DE19822122A1

DE19822122A1 - Humane deadenylierende Nuclease, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19822122A1
Application number: DE19822122A
Authority: DE
Inventors: Christopf Huels; Karl-Christian Gallert; Christof G Koerner; Elmar Wahle
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 1999-12-23
Also published as: WO1999058647A3; PL345310A1; NZ507993A; AU758898B2; HUP0101805A2; AU4258399A; JP2002514410A; EP1084234A2; KR20010043415A; WO1999058647A2; CA2328492A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, kodierend für eine humane deadenylierende Nuclease (DAN) mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine humane deadenylierende Nuclease (DAN), ihre kodierende Nukleinsäure sowie ihre Herstellung und Verwendung.

Die intrazelluläre Konzentration von mRNA scheint nicht nur durch die Produktions- sondern auch durch die Abbaurate kontrolliert zu sein. Dabei scheinen mRNAs nicht durch ein zufäl liges nukleolytisches Ereignis, sondern durch spezifische Mechanismen und durch Abbaura ten, die spezifisch für die jeweilige RNA sind, abgebaut zu werden. Zur Zeit sind zwei unter schiedliche Abbauwege bekannt, in denen die Poly(A)-Schwänze eine besondere Rolle spie len. In E. coli werden poly(A)-Schwänze an mRNAs oder mRNA-Fragmente angehängt, die durch die RNAse E generiert werden. Der poly(A)-Schwanz scheint als eine relativ unstruktu rierte Einheit zu fungieren, die für die Anlagerung eines Komplexes verantwortlich ist, der neben anderen Proteinen eine prozessive 3'-Exonuclease, die eine Polynucleotid- Phosphorylase darstellt, und eine RNA-abhängige ATPase enthält, welche der Exonuclease hilft, inhibierende Sekundärstrukturen in der mRNA zu umgehen. Ein ähnlicher Mechanis mus scheint in Chloroplasten zu wirken.

In Eukaryonten leitet die exonukleolytische Verkürzung des poly(A)-Schwanzes ebenfalls den Abbau von vielen, aber nicht allen mRNAs ein. In Gegensatz zu dem Prozeß in Bakterien scheint die poly(A)-abbauende Exonuclease nicht in die 3'-UTR und die kodierende Sequenz in ihrem Abbau fortzuschreiten. Statt dessen scheint die eukaryotische Exonuclease nach Ab bau des poly(A)-Schwanzes anzuhalten. Bei S. cerevisiae beinhaltet der zweite Schritt des mRNA-Abbaus die Entfernung der 5'-Cap-Struktur durch eine spezifische Pyrophosphatase. Allerdings findet die Entfernung des CAPs erst nach der einer Verkürzung des poly(A)- Schwanzes auf ca. 10-15 Nukleotide statt. Die Entfernung der CAP-Struktur macht die mRNA für 5'-Exonucleasen, deren wichtigster Vertreter durch das XRN1-Gen codiert wird, zugänglich.

Die Beobachtung des initialen Deadenylierungsprozesses in Säugetierzellen ist relativ ein fach, während eine Untersuchung der weiteren Schritte durch die Schnelligkeit der nachfol genden Abbauprozesse und das Fehlen von analysierbaren Zwischenprodukten erschwert wird. Indirekte Beweise sprechen aber dennoch für eine Entfernung der CAP-Struktur im zweiten Schritt. Ein Homolog aus der Maus ist für das XRNI-Gen beschrieben worden. Im allgemeinen werden stabile mRNAs langsam und instabile mRNAs schnell deadenyliert. Der schnelle Abbau hängt von dem Vorkommen von bestimmten destabilisierenden Sequenzen in dem 3'-UTR oder in der codierenden Sequenz ab. Mutationen in diesen Sequenzen führen zudem nicht nur zu einer Stabilisierung der mRNA, sondern ebenso auch zu einer verlang samten Deadenylierung. Im Gegensatz dazu führt eine Inaktivierung eines stabilisierenden Elements der α-Globulin mRNA zu einer Instabilität und zu einer beschleunigten Deadeny lierung. Diese Daten sprechen eindeutig für eine Kontrolle des mRNA-Abbaus durch die Deadenylierungsrate.

Die Deadenylierung von bestimmten mRNAs kann ebenfalls zu einer Inaktivierung der Translation führen. Dies ist durch die Bedeutung des poly(A)-Schwanzes für die Initiation der Translation zu erklären. Die Deadenylierung als Translationskontrollmechanismus spielt bei der Reifung von Oozyten und der frühen Embryogenese in vielen tierischen Spezies eine ent scheidende Rolle. Zum Beispiel wird bei Drosophila die Polarität des Embryos durch die Deadenylierung der sogenannten hunchback mRNA reguliert.

In Vertebraten können grundsätzlich drei Deadenylierungsreaktionen in der Oozytenreifung und frühen Embryogenese unterschieden werden:

1. In unreifen Oozyten werden die meisten mRNAs in einer translational inaktiven Form mit kurzen poly(A)-Schwänzen gespeichert. Ein Beispiel ist die mRNA für tPA (tissue plas minogen activator) in der Maus. Zunächst erhält diese mRNA einen langen poly(A)- Schwanz in der normalen Polyadenylierungsreaktion, der dann durch Deadenylierung in einen Oligo(A)-Schwanz verkürzt wird. Diese Verkürzung wird durch Sequenzen im 3'- UTR gesteuert.
2. Bei der Reifung von Oozyten wird die Deadenylierung zur Inaktivierung bestimmter mRNAs verwendet, die ursprünglich lange poly(A)-Schwänze hatten und in der frühen Eientwicklung aktiv waren. Die Deadenylierung ist nicht von spezifischen Sequenzen in der mRNA abhängig. Alle mRNAs werden deadenyliert, außer sie werden durch einen aktiven Adenylierungsprozess geschützt.
3. Während der frühen Embryogenese werden bestimmte mRNAs in einer spezifischen Re aktion deadenyliert, die ebenfalls spezifische Sequenzen im 3'-UTR benötigt.

