DE60313340T2

DE60313340T2 - Mikroorganismus und verfahren für die produktion von vitamin b6

Info

Publication number: DE60313340T2
Application number: DE60313340T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kanagawa-ken HOSHINO; Keiko Kanagawa-ken ICHIKAWA; Yoshie Kanagawa-ken NAGAHASHI; Masaaki Yokohama-shi TAZOE
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2023-09-17
Also published as: DE60313340D1; CN1703503A; EP1543104A1; AU2003267370A1; CN100355879C; AU2003267370A8; EP1543104B1; US20060127992A1; ATE360059T1; WO2004029228A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ unter Verwendung derselben.
Der Ausdruck "Vitamin B₆", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt Pyridoxol, Pyridoxal und Pyridoxamin ein. Vitamin B₆ ist ein Vitamin, das für Menschen und Tiere unentbehrlich ist und als Rohmaterial für Arzneimittel oder als Futterzusatzstoff verwendet wird.
Der Biosyntheseweg von Vitamin B₆ in Escherichia coli und Sinorhizobium meliloti ist gut aufgeklärt. Pyridoxol-5'-phosphat (im Folgenden als PNP bezeichnet) dürfte aus zwei Vorläufern synthetisiert werden, 1-Desoxy-D-xylulose-5'-phosphat (im Folgenden als DXP bezeichnet) und 4-(Phosphohydroxy)-L-threonin (im Folgenden als HTP bezeichnet), durch zwei Enzyme, HTP-Dehydrogenase und PNP-Synthase, die von dem pdxJ-Gen codiert werden.
Es wird angenommen, dass in E. coli HTP aus D-Erythrose-4-phosphat (E4P) in einer dreistufigen Reaktion synthetisiert wird. Die Reaktion der ersten Stufe, Oxidation von E4P zu D-Erythronat-4-phosphat (im Folgenden als ENP bezeichnet) wird katalysiert durch E4P-Dehydrogenase, die von epd codiert wird.
Gemäß einer Suche in der Genomdatenbank von S.-meliloti-Stamm 1021 wurde aber kein Homologon von epd in E. coli nachgewiesen. Weiterhin gibt es bisher keinen Bericht über E4P-Dehydrogenase in S. meliloti. Es wird daher angenommen, dass S. meliloti einen anderen Biosyntheseweg von HTP hat, als E. coli. Andererseits sammelt S. meliloti IFO 14782 eine große Menge an Protocatechuat an (eins der Shikimisäurederivate), das aus E4P synthetisiert werden könnte.
Die obigen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Stimulierung der Umwandlung von E4P in ENP durch Einbau von epd in S. meliloti zu der Entwicklung eines zusätzlichen Biosynthesewegs für Vitamin B₆ und einem Anstieg der Vitamin-B₆-Produktion in S. meliloti führt. Tatsächlich wurde die Vitamin-B₆-Produktion von S. meliloti jedoch durch den Einbau nur des epd-Gens nicht stimuliert. Andererseits war dann, wenn sowohl epd- als auch pdxJ-Gene in S. meliloti eingebaut wurden, die Vitamin-B₆-Produktion erheblich verbessert.
Erfindungsgemäß ist es möglich, die Produktionseffizienz für Vitamin B₆ drastisch zu verbessern durch Fermentation unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Sinorhizobium mit einem rekombinanten Plasmid, das einen Vektor enthält, der epd und pdxJ enthält. Vitamin B₆ kann vorteilhafterweise in der Kulturbrühe erzeugt werden, indem dieser Mikroorganismus gezüchtet wird und daraus Vitamin B₆ in gewünschter Reinheit gewonnen wird.
Die vorliegende Erfindung liefert einen rekombinanten Mikroorganismus, z.B. ein Mitglied der Gattung Sinorhizobium, das Vitamin B₆ erzeugen kann, das ein Plasmid mit pdxJ und epd enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Erzeugung von Vitamin B₆, das beinhaltet, dass der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, so dass Vitamin B₆ erzeugt und in der Kulturbrühe angesammelt wird und das erzeugte Vitamin B₆ gesammelt wird.
