FR2850394A1 - Procede pour produire de la l-lysine avec une bacterie utilisant le methanol, et bacterie correspondante - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé pour produire de la L-lysine qui comprend la culture d'une bactérie utilisant le méthanol qui nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et qui est capable de produire de la L-lysine dans un milieu contenant du méthanol comme principale source de carbone, l'accumulation de L-lysine dans la culture, et la récupération de la L-lysine à partir de la culture, ainsi qu'une bactérie utilisée dans ce procédé.

Description

<Desc/Clms Page number 1>

La présente invention concerne une technique utile dans l'industrie microbienne, plus spécifiquement un procédé pour produire de la L-lysine par fermentation au moyen d'une bactérie utilisant le méthanol, ainsi qu'une telle bactérie.

La L-lysine est produite par fermentation avec des micro-organismes qui appartiennent par exemple aux genres Corynebacterium, Bacillus, Escherichia (voir "Amino Acid Fermentation", édité par H. Aida et al., the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1ère édition, publié le 30 mai 1986). Des souches bactériennes isolées à partir de souches naturelles ou mutantes auxotrophes ont été utilisées pour améliorer la production de ces micro-organismes. De plus, différentes techniques ont été décrites pour augmenter la capacité de production de L-lysine par génie génétique, pour améliorer les enzymes de biosynthèse de L-lysine (WO 95/16042).

La productivité de la L-lysine a été considérablement accrue par culture de micro-organismes tels que ceux mentionnés ci-dessus ainsi que par des améliorations des procédés de production. Cependant, pour répondre aux demandes croissantes dans le futur, il est clair que le développement d'un procédé permettant la production plus efficace de L-lysine à moindre coût est nécessaire.

Le méthanol est une matière première de fermentation qui est disponible en grandes quantités à faible coût. Des procédés pour produire des L-aminoacides par fermentation du méthanol sont connus et comprennent des procédés utilisant des micro-organismes qui appartiennent aux genres Achromobacter ou Pseudomonas (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 45-25273), Protaminobacter (demande de brevet japonais (Kokoku) n 49-125590), Protaminobacter ou Methanomonas (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 50-25790), Microcyclus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 52-18886), Methylobacillus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 4-91793), Bacillus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 3-505284), Methylophilus (WO 00/61723).

De plus, pour des bactéries utilisant strictement le méthanol, en particulier les bactéries Methylophilus, il a été décrit qu'il était difficile

<Desc/Clms Page number 2>

d'obtenir des mutants auxotrophes par les procédés courants ((1983), vol. 129, p. 785-799 ; M.L. O'Connor et R.S. Hanson, Journal of Général Microbiology (1978), vol. 104, p. 105-111). De ce fait, quand on a tenté d'obtenir une souche auxotrophe pour la glutamine, par exemple, il n'a été possible d'obtenir qu'une souche ayant une auxotrophie sensible à la température (Windass J. D. et al., Nature, 287, p. 396-401 (1980)). Même quand on a utilisé un processus spécial, par exemple la mise en suspension de cellules d'une souche bactérienne dans une solution contenant un agent mutagène pour l'ADN et en appliquant une tension aux cellules pour pratiquer des trous dans les membranes cellulaires et pour faire pénétrer ainsi l'agent mutagène dans les cellules (électroporation), on a pu obtenir seulement trois types de souches mutantes, à savoir une souche auxotrophe pour l'acide folique, une souche polyauxotrophe pour la sérine et l'alanine et une souche polyauxotrophe pour l'acide glutamique et l'inositol (C. S. Kim et T.K.

Wood, Applied Microbiol. & Biotechnology, 48, p. 105-108 (1997).

De plus, WO 00/61723 indique aussi que Methylophilus methylotrophus a été soumis à un traitement de mutagenèse au moyen d'un agent mutagène chimique pour obtenir une souche auxotrophe pour les casaminoacides perméable, et que cette souche produisait de la valine, de la leucine et de l'isoleucine. Cependant, à en juger d'après les caractéristiques de la souche mutante, il semble que la souche est devenue une souche auxotrophe pour les casaminoacides perméable du fait de la modification des membranes cellulaires qui permettait à différents aminoacides présents dans le milieu de pénétrer dans les cellules.

La présente invention a pour but de fournir un procédé pour améliorer l'efficacité de la production de L-lysine au moyen d'une bactérie utilisant le méthanol.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour produire de la L-lysine comprenant la culture d'une bactérie utilisant le méthanol qui nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et qui est capable de produire de la L-lysine dans un milieu contenant du méthanol comme principale source de carbone, l'accumulation de L-lysine dans la culture et la récupération de la L-lysine à partir de la culture.

<Desc/Clms Page number 3>

De préférence, dans le procédé décrit ci-dessus, la bactérie est une bactérie Methylophilus, de préférence encore une bactérie Methylophilus methylotrophus.

De préférence, la bactérie Methylophilus est modifiée de sorte que l'activité enzymatique de la diaminopimélate synthétase est stimulée ainsi que le système de sécrétion de la L-lysine.

La présente invention concerne aussi une bactérie Methylophilus qui nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et qui est capable de produire de la L-lysine.

De préférence, cette bactérie est une bactérie Methylophilus methylotrophus.

De préférence également, la bactérie Methylophilus décrite cidessus est modifiée de sorte que l'activité enzymatique de la diaminopimélate synthétase est stimulée ainsi que le système de sécrétion de la L-lysine.

Grâce à la présente invention, la production de L-lysine avec des bactéries utilisant le méthanol peut être améliorée.

A la suite de recherches approfondies pour atteindre les buts mentionnés ci-dessus, la demanderesse est parvenue à conférer une auxotrophie pour la méthionine à une bactérie utilisant le méthanol, et a constaté que cette caractéristique améliorait la productivité de la L-lysine à partir du méthanol par la bactérie utilisant le méthanol.

Dans la présente invention, le terme "aptitude à produire de la L-lysine" désigne l'aptitude de la bactérie de la présente invention à provoquer une accumulation de L-lysine dans un milieu en une quantité significative, par exemple 0,1 g/L ou plus, quand elle est cultivée dans le milieu, ou l'aptitude de la bactérie de la présente invention à augmenter sensiblement la quantité de L-lysine libre dans les cellules par rapport à la masse totale des protéines dans les cellules, par exemple de 1,5 fois ou plus, par rapport à la souche de type sauvage initiale.

La bactérie selon la présente invention est une bactérie utilisant le méthanol qui exige de la L-méthionine pour sa croissance, c'est-à-dire qu'elle est auxotrophe pour la L-méthionine, et qui est capable de produire de la L-lysine. Dans la présente invention, une bactérie utilisant le méthanol, ou méthylotrophe, désigne une bactérie qui peut se développer en utilisant le méthanol comme principale source de carbone et à laquelle

<Desc/Clms Page number 4>

une aptitude à produire de la L-lysine peut être conférée ou améliorée par le biais de l'auxotrophie pour la L-méthionine. Des exemples spécifiques de telles bactéries comprennent les bactéries Methylophilus comme Methylophilus methylotrophus et les bactéries Methylobacillus comme Methylobacillus glycogenes et Methylobacillus flagellatum.

Des exemples de Methylophilus methylotrophus comprennent la souche AS1 (NCIMB 10515), par exemple. La souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB 10515) est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume Uni).

Des exemples de Methylobacillus glycogenes comprennent la souche T-11 (NCIMB 11375), la souche ATCC 21276, la souche ATCC 21371, la souche ATR80 (décrite dans Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)), la souche A513 (décrite dans Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)). La souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume Uni). Des exemples de Methylobacillus flagellatum comprennent la souche KT (décrite dans Arch. Microbiol., 149, p. 441-446 (1988)).

La bactérie utilisant le méthanol qui nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et qui est capable de produire de la L-lysine peut être obtenue à partir d'une bactérie utilisant le méthanol qui n'exige pas la L-méthionine (non auxotrophe pour la L-méthionine) par exemple une souche de type sauvage de bactéries utilisant le méthanol.

