JP2000511892A

JP2000511892A - 可溶性ベーターシート形成性ペプチドの合成

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Publication number: JP2000511892A
Application number: JP09542843A
Authority: JP
Inventors: エイチ．グレイ，ブラー; アール．ヘイズマン，ジュディス; マヨ，ケビン; ダブリュ．グリフィオエン，アルジャン
Original assignee: University of Minnesota System
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2000-09-12
Also published as: US20080261880A1; WO1997044354A2; EP0939766A2; US20030153502A1; US7030087B2; WO1997044354A3; US20060183191A1; US6486125B1; CA2255865C; CA2255865A1

Abstract

(57)【要約】本発明はペプチドの化学的デザイン及び製造に関連し、ペプチド構造及び三次元コンホメーションはNMR、円二色性及びパルスフィールド勾配NMRを利用して評価した。更に、本発明はこのような方法により製造したペプチド及びこのペプチドの利用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性ベーターシート形成性ペプチドの合成発明の分野本発明は化学物質のデザイン、並びに合成化学構造の選択、修飾及び構築のための方法、更にはその利用方法に関する。背景ポリペプチドの重要な特徴はその三次元コンホメーション又は構造へと折りたたまる能力にある。ポリペプチドは通常固有のコンホメーションを有し、それがその機能を決定する。ポリペプチドの構造はいくつかの構造レベルを有する。一次構造はポリペプチド鎖へと連なる一連のアミノ酸の線状配列である。二次構造はポリペプチドのポリペプチド骨格が経る経路が立体的であることを意味し、そして三次構造は側鎖及びポリペプチド骨格を含むポリペプチド鎖内の全ての原子の三次元統合を意味する。アミノ酸間での共有及び非共有的相互作用はポリペプチドのコンホメーションを決定する。ポリペプチドの二次及び三次構造を樹立するうえで最も一般的な共有結合は２個のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成である（システインの形成）。非共有結合の形成は水の如き水性環境により影響される。幾多の非共有的相互作用、例えばファン・デル・ワールスカ、イオン、疎水性及び水性結合相互作用がポリペプチドの折りたたみの方式に寄与する。非極性側鎖を有するアミノ酸間で生ずる疎水性相互作用は極めて重要であり、なぜならそれらは水を排除するからである。これらの側鎖は一般にポリペプチドのコアを形成し、そこでそれらは水に対してほとんどアクセスできない。ポリペプチドの二次構造は２つの一般的なクラス、α−ヘリックス及びβ−シートに分類できる。α−ヘリックスは同じポリペプチド鎖内で３及び４個の残基で離れたアミノ酸間での水素結合及び側鎖相互作用により安定となっており、一方β−シートはポリペプチド鎖内でのもっと離れたアミノ酸間及び別々のポリペプチド鎖におけるアミノ酸間での水素結合及び側鎖相互作用により安定となる。 αヘリックス及びβシートの構造の完全な理解はポリペプチドの構造及び機能の取り扱いのために重要である。スクラッチからのポリペプチド（又はペプチド）のデザインであるde novoポリペプチドデザイン（往々にしてde novoペプチドデザインと称する）における主たる挑戦は天然ポリペプチドの天然構造の折りたたみ安定性を有するポリペプチドのエンジニアリングである。主要構造要素としてαヘリックスを有するいくつかのポリペプチドがデザインされている。主要構造要素としてβシートを有するいくつかのポリペプチドがデザインされている。配列内で３及び４残基離れたアミド間での水素結合の規則的な連続性があるαヘリックスとは異なり、βシートは配列内の様々な、且つ往々にして離れた位置にある残基同志で形成される。更に、それらは溶液中で凝集物を形成し、そして生理条件下で沈殿しがちである。