-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante Mikroorganismen
und ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B6 unter
Verwendung derselben.
-
Der
Ausdruck "Vitamin
B6",
wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt Pyridoxol,
Pyridoxal und Pyridoxamin ein. Vitamin B6 ist
ein Vitamin, das für
Menschen und Tiere unentbehrlich ist und als Rohmaterial für Arzneimittel
oder als Futterzusatzstoff verwendet wird.
-
Der
Biosyntheseweg von Vitamin B6 in Escherichia
coli und Sinorhizobium meliloti ist gut aufgeklärt. Pyridoxol-5'-phosphat (im Folgenden
als PNP bezeichnet) dürfte
aus zwei Vorläufern
synthetisiert werden, 1-Desoxy-D-xylulose-5'-phosphat (im Folgenden
als DXP bezeichnet) und 4-(Phosphohydroxy)-L-threonin (im Folgenden
als HTP bezeichnet), durch zwei Enzyme, HTP-Dehydrogenase und PNP-Synthase,
die von dem pdxJ-Gen codiert werden.
-
Es
wird angenommen, dass in E. coli HTP aus D-Erythrose-4-phosphat
(E4P) in einer dreistufigen Reaktion synthetisiert wird. Die Reaktion
der ersten Stufe, Oxidation von E4P zu D-Erythronat-4-phosphat (im
Folgenden als ENP bezeichnet) wird katalysiert durch E4P-Dehydrogenase,
die von epd codiert wird.
-
Gemäß einer
Suche in der Genomdatenbank von S.-meliloti-Stamm 1021 wurde aber
kein Homologon von epd in E. coli nachgewiesen. Weiterhin gibt es
bisher keinen Bericht über
E4P-Dehydrogenase in S. meliloti. Es wird daher angenommen, dass
S. meliloti einen anderen Biosyntheseweg von HTP hat, als E. coli. Andererseits
sammelt S. meliloti IFO 14782 eine große Menge an Protocatechuat
an (eins der Shikimisäurederivate),
das aus E4P synthetisiert werden könnte.
-
Die
obigen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Stimulierung der
Umwandlung von E4P in ENP durch Einbau von epd in S. meliloti zu
der Entwicklung eines zusätzlichen
Biosynthesewegs für
Vitamin B6 und einem Anstieg der Vitamin-B6-Produktion in S. meliloti führt. Tatsächlich wurde
die Vitamin-B6-Produktion von S. meliloti
jedoch durch den Einbau nur des epd-Gens nicht stimuliert. Andererseits
war dann, wenn sowohl epd- als
auch pdxJ-Gene in S. meliloti eingebaut wurden, die Vitamin-B6-Produktion erheblich verbessert.
-
Erfindungsgemäß ist es
möglich,
die Produktionseffizienz für
Vitamin B6 drastisch zu verbessern durch Fermentation
unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Sinorhizobium
mit einem rekombinanten Plasmid, das einen Vektor enthält, der
epd und pdxJ enthält.
Vitamin B6 kann vorteilhafterweise in der
Kulturbrühe
erzeugt werden, indem dieser Mikroorganismus gezüchtet wird und daraus Vitamin
B6 in gewünschter Reinheit gewonnen wird.
-
Die
vorliegende Erfindung liefert einen rekombinanten Mikroorganismus,
z.B. ein Mitglied der Gattung Sinorhizobium, das Vitamin B6 erzeugen kann, das ein Plasmid mit pdxJ
und epd enthält.
-
Die
vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Erzeugung von
Vitamin B6, das beinhaltet, dass der Mikroorganismus
in einem Kulturmedium gezüchtet
wird, so dass Vitamin B6 erzeugt und in
der Kulturbrühe
angesammelt wird und das erzeugte Vitamin B6 gesammelt
wird.
-
Es
wird berichtet, dass pdxJ von E. coli das Gen ist, das PNP-Synthase
codiert, die die Synthese von PNP aus DXP und Aminoaceton-3-phosphat
katalysiert. Die Bezugnahme auf "pdxJ", wie sie hier verwendet wird,
bedeutet das natürliche
Gen selbst ebenso wie ein funktionelles Äquivalent davon. Ein funktionelles Äquivalent
von pdxJ ist daher irgendein Gen, das ein Enzym, PNP-Synthase, codiert.