Dans la présente invention, l'expression "nécessite de la L-méthionine pour sa croissance" signifie par exemple qu'une souche ne se développe pas quand elle est cultivée dans du milieu SEII qui ne contient pas de L-méthionine ou qui a une teneur en L-méthionine de 0,001 g/L ou moins à 30 à 37 C pendant 2 jours, tandis qu'elle se développe à une vitesse, mesurée par le biais de l'augmentation de la masse de cellules par unité de temps, comparable à celle d'une souche de type sauvage non modifiée ou souche mère, ou à une vitesse correspondant à 5 % ou plus, de préférence à 20 % ou plus, de celle d'une souche de type sauvage non modifiée ou souche mère, quand elle est cultivée dans le même milieu contenant au moins 0,05 g/L ou plus de

<Desc/Clms Page number 5>

L-méthionine. De plus, quand une souche souhaitée (souche auxotrophe pour la L-méthionine) ne peut pas former une colonie ayant un diamètre de 1 mm ou plus même après qu'environ 100 cellules ont été appliquées sur une boîte typique de milieu SEII gélosé ne contenant pas de L-méthionine, et cultivée à 37 C pendant 2 jours, mais est capable de former des colonies ayant un diamètre de 1 mm ou plus sur le même milieu contenant 1 g/L de L-méthionine après une culture dans les mêmes conditions, la souche "nécessite de la L-méthionine pour sa croissance".

Les procédés pour obtenir une souche auxotrophe pour la L-méthionine à partir d'une souche non auxotrophe pour la L-méthionine comprennent le traitement d'une souche non auxotrophe pour la L-méthionine avec une stimulation physique capable de muter un gène, comme les rayons ultraviolets, les rayons X et les rayons y, ou le traitement d'une souche non auxotrophe pour la L-méthionine avec un agent mutagène chimique comme la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), puis la sélection d'une souche qui est devenue auxotrophe pour la L-méthionine. Parmi ces procédés, on préfère un procédé utilisant par exemple la NTG. Bien que l'on sache qu'il est extrêmement difficile d'obtenir une souche de Methylophilus methylotrophus auxotrophe pour un acide aminé spécifique, la demanderesse a trouvé qu'il était possible d'obtenir une souche auxotrophe pour la L-méthionine même en utilisant un agent mutagène chimique.

En outre, quand on suppose qu'il existe une voie métabolique responsable de la synthèse de la L-méthionine pour une bactérie utilisant le méthanol, et quand on a identifié un gène codant une enzyme de cette voie, il est possible d'utiliser un procédé de coupure de gène utilisant la recombinaison homologue pour couper directement le gène et obtenir ainsi une souche auxotrophe pour la L-méthionine. De plus, il est possible aussi de conférer une auxotrophie pour la L-méthionine en utilisant une technique de recombinaison génétique pour supprimer l'activité d'une enzyme impliquée dans la synthèse de la L-méthionine. Par exemple, dans Methylophilus methylotrophus, le gène met4 présenté dans SEQ ID NO : 15 en annexe est un exemple de gène codant une enzyme qui peut être coupé, ou dont l'activité enzymatique peut être supprimée.

On pense que ce gène code l'homosérine o-acétyltransférase. Ainsi que cela sera décrit de manière plus détaillée dans la suite, Methylophilus

<Desc/Clms Page number 6>

methylotrophus dont le gène metA a été coupé a besoin de L-méthionine et présente une productivité de L-lysine améliorée.

En outre, les enzymes dont une déficience fonctionnelle conduit à une auxotrophie pour la L-méthionine comprennent les enzymes de la voie métabolique qui va de l'aspartate semialdéhyde à la L-méthionine.

La "déficience fonctionnelle d'une enzyme" comprend la réduction de l'activité enzymatique à un degré tel que la bactérie doit avoir une auxotrophie pour la L-méthionine, en plus de la disparition sensiblement totale de l'activité enzymatique. Par exemple, quand l'homosérine déshydrogénase est déficience, on prévoit que le phénotype est auxotrophe pour la L-méthionine et la L-thréonine et on prévoit aussi que le phénotype de déficience de la o-succinylhomosérine sulfhydrylase (par exemple produit du gène metZ) ou de la méthionine synthase (par exemple metE, metH, etc. ) est aussi auxotrophe pour la L-méthionine. Cependant, parmi eux, quand deux ou plusieurs types d'enzymes catalysant la même réaction enzymatique existent dans une bactérie utilisant le méthanol (comme dans le cas où des enzymes catalysant la même réaction enzymatique existent séparément, par exemple metE et metH), on préfère que les fonctions des deux enzymes soient éliminées simultanément.

Dans la suite, on va expliquer à titre d'exemple le procédé d'élimination de l'activité d'une enzyme de synthèse de la L-méthionine en se référant au gène metA. Le gène metA peut être obtenu à partir de l'ADN génomique d'un micro-organisme contenant le gène, par exemple Methylophilus methylotrophus, par amplification du gène par le procédé de réaction en chaîne par polymérase (PCR). L'ADN génomique peut être préparé par des procédés bien connus. Les amorces utiles pour la PCR comprennent par exemple des oligonucléotides ayant les séquences d'ADN montrées dans SEQ ID NO : 7 et 10 en annexe.

Les moyens pour supprimer l'expression du gène metA comprennent par exemple un procédé de suppression de l'expression du gène au niveau de la transcription par introduction d'une substitution, d'une délétion, d'une insertion, d'une addition ou d'une inversion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence promotrice du gène pour réduire l'activité du promoteur (voir M. Rosenberg & D. Court, Ann. Rev. Genetics, 13,319 (1979) ; P. Youderian, S. Bouvier & M. Susskind, Cell, 30,843-853

<Desc/Clms Page number 7>

(1982)). De plus, l'expression de la protéine MetA peut aussi être supprimée au niveau de la traduction par substitution, délétion, insertion, addition ou inversion d'un ou plusieurs nucléotides dans une région située entre la séquence SD (séquence de Shine-Dalgarno) et le codon d'initiation (voir J.J. Dunn, E. Buzash-Pollert & F. W. Studier, Proc. Natl.

Acad . Sci. U. S.A., 75, p. 2743 (1978)).

Par ailleurs, pour réduire ou éliminer l'activité spécifique de l'enzyme homosérine o-acétyltransférase, on peut envisager de modifier ou couper la région codante du gène metA par substitution, délétion, insertion, addition ou inversion d'un ou plusieurs nucléotides dans la séquence nucléotidique de la région codante.

On peut employer spécifiquement la mutagenèse spécifique de site (W. Kramer & H. J. Frits, Methods in Enzymology, 154,350 (1987)) et un procédé de traitement de l'ADN contenant un gène voulu avec un agent chimique comme l'hyposulfite de sodium ou l'hydroxylamine (D. Shortle & D. Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A., 75,270 (1978)) pour introduire une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un nucléotide dans un gène.

La mutagenèse spécifique de site est un procédé utilisant un oligonucléotide synthétique qui peut introduire une substitution, délétion, insertion, addition ou inversion arbitraire dans des paires de bases spécifiques. Pour utiliser ce procédé, un plasmide contenant un gène voulu qui est cloné et qui a une séquence nucléotidique connue est d'abord dénaturé pour préparer un brin unique. Puis, un oligonucléotide synthétique complémentaire d'une région dans laquelle on souhaite introduire une mutation est synthétisé. Dans cette synthèse, la séquence de l'oligonucléotide synthétique n'est pas préparée sous forme d'une séquence totalement complémentaire, mais elle est préparée de manière à inclure une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un nucléotide arbitraire. Ensuite, l'ADN simple brin et l'oligonucléotide synthétique incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un nucléotide arbitraire sont hybridés et un plasmide double brin complet est synthétisé au moyen du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I et de la ligase de T4 et est introduit dans des cellules compétentes de Escherichia coli. Certains des transformants obtenus de la manière décrite ci-dessus ont un plasmide

<Desc/Clms Page number 8>

contenant le gène souhaité dans lequel une substitution, délétion, insertion, addition ou inversion d'un nucléotide arbitraire est établie.

Le procédé de PCR recombinant (PCR Technology, Stockton Press (1989)) peut être employé comme procédé similaire pour permettre l'introduction d'une mutation et donc d'une modification ou d'une rupture du gène.

De plus, le procédé utilisant un traitement avec un agent chimique est un procédé consistant à introduire au hasard une mutation incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un nucléotide dans un fragment d'ADN incluant un gène voulu par traitement direct du fragment d'ADN avec l'hyposulfite de sodium ou l'hydroxylamine, par exemple.

