重组玉米膨胀蛋白粗酶液、纤维素酶和酶解缓冲液进行酶解；所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.005mg/g～0.015mg/g，纤维素酶用量为2FPU/g～8FPU/g。
优选地，所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.015mg/g，所述纤维素酶添加量为2FPU/g。
进一步地，所述木质纤维素类生物质为玉米秸秆、水稻秸秆、玉米芯中的任意一种。
进一步地，所述预处理为稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理、蒸汽爆破预处理、离子液体预处理中的任意一种。
优选地，所述原料为经过蒸汽爆破预处理的玉米秸秆糖化渣。
进一步地，所述酶解缓冲液为柠檬酸缓冲液。
优选地，所述酶解缓冲液为pH 4.8、0.05M的柠檬酸缓冲液。
进一步地，所述酶解温度为45～55℃，酶解时间为2～72h。
优选地，所述酶解时间为50℃，酶解时间为6～24h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新型的植物源重组玉米膨胀蛋白的制备方法，通过对玉米膨胀素基因ExpA17进行密码子优化后再进行酵母表达，成功制备得到了重组玉米膨胀蛋白粗酶液。得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液可加快纤维素酶水解玉米秸秆的反应速率，减少了纤维素酶的使用量，显著提高纤维素酶水解效率，且与对照组BSA相比，效果更加显著。所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解效率，而且可以快速获得较高的葡萄糖产率。本发明对有效利用纤维素资源解决食品、能源等缺乏问题具有重要的理论和现实意义。
附图说明
图1为毕赤酵母分泌性表达载体pPICZαA载体图谱。
图2为密码子优化前后ExpA17编码序列比对结果。
图3为Western Blot检测重组酶的表达结果。
图4为不同浓度纤维素酶单独对底物水解影响结果。
图5为重组玉米膨胀蛋白对蒸汽爆破预处理的玉米秸秆渣糖化的影响。
图6为重组玉米膨胀蛋白与BSA分协同效果的比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
纤维素酶为诺维信二代纤维素酶Cellic CTec2，为纤维素酶混合液，包含葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
蒸汽爆破处理后的玉米秸秆糖化渣底物由河北易高生物能源有限公司提供，各组分含量（重量比）分别为：纤维素52.53%、半纤维素2.51%、木质素34.77%、灰分0.19%、其他组分10%。
实施例1 重组玉米膨胀蛋白的制备
1、重组表达菌株构建
（1）根据已有玉米基因组注释的玉米膨胀素基因ExpA17的基因编码序列ExpA17-corn（SEQ ID No.1），对玉米膨胀素基因ExpA17进行密码子优化，使其在酵母中更好地表达。
（2）将密码子优化后的ExpA17-Yeast序列（SEQ ID No.2所示）交由公司进行合成。
（3）合成后的ExpA17-Yeast，将其通过T4连接法连接于毕赤酵母分泌性表达载体pPICZαA，形成重组质粒pPICZαA-Exp A17，pPICZαA载体图谱如图1所示。
（4）将重组质粒pPICZαA-Exp A17线性化（PmeI酶切），再通过化学转化法将重组质粒转入到毕赤酵母X33中，经检测膨胀素基因ExpA17通过同源重组整合到毕赤酵母染色体上，成功获得重组菌株。
密码子优化前后ExpA17编码序列比对如图2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2、重组玉米膨胀蛋白的表达
将步骤1构建得到的重组菌株进行甲醇诱导表达，甲醇添加浓度为1%，诱导表达时间为96h，离心，取上清发酵液，使用超滤管进行超滤浓缩，进行Western Blot检测重组酶的表达，结果如图3所示：在43kDa左右处有特异目的条带，与预期相符，表明成功制备得到了重组玉米膨胀蛋白粗酶液。
实施例2 纤维素酶水解的浓度优化
一、实验方法
1、根据不同的底物，添加纤维素酶的浓度分别为2FPU/g、4FPU/g、6FPU/g、8FPU/g，设置不同的实验组。具体实验设置如表1所示：
表1
2、酶水解方法
取0.3g（以绝干计）玉米秸秆糖化渣，加入2FPU/g、4FPU/g、6FPU/g、8FPU/g的纤维素酶，再用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH＝4.8，0.05 mol/L）定容至10mL进行酶水解。酶水解过程中温度为50℃，转速为150 rpm，得水解液。
3、不同实验组水解农业秸秆后的葡萄糖得率
（1）在步骤（3）酶水解进行2、6、8、12、24、48、72h时，取200微升水解液进行离心。
（2）用HPLC测定水解液中葡萄糖浓度，计算水解玉米秸秆的葡萄糖得率。
HPLC所用柱子为KS801糖柱，配有示差折光显示器（RID），检测条件：流动相为去离子水，流速0.4 ml/min，柱温60℃，进样量10 μL，运行时间30 min。
二、实验结果