構造的に安定なβポリペプチドをデザインするうえでの主たる困難さはβシート間の相互作用の扱いである。 β−シートを形成するためのポリペプチドのデザインは過去において、通常当業界において公知のいくつかの構造的傾向スケールのいづれかを基礎としていた。これらのスケールは既知の折りたたまれたポリペプチドの構造データーベースから統計学的に、又は完璧に折りたたまれたポリペプチドにおける単一もしくは最少限の部位特異的変化を施すことに由来する。例えば、C.A.KimらNature，362，267(1993); D.L.MinorらNature，371，264(1994);D.L.MinorらNature，367，660(1994);及び C.K.SmithらBiochemistry，33，5510（1994）を参照のこと。しかしながら、かかるスケールは一般に、βシート及び／又は側鎖表層（特に疎水性表層）が水により著しく露出されるであろう短いペプチドのde novoβシート折りたたみデザインにはあまり有用でない。D.E.OtzenらBiochemistry，34，5718（1995）。ベーターベリンはβシートペプチドのうちの最初にde novoデザインされたクラスの一つである。J.Richardsonら、Biophys.J.，63，1186（1992）。それは２枚の同一の４本鎖の逆平行βシートのサンドイッチへと折りたたまれることを意図されている。ベーターベリンのより最近のバージョン、ベーターベリン14Ｄが YanらProtein Science，3，1069（1994）によりデザインされた。Quinnらはベーターダブレットをデザインし、それはベーターベリンと似ているが、天然にコードされるアミノ酸のみを含む。T.P.Quinnら、Proc.Natl.Acad.Sci ．U.S.A.，91 ，8747（1994）。しかしながら、ベーターベリン及びベーターダブレットシリーズにおけるペプチドは制約された水溶性及びごくわずかな、非常に一過性なβシート構造を示し、即ち、不安定な構造を示す。今までに作られた最良のベーターベリン、ベーターベリンペプチド14Ｄは例えば5.5を超えるpHにおいて低い溶解性を示し、生理学的pHでは使用できないものである。更に、ペプチド14Ｄにより形成されるβシート構造は二量体を供する分子間ジスルフィド結合の存在を頼りとする。本発明のペプチドはこのような制約を有さない。ベーターベリンと同じ推定逆平行βシートモチーフを有するベーターダブレットは更に水溶性が低く（約４の低めのpH でのみ）、そしてコンパクトで安定な折りたたみ、即ち構造を示すことができない。水溶性及びpH域はペプチドの機能にとって重要である。生理条件下（即ち、約 7.0〜7.4のpHの水及び150mMのNaCl又は当量の生理塩）で可溶性でないポリペプチドは機能的でなく、それ故有用でない。ペプチドのデザインのためのベーターペリンもベーターダブレット戦略も生理条件下での十分な可溶性、ペプチドコンパクト性又はペプチドの自己会合性を達成せしめていない。従って、水溶性であるのみならず、生理条件下で可溶性であり、且つ自己会合性であるβシート形成性ペプチドのニーズが残っている。敗血症候群は危険性をはらんだ病気患者における死亡率の主たる原因の一つであり続け、そしてグラム陰性菌病原体がこの症例の約１／３の原因となっている。多大な実験室及び臨床的研究にもかかわらず、グラム陰性菌敗血症及びショックに関わる死亡率は約40％であり続けており、統計的にほとんど変化していない。リポ多糖(LPS又は内毒素)はグラム陰性菌の必須成分であり、そしてマクロファージの活性化を誘導し、そのマクロファージは内性組織環境及び全身循環系においてサイトカインを合成及び分泌する。その結果としてのマクロファージによる腫瘍壊死因子−α（TNF-α）及びその他のサイトカインの放出は宿主の炎症応答及びその後の敗血性ショックの発症に結びつく。残念ながら、標準的な炎症応答並びにその後の敗血症及びショックの発症において、有能な抗生物質の投与、アグレッシブな流体蘇生法、血行力学モニター及び代謝支持等は死亡率の有意な低下に結びついていない。 BPIのアミノ酸82−108を基礎とする27個のアミノ酸の合成ペプチドはin vitro でTNF-α分泌を有意に阻害し、そして動物へのこのペプチドの投与は、TNF-α分泌の消失が不完全であるにもかかわらず、内毒素レベルを低めた(Battafaranoら、Surgery 118:318-324，1995及びDah lbergら、J.Surg.Res．