Ein funktionelles Äquivalent von
pdxJ kann aus irgendeinem Organismus isoliert werden, wie z.B. ohne
darauf beschränkt
zu sein, Klebsiella pneumo niae und Pseudomonas aeruginosa, anderen
Bakterien, Hefen und Pflanzen. Das pdxJ, das in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, stammt bevorzugt aus Mikroorganismen der
Gattung Sinorhizobium, aber jedes in Bezug auf das Gen funktionelle Äquivalent
davon kann für
die vorliegende Erfindung verwendet werden. Z.B. kann eine DNA von
pdxJ, die aus S. meliloti IFO 14782 stammt, auf folgende Art und
Weise kloniert werden.
-
Die
Primer für
die Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden als PCR bezeichnet)
werden gemäß der DNA-Sequenz
für pdxJ
in einer DNA-Datenbank von S. meliloti Stamm 1021 synthetisiert
und enthalten eine Restriktionsenzymerkennungsstelle am 5'-Ende jedes Primers.
Das Gen pdxJ kann durch PCR amplifiziert werden unter Verwendung
der Primer und der chromosomalen DNA von S. meliloti IFO 14782.
Amplifiziertes pdxJ wird in einen Vektor ligiert, der in E. coli
replizierbar ist, z.B. die verfügbaren
pUC-Serien oder pBR-Serien. Ein Plasmid, in das pdxJ insertiert
ist, kann ausgewählt
werden durch Agarosegelanalyse des Plasmid, das mit Endonuclease
verdaut wurde, und die Sequenz des amplifizierten Bereichs kann
mit einem DNA-Sequenzautomaten sichergestellt werden.
-
Ein
epd, auf das hier Bezug genommen wird, bedeutet das Gen, das E4P-Dehydrogenase
codiert, die die Oxidation von E4P zu ENP katalysiert und ein funktionelles Äquivalent
von E.-coli-epd ist daher irgendein Gen, das eine aktive E4P-Dehydrogenase
codiert. Ein funktionelles Äquivalent
von E.-coli-epd kann aus irgendeinem Mikroorganismus isoliert werden,
z.B., ohne darauf beschränkt
zu sein, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeroginosa, anderen Bakterien,
Hefen und Pflanzen. Z.B. kann epd, das aus E. coli K12 stammt, unter Verwendung
der PCR auf gleiche Weise, wie oben erwähnt, kloniert werden.
-
Als
Vektor zum Einbau von rekombinanter DNA von S. meliloti können zwei
Arten von Vektoren verwendet werden. Einer ist replizierbar, ein
Vektor für
einen breiten Bereich an Wirten, wie pVK100, pRK290, pLAFR1 oder
RSF1010. Der andere ist ein Integrationsvektor, wie pSUP202.
-
Ein
Vektor zur Expression von rekombinantem Protein in S. meliloti kann
bereitgestellt werden, indem ein DNA-Fragment, das einen Promotor
codiert, der in S. meliloti funktioniert, z.B. ptac, plac, ptrc,
pS1 (Promotor der kleinen ribosomalen Untereinheit von S. meliloti)
oder pNm (Promotor des Neomycinresistenzgens) und entweder pdxJ
oder epd oder beide in einen Vektor insertiert werden.
-
Das
Verfahren zur Konstruktion solcher rekombinanten Vektoren kann mit
Standardtechniken durchgeführt
werden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie, der Biotechnologie
und der Gentechnik bekannt sind.
-
Z.B.
kann pdxJ in pVK100 unter die Kontrolle des ptrc-Promotors gebracht
werden, um pVK601 zu konstruieren. In einer anderen Ausführungsform
wird epd in pVK100 unter die Kontrolle des ptac-Promotors gebracht,
um pVK602 zu konstruieren und sowohl pdxJ als auch epd werden in
pVK100 unter die Kontrolle des ptrc-Promotors und des ptac-Promotors
gebracht, um pVK611 zu konstruieren.
-
Als
Elternstamm zur Herstellung der rekombinanten Mikroorganismen, die
erfindungsgemäß konstruiert
werden, können
alle Stämme,
die zur Gattung Sinorhizobium gehören, verwendet werden und die
Mikroorganismen, die zur Gattung Sinorhizobium gehören, können aus
natürlichen
Quellen isoliert werden oder können
von Kultursammlungen erworben werden, z.B. dem Institute for fermentation,
Osaka (IFO), Japan. Bevorzugt kann S. meliloti IFO 14782, der bei
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSM) in Göttingen,
Deutschland, unter DSM 10226 am 4. September 1995 hinterlegt wurde,
für die vorlegende
Erfindung verwendet werden.