Es wird berichtet, dass pdxJ von E. coli das Gen ist, das PNP-Synthase codiert, die die Synthese von PNP aus DXP und Aminoaceton-3-phosphat katalysiert. Die Bezugnahme auf "pdxJ", wie sie hier verwendet wird, bedeutet das natürliche Gen selbst ebenso wie ein funktionelles Äquivalent davon. Ein funktionelles Äquivalent von pdxJ ist daher irgendein Gen, das ein Enzym, PNP-Synthase, codiert. Ein funktionelles Äquivalent von pdxJ kann aus irgendeinem Organismus isoliert werden, wie z.B. ohne darauf beschränkt zu sein, Klebsiella pneumo niae und Pseudomonas aeruginosa, anderen Bakterien, Hefen und Pflanzen. Das pdxJ, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, stammt bevorzugt aus Mikroorganismen der Gattung Sinorhizobium, aber jedes in Bezug auf das Gen funktionelle Äquivalent davon kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Z.B. kann eine DNA von pdxJ, die aus S. meliloti IFO 14782 stammt, auf folgende Art und Weise kloniert werden.
Die Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden als PCR bezeichnet) werden gemäß der DNA-Sequenz für pdxJ in einer DNA-Datenbank von S. meliloti Stamm 1021 synthetisiert und enthalten eine Restriktionsenzymerkennungsstelle am 5'-Ende jedes Primers. Das Gen pdxJ kann durch PCR amplifiziert werden unter Verwendung der Primer und der chromosomalen DNA von S. meliloti IFO 14782. Amplifiziertes pdxJ wird in einen Vektor ligiert, der in E. coli replizierbar ist, z.B. die verfügbaren pUC-Serien oder pBR-Serien. Ein Plasmid, in das pdxJ insertiert ist, kann ausgewählt werden durch Agarosegelanalyse des Plasmid, das mit Endonuclease verdaut wurde, und die Sequenz des amplifizierten Bereichs kann mit einem DNA-Sequenzautomaten sichergestellt werden.
Ein epd, auf das hier Bezug genommen wird, bedeutet das Gen, das E4P-Dehydrogenase codiert, die die Oxidation von E4P zu ENP katalysiert und ein funktionelles Äquivalent von E.-coli-epd ist daher irgendein Gen, das eine aktive E4P-Dehydrogenase codiert. Ein funktionelles Äquivalent von E.-coli-epd kann aus irgendeinem Mikroorganismus isoliert werden, z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeroginosa, anderen Bakterien, Hefen und Pflanzen. Z.B. kann epd, das aus E. coli K12 stammt, unter Verwendung der PCR auf gleiche Weise, wie oben erwähnt, kloniert werden.
Als Vektor zum Einbau von rekombinanter DNA von S. meliloti können zwei Arten von Vektoren verwendet werden. Einer ist replizierbar, ein Vektor für einen breiten Bereich an Wirten, wie pVK100, pRK290, pLAFR1 oder RSF1010. Der andere ist ein Integrationsvektor, wie pSUP202.
Ein Vektor zur Expression von rekombinantem Protein in S. meliloti kann bereitgestellt werden, indem ein DNA-Fragment, das einen Promotor codiert, der in S. meliloti funktioniert, z.B. ptac, plac, ptrc, pS1 (Promotor der kleinen ribosomalen Untereinheit von S. meliloti) oder pNm (Promotor des Neomycinresistenzgens) und entweder pdxJ oder epd oder beide in einen Vektor insertiert werden.
Das Verfahren zur Konstruktion solcher rekombinanten Vektoren kann mit Standardtechniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie, der Biotechnologie und der Gentechnik bekannt sind.
Z.B. kann pdxJ in pVK100 unter die Kontrolle des ptrc-Promotors gebracht werden, um pVK601 zu konstruieren. In einer anderen Ausführungsform wird epd in pVK100 unter die Kontrolle des ptac-Promotors gebracht, um pVK602 zu konstruieren und sowohl pdxJ als auch epd werden in pVK100 unter die Kontrolle des ptrc-Promotors und des ptac-Promotors gebracht, um pVK611 zu konstruieren.
Als Elternstamm zur Herstellung der rekombinanten Mikroorganismen, die erfindungsgemäß konstruiert werden, können alle Stämme, die zur Gattung Sinorhizobium gehören, verwendet werden und die Mikroorganismen, die zur Gattung Sinorhizobium gehören, können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können von Kultursammlungen erworben werden, z.B. dem Institute for fermentation, Osaka (IFO), Japan. Bevorzugt kann S. meliloti IFO 14782, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) in Göttingen, Deutschland, unter DSM 10226 am 4. September 1995 hinterlegt wurde, für die vorlegende Erfindung verwendet werden.