63:44-48，1996)。抗内毒素モノクローナル抗体HA-1A及びE5の敗血症候群の際の死亡率に対する効果は第三期臨床試験により試験されている。これらの研究において、死亡率は偽薬処置と比べて低まっていない(The C HESS trial study group，Ann.Int.Med．121:1-5，1994;BoneらCrit.Care Med． 23:994-1005，1995)。従って、グラム陰性菌感染症を処置するのに新規の試薬が必要である。腫瘍増殖は脈管形成の喪失により制御できる(Folkman，Natl.Cancer.Inst．82 :，4-6，1990及びFolkmanらJ.Biol.Chem．267: 10931-10934，1992)。脈管形成の内因性阻害剤の数は増え続け、血小板因子−４(PF4，Guptaら、Proc.Natl.Aca d.Sci．USA 92:7799-7803，1995)、インターフェロン誘導性タンパク質−10(IP- 10，LusterらJ.Exp.Med．182:219-231，1995)、並びにタリドミド、メタロプロティナーゼ等の合成試薬が挙げられる。限定することなく、腫瘍原性等の様々な用途についての内皮細胞増殖を阻害する試薬等の脈管形成を阻害する試薬に対するニーズがある。発明の概要本発明は約35％以上の疎水性側鎖をもつアミノ酸を有する水溶性ペプチドを合成するための方法を提供し、この方法は帯電した側鎖を有するアミノ酸及び無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を疎水性側鎖を有するアミノ酸と組合せることを含んで成り、ここで当該帯電した側鎖を有するアミノ酸は少なくとも約２：１の正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比において供与されている。本発明は更に、約35％以上の疎水性側鎖を有する水溶性ペプチドを合成するための方法を提供し、この方法は帯電した側鎖を有するアミノ酸及び約20％未満の無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を疎水性側鎖を有するアミノ酸と組合せることを含んで成り、ここで：当該帯電した側鎖を有するアミノ酸は少なくとも約２：１の正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比において供与されており；当該水溶性ペプチドは約35〜約 55％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を有し；そして当該疎水性側鎖を有するアミノ酸のうちの少なくとも２個はこの疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸がβシート構造を形成するよう対合態様で並ぶことができるような状況で介在ターン配列をもつ当該ペプチド内に配置されており；そして当該ターン配列はLXXGRであり、ここで各Ｘは独立してＫ，Ｎ，Ｓ及びＤより成る群から選ばれる。ここで、パーセンテージは当該ペプチド鎖内のアミノ酸の総数に対する特定したアミノ酸の数として報告する。本発明は更に本発明の方法を利用して調製した一連のβpepペプチドに関する。これらのペプチドはβpep-1〜βpep-30として提供し、そしてSEQID NO:１〜SE Q ID NO:30に対応する。本発明は更に細菌感染症又は内毒素ショックを処置するための方法であって、哺乳動物に当該細菌感染症を抑制する又は内毒素を中和するのに有効な量の薬理組成物を投与することを含んで成り、ここで当該薬理組成物は（ａ）βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる殺菌活性又は内毒素中和活性を発揮するペプチド及び（ｂ）薬理学的に許容される担体を含んで成る。一の態様において、当該ペプチドは内毒素を中和し、別の態様において当該ペプチドは殺菌性であり、そして別の態様において当該ペプチドは殺菌性且つ内毒素を中和する。好適な態様において、当該ペプチドは内毒素中和活性を有し、そしてβpep-8及びβpep-23 より成る群から選ばれる。別の好適な態様において、当該ペプチドはβpep-19， βpep-7，βpep-4，βpep-22及びβpep-1より成る群から選ばれる。