-
Mikroorganismen,
die eine drastisch erhöhte
Produktivität
für Vitamin
B6 zeigen, können konstruiert werden, indem
ein rekombinanter Vektor eingeführt
wird, in den pdxJ und epd eingebracht wurden. Z.B. wird ein solcher
rekombinanter Mikroorganismus, der eine drastisch erhöhte Produktivität für Vitamin
B6 zeigte, der von S. meliloti IFO 14782
abgeleitet ist, wie unten beschrieben, konstruiert. Ein rekombinanter
Vektor, der konstruiert wird, indem entweder pdxJ, epd oder beide
kann in S. meliloti IFO 14782 durch triparentale Paarbildung auf
folgende Art und Weise eingebracht werden. S. meliloti als Empfängerstamm,
E. coli, der ein Helferplasmid beherbergt, als Helferstamm, und
E. coli, der einen rekombinanten Vektor beherbergt, als Donorstamm
werden getrennt gezüchtet
und miteinander vermischt. Nach der Mischkultivierung auf einer
Platte kann S. meliloti, der den rekombinanten Vektor von einem
Donorstamm erhalten hat, auf einer Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, selektiert
werden.
-
Der
rekombinante Stamm, der das Plasmid trägt, wird ausgewählt durch
Herstellung des Plasmids aus Kolonien, die auf den Platten gewachsen
sind und durch Untersuchung des Endonucleaseverdaus. Der rekombinante
Stamm, bei dem rekombinante DNA in das Chromosom integriert ist,
wird ausgewählt
durch Herstellung von Chromosomen-DNA aus zehn Kolonien, die auf
den Platten gewachsen sind, und Nachweis der integrierten DNA durch
Southern-Hybridisierung.
-
Die
Expression von in das Plasmid eingebrachtes pdxJ und epd in S. meliloti
kann analysiert werden, indem der entstehende rekombinante Stamm
in einem Medium gezüchtet
wird und ein zellfreier Extrakt erzeugt wird und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) unterzogen wird.
-
Die
erfindungsgemäß erhaltenen
rekombinanten Mikroorganismen werden in einem Medium inkubiert, das
eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle,
ein anorganisches Salz und andere Nährstoffe enthält, die
für ihr
Wachstum notwendig sind. Als Kohlenstoffquelle kann z.B. Glucose,
Fructose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Starke, Dextrin
oder Glycerin angewendet werden. Als Stickstoffquelle kann z.B.
Pepton, Maiseinweichwasser, Sojapulver, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff oder
deren Mischung angewendet werden.
-
Weiterhin
können
als Spurenelemente Sulfate, Hydrochloride oder Phosphate von Calcium,
Magnesium, Zink, Mangan, Cobalt und Eisen angewendet werden. Und
falls notwendig, können übliche Nährfaktoren, ein
Einfangmittel für
Phosphationen oder ein Antischaummittel, wie Magnesiumcarbonat,
Aluminiumoxid, Allophan, tierisches Öl, pflanzliches Öl oder Mineralöl ergänzend dem
Fermentationsmedium zugefügt
werden.
-
Der
pH-Wert des Kulturmediums kann etwa 5,0 bis 9,0, bevorzugt 6,5 bis
7,5 sein. Die Kultivierungstemperatur kann etwa 10 bis 40°C, bevorzugt
25 bis 35°C
sein. Die Kultivierungszeit kann etwa 1 Tag bis 15 Tage, bevorzugt
2 Tage bis 9 Tage sein. Bei der Kultivierung liefern gewöhnlich Belüftung und
Rühren
vorteilhafte Ergebnisse.
-
Nach
der Kultivierung kann erzeugtes Vitamin B6 aus
der Kulturbrühe
abgetrennt und gereinigt werden. Für diesen Zweck kann ein Verfahren
angewendet werden, das allgemein zur Extraktion eines bestimmten
Produkts aus der Kulturbrühe
verwendet wird, indem verschiedene Eigenschaften von Vitamin B6 verwertet werden. So können z.B. die Zellen aus der
Kulturbrühe
entfernt werden, die gewünschte
Substanz in dem Filtrat an Aktivkohle absorbiert werden, dann eluiert
werden und weiter mit einem Ionenaustauschharz gereinigt werden.
Alternativ wird das Kulturfiltrat direkt auf ein Ionenaustauschharz
aufgebracht und nach der Elution wird das gewünschte Produkt aus einer Mischung
von Alkohol und Wasser umkristallisiert. Die Menge an Vitamin B6, die in der Kulturbrühe erzeugt wurde, kann mit
Hochdruckflüssigchromatographie
(HPLC) quantitativ ausgewertet werden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun genauer unter Bezugnahme auf die
folgenden Beispiele erklärt.