Mikroorganismen, die eine drastisch erhöhte Produktivität für Vitamin B₆ zeigen, können konstruiert werden, indem ein rekombinanter Vektor eingeführt wird, in den pdxJ und epd eingebracht wurden. Z.B. wird ein solcher rekombinanter Mikroorganismus, der eine drastisch erhöhte Produktivität für Vitamin B₆ zeigte, der von S. meliloti IFO 14782 abgeleitet ist, wie unten beschrieben, konstruiert. Ein rekombinanter Vektor, der konstruiert wird, indem entweder pdxJ, epd oder beide kann in S. meliloti IFO 14782 durch triparentale Paarbildung auf folgende Art und Weise eingebracht werden. S. meliloti als Empfängerstamm, E. coli, der ein Helferplasmid beherbergt, als Helferstamm, und E. coli, der einen rekombinanten Vektor beherbergt, als Donorstamm werden getrennt gezüchtet und miteinander vermischt. Nach der Mischkultivierung auf einer Platte kann S. meliloti, der den rekombinanten Vektor von einem Donorstamm erhalten hat, auf einer Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, selektiert werden.
Der rekombinante Stamm, der das Plasmid trägt, wird ausgewählt durch Herstellung des Plasmids aus Kolonien, die auf den Platten gewachsen sind und durch Untersuchung des Endonucleaseverdaus. Der rekombinante Stamm, bei dem rekombinante DNA in das Chromosom integriert ist, wird ausgewählt durch Herstellung von Chromosomen-DNA aus zehn Kolonien, die auf den Platten gewachsen sind, und Nachweis der integrierten DNA durch Southern-Hybridisierung.
Die Expression von in das Plasmid eingebrachtes pdxJ und epd in S. meliloti kann analysiert werden, indem der entstehende rekombinante Stamm in einem Medium gezüchtet wird und ein zellfreier Extrakt erzeugt wird und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen wird.
Die erfindungsgemäß erhaltenen rekombinanten Mikroorganismen werden in einem Medium inkubiert, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und andere Nährstoffe enthält, die für ihr Wachstum notwendig sind. Als Kohlenstoffquelle kann z.B. Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Starke, Dextrin oder Glycerin angewendet werden. Als Stickstoffquelle kann z.B. Pepton, Maiseinweichwasser, Sojapulver, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff oder deren Mischung angewendet werden.
Weiterhin können als Spurenelemente Sulfate, Hydrochloride oder Phosphate von Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Cobalt und Eisen angewendet werden. Und falls notwendig, können übliche Nährfaktoren, ein Einfangmittel für Phosphationen oder ein Antischaummittel, wie Magnesiumcarbonat, Aluminiumoxid, Allophan, tierisches Öl, pflanzliches Öl oder Mineralöl ergänzend dem Fermentationsmedium zugefügt werden.
Der pH-Wert des Kulturmediums kann etwa 5,0 bis 9,0, bevorzugt 6,5 bis 7,5 sein. Die Kultivierungstemperatur kann etwa 10 bis 40°C, bevorzugt 25 bis 35°C sein. Die Kultivierungszeit kann etwa 1 Tag bis 15 Tage, bevorzugt 2 Tage bis 9 Tage sein. Bei der Kultivierung liefern gewöhnlich Belüftung und Rühren vorteilhafte Ergebnisse.
Nach der Kultivierung kann erzeugtes Vitamin B₆ aus der Kulturbrühe abgetrennt und gereinigt werden. Für diesen Zweck kann ein Verfahren angewendet werden, das allgemein zur Extraktion eines bestimmten Produkts aus der Kulturbrühe verwendet wird, indem verschiedene Eigenschaften von Vitamin B₆ verwertet werden. So können z.B. die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt werden, die gewünschte Substanz in dem Filtrat an Aktivkohle absorbiert werden, dann eluiert werden und weiter mit einem Ionenaustauschharz gereinigt werden. Alternativ wird das Kulturfiltrat direkt auf ein Ionenaustauschharz aufgebracht und nach der Elution wird das gewünschte Produkt aus einer Mischung von Alkohol und Wasser umkristallisiert. Die Menge an Vitamin B₆, die in der Kulturbrühe erzeugt wurde, kann mit Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) quantitativ ausgewertet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun genauer unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt.
