DE60318462T2

DE60318462T2 - Ein gen kodierend für vitamin b6-phosphat-phosphatase und deren verwendung

Info

Publication number: DE60318462T2
Application number: DE60318462T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kanagawa-ken HOSHINO; Yoshie 251-0015 Fujisawa-shi Nagahashi; Masaaki Kanagawa-ken TAZOE
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-23
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2023-09-24
Also published as: DE60318462D1; WO2004029252A3; WO2004029252A2; EP1543126B1; CN1685044A; EP1543126A2; US20060263862A1; ES2297228T3; ATE382698T1; US7598066B2; AU2003277889A1; CN100532556C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Vitamin-B₆-Phosphatphosphatase-(VB6P-Phosphatase)-Gen und rekombinante Mikroorganismen, die mit einem Vektor transformiert sind, der dieses Gen aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen oder des Polypeptids.
Der Ausdruck "Vitamin B₆", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt Pyridoxol (hier im Folgenden als PN bezeichnet), Pyridoxal und Pyridoxamin ein. Vitamin B₆ ist ein Vitamin, das für Menschen oder andere Tiere unersetzbar ist und als Rohmaterial für Medikamente oder als Nahrungsmittelzusatz verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung liefert rekombinante Mikroorganismen, die mit einem neuen VB6P-Phosphatasegen (nämlich pdxP) transformiert sind, die aus Sinorhizobium meliloti kloniert wurden.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P unter Verwendung eines zellfreien Extrakts (hier im Folgenden als CFE bezeichnet) der Mikroorganismen und durch In-Kontakt-Bringen von VB6P mit (i) dem CFE oder (ii) einem Enzympräparat, das weiter aus dem obigen CFE gereinigt wurde, in Gegenwart von Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Sn²⁺ oder Ni²⁺, und Isolierung des entstehenden Vitamin B₆ aus der Reaktionsmischung.
Die vorliegende Erfindung liefert eine isolierte Desoxyribonucleinsäure (DNA), die VB6P-Phosphatase codiert, und rekombinante Mikroorganismen, die Vitamin B₆ aus VB6P erzeugen können, indem Vektoren mit der isolierten DNA eingeführt werden.
Ein VB6P-Phosphatasegen (pdxP), auf das hier Bezug genommen wird, bedeutet das Gen, das eine VB6P-Phosphatase codiert, die die Dephosphorylierung von VB6P zu Vitamin B₆ mit hoher Substratspezifität für Pyridoxolphosphat und Pyridoxalphosphat katalysiert.
Der Ausdruck "isoliert", wenn er auf DNA angewendet wird, bezeichnet, dass die DNA aus ihrer natürlichen genetischen Umgebung entfernt wurde und somit frei ist von anderen äußeren oder unerwünschten codierenden Sequenzen und in einer Form ist, die geeignet ist zur Verwendung innerhalb eines gentechnisch hergestellten Proteinerzeugungssystems. Der Ausdruck "eine isolierte DNA" wird alternativ als "eine klonierte DNA" bezeichnet.
Der Ausdruck "Vektor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, linear oder zirkulär, das im Allgemeinen von einem Plasmid oder viraler DNA abgeleitet ist oder Elemente von beiden enthalten kann. Der Vektor kann einer sein, der von der Chromosomenreplikation unabhängig ist oder einer, der wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem Chromosom/den Chromosomen, in die er integriert wurden, repliziert wird.
Der Ausdruck "rekombinanter Mikroorganismus" bezieht sich auf irgendeinen Mikroorganismus, der mit einem Vektor transformiert ist, der die interessierende isolierte DNA ent hält. Die rekombinanten Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung exprimieren ein Gen, das VB6P-Phosphatase codiert, zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P.
WO 03/000875 , die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, offenbart die chromatographische Reinigung von Vitamin B₆-Phosphatphosphatase. Dieses Dokument ist jedoch nur im Hinblick auf Neuheit [Art. 54 (3) EPC] relevant.
EP 0 950 715 offenbart ein Verfahren zur zellfreien Produktion von Vitamin B₆ unter Verwendung eines zellfreien Systems, das aus S. meliloti abgeleitet ist.
Klonierung des VB6P-Phosphatasegens