-
E.
coli K12 wurde verwendet als Quelle für Chromosomen-DNA für das epd-Genklonierungsexperiment.
S. meliloti IFO 14782 wurde als Quelle für Chromosomen-DNA für den pdxJ-Genklonierungsversuch verwendet
und als Wirtsstamm zur Auswertung der Vitamin-B6-Fermentation
durch Rekombinanten. Stämme von
E. coli wurden in einem Medium gezüchtet (im Folgenden als LB
bezeichnet), das aus 1% Bacto-Trypton (Becton Dickinson Microbiology
systems, MD, USA), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Becton Dickinson Microbiology systems,
MD, USA) und 0,5% NaCl bestand. Bacto-Agar (1,5%) wurde dem LB-Medium
zur Herstellung von Agarplatten zugefügt. Plasmid-DNA wurde aus E.
coli oder S. meliloti mit QIAGEN Midi-Kit (QIAGEN GmbH, Deutschland)
oder mit dem Automatic DNA Isolation System PI-50 (Kurabo Industry
Ltd., Japan) isoliert. Chromosomale DNA wurde isoliert unter Verwendung
von QIAGEN Genomic-tips. Restriktionsenzyme, alkalische Phosphatase,
Ligierungskit, E. coli JM109, HIB101-kompetente Zellen (Takara Bio.
Inc., Shiga, Japan), TOPO Cloning kit (Invitrogen Japan K.K., Japan)
wurden nach den Anleitungen des Herstellers verwendet.
-
Das
Plasmid pKK223-3, pTrc99A und der SureClone Ligation kit wurden
von Amersham Biosciences Corp. (NJ, USA) erworben. Zur Restriktionsenzymanalyse
wurden die DNA-Fragmente in Agarosegelen (1%) fraktioniert und aus
den Gelen mithilfe einer Extraktion unter Verwendung eines im Handel
erhältlichen
Systems mit QIAEXII (QIAGEN GmbH, Deutschland) isoliert. Die DNA-Sequenz
wurde mit einem ALF-DNA-Sequenzautomaten
bestimmt (Amersham Biosciences Corp., NJ, USA).
-
Beispiel 1: Klonierung von pdxJ von S.
meliloti und epd von E.coli
-
(a) pdxJ aus S. meliloti IFO 14782-Chromosom
-
Um
pdxJ aus S. meliloti IFO 14782 unter Verwendung der PCR-Methode
zu amplifizieren, wurden zwei Primer gemäß der DNA-Sequenz von pdxJ
(2249854 bis 2250606, Komplement) in der Genomdatenbank von S. meliloti
Stamm 1021 (Zugangsnummer NC_003047) synthetisiert: Primer A (SEQ
ID Nr. 1) und Primer B (SEQ ID Nr. 2).
-
Chromosomale
DNA wurde aus den Zellen, die in einem Medium gewachsen waren (im
Folgenden als LBMC bezeichnet), das aus 1% Bacto-Trypton (Becton
Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% Bacto-Hefeextrakt
(Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% NaCl, 0,061%
MgSO4·7H2O und 0,036% CaCl2·2H2O zusammengesetzt war, mit QIAGEN Genomic-tips
extrahiert. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des Advantage-HF-PCR-Kits
(Clontech Laborstories Inc., CA, USA).
-
100 μl der Reaktionsmischung
enthielten 10 ng chromosomale DNA von S. meliloti IFO 14782, 50 pmol
der zwei Primer, 10 μl
10 × HF
dNTP-Mischung, 10 μl
des beigefügten
10 × HF
PCR-Reaktionspuffers und 2 μl
50 × Advantage-HF-Polymerasemischung.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 3 min bei 94°C, 4 Zyklen
mit 30 s bei 98°C,
1 min bei 53°C,
1 min bei 72°C,
20 Zyklen mit 30 s bei 98°C,
1 min bei 68°C und
10 min Halten auf 72°C.
10 μl Reaktionsmischung
wurden dem Agarosegel mit 1% (G/V) ausgesetzt und eine DNA-Bande
von 770 bp wurde aus dem Gel mit QIAEXII gewonnen.