E. coli K12 wurde verwendet als Quelle für Chromosomen-DNA für das epd-Genklonierungsexperiment. S. meliloti IFO 14782 wurde als Quelle für Chromosomen-DNA für den pdxJ-Genklonierungsversuch verwendet und als Wirtsstamm zur Auswertung der Vitamin-B₆-Fermentation durch Rekombinanten. Stämme von E. coli wurden in einem Medium gezüchtet (im Folgenden als LB bezeichnet), das aus 1% Bacto-Trypton (Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA) und 0,5% NaCl bestand. Bacto-Agar (1,5%) wurde dem LB-Medium zur Herstellung von Agarplatten zugefügt. Plasmid-DNA wurde aus E. coli oder S. meliloti mit QIAGEN Midi-Kit (QIAGEN GmbH, Deutschland) oder mit dem Automatic DNA Isolation System PI-50 (Kurabo Industry Ltd., Japan) isoliert. Chromosomale DNA wurde isoliert unter Verwendung von QIAGEN Genomic-tips. Restriktionsenzyme, alkalische Phosphatase, Ligierungskit, E. coli JM109, HIB101-kompetente Zellen (Takara Bio. Inc., Shiga, Japan), TOPO Cloning kit (Invitrogen Japan K.K., Japan) wurden nach den Anleitungen des Herstellers verwendet.
Das Plasmid pKK223-3, pTrc99A und der SureClone Ligation kit wurden von Amersham Biosciences Corp. (NJ, USA) erworben. Zur Restriktionsenzymanalyse wurden die DNA-Fragmente in Agarosegelen (1%) fraktioniert und aus den Gelen mithilfe einer Extraktion unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Systems mit QIAEXII (QIAGEN GmbH, Deutschland) isoliert. Die DNA-Sequenz wurde mit einem ALF-DNA-Sequenzautomaten bestimmt (Amersham Biosciences Corp., NJ, USA).
Beispiel 1: Klonierung von pdxJ von S. meliloti und epd von E.coli
(a) pdxJ aus S. meliloti IFO 14782-Chromosom
Um pdxJ aus S. meliloti IFO 14782 unter Verwendung der PCR-Methode zu amplifizieren, wurden zwei Primer gemäß der DNA-Sequenz von pdxJ (2249854 bis 2250606, Komplement) in der Genomdatenbank von S. meliloti Stamm 1021 (Zugangsnummer NC_003047) synthetisiert: Primer A (SEQ ID Nr. 1) und Primer B (SEQ ID Nr. 2).
Chromosomale DNA wurde aus den Zellen, die in einem Medium gewachsen waren (im Folgenden als LBMC bezeichnet), das aus 1% Bacto-Trypton (Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% NaCl, 0,061% MgSO₄·7H₂O und 0,036% CaCl₂·2H₂O zusammengesetzt war, mit QIAGEN Genomic-tips extrahiert. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des Advantage-HF-PCR-Kits (Clontech Laborstories Inc., CA, USA).
100 μl der Reaktionsmischung enthielten 10 ng chromosomale DNA von S. meliloti IFO 14782, 50 pmol der zwei Primer, 10 μl 10 × HF dNTP-Mischung, 10 μl des beigefügten 10 × HF PCR-Reaktionspuffers und 2 μl 50 × Advantage-HF-Polymerasemischung. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 3 min bei 94°C, 4 Zyklen mit 30 s bei 98°C, 1 min bei 53°C, 1 min bei 72°C, 20 Zyklen mit 30 s bei 98°C, 1 min bei 68°C und 10 min Halten auf 72°C. 10 μl Reaktionsmischung wurden dem Agarosegel mit 1% (G/V) ausgesetzt und eine DNA-Bande von 770 bp wurde aus dem Gel mit QIAEXII gewonnen.