Alle drei Deadenylierungsreaktionen finden im Cytoplasma statt. Allerdings bleiben in Ge gensatz zu somatischen Zellen die oligoadenylierten oder deadenylierten mRNAs in Oozyten stabil und werden erneut adenyliert oder erst in späteren Entwicklungsstadien abgebaut.

Bisher sind die für diese Reaktionen verantwortlichen Enzyme nicht eindeutig identifiziert worden. In der Hefe konnte gezeigt werden, daß der Abbau von poly(A) direkt oder indirekt vom poly(A) binding protein (PAB1) abhängt. Obwohl eine PAB1-abhängige Po ly(A)nuclease (PAN) gereinigt worden ist (Sachs, A. B. & Deardorff (1992) Cell, 70, 961; Lowell, J. E. et al. (1992) Genes Dev., 6, 2088), konnten bei Mutanten der betreffenden Gene (PAN2 und PAN3) nur geringe Defekte in der Deadenylierung festgestellt werden (Boeck, R. et al. (1996) 271 (1), 432; Brown, C. et al. (1996) 16 (10) 5744).

Körner, Ch.G. & Wahle, E. (1997) J. Biol. Chem., 272, 10448, No. 16 beschreiben eine Mg2+- abhängige Poly(A)-spezifische 3'-Exoribonuclease aus Kalbsthymus mit einem Molekular gewicht von 74 kDa, die auch als deadenylierende Nuclease (DAN) bezeichnet wurde. Die beschriebene DAN aus Kalbsthymus wird durch das cytoplasmatische Poly(A)-bindende Protein I (PAB I) unter bestimmten Reaktionsbedingungen stimuliert (Körner, Chr. & Wahle, E. (1997), supra) und bevorzugt als Substrat Poly(A).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine humane Poly(A)-spezifische 3'- Exoribonuclease bereitzustellen.

In einer Genbank wurde nun überraschenderweise ein nicht näher charakterisierter und nur ansequenzierter Klon gefunden, der gemäß der vorliegenden Erfin dung für eine humane deadenylierende Nuclease (humane DAN) kodiert.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäure kodierend für eine humane DAN mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 15 oder 20 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 100 Nukleotiden, vor allem mit mindestens 300 Nukleotiden (nachfolgend "erfindungsgemäße Nukleinsäure" genannt).

Die vollständige Nukleinsäure kodiert für ein Protein mit 639 Aminosäuren und einer mole kularen Masse von 73,5 kDa. Die Expression der Nukleinsäure in E. coli führte zu einem Protein, welches ähnliche enzymatische Aktivitäten wie die von Körner, Ch.G. & Wahle, E. (1997, supra) beschriebene DAN zeigt. Weitere Experimente gemäß der vorliegenden Erfin dung bestätigten, daß es sich bei der Nukleinsäure um eine Nukleinsäure handelt, die für eine humane DAN kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure wurde am 25. März 1998 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 12075 hinterlegt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA, und insbesondere eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 von Pos. 58 bis Pos. 1977. Die beiden Positionen be stimmen gemäß der vorliegenden Erfindung den Start und das Ende des kodierenden Berei ches.

Unter dem Begriff "funktionelle Variante" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die funktionell mit der humanen DAN-kodierenden Nukleinsäure ver wandt und insbesondere humanen Ursprungs ist. Beispiele verwandter Nukleinsäuren sind bespielsweise Nukleinsäuren aus unterschiedlichen humanen Zellen bzw. Geweben oder alle lische Varianten. Auch umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten von Nukleinsäuren, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen können.

Im weiteren Sinne versteht man unter dem Begriff "Varianten" gemäß der vorliegenden Er findung Nukleinsäuren, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 60%, vorzugsweise von ca. 75%, insbesondere von ca. 90% und vor allem von ca. 95% aufweisen.

Die Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäure können beispielsweise zur Herstellung ein zelner Epitope, als Sonden zur Identifizierung weiterer funktioneller Varianten oder als Anti sense-Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise eignet sich eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 8 Nukleotiden als Antisense-Nukleinsäure, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 1 S Nukleotiden als Primer beim PCR-Verfahren, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 20 Nukleotiden für die Identifizierung weiterer Varianten und eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 100 Nukleotiden als Sonde.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine Poly(A)-Sequenz. Die nicht kodierenden Sequenzen sind beispielsweise Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, zur kontrollierten Expression des humanen DAN kodierenden Gens.

In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure daher in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressi onsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher für einen N terminalen Met-Ala-His6-Tag kodiert, der eine vorteilhafte Reinigung des exprimierten Pro teins über eine Ni²⁺-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767), für die Expression in Insek tenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. SV40-Vektoren, welche allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die Wirtszelle geeignete regulato rische Sequenzen, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (s. z. B. EP-B1- 0154133), den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzel len (s. z. B. EP-B1-0127839) oder den frühen SV40-Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981) Nature, 214, 228).