-
Das
Fragment wurde in pUC18 ligiert, der mit SmaI verdaut worden war
und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden war unter
Verwendung des SureClone Ligation Kit. Die so erhaltene Ligierungsmischung
wurde in E. coli JM109-kompetente Zellen überführt und auf Platten mit LB-Medium
plattiert, das 100 μg/ml
Ampicillin enthielt (im Folgenden als Amp bezeichnet). Plasmide
von Kolonien, die auf den Platten gewachsen waren, wurden mit einem
automatischen DNA-Isolierungssystem präpariert. Durch Analyse des
Plasmids mit Restriktionsenzym wurde ein rekombinantes Plasmid pSHT56,
worin pdxJ die gleiche Richtung wie das lacZ-Gen auf pUC18 hatte,
erhalten. pSHT56 wurde aus E. coli JM109, der pSHT56 beherbergt,
mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit präpariert.
Die DNA-Sequenz von pdxJ in dem Plasmid wurde sichergestellt mit
einem ALF-DNA-Sequenzautomaten
und es wurde bestätigt,
dass sie identisch war mit der aus einer Genomdatenbank von S. meliloti
Stamm 1021. Die Funktion des pdxJ-Gens, das aus S. meliloti IFO
14782 kloniert worden war, wurde bestätigt durch die folgende Methode.
Als Vektor für
die Expression von pdxJ in E. coli wurde pUC18 in pUC-trc2 remodelliert,
der eine trc-Promotorregion von pTrc99A und anschließend eine
NdeI-Erkennungssequenz hat. pUC-trc2 wurde aus E. coli JM109, der
pUC-trc2 beherbergt, präpariert
mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit. Um ein Expressionsplasmid für pdxJ in
E. coli zu werden, wurde pUC-trc2 mit NdeI verdaut und ein 2,5-kb-Fragment
auf Agarosegel gewonnen und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
-
pSHT56
wurde mit NdeI gespalten, einem Agarosegel unterzogen und das entstehende
1-kb-Fragment wurde aus dem Gel mit QIAEXII gewonnen. Das gewonnene
1-kb-Fragment wurde in das vorher beschriebene 2,5-kb-Fragment von
pUC-trc2 mit dem Ligierungskit ligiert. E. coli JM109 wurde mit
der so erhaltenen Ligierungsmischung transformiert und auf LB-Platten
plattiert, die 100 μg/ml
Amp enthielten. Ein Plasmid einer Kolonie, die auf der Platte wuchs,
wurde mit einem automatischen DNA-Isolierungssystem präpariert.
-
Durch
Analyse des Plasmids mit Restriktionsenzymen wurde ein rekombinantes
Plasmid pSHT57, bei dem pdxJ in gleicher Richtung wie der trc-Promotor
eingebaut war, erhalten (1) pSHT57 wurde aus F. coli JM109
präpariert,
der pSHT57 beherbergt, mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit.
-
(b) epd aus E. coli K-12-Chromosom
-
Das
epd-Gen wurde aus 100 ng chromosomaler DNA von E. coli K-12 mit
Advantage-HF-PCR-Kit amplifiziert unter Verwendung von 10 pmol von
zwei Primern, d.h. Primer C (SEQ ID Nr. 3) und Primer D (SEQ ID Nr.
4).
-
Die
Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 15 s Halten auf 94°C und danach
25 Zyklen 15 s bei 94°C, 3
min bei 68°C.
Das amplifizierte 1,0-kb-Fragment wurde direkt. in pCRII-TOPO-Vektor
mit dem TOPO-TA-Klonierungskit
kloniert. Es wurde sichergestellt, dass die Sequenz des amplifizierten
Bereichs identisch war mit der CDS-Region von epd (3070692 bis 3071711,
Komplement) mit der Zugangsnummer NC_000913 und das erhaltene Plasmid
wurde als pCRepd bezeichnet.
-
Beispiel 2: Konstruktion rekombinanter
Plasmide
-
(a) pVK 601
-
Um
einen Expressionsvektor in S. meliloti IFO 14782 zu konstruieren,
wurde pVK100 verwendet, von dem angegeben wird, dass er ein Vektor
für einen
breiten Bereich an Wirten ist, vom IncP-1-Typ ist, und in S. meliloti
replizierbar ist. pVK100 wurde aus E. coli HB101/pVK100 mit QIAGEN
Plasmid Midi-Kit präpariert
und mit HindIII verdaut, die Enden geglättet mit einem Blunting-Kit
und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. pSHT57 wurde mit
BamHI und KpnI verdaut.