实验组1～4在不同时间水解玉米秸秆的葡萄糖得率如表2和图4所示，结果显示，玉米秸秆糖化渣在2FPU/g纤维素酶添加量时有较大的提升空间，而4FPU/g～8FPU/g纤维素酶添加量组由于添加的酶含量增加，能继续提升的空间已经不大。因此，2FPU/g纤维素酶添加量可能有利于后续重组玉米膨胀蛋白协同纤维素酶水解的促进作用。所以将后续纤维素酶的负载量确定为2FPU/g（实验组1）。
表2
实施例3 重组玉米膨胀蛋白协同纤维素酶降解糖化渣对葡萄糖得率的影响
一、实验方法
1、根据实施例2确定的纤维素酶负载量为2FPU/g，底物为玉米秸秆糖化渣，实施例1获得的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同的量分别为0.005mg/g、0.01mg/g、0.015mg/g，设置不同的实验组。即实验组1：2FPU/g Cellulase，实验组2：2FPU/g Cellulase+0.005mg/gExp，实验组3：2FPU/g Cellulase+0.01mg/g Exp，实验组4：2FPU/g Cellulase+0.015mg/gExp。
2、酶水解方法
取0.3g（以绝干计）玉米秸秆糖化渣，加入2FPU/g纤维素酶，或分别加入0.005mg/g、0.01mg/g、0.015mg/g的重组玉米膨胀蛋白粗酶液和2FPU/g纤维素酶，再用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH＝4.8，0.05 mol/L）定容至10mL进行酶水解。酶水解过程中温度为50℃，转速为150 rpm，得水解液。
3、不同实验组水解农业秸秆后的葡萄糖得率，检测方法同实施例2。
二、实验结果
实验组1～4的实验结果如表3、图5所示，可以得出以下结论：
1、当纤维素酶的负载量固定为2FPU/g时，添加实施例1获得的重组玉米膨胀蛋白粗酶液可以加快玉米秸秆糖化渣的葡萄糖得率。
2、随着重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量增加，协同作用对葡萄糖产率的影响越来越大，当重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.015mg/g时，协同效果最高。
3、纤维素酶酶负载量为2 FPU/g，重组玉米膨胀蛋白粗酶液的浓度达到0.015mg/g时，协同作用对纤维素降解生产的葡萄糖效果最明显。其中在8h、12h、24h时，葡糖糖得率分别可以增加：11.44%、9.92%、14%。
表3
实施例4 重组玉米膨胀蛋白与BSA协同作用比较
一、实验方法
1、根据实施例2确定的纤维素酶负载量为2FPU/g，底物为玉米秸秆糖化渣，实施例1获得的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同的量分别为0.005mg/g、0.015mg/g，BSA（牛血清白蛋白）添加量为0.005mg/g，设置不同的实验组：2FPU/g，2FPU/g+0.005mg/g BSA，2FPU/g+0.005mg/g Exp，2FPU/g+0.015mg/g Exp，对比6h、12h、24h时的葡萄糖得率。
2、酶水解方法，方法同实施例3。
3、不同实验组水解农业秸秆后的葡萄糖得率，方法同实施例2。
二、实验结果
实验结果如表4、图6所示，可以得出以下结论：虽然BSA和重组玉米膨胀蛋白粗酶液都能够有效促进玉米秸秆的产糖率，但当酶水解到12h～24h时，本发明的重组玉米膨胀蛋白促进效果更加显著。
表4
Claims (1)
1.一种重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用，其特征在于，以预处理后的木质纤维素类生物质为原料，分别添加重组玉米膨胀蛋白粗酶液、纤维素酶和酶解缓冲液进行酶解；所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.15mg/g，纤维素酶用量为2FPU/g；所述木质纤维素类生物质为玉米秸秆；所述预处理为蒸汽爆破预处理；所述酶解缓冲液为柠檬酸缓冲液；所述酶解温度为50℃，酶解时间为6～24h；
所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成密码子优化后的玉米膨胀素基因ExpA17；
S2.将步骤S1的玉米膨胀素基因ExpA17插入到毕赤酵母分泌性表达载体的多克隆位点区，得到含玉米膨胀素基因ExpA17的重组质粒；
S3.将步骤S2的重组质粒线性化，再转入到毕赤酵母中，获得重组表达玉米膨胀素基因ExpA17的重组菌株；
S4.将步骤S3的重组菌株进行甲醇诱导表达，分离菌株发酵上清液浓缩后的混合物，得到重组玉米膨胀蛋白粗酶液；
步骤S1所述密码子优化后的玉米膨胀素基因ExpA17的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；步骤S2所述毕赤酵母分泌性表达载体为pPICZαA，重组质粒为pPICZαA-ExpA17；步骤S3所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。
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