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Ade novirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoasso ziierte Virusvektoren, z. B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.

Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, W. J. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J. 5, 2377 oder WO95/00655 beschrieben.

Geeignete Adenoassoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO95/23867; Samulski, R. J. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95123867; Chiorini, J. A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfin dungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischun gen wie bei Felgner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 7413; Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen ge bunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise chemisch anhand der in Fig. 2 offenbarten Sequenz oder anhand der in Fig. 1 offenbarten Peptidsequenz unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (s. z. B. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4). Eine weitere Möglich keit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, anhand einer geeig neten Sonde (s. z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträn gige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100 bis 1000 Nucleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200 bis 500 Nucleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300 bis 400 Nucleotiden, deren Sequenz aus der Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 1 abgeleitet wer den kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Polypeptid selbst mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 oder einer funktionellen Variante davon, und Teile davon mit mindestens sechs Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 12 Aminosäuren, insbe sondere mit mindestens 65 Aminosäuren und vor allem mit 638 Aminosäuren (nachfolgend "erfindungsgemäßes Polypeptid" genannt). Beispielsweise kann ein ca. 6-12, vorzugsweise ca. 8 Aminosäuren-langes Polypeptid ein Epitop enthalten, das nach Kopplung an einen Trä ger zur Herstellung von spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörper dient (siehe hierzu z. B. US 5,656,435). Polypeptide mit einer Länge von mindestens ca. 65 Aminosäuren kön nen auch direkt ohne Träger zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Antikörper dienen. Unter dem Begriff "funktionelle Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Peptid verwandt sind, d. h. eine Po ly(A)-spezifische 3'-Exoribonucleaseaktivität aufweisen und vorzugsweise unter zwei ver schiedenen Reaktionsbedingungen aktiv sind. Bei der ersten Reaktionsbedingung ist in Ab wesenheit von Salz die Aktivität vollständig von der Anwesenheit von Spermidin abhängig.

Im Gegensatz hierzu ist in Abwesenheit von Spermidin die Aktivität des Enzyms von der Salzkonzentration abhängig. Zudem kann in Anwesenheit von PAB 1 unter bestimmten Re aktionsbedingungen ein stufenweiser Abbau des Poly(A)-Schwanzes beobachtet werden (siehe auch Körner, Chr. G. & Wahle, E. (1997), supra). Insbesondere unterscheiden sich die vorherrschenden Abbauprodukte in ihrer Länge um ca. 30 Nukleotide. Unter Varianten ver steht man auch allelische Varianten oder Polypeptide, die von anderen menschlichen Zellen bzw. Gewebe abstammen. Auch versteht man darunter Polypeptide, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen.

Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, ins besondere eine Sequenzidentität von ca. 70%, vorzugsweise von ca. 80%, insbesondere von ca. 90%, vor allem von ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 2 haben. Ferner zählen hierzu auch Deletion des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vor zugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Po lypeptids wesentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion einer humanen DAN haben oder erst nach Abspaltung des Fusi onsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionspro teine mit einem Anteil von insbesondere nicht-humanen Sequenzen von ca. 1-200, vorzugs weise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 Aminosäuren. Beispiele von nicht-humanen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, z. B. aus der Galacto sidase von E. coli oder ein sogenannter Histidin-Tag, z. B. ein Met-Ala-His6-Tag. Ein Fusi onsprotein mit einem sogenannten Histidin-Tag eignet sich besonders vorteilhaft zur Reini gung des exprimierten Proteins über Metallionen-haltige Säulen, beispielsweise über eine Ni²⁺-NTA-Säule. "NTA" steht für den Chelator "nitrilotriacetic acid" (Qiagen GmbH, Hilden).

Die Teile des erfindungsgemäßen Polypeptids repräsentieren beispielsweise Epitope, die spe zifisch von Antikörpern erkannt werden können.

Durch Vergleich mit bekannten Nucleasen wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Polypeptid ein Mitglied der sogenannten RNaseD-Familie ist. Fig. 7 zeigt die konservierten Aminosäuren der Exo I, Exo II und Exo III Motive, die für diese Klasse von Exonucleasen charakteristisch sind. Andere konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt. Die drei sauren Aminosäureseitenketten, zwei in der Exo I Domäne und eine in der Exo III Domäne, sind direkt in der Bindung der zwei Mg²⁺-Ionen, die an der enzymatischen Hydrolyse beteiligt sind, involviert. Eine dritte saure Aminosäureseitenkette, die in der Exo II Domäne lokalisiert ist, bindet eines der Metallionen über Wasserbrückenmoleküle. All diese Aminosäurereste sind innerhalb der Familie hoch konserviert und werden auch in der erfindungsgemäßen hu manen DAN gefunden. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann daher als eine Poly(A)- spezifische 3'-Exoribonuclease der RNaseD-Familie bezeichnet werden.

Das erfindungsgemäße Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der erfindungsge mäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB 101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera Frugiperda, oder tierische Zellen wie COS, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Insbesondere die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Mernfield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht wer den können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei eine erfindungsgemäße Nuklein säure in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und gegebenenfalls isoliert wird.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid spezifisch reagieren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Koppelung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können.

Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein be kannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freunds Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (s. z. B. Dia mond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschlie ßend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säu lenchromatographie reinigen. Bevorzugt wird eine Affinitätsreinigung der Antikörper, bei der beispielsweise das C-terminale DAN-Fragment an eine NHS-aktivierte HiTrap-Säule gekop pelt wurde.

Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293) hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine erfin dungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls ge eignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chroni sche Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und /oder zur Beeinflussung des Zellmetabo lismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, beispielsweise eine sogenannten Antisense- Nukleinsäure, oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit pharmazeutisch annehmbaren Zu satz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.

Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komple xierter Form enthält.

Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z. B. eine physiologische Kochsalzlö sung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsge mäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe und ein Verfah ren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklero se, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und /oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantatio nen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen versetzt werden.

Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR- Diagnostik, z. B. gemäß EP-0200362) oder eines Northern Blots, wie in Beispiel 5 näher be schrieben, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit dem komplementären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z. B. in EP0063879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes DNA- Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z. B. radioaktiv mit α-P32-dATP oder nicht radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugsweise an geeignete Membranen aus z. B. Zellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft, die isolierte RNA vor der Hybridisierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z. B. mittels Agarose-Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.

Ein weiteres Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. Teile davon, die vorzugswei se an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispiels weise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörper reagieren zu können. Der Antikör per-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwe senheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörpern kann somit über die Farbreak tion leicht und schnell nachgewiesen werden.

Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Menschen leicht und schnell dahinge hend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid vorhanden ist. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrie ben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Test zur Identifizie rung funktioneller Interaktoren, wie z. B. Inhibitoren oder Stimulatoren, enthaltend eine erfin dungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren ist z. B. das sogenannte "Two-Hybrid System" (Fields, 5. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Genetics, 10, 286). Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expres sionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimieren, das das er findungsgemäße Polypeptid und eine DNA-Bindedomäne eines bekannten Proteins, bei spielsweise von Gal4 oder LexA aus E. coli, enthält und/oder ein Fusionsprotein exprimieren, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Ga14, Herpesvirus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das LacZ-Gen aus E. coli, "Green Fluorescence Protein" oder die Aminosäure-Biosynthesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Sequenzen, wie z. B. den lexA-Promotor/Operator oder durch eine sogenannte "Upstream Activation Se quence" (UAS) der Hefe kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird beispielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, stammt. Üblicherweise wird gleich eine cDNA-Genbank mit Hilfe der beschriebe nen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmittelbar danach durchgeführt werden kann.

Beispielsweise wird in einem Hefe-Expressionsvektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die lexA-DNA-Bindedomäne klo niert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und der LexA-DNA- Bindedomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe- Expressionsvektor werden cDNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank in funktioneller Ein heit an. die Nukleinsäure kodierend für die Ga14-Transkriptions-Aktivierungsdomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der Gal4-Transkriptions- Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressi onsvektoren transformierte Hefe, die beispielsweise Leu2^- ist, enthält zusätzlich eine Nu kleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Promotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA-Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu1 Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.

Bei Verwendung des LacZ- bzw. "Green Fluorescence Protein"-Reportergens anstelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Transkription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blau- bzw. grün-fluoreszierende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluores zenzfärbung läßt sich aber auch leicht im Spectrophotometer z. B. bei 585 nM im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.

Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Polypeptide durch sucht werden, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid interagieren. Anschließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakterisiert werden.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des "Two-Hybrid-Systems" ist die Beeinflussung der Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem bekannten oder unbe kannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z. B. chemische Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue wertvolle chemisch synthetisierbare Wirkstoffe auffinden, die als Therapeutikum eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von polypeptidartigen Interaktoren bestimmt, sondern erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben be schriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Derartige peptidartige, wie auch chemische Interaktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindung als funktionelle Interaktoren bezeichnet, die eine inhibierende oder eine stimulierende Wirkung haben kön nen.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Polypeptids ist der Poly(A)- spezifische Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere von mRNA. Der Poly(A)-spezifische Abbau von Nukleinsäuren kann insbesondere in Forschungslabors Verwendung finden.

Die nachfolgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der humanen DAN Fig. 2 zeigt die Nukleinsäuresequenz der humanen DAN einschließlich Start- und Stoppkodon Fig. 3 zeigt das Elutionsprofil der humanen DAN an MonoQ (Fig. 3A) und SDS-PAGEs (Fig. 3B und C) Fig. 4 zeigt einen Western-Blot von rekombinanter humaner DAN und nativer boviner DAN . Fig. 5 zeigt die Deadenylierung von mRNA, die Akkumulierung von deadenylierter RNA und den Einfluß von PABI Fig. 6 zeigt einen Vergleich bekannter Nucleasen mit der erfindungsgemäßen humanen DAN.

Beispiele 1. Identifizierung von humanen DAN cDNA-Klonen

Die Reinigung von boviner DAN wurde, wie bei Körner, G. & Wahle, E. (1997), supra, be schrieben, wie folgt durchgeführt:

Alle Schritte der Reinigung wurden bei 4°C durchgeführt. Zwischen den Reinigungsschritten wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C eingefroren. Folgender Basispuffer wurde benutzt: 50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 1 mM Dit hiothreitol, 0,4 µgIml Leupeptinhemisulfat, 0,7 µg/ml Pepstatin, 0,5 mM Phenylmethylsul fonylfluorid, 0,02% (v/v) Nonidet P-40, pH 7,9. Bei den verschiedenen Reinigungsschritten wurden diesem Basispuffer unterschiedliche Konzentrationen KCl wie unten beschrieben zugesetzt.