-
Das
entstehende 875-bp-Fragment, das den trc-Promotor und pdxJ enthielt,
wurde aus Agarosegel gewonnen, die Enden geglättet und in den vorher beschriebenen
pVK100 mit Ligierungskit ligiert. E. coli HB101-kompetente Zellen wurden mit der erhaltenen
Ligierungsmischung transformiert und auf LB-Platten plattiert, die
10 μg/ml
Tetracyclin enthielten (im Folgenden als Tc bezeichnet). Plasmide
von Kolonien, die auf den Platten wuchsen, wurden in einem automatischen
DNA-Isolierungssystem präpariert.
Durch Analyse des Plasmids mit Restriktionsenzymen, wurde ein rekombinantes
Plasmid, pVK601 erhalten, bei dem der trc-Promotor und pdxJ in entgegengesetzter
Richtung, wie das Kanamycin-(im Folgenden als Km bezeichnet)-Resistenzgen
waren (1).
-
(b) pVK602
-
Um
epd in S. meliloti zu amplifizieren, wurde eine von tac-Promotor
gesteuerte epd-Kassette konstruiert. Ein 1,0-kb-PstI-Fragment aus
pCRepd [Beispiel 1-(b)] wurde geglättet und in die SmaI-Stelle
von pKK223-3 in einer Orientierung ligiert, die die Transkription
von epd durch den tac-Promotor zuließ und das entstehende Plasmid
wurde mit pKKepd bezeichnet (2). Dann
wurde das mobilisierbare Cosmid pVK100 mit BglII verdaut und ein
etwa 21,3-kb-Fragment gewonnen.
-
Nachdem
das Fragment mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt
worden war, wurden 1,3-kb BamHI-Fragmente aus pKKepd in das mit
BglII verdaute und dephosphorylierte Fragment ligiert, was Plasmid
pVK602 ergab (3).
-
(c) pVK611
-
Um
sowohl epd aus E. coli als auch pdxJ aus S. meliloti in S. meliloti
zu coexprimieren, wurde pVK611 konstruiert auf gleiche Weise, wie
in Beispiel 2-(b) beschrieben. pVK601 wurde mit BglII verdaut und
etwa 22,2-kb-Fragmente
wurden gewonnen. Nachdem die Fragmente mit bakterieller alkalischer
Phosphatase behandelt worden waren, wurden 1,3-kb-BamHI-Fragmente
aus pKKepd in das mit BglII verdaute und dephosphorylierte Fragment
ligiert, was Plasmid pVK611 ergab (4).
-
Beispiel 3: Einführung rekombinanter Plasmide
in S. meliloti IFO 14782
-
Die
Plasmide wurden aus E. coli HB101 in S. meliloti IFO 14782 mithilfe
von E. coli HB101, der pRK2013 (Km', IncP, tra+,
CoIEI ori (ATCC 37159)) trug, unter Verwendung der triparentalen
konjugalen Paarungsmethode, wie unten beschrieben, transferiert.
S. meliloti IFO 14782 als Empfängerstamm
wurde in flüssiges
LBMC-Medium geimpft und unter Schütteln bei 30°C mit 140
U/min 16 Stunden lang inkubiert.
-
E.
coli HB101, der pRK2013 beherbergt, als Helferstamm und F. coli
HB101, der pVK601 beherbergt, als Donatorstamm wurden in flüssiges LB-Medium,
das 50 μg/ml
Km enthielt bzw. in flüssiges
LB-Medium das 10 μg/ml
Tc enthielt, geimpft und unter Schütteln bei 37°C mit 140
U/min 16 Stunden lang inkubiert. Jeder Stamm wurde in das gleiche
Medium überführt und
weitere 6 Stunden lang gezüchtet.
Dann wurden Zellen durch Zentri fugation geerntet und in LB-Medium
(End-OD600 = 20) mit gemischten Empfängerzellen,
Helferzellen und Donatorzellen in einem Verhältnis von 1:1:4 (V/V/V) suspendiert.
-
Die
Mischung wurde auf ein Nitrocellulosefilter gebracht, das auf LBMC-Agarplatten
gelegt wurde. Nachdem diese Platten 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert
worden waren, wurden Zellen von dem Filter gekratzt und in sterilisierter
0,85% NaCl-Lösung
suspendiert. Die Suspension wurde in geeigneter Weise verdünnt und
auf LBMC-Platten ausgebreitet, die 20 μg/ml Nalidixinsäure (um
S. meliloti IFO 14782 zu selektieren) und 10 μg/ml Tc (um pVK601 zu selektieren)
enthielten. Nach 5-tägiger
Inkubation dieser Platten bei 30°C wurden
die Kolonien, die auf den Platten gewachsen waren, herausgepickt
und zur Plasmidextraktion mit QIAGEN Plasmid Mini-Kit kultiviert.