Il est possible de supprimer l'expression du gène metA en remplaçant un gène natif dans le chromosome d'une bactérie utilisant le méthanol par le gène obtenu de la manière décrite ci-dessus, qui est modifié ou coupé par introduction d'une mutation.

Les procédés de substitution de gène comprennent par exemple un procédé utilisant la recombinaison homologue (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972) ; S. Matsuyama & S. Mizushima, J. Bacteriol., 162,1196 (1985)). L'aptitude à provoquer une recombinaison homologue est une propriété possédée généralement par une bactérie utilisant le méthanol. Quand un plasmide contenant une séquence ayant une homologie avec une séquence du chromosome est introduit dans une cellule bactérienne, il se produit, à une certaine fréquence, une recombinaison à un site de la séquence ayant une homologie et l'ensemble du plasmide est incorporé dans le chromosome.

Puis, si une recombinaison est réalisée au niveau de la séquence ayant une homologie sur le chromosome, le plasmide est éliminé de nouveau du chromosome. A ce stade, le gène comportant une mutation qui est introduite peut être fixé sur le chromosome, et le gène natif peut être éliminé en même temps que le plasmide, selon le site où a lieu la recombinaison. En choisissant une telle souche, il est possible d'obtenir une souche dans laquelle un gène modifié ou coupé par introduction d'une mutation incluant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un nucléotide se substitue à un gène natif dans le chromosome.

<Desc/Clms Page number 9>

De plus, la demanderesse a trouvé que, dans Methylophilus methylotrophus, l'introduction d'un gène homologue d'un gène souhaité dans le chromosome sous forme d'un fragment d'ADN linéaire entraînait une recombinaison homologue entre le gène souhaité dans le chromosome et le gène homologue du fragment d'ADN linéaire introduit dans une cellule, de sorte qu'il est possible d'obtenir une substitution de gène et qu'il est possible d'appliquer aussi une telle technique.

Un exemple de substitution de gène réalisée au moyen de cette technique est décrit dans les exemples qui suivent.

Pour déterminer si la substitution de gène s'est déroulée de manière prévue, il est possible par exemple d'incorporer dans le fragment d'ADN un gène marqueur de résistance à un médicament pour la résistance à un antibiotique. Quand un marqueur de résistance à un médicament est utilisé de cette manière, on utilise un gène conférant une résistance à un médicament comme la kanamycine, la gentamycine, la tétracycline, l'ampicilline ou la streptomycine à une bactérie utilisant le méthanol. Un tel gène marqueur peut être utilisé pour la préparation d'un gène qui doit être introduit, dont la région codante est coupée par insertion du gène marqueur. Le gène coupé dans lequel un gène marqueur a été inséré peut être préparé par une technique de génie génétique au moyen d'un ADN plasmidique, de la manière indiquée dans les exemples qui suivent, ou bien il peut aussi être préparé par la mise en #uvre simultanée d'une amplification du gène qui doit être introduit et d'une insertion du gène marqueur par PCR d'enjambement ( crossover PCR ).

Dans les exemples qui suivent, une souche de Methylophilus methylotrophus dans laquelle la fonction du gène metA a été supprimée a été construite en remplaçant le gène metA sur le chromosome de Methylophilus methylotrophus par un gène metA dans lequel une partie de la région codante a été délétée et un gène de résistance à la kanamycine a été inséré à la place de la partie de la région codante, au moyen du procédé mentionné précédemment qui utilise la recombinaison homologue.

La bactérie selon la présente invention peut être obtenue en conférant une auxotrophie pour la L-méthionine à une bactérie utilisant le méthanol qui est capable de produire de la L-lysine comme décrit

<Desc/Clms Page number 10>

ci-dessus. La bactérie selon la présente invention peut aussi être obtenue en conférant une aptitude à produire de la L-lysine à une bactérie utilisant le méthanol ayant une auxotrophie pour la L-méthionine. Il est possible d'obtenir une bactérie utilisant le méthanol, par exemple une souche de Methylophilus methylotrophus capable de produire de la L-lysine, en soumettant une souche qui n'est pas capable de produire de la L-lysine ou qui a une faible capacité à produire de la L-lysine à un traitement de mutagenèse pour lui conférer une résistance à un analogue de la L-lysine comme la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine (appelée dans la suite "AEC").

Les procédés pour le traitement de mutagenèse comprennent par exemple des procédés consistant à traiter la souche avec une stimulation physique comme les rayons ultraviolets, les rayons X et les rayons y ou avec un agent mutagène chimique comme NTG, comme mentionné ci-dessus pour l'obtention d'une souche auxotrophe pour la L-méthionine. Des exemples spécifiques de bactéries Methylophilus capables de produire de la L-lysine obtenues comme décrit ci-dessus comprennent par exemple Methylophilus methylotrophus AJ13608. Cette souche a été obtenue en conférant une résistance à AEC à la souche AS1 de Methylophilus methylotrophus.

Methylophilus methylotrophus AJ13608 a été déposée auprès du National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) le 10 juin 1999 et s'est vu attribuer le numéro de dépôt FERM P-17416. Par la suite, le dépôt a été converti en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 31 mars 2000 et s'est vu attribuer le numéro de dépôt FERM BP-7112.

Il est possible aussi de cultiver une bactérie Methylophilus capable de produire de la L-lysine en introduisant ou stimulant un ADN portant des informations génétiques liées à la biosynthèse de la L-lysine au moyen d'une technique de recombinaison génétique. Le ou les gènes à introduire codent une enzyme de la voie de biosynthèse de la L-lysine comme la dihydrodipicolinate synthase et la succinyldiaminopimélate transaminase. Dans le cas d'un gène d'une enzyme soumise à une rétro-inhibition par la L-lysine comme la dihydrodipicolinate synthase (DDPS), il est préférable d'utiliser un gène mutant codant une enzyme

<Desc/Clms Page number 11>

pour laquelle l'inhibition est levée. Des exemples de tels gènes mutants comprennent par exemple le gène dapA*24 (codant la DDPS dont le résidu histidine à la position 118 est remplacé par un résidu tyrosine) de E coli décrit dans WO 95/16 042. Les autres gènes mentionnés ci-dessus sont décrits également dans cette demande de brevet international publiée. Dans la description du document précédent, un gène codant la tétrahydrodipicolinate succinylase et un gène codant la succinyldiaminopimélate transaminase sont mutuellement échangés.

De plus, il est possible aussi d'améliorer l'aptitude à produire un L-aminoacide en stimulant l'activité d'une protéine impliquée dans la sécrétion du L-aminoacide à l'extérieur des cellules. Par exemple, comme protéine impliquée dans la sécrétion de la L-lysine à l'extérieur des cellules, on connaît la protéine LysE codée par le gène lyse (M. Vrljic, H. Sahm and L. Eggeling, Molecular Microbiology 22, pages 815-826 (1996) ; demande de brevet international publiée WO 97/23 597).

La demanderesse a confirmé qu'un gène lysE du type sauvage issu d'une bactérie Brevibacterium est inactif dans une bactérie Methylophilus ou une bactérie Methylobacillus mais qu'il pouvait être modifié pour être actif dans une bactérie méthylotrophe. Des exemples de telles protéines LysE modifiées comprennent LysE24 décrite dans les exemples qui suivent.

La protéine LysE qui est codée par le gène lysE comporte six régions en hélice hydrophobes. On suppose que certaines de ces régions hydrophobes sont des domaines transmembranaires. On estime également qu'une région située entre les troisième et quatrième régions à partir de l'extrémité N-terminale est hydrophile et a une structure en boucle. Dans la présente invention, cette région hydrophile est appelée région en boucle. La séquence nucléotidique de lysE de type sauvage et la séquence d'acides aminés de la protéine LysE de Brevibacterium lactofermentum 2256 sont montrées dans SEQ ID NO : 17 et 18 en annexe, respectivement. Dans cette séquence d'acides aminés, les régions en hélice hydrophobes correspondent aux acides aminés n 5-20,37-58, 67-93,146-168, 181-203 et 211-232. La région en boucle correspond aux acides aminés n 94-145.

La demanderesse a trouvé que le gène lysE était létal dans une bactérie utilisant le méthanol, mais qu'un ADN codant un variant de la protéine LysE qui ne comportait pas la région en boucle ou qui consistait

<Desc/Clms Page number 12>

sensiblement seulement en les hélices hydrophobes favorisait la sécrétion de la L-lysine et/ou de la L-arginine à l'extérieur d'une bactérie utilisant le méthanol. L'ADN de la présente invention code une telle protéine LysE mutante qui est dépourvue de la région en boucle qui est contenue dans une protéine LysE de type sauvage ou qui consiste sensiblement en les seules hélices hydrophobes.