Frischer Kalbsthymus wurde von einem örtlichen Schlachthaus bezogen, auf Eis transportiert und bei -80°C gelagert. Ein kg wurde in 2 l Basispuffer mit 50 mM KCl aufgetaut und in ei nem Waring Blendar Homogenizator zunächst mit kleiner, dann mit mittlerer und schließlich mit höchster Geschwindigkeit homogenisiert. Das Homogenisat wurde 1 h bei 16000 × g zentrifugiert und der Überstand durch eine weitmaschige Gaze dekantiert (Wahle, E., J. Biol. Chem., 266, 1991).

Dieser Extrakt aus Kalbsthymus wurde auf eine DEAE-Sepharose FF Säule (Säulenvolumen 4 l) aufgetragen und mit einem Salzgradienten über das 2,5fache Säulenvolumen von 50 bis 600 mM KCl von der Säule mit einer Flußrate von 3 l/h eluiert. Aktive Fraktionen wurden bei einer Salzkonzentration zwischen 75 und 200 mM KCl von der Säule eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, mit Ammoniumsulfat bis zu einer 30% gesättigten Lösung ver setzt und für 1,5 h auf Eis gerührt. Nach einer Zentrifugation (30 min. 10800 × g, gilt für alle unten erwähnten Zentrifugationsschritte) wurde der Überstand auf 50%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat eingestellt, erneut auf Eis gerührt und zentrifugiert. Das Sediment wurde in 400 ml Basispuffer mit 50 mM KCl resuspendiert und für 10 h gegen 2 × 4,5 l Basispuffer dialysiert und erneut zentrifugiert. Eine 1,4 l Sepharose-Blue Säule (7 × 36 cm) wurde mit Basispuffer mit 50 mM KCl äquilibriert und der dialysierte Extrakt auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 1,5 Bettvolumina von Basispuffer mit 250 mM KCl gewaschen und mit einem Bettvolumen Basispuffer mit 1 M KCl eluiert (Flußgeschwindigkeit 2 l/h).

Die aktiven Fraktionen von zwei Präparationen aus jeweils 1,2 kg Kalbsthymus wurden zu sammengeführt und mit Ammoniumsulfat (60% Sättigung) gefällt. Nach der Zentrifugation wurde das Sediment in 200 ml Basispuffer mit 50 mM KCl aufgenommen, 12 h gegen 3 × 4 l des selben Puffers dialysiert und in zwei Portionen auf eine Heparin-Sepharose Säule (2,5 × 37 cm) aufgetragen. Die Säule wurden mit 1,5 Bettvolumina Basispuffer mit 50 mM KCl gewaschen und anschließend mit 10 Bettvolumina in einem Gradienten bis 500 mM KCl (Flußgeschwindigkeit: 145 ml/h) eluiert. Die DAN Aktivität eluierte zwischen 80 und 150 mM KCl. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen Basispuffer mit 30 mM KCl für 4 h dialysiert. Das Dialysat wurde abzentrifugiert und in zwei Portionen an einer MonoQ FPLC Säule chromatographiert (Bettvolumen 8 ml). Die Säule wurde mit zwei Bettvolumen Basispuffer mit 50 mM KCl gewaschen und anschließend mit einem Gradienten über 320 ml mit einer steigenden Salzkonzentration (Endkonzentration: 500 mM KCl, Flußgeschwindig keit: 2,5 ml/h) von der Säule eluiert. Die DAN-Aktivität eluierte bei ca. 160 mM KCl. Die aktiven Fraktionen (40 ml) wurden vereinigt und für 4 h gegen 2 l Basispuffer mit 30 mM KCl dialysiert, zentrifugiert und auf eine weitere MonoQ-Säule (1 ml Bettvolumen, Flußge schwindigkeit: 0,9 ml/h) aufgetragen. Die an die Säule gebundene DAN-Aktivität wurde mit Basispuffer mit 500 mM KCl eluiert und in vier Portionen auf eine Superdex HR 10/30 FPLC Säule (äquilibriert mit Basispuffer mit 300 mM KCl, Flußgeschwindigkeit: 0,15 ml/h) aufgetragen (Körner, Ch. G. & Wahle, E. (1997), supra).

Verschiedene Fraktionen einer Superdex-Säule, die die DAN Aktivität enthielten, wurden gesammelt und über eine Phenyl-Superose-Säule getrennt (Körner, G. & Wahle, E. (1997), supra). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen Puffer (50 mM Tris HCl, pH 7,9, 1mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 0,4 µg/ml Leupeptin-Hemisulfat, 0,7 µg/ml Pepstatin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonat (PMSF), 0,02% (v/v) Nonidet p-40, 50 mM KCl) dialysiert. Nach Zentrifugation wurde das Dialysat an einer 100 µl Smart MonoQ (PC 1.6/5) Säule aufgetragen. Anschließend wurde mit 200 µl Puffer gewaschen. Die gebun denen Proteine wurden in einem Gradienten mit einer steigenden Salzkonzentration (Endkonzentration 500 mM KCl) über ein Volumen von 40 Säulenbettvolumina eluiert. Die Fraktionen, die positiv für die DAN-Aktivität waren, eluierten bei einer KCl-Konzentration von ca. 200 mM KCl. Die zwei Fraktionen mit der höchsten DAN-Aktivität wurden mittels einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Anschließend folgte eine in-situ Hy drolyse durch die Protease Lys-C, die Auftrennung über HPLC und Sequenzierung der Pepti de. Folgende Sequenzen wurden gefunden:

1. KSFNFYVFPK,
2. KPFNRSSPD(V/K)K,
3. KYAESYWIQTYADYVG sowie
4. eine Mischung aus: KEQEELNDA und KLFLMRVMD.

Die N-terminale Sequenz der gereinigten bovinen DAN konnte nicht bestimmt werden.

Anschließend wurden EST (expressed sequence tags)-Datenbankrecherchen mit Hilfe des BLAST-Programms (NCBI) durchgeführt. Folgende Klone konnten identifiziert werden:

I.M.A.G.E.-Konsortium Klon ID 645295 durch Peptide 1 und 2 und I.M.A.G.E.-Konsortium Klon ID 301901 durch Peptid 3.

Das vollständige Sequenzieren der gefundenen Klone wurde auf einem ABI373A- Sequenziergerät mit dem ABI Dye Terminator Cycle SequencingKit durchgeführt.

Hierbei wurde gefunden, daß der I.M.A.G.E.-Konsortium Klon ID 301901 für die 176 C terminalen Aminosäuren von DAN und den gesamten 3'-UTR kodiert, während LM. A. G. E.- Konsortium Klon ID 645295 den gesamten ORF und den 5'UTR und einen Teil des 3'-UTR kodiert, was einem Protein von 639 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 73,5 kDa entspricht (Fig. 2). Die 57 Nukleotide, die stromaufwärts vom ersten AUG Codon liegen ent halten kein Stop-Codon im Leseraster. Die dieses AUG-Codon umgebenden Sequenzen (AGAAUGG) entsprechen den sogenannten Kozak-Regeln (Kozak, 1991), die für den Translationsstart bevorzugte Startsequenzen beschreiben. Ein 3'-UTR von 0,7 kB ist im cDNA-Klon 645 295 und ein poly(A)-Schwanz ist am Ende des cDNA-Klons 301901 zu fin den. Dem poly(A)-Schwanz geht stromaufwärts das seltene Polyadenylierungssignal AU- UAAA voraus (Fig. 1).

2. Herstellung von Expressionsvektoren

Das Plasmid pGMMCS wurde auf folgende Weise konstruiert:

Der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher die PABII cDNA-Sequenz (Nemeth, 1996) mit einem Nterminalen Met-Ala-His6-Tag enthielt, wurde mit Xho I und BamH I verdaut und das Fragment, das den 3'-Teil des PAB II enthielt, wurde durch ein Xho I/BamH I-Fragment aus der Multiple Cloning Site vom pBluescript KS (+/-) Plasmid ersetzt. Das resultierende Plasmid enthält eine durch den T7-Promotor kontrollierte Sequenz, die mit Met-AlaHis6 beginnt und durch den 5'- Teil vom PAB II und einer Multi Cloning Site gefolgt wird. Eine Nde I Schnittstelle liegt zwischen dem His₆-Tag und der PAB II Sequenz und kann zusammen mit der Multi Cloning Site dafür benutzt werden, um die verbliebene PAB II Se quenz durch jede beliebige kodierende Sequenz zu ersetzen.

Das Plasmid pGMMCS301901 wurde auf folgende Weise hergestellt:

Ein Teil der Sequenz des humanen DAN-Klons, der die 176 C-terminalen Aminosäuren ent hielt wurde mittels PCR aus dem Klon 301901 mit folgenden Bedingungen amplifiziert:

15 Zyklen: 45 s bei 94°C, 45 s bei 54°C und 3,5 min bei 72°C. Pfu-Polymerase und die Primer Nde I301901: CCATATCCATATGCTTTTCAGTGCCTTTCCTAAC und Xho I 301901: AGTACTCGAGTTACAATGTGTCAGG. .Nach Verdau mit Nde I und Xho I wur den die entstandenen cDNA-Fragmente mit dem Qia-Ex-Kit (Qiagen GmbH, Hilden) gerei nigt und in den Nde I und Xho I verdauten pGMMCS-Vektor integriert. Die Sequenz wurde mit Hilfe von Sequenzierung bestätigt.

Das Plasmid pGMMCS645295 wurde wie folgt hergestellt:

Die kodierende Sequenz des humanen DAN-Klons wurde mittels PCR aus dem Klon 645295 mit folgenden Bedingungen amplifiziert:
20 Zyklen: 45 s bei 94°C, 45 s bei 54°C und 3,5 min bei 72°C. Pfu-Polymerase und die Pri mer Nde I645295: AGTGTCGCATATGGAGATAATCAGGAGCA und Xho I 645295: AGTACTCAGCGGTTTGCTGCCCTCA. Das entstandenen Produkt wurde in den Vektor pCR2.1 mit Hilfe des TA-Klonierungs-Kits (InVitrogen®) kloniert. Nach Verdau mit Nde I und Xho I wurden die entstandenen cDNA-Fragmente mit dem Qia-Ex-Kit (Qiagen) gereinigt und in den Nde I und Xho I verdauten pGMMCS-Vektor integriert. Anschließend wurde der größte Teil der durch PCR generierten Sequenz mit Hilfe eines Verdaus mit Dra III und BstE II entfernt und durch das entsprechende Fragment des Originalklons ersetzt. Die neue Se quenz wurde mit Hilfe von Sequenzierung bestätigt.