Die erhaltene Plasmid-DNA wurde durch Behandlung mit Restriktionsenzymen
untersucht, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und zeigte
das identische Muster wie pVK601. Die entstehenden Kolonien wurden
gereinigt, indem auf der gleichen Selektionsplatte ausgestrichen
wurde und wurden als rekombinanter Stamm S. meliloti IFO 14782/pVK601
verwendet. Auf gleiche Weise wie bei der Konstruktion von S. meliloti
IFO 14782/pVK601 wie oben erwähnt,
wurden S. meliloti IFO 14782/pVK602 und S. meliloti IFO 14782/pVK611
erhalten unter Verwendung von E. coli HB101, der pVK602 trug bzw.
E. coli HB101, der pVK611 trug, als Donatorstämme. Um die Expression von
pdxJ und epd in rekombinanten Stämmen
zu bestätigen,
wurde eine SDS-PAGE durchgeführt.
Die Zellen wurden in LBMC-Medium mit 10 μg/ml Tc bei 30°C 18 Stunden
lang gezüchtet.
Dann wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugation geerntet,
mit Kochsalzlösung
gewaschen und wieder in eiskaltem 20 mM Phosphatpuffer (pH 8,2)
suspendiert. Die Zellsuspension wurde einer Beschallung (Bioruptor,
Cosmo Bio Co., Japan) unterzogen und das entstehende Lysat wurde
mit 15.000 U/min 10 min lang bei 4°C zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen.
-
Der Überstand
wurde als zellfreier Extrakt verwendet und dann einer SDS-PAGE in
12,5% Gel unterzogen und mit Comassie Brilliantblau (Rapid Stain
CBB Kit, nacalai tesque Japan) gefärbt. Die Expression eines Polypeptids
mit der erwarteten Größe (PdxJ
29,0 kDa, Epd 37,2 kDa) wurde in S. meliloti IFO 14782 mit rekombinanten
Plasmiden nachgewiesen.
-
Beispiel 4: Herstellung von Vitamin B6 durch Fermentation von S. meliloti IFO
4782 mit rekombinantem Plasmid
-
S.
meliloti IFO 14782 mit einem rekombinanten Plasmid und der Elternstamm,
S. meliloti IFO 14782, wurden auf LBMC-Agarplatten bei 30°C 48 Stunden
lang inkubiert und eine Schlinge jedes Stamms wurde in Röhrchen geimpft,
die 8 ml Impfmedium enthielten, das aus 1% Glucose, 1% Maiseinweichwasser
(Nihon Syokuhin Kako Co., Ltd., Tokio, Japan) und 0,2% Bacto-Hefeextrakt,
0,1% Polypepton S (Nihon Pharmaceuticals Co., Japan), 0,05% MgSO4·7H2O, 0,001% MnSO4·5H2O und 0,001% FeSO4·7H2O aufgebaut war, pH 6,8, und dann wurden
die Röhrchen
auf einem Reziprokschüttler
(275 U/min) bei 30°C
geschüttelt.
-
Nach
19-stündigem
Schütteln
wurden jeweils 3 ml Kulturbrühe
in 500-ml-Kolben mit zwei Strombrechern überführt, die 150 ml Produktionsmedium
enthielten, das aus 6% Glucose, 3% Maiseinweichwasser, 0,8% Bacto-Hefeextrakt, 0,175%
NH4Cl, 0,05% MgSO4·7H2O, 0,025% MnSO4·5H2O, 1% Allophosit (Shinagawa Chemicals Co.,
Ltd., Tokio, Japan) und 0,025% Actocol (Takeda Chemical Industries,
Ltd., Osaka, Japan) aufgebaut war, pH 6,8, und auf einem Rotationsschüttler (180
U/min) bei 30°C
geschüttelt.
Nach 2-tägigem Schütteln wur de
eine sterile Harnstofflösung
zu jedem Kolben mit 0,125% zugegeben und das Schütteln wurde 5 Tage lang fortgesetzt.