Gereinigtes Protein von VB6P-Phosphatase, z.B. von S. meliloti, wird mit einer geeigneten Protease, wie Trypsin, verdaut und die entstehenden Peptide werden fraktioniert unter Verwendung von Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC). Die Aminosäuresequenzen der Peptide werden bestimmt unter Verwendung eines Proteinsequenzautomaten und degenerierte Primer werden synthetisiert basierend auf den Aminosäuresequenzen der Peptide. Ein Teilfragment des VB6P-Phosphatasegens wird durch PCR mit degenerierten Primern erhalten. Ein VB6P-Phosphatgen voller Länge wird erhalten durch Screenen einer genomischen Bibliothek unter Verwendung des entstehenden Teilfragments als Sonde.
Ein Beispiel für ein geeignetes DNA-Fragment stammt aus S. meliloti, dessen Nucleotidsequenz als SEQ ID Nr. 9 dargestellt ist.
Im Fall von S. meliloti wurde die vollständige Genomsequenz veröffentlicht (EMBL Zugangsnummer AL 591688) und die BLAST-Suche zeigt, dass die DNA-Sequenz des pdxP von S. meliloti, die in SEQ ID Nr. 9 dargestellt ist, der Region 472329-473036, Komplement, offener Leserahmen SMc01730 mit der Hinterlegungsnummer AL 591688 (EMBL) außer einer Nucleotidsubstitution entspricht, d.h. dem Nucleotid an Position 163, aber die Funktion des in diesem offenen Leserahmen Smc01730 dargestellten Polypeptids wurde bisher nicht aufgefunden.
Ein funktionelles Äquivalent von S. meliloti pdxP kann aus irgendeinem Organismus isoliert werden, wie z.B. Mesorhizobium loti, anderen Bakterien, Hefen und Pflanzen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung liefert DNA-Sequenzen, die eine VB6P-Phosphatase codieren, wie sie in SEQ ID Nr. 9 dargestellt ist, ebenso wie DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit den in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Sequenzen hybridisieren, oder Fragmente davon.
Der Ausdruck "DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen hybridisieren", wie er hier beschrieben wird, bezieht sich auf DNA, die erhältlich ist unter Verwendung von Koloniehybridisierung, Plaque-Hybridisierung oder Southern-Hybridisierung, wobei irgendeine DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 9 gezeigt, ist, als Sonde verwendet wird.
"Standardbedingungen" zur Hybridisierung bedeuten in diesem Zusammenhang die Bedingungen, die allgemein von einem Fachmann auf diesem Gebiet verwendet werden, um spezifische Hybridisierungssignale nachzuweisen oder bevorzugt so genannte stringente Hybridisierungs- und nicht stringente Waschbedingungen oder bevorzugter so genannte mäßig stringente Bedingungen oder sogar noch bevorzugter so genannte stringente Hybridisierungs- und stringente Waschbedingungen, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Ein spezifisches Beispiel hierfür ist DNA, die gefunden werden kann, indem sie einer Hybridisierung unterzogen wird unter Verwendung des Digoxigenin-(im Folgenden als DIG bezeichnet)-DNA Labeling and Detection Kits (Roche Diagnostics, Tokio, Japan), gemäß dem vom Hersteller angegebenen Protokoll. Die Hybridisierungslösung enthält 50% Formamid, 5 × SSC (10 × SSC ist aus 87,65 g NaCl und 44,1 g Natriumcitrat in einem Liter zusammengesetzt), 2% Blockierungsreagenz (Roche Diagnostics, Tokio, Japan), 0,1% N-Lauroylsarcosin und 0,3% Natriumdodecylsulfat (im Folgenden als SDS bezeichnet). Die Hybridisierung kann über Nacht bei 42°C erfolgen und dann durch zweimaliges Waschen in 2 × SSC, das 0,1% SDS enthält, 5 min bei Raumtemperatur und zweimal in 0,1 × SSC, das 0,1% SDS enthält, 15 min bei 50 bis 68°C. Der Nachweis kann wie vom Hersteller angegeben erfolgen.
Die vorliegende Erfindung schließt auch DNA-Sequenzen ein, die mindestens zu 70%, bevorzugt mindestens 80% und besonders bevorzugt mehr als 90% identisch mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 9 sind, oder ein Fragment davon.
Wirtszellen und Vektoren