本発明は更に哺乳動物のTNF-αレベルを抑制するための方法であって、（ａ） βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる殺菌活性又は内毒素中和活性を発揮するペプチド及び（ｂ）薬理学的に許容される担体を含んで成る治療的に有効な量の薬理組成物を投与する工程を含んで成る方法に関する。好適な態様において、当該ペプチドはβpep-3である。本発明は更に内皮細胞増殖を抑制する方法であって、βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる内皮細胞増殖阻害を発揮するペプチドを含んで成る有効量の組成物を投与する工程を含んで成る方法に関する。一の態様において、当該組成物はβpep-14又はβpep-16より成る群から選ばれるペプチド及び薬理学的に許容される担体を含んで成る治療的に有効な量の薬理組成物である。本発明は更に細胞間接着分子（ICAM）発現を促進するための方法であって、β pep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる細胞間接着分子発現を促進するペプチドを含んで成る有効量の組成物を投与する工程を含んで成る方法に関する。「アミノ酸」とは本明細書において一般式NH₂・・・CRH・・・COOHを有する化学化合物を意味するのに用いられ、ここでＲは側鎖、Ｈ又は有機基である。Ｒが有機基の場合、Ｒは様々であってよく、そして極性又は非極性（即ち、疎水性）である。本発明のアミノ酸は天然又は合成（往々にして非タンパク質原性）であってよい。本明細書において用いている有機基とは脂肪族基、環式基又は脂肪族と環式基との組合せに分類される炭化水素基をいう。「脂肪族基」とは飽和又は不飽和の線形又は枝分れ炭化水素基を意味する。この語はアルキル、アルケニル及びアルキニル基等を包括する。「環式基」とは脂環式基、芳香族基又は複素環式基に分類される閉環炭化水素基を意味する。「脂環式基」とは脂肪族基に似た特性を有する環式炭化水素基を意味する。「芳香族基」とは単環又は多環式芳香族炭化水素基を意味する。ここで用いる有機基は置換又は未置換のものであってよい。一文字及び三文字記号は本明細書においては天然アミノ酸を表示するために用いている。かかる表示、例えばアルギニンについてのＲ又はArg、リジンについてのＫ又はLys、グリシンについてのＧ又はGly、そして未決定のアミノ酸についてのＸ等は当業者に周知である。本明細書において用いる「ペプチド」又は「ポリペプチド」とはアミノ酸ポリマーを意味する。本発明の単一ペプチドは好ましくは20個以上のアミノ酸を有する。好ましくは、本発明のペプチドは長さにおいて50個以下のアミノ酸、そしてより好ましくは長さにおいて約28〜約33個のアミノ酸である。「水溶性」とは好ましくは水に容易に溶解する本発明のペプチドを含む化合物、分子等を意味するのに用いている。本発明の化合物は、約１mgの当該化合物が約35〜45℃の温度を有する水１mlの中で溶解するなら容易に溶解するものである。より好ましくは、本発明のぺプチドは少なくとも約10mg／ml、そして往々にして少なくとも約20mg／mlの水溶解度を有するであろう。更により好ましくは、当該ペプチドは約7.0〜7.4のpH及び約150mMのNaClの塩濃度等の生理条件下でかかる濃度において溶解する。「疎水性アミノ酸側鎖」又は「非極性アミノ酸側鎖」なる語は本明細書ではそれらが撥水性である点で油又はワックスに似た性質を有するアミノ酸側鎖を意味するように用いている。水の中で、これらのアミノ酸側鎖は互いと相互作用して非水性環境を構築する。疎水性側鎖を有するアミノ酸の例には、限定することなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。本明細書において用いる「極性アミノ酸側鎖」とは、水を吸引する、又は水に容易に溶解する、又は水の中で水素結合を形成する基を意味する。極性アミノ酸側鎖の例にはヒドロキシル、アミン、グアニジニウム、アミド及びカルボン酸基が挙げられる。極性アミノ酸側鎖は帯電又は無帯電であってよい。本明細書において用いる「無帯電の極性アミノ酸側鎖」又は「中性極性アミノ酸側鎖」とは、電離性でなく、又は総合的に正もしくは負の電荷を帯びていないアミノ酸側鎖を意味する。無帯電の極性又は中性極性側鎖を有するアミノ酸の例にはセリン、スレオニン、グルタミン等が挙げられる。