Nach 7-tägiger
Kultivierung wurde der Gehalt an Vitamin B6 im Überstand
jeder Kulturbrühe
mit HPLC quantitativ ausgewertet und der Anteil an erzeugtem Vitamin
B6 wurde berechnet mit der Methode des inneren
Standards mit 4'-Desoxypyridoxol
wie unten beschrieben. Um die Proben für HPLC herzustellen, wurden
400 μl von
500 mg/l 4'-Desoxypyridoxol
als innere Substanz bzw. innerer Standard, 50 μl 60% Perchlorsäure und
550 μl deionisiertes
Wasser zu 250 μl
der Standardlösungen
von Pyridoxol oder dem Überstand
der Kulturbrühe
zugegeben und dann die Mischung 10 min lang auf Eis gestellt. Dann
wurde die Mischung mit 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand
auf die folgende Säule
gegeben.
-
Die
Analysebedingungen waren wie folgt: Säule Capcell pak C18 SG120 (4,6 × 250 mm)
(Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japan); mobile Phase: 0,1 M Natriumperchlorat,
0,1 M Kaliumphosphat und 2% Acetonitril (pH 3,5); Säulentemperatur
30°C; Durchflussrate
1,0 ml/min und Detektor: Ultraviolett (bei 292 nm). Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt. S. meliloti IFO 14782/pVK601, der Stamm
mit dem pdxJ-Expressionsplasmid, zeigte einen doppelt so hohen Titer
wie der Elternstamm IFO 14782 und S. meliloti IFO 14782/pVK602,
der Stamm mit dem epd-Expressionsplasmid zeigte einen geringeren
Titer als der Elternstamm. Andererseits erzeugte S. meliloti IFO
14782/pVK611, der rekombinante Stamm, dem sowohl epd- als auch pdxJ-Gen
zugefügt wurden,
1300 mg Pyridoxol/l und dies war ein etwa 13 Mal höherer Titer
als der des Elternstamms. Die Produktivität von Vitamin B
6 wurde
drastisch verbessert durch Einbau der epd- und pdxJ-Gene. Tabelle 1: PN-Produktivität von rekombinantem
S. meliloti
Stamm | PN-Produktivitat
(mg/l) |
S.
meliloti IFO 14782 S. meliloti IFO 14782/pVK601 S. meliloti IFO
14782/pVK602 S. meliloti IFO 14782/pVK611 | 103
192 84 1.300 |
-
Beispiel 5: Isolierung und Reinigung von
Vitamin B6 aus der Kulturbrühe
-
Vitamin
B6 wurde aus der Kulturbrühe von S.
meliloti IFO 14782/pVK611 gewonnen, das unter den gleichen Kulturbedingungen,
wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt wurde. Das Vitamin B6 und seine Konzentration wurden in jeder
Reinigungsstufe mit HPLC verfolgt. 11 einer 168-Stunden-Kulturbrühe, die
1.300 mg/ml Vitamin B6 enthielt, wurde mit
7.500 U/min 10 min lang zentrifugiert. Der pH-Wert des entstehenden Überstandes
wurde mit 1 n Salzsäure
auf 3,1 eingestellt und dann wurde der Überstand auf eine Säule aufgebracht
(5,5 × 15
cm), die mit 350 ml Amberlite CG 120 (H+-Form,
100 bis 200 mesh, Rohm und Haas Company, Philadelphia, Pennsylvania,
USA) gepackt war. Die Säule
wurde mit 500 ml deionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 5%
Ammoniumhydroxid eluiert. Die Vitamin-B6-Fraktionen
wurden bei vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene Rückstand
wurde in 10 ml deionisiertem Wasser gelöst und die Lösung auf
eine Säule (5,5 × 16 cm)
geladen, die mit 380 ml Dowex 1 × 4 (OH-Form, 200 bis 400 mesh,
Dow Chemical Co., Ltd., Midland, Michigan, USA) gepackt war und
dann mit 500 ml deionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde dann
mit 0,1 n HCl eluiert. Die Fraktionen, die Vitamin 136 enthielten,
wurden auf ein kleines Volumen bei vermindertem Druck eingeengt.
Nachdem der feste Rückstand
in einer geringen Menge heißem
Ethanol gelöst worden
war, wurde die Lösung über Nacht
bei 4°C
stehen gelassen. Der entstehende Niederschlag wurde durch Filtration
gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 1.090 mg roher Kristalle
zu erhalten. Er wurde aus Ethanol umkristallisiert, um 839 mg weiße Kristalle
mit einem Schmelzpunkt von 160°C
zu erhalten. Die Infrarotabsorption, Ultraviolettabsorption und
das NMR-Spektrum des Produkts stimmten überein mit dem von authentischem
Pyridoxol.
-