3. Herstellung von Antikörpern

Antikörper gegen den C-terminalen Teil von humanem DAN wurden wie folgt produziert: Das Plasmid pGMMCS301901 wurde in BL21 (pLysC) transformiert. Die Zellen wurden bei 37°C in SOB-Medium mit 200 µg/ml Carbenicellin bis zu einer OD600 von 1,9 inkubiert. Anschließend wurde 200 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid dazugegeben und für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und in Puffer A (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris, 8M Harnstoff, pH 7,9) aufgenommen. Die Zellen wurden mit Ultraschall lysiert, das Lysat zentri fugiert und mit 3 ml Ni-NTA-Säulenmaterial für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Säulenmaterial wurde in eine Säule gepackt und mit 70 ml Puffer A, pH 6,3 gewaschen. An schließend wurde mit 15 ml Puffer B (300 mM NaCl, 10% (v/v) Glycerin, 50 mM Tris, 0,01% (v/v) Nonidet-P40, 8M Harnstoff, pH 7,9) gewaschen. Das Protein wurde auf der Säule zurückgefaltet, indem mit zwei Gradienten der Harnstoffgehalt verringert wurde (45 ml/h, Gradient 1: Puffer B von 8 auf 4 M Harnstoff bei Raumtemperatur, Gradient 2: von 4 auf 0 M Harnstoff bei 4°C). das Protein wurde mit Puffer B, der 500 mM Imidazole enthielt, von der Säule eluiert, gegen Puffer B ohne Harnstoff dialysiert und für die Immunisierung von Kaninchen verwendet.

Die Affinitätsreinigung von Anti-DAN-Antikörper wurde wie folgt vorgenommen: Das C terminale DAN-Fragment wurde an eine NHS-aktivierte HiTrap-Säule (1 ml Volumen, Pharmacia, Freiburg) nach Herstelleranweisungen gekoppelt. 3 ml Serum wurden auf die Säule aufgetragen und nach Herstellerangaben eluiert. 300 µg/ml BSA und 0,02% (w/v) NaN3 wurden den Fraktionen zugesetzt und der Puffer wurde mittels Dialyse ausgetauscht.

4. Expression und Reinigung von humaner DAN

Humane DAN wurde in E. coli als Fusionsprotein mit N-terminalem His-Tag (Met-Ala-His6- Tag) folgendermaßen exprimiert:
Das Plasmid pGMMCS645295 wurde in BL21 (pLysC) transformiert. Die Zellen wurden in 50 ml LB Medium mit 100 µg/ml Carbenicellin und 24 µg/ml Chloramphenicol bei 37°C angezogen und anschließend in eine 500 ml Kultur ohne Chloramphenicol überführt und bei 33°C weiterinkubiert. Nach dem Erreichen einer OD600 von 1,3 wurden 100 µM Isopropyl β-D-Thiogalactosid hinzugefügt und die Kultur für eine weitere Stunde inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und in Puffer A (50 mM Tris, 300 mM KCl, 0,1 mM MgAc, 1mM β- Mercaptoethanol, 0,4 µg/ml Leupeptin, 0,7 mg/ml Pepstatin, 0,5 mM PMSF, pH 7,9) aufge nommen. Die Zellen wurden mit Ultraschall lysiert, das Lysat zentrifugiert und mit 2 ml Niz+- NTA-Säulenmaterial für 2 h bei 4°C inkubiert. Das Säulenmaterial wurde in eine Säule ge packt und mit 25 ml Puffer A und anschließend mit 20 ml Puffer B (Puffer A und 10% (v/v) Glycerin, 0,02% (v/v) Nonidet-P40, ohne Magnesium, pH 6,3) gewaschen. Anschließend wurde das Protein mit 5 ml Puffer C (Puffer B mit 500 mM Imidazol) eluiert. Darauf folgte eine Dialyse gegen Puffer D (50 mM Tris, 20 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM PMSF, 10% (v/v) Glycerin, 0,02 (v/v) Nonidet-P40, pH 7,9). Die Präparation wurde zentrifugiert und auf eine MonoQ-Säule (1 ml Bettvolumen) aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit 5 Bettvolumen Puffer mit SO mM KCl gewaschen und die Säule mit einem Gradienten über 40 Bettvolumen mit einer Endkonzentration von 500 mM KCl eluiert. Die DAN-Aktivität elu ierte in einem scharfen Peak bei ca. 190 mM KCl (Fig. 3A).

Die Reinigung führte zu einer nahezu homogenen Präparation eines Proteins mit der erwar teten molekularen Masse (Fig. 3B und C). Das Protein weist eine poly(A)-spezifische 3'- Exoribonuclease-Aktivität auf (siehe Beispiel 6). Daraus folgt, daß der gefundene cDNA- Klon für eine humane DAN kodiert.

5. Northern-Blot Analyse

RNA wurde aus HeLa-Zellen nach einer Methode von Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156 isoliert. Poly(A) mRNA wurde mit Hilfe von oligo(dT)-Zellulose nach einer Methode von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., gereinigt. Die re sultierende RNA wurde auf einem 1%igen Agarose-Formaldhyd-Gel aufgetrennt, auf eine Hybond N+ Membran von der Fa. Amersham Buchler, Braunschweig durch Kapillar-Blot transferiert und durch Inkubation für 2 h bei 80°C auf der Membran fixiert. Die für die huma ne DAN kodierende Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, mit a 32P-dATP durch Ran dom-Priming markiert und als Sonde benutzt. Die Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt (Ausubel) und die Membran wurde unter hoher Stringenz gewaschen. Die Nort hem-Blot-Analyse mit poly(A)⁺ RNA aus HeLa Zellen zeigte ein einziges 3,1 kB Fragment, das mit der DAN-Probe hybridisierte. Diese Größe stimmt gut mit der Größe des cDNA- Klons überein.

6. DAN-Aktivitätstest

Der Assay für die DAN-Aktivität wurde wie beschrieben durchgeführt (Körner, Chr G. & Wahle, E. (1997), supra). SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680 durchgeführt.

Wie das bovine Enzym ist die rekombinante DAN in Abhängigkeit von der Neutralisierung von Phosphatladungen unter zwei verschiedenen Reaktionsbedingungen aktiv. In der Abwe senheit von Salz ist die Aktivität vollständig von der Anwesenheit von Spermidin mit einem Konzentrationsoptimum von 1mM abhängig. Unter diesen Bedingungen ist die spezifische Aktivität der rekombinanten DAN (79.000 U/mg) nicht signifikant unterschiedlich von der Aktivität gereinigter boviner DAN (110.000 U/mg). In der Anwesenheit von Spermidin wird die Aktivität von DAN durch Salz gehemmt. In der Abwesenheit von Spermidin ist die Akti vität des Enzyms mit einem Konzentrationsoptimum von 150 mM Kaliumacetat von Salz abhängig. Bovine DAN verhält sich auch unter diesen Bedingungen ähnlich.. Allerdings ist die spezifische Aktivität des rekombinanten Proteins (960 U/mg) unter diesen Bedingungen geringer, als die des aus Kalbsthymus gereinigten Enzyms (8070 U/mg). Dieser Unterschied ist durch eine posttranslationale Modifikation oder durch kontaminierende Proteine in der Präparation des bovinen Enzyms erklärbar.

Wurde eine mit einem Cap versehene, polyadenylierte RNA mit den DAN-Präparationen in der Anwesenheit von Salz inkubiert, wurde der poly(A)-Schwanz degradiert und vollständig deadenylierte RNA vorübergehend accumuliert (Fig. 5). Wurde der Assay in Anwesenheit von PABI durchgeführt, wurde die Aktivität teilweise inhibiert und stufenweiser Abbau des poly(A)-Schwanzes beobachtet. Die vorherrschenden Abbauprodukte differierten in der Län ge um ca. 30 Nukleotide, welches offensichtlich durch die PABI-Bindung verursacht wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit den Untersuchungen für bovines Protein überein (Körner Chr. & Wahle, E. (1997, supra). Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse, daß das rekombinante Protein eine poly(A)-spezifische 3'-Exoribonuclease ist.

7. Western-Blot Analysen

Western-Blot Analysen wurden wie folgt durchgeführt: Die Proteine wurden mittels SDS- PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran mit Hilfe der Semidry-Methode (Kyse-Andersen, 1984) übertragen. Die Blots wurden mit TNT-Puffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20, pH 7,5) mit 5% (w/v) entfetteter Trockenmilch inkubiert. Der gleiche Puffer wurde für die Inkubation mit Antiserum und die Waschschritte verwendet. Die Blots wurden mit den Antikörpern für 2-3 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschlie ßend gewaschen. Die gebundenen Antikörper wurden mittels eines Peroxidase-konjugierten Schwein-anti-Kaninchen-Antikörpers (DAKO, Glostrup, Denmark) und Chemiluminiszenz- Färbung (SuperSignal-Kit, Pierce) nachgewiesen.

Die Analysen zeigen, daß Kaninchen-Antikörper, die gegen ein C-terminales Fragment von DAN erzeugt wurden, aus teilgereinigten Fraktionen DAN präzipitieren können. Die Anti körper erkennen im Western-Blot sowohl bovines, als auch humanes DAN (Fig. 4). In diesem Experiment erscheint das rekombinante DAN etwas größer als das Enzym in SDS-Lysaten aus HeLa-Zellen, was durch die Einführung des Tag (1004 Da) in die Sequenz erklärt werden kann. Wenn das erste AUG in der cDNA-Sequenz nicht das benutzte Start-Codon sein sollte, hätte die natürliche DAN aus HeLa-Zellen mindestens 1260 Da größer als das mit einem Tag versehene rekombinante Protein sein müssen. Auch diese Ergebnisse bestätigen eine Benut zung der ersten AUG-Sequenz im cDNA-Klon als Start-Codon in vivo.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäure kodierend für eine humane deadenylierende Nuclease (DAN) mit einer Ami nosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, wobei Fig. 1 Teil des Anspruchs ist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA ist.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 2 von Position 58 bis 1977 ist, wobei Fig. 2 Teil des Anspruchs ist.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine polyA-Sequenz enthält.

5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklein säure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthalten ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.

7. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 in einer geeigneten Wirtszelle ex primiert wird.

9. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 7.

10. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 7 immunisiert und gegebenen falls die entstandenen Antikörper isoliert werden.

11. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Poly peptid gemäß Anspruch 7 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmun krankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer- Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoff formuliert wird.

13. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Po lypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 und gegebenenfalls geeig nete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

14. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmun krankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer- Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, insbesondere des Immun status, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.

15. Test zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure ge mäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

16. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder eines Polypeptids gemäß Anspruch 7 zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.

17. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 zum Auffinden von Va rianten der humanen DAN, dadurch gekennzeichnet, daß eine Genbank mit der genannten Nukleinsäure abgesucht und die gefundene Variante isoliert wird.

18. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7 zum poly(A)-spezifischem Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere von mRNA.