「正に帯電したアミノ酸側鎖」とは完全又は正電荷を帯びることのできるアミノ酸側鎖を意味し、そして「負に帯電したアミノ酸側鎖」は負の電荷を帯びることのできるアミノ酸側鎖を意味する。正に帯電した側鎖を有するアミノ酸の例にはアルギニン、ヒスタジン、リジン等が挙げられる。負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の例にはアスパラギン酸及びグルタミン酸等が挙げられる。「自己会合」とは２個以上の独立のペプチド分子又は分子の自発的会合を意味し、それはペプチド鎖が同一であるか否かは問わない。図面の簡単な説明図１はポリペプチドPF4，IL-8及びGROポリペプチド由来のβシート領域のアラインメントを示す。βシート残基を枠で囲み、そして線分は鎖内で対合する残基を連結している。配列におけるＣ末端はアミド形態で合成した。 PF４配列の下に示す番号は天然PF４に由来する。図２はデザインされたペプチドβpep-5，βpep-8，βpep-11及びβpep-1についての遠紫外線円二色スペクトルを示すグラフである。使用したペプチド濃度は 20mMのリン酸カリウムpH＝6.3中で10〜20μＭとした。温度は５℃〜75℃で変えた。図３は600MHzでのH₂O中でのβpep-5，βpep-8，βpep-11及びβpep-1についての¹HNMRスペクトルを示すグラフである。ペプチド濃度は40℃の温度及び6.3のpH において20mMのリン酸カリウム中で20mg／mlとした。スペクトルは6000Hzのスウィープ幅で、8,000個のデーター点で集積し、そして３Hzのラインブロードニングで処理した。HDO共鳴より下のスペクトル領域のみを示す。図４はβpep-5，βpep-8，βpep-11，βpep-1及びリゾチームについての温度の関数としてのパルスーフィールド勾配（PFG）NMR拡散係数を示すグラフである。図５はRAW 264.7細胞によるin vitroでのTNF-αのLPS誘導分泌を消失せしめる抗内毒素ペプチドBG22及びβpep-3の能力を実証するグラフである。図６はin vivoで内毒素症の際にTNF-αの分泌を消失せしめる抗内毒素ペプチドBG22及びβpep-3の能力を実証するグラフである。データーは負荷後90分にて示す。図７はペプチド(βpep1〜βpep24)濃度２×10^-6Ｍによる２種類の内皮細胞についての³Ｈチミジン組込みデーターを示す。図７ＡはFBHEC細胞についての³Ｈチミジン組込みデーターを示し、そして図７ＢはHUVEC細胞についての³Ｈチミジン組込みデーターを示す。図８Ａは1.2×10^-7Ｍのペプチド濃度でのβpep-1〜βpep24のＰ．アエルギノーザ(P．aeruginosa)殺菌活性を示し、そして図８Ｂは1.2×10^-6Ｍのペプチド濃度でのβpep-1〜βpep-24の内毒素中和活性を示す。発明の詳細な説明ペプチドのβシート形成、自己会合及び水溶解度との間では入り組んだ相互作用がある。可溶性の折りたたまれたペプチドを作るうえでの挑戦は可溶性がダブルエッヂ効果を有する点にある：沈殿、対、溶媒和。沈殿はペプチド溶液の沈降であり、一方過剰溶媒和は可溶性ペプチドが分子内折りたたみ相互作用よりも分子間水−ペプチド相互作用を優先する傾向である。いづれかの方向に行きすぎると（沈殿又は過剰溶媒和）、折りたたみ状態は不安定となる。低まった溶解性は一般に分子間ペプチド、対、ペプチド相互作用（疎水性及び静電性）に基づき、それは沈殿又はゲル化をもたらす。沈殿は例えば可溶性ペプチドと平衡状態であるが、平衡は溶液からシフトする。もしデザインされたβシート形成性ペプチドが比較的大量の疎水性側鎖を有するアミノ酸であって折りたたみプロセスによりある程度スクリーニングしにくいものを含むなら、沈殿又はゲル化が生じうる。従って、βシート形成性ペプチドのデザインの特徴は自己会合の能力にあり、これより溶媒和水から疎水性表層がスクリーニングされる。本発明は生理条件又はその付近において水溶性であり、且つβシート構造を好ましくは形成するペプチドのde novoデザインのための方法を提供する。好ましくは、且つ好都合には、この水溶性ペプチドは、自己会合を介して、任意の分子間共有相互作用抜きでβシートを形成する（但し、これは必須要件ではない）。この方法は下記のパラメーターを考慮する：正及び負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の数又はパーセンテージ組成、無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸の数又はパーセンテージ組成、疎水性側鎖を有するアミノ酸の数又はパーセンテージ組成、配列及び空間におけるアミノ酸の適正な配置及び対合、並びに特異的なターン特徴。