DE102004001674A1

DE102004001674A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien

Info

Publication number: DE102004001674A1
Application number: DE102004001674A
Authority: DE
Inventors: Takayuki Kawasaki Asahara; Seiko Kawasaki Hirano; Hisashi Kawasaki Yasueda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2004-01-12
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2024-01-13
Also published as: CN1530438A; FR2850394B1; FR2850394A1; US20040214296A1; US7211416B2; DE102004001674B4

Abstract

L-Lysin wird durch Kultivieren eines methanolverwertenden Bakteriums, welches L-Methionin für sein Wachstum benötigt und die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, produziert, wobei L-Lysin in der Kultur hergestellt und angehäuft wird und L-Lysin aus der Kultur gewonnen wird.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik, die in der mikrobiellen Industrie nützlich ist. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von L-Lysin durch Fermentation.
Kurze Beschreibung der verwandten Technik L-Lysin wird durch Fermentation unter Einsatz von Mikroorganismen produziert, die zur Gattung Corynebacterium, Bacillus, Escherichia oder dergleichen gehören (vgl. "Amino Acid Fermentation", herausgegeben von H. Aida et al., Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], erste Ausgabe, veröffentlicht am 30. Mai 1986). Bakterienstämme, die aus der Natur isoliert wurden, oder davon abgeleitete Mutantenstämme, die bezüglich Nährstoffen auxotroph sind, sind zur Verbesserung der Produktion in diesen Mikroorganismen eingesetzt worden. Außerdem sind verschiedene Techniken zur Erhöhung der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken zur Verstärkung der Aktivität von biosynthetischen Enzymen für L-Lysin offenbart worden (WO95/16042).
Die Produktivität für L-Lysin ist durch das Züchten von Mikroorganismen, wie solchen, die vorstehend erwähnt wurden, sowie durch Verbesserung von Produktionsmethoden erheblich erhöht worden. Um jedoch dem erhöhten zukünftigen Bedarf Rechnung zu tragen, besteht immer noch ein Bedarf an der Entwicklung eines Verfahrens, das eine effizientere Produktion von L-Lysin bei niedrigeren Kosten bereitstellt.
Methanol ist ein Fermentationsrohmaterial, das in großen Mengen und kostengünstig zur Verfügung steht. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation unter Einsatz von Methanol sind bekannt und umfassen Verfahren unter Einsatz von Mikroorganismen, die zur Gattung Achromobacter oder Pseudomonas (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 45-25273), Protaminobacter (Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 49-125590), Protaminobacter oder Methanomonas (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 50-25790), Microcyclus (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 52-18886), Methylobacillus (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 4-91793), Bacillus (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 3-505284) Methylophilus (WO00/61723) u.s.w. gehören.
Außerdem ist für strikt Methanol verwertende Bakterien, insbesondere Methylophilusbakterien, berichtet worden, dass es schwierig ist, auxotrophe Mutanten durch übliche Verfahren zu erhalten ((1983), Band 129, S. 785-799; M.L. O'Connor und R.S. Hanson, Journal of General Microbiology (1978), Band 104, S. 105-111). Deshalb konnte bei Versuchen zur Gewinnung von glutaminauxotrophen Stämmen beispielsweise nur ein Stamm mit einer temperatursensitiven Auxotrophie erhalten werden (Windass J. D. et al., Nature, 287, S. 396-401 (1980)). Selbst beim Einsatz eines speziellen Verfahrens, beispielsweise dem Suspendieren von Zellen in einer Lösung, die ein Mutagenisierungsmittel für DNA enthält, und Anlegen einer Spannung an die Zellen, um in den Zellmembranen Löcher hervorzurufen und dadurch den Fluss des Mutagenisierungsmittels in die Zellen (Elektroporation) zu ermöglichen, konnten nur drei Arten von Mutantenstämmen erhalten werden, nämlich ein folsäureauxotropher Stamm, ein polyauxotropher Stamm für Serin und Alanin und ein polyauxotropher Stamm für Glutaminsäure und Inositol (C.S. Kim und T.K. Wood, Applied Microbiol. & Biotechnology, 48, S. 105-108 (1997).
Zusätzlich beschreibt die WO 00/61723, dass Methylophilus methylotrophus einer Mutagenisierungsbehandlung unter Einsatz eines chemischen Mutagenisierungsmittels ausgesetzt wurde, um unvollständig (leaky) auxotrophe Stämme für Casaminsäure zu erhalten, wobei dieser Stamm Valin, Leucin und Isoleucin produzierte. Angesichts der Eigenschaften des Mutantenstammes scheint es jedoch, dass der Stamm für Casaminosäure unvollständig auxotroph wurde, weil der Wechsel in den Zellmembranen die Permeation von verschiedenen Aminosäuren aus der Zelle in das Medium erlaubte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der L-Lysinproduktion unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen, welches das Kultivieren eines Methanol verwertenden Bakteriums, das L-Methionin für sein Wachstum benötigt und L-Lysin in einem Medium produzieren kann, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, das Anhäufen von L-Lysin in der Kultur und das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen, wobei das Bakterium ein Methylophilusbakterium ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen, wobei das Methylophilusbakterium Methylophilus methylotrophus ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen, wobei das Methylophilusbakterium derart modifiziert ist, dass eine enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetase und ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Methylophilusbakterium bereitzustellen, welches L-Methionin für sein Wachstum benötigt und die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das vorstehend beschriebene Methylophilusbakterium bereitzustellen, welches Methylophilus methylotrophus ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das vorstehend beschriebene Methylophilusbakterium bereitzustellen, welches derart modifiziert ist, dass eine enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetase ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
Erfindungsgemäß kann die L-Lysinproduktion unter Einsatz methanolverwertender Bakterien verbessert werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Studien durchgeführt, um die vorstehend genannten Aufgaben zu lösen. Im Ergebnis waren sie dahingehend erfolgreich, dass sie Methioninauxotrophie auf ein Methanol verwertendes Bakterium übertrugen, und sie fanden, dass diese Eigenschaft die L-Lysinproduktivität aus Methanol durch das Methanol verwertende Baktrium verbesserte.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin" die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Bakteriums, die Anhäufung von L-Lysin in einem Medium in einer signifikanten Menge, beispielsweise 0,1 g/l oder mehr, zu bewirken, wenn es in dem Medium kultiviert wird, oder die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Bakteriums, die Menge an freiem L-Lysin in den Zellen pro Gesamtmasse der Proteine in den Zellen im Vergleich zum Wildtypstamm beispielsweise um das 1,5-fache oder mehr zu erhöhen.
Erfindungsgemäßes Bakterium
Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Methanol verwertendes Bakterium, das L-Methionin für sein Wachstum benötigt, was auch als L-Methioninauxotrophie bezeichnet wird, und das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat. In der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Methanol verwertendes Bakterium oder methylotrophes Bakterium ein Bakterium, das durch Verwerten von Methanol als Hauptkohlenstoffquelle wachsen kann und worin die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin durch L-Methioninauxotrophie verliehen oder verstärkt werden kann. Spezifische Beispiele umfassen Methylophilusbakterien, wie Methylophilus methylotrophus und Methylobacillusbakterien, wie Methylobacillus glycogenes und Methylobacillus flagellatum.
Beispiele von Methylophilus methylotrophus umfassen den AS1-Stamm (NCIMB 10515) und dergleichen. Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB 10515) ist von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria erhältlich (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Vereinigtes Königreich).
Beispiele von Methylobacillus glycogenes umfassen den T-11-Stamm (NCIMB-11375), den ATCC 21276-Stamm, den ATCC 21371-Stamm, den ATR80-Stamm (beschrieben in Appl. Micro biol. Biotechnol., 42, Seiten 67-72 (1994), den A513-Stamm (beschrieben in Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, Seiten 67-72 (1994) und dergleichen. Der Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375-Stamm ist von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria erhältlich (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Vereinigtes Königreich). Beispiele von Methylobacillus flagellatum umfassen den KT-Stamm (beschrieben in Arch. Microbiol., 149, Seiten 441-446 (1988)) und dergleichen.
Das Methanol verwertende Bakterium, das L-Methionin für sein Wachstum benötig und die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, kann unter Verwendung eines Methanol verwertenden Bakteriums, das L-Methionin nicht benötigt (nicht-auxotroph bezüglich L-Methionin), hergestellt werden. Beispiele für Methanol verwertende Bakterien, die für ihr Wachstum L-Methionin nicht benötigen, sind unter anderem Wildtypstämme von Methanol verwertenden Bakterien.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "benötigt L-Methionin für sein Wachstum", dass beispielsweise ein Stamm nicht wächst, wenn er in einem SEII-Medium, das L-Methionin nicht enthält oder einen L-Methioningehalt von 0,001 g/l oder weniger hat, bei 30 bis 37°C während 2 Tagen kultiviert wird, während er, wenn er in dem selben Medium kultiviert wird, das mindestens 0,05 g/l oder mehr L-Methionin enthält, mit einer Geschwindigkeit, gemessen als Erhöhung der Masse von Zellen pro Zeiteinheit, wächst, die derjenigen des Wildtyps, des nichtmodifizierten Stammes oder des Elternstammes vergleichbar ist, oder mit einer Geschwindigkeit wächst, die 5% oder mehr, vorzugsweise 20% oder mehr des Wildtyps, des nichtmodifizierten Stammes oder des Elternstammes entspricht,. Wenn ein gewünschter Stamm (auxotroph für L-Methionin) eine Kolonie mit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr selbst dann nicht bilden kann, nachdem etwa 100 Zellen auf eine typische Platte mit SEII-Agarmedium, das L-Methionin nicht enthält, aufgetragen wurden und zwei Tage bei 37 °C kultiviert wurden, dieser Stamm jedoch die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr auf dem selben Medium, das 1 g/l L-Methionin enthält, nach der Kultivierung unter denselben Bedingungen hat, wird dieser Stamm zudem als einer bezeichnet, der "L-Methionin für sein Wachstum benötigt".
Beispiele des Verfahrens zur Ableitung eines auxotrophen Stammes für L-Methionin aus einem nichtauxotrophen Stamm für L-Methionin umfassen das Behandeln eines nichtauxotrophen Stammes für L-Methionin mit einer physikalischen Stimulation, die ein Gen mutieren kann, wie UV-Strahlen, Röntgenstrahlen und γ-Strahlen, oder das Behandeln eines nichtauxotrophen Stammes für L-Methionin mit einem chemischen Mutagenisierungsmittel, wie N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin (NTG), und das nachfolgende Selektieren eines Stammes, der für L-Methionin auxotroph geworden ist. Unter diesen ist ein Verfahren unter Einsatz von beispielsweise NTG bevorzugt. Obwohl es herkömmlicherweise bekannt ist, dass es extrem schwierig ist, einen Stamm von Methylophilus methylotrophus zu erhalten, der für eine spezifische Aminosäure auxotroph ist, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass ein auxotropher Stamm für L-Methionin selbst unter Einsatz eines chemischen Mutagenisierungsmittels erhalten werden kann.
Wenn der metabolische Weg, der für die L-Methioninsynthese zuständig ist, in einem Methanol verwertendem Bakterium mutmaßlich existiert, und ein Gen, das für ein Enzym in dem Biosyntheseweg kodiert, gefunden worden ist, kann außerdem ein Verfahren zur Ausschaltung eines Gens unter Einsatz homologer Rekombination eingesetzt werden, um das Gen direkt auszuschalten und somit einen auxotrophen Stamm für L-Methionin zu erhalten. Überdies ist es auch möglich, L-Methioninauxotrophie durch Einsatz einer genetischen Rekombinationstechnik zu verleihen, wobei eine Aktivität eines Enzyms, das an der L-Methioninsynthese beteiligt ist, unterdrückt wird. Beispielsweise ist in Methylophilus methylotrophus das metA-Gen, das in SEQ ID NO: 15 gezeigt ist, ein Beispiel für ein Gen, das ein Enzym kodiert, das ausgeschaltet werden kann oder dessen enzymatische Aktivität unterdrückt werden kann. Man geht davon aus, dass dieses Gen für Homoserin-o-acetyltransferase kodiert. Wie hierin eingehend beschrieben wird, benötigt Methylophilus methylotrophus, das ein ausgeschaltetes metA-Gen enthält, L-Methionin und zeigt verbesserte L-Lysinproduktivität.
Zudem umfassen Beispiele von Enzymen, deren funktionelle Beeinträchtigungen zu L-Methioninauxotrophie führen, die Enzyme des metabolischen Weges, der von Aspartatsemialdehyd zu L-Methionin führt. Die "funktionelle Beeinträchtigung des Enzyms" umfasst die Verminderung der enzymatischen Aktivität in einem solchen Maß, dass das Bakterium L-methioninauxotroph sein sollte, und zudem das im wesentlichen vollständige Verschwinden der enzymatischen Aktivität. Wenn beispielsweise die Homoserindehydrogenase beeinträchtigt ist, ist der Phenotyp erwartungsgemäß Auxotrophie bezüglich L-Methionin und L-Threonin, und der Phenotyp der Beeinträchtigung von o-Succinylhomoserinsulfhydrylase (beispielsweise das metZ-Genprodukt) oder der Methioninsynthase (beispielsweise meE, metH etc.) ist ebenfalls erwartungsgemäß eine L-Methioninauxotrophie. Wenn jedoch unter diesen zwei oder mehr Arten von Enzymen, welche dieselbe enzymatische Reaktion katalysieren, in einem Methanol verwertenden Bakterium vorkommen (wie es der Fall ist, wenn Enzyme, die dieselbe enzymatische Reaktion katalysieren, getrennt voneinander existieren, wie metE und metH), ist es bevorzugt, dass die Funktionen der beiden Enzyme gleichzeitig ausgeschaltet werden.
Im folgenden wird das Verfahren zur Ausschaltung der Aktivität des L-Methioninsyntheseenzyms unter Bezugnahme auf das metA-Gen als Beispiel erklärt. Das metA-Gen kann auf einer genomischen DNA eines Mikroorganismus, der das Gen enthält, beispielsweise Methylophilus methylotrophus, durch Amplifizieren des Gens unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (im folgenden als "PCR" bezeichnet) erhalten werden. Die genomische DNA kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele von Primern, die für die PCR einsetzbar sind, umfassen Oligonukleotide mit den DNA-Sequenzen, die in den SEQ ID NOS: 7 und 10 gezeigt sind.
Die Expression des metA-Gens kann beispielsweise durch ein Verfahren zur Suppression der Expression eines Gens auf Transkriptionsebene durch Einführen einer Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in eine Promotorsequenz des Gens zur Verminderung der Promotoraktivität durchgeführt werden (vgl. M. Rosenberg & D. Court, Ann. Rev. Genetics, 13, 319 (1979); P. Youderian, S. Bouvier & M. Susskind, Cell, 30, 843-853 (1982)). Außerdem kann die Expression des metA-Proteins auf Translationsebene durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in eine Region zwischen der SD-Sequenz (Shine-Dalgarno-Sequenz) und dem Initiationskodon durchgeführt werden (s. J. J. Dunn, E.Buzash-Pollert & F.W. Studier, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, Seite 2743 (1978)).
Außerdem kann für die Verminderung oder Eliminierung der spezifischen Aktivität des Homoserin-o-acetyltransferaseenzyms das Modifizieren oder Zerstören der kodierenden Region des metA-Gens durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in eine Nukleotidsequenz der kodierenden Region durchgeführt werden.
Ortsgerichtete Mutagenese (W. Kramer & H.J. Frits, Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) und ein Verfahren zur Behandlung von DNA, die ein Zielgen enthält, mit einem chemischen Mittel, wie Natriumhyposulfit oder Hydroxylamin (D. Shortle & D. Nathans, Proc., Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270 (1978)) können spezifisch eingesetzt werden, um Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines Nukleotids in ein Gen einzuführen.
Die ortsgerichtete Mutagenese ist ein Verfahren unter Einsatz eines synthetischen Oligonukleotids, das willkürliche Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion in spezifische Basenpaare einführen kann. Um dieses Verfahren einzusetzen, wird zunächst ein Plasmid, welches ein gewünschtes Gen enthält, das kloniert wird und eine bekannte DNA-Nukleotidsequenz hat, zur Herstellung eines Einzelstranges denaturiert. Dann wird ein synthetisches Oligonukleotid synthetisiert, das zu einer Region komplementär ist, in der die Mutation eingeführt werden soll. Bei dieser Synthese wird die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids nicht als vollständig komplementäre Sequenz hergestellt, sondern so hergestellt, dass sie Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen an willkürlichen Nukleotiden enthält. Danach wird die einzelsträngige DNA und das synthetische Oligonukleotid, welches Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines willkürlichen Nukleotids enthält, zum Doppelstrang vereinigt und ein vollständiges doppelsträngiges Plasmid wird unter Einsatz eines Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und T4-Ligase synthetisiert und in kompetente Zellen von Escherichia coli eingefügt. Einige der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Transformanten haben ein Plasmid, das das gewünschte Gen mit Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines willkürlichen Nukleotids enthält.
Die rekombinante PCR-Methode (PCR Technology, Stockton Press (1989)) kann als ähnliches Verfahren eingesetzt werden, das die Einführung und somit die Modifikation oder Zerstörung des Gens erlaubt.
Außerdem ist das Verfahren unter Einsatz einer Behandlung mit einem chemischen Mittel ein Verfahren zur statistischen Einführung einer Mutation, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von Nukleotiden in ein DNA-Fragment, einschließlich ein Zielgen, durch direktes Behandeln des DNA-Fragments mit Natriumhyposulfit, Hydroxylamin oder dergleichen.
Die Expression des metA-Gens in einer Zelle kann dadurch unterdrückt werden, dass ein natives Gen auf einem Chromosom eines methanolverwertenden Bakteriums durch das Gen, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde und durch Einführung einer Mutation modifiziert oder zerstört ist, ersetzt wird.
Verfahren zur Gensubstitution umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, ein Verfahren unter Einsatz homologer Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); S. Matsuyama & S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Die Fähigkeit, homologe Rekombination zu bewirken, ist eine Eigenschaft, die allgemein in methanolverwertenden Bakterien vorhanden ist. Wenn ein Plasmid oder dergleichen, das eine Sequenz mit einer Homologie zu einer Sequenz auf einem Chromosom hat, in eine Bakterienzelle eingeführt wird, kommt es mit einer bestimmten Häufigkeit zu einer Rekombination an einer homologen Stelle der Sequenz, und das gesamte Plasmid wird in das Chromosom einverleibt. Danach wird, wenn die Rekombination bei einer homologen Sequenz auf dem Chromosom bewirkt wird, das Plasmid wieder aus dem Chromosom entfernt. Zu diesem Zeitpunkt kann das eingeführte mutierte Gen auf dem Chromosom fixiert werden, und das native Gen kann zusammen mit dem Plasmid entfernt werden, was von der Stelle abhängt, wo die Rekombination stattfindet. Durch Selektieren eines solchen Stammes kann ein Stamm erhalten werden, worin ein Gen, das durch Einführen einer Mutation, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines Nukleotids modifiziert oder zerstört ist, ein natives Gen auf dem Chromosom ersetzt.
Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass in Methylophilus methylotrophus die Einführung eines Gens, das zu einem gewünschten Gen auf einem Chromosom homolog ist, in der Form eines linearen DNA-Fragments eine homologe Rekombination zwischen dem gewünschten Gen auf dem Chromosom und dem homologen Gen des eingeführten linearen DNA-Fragments in der Zelle bewirkt, so dass eine Gensubstitution erhalten werden konnte, wobei eine solche Technik auch angewendet werden konnte. Ein Beispiel für eine Gensubstitution, die unter Einsatz dieser Technik durchgeführt wurde, wird in den Beispielen beschrieben.
Um zu bestimmen, ob die Gensubstitution wie beabsichtigt fortschreitet, kann beispielsweise ein Arzneimittelresistenzmarkergen für die Resistenz gegen ein Antibiotikum in das einzuführende DNA-Fragment einverleibt werden. Wenn ein Arzneimittelresistenzmarker auf diese Weise eingesetzt wird, wird ein Gen, das Resistenz gegen ein Arzneimittel, wie Kanamycin, Gentamycin, Tetracyclin, Ampicillin oder Streptomycin auf ein methanolverwertendes Bakterium überträgt, eingesetzt.
Ein solches Markergen, das vorstehend beschrieben wurde, kann für die Herstellung eines einzuführenden Gens, dessen kodierende Region zerstört ist, durch Einsetzen in das Gen eingesetzt werden. Das zerstörte Gen, in das ein Markergen eingesetzt ist, kann durch eine Genrekombinationstechnik unter Einsatz einer Plasmid-DNA hergestellt werden, wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, oder es kann auch durch gleichzeitige Amplifikation des einzuführenden Gens und Einführen des Markergens durch Crossover-PCR hergestellt werden.
In den Beispielen wurde ein Methylophilus methylotrophus-Stamm, worin die Funktion des metA-Gens zerstört war, durch Ersetzen des metA-Gens aus einem Chromosom von Methylophilus methylotrophus durch ein metA-Gen, worin ein Teil der kodierenden Region entfernt war und ein Kanamycin-Resistenzgen anstelle des Teils der kodierenden Region unter Einsatz des vorstehend beschriebenen Verfahrens unter Verwendung homologer Rekombination eingeführt war, erhalten.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann durch Übertragen einer L-Methioninauxiotrophie auf ein methanolverwertendes Bakterium mit der Fähigkeit, L-Lysin zu produzieren, wie vorstehend beschrieben erhalten werden. Das erfindungsgemäße Bakterium kann auch durch Übertragen der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin auf ein methanolverwertendes Bakterium mit L-Methioninauxotrophie erhalten werden. Ein methanolverwertendes Bakterium, beispielsweise ein Methylophilus methylotrophus-Stamm mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, kann durch Mutagenesebehandlung eines Stammes, der die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin nicht hat oder eine geringe Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, erhalten werden, wobei diesem Stamm Resistenz gegenüber einem L-Lysin-Analogon, wie S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (im folgenden als "AEC" bezeichnet), übertragen wird. Beispiele des Verfahrens für die Mutagenesebehandlung umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, Verfahren zur physikalischen Behandlung des Stammes, beispielsweise mit UV-Strahlen, Röntgenstrahlen und γ-Strahlen, oder die Behandlung mit einem chemischen Mutagenisierungsmittel, wie NTG, wie vorstehend beschrieben, wobei ein L-methioninauxotropher Stamm erhalten wird. Spezifische Beispiele von Methylophilusbakterien mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, Methylophilus methylotrophus AJ13608. Dieser Stamm wurde durch Übertragung der AEC-Resistenz auf Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm kultiviert. Methylophilus methylotrophus AJ13608 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, -1, Higashi 1-come, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) am 10. Juni 1999 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-17416. Dann wurde die Hinterlegung in eine Internationale Hinterlegung am 31. März 2000 unter der Maßgabe des Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7112.
Ein Methylophilusbakterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin kann auch durch Einführen oder Verstärken der DNA, welche die genetische Information trägt, die an der Biosynthese von L-Lysin beteiligt ist, mit einer genetischen Rekombinationstechnik gezüchtet werden. Das Gen oder die Gene, die eingeführt werden sollen, kodieren für ein Enzym des Biosynthesewegs von L-Lysin, wie Dihydrodipicolinatsynthase und Succinyldiaminopimelattransaminase. Im Fall eines Gens für ein Enzym, das einer Rückkoppelungshemmung durch L-Lysin unterliegt, wie Dihydrodipicolinatsynthase (DDPS), ist es bevorzugt, ein mutiertes Gen zu verwenden, das für das Enzym kodiert, das unempfindlich gegen die Rückkopplungshemmung ist. Beispiele eines solchen mutierten Gens umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, das dapA*24-Gen (kodiert für DDPS, worin der Histidinrest in Position 118 durch einen Tyrosinrest ersetzt ist) aus Escherichia coli, beschrieben in W095/16042, und dergleichen. Die anderen vorstehend erwähnten Gene sind auch in dieser Internationalen Patentveröffentlichung beschrieben. In der Beschreibung dieser Internationalen Patentveröffentlichung sind ein Gen, das für Tetrahydrodipicolinatsuccinylase kodiert, und ein Gen, das für Succinyldiaminopimelattransaminase kodiert, vertauscht.
Außerdem kann die Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auch durch Verstärken der Aktivität eines Proteins verbessert werden, das an der Sekretion der L-Aminosäure aus der Zelle heraus beteiligt ist.
Beispielsweise ist als Protein, das an der Sekretion von L-Lysin aus der Zelle heraus beteiligt ist, das LysE-Protein bekannt, das von dem lysE-Gen kodiert wird (M. Vrljic, H.Sahm und L. Eggeling, Molecular Microbiology 22, Seiten 815-826 (1996); Internationale Patentveröffentlichung W097/23597). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, dass ein Wildtyp-lysE-Gen, abgeleitet von Brevibacterium, in einem Methylophilusbakterium oder in einem Methylobacillusbakterium nicht funktioniert, es konnte jedoch derart modifiziert werden, dass es in einem methylotrophen Bakterium funktionierte. Beispiele eines solchen modifizierten LysE-Proteins umfassen LysE24, welches in den vorliegenden Beispielen beschrieben wird.
Das LysE-Protein, das durch das lysE-Gen kodiert wird, hat sechs hydrophobe Helixregionen. Einige dieser hydrophoben Regionen sind vermutlich Transmembrandomänen. Es wird auch davon ausgegangen, dass eine Region zwischen der dritten und der vierten Region bezüglich des N-Terminus hydrophil ist und eine Schleifenstruktur hat. In der vorliegenden Erfindung wird die hydrophile Region als Schleifenregion bezeichnet. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-LysE- und die Aminosäuresequenz des LysE-Proteins von Brevibacterium lactofermentum 2256 sind in den SEQ ID-Nummern 17 bzw. 18 gezeigt. In dieser Aminosäuresequenz entsprechen die hydrophoben Helixregionen den Aminosäurenummern 5-20, 37-58, 67-93, 146-168, 181-203 und 211-232. Die Schleifenregion entspricht den Aminosäurenummern 94-145.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden, dass das lysE-Gen in einem Methanol verwertenden Bakterium letal wirkt, dass jedoch eine DNA, die für eine Variante des LysE-Proteins kodiert, welches die Schleifenregion nicht hat oder im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand, die Sekretion von Lysin und/oder L-Arginin aus der Zelle eines Methanol verwertenden Bakteriums heraus förderte. Die erfindungsgemäße DNA kodiert für ein solches mutiertes LysE-Protein, welches die vorstehend erwähnte Schleifenregion, die in einem Wildtyp-LysE-Protein enthalten ist, nicht aufweist oder welches im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand.
Das vorstehend erwähnte mutierte LysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es eine oder mehrere hydrophobe Helices hat und bei der Expression zu einer erhöhten Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beiden führt, wenn es in ein Methanol verwertendes Bakterium eingeführt wird. Genauer gesagt ist eine DNA, die für ein mutiertes LysE kodiert, das alle hydrophoben Helices, bezogen auf den N-Terminus, nämlich die erste bis sechste Helix, enthält, mit umfasst. Im speziellen ist eine DNA mit umfasst, die ein Peptid kodiert, das die erste bis dritte hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus, enthält und für ein Peptid kodiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix, bezogen auf den N-Terminus, enthält. Das vorstehend erwähnte LysE24 ist ein Beispiel für ein mutiertes LysE, das für ein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, und ein Peptid kodiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält. Das lysE24-Gen wird durch eine Mutation mit einem Stopkodon stromabwärts der kodierenden Region für die dritte hydrophobe Helix eingeführt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten, dass, wenn eine Region stromabwärts des Stopkodons deletiert ist, das mutierte lysE24-Gen die Anhäufung von L-Lysin in dem Medium nicht bewirkt, wenn es in dem Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm exprimiert wird. Deshalb wird davon ausgegangen, dass ein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, und ein Peptid, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält, getrennt voneinander translatiert werden und in einem Methanol verwertenden Bakterium funktionieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Einführung des lysE24-Gens in ein Methanol verwertendes Bakterium zu einer Verbesserung der Produktion von L-Lysin und L-Arginin führt.
Jeder Mikroorganismus kann eingesetzt werden, um eine DNA zu erzeugen, die für ein Protein kodiert, das an der Sekretion von Lysin aus einer Zelle heraus beteiligt ist, d.h. das lysE-Gen oder ein homologes Gen, solange es eine Variante es Gens hat, welche die L-Lysinsekretionsaktivität in einem Methanol verwertenden Bakterium exprimieren kann. Genauer gesagt umfassen Beispiele solcher Mikroorganismen, wobei sie jedoch nicht auf coryneforme Bakterien beschränkt sind, Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium lactofermentum, Escherichiabakterien, wie Escherichia coli, Pseudomonasbakterien, wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacteriumbakterien, wie Mycobacterium tuberculosis und dergleichen.
Beispiele des homologen Gens von lysE umfassen eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:17 oder einem Teil davon hybridisierbar ist und für ein Protein kodiert, welches die Funktion des LysE-Proteins in einem Methanol verwertenden Bakterium als Ergebnis der vorstehend erwähnten Aminosäuresubstitution zeigt. Die vorstehend genannten "stringenten Bedingungen" umfassen Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nichtspezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingung in Zahlenwerten auszudrücken. Beispielsweise umfassen die stringenten Bedingungen jedoch eine Bedingung, unter der DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologie von 80% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr, stärker bevorzugt 95% oder mehr, miteinander hybridisieren, während DNAs mit einer Homologie, die geringer ist als die vorstehend genannten Werte, nicht miteinander hybridisieren. Alternativ dazu umfassen die stringenten Bedingungen solche, bei denen DNAs bei einer Salzkonzentration miteinander hybridisieren, welche der typischen Waschbedingung für die Southern-Hybridisierung entspricht, d.h. 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.
Eine Teilsequenz der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 17 kann auch als Sonde eingesetzt werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Einsatz von Oligonukleotiden, die auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17 hergestellt wurden, als Primer und eines DNA-Fragments, welches die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17 enthält, als Matrize hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 Basenpaaren als Sonde eingesetzt wird, können die Waschbedingungen für die Hybridisierung beispielsweise 2 × SSC, 0,1% SDA bei 50°C sein.
Um die Expression des Aminosäuresekretionsgens oder eines Gens des L-Lysinbiosynthesesystems in einem Methanol verwertenden Bakterium zu erhöhen, wird das Genfragment mit einem Vektor ligiert, der in einem Methanol verwertenden Bakterium funktionieren kann, vorzugsweise ein Vektor vom Mehrkopientyp, wobei eine rekombinante DNA hergestellt wird, die dann eingesetzt wird, um das Methanol verwertende Wirtsbakterium zu transformieren. Alternativ dazu kann das Gen in ein Transposon einverleibt und in das Chromosom eingeführt werden. Außerdem kann ein Promotor, der eine effektive Transkription in einem Methanol verwertenden Bakterium induziert, stromaufwärts von diesem Gen ligiert werden.
Um ein Gen in ein Methylophilusbakterium einzuführen und dessen Expression zu verstärken, kann das Gen an einen Vektor ligiert werden, der in einer Zelle von Methylophilusbakterien autonom replizierbar ist, wobei eine rekombinante DNA konstruiert wird, die dann eingesetzt wird, um ein Methylophilusbakterium durch Elektroporation oder dergleichen zu transformieren. Zusätzlich ist es auch möglich, ein Zielgen in ein Wirtschromosom dadurch einzuverleiben, dass Transduktion, ein Transposon (D.E. Berg und C.M. Berg, Bio/Technol., 1, Seite 417, 1983), ein Mu-Phage (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai)Nr.2-109985) oder homologe Kombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) eingesetzt wird.
Die Vektoren, die in Methylophilusbakterien funktionieren, umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, ein Plasmid, das in Methylophilusbakterien autonom replizierbar ist. Genauer gesagt umfassen Beispiele RSF1010, welcher ein Vektor mit breitem Wirtsbereich ist, und Derivate davon, beispielsweise pAYC32 (A.Y. Chistorerdov, Y.D. Tsygankov, Plasmid, 16, Seiten 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, Seite 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, S. 396 (1980)) und dergleichen.
Der Vektor, der in Methylobacillusbakterien funktioniert, ist, wobei er jedoch nicht darauf beschränkt ist, ein Plasmid, das in Methylobacillusbakterien autonom replizieren kann. Genauer gesagt umfassen Beispiele RSF1010, der ein Vektor mit breitem Wirtsbereich ist, und Derivate davon, beispielsweise pMFY42 (Gene, 44, S. 53 (1990)) und dergleichen.
Jede Methode kann eingesetzt werden, um ein rekombinantes DNA-Molekül in ein Methylophilusbakterium einzuführen, solange es ausreichende Transformationseffizienz bereitstellt. Beispielsweise kann Elektroporation verwendet werden (Canadian Journal of Microbiology, 43, S. 197 (1997)).
Produktion von L-Lysin unter Einsatz eines Methanol verwertenden Bakteriums, dem L-Methioninauxotrophie verliehen wurde
Die Kultivierung eines Methanol verwertenden Bakteriums, dem L-Methioninauxotrophie durch Zerstörung des metA-Gens oder durch Mutagenesebehandlung verliehen wurde und das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin, erhalten wie vorstehend beschrieben, in einem Medium hat, dem eine geeignete Menge von L-Methionin zugesetzt ist, führt zur Produktion einer merklichen Menge von L-Lysin und zur Anhäufung des produzierten L-Lysins in dem Medium. Somit ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Methanol verwertenden Bakteriums, dem L-Methioninauxotrophie verliehen wurde, und das die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, zur Erhöhung der angehäuften Menge von L-Lysin wirksam.
Das für die Produktion von L-Lysin eingesetzte Medium ist ein typisches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurennährstoffe, soweit erforderlich, enthält. Die Hauptkohlenstoffquelle ist Methanol. Es können jedoch Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysate, Alkohole wie Glycerin und Sorbitol und organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Benztraubensäure, zusammen eingesetzt werden. Der Ausdruck "Methanol wird als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt" bedeutet, dass der Methanolgehalt in der Gesamtkohlenstoffquelle 50 % (Gew./Gew.) oder mehr, vorzugsweise 80% (Gew./Gew.) oder mehr beträgt. Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt wird, ist dessen Konzentration üblicherweise zwischen 0,001 bis 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis 2% (Gew./Vol.). Außerdem ist, wenn Glucose u.s.w. zugegeben wird, dessen Konzentration üblicherweise zwischen 0,1% und 3% (Gew./Gew.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis 1% (Gew./Vol.).
Außerdem muss das Medium eine geeignete Menge L-Methionin enthalten. Obwohl der Gehalt vorzugsweise in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen eingestellt wird, ist er üblicherweise innerhalb eines solchen Bereichs, dass der L-Methioningehalt nicht ausreichend ist, so dass das Wachstum des Bakteriums limitiert sein sollte, was die effizienteste Produktion von L-Lysin durch das Bakterium erlaubt. Beispielsweise ist der L-Methioningehalt in dem Medium vorzugsweise zwischen 0,01 bis 1 g/l.
Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wässeriges Ammoniak u.s.w. eingesetzt werden.
Als anorganische Ionen (oder deren Quellen) kann eine kleine Menge Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen u.s.w. zu dem Medium gegeben werden. Als organische Spurennährstoffe kann Vitamin B₁, Hefeextrakt u.s.w. in geeigneter Menge zu dem Medium gegeben werden.
Die Kultivierung wird vorzugsweise zwischen etwa 16 und 72 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird auf zwischen 25 und 45°C eingestellt, und der pH-Wert wird während der Kultivierung zwischen 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas und dergleichen können eingesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen.
Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung kann L-Lysin aus der Fermentationsbrühe beispielsweise durch übliche Verfahren unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes, Ausfällung und anderen bekannten Verfahren in Kombination gewonnen werden.
Beispiele
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden nichtlimitierenden Beispiele eingehend erklärt.
Beispiel 1: Herstellung eines L-Methionin-auxotrophen Stammes aus einem Wildtypstamm eines Methylophilusbakteriums.
Ein Wildtypstamm von Methylophilus methylotrophus, AS1-Stamm (NCIMB 10515), wurde mit N-Methyl-N'-nitronitrosoguanidin (NTG) behandelt, um einen L-Methioninauxotrophen Stamm, wie nachstehend beschrieben, zu isolieren. Zuerst wurde ein Tag vor der Behandlung mit NTG der Wildtypstamm AS1 in 50 ml des SEII-Mediums geimpft (Zusammensetzung: 1,9 g/l K₂HPO₄, 5,0 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,56 g/l NaHP₂O₄·2H₂O, 0,2 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,72 mg/l CaCl₂·6H₂O, 5 μg/l CuSO₄·5H₂O, 25 μg/l MnSO₄·5H₂O, 23 μg/l ZnSO₄·7H₂O, 9,7 mg/l FeCl₃·6H₂O, 1% (Vol./Vol.) Methanol) und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln kultiviert. Eine NTG-Lösung wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt (hergestellt durch Auflösen von NTG in Dimethylsulfoxid (DMSO)).
Am nächsten Tag wurden die kultivierten Zellen durch Zentrifugation bei 4°C gewonnen, und 50 ml eisgekühlter 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) wurden zu den Zellen gegeben, um diese zu suspendieren. Dann wurde die Suspension erneut zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt, um die Zellen einmal zu waschen. Die Zellen wurden in 2 ml desselben Puffers suspendiert und in zwei Eppendorfröhrchen in gleiche Volumen aufgeteilt. Eines davon wurde für die NTG-Behandlung eingesetzt, und das andere wurde als Kontrolle verwendet, das nicht mit NTG behandelt wurde. 10 μl der NTG-Lösung oder einer DMSO-Lösung, welche NTG nicht enthielt, wurden in jedes Röhrchen gegeben. Auf dieser Stufe betrug die Endkonzentration von NTG in der Probe, welche der NTG-Behandlung unterworfen wurde, 0,1 mg/ml. Die Proben wurden 5 Minuten bei 37°C behandelt und 2 Minuten auf Eis stehen gelassen, und dann wurde jede Probe 2 Minuten bei 15.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen.
Die gewonnenen Zellen aus jeder Probe wurden zweimal mit eisgekühltem SEII-Medium gewaschen, dann in 3 ml des SEII+MT-Mediums (Zusammensetzung: SEII-Medium, welches L-Methionin (1 g/l) und L-Threonin (10 g/l) enthielt) suspendiert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Auf dieser Stufe wurde ein Teil jeder Probe extrahiert und auf ein SEII-Agarmedium geimpft (Zusammensetzung: SEII-Medium, das 1,5 % (Gew./Vol.) Agar enthielt) und die Anzahl der erschienenen Kolonien (Anzahl lebensfähiger Bakterien) wurde verwendet, um die Sterblichkeitsrate aufgrund der NTG-Behandlung zu berechnen. Die Sterblichkeitsrate wurde ausgedrückt als [Anzahl lebensfähiger Zellen in der Probe, die einer NTG-Behandlung unterworfen wurde/Anzahl lebensfähiger Zellen in der Probe, die nur mit DMSO-Lösung behandelt wurde].
Am Tag nach der NTG-Behandlung wurde ein Teil der verstehend erwähnten Kulturbrühe in das SEII+MT-Medium bei 37°C eingeeimpft, um die Zellen zu züchten. Nachdem der Absorptionswert der Kulturbrühe bei einer Wellenlänge von 660 nm (OD 660 nm) etwa 0,5 erreicht hatte, wurde das geliche Volumen einer 20%-igen DMSO-Lösung (Endkonzentration: 10%) für die Konservierung der Zellen zugegeben, und die Kulturbrühe wurde ausreichend gerührt und dann bei -80°C gelagert. Außerdem wurde ein Teil der Kulturbrühe auf das SEII-MT-Agarmedium und das SE-II-Agarmedium geimpft, das 50 μg/ml des Antibiotikums Streptomycin (Sm) enthielt, und die auftretende Häufigkeit Sm-resistenter Stämme, d. h. die Mutationsrate, wurde gemessen. Es zeigte sich, dass die Mutationsrate etwa 4 × 10^–6 war.
Die Stammlösung des Bakteriums, das mit NTG behandelt wurde, wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, und 1 bis 1/10^–7- fache Reihenverdünnungen davon wurden hergestellt und auf das SEII-MT-Agarmedium geimpft. Die Zellen wurden zwei Tage bei 37°C kultiviert, und der Verdünnungsgrad, der die Bildung von 10 bis 200 Kolonien pro Agarplatte bereitstellte, wurde festgestellt. Dann wurde die Ausgangslösung des Bakteriums erneut auf diese Konzentration verdünnt und auf das SEII-MT-Agarmedium geimpft. Die Zellen wurden drei Tage bei 37°C kultiviert, und dann wurden die auftretenden Kolonien auf eine SEII-Agarmediumplatte und eine SEII+MT-Agarmediumplatte als Replika aufgetragen, um die Kolonien zu isolieren, die auf dem SEII-MT-Agarmedium wachsen können, jedoch auf dem SEII-Agarmedium nicht wachsen können. Dann wurden die selektierten Kolonien nacheinander auf das SEII-Agarmedium, SEII+MT-Agarmedium (Zusammensetzung: Agarmedium, das L-Methionin (1 g/l) in dem SEII-Medium enthielt), SEII+T-Agarmedium (Zusammensetzung: Agarmedium, das L-Threonin (10 g/l) in dem SEII-Medium enthielt) und das SEII+MT-Agarmedium geimpft, und es wurde untersucht, ob die Aminosäureauxotrophie dieser Klone eine Auxotrophie für L-Methionin, L-Threonin oder beide war.
Es zeigte sich, dass zwei der L-Methionin-auxotrophen Stämme und einer der L-Threonin-auxotrophen Stämme erhalten werden konnten. Diese wurden als MR102-Stamm, MR103-Stamm bzw. TR115-Stamm bezeichnet. Es konnte in diesem Experiment kein Stamm erhalten werden, der diese beiden Aminosäuren für sein Wachstum benötigt.
Beispiel 2
<1> Einführung des lysE-Gens, das von einem Brevibacteriumbakterium abgeleitet ist, in ein Methylophilusbakterium
(1) Konstruktion von pRSlysE24
Um das lysE-Gen, welches für ein Protein kodiert, das eine Aktivität zur Exkretion von Lysin in Corynebakterium glutamicum hat, in ein Methylophilusbakterium einzuführen, wurde das bekannte Plasmid pRS (Internationale Patentveröffentlichung in Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682) eingesetzt, um ein Plasmid pRSlysE für die Expression von lysE zu konstruieren. pRS ist ein Plasmid mit dem Vektorsegment des pVIC40-Plasmids (Internationale Patentveröffentlichung W090/04636, Internationale Patentveröffentlichung in Japanisch Nr. 3-501682), das aus pVIC40 durch Deletion einer DNA-Region erhalten wurde, welche das Threoninoperon enthielt und auf dem Plasmid vorhanden war. Das Plasmid pVIC40 ist von einem Vektorplasmid pAYC32 mit breitem Wirtsbereich (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167) abgeleitet, welches ein Derivat von RSF1010 ist.
Zuerst wurde ein Plasmid pRStac mit dem tac-Promotor aus pRS konstruiert. Das pRStac-Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und PstI verdaut und zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zum Abbrechen der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen und DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8%-Agarosegel abgetrennt. Ein DNA-Fragment aus 8 Kilobasenpaaren ("kbp") wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver.2 (DNA-Gewinnungskit, Takara Shuzo) gewonnen. Auf der anderen Seite wurde die Tac-Promotorregion durch PCR unter Verwendung des pKK223-3-Plasmids (Expressionsvektor, Pharmacia) als Matrize und der Primer, die in SEQ ID NOS: 1 und 2 gezeigt sind, amplifiziert (ein Zyklus bestand aus der Denaturierung bei 94°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C während 60 Sekunden, und dieser Zyklus wurde dreißigmal wiederholt). Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR eingesetzt. Das DNA-Fragment, das den amplifizierten tac-Promotor enthielt, wurde unter Verwendung von PCR-Prep (Promega) gereinigt und dann an den Restriktionsenzymstellen verdaut, die vorher in den Primern konstruiert worden waren, d. h. an den EcoRI- und den EcoT22I-Stellen. Dann wurde das Reaktionsgemisch zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und die DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8%-Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragment von etwa 0,15 kbp wurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver.2 gewonnen.
Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektors und das tac-Promotorregionfragment, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden unter Einsatz des DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) ligiert. Die Ligierungsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichia coli zu transformieren (E. coli JM109-kompetente Zellen, Takara Shuzo). Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRS-tac erhalten wurde. Ein Plasmid, worin die Transkriptionsrichtungen des Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promotors identisch waren, wurde als pRStac selektiert.
Das wie vorstehend erhaltene pRStac wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolobs) verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen und die DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8%-Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment mit etwa 9,0 kbp erhalten wurde.
Das lysE-Genfragment wurde auch durch PCR unter Einsatz von Chromosomen, die aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm (Corynebacterium glutamicum ATCC13869) extrahiert wurden, als Matrize und den Primern, die in den SEQ ID Nummern 5 und 6 gezeigt sind, amplifiziert (Denaturierung bei 95°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C während 90 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR eingesetzt. Um die Expression des lysE-Gens in einem Methylophilusbakterium zu ermöglichen, wurden die Primer so konstruiert, dass Nukleotide mit 9-15 by aus dem Translationsinitiationskodon des lysE-Gens durch eine Sequenz ersetzt sein sollten, die bekanntlich in einem Methylophilusbakterium funktioniert (Wyborn, N.R., Mills, J., Williamis, S.G. und Jones, C.W., Eur.J.Biochem., 240, 314-322 (1996)). Das erhaltene Fragment wurde unter Einsatz von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit Sse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegeben und zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAs wurde durch Ethanolausfällung gewonnen und mit einem 0,8%-Agarosegel getrennt.
Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das lysE-Genregionfragment, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden unter Einsatz des DNA-Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligierungsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM109-kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, das 20mg/L Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden in LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und durch Bestimmen der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE erhalten wurde. In pRSlysE ist das lysE-Gen so positioniert, dass seine Transkriptionsrichtung dieselbe ist wie die des tac-Promotors.
(2) Einführung von pRSlysE in Methylophilusbakterium
pRSlysE, das wie vorstehend erhalten wurde, wurde in einen Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) durch Elektroporation eingeführt (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Zusätzlich wurde auch pRS in den AS1-Stamm als Kontrolle auf dieselbe Weise wie pRSlysE eingefügt. Im Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA mit pRS als Kontrolle erhalten, während nur mehrere Kolonien mit pRSlysE erhalten wurden.
Nach der Extraktion der Plasmide aus den Transformantenstämmen, die pRSlysE mutmaßlich enthielten, und der Untersuchung der Nukleotidsequenzen wurde gefunden, dass eine spontane Mutation in einer Region, die für lysE kodiert, in allen untersuchten Plasmiden eingeführt war, und in einigen Fällen wurde eine Unsinnmutation mit einem Kodon, bei dem ein Kodon für eine Aminosäure durch ein Stopkodon, das die Translation beendet, ersetzt war, eingeführt. Außerdem wurde in anderen Plasmiden die Deletion des lysE-Gens beobachtet. Man geht davon aus, dass in beiden Fällen die Funktion von LysE, das auf solchen Plasmiden enthalten war, verloren gegangen war.
Wie vorstehend beschrieben war die Einführungshäufigkeit von pRSlysE, welches das lysE-Gen in voller Länge enthält, in Methylophilus methylotrophus extrem gering, und nur Plasmide mit einem lysE-Mutantengen, das eine Mutation enthielt, die die Funktion eliminierte, konnten eingeführt werden. Angesichts dieser Tatsachen wurde vermutet, dass die Einführung des lysE-Gens in Methylophilus methylotrophus einen letalen Effekt hätte. Dies deutet darauf hin, dass das lysE-Gen für die Sekretion von L-Lysin in heterogenen Bakterien nicht universell funktionieren kann.
Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm, der pRSlysE, das eine Mutation aufwies, enthielt, wurde auf eine SEII-Platte, die 20 mg/l Streptomycin enthielt, aufgetragen und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen von etwa 0,3 m² der Mediumoberfläche abgenommen, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft, und 34 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kulturüber stand wurde unter Einsatz eines Aminosäureanalysiergerätes bestimmt (Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie). Es zeigte sich, dass im wesentlichen kein Stamm erhalten wurde, worin die Sekretion von L-Lysin verstärkt war, obwohl das mutierte lysE-Gen eingeführt wurden war.
<2> Bereitstellung des Gens, das die Aktivität zur Sekretion von L-Lysin in einem Methylophilusbakterium zur Verfügung stellt
Wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben, wurde angenommen, dass das bekannte lysE-Gen in Methylophilusbakterien letal ist, und im Ergebnis wurden viele Mutantengene, deren Funktion verloren gegangen war, nachfolgend erhalten.
Während der Analyse von pRSlysE, das eine Mutation enthielt, wurde ein mutiertes lysE-Gen, das in Methylophilusbakterien funktionierte, jedoch nicht letal war, erhalten.
Dieses mutierte lysE-Gen wurde als lysE24-Gen bezeichnet. Bei der Analyse der Nukleotidsequenz des lysE24-Gens wurde gefunden, dass die Mutation nicht zu einer Aminosäuresubstitution führte, sondern zu einer Unsinnmutation, welche ein Stopkodon um die Mitte der Translationsregion von LysE einführte. In lysE24 wurde T (Thymin) nach G (Guanin) bei Position 355 des Wildtyp-lysE-Gens, gezeigt in SEQ ID NO: 17, eingeführt. Das Plasmid mit LysE24 wurde als pRSlysE24 bezeichnet.
Der E. coli JM109-Stamm, der mit pRSlysE24 transformiert war, wurde als AJ13830 bezeichnet, und dieser Stamm wurde am 4. Juni 2001 bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-18369. Dann wurde die Hinterlegung am 13. Mai 2002 in eine internationale Hinterlegung unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-8040.
Beispiel 3: Konstruktion des Lysin produzierenden Plasmids pSEA10 und pSEAl2
<1> Konstruktion des Plasmids pRSdapA mit dem dapA*-Gen
Es wurde ein Plasmid mit einem Gen (dapA*), welches für Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, welche nicht der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, als Gen für ein Enzym des L-Lysinbiosynthesesystems hergestellt.
pRStac, hergestellt in Beispiel 2, wurde mit Sse83871 und XBaI verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und die DNA wurde durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment mit etwa 9 kbp erhalten wurde.
Das bekannte Plasmid RSFD80 (WO 90/16042), welches das dapA*-Genfragment enthielt, wurde als Matrize zur Amplifizierung von dapA* durch PCR unter Einsatz der in SEQ ID NOS: 3 und 4 eingesetzt (Denaturierung bei 94°C während 20 Sekunden, Annealing bei 55°C während 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C während 60 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für de PCR eingesetzt. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Einsatz von PCR preg (Promega) gereinigt und dann mit Restriktionsenzymen Sse83871 und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und DNA wurde durch Ethanolausfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von etwa 0,1 kbp erhalten wurde.
Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das dapA*-Genregionfragment, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligierungsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM109-kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB Agarmedium, das 20 mg/Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymenen und Bestimmmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein pRSdapA-Plasmid erhalten wurde. In dem pRS-dapA-Plasmid war das dapA*-Gen so positioniert, dass eine Transkriptionsrichtung dieselbe wie die des tac-Promotors ist.
Der E. coli-Stamm JM109, der mit dem pRS-dapA-Plasmid transformiert war, wurde als AJ13831 bezeichnet, und dieser Stamm wurde 4. Juni 2001 bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository am hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-18370. Dann wurde die Hinterlegung am 13. Mai 2002 in eine Internationale Hinterlegung unter der Maßgabe des Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-8041.
<2> Konstruktion von Plasmiden pSER10 und pSEA12 mit lysE24 und dapA*
Ein Plasmid, das aus dem Plasmid pRSlysE24 mit eingefügtem dapA*-Gen bestand, wurde konstruiert, um die Wirkung der Kombination von lysE24 und dapA* zu untersuchen.
pRSlysE24, hergestellt in Beispiel 2, wurde mit dem Restriktionsenzym SapI verdaut und unter Verwendung des DNA Blunting Kits (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen. DAs Plasmid pRSlysE24 mit dapA* wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment mit etwa 1 kbp, welches den tac-Promotor und die dapA*-Region enthielt, wurde auf einem 0,8%-Agarosegel abgetrennt. Dieses Fragment wurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) gewonnen. Dieses Fragment wurde wie vorstehend beschrieben mit glatten Enden versehen und an das vorstehend beschriebene Verdauungsprodukt von pRSlysE24 unter Verwendung von DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert.
Die vorstehend erwähnte Ligierungsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM 109-kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, plattiert. Nachdem die Agarplatte über Nacht bei 37°C inkubiert worden war, traten auf dem Agarmedium viele Kolonien auf. Unter diesen wurden 8 Kolonien jeweils in ein LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestim mung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei die Plasmide pSEA10 und pSEA12 erhalten wurden. In diesen Plasmiden waren das lysE24-Gen und das dapA*-Gen so angeordnet, dass ihre Transkriptionsrichtungen im erstgenannten umgekehrt zueinander lagen, und sie waren so angeordnet, dass ihre Transkriptionsrichtungen im letztgenannten identisch waren.
Beispiel 4: Einführung von pSEA12 in Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm und in L-methioninauxotrophe Stämme (MR102-Stamm und MR103-Stamm) (Wirkung der Verleihung von L-Methioninauxotrophie auf die Lysinproduktion)
Das Plasmid, welches die Gene trug, wurde in Methylophilus methyotrophus Wildtyp-Stamm AS1 und in zwei der L-methioninauxotrophen Stämme MR102 und MR103 durch das Konjugationstransferverfahren eingeführt. Am Tag vor dem Konjugationsverfahren wurden der Stamm AS1, der Stamm MR102 und der Stamm MR103 als Empfängerstämme jeweils in 15 ml des SEII+M-Mediums kultiviert (Zusammensetzung: SEII-Medium, enthaltend 0,5 g/l L-Methionin). Der E. coli-Stamm HB101, der pRK2013 enthielt, wurde als Mobilisierer auf 10 ml des LB (Km)-Mediums geimpft (LB-Medium, enthaltend 25 μg pro ml Kanamycin), der E.coli-Stamm JM109, der pSEA12 trug, wurde in 3 ml LB(Sm)-Medium (LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Streptomycin) als Donor geimpft und diese Stämme wurden kultiviert.
Am nächsten Tag wurde jede Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen und die Zellen wurden einmal mit dem LB-Medium für den E.coli-Stamm HB101, der pRK2013 enthielt, und dem E.coli-Stamm JM109, der pSEA12 enthielt, gewaschen. Außerdem wurden für die drei Stämme der vorstehend genannten Methanol verwertenden Bakterien die Zellen auch gewonnen und dann mit dem SEII-Medium ge waschen. Dann wurden die E.coli-Zellen jeder Art in dem LB-Medium suspendiert, und die Zellen der Methanol verwertenden Bakterien wurden in dem SEII-Medium suspendiert. Dann wurden geeignete Volumen der Suspensionen auf dem LB-Agarmedium unter Einsatz einer Impföse gemischt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert, um den Konjugationstransfer von pSEA12 in jeden der Stämme AS1, MR102 und MR103 zu bewirken. Dann wurden die Zellen jedes Stammes von dem Agarmedium abgeschabt und auf das SEII+M (Sm)-Agarmedium (Zusammensetzung: SEII+M-Agarmedium, enthaltend Sm (50 μg/ml)) verbreitet und bei 37°C für die Selektion von Transformanten kultiviert. Jede einzelne Kolonie, die auf dem Medium erschien, wurde außerdem zweimal auf einem frischen SEII+M (Sm)-Agarmedium ausplattiert, um den Stamm MR102(pSEA12) und den Stamm MR103(pSEA12) als Zielstämme und den Stamm AS1(pSEA12) als Kontrollstamm zu isolieren.
Jeder der drei vorstehend genannten Stämme wurde auf die SEII+M(Sm)-Agarplatte aufgetragen und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die auf der Mediumoberfläche gewachsenen Zellen auf einer Fläche von etwa 3 cm² abgeschabt, in das SEII-Produktionsmedium (20 ml), welches L-Methionin in verschiedenen Konzentrationen enthielt, geimpft und 48 Stunden bei 37° unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kulturüberstand wurde unter Einsatz eines Aminosäureanalysiergeräts bestimmt (Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie). Im Ergebnis wurde eine L-Lysinanhäufung in dem Medium mit dem Stamm AS1(pSEA12) von 0,96 g/l als Höchstwert erhalten. Die Stämme MR102 und MR103, in denen pSEA12 eingeführt worden war, zeigten L-Lysinanhäufungen in dem Medium von 1,675 g/l bzw. 1,57 g/l, wenn 0,075 g/l L-Methionin zu dem Produktions medium gegeben wurde, und somit war die L-Lysinanhäufung in dem Medium erheblich verbessert.
Beispiel 5: Herstellung eines L-methioninauxotrophen Stammes (Stamm MR701) aus dem Methylophilus methylotrophus-Stamm AS1 und Herstellung eines Lysin produzierenden Bakteriums durch Einführung von pSEA10 in diesen Stamm
<1> Herstellung eines Stammes mit zerstörtem metA-Gen
Aus dem Methylophilus methylotrophus-Stamm AS1 wurde ein Fragment für die Zerstörung des Gens zur Herstellung eines L-methioninauxotrophen Stammes durch Genzerstörung hergestellt. Als zu zerstörendes Gen wurde eine Genregion ausgewählt, die hohe Homologie zu dem metA-Gen des Mycobacterium tuberculosis-Stammes H37Rv hatte (GenBank Hinterlegungsnummer CAA 17113), wobei diese Genregion vermutlich Homoserin-o-acetyltransferase kodiert. Diese Region kann durch PCR unter Einsatz der in SEQ ID NOS: 7 und 10 gezeigten DNA-Primer amplifiziert werden (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus der Reaktionsstufen der Denaturierung: 94°C während 30 Sekunden, Annealing: 60°C während 30 Sekunden und DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 4 Minuten; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt). Die DNA-Sequenz der Region und die Aminosäuresequenz, die davon kodiert wird, sind in den SEQ ID NO: 15 und 16 gezeigt, und das Gen wurde als metA-Gen bezeichnet.
Um eine chromosomale DNA aus dem Wildtypstamm ASl zu erhalten, wurde der Stamm AS1 in 50 ml SEII-Medium (Zusammensetzung 5 g/l (NH₄)₂SO₄, 1,9 g/l K₂HPO₄, 1,56 g/l NaH₂PO₄·2H₂O, 200 mg/l MgSO₄·7H₂O, 72 mg/l CaCl₂·6H₂O, 5 μg/l CuSO₄·5H₂0, 25 μg/l MnSO₄·5H₂O, 23 μg/l ZnSO₄·7H₂O, 9,7 mg/l FeCl₃·6H₂O, 0,5% (Vol./Vol.) Methanol) geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Dann wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen, und eine chromosomale DNA wurde unter Verwendung eines käuflich erwerbbaren Kits hergestellt (Genomic DNA Purification Kit (hergestellt von Edge Biosystems).
Die erhaltene chromosomale DNA wurde als Matrize mit den in den SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigten DNA-Primern für die PCR eingesetzt (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufen der Denaturierung: 94°C während 30 Sekunden, Annealing: 60°C während 30 Sekunden, und DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 2 Minuten; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragment von etwa 1,3 kb erhalten wurde. Die PCR wurde auch unter Einsatz der Primer, gezeigt in SEQ ID NO: 9 und 10, unter denselben Bedingungen durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhalten wurde.
Die PCR wurde auch unter Verwendung des Plasmids pKD4 (GenBank Hinterlegungsnummer AY048743, Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12), 6640-6645, 2000) als Matrize und den Primern, gezeigt in SEQ ID NO: 11 und 12, unter denselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment, das ein Kanamycinresistenzgen enthielt, erhalten wurde (etwa 1,5 kb).
Die drei Arten von DNA-Fragmenten, die vorstehend erwähnt sind, wurden gemischt und als Matrize zusammen mit den in den SEQ ID NO: 13 und 14 gezeigten Primern einer PCR unterzogen (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufen der Denaturierung: 94°C während 30 Sekunden, des Annealings: 60°C während 30 Sekunden, und der DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 4 Minuten und 30 Sekunden; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragment von etwa 4,2 kb erhalten wurde. Die PCR wurde auch unter Einsatz der Primer, gezeigt in SEQ ID NO: 9 und 10, unter denselben Bedingungen durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhalten wurde. Das Fragment wurde unter Einsatz eines käuflich erwerbbaren Kits (Wizard PCR Pregs DNA Purification System, hergestellt von Promega) gereinigt und dann einer Ethanolausfällung unterworfen, und die Präzipitate wurden in TE suspendiert. Diese DNA-Lösung wurde im Folgenden als Fragment für die Genzerstörung eingesetzt. Dieses Genfragment hatte eine Struktur, die aus dem metA-Gen bestand, in das ein Kanamycinresistenzgen eingeführt war.
Dann wurde das vorstehend beschriebene Genfragment in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm eingeführt. Das Elektroporationsverfahren (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) wurde für die Transformation eingesetzt. Die Zellen wurden nach der Elektroporation auf das SEII-Agarmedium (20 mg/l Kanamycin und 0,5 g/l L-Methionin zugegeben) aufgetragen. Nach 48-stündiger Kultivierung traten mehrere Zehn Kolonien auf. Unter ihnen wurden 13 Stämme willkürlich ausgewählt und auf L-Methioninauxotrophie untersucht. Es zeigte sich, dass alle Stämme L-Methioninauxotrophie hatten. Der L-methioninauxotrophe Stamm, der durch die Genzerstörung erhalten wurde, wurde als MR701-Stamm bezeichnet.
Die Zerstörung des Zielgens wurde durch das PCR-Verfahren bestätigt. Das heißt, die vorstehend genannten Kolonien, die auftraten, wurden in 20 μl sterilisiertem Wasser suspendiert, mit 5 μl 1 mg/ml Proteinase K und 25 μl einer Puffers (40 Millimolar Tris, 0,5% Tween 20, 1% Nonidet P-40 1 Millimolar EDTA (eingestellt mit HCl auf pH 8,0)) versetzt und dann 20 Minuten bei 60°C und 5 Minuten bei 95°C umgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde als Matrize für die PCR eingesetzt. Die PCR wurde unter Verwendung der Sequenzen, die in den SEQ ID NO: 7 und 10 gezeigt sind, als Primer (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt, ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufen der Denaturierung: 94°C während 30 Sekunden, des Annealings: 60°C während 30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 4 Minuten und 30 Sekunden; der Zyklus wurde 25-mal wiederholt) durchgeführt, um die Zerstörung des Zielgens zu bestätigen.
<2> Untersuchung der L-Lysinproduktivität in dem Stamm mit zerstörtem metA-Gen
Dann wurde pSEA10, beschrieben in Beispiel 3, in den Stamm MR701, der wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, eingeführt, und die L-Lysinproduktion des Stammes wurde untersucht. pSEA10 wurde in den Stamm MR701 durch Elektroporation eingeführt und die erhaltene Transformante wurde als MR701(pSEA10) bezeichnet. Der Stamm AS1(pSEA10) wurde auf dem SEII(Sm)-Agarmedium (SEII-Medium, enthaltend 50 μg/ml Streptomycin) ausgebreitet, und der Stamm MR701(pSEA10) wurde auf dem SEII+M(SmKm)-Agarmedium (SEII-Medium, enthaltend 0,5 g/l L-Methionin und 50 μg/ml Streptomycin und 20 μg/ml Kanamycin) ausgebreitet. Nachdem die Zellen über Nacht bei 37°C kultiviert worden waren, wurden die auf der Zelloberfläche gewachsenen Zellen auf einer Fläche von etwa 3 cm² abgeschabt, in das SEII-Produktionsmedium (20 ml), enthaltend 0,075 g/l L-Methionin (50 μg/ml Streptomycin wurden zugegeben), geimpft und 48 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kultur überstand wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysiergeräts bestimmt (Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie). Es zeigte sich, dass die L-Lysinanhäufung in dem Medium des Stammes AS1(pSEA12) 0,97 g/l war, während der Stamm MR701 (pSEA10) eine L-Lysinanhäufung in dem Medium von 1,52 g/l zeigte, so dass bestätigt werden konnte, dass die L-Lysinproduktion durch Verleihung von L-Methioninauxotrophie verbessert war.
[Erklärung der SEQUENZLISTE]

SEQ ID NO: 1: Primer für die Amplifizierung der tac-Promotorregion
SEQ ID NO: 2: Primer für die Amplifizierung der tac-Promotorregion
SEQ ID NO: 3: Primer für die Amplifizierung des dapA*-Gens
SEQ ID NO: 4: Primer für die Amplifizierung des dapA*-Gens
SEQ ID NO: 5: Primer für die Amplifizierung des lysE-Gens
SEQ ID NO: 6: Primer für die Amplifizierung des lysE-Gens
SEQ ID NO: 7: Primer für die Amplifizierung des metA-Gens
SEQ ID NO: 8: Primer für die Amplifizierung des metA-Gens
SEQ ID NO: 9: Primer für die Amplifizierung des metA-Gens
SEQ ID NO: 10: Primer für die Amplifizierung des metA-Gens
SEQ ID NO: 11: Primer für die Amplifizierung des Kanamycinresistenzgens
SEQ ID NO: 12: Primer für die Amplifizierung des Kanamycinresistenzgens
SEQ ID NO: 13: Primer für die Amplifizierung des Fragments für die Zerstörung des metA-Gens
SEQ ID NO: 14: Primer für die Amplifizierung des Fragments für die Zerstörung des metA-Gens
SEQ ID NO: 15: Nukleotidsequenz von metA
SEQ ID NO: 16: Aminosäuresequenz, die von metA kodiert wird
SEQ ID NO: 17: Nukleotidsequenz von lysE
SEQ ID NO: 18: Aminosäuresequenz, die von lysE kodiert wird.

SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, welches a) das Kultivieren eines Methanol verwertenden Bakteriums, welches L-Methionin für sein Wachstum benötigt und L-Lysin in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, produzieren kann, b) das Anhäufen von L-Lysin in der Kultur und c) das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium ein Methylophilusbakterium ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Methylophilusbakterium Methylophilus methylotrophus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Methylophilusbakterium derart modifiziert ist, dass die enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetase und ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
Methylophilusbakterium, welches L-Methionin für sein Wachstum benötigt und L-Lysin produzieren kann.
Methylophilusbakterium nach Anspruch 5, welches Methylophilus methylotrophus ist.
Methylophilusbakterium nach Anspruch 5, welches derart modifiziert ist, dass eine enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetase und ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.