La protéine LysE mutante mentionnée précédemment n'est pas limitée particulièrement à condition qu'elle comporte une ou plusieurs hélices hydrophobes et que, quand elle est exprimée, elle conduise à une sécrétion accrue de L-lysine, de L-arginine ou de ces deux acides aminés quand elle est introduite dans une bactérie utilisant le méthanol.

Spécifiquement, on envisage un ADN codant une LysE mutante qui comporte les première à sixième hélices hydrophobes par rapport à l'extrémité N-terminale. Plus spécifiquement, on envisage un ADN codant un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes par rapport à l'extrémité N-terminale et codant un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes par rapport à l'extrémité N-terminale. Le gène lysE24 mentionné précédemment est un exemple de gène lysE du type mutant qui code un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes et un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes. Le gène lysE24 est introduit par une mutation avec un codon d'arrêt en aval de la région codant la troisième hélice hydrophobe. La demanderesse a confirmé que, si une région en aval de ce codon d'arrêt est délétée, le gène lysE24 mutant n'entraîne pas d'accumulation de la L-lysine dans le milieu quand il est exprimé dans la souche AS1 de Methylophilus methylotrophus. De ce fait, on estime qu'un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes et un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes sont traduits séparément et fonctionnent séparément dans une bactérie utilisant le méthanol. Les résultats montrent que l'introduction du gène lysE24 dans une bactérie utilisant le méthanol conduit à une amélioration de la production de L-lysine ou de L-arginine.

Il est possible d'utiliser un micro-organisme quelconque pour produire un ADN codant d'une protéine impliquée dans la sécrétion de la L-lysine à l'extérieur d'une cellule, c'est-à-dire le gène lysE ou un gène homologue de celui-ci, à condition qu'il comporte une variante du gène qui

<Desc/Clms Page number 13>

peut exprimer l'activité de sécrétion de la L-lysine dans une bactérie utilisant le méthanol. Spécifiquement, des exemples de tels micro-organismes comprennent les bactéries corynéformes comme Corynebacterium glutamicum et Brevibacterium lactofermentum, les bactéries Escherichia comme Escherichia coli, les bactéries Pseudomonas comme Pseudomonas aeruginosa, et les bactéries Mycobacterium comme Mycobacterium tuberculosis.

Les exemples de gènes homologues de lysE comprennent un ADN codant une protéine qui est hybridable dans des conditions stringentes avec une sonde ayant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 17 ou une partie de celle-ci, et qui code une protéine présentant la fonction de la protéine LysE dans une bactérie utilisant le méthanol par suite de la substitution d'aminoacide mentionnée précédemment. Les conditions stringentes mentionnées précédemment comprennent des conditions dans lesquelles il se forme un hybride spécifique et dans lesquelles un hybride non spécifique ne se forme pas. Il est difficile d'exprimer clairement cette condition au moyen d'une valeur numérique quelconque. Toutefois, par exemple, les conditions stringentes comprennent des conditions dans lesquelles des ADN ayant une grande homologie, par exemple des ADN ayant une homologie de 80 % ou plus, de préférence de 90 % ou plus, de préférence encore de 95 % ou plus, sont hybridés l'un avec l'autre, tandis que les ADN ayant une homologie inférieure à l'homologie précédente ne s'hybrident pas entre eux. A titre d'alternative, les conditions stringentes incluent des conditions dans lesquelles les ADN s'hybrident entre eux à une concentration de sel correspondant à des conditions de lavage typiques de l'hybridation de Southern, c'est-à-dire 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, à 60 C.

Il est possible aussi d'utiliser comme sonde une séquence partielle de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 17. Il est possible de préparer une telle sonde par PCR en utilisant comme amorces des oligonucléotides préparés sur la base de la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 17 et comme matrice un fragment d'ADN contenant la séquence nucléotidique de SEQ ID NO : 17. Quand on utilise comme sonde un fragment d'ADN ayant une longueur d'environ 300 pb,

<Desc/Clms Page number 14>

les conditions de lavage pour l'hybridation peuvent être par exemple 2 x SSC, 0,1 % SDS à 50 C.

Pour stimuler l'expression du gène de sécrétion d'acides aminés ou d'un gène du système de biosynthèse de la L-lysine dans une bactérie utilisant le méthanol, le fragment de gène est ligaturé à un vecteur capable de fonctionner dans une bactérie utilisant le méthanol, de préférence un vecteur de type à copies multiples, pour préparer un ADN recombiné qui est ensuite utilisé pour transformer la bactérie utilisant le méthanol qui constitue l'hôte. A titre d'alternative, le gène peut être incorporé dans un transposon et introduit dans le chromosome de la bactérie. De plus, un promoteur qui induit une transcription active dans une bactérie utilisant le méthanol peut être ligaturé en amont du gène.

Pour introduire un gène dans des bactéries Methylophilus et pour stimuler son expression, le gène peut être ligaturé à un vecteur réplicable de manière autonome dans une cellule de bactérie Methylophilus pour construire un ADN recombiné, qui est ensuite utilisé pour transformer une bactérie Methylophilus par électroporation, par exemple. De plus, il est possible aussi d'incorporer un gène cible dans le chromosome de l'hôte par un procédé utilisant la transduction, un transposon (D. E. Berg, and C. M. Berg, Bio/Technol., 1, p. 417,1983), le phage Mu (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 2-109 985) ou la recombinaison homologue (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)).

Les vecteurs qui sont actifs dans les bactéries Methylophilus comprennent par exemple un plasmide qui peut se répliquer de manière autonome dans les bactéries Methylophilus. Spécifiquement, les exemples comprennent RSF1010, qui est un vecteur à large gamme d'hôtes, et ses dérivés, par exemple pAYC32 (A. Y. Chistorerdov, Y. D. Tsygankov, Plasmid, 16, p. 161-167 (1986)), pMFY42 (Gène, 44, p. 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, p. 396, (1980)).

Le vecteur qui est actif dans les bactéries Methylobacillus est par exemple un plasmide qui peut se répliquer de manière autonome dans les bactéries Methylobacillus. Spécifiquement, les exemples comprennent RSF1010, qui est un vecteur à large gamme d'hôtes, et ses dérivés, par exemple pMFY42 (Gène, 44, p. 53 (1990)).

<Desc/Clms Page number 15>

Il est possible d'utiliser un procédé quelconque pour introduire une molécule d'ADN recombiné dans une bactérie Methylophilus, à condition qu'il conduise à une efficacité de transformation suffisante. Par exemple, il est possible d'utiliser l'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, p. 197 (1997)).

Production de L-lysine au moyen d'une bactérie utilisant le méthanol à laquelle une auxotrophie pour la L-méthionine a été conférée.

La culture d'une bactérie utilisant le méthanol à laquelle a été conférée une auxotrophie pour la L-méthionine par coupure du gène metA ou par un traitement de mutagenèse et qui est capable de produire de la L-lysine obtenue comme décrit ci-dessus dans un milieu additionné d'une quantité appropriée de L-méthionine conduit à la production d'une quantité marquée de L-lysine et à l'accumulation de la L-lysine produite dans le milieu. Ainsi, l'utilisation de la bactérie utilisant le méthanol selon la présente invention, à laquelle a été conférée une auxotrophie pour la L-méthionine et qui est capable de produire de la L-lysine, est efficace pour améliorer la quantité de L-lysine accumulée.

Le milieu utilisé pour produire de la L-lysine est un milieu typique qui contient une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et d'autres matières nutritives à l'état de traces selon ce qui est nécessaire. La principale source de carbone est le méthanol. Cependant, il est possible d'utiliser conjointement des sucres comme le glucose, le lactose, le galactose, le fructose et un hydrolysat d'amidon, des alcools comme le glycérol et le sorbitol, et des acides organiques comme l'acide fumarique, l'acide citrique, l'acide succinique et l'acide pyruvique.

L'expression "le méthanol est utilisé comme principale source de carbone" signifie que la teneur en méthanol de la source de carbone totale est 50 % (m/m) ou plus, de préférence 80 % (m/m) ou plus.