この特異的なターン特徴とはターン配列に位置するアミノ酸の側鎖の組成をいう。ターン配列とは空間におけるアミノ酸配列の方向を逆転させるアミノ酸配列を意味する。正及び負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の数がほぼ同等のとき、分子間静電相互作用は溶媒和−沈殿平衡を沈殿状態へとシフトさせる。これは従来のデザインアプローチにおける基本的な欠点であったペプチドの総合正味電荷をほとんど正に帯電した側鎖を有するアミノ酸に調整することは可溶性を著しく高める。ペプチド間電荷反発作用は沈殿を抑制するのにも役立ちうる。本発明の好適な態様において、正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比は少なくとも約２：１である。好ましくは、正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比は約３：１以下とする。しかしながら、本発明は正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸のより高い比も考慮し、限定することなく、４：１，５：１又は６：１、又はそれより高い比が含まれる。可溶性の反対は、ペプチドが可溶性でありすぎうる、即ち、過剰溶媒和されていることにある。極性側鎖を有するアミノ酸の数が高すぎ、そしてその他の安定化力が低すぎると、分子間つぶれ（コラプス）又は折りたたみは分子間ペプチド −水会合と対立しうる。従って、短鎖の極性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリン及びスレオニン（ヒドロキシル化アミノ酸）の高含有率は、スレオニンがβ−シート傾向スケールの最頂部にあるにもかかわらず、所望されない。これは従来のデザインアプローチの別の基本的な欠点である。本発明のペプチドは100％未満、好ましくは約50％未満、より好ましくは約20％未満の無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を含むのが好ましい。疎水性側鎖を有するアミノ酸の適正なパーセンテージ組成及びかかるアミノ酸の配列内での配置は自己会合誘導構造つぶれ及び安定性を促進する。そのトレードオフは不溶性を回避するための疎水性側鎖を有するアミノ酸のパーセンテージ組成の調整、それと同時の折りたたみ及び構造形成の促進である。本発明のペプチドは好ましくは約35〜約55％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を含み、そして特に好ましい態様において、約40〜約50％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を含む。本発明の好適な態様において、この疎水性アミノ酸又はそれらの組合せは脂肪族であるが、芳香族の疎水性アミノ酸も考えられる。よりコンパクトな折りたたみを構築するため、側鎖の対合及びパッキングを最適化しなければならない。疎水性相互作用は折りたたみ状態の安定性を高める。配列内での疎水性側鎖を有するアミノ酸の適正な配置並びにストランド間を横断する及び自己会合ペプチド内のストランド間での疎水性側鎖トリプレットの組合せの選択は安定なβシート折りたたみをデザインするのに重要な事項である。本明細書において利用するストランドとはターン配列間での折りたたみペプチド鎖部分をいう。好ましくは、これらのアミノ酸は実質的に疎水性の表層を形成するよう折りたたまれたペプチドの中に立体的に配置されている。より好ましくは、これらのアミノ酸は一個のペプチド分子が別のペプチド分子と自己会合できて多量体を形成するようにこの折りたたまれたペプチド内に立体配置させている。このβシートデザインプロセスへの追加のディメンジョンはオリゴマー化であり、この場合重なり合ったシートの頂部のシートの効率的な疎水性側鎖パッキングが最適な折りたたみ安定性及びコンパクトさにとって重要なようである。アミノ酸配列における側鎖、特に疎水性側鎖の適正な配置の選定は折りたたみ安定性を調節するのに重要である。コンパクトβ−シート折りたたみは典型的には十分にパッキングされたストランド間側鎖対合に依存する。