Geeignete Wirtszellen für die rekombinante Produktion von Vitamin B₆ aus VB6P durch Expression von VB6P-Phosphatase können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein und sind nur durch ihre Fähigkeit, aktive Enzyme zu exprimieren, beschränkt. In einer Ausführungsform wird als Wirt rekombinanter Escherichia coli bereitgestellt. Als Wirtsstamm können irgendwelche Stämme, die zur Gattung Escherichia gehören, verwendet werden und die Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören, können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können von Kultursammlungen erworben werden. Bevorzugt kann E. coli JM109 (Takara, Shiga, Japan) für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Geeignete Vektoren, die in E. coli erhalten werden können und zur Expression von rekombinanter DNA in E. coli verwendet werden können, schließen die Plasmide der Reihen pUC, pBR322 und Derivate davon, wie pKK223-3 ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
In einer weiteren Ausführungsform wird der rekombinante S. meliloti in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Als Wirtsstamm kann jeder Stamm, der zur Gattung Sinorhizobium gehört, verwendet werden und die Mikroorganismen, die zur Gattung Sinorhizobium gehören, können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können aus Kultursammlungen erworben werden. Bevorzugt kann S. meliloti IFO 14782 (DSM 10226) für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Als Vektor zur Expression von rekombinanter DNA in S. meliloti kann ein Vektor für einen breiten Bereich an Wirten verwendet werden, wie pVK100, pRK290, pLAFR1 oder RSF1010. Ein Plasmid, das rekombinantes Protein in S. meliloti exprimiert, kann bereitgestellt werden, indem ein DNA-Fragment, das einen Promotor codiert, der in S. meliloti funktioniert, wie ptac, plac, ptrc, pS1 (Promotor der kleinen ribosomalen Untereinheit von S. meliloti) oder pNm (Promotor des Neomycinresistenzgens) insertiert wird.
Ein rekombinantes Plasmid zur Aufnahme von pdxP kann in S. meliloti IFO 14782 eingeführt werden durch triparentale Paarbildung auf folgende Art und Weise. S. meliloti als Empfängerstamm, E. coli, der das Helferplasmid beherbergt als Helferstamm und E. coli, der das Donorplasmid beherbergt als Donorstamm, werden getrennt kultiviert und miteinander vermischt. Nach der gemischten Kultivierung auf einer Platte kann S. meliloti, der ein rekombinantes Plasmid aufgenommen hat, auf einer Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, selektiert werden. Der rekombinante Stamm, der die Plasmide trägt, wird selektiert durch Herstellung des Plasmids aus den Kolonien, die auf dieser Platte gewachsen sind und Untersuchung durch Endonucleaseverdau.
Das Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Vektoren kann durchgeführt werden gemäß Standardtechniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Bei dieser Erfindung wird pdxP in pKK223-3 unter die Kontrolle von ptac-Promotor gebracht, um pKKpdxP als Expressionsvektor in E. coli zu konstruieren. In einer weiteren Ausführungsform wird pdxP in pVK100 unter die Kontrolle des ptac-Promotors gebracht, um pVKptacpdxP als Expressionsvektor in S. meliloti zu konstruieren.
Polypeptid
Die vorliegende Erfindung liefert auch Polypeptide mit VB6P-Phosphataseaktivität und funktionelle Derivate der Polypeptide. Solche funktionellen Derivate werden auf Basis der Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung durch Addition, Deletion und/oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäurereste solcher Sequenzen definiert, wobei solche Derivate immer noch die VB6P-Phosphataseaktivität haben. Solche funktionellen Derivate können entweder durch chemische Peptidsynthese, die im Stand der Technik bekannt ist, oder durch rekombinante Mittel auf Basis der DNA-Sequenz, wie hier offenbart, mit Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Aminosäureaustausch in Proteinen und Peptiden, die nicht allgemein die Aktivität solcher Moleküle verändern, sind im Stand der Technik bekannt. Die am häufigsten auftretenden Austausche sind: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly ebenso wie umgekehrt.
Weiterhin schließen die hier beschriebenen Polypeptide ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 10 ein, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität einer VB6P-Phosphatase und auch solche, die zu mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mehr als 90% identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 10 sind und die erwähnte Aktivität haben.
Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen rekombinanten Mikroorganismen können in einem Medium inkubiert werden, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und andere Nährstoffe, die für ihr Wachstum notwendig sind, enthält. Als Kohlenstoffquelle kann z.B. Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Stärke, Dextrin oder Glycerin verwendet werden. Als Stickstoffquelle kann z.B. Pepton, Maiseinweichwasser, Sojapulver, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff oder deren Mischung angewendet werden. Weiterhin können als Spurenelemente Sulfate, Hydrochloride oder Phosphate von Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Cobalt und Eisen angewendet werden. Und falls notwendig können übliche Nährstofffaktoren, ein Einfangmittel für das Phosphation oder ein Antischaummittel, wie Magnesiumcarbonat, Aluminiumoxid, Allophan, tierisches Öl, pflanzliches Öl oder Mineralöl ergänzend einem Fermentationsmedium zugegeben werden. Der pH-Wert des Kulturmediums kann etwa 5,0 bis etwa 9,0 sein. Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 45°C liegen. Die Kultivierungszeit kann etwa 1 Tag bis etwa 15 Tage sein. Bei der Kultivierung liefern Belüftung und Bewegung gewöhnlich vorteilhafte Ergebnisse.
Das Protein mit VB6P-Phosphataseaktivität kann in Form der Kultur selbst verwendet werden, die in oben beschriebener Art und Weise hergestellt wurde, in Form eines zellfreien Extrakts (CFE) aus der Kultur, in Form des isolierten Proteins aus dem CFE oder als immobilisiertes Enzym, um Vitamin B₆ aus VB6P herzustellen. Die Expression von pdxP, das in das Plasmid eingebaut wurde, in geeigneten Wirtszellen kann analysiert werden, indem CFE aus der Kultur rekombinanter Mikroorganismen präpariert wird und einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen wird. Das enzymatische Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P kann erreicht werden, indem enzymatisch aktives Protein mit VB6P in einem wässrigen Medium in Kontakt gebracht wird. Das wässrige Medium kann eine wässrige Lösung sein, die nach Bedarf gepuffert sein kann. VB6P wird in Wasser gelöst und dem wässrigen Medium zugegeben. Die Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P kann in dem wässrigen Medium mit einem pH-Bereich zwischen 5,5 und 9,0, bevorzugt 7,0 und 8,0 und in einem Temperaturbereich von 15 bis 45°C, bevorzugt 30 bis 40°C 15 min bis 5 h lang in Gegenwart von Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Sn²⁺ oder Ni²⁺ erreicht werden.
Nach der Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P kann das erzeugte Vitamin B₆ aus der Reaktionsmischung abgetrennt und gereinigt werden. Zu diesem Zweck wird ein Verfahren, das allgemein zur Extraktion eines bestimmten Produkts aus der Reaktionsmischung verwendet wird, angewendet, indem verschiedene Eigenschaften von Vitamin B₆ ausgenutzt werden. Z.B. können die Proteine durch Erwärmen oder durch Zugabe eines Denaturierungsmittels, wie Methanol oder Ethanol, denaturiert werden und aus der Reaktionsmischung durch Filtration entfernt werden. Die gewünschte Substanz in dem Filtrat kann auf Aktivkohle absorbiert werden, dann eluiert und weiter mit einem Ionenaustauschharz gereinigt werden. Alternativ kann das Filtrat direkt auf ein Ionenaustauschharz aufgetragen werden und nach Elution das gewünschte Produkt aus einer Mischung von Alkohol und Wasser umkristallisiert werden. Die Menge an Vitamin B₆, die in der Reaktionsmischung erzeugt wird, kann mit HPLC quantitativ ausgewertet werden.
Die vorliegende Erfindung wird genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt.
Allgemeine Methoden
S. meliloti IFO 14782 wurde als Quelle für chromosomale DNA für ein Genklonierungsexperiment und als Wirtsstamm zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P durch Transkonjuganten verwendet. Derivate von E. coli K12 wurden auch als Wirtsstamm für molekulare Klonierungsversuche verwendet und zur Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P. E.-coli-Stämme wurden in LB-Medium (im Folgenden als LB bezeichnet) gezüchtet, das aus 1% Bacto-Trypton (Becton Dickinson Microbiology Systems, MD, USA), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Becton Dickinson Microbiology Systems, MD, USA) und 0,5% NaCl bestand, und S.-meliloti-Stämme wurden in LB, das mit 0,061% MgSO₄·7 H₂O und 0,036% CaCl₂·2 H₂O ergänzt war (im Folgenden als LBMC bezeichnet) gezüchtet. Bacto-Agar (1,5%) wurde den Medien zur Herstellung von Agarplatten zugegeben. Plasmid-DNA wurde aus E. coli oder S. meliloti mit QIAGEN Midi Kit (QIAGEN GmbH, Deutschland) oder mit dem Automatic DNA Isolation System PI-50 (Kurabo Industry Ltd., Japan) isoliert. Chromosomale DNA wurde unter Verwendung von QIAGEN Genomspitzen isoliert.
Restriktionsenzyme, alkalische Phosphatase, Ligierungskit, E. coli JM109 und HB101-kompetente Zellen (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), TOPO TA Klonierungskit (Invitrogen Japan, K.K., Japan) wurden nach der Anweisung des Herstellers verwendet. Plasmid pKK223-3 wurde von Amersham Biosciences Corp. erworben. Für die Restriktionsenzymanalyse wurden DNA-Fragmente in Agarosegelen fraktioniert und aus den Gelen mithilfe einer Extraktion unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Systems mit QIAEXII (QIAGEN GmbH) fraktioniert. Die DNA-Sequenz wurde bestimmt mit einem ALF DNA Sequenzautomaten (Amersham Biosciences).
Beispiel 1: Klonierung des VB6P-Phosphatasegens
(1) Herstellung von chromosomaler DNA aus S. meliloti IFO 14782
S. meliloti IFO 14782 wurde in LBMC bei 30°C 16 Stunden lang gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und die chromosomale DNA wurde unter Verwendung von QIAGEN Genomspitzen isoliert.
(2) Entnahme eines Teilfragments des VB6P-Phosphatasegens
Um PCR-Primer zur Klonierung von VB6P-Phosphatasegen unter Verwendung der Methode der degenerierten PCR zu entwickeln, wurden Aminosäuresequenzen von N-terminalen und inneren Peptiden bestimmt unter Verwendung eines Proteinsequenzautomaten, was die Peptide Fr60 (SEQ ID Nr. 1), Fr64 (SEQ ID Nr. 2), Fr70 (SEQ ID Nr. 3) und das N-terminale Ende (SEQ ID Nr. 4) lieferte.
Die DNA, die VB6P-Phosphatase von S. meliloti codiert, wurde mit der Methode der degenerierten PCR erhalten. Als Vorwärtsprimer wurde CN02 (SEQ ID Nr. 5), der der N-terminalen Aminosäuresequenz von VB6P-Phosphatase von S. meliloti (SEQ ID Nr. 4) entsprach, verwendet. Als Rückwärtsprimer wurde C642 (SEQ ID Nr. 6), der der inneren Aminosäuresequenz von VB6P-Phosphatase von S. meliloti (SEQ ID Nr. 2) entsprach, verwendet.
Die PCR wurde durchgeführt gemäß dem Protokoll von Takara Shuzo. Chromosomale DNA (0,1 μg) von S. meliloti IFO 14782 wurde als Matrize verwendet und ExTaq-Polymerase wurde als PCR-Polymerase verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 5 min bei 94°C, 30 Zyklen mit 30 s bei 94°C, 30 s bei 50°C, 30 s bei 72°C, 7 min bei 72°C. Nach der Reaktion wurde ein Aliquot mit Agarosegelelektrophorese auf 1,5%-(G/V)-Gelen analysiert und Produkte mit etwa 0,5 kb wurden gereinigt unter Verwendung von QIAEXII und in pCR2.1 TOPO kloniert. Die DNA-Sequenzierung von drei unabhängigen Klonen mit den erwarteten Inserts wurde durchgeführt und es wurde bestätigt, dass die DNA-Sequenzen des eingesetzten Fragments der drei Klone fast identisch waren und die aus den DNA-Sequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen enthielten alle die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 3 und 4. Einer der Klone, phoC28 wurde für die nächste Untersuchung verwendet. Als Nächstes wurden PCR-Primer C101 (Sense-Primer) (SEQ ID Nr. 7) und C102 (Antisense-Primer) (SEQ ID Nr. 8) synthetisiert basierend auf der DNA-Sequenz des Insertfragments von phoC28, um ein Teilfragment des VB6P-Phosphatasegens durch PCR zu erhalten.
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 5 min bei 94°C, 30 Zyklen mit 30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 30 s bei 72°C, 7 min bei 72°C. Die chromosomale DNA (0,1 μg) von S. meliloti IFO 14782 und ExTaq-Polymerase wurden als Matrize bzw. PCR-Polymerase verwendet. Produkte mit etwa 0,5 kb wurden mit PCR amplifiziert, wie erwartet, und die Produkte wurden in pCR2.1TOPO kloniert. Als Ergebnis der DNA-Sequenzierungsanalyse wurde bestätigt, dass mehrere Klone, die identische Sequenzen mit phoC28 hatten, erhalten wurden. Einer dieser Klone, pCl wurde für den nächsten Test verwendet, der ein Teilfragment des VB6P-Phosphatasegens von S. meliloti IFO 14782 aufwies.
(3) Southern-Hybridisierungsanalyse des Verdaus der Chromosomen von S. meliloti
EcoRI-Fragmente von pCl mit 0,5 kb wurden mit DIG-11-dUTP markiert unter Verwendung des DIG DNA-Markierungskits und als Sonde für die Southern-Hybridisierungsanalyse verwendet, um das geeignete Restriktionsenzym zu bestimmen, um die Genombibliothek zu konstruieren. Die Southern-Hybridisierungsanalyse wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt. Chromosomale DNA (3,4 μg) wurde mit Restriktionsenzymen verdaut und einer Agarosegelelektrophorese auf 0,8%-(G/V)-Gelen unterzogen. Die DNA wurde auf eine Nylonmembran in 10 × SSC überführt unter Verwendung eines Vakuumblotters (Modell 785 Bio-Rad). Die Membran wurde in Hybridisierungspuffer [50% Formamid, 5 × SSC, 2% Blockierungsreagenz, 0,1% N-Lauroylsarcosin und 0,3% SDS] 6 Stunden lang vorhybridisiert und nach Zugabe einer denaturierten Sonde über Nacht bei 42°C. Der Blot wurde zweimal 5 min bei Raumtemperatur in 2 × SSC, das 0,1% SDS enthielt, und zweimal in 0,1 × SSC, das 0,1% SDS enthielt, 15 min bei 68°C gewaschen. Die DNA-Fragmente, die mit der Sonde hybridisierten, wurden unter Verwendung des DIG-Detektionskits nachgewiesen. Als Ergebnis hybridisierte die Sonde mit 2,3 kb SalI, 3,5 kb EcoRI und 7 kb KpnI-DNA-Fragmenten bei der Southern-Hybridisierungsanalyse des Verdaus von S.-meliloti-Chromosomen.
(4) Konstruktion der Genombibliothek von S. meliloti IFO 14782
Die chromosomale DNA wurde teilweise mit EcoRI verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente mit 15 bis 30 kb wurden aus den Gelen gewonnen und in pVK100 ligiert, der mit EcoRI verdaut worden war und mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Die Ligierungsmischung wurde für die in-vitro-Verpackungsreaktion verwendet und die Phagenteilchen wurden verwendet, um E.-coli-8767-Zellen in der log-Phase des Wachstums zu infizieren. Die Zellsuspension wurde auf LB-Platten, die 10 μg/ml Tetracyclin (im Folgenden als Tc bezeichnet) enthielten, plattiert. Die Kolonien, die resistent gegen Tc waren, wurden erhalten und als Genombibliothek von S. meliloti IFO 14782 aufbewahrt.
(5) Screening der Genombibliothek von S. meliloti IFO 14782
Um Kolonien mit dem VB6P-Phosphatasegen von S. meliloti aus der in Beispiel 1 (4) hergestellten Bibliothek zu screenen, wurden die Kolonien, die auf LB-Platten mit 10 μg/ml Tc gewachsen waren, auf die Nylontransfermembran (HybondTM-N⁺ Amersham Pharmacia Biotech) überführt und einer Koloniehybridisierung mit der in Beispiel 1 (3) hergestellten Sonde unterzogen. Aus 3000 Klonen der Genombibliothek von S. meliloti IFO 14782 wurden 7 positive Kolonien erhalten. Die Plasmide wurden hergestellt unter Verwendung von QIA GEN Miditip aus positiven Kolonien und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut. Die verdauten Plasmide wurden einer Agarosegelelektrophorese auf 1,0%-(G/V)-Gelen unterzogen und eine Southern-Hybridisierungsanalyse wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 (3) beschrieben, und es wurde bestätigt, dass die Sonde mit 2,3 kb SalI und 3,5 kb EcoRI-Fragmenten der verdauten Plasmide hybridisierte. Eines der Plasmide aus den positiven Kolonien, das ein etwa 24-kb-EcoRI-Fragment hatte, wurde als pVEC1 bezeichnet.
(6) Sequenzierung des VB6P-Phosphatasegens
2,3-kb-SalI- und 3,5-kb-EcoRI-Fragmente von pVEC1 wurden in pUC19 ligiert und die erhaltenen Plasmide wurden als pUCEC1 bzw. pUCEC19 bezeichnet. Die Nucleotidsequenz des Insertfragments von pUCEC1 und pUCEC19 wurde mit einem ALF DNA-Sequenzautomaten bestimmt. Als Ergebnis der DNA-Sequenzierung wurde eine Sequenz mit 708 bp, die den ORF codierte, der aus 235 Aminosäuren bestand, der alle Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 3 und 4 enthielt, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Sequenz mit 708 bp, wie in SEQ ID Nr. 9 gezeigt, dem VB6P-Phosphatasegen entsprach und dieses Gen wurde als pdxP bezeichnet. Die Restriktionskarte der chromosomalen DNA rund um pdxP ist in 1 gezeigt.
Beispiel 2: Expression von pdxP und Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P
(1) Expression von pdxP in E. coli
Um das pdxP-Gen unter der Kontrolle des tac-Promotors in E. coli zu exprimieren, wurde das Plasmid pKKpdxP konstruiert. Das pdxP-Gen wurde aus 100 ng chromosomaler DNA von S. meliloti IFO 14782 amplifiziert mit Advantage-HF-PCR-Kit (Clontech, USA) unter Verwendung von 10 pmol der Primer, Primer P101 (SEQ ID Nr. 11) und Primer P102 (SEQ ID Nr. 12).
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Nachdem 15 s bei 94°C gehalten worden war, 30 Zyklen mit 15 s bei 94°C, 4 min bei 68°C. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und ein 0,86-kb-DNA-Fragment wurde aus den Gelen mit QIAEXII gewonnen. Das erhaltene 0,86-kb-Fragment wurde in pCRII-TOPO-Vektor kloniert mit dem TOPO-TA-Klonierungskit und die erhaltenen 5 unabhängigen Kandidaten wurden untersucht auf die DNA-Sequenz des Insertfragments. Als Ergebnis wurde einer der Kandidaten, TOPOpdxP105, der die exakte Insertsequenz aufwies, für die weitere Untersuchung verwendet.
Ein 0,86-kb-SmaI-Fragment von TOPOpdxP105 wurde in die SmaI-Stelle von pKK223-3 in einer Orientierung ligiert, die die Transkription von pdxP unter dem tac-Promotor zuließ, und das entstehende Plasmid wurde mit pKKpdxP bezeichnet (2).
Dann wurden zwei unabhängige Klone JM109 mit pKKpdxP (nämlich JM109/pKKpdxP-1 und JM109/pKKpdxP-7) in LB mit 100 μg/ml Ampicillin (Amp) und 1 mg/ml Pyridoxamin gezüchtet. Nach 1,5 h Kultivierung wurde die Expression von pdxP induziert durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranose (IPTG). Nach weiteren 4,5 h Kultivierung wurden die Zellen geerntet und in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, Puffer, der 15% Saccharose, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthielt, suspendiert. Die Zellsuspension wurde einer French-Presse mit einem Druck von 800 kg/cm² unterworfen und das entstehende Lysat wurde mit 35.000 × g 60 min bei 4°C zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde als CFE nach Dialyse mit dem gleichen Puffer verwendet. Um die Expression von PdxP zu bestätigen, wurde der CFE einer SDS-PAGE auf 12,5%-(G/V)-Gelen unterzogen und mit Coomassie-Brillantblau (Rapid Stain CBB Kit, nacalai tesque Japan) angefärbt. Die Überproduktion des Polypeptids mit der erwarteten Molekülgröße (29,0 kDa) wurde in E. coli JM109/pKKpdxP-1, nicht aber in E. coli JM109/pKKpdxP-7 nachgewiesen. Dann wurde der CFE von E. coli JM109/pKKpdxP-1 für die weitere Untersuchung verwendet.
(2) Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P in CFE von rekombinantem E. coli
Die Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P erfolgte, indem der in Beispiel 2 (1) hergestellte CFE verwendet wurde. Die Reaktionsmischung enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 2 mM Pyridoxol-5'-phosphat (PNP), 1 mM MnCl₂ und CFE (0,5 mg Protein) in 125 μl. Die Reaktion erfolgte 15 min bei 37°C und die Menge an PN wurde mit HPLC mit der Methode des inneren Standards mit 4'-Desoxypyridoxol, wie unten beschrieben, quantitativ ausgewertet. Um die Proben für die HPLC vorzubereiten, wurden 200 μl 100 mg/l 4'-Desoxypyridoxol als innere Substanz, 50 μl 60% Perchlorsäure und 950 μl deionisiertes Wasser zu 50 μl der Standardlösung und Pyridoxol oder der Reaktionsmischung zugegeben und dann die Mischung 10 min auf Eis gestellt. Dann wurde die Mischung mit 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand auf die folgende Säule gegeben. Die Analysebedingungen waren wie folgt: Säule: Capcell pak C18 SG120 (4,6 × 250 mm) (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japan); mobile Phase: 0,1 M Natriumperchlorat, 0,1 M Kaliumphosphat und 2% Acetonitril (pH 3,5); Säulentemperatur: 30°C; Durchflussrate: 1,0 ml/min und Detektor: ultraviolett (bei 292 nm). Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt. Die Konzentration des gebildeten PN in der Reaktionsmischung, die CFE von JM109/pKKpdxP enthielt, war 0,50 mM und war 1,4 Mal höher als die von JM109/pKK223-3 (0,37 mM). Tabelle 5: Menge an gebildetem PN in CFE von JM109/pKKtpdiP

CFE Gebildetes PN

(mM) (Verhältnis)

JM109/pKK223-3 (Vektor) 0,37 1

JM109/pKKpdxP 0,50 1,4

Minus CFE ND ND

ND: Nicht nachweisbar

(3) Expression von pdxP in S. meliloti
Das mobilisierbare Cosmid pVK100 wurde mit BglII verdaut, dann wurden Fragmente mit etwa 21,3 kb gewonnen. Nachdem die Fragmente mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden waren, wurden BamHI-Fragmente mit 1,1 kb aus pKKpdxP in das mit BglII verdaute und dephosphorylierte Fragment ligiert, was ein Plasmid pVKPtacpdxP ergab (3). Dann wurde S. meliloti IFO 14782 mit pVKPtacpdxP durch triparentale Konjugation erhalten und die Zellen wurden in dem Impfmedium gezüchtet, das 1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,2% Bacto-Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄·7 H₂O, 0,001% MnSO₄·5 H₂O und 0,001% FeSO₄·7 H₂O enthielt und die Impfkultur wurde in Glucosepolypeptonmedium überführt, das 4% Glucose, 2% Polypepton, 0,2% Bacto-Hefeextrakt, 0,05% MgSO₄·7 H₂O, 0,05% MnSO₄.5 H₂O und 0,001% FeSO₄·7 H₂O enthielt und 3 Tage bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit Kochsalzlösung gewaschen und in 20 mM Tris-HCl, pH-7,5-Puffer, der 15% Saccharose, 1 mM DTT, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂ und 0,1 mM PMSF enthielt, suspendiert. Die Zellsuspension wurde einer French-Presse unterworfen mit einem Druck von 800 kg/cm² und das entstehende Lysat wurde mit 35.000 × g 60 min lang bei 4°C zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde als CFE nach Dialyse mit dem gleichen Puffer verwendet.
(4) Herstellung von Vitamin B₆ aus VB6P durch CFE von rekombinanten S. meliloti
Die Erzeugung von Vitamin B₆ aus VB6P wurde untersucht unter Verwendung des in Beispiel 2 (3) hergestellten CFE. Die Reaktionsmischung enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 2 mM PNP, 1 mM MnCl₂ und CFE (0,4 mg Protein) in 125 μl. Die Reaktion erfolgte 30 min lang bei 37°C und die Menge an PN wurde mit HPLC quantitativ ausgewertet, wie in Beispiel 2 (2) gezeigt. Das Ergebnis ist in Tabelle 6 gezeigt. Die Konzentration des gebildeten PN in der CFE von S. meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP enthaltenden Reaktionsmischung war 1,66 mM und war viermal höher als die von S. meliloti IFO 14782 (0,41 mM). Tabelle 6: Menge an gebildetem PN in CFE von S. meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP

CFE Gebildetes PN

(mM) (Verhältnis)

S. meliloti IFO 14782 0,41 1

S. meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP 1,66 4,0

Minus CFE ND ND

ND: Nicht nachweisbar

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die Vitamin-B₆-Phosphatphosphatase codiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer DNA-Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 9 dargestellt; (b) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Vitamin-B₆-Phosphatphosphataseaktivität codiert und unter Standardbedingungen mit der in (a) definierten DNA-Sequenz oder einem Fragment davon hybridisiert und von der mindestens 70% identisch mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 9 oder einem Fragment davon sind; (c) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Vitamin-B₆-Phosphatphosphataseaktivität codiert, wobei das Polypeptid zu mindestens 70% identisch ist mit der in SEQ ID Nr. 10 dargestellten Aminosäuresequenz; (d) einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit einer Vitamin-B₆-Phosphatphosphataseaktivität codiert und zu mindestens 70% identisch ist mit der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 9 dargestellt ist; (e) einer degenerierten DNA-Sequenz von einer der Absätze (a) bis (c).
Vektor oder Plasmid enthaltend die isolierte DNA von Anspruch 1.
Rekombinanter Mikroorganismus der Gattung Sinorhizobium oder Escherichia, der Vitamin B₆ aus Vitamin-B₆-Phosphat erzeugen kann, wobei der Mikroorganismus mit der DNA von Anspruch 1 oder dem Vektor oder Plasmid von Anspruch 2 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines zellfreien Extrakts mit Vitamin-B₆-Phosphatphosphataseaktivität, das umfasst, dass der Mikroorganismus gemäß Anspruch 3 gezüchtet wird, wobei der Mikroorganismus unter Bedingungen in einem Medium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, enthält mit einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0, bei einer Temperatur von 5°C bis 45°C 1 bis 15 Tage lang unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird und die Zellen des Mikroorganismus aufgerissen werden.
Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ aus Vitamin-B₆-Phosphat, das umfasst, dass Vitamin-B₆-Phosphat mit dem zellfreien Extrakt des Mikroorganismus gemäß Anspruch 3 in einer Reaktionsmischung in Kontakt gebracht wird und das entstehende Vitamin B₆ aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.