Das Fragment wurde in pUC18 ligiert, der mit SmaI verdaut worden war und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden war unter Verwendung des SureClone Ligation Kit. Die so erhaltene Ligierungsmischung wurde in E. coli JM109-kompetente Zellen überführt und auf Platten mit LB-Medium plattiert, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt (im Folgenden als Amp bezeichnet). Plasmide von Kolonien, die auf den Platten gewachsen waren, wurden mit einem automatischen DNA-Isolierungssystem präpariert. Durch Analyse des Plasmids mit Restriktionsenzym wurde ein rekombinantes Plasmid pSHT56, worin pdxJ die gleiche Richtung wie das lacZ-Gen auf pUC18 hatte, erhalten. pSHT56 wurde aus E. coli JM109, der pSHT56 beherbergt, mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit präpariert. Die DNA-Sequenz von pdxJ in dem Plasmid wurde sichergestellt mit einem ALF-DNA-Sequenzautomaten und es wurde bestätigt, dass sie identisch war mit der aus einer Genomdatenbank von S. meliloti Stamm 1021. Die Funktion des pdxJ-Gens, das aus S. meliloti IFO 14782 kloniert worden war, wurde bestätigt durch die folgende Methode. Als Vektor für die Expression von pdxJ in E. coli wurde pUC18 in pUC-trc2 remodelliert, der eine trc-Promotorregion von pTrc99A und anschließend eine NdeI-Erkennungssequenz hat. pUC-trc2 wurde aus E. coli JM109, der pUC-trc2 beherbergt, präpariert mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit. Um ein Expressionsplasmid für pdxJ in E. coli zu werden, wurde pUC-trc2 mit NdeI verdaut und ein 2,5-kb-Fragment auf Agarosegel gewonnen und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
pSHT56 wurde mit NdeI gespalten, einem Agarosegel unterzogen und das entstehende 1-kb-Fragment wurde aus dem Gel mit QIAEXII gewonnen. Das gewonnene 1-kb-Fragment wurde in das vorher beschriebene 2,5-kb-Fragment von pUC-trc2 mit dem Ligierungskit ligiert. E. coli JM109 wurde mit der so erhaltenen Ligierungsmischung transformiert und auf LB-Platten plattiert, die 100 μg/ml Amp enthielten. Ein Plasmid einer Kolonie, die auf der Platte wuchs, wurde mit einem automatischen DNA-Isolierungssystem präpariert.
Durch Analyse des Plasmids mit Restriktionsenzymen wurde ein rekombinantes Plasmid pSHT57, bei dem pdxJ in gleicher Richtung wie der trc-Promotor eingebaut war, erhalten (1) pSHT57 wurde aus F. coli JM109 präpariert, der pSHT57 beherbergt, mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit.
(b) epd aus E. coli K-12-Chromosom
Das epd-Gen wurde aus 100 ng chromosomaler DNA von E. coli K-12 mit Advantage-HF-PCR-Kit amplifiziert unter Verwendung von 10 pmol von zwei Primern, d.h. Primer C (SEQ ID Nr. 3) und Primer D (SEQ ID Nr. 4).
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 15 s Halten auf 94°C und danach 25 Zyklen 15 s bei 94°C, 3 min bei 68°C. Das amplifizierte 1,0-kb-Fragment wurde direkt. in pCRII-TOPO-Vektor mit dem TOPO-TA-Klonierungskit kloniert. Es wurde sichergestellt, dass die Sequenz des amplifizierten Bereichs identisch war mit der CDS-Region von epd (3070692 bis 3071711, Komplement) mit der Zugangsnummer NC_000913 und das erhaltene Plasmid wurde als pCRepd bezeichnet.
Beispiel 2: Konstruktion rekombinanter Plasmide
(a) pVK 601
Um einen Expressionsvektor in S. meliloti IFO 14782 zu konstruieren, wurde pVK100 verwendet, von dem angegeben wird, dass er ein Vektor für einen breiten Bereich an Wirten ist, vom IncP-1-Typ ist, und in S. meliloti replizierbar ist. pVK100 wurde aus E. coli HB101/pVK100 mit QIAGEN Plasmid Midi-Kit präpariert und mit HindIII verdaut, die Enden geglättet mit einem Blunting-Kit und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. pSHT57 wurde mit BamHI und KpnI verdaut.
Das entstehende 875-bp-Fragment, das den trc-Promotor und pdxJ enthielt, wurde aus Agarosegel gewonnen, die Enden geglättet und in den vorher beschriebenen pVK100 mit Ligierungskit ligiert. E. coli HB101-kompetente Zellen wurden mit der erhaltenen Ligierungsmischung transformiert und auf LB-Platten plattiert, die 10 μg/ml Tetracyclin enthielten (im Folgenden als Tc bezeichnet). Plasmide von Kolonien, die auf den Platten wuchsen, wurden in einem automatischen DNA-Isolierungssystem präpariert. Durch Analyse des Plasmids mit Restriktionsenzymen, wurde ein rekombinantes Plasmid, pVK601 erhalten, bei dem der trc-Promotor und pdxJ in entgegengesetzter Richtung, wie das Kanamycin-(im Folgenden als Km bezeichnet)-Resistenzgen waren (1).