本発明の好適な態様において、疎水性側鎖を有する少なくとも２個のアミノ酸、そしてより好ましくは疎水性側鎖を有する少なくとも３個のアミノ酸が、βシート構造を形成するよう空間において並ぶように配置されている。これらのアミノ酸間にはこれらの側鎖対合を可能にするターン配列がある。特異的なターン特徴は所望の折りたたみを促進又は安定化しうる。様々なターン配列が当業界において公知である。特定のβシート折りたたみにとって、いくつかのターンは重要であるが、他は重要でないことがある。当業者は以降の実施例において提供する方法に従い、当該ペプチドがβシート構造等を保つか否かを調べるため、本発明に従ってデザインしたペプチドの中にターン配列を組込むことができるであろう。実施例に記載の通り、SEQ ID NO:１〜４(βpep-5，βpep- 8，βpep-11及びβpep-1)において特定の新規の折りたたみ開始ターン／ループ配列KXXGR(Ilyina ら、Biochemistry 33，13436(1994))を使用した。この配列において、各Ｘは独立してＫ，Ｎ，Ｓ及びＤより成る群から選ばれる。この配列は疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸の間に配置され、これによりこの疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸は対合状態で並ぶことができ、βシート構造を形成する。本明細書に開示の発明を利用して、30種類のペプチドβpep-1〜βpep-30がde novoデザインできた（以下の表１参照）。13pepペプチドは全て30mg／ml（９mM ）以下においてpH＝２〜pH1OのpH値で水溶性であり、そして全てβシートを形成し、そして円二色（CD）及び核磁気共鳴(NMR)により近生理条件下で水の中で自己会合誘導βシート構造の有意な集団を形成することが示された。特にβpep-1 は比較的安定でコンパクトな三本鎖βシート構造を良好な側鎖パッキングをもって示すことによりこのデザインアプローチの驚くべき用途を例示する。似たように挙動するその他のものはβpep-14〜βpep-30である。本発明の方法を利用し、任意の数のペプチド、好ましくはβシート構造を有するペプチドを構築することが可能である。本発明はペプチドをその天然のβシート構造において支持するペプチド足場をデザインするための方法を提供する。当業者はβシート構造を有する様々なタンパク質及びポリペプチドがあり、そしてこのようなβシート構造を有するタンパク質及びポリペプチドは様々な生物学的作用を媒介、促進又は阻害することを知っているであろう。例えば、幾多の生物学的作用がβシートコンホメーションを示すタンパク質の中のペプチド配列において位置決めされている。本発明はタンパク質からのβシート構造を有するドメインにおけるペプチド配列の選択及び保持型βシート構造を有するペプチドを構築するための本発明に従う足場へのこのペプチド配列の組込みを可能にする。これら新規のペプチドは、このペプチドドメインに基づくものと同一又は向上した天然タンパク質の生物活性を有することができ、しかもこのタンパク質の残り部分が活性にとって必要ではないという利点を有する。ペプチドドメインの作用を倍増させるためのタンパク質全体の利用は実験及び治療法を複雑にする。タンパク質中のその他のドメインはその他の生物学的及び化学的作用、例えば限定することなく、高まった抗原性、低まった可溶性を刺激しうるか、又は不要な生物応答等を刺激することがある。タンパク質は往々にして不安定であるか、又は更なる修飾抜きでは生物学的もしくは治療的用途に適切でない。本発明の戦略は機能性ペプチドドメインを本発明の足場においてその三次コンホメーションにおいて保持することを可能にする。本発明の方法はペプチドであって新規の活性又はそのペプチドが由来する親タンパク質に基づく活性を有する様々なペプチドを作製するための当業者の指針を提供する。本発明の方法を利用して調製したペプチドは誘導体又は類似体を形成するよう様々な方式で更に修飾されうる。これらの修飾には、ペプチドを生物活性について試験する前、又はペプチドを活性について試験した後の、アミノ酸の付加、置換又は欠失が挙げられる。保存アミノ酸置換は典型的には生物活性に影響を及ぼすことなく施すことができうる。保存アミノ酸置換にはアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸に置換することが含まれる。