Si le méthanol est utilisé comme principale source de carbone, sa concentration est habituellement de 0,001 % à 4 % (m/m), de préférence de 0,1 à 2 % (m/m). De plus, quand du glucose est ajouté, sa concentration est habituellement de 0,1 % à 3 % (m/m), de préférence de 0,1 % à 1 % (m/m).

En outre, le milieu doit contenir une quantité appropriée de L-méthionine. Bien que sa teneur soit de préférence ajustée selon les

<Desc/Clms Page number 16>

conditions de culture, elle est habituellement située dans un domaine tel que la teneur en L-méthionine n'est pas suffisante, de sorte que la croissance de la bactérie est limitée, et permet la production la plus efficace de L-lysine par la bactérie. Par exemple, la teneur en L-méthionine du milieu est de préférence de 0,01 à 1 g/L.

Comme source d'azote, il est possible d'utiliser des sels d'ammonium inorganiques comme le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium et le phosphate d'ammonium, de l'azote organique comme un hydrolysat de soja, du gaz ammoniac ou de l'ammoniaque.

Comme ions inorganiques (ou comme sources d'ions inorganiques), il est possible d'ajouter au milieu une petite quantité de phosphate de potassium, de sulfate de magnésium, d'ions fer ou d'ions manganèse. Comme matières nutritives organiques à l'état de traces, il est possible d'ajouter au milieu en une quantité appropriée de la vitamine B1 ou un extrait de levure.

La culture est de préférence réalisée pendant environ 16 à 72 h dans des conditions aérobies. La température de culture est régulée à une valeur allant de 25 C à 45 C, et le pH est régulé à une valeur allant de 5 à 8 pendant la culture. Il est possible d'utiliser des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques ou du gaz d'ammoniac pour ajuster le pH.

Après la fin de la culture, la L-lysine peut être recueillie à partir du bouillon de fermentation, par exemple par des procédés typiques utilisant des résines échangeuses d'ions, la précipitation et d'autres procédés connus, en combinaison.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants.

Exemple 1 : Préparation d'une souche auxotrophe pour la L-méthionine à partir d'une souche de bactéries Methylophilusde type sauvage
On a traité une souche de type sauvage de Methylophilus methylotrophus, la souche AS1 (NCIMB 10515), avec de la N-méthyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) pour isoler une souche auxotrophe pour la L-méthionine, comme décrit ci-dessous. Tout d'abord, un jour avant le traitement avec NTG, on a inoculé la souche de type sauvage AS1 à 50 mL de milieu SEII (composition : 1,9 g/L de K2HP04, 5,0 g/L de (NH4)2S04,

<Desc/Clms Page number 17>

1,56 g/L de NaH2P04,2H20, 0,2 g/L de MgS04,7H20, 0,72 mg/L de CaC12,6H20, 5 g/L de CuS04,5H20, 25 ug/L de MnS04,5H20, 23 g/L de ZnS04,7H20, 9,7 mg/L de FeC13,6H20, 1 % (v/v) de méthanol) et on a cultivé pendant une nuit à 37 C sous agitation. On a préparé une solution de NTG à une concentration de 10 mg/ml (en dissolvant de la NTG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)).

Le jour suivant, on a recueilli les cellules cultivées par centrifugation à 4 C, et on a ajouté aux cellules 50 mL de tampon phosphate de potassium 50 mM glacé (pH 7,0) pour les mettre en suspension. Puis, on a centrifugé de nouveau la suspension et on a retiré le surnageant pour laver les cellules une fois. On a mis les cellules en suspension dans 2 ml du même tampon et on les a réparties dans deux tubes Eppendorf en volumes égaux. On a utilisé l'un d'eux pour le traitement avec la NTG et on a utilisé l'autre comme témoin sans traitement avec la NTG. On a ajouté à chaque tube 10 l de la solution de NTG ou d'une solution dans le DMSO ne contenant pas de NTG.

A ce stade, la concentration finale de la NTG dans l'échantillon soumis au traitement avec la NTG était 0,1 mg/mL. On a traité ces échantillons à 37 C pendant 5 min et on les a laissés sur de la glace pendant 2 min, puis on a centrifugé chaque échantillon à 15 000 tr/min pendant 2 min pour recueillir les cellules.

On a lavé deux fois avec du milieu SEII glacé les cellules recueillies à partir de chaque échantillon, puis on les a mises en suspension dans 3 ml de milieu SEII + MT (composition : milieu SEII contenant de la L-méthionine (1 g/L) et de la L-thréonine (10 g/L)) et on les a cultivées pendant une nuit à 37 C. A ce stade, on a extrait une partie de chaque échantillon et on l'a inoculée à du milieu SEII gélosé (composition : milieu SEII contenant 1,5 % (m/v) de gélose), et on a utilisé le nombre de colonies apparues (nombre de bactéries viables) pour calculer le taux de mortalité dû au traitement avec la NTG.

On a représenté le taux de mortalité comme étant le rapport nombre de cellules viables dans l'échantillon soumis au traitement avec la NTG/nombre de cellules viables dans l'échantillon traité seulement avec la solution de DMSO.

Le jour suivant le traitement avec la NTG, on a inoculé une partie du bouillon de culture mentionné précédemment au

<Desc/Clms Page number 18>

milieu SEII + MT et on a incubé à 37 C pour permettre la prolifération des bactéries. Quand la valeur de l'absorbance du bouillon de culture à une longueur d'onde de 660 nm (DO 660 nm) est devenue d'environ 0,5, on a ajouté un même volume de solution de DMSO à 20 % (concentration finale : 10 %) pour la préservation des cellules, et on a agité suffisamment le bouillon de culture puis on l'a conservé à -80 C.

De plus, on a inoculé une partie du bouillon de culture au milieu SEII-MT gélosé et au milieu SE-II gélosé contenant 50 pg/ml d'antibiotique streptomycine (SM), et on a mesuré la fréquence d'émergence de souches résistant à SM, c'est-à-dire le taux de mutation.

On a ainsi déterminé que le taux de mutation était d'environ 4 x 10-6.

On a décongelé à la température ambiante la solution stock de bactéries traitées avec NTG, et on a préparé à partir de celle-ci des dilutions en séries de 1 à 1/107 que l'on a inoculées au milieu SEII-MT gélosé. On a cultivé les cellules à 37 C pendant deux jours, et on a confirmé le degré de dilution conduisant à la formation de 100 à 200 colonies par boîte de gélose. Puis, on a dilué de nouveau la solution stock de bactéries à cette concentration et on l'a inoculée au milieu SEII + MT gélosé. On a cultivé les cellules à 37 C pendant trois jours, puis on a formé des répliques des colonies apparues sur une boîte de milieu SEII gélosé et une boîte de milieu SEII + MT gélosé pour sélectionner les colonies qui pouvaient se développer sur le milieu SEII + MT gélosé mais qui ne pouvaient pas se développer sur le milieu SEII gélosé. Ensuite, on a inoculé les colonies sélectionnées successivement au milieu SEII gélosé, au milieu SEII + M gélosé (composition : milieu gélosé contenant de la L-méthionine (1 g/L) dans le milieu SEII), au milieu SEII + T gélosé (composition : milieu gélosé contenant de la L-thréonine (10 g/L) dans le milieu SEII) et au milieu SEII + MT gélosé, et on a déterminé si l'auxotrophie de ces clones pour des acides aminés était une auxotrophie pour la L-méthionine, pour la Lthréonine ou pour ces deux acides aminés.

On a ainsi pu obtenir deux des souches auxotrophes pour la L méthionine et une des souches auxotrophes pour la L-thréonine que l'on a appelées respectivement souche MR102, souche MR103 et souche TR115. Dans cette expérience, on n'a pu obtenir aucune souche nécessitant les deux acides aminés pour sa croissance.

<Desc/Clms Page number 19>

Exemple 2 [1] Introduction du gène lysE issu d'une bactérie Brevibacterium dans une bactérie Methylophilus (1) Construction de pRSIysE24
Pour introduire dans une bactérie Methylophilus le gène lysE qui code une protéine présentant une activité de sécrétion de lysine dans Corynebacterium glutamicum, on a utilisé le plasmide connu pRS (demande de brevet international publiée en japonais (Kohyo) n 3-501 682) pour construire un plasmide pRSIysE pour l'expression de lyse pRS est un plasmide comportant le segment de vecteur du plasmide pVIC40 (demande de brevet international publiée WO 90/04 636, demande de brevet international publiée en japonais n 3-501 682) et obtenu à partir de pVIC40 par délétion d'une région d'ADN codant l'opéron thréonine contenu dans le plasmide. Le plasmide pVIC40 est dérivé d'un vecteur plasmidique à large gamme d'hôtes pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986,16, 161-167), qui est un dérivé de RSF1010.

Tout d'abord, on a construit à partir de pRS un plasmide pRStac comportant le promoteur tac. On a construit le plasmide pRStac de la manière suivante. On a digéré le vecteur pRS avec les enzymes de restriction EcoRI et PstI et on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN de 8 kilopaires de bases ("kpb") avec la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP version 2 (Takara Shuzo). D'autre part, on a amplifié la région du promoteur tac par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pKK223-3 (vecteur d'expression, Pharmacia) et les amorces montrées dans SEQ ID NO : 1 et 2 en annexe (on a réalisé 30 fois un cycle consistant en une dénaturation à 94 C pendant 20 s, une hybridation à 55 C pendant 30 s et une réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé pour la PCR l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo). On a purifié le fragment d'ADN contenant le promoteur tac amplifié par PCR prep (Promega), puis on l'a digéré au niveau des sites d'enzymes de restriction préalablement conçus dans les amorces, c'est-à-dire au niveau des sites EcoRI et

<Desc/Clms Page number 20>

EcoT22I. Puis on a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN d'environ 0,15 kpb avec EASY TRAP Vers. 2.

En utilisant la trousse de ligature d'ADN version 2 (Takara Shuzo), on a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRS et le fragment de la région du promoteur tac préparé comme décrit ci-dessus. On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E, coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu LB gélosé contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélosé à du milieu LB liquide contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture au moyen du procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRStac. On a choisi comme plasmide pRStac un plasmide dans lequel les sens de transcription du gène de résistance à la streptomycine sur le vecteur pRS et du promoteur tacétaient identiques.

On a digéré pRStac obtenu comme décrit ci-dessus avec Sse83871 (Takara Shuzo) et SapI (New England Biolabs), on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 9,0 kpb.

On a amplifié aussi le fragment de gène lysE par PCR en utilisant comme amorce le chromosome extrait de la souche de Brevibacterium lactofermentum 2256 (Corynebacterium glutamicum ATCC13869) et les amorces montrées dans SEQ ID NO : 5 et 6 en annexe (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 90 s). On a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo) pour la PCR. Pour permettre l'expression du gène lysE dans une bactérie Methylophilus, on a conçu les amorces de

<Desc/Clms Page number 21>

manière que les nucléotides situés à 9-15 pb du codon d'initiation de la traduction du gène lyse puissent être remplacés par une séquence dont on sait qu'elle est active dans une bactérie Methylophilus (Wyborn, N. R., Mills, J., Williamis, S. G. et Jones, C. W., Eur. J. Biochem, 240,314- 322 (1996)). On a purifié le fragment résultant avec PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec Sse83871 et SapI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, puis on les a recueillis encore à partir d'un gel d'agarose à 0,8 %.

On a ligaturé avec la trousse de ligature d'ADN version 2 (Takara Shuzo) le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de la région du gène lysE préparé comme décrit ci-dessus. On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu LB gélosé contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparues sur le milieu gélosé à du milieu LB liquide contenant 20 mg/L de streptomycine et on a cultivé à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir pRSIysE. Dans pRSIysE, le gène lysE était positionné de telle manière que son sens de transcription était le même que celui du promoteur tac.

<Desc/Clms Page number 22>

(2) Introduction de pRSIysE dans une bactérie Methylophilus
On a introduit pRSIysE obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)).

En outre, on a introduit aussi pRS dans la souche AS1 à titre de témoin, de la même manière que pRSIysE. On a ainsi obtenu plusieurs milliers de colonies par ug d'ADN, en utilisant pRS comme témoin, tandis que l'on a obtenu seulement quelques colonies avec pRSIysE.

Quand on a extrait des plasmides de souches transformantes dont on supposait qu'elles contenaient pRSIysE et quand on a étudié leurs séquences nucléotidiques, on a constaté qu'une mutation spontanée était introduite dans la région codante de lyse pour tous les plasmides étudiés, et, dans certains cas, qu'une mutation non-sens ayant un codon codant un acide aminé remplacé par un codon d'arrêt qui terminait la traduction était introduite. De plus, dans d'autres plasmides, on a observé une délétion du gène lysE On a considéré que, dans tous ces cas, la fonction de lyse portée par de tels plasmides était perdue.

Ainsi qu'on l'a décrit ci-dessus, la fréquence d'introduction de pRSIysE portant le gène lysEde longueur intégrale dans Methylophilus methylotrophus était extrêmement faible, et on a pu introduire seulement des plasmides ayant un gène lysE mutant contenant une mutation qui éliminait sa fonction. En considérant ces faits en combinaison, on a estimé que l'introduction du gène lyse dans Methylophilus methylotrophus devait avoir un effet létal. Ceci suggère que le gène lysE ne peut pas fonctionner universellement pour la sécrétion de L-lysine dans des bactéries hétérogènes.

On a appliqué sur la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant pRSIysE comportant une mutation à une boîte de SEII contenant 20 mg/L de streptomycine et on l'a cultivée pendant une nuit à 37 C. Puis, on a recueilli par grattage les cellules sur environ 0,3 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 20 mg/L de streptomycine, et on les a cultivées à 37 C pendant 34 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation et on a déterminé la concentration de L-lysine dans le surnageant de culture au moyen d'un analyseur d'acides aminés (chromatographie liquide à grande vitesse, Nihon Bunko). On n'a obtenu

<Desc/Clms Page number 23>

sensiblement aucune souche dans laquelle la sécrétion de la L-lysine était augmentée, malgré l'introduction du gène lysE mutant.

[2] Obtention d'un gène présentant une activité de sécrétion de L-lysine dans une bactérie Methylophilus
Comme décrit dans la section précédente, il a été suggéré que le gène lysE connu est létal dans les bactéries Methylophilus, de sorte que l'on a obtenu ensuite de nombreux gènes mutants dont la fonction était perdue.

Pendant l'analyse de pRSlysE contenant une mutation, on a obtenu un gène lyse mutant qui était actif dans des bactéries Methylophilus mais qui n'était pas létal.

On a appelé lysE24 ce gène lyse mutant. Quand on a analysé la séquence nucléotidique du gène lysE24, on a constaté que cette mutation ne conduisait pas à une substitution d'acide aminé, mais était une mutation non-sens introduisant un codon d'arrêt au voisinage du centre de la région traduite de lyse Dans lysE24, une thymine (T) était insérée après la guanine (G) à la position 355 du gène lyse de type sauvage présenté dans SEQ ID NO: 17 en annexe. On a appelé pRSIysE24 ce plasmide contenant lysE24.

On a appelé AJ13830 la souche de E, coli JM109 transformée avec pRSIysE24, et on a déposé cette souche auprès du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary le 4 juin 2001 à laquelle le numéro de dépôt FERM P-18369 a été attribué. Dans la suite, le dépôt a été converti en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 13 mai 2002 et s'est vu attribuer le numéro de dépôt FERM BP-8040.

Exemple 3 : construction des plasmides producteurs de lysine pSEAlO et pSEA12 [1] Construction du plasmide pRSdapA contenant le gène dapA*
On a préparé un plasmide contenant un gène (dapA*) codant une dihydrodipicolinate synthase qui n'était pas soumise à une rétro-inhibition par la L-lysine, à titre de gène d'une enzyme du système de biosynthèse de la L-lysine.

<Desc/Clms Page number 24>

On a digéré pRStac préparé dans l'exemple 2 avec Sse83871 et XbaI, on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 9 kpb.

On a utilisé le plasmide connu RSFD80 (voir W090/16042) contenant le fragment de gène dapA* comme matrice pour amplifier dapA* par PCR en utilisant les amorces montrées dans SEQ ID NO: 3 et 4 en annexe (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). Pour la PCR, on a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo). On a purifié le fragment de dapA* obtenu avec PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec les enzymes de restriction Sse83871 et XbaI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 0,1 kpb.

Avec la trousse de ligature d'ADN version 2 (Takara Shuzo) on a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de région de gène dapA * préparé comme décrit ci-dessus. On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E, coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu LB gélosé contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies qui sont apparues sur le milieu gélosé à du milieu LB liquide contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture au moyen du procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et on a déterminé la séquence nucléotidique pour obtenir un plasmide pRSdapA. Dans le plasmide pRSdapA, le gène dapA* était positionné de telle façon que son sens de transcription était le même que celui du promoteur tac.

<Desc/Clms Page number 25>

On a appelé AJ13831 la souche de E coli JM109 transformée avec le plasmide pRSdapA, et on a déposé cette souche auprès du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary le 4 juin 2001 qui s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM P-18370. Puis, le dépôt a été converti en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le
13 mai 2002 et s'est vu attribuer le numéro de dépôt FERM BP-8041.

[2] Construction des plasmides pSEAlO et pSEA12 contenant lysE24 et dapA*
On a construit un plasmide consistant en le plasmide pRSIysE24 dans lequel était inséré le gène dapA* pour évaluer l'effet de la combinaison de lysE24 et de dapA*
On a digéré pRSIysE24 préparé dans l'exemple 2 avec l'enzyme de restriction SapI, et on l'a muni d'extrémités franches avec la trousse DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). On a digéré le plasmide pRSdapA contenant dapA* avec les enzymes de restriction EcoRI et SapI, et on a séparé sur un gel d'agarose à 0,8 % un fragment d'environ 1 kpb contenant le promoteur tac et la région de dapA*. On a recueilli ce fragment avec la trousse EASY TRAP version 2 (Takara Shuzo). On a muni ce fragment d'extrémités franches de la manière décrite ci-dessus et on l'a ligaturé au produit de digestion de pRSIysE24 mentionné précédemment avec la trousse de ligature d'ADN version 2 (Takara Shuzo).

On a utilisé la solution de réaction de ligature mentionnée précédemment pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E, coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur une boîte de milieu LB gélosé contenant 20 mg/L de streptomycine. Après avoir incubé la boîte de gélose pendant une nuit à 37 C, de nombreuses colonies sont apparues sur le milieu gélosé. Parmi celles-ci, on a inoculé une colonie dans du milieu LB liquide contenant 20 mg/L de streptomycine et on l'a cultivée à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir les plasmides pSEAlO et pSEA12. Dans ces plasmides, le gène lysE24 et le gène dapA* étaient positionnés de telle manière qu'ils présentaient des

<Desc/Clms Page number 26>

sens de transcription inverses l'un de l'autre dans le premier, et les mêmes sens de transcription dans le second.

Exemple 4 : introduction de pSEA12 dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 et des souches auxotrophes pour la L-méthionine (souche MR102 et souche MR103) (effet de l'auxotrophie pour la L-méthionine sur la production de lysine)
On a introduit le plasmide contenant les gènes dans la souche sauvage AS1 de Methylophilus methylotrophus et deux des souches auxotrophes pour la L-méthionine, la souche MR102 et la souche MR103, par le procédé de transfert par conjugaison. Le jour précédant le processus de conjugaison, on a cultivé la souche AS1, la souche MR102 et la souche MR103 à titre de souches receveuses dans 15 ml de milieu SEII + M (composition : milieu SEII contenant 0,5 g/L de L-méthionine). On a inoculé la souche de E coli HB101 contenant pRK2013 à 10 ml de milieu LB (Km) (milieu LB contenant 25 pg/ml de kanamycine) à titre de mobilisateur, on a inoculé la souche de E coli JM109 contenant pSEA12 à 3 mL de milieu LB (Sm) (milieu LB contenant 20 g/ml de streptomycine) à titre de donneur, et on les a cultivées.

Le jour suivant, on a centrifugé chaque bouillon de culture pour recueillir les cellules, on a lavé les cellules 1 fois avec du milieu LB pour la souche de E coli HB101 contenant pRK2013 et la souche de E coliJM109 contenant pSEA12. En outre, pour trois souches de bactéries utilisant le méthanol mentionnées précédemment, on a recueilli également les cellules puis on les a lavées avec du milieu SEII. Ensuite, on a mis en suspension dans du milieu LB les cellules de E coli de chaque type, et on a mis en suspension dans du milieu SEII les cellules des bactéries utilisant le méthanol. Puis, on a mélangé des volumes appropriés des suspensions sur du milieu LB gélosé au moyen d'une anse et on les a incubées à 37 C pendant 4 h pour permettre le transfert par conjugaison de pSEA12 dans la souche AS1, la souche MR102 et la souche MR103.

Ensuite, on a séparé par grattage les cellules de chaque souche du milieu gélosé et on les a étalées sur du milieu SEII + M (Sm) gélosé (composition du milieu : milieu SEII + M gélosé contenant Sm (50 g/ml)) et on les a cultivées à 37 C pendant deux jours pour sélectionner des transformants. On a étalé encore 2 fois, sur du milieu SEII + M (Sm)

<Desc/Clms Page number 27>

gélosé frais, chaque colonie individuelle qui est apparue sur le milieu, pour isoler la souche MR102(pSEA12) et la souche MR103(pSEA12) à titre de souches recherchées, et la souche AS1 (pSEA12) à titre de souche témoin.

On a appliqué chacune de ces souches à une boîte de milieu SEII + M (Sm) gélosé et on l'a cultivée pendant une nuit à 37 C.

Puis, on a retiré les cellules par grattage sur environ 3 cm2 de milieu, on les a inoculées au milieu de production SEII (20 ml) contenant de la L-méthionine à différentes concentrations et on les a cultivées à 37 C pendant 48 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation et on a déterminé la concentration de L-lysine dans le surnageant de culture au moyen d'un analyseur d'acides aminés (chromatographie liquide à grande vitesse, Nihon Bunko). Il est ainsi apparu que l'accumulation de L-lysine dans le milieu obtenu avec la souche AS1(pSEA12) était d'au plus 0,96 g/L. Cependant, la souche MR102 et la souche MR103 dans lesquelles pSEA12 avait été introduit présentaient des accumulations de L-lysine dans le milieu de 1,675 g/L et 1,57 g/L, respectivement, quand on a ajouté 0,075 g/L de L-méthionine au milieu de production, de sorte que l'accumulation de L-lysine dans le milieu était nettement améliorée.

Exemple 5 : préparation d'une souche auxotrophe pour la L-méthionine (souche MR701) à partir de la souche AS1 de Methylophilus methylotrophus et préparation d'une bactérie produisant de la lysine par introduction de pSEAlO dans la même souche.

[1] Préparation d'une souche dans laquelle le gène metA est coupé
A partir de la souche AS1 de Methylophilus methylotrophus, on a préparé un fragment pour la coupure de gène en vue d'obtenir une souche auxotrophe pour la L-méthionine par coupure de gène.

Comme gène destiné à être coupé, on a choisi une région de gène qui présente une grande homologie avec le gène met4 de la souche H37Rv de Mycobacterium tuberculosis (n d'accès GenBank CAA17113), dont on suppose qu'elle code l'homosérine o-acétyltransférase. On peut amplifier cette région par PCR en utilisant les amorces d'ADN montrées dans SEQ ID NO: 7 et 10 en annexe (conditions de la réaction : on a utilisé la

<Desc/Clms Page number 28>

Tac polymérase de Takara, et on a appliqué 25 fois un cycle d'étapes réactionnelles de dénaturation à 94 C pendant 30 s, d'hybridation à 60 C pendant 30 s et de réaction d'extension des brins d'ADN à 72 C pendant 4 min). La séquence d'ADN de la région et la séquence d'acides aminés codée par cette région d'ADN sont montrées dans SEQ ID NO: 15 et 16 en annexe, et on a identifié le gène comme étant le gène metA.

Pour obtenir un ADN chromosomique à partir de la souche de type sauvage AS1, on a inoculé la souche AS1 à 50 ml de milieu SEII (composition : 5 g/L de (NH4)2S04, 1,9 g/L de K2HP04, 1,56 g/L de NaH2P04,2H20, 200 mg/L de MgS04,7H20, 72 mg/L de CaCl2,6H2O, 5 g/L de CuS04,5H20, 25 g/L de MnS04,5H20, 23 pg/L de ZnS04,7H20, 9,7 mg/L de FeC13,6H20, 0,5 % (v/v) de méthanol) et on a cultivé pendant une nuit à 37 C sous agitation. Puis, on a centrifugé le bouillon de culture pour recueillir les cellules, et on a préparé un ADN chromosomique au moyen d'une trousse du commerce (Genomic DNA Purification Kit (produite par Edge Biosystems)).

On a utilisé comme matrice l'ADN chromosomique obtenu et les amorces d'ADN montrées dans SEQ ID NO: 7 et 8 pour réaliser une PCR (conditions de la réaction : on a utilisé la Tac polymérase de Takara, et on a répété 25 fois un cycle consistant en les étapes réactionnelles de dénaturation à 94 C pendant 30 s, d'hybridation à 60 C pendant 30 s et de réaction d'extension des brins d'ADN à 72 C pendant 2 min) pour obtenir ainsi un fragment d'environ 1,3 kb. On a réalisé aussi une PCR avec les amorces montrées dans SEQ ID NO: 9 et 10 dans les mêmes conditions, pour obtenir un fragment d'ADN d'une taille d'environ 2,0 kb.

On a réalisé également une PCR avec le plasmide pKD4 (n d'accès GenBank AY048743, Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., U. S. A., 97 (12), 6640-6645,2000) comme matrice et les amorces montrées dans SEQ ID NO: 11 et 12 en annexe dans les mêmes conditions que celles mentionnées précédemment pour obtenir un fragment d'ADN contenant un gène de résistance à la kanamycine (environ 1,5 kb).

On a mélangé les trois types de fragments d'ADN mentionnés ci-dessus et on les a utilisés comme matrice en même temps que les amorces montrées dans SEQ ID NO: 13 et 14 pour réaliser une PCR (conditions réactionnelles : on a utilisé la Tac polymérase de Takara et on

<Desc/Clms Page number 29>

a répété 25 fois un cycle consistant en les étapes réactionnelles de dénaturation à 94 C pendant 30 s, d'hybridation à 60 C pendant 30 s et de réaction d'extension des brins d'ADN à 72 C pendant 4 min et 30 s) pour obtenir ainsi un fragment d'environ 4,2 kb. On a purifié le fragment au moyen d'une trousse du commerce (Wizard PCR Preps DNA Purification System produit par Promega) puis on l'a soumis à une précipitation à l'éthanol, et on a mis le précipité en suspension dans TE. On a utilisé cette solution d'ADN dans l'opération suivante comme fragment pour la coupure de gène. Ce fragment de gène avait une structure consistant en le gène metA dans lequel était inséré le gène de résistance à la kanamycine.

Puis, on a introduit le fragment de gène décrit ci-dessus dans la souche AS1 de Methylophilus methylotrophus. Pour la transformation, on a utilisé le procédé d'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). Après l'électroporation, on a appliqué les cellules à du milieu SEII gélosé (on a ajouté 20 mg/L de kanamycine et 0,5 g/L de L-méthionine). Au bout de 48 h de culture, plusieurs dizaines de colonies sont apparues. Parmi elles, on a choisi au hasard 13 souches dont on a examiné l'auxotrophie pour la L-méthionine. Il est apparu que toutes les souches présentaient une auxotrophie pour la L-méthionine. On a appelé souche MR701 la souche auxotrophe pour la L-méthionine obtenue par la coupure de gène.

On a confirmé par le procédé PCR la coupure du gène voulu.

Pour ce faire, on a mis en suspension les colonies précédentes dans 20 l d'eau stérilisée, on a ajouté 5 l de protéinase K à 1 mg/ml et 25 l de tampon (Tris 40 mM, Tween 20 0,5 %, Nonidet P-40 1 %, EDTA 1 mM (ajusté à pH 8,0 avec HCI)) puis on a fait réagir à 60 C pendant 20 min et à 95 C pendant 5 min. On a utilisé ce mélange réactionnel comme matrice pour la PCR. On a réalisé la PCR en utilisant comme amorces les séquences montrées dans SEQ ID NO: 7 et 10 en annexe (conditions réactionnelles : on a utilisé la Tac polymérase de Takara, et on a répété 25 fois un cycle consistant en les étapes réactionnelles de dénaturation à 94 C pendant 30 s, d'hybridation à 60 C pendant 30 s et de réaction d'extension des brins d'ADN à 72 C pendant 4 min et 30 s) pour confirmer la coupure du gène voulu.

<Desc/Clms Page number 30>

[2] Evaluation de la productivité de L-lysine d'une souche contenant un gène metA coupé
On a introduit pSEAlO décrit dans l'exemple 3 dans la souche MR701 obtenue comme décrit ci-dessus, et on a examiné la production de L-lysine par la souche. On a introduit pSEAlO dans la souche MR701 par électroporation, et on a appelé MR701(pSEA10) le transformant ainsi obtenu. On a étalé la souche ASl(pSEAlO) sur du milieu SEII (Sm) gélosé (milieu SEII contenant 50 pg/ml de streptomycine), et on a étalé la souche MR701 (pSEAlO) sur du milieu SEII + M (Sm Km) gélosé (milieu SEII contenant 0,5 g/L de L-méthionine, 50 g/ml de streptomycine et 20 pg/ml de kanamycine). Après avoir cultivé les cellules pendant une nuit à 37 C, on a prélevé les cellules par grattage sur environ 3 cm2 de la surface du milieu, on les inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 0,075 g/L de L-méthionine (on a ajouté 50 g/ml de streptomycine) et on les a cultivées à 37 C pendant 48 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation et on a déterminé la concentration de L-lysine dans le surnageant de culture en utilisant un analyseur d'acides aminés (chromatographie liquide à grande vitesse, Nihon Bunko). On a ainsi trouvé que l'accumulation de L-lysine dans le milieu de la souche AS1(pSEA12) était de 0,97 g/L, tandis que la souche MR701(pSEA10) présentait une accumulation de L-lysine dans le milieu de 1,52 g/L, de sorte que l'on a pu confirmer que la production de L-lysine était améliorée du fait que l'on avait conféré une auxotrophie pour la L-méthionine.

Légende de la liste de séquences SEQ ID NO: 1 : amorce pour l'amplification de la région du promoteur tac SEQ ID NO: 2 : amorce pour l'amplification de la région du promoteur tac SEQ ID NO: 3 : amorce pour l'amplification du gène dapA* SEQ ID NO: 4 : amorce pour l'amplification du gène dapA* SEQ ID NO: 5 : amorce pour l'amplification du gène lysE SEQ ID NO: 6 : amorce pour l'amplification du gène lysE SEQ ID NO: 7 : amorce pour l'amplification du gène metA

<Desc/Clms Page number 31>

SEQ ID NO: 8 : amorce pour l'amplification du gène metA SEQ ID NO: 9 : amorce pour l'amplification du gène metA SEQ ID NO: 10 : amorce pour l'amplification du gène metA SEQ ID NO: 11 : amorce pour l'amplification du gène de résistance à la kanamycine SEQ ID NO: 12 : amorce pour l'amplification du gène de résistance à la kanamycine SEQ ID NO: 13 : amorce pour l'amplification du fragment pour la coupure du gène metA SEQ ID NO: 14 : amorce pour l'amplification du fragment pour la coupure du gène metA SEQ ID NO: 15 : séquence nucléotidique de metA SEQ ID NO: 16 : séquence d'acides aminés codée par metA SEQ ID NO: 17 : séquence de nucléotide de lysE SEQ ID NO: 18 : séquence d'acides aminés codée par lysE

Claims (7)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour produire de la L-lysine, caractérisé en ce qu'il comprend a) la culture d'une bactérie utilisant le méthanol qui nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et qui est capable de produire de la L-lysine dans un milieu contenant du méthanol comme principale source de carbone, b) l'accumulation de L-lysine dans la culture, et c) la récupération de la L-lysine à partir de la culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie est une bactérie Methylophilus.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite bactérie Methylophilus est Methylophilus methylotrophus.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que ladite bactérie Methylophilus est modifiée de manière à stimuler l'activité enzymatique de la diaminopimélate synthétase et le système de sécrétion de L-lysine.

5. Bactérie Methylophilus, caractérisée en ce qu'elle nécessite de la L-méthionine pour sa croissance et en ce qu'elle est capable de produire de la L-lysine.

6. Bactérie Methylophilus selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie Methylophilus methylotrophus.

7. Bactérie Methylophilus selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisée en ce qu'elle est modifiée pour stimuler l'activité enzymatique de la diaminopimélate synthétase et le système de sécrétion de L-lysine.