(b) pVK602
Um epd in S. meliloti zu amplifizieren, wurde eine von tac-Promotor gesteuerte epd-Kassette konstruiert. Ein 1,0-kb-PstI-Fragment aus pCRepd [Beispiel 1-(b)] wurde geglättet und in die SmaI-Stelle von pKK223-3 in einer Orientierung ligiert, die die Transkription von epd durch den tac-Promotor zuließ und das entstehende Plasmid wurde mit pKKepd bezeichnet (2). Dann wurde das mobilisierbare Cosmid pVK100 mit BglII verdaut und ein etwa 21,3-kb-Fragment gewonnen.
Nachdem das Fragment mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war, wurden 1,3-kb BamHI-Fragmente aus pKKepd in das mit BglII verdaute und dephosphorylierte Fragment ligiert, was Plasmid pVK602 ergab (3).
(c) pVK611
Um sowohl epd aus E. coli als auch pdxJ aus S. meliloti in S. meliloti zu coexprimieren, wurde pVK611 konstruiert auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2-(b) beschrieben. pVK601 wurde mit BglII verdaut und etwa 22,2-kb-Fragmente wurden gewonnen. Nachdem die Fragmente mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden waren, wurden 1,3-kb-BamHI-Fragmente aus pKKepd in das mit BglII verdaute und dephosphorylierte Fragment ligiert, was Plasmid pVK611 ergab (4).
Beispiel 3: Einführung rekombinanter Plasmide in S. meliloti IFO 14782
Die Plasmide wurden aus E. coli HB101 in S. meliloti IFO 14782 mithilfe von E. coli HB101, der pRK2013 (Km', IncP, tra⁺, CoIEI ori (ATCC 37159)) trug, unter Verwendung der triparentalen konjugalen Paarungsmethode, wie unten beschrieben, transferiert. S. meliloti IFO 14782 als Empfängerstamm wurde in flüssiges LBMC-Medium geimpft und unter Schütteln bei 30°C mit 140 U/min 16 Stunden lang inkubiert.
E. coli HB101, der pRK2013 beherbergt, als Helferstamm und F. coli HB101, der pVK601 beherbergt, als Donatorstamm wurden in flüssiges LB-Medium, das 50 μg/ml Km enthielt bzw. in flüssiges LB-Medium das 10 μg/ml Tc enthielt, geimpft und unter Schütteln bei 37°C mit 140 U/min 16 Stunden lang inkubiert. Jeder Stamm wurde in das gleiche Medium überführt und weitere 6 Stunden lang gezüchtet. Dann wurden Zellen durch Zentri fugation geerntet und in LB-Medium (End-OD₆₀₀ = 20) mit gemischten Empfängerzellen, Helferzellen und Donatorzellen in einem Verhältnis von 1:1:4 (V/V/V) suspendiert.
Die Mischung wurde auf ein Nitrocellulosefilter gebracht, das auf LBMC-Agarplatten gelegt wurde. Nachdem diese Platten 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert worden waren, wurden Zellen von dem Filter gekratzt und in sterilisierter 0,85% NaCl-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde in geeigneter Weise verdünnt und auf LBMC-Platten ausgebreitet, die 20 μg/ml Nalidixinsäure (um S. meliloti IFO 14782 zu selektieren) und 10 μg/ml Tc (um pVK601 zu selektieren) enthielten. Nach 5-tägiger Inkubation dieser Platten bei 30°C wurden die Kolonien, die auf den Platten gewachsen waren, herausgepickt und zur Plasmidextraktion mit QIAGEN Plasmid Mini-Kit kultiviert. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde durch Behandlung mit Restriktionsenzymen untersucht, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und zeigte das identische Muster wie pVK601. Die entstehenden Kolonien wurden gereinigt, indem auf der gleichen Selektionsplatte ausgestrichen wurde und wurden als rekombinanter Stamm S. meliloti IFO 14782/pVK601 verwendet. Auf gleiche Weise wie bei der Konstruktion von S. meliloti IFO 14782/pVK601 wie oben erwähnt, wurden S. meliloti IFO 14782/pVK602 und S. meliloti IFO 14782/pVK611 erhalten unter Verwendung von E. coli HB101, der pVK602 trug bzw. E. coli HB101, der pVK611 trug, als Donatorstämme. Um die Expression von pdxJ und epd in rekombinanten Stämmen zu bestätigen, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Die Zellen wurden in LBMC-Medium mit 10 μg/ml Tc bei 30°C 18 Stunden lang gezüchtet. Dann wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit Kochsalzlösung gewaschen und wieder in eiskaltem 20 mM Phosphatpuffer (pH 8,2) suspendiert. Die Zellsuspension wurde einer Beschallung (Bioruptor, Cosmo Bio Co., Japan) unterzogen und das entstehende Lysat wurde mit 15.000 U/min 10 min lang bei 4°C zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen.
Der Überstand wurde als zellfreier Extrakt verwendet und dann einer SDS-PAGE in 12,5% Gel unterzogen und mit Comassie Brilliantblau (Rapid Stain CBB Kit, nacalai tesque Japan) gefärbt. Die Expression eines Polypeptids mit der erwarteten Größe (PdxJ 29,0 kDa, Epd 37,2 kDa) wurde in S. meliloti IFO 14782 mit rekombinanten Plasmiden nachgewiesen.
Beispiel 4: Herstellung von Vitamin B₆ durch Fermentation von S. meliloti IFO 4782 mit rekombinantem Plasmid
S. meliloti IFO 14782 mit einem rekombinanten Plasmid und der Elternstamm, S. meliloti IFO 14782, wurden auf LBMC-Agarplatten bei 30°C 48 Stunden lang inkubiert und eine Schlinge jedes Stamms wurde in Röhrchen geimpft, die 8 ml Impfmedium enthielten, das aus 1% Glucose, 1% Maiseinweichwasser (Nihon Syokuhin Kako Co., Ltd., Tokio, Japan) und 0,2% Bacto-Hefeextrakt, 0,1% Polypepton S (Nihon Pharmaceuticals Co., Japan), 0,05% MgSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·5H₂O und 0,001% FeSO₄·7H₂O aufgebaut war, pH 6,8, und dann wurden die Röhrchen auf einem Reziprokschüttler (275 U/min) bei 30°C geschüttelt.
Nach 19-stündigem Schütteln wurden jeweils 3 ml Kulturbrühe in 500-ml-Kolben mit zwei Strombrechern überführt, die 150 ml Produktionsmedium enthielten, das aus 6% Glucose, 3% Maiseinweichwasser, 0,8% Bacto-Hefeextrakt, 0,175% NH₄Cl, 0,05% MgSO₄·7H₂O, 0,025% MnSO₄·5H₂O, 1% Allophosit (Shinagawa Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japan) und 0,025% Actocol (Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) aufgebaut war, pH 6,8, und auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) bei 30°C geschüttelt. Nach 2-tägigem Schütteln wur de eine sterile Harnstofflösung zu jedem Kolben mit 0,125% zugegeben und das Schütteln wurde 5 Tage lang fortgesetzt. Nach 7-tägiger Kultivierung wurde der Gehalt an Vitamin B₆ im Überstand jeder Kulturbrühe mit HPLC quantitativ ausgewertet und der Anteil an erzeugtem Vitamin B₆ wurde berechnet mit der Methode des inneren Standards mit 4'-Desoxypyridoxol wie unten beschrieben. Um die Proben für HPLC herzustellen, wurden 400 μl von 500 mg/l 4'-Desoxypyridoxol als innere Substanz bzw. innerer Standard, 50 μl 60% Perchlorsäure und 550 μl deionisiertes Wasser zu 250 μl der Standardlösungen von Pyridoxol oder dem Überstand der Kulturbrühe zugegeben und dann die Mischung 10 min lang auf Eis gestellt. Dann wurde die Mischung mit 15.000 U/min zentrifugiert und der Überstand auf die folgende Säule gegeben.
Die Analysebedingungen waren wie folgt: Säule Capcell pak C18 SG120 (4,6 × 250 mm) (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japan); mobile Phase: 0,1 M Natriumperchlorat, 0,1 M Kaliumphosphat und 2% Acetonitril (pH 3,5); Säulentemperatur 30°C; Durchflussrate 1,0 ml/min und Detektor: Ultraviolett (bei 292 nm). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. S. meliloti IFO 14782/pVK601, der Stamm mit dem pdxJ-Expressionsplasmid, zeigte einen doppelt so hohen Titer wie der Elternstamm IFO 14782 und S. meliloti IFO 14782/pVK602, der Stamm mit dem epd-Expressionsplasmid zeigte einen geringeren Titer als der Elternstamm. Andererseits erzeugte S. meliloti IFO 14782/pVK611, der rekombinante Stamm, dem sowohl epd- als auch pdxJ-Gen zugefügt wurden, 1300 mg Pyridoxol/l und dies war ein etwa 13 Mal höherer Titer als der des Elternstamms. Die Produktivität von Vitamin B₆ wurde drastisch verbessert durch Einbau der epd- und pdxJ-Gene. Tabelle 1: PN-Produktivität von rekombinantem S. meliloti

Stamm PN-Produktivitat (mg/l)

S. meliloti IFO 14782 S. meliloti IFO 14782/pVK601 S. meliloti IFO 14782/pVK602 S. meliloti IFO 14782/pVK611 103 192 84 1.300
Beispiel 5: Isolierung und Reinigung von Vitamin B₆ aus der Kulturbrühe
Vitamin B₆ wurde aus der Kulturbrühe von S. meliloti IFO 14782/pVK611 gewonnen, das unter den gleichen Kulturbedingungen, wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt wurde. Das Vitamin B₆ und seine Konzentration wurden in jeder Reinigungsstufe mit HPLC verfolgt. 11 einer 168-Stunden-Kulturbrühe, die 1.300 mg/ml Vitamin B₆ enthielt, wurde mit 7.500 U/min 10 min lang zentrifugiert. Der pH-Wert des entstehenden Überstandes wurde mit 1 n Salzsäure auf 3,1 eingestellt und dann wurde der Überstand auf eine Säule aufgebracht (5,5 × 15 cm), die mit 350 ml Amberlite CG 120 (H⁺-Form, 100 bis 200 mesh, Rohm und Haas Company, Philadelphia, Pennsylvania, USA) gepackt war. Die Säule wurde mit 500 ml deionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 5% Ammoniumhydroxid eluiert. Die Vitamin-B₆-Fraktionen wurden bei vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wurde in 10 ml deionisiertem Wasser gelöst und die Lösung auf eine Säule (5,5 × 16 cm) geladen, die mit 380 ml Dowex 1 × 4 (OH-Form, 200 bis 400 mesh, Dow Chemical Co., Ltd., Midland, Michigan, USA) gepackt war und dann mit 500 ml deionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde dann mit 0,1 n HCl eluiert. Die Fraktionen, die Vitamin 13₆ enthielten, wurden auf ein kleines Volumen bei vermindertem Druck eingeengt. Nachdem der feste Rückstand in einer geringen Menge heißem Ethanol gelöst worden war, wurde die Lösung über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Der entstehende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 1.090 mg roher Kristalle zu erhalten. Er wurde aus Ethanol umkristallisiert, um 839 mg weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 160°C zu erhalten. Die Infrarotabsorption, Ultraviolettabsorption und das NMR-Spektrum des Produkts stimmten überein mit dem von authentischem Pyridoxol.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinanter Mikroorganismus der Gattung Sinorhizobium, der einen Vektor enthält, der Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen und D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen enthält und Vitamin B₆ erzeugen kann.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia coli oder Sinorhizobium meliloti stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia coli K12 oder Sinorhizobium meliloti IFO 14782 stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Sinorhizobium meliloti IFO 14782 stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia toll K12 stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen aus einem Mikroorganismus von Escherichia coli oder Vibrio cholerae stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen aus einem Mikroorganismus von Escherichia coli K12 stammt.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, der Sinorhizobium meliloti IFO 14782 ist, der das Plasmid pVK611, das in 4 gezeigt ist, aufweist.
Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₆ durch Züchtung eines rekombinanten Mikroorganismus der Gattung Sinorhizobium, der einen Vektor enthält, der Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen und D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen enthält und Vitamin B₆ erzeugen kann, das umfasst, dass der rekombinante Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0 bei einer Temperatur von 10 bis 40°C 1 bis 15 Tage lang in einem Medium gezüchtet wird, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, enthält, und dann das gebildete und in der Kulturbrühe angesammelte Vitamin B₆ gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia coli oder Sinorhizobium meliloti stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia coli K12 oder Sinorhizobium meliloti IFO 14782 stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Sinorhizobium meliloti IFO 14782 stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Pyridoxol-5'-phosphat-Synthasegen aus Escherichia coli K12 stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen aus einem Mikroorganismus von Escherichia coli oder Vibrio cholerae stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das D-Erythrose-4-phosphat-Dehydrogenasegen aus einem Mikroorganismus von Escherichia coli K12 stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der rekombinante Mikroorganismus Sinorhizobium meliloti IFO 14782/pVK611 ist.