アミノ酸のタイプには：（１）塩基性アミノ酸、例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン；（２）疎水性アミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びトリプトファン；（３）非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン及びメチオニン；（４）極性アミノ酸、例えばセリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン；並びに（５）正に帯電したアミノ酸、例えばアスパラギン及びグルタミン酸；が挙げられる。本発明に従って調製及びデザインされたペプチドは単独で、又は薬理学的に許容されるバッファーの中で、抗原として、別のタンパク質、例えば免疫刺激性タンパク質又はタンパク質担体、例えば限定することなく、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、牛血清アルブミン(BSA)、オバルブミン等と一緒に投与してよい。ペプチドは標準的な方法、例えば担体分子のヘテロ二価スルホスクシニミジル４−（ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボキシレート試薬による活性化を利用して別のタンパク質に接合させてよい。ペプチドへの活性化担体の架橋は担体のマレイミド基のシステイン残基含有ペプチドのスルフヒドリル基との反応により行ってよい。コンジュゲートはゲル濾過カラムクロマトグラフィー又はその他の当業界公知の方法を利用して遊離ペプチドから分離されうる。実証済みの生物活性を有するペプチドは哺乳動物に所定量で単独で、又はその他の活性剤と、及び薬理学的に許容されるバッファーと一緒に投与してよい。例えば、内毒素中和活性及び／又は殺菌活性を示す本発明に従って調製したペプチドは細菌感染症の処置のために投与してよい。この薬理組成物は本発明に従って調製した殺菌性ペプチド及び／又は内毒素中和ペプチドを含みうる。当該ペプチドは患者に導入するための様々な生理学的に許容される担体、例えば当業者に公知の様々な希釈剤又は賦形剤と組合せてよい。例えば、非経腸投与のため、等張食塩水が好ましい。局所投与のためには、クリーム、例えばジメチルスルホキシド（DMSO）の如き担体、又はペプチドの活性をブロッキングもしくは阻害しない局所クリームにおいて典型的に見い出せるその他の試薬を使用してよい。その他の適当な担体には、限定することなく、アルコール、リン酸緩衝食塩水、及びその他のバランス塩溶液が挙げられる。生物活性を示す本発明に従って調製したペプチドは静脈内、局所、経口及び筋肉内等の様々な方式で、ヒト、マウス及びウサギ等の哺乳動物に投与できる。これらのペプチドは単独投与又は多重投与として投与されうる。好ましくは、その用量は本明細書に記載の標準的な方法により決定される有効量であり、そして約１μｇ〜約１,000μｇの前処置、より好ましくは約50 〜約25μｇの前処置が含まれ、そして臨床試験の当業者は標準的な臨床試験を通じて特定のペプチドの用量を最適化できるであろう。細菌感染症を処置するためのペプチドの有効量はその細菌感染症、感染箇所及びペプチドに依存するであろう。ペプチドの有効量は動物における細菌の数を減少させ、且つ細菌感染症に係る症状、例えば発熱、疼痛及びその他の細菌感染症関連症状を軽減せしめる量である。ペプチドの有効量はin vitroでの標準的な用量応答方法により決定でき、そして細菌の少なくとも50〜100％を死滅させるのに有効な量（LD₅₀）、そしてより好ましくは細菌の約60〜100％を死滅させる量が有効量と考えられるであろう。他方、細菌感染症を処置するためのペプチドの有効量はマウスの如き動物系において決定できる。急性腹膜炎は異系交配スイスウェブスターマウスの如きマウスにおいてDunnら(Surgery，98:283，1985);Codyら（Int.Surg.Res.，52:315，1 992）に記載の通りＰ．アエルギノーザの如き細菌を腹腔内注射することにより誘導できる。様々な量の当該ペプチドを細菌の注射前に１時間静脈内注射してよい。血液、脾臓及び肝臓中の生存細菌率を当該ペプチド又はその他の抗生物質の存在下及び非存在下で決定できる。本発明を制限するつもりはないが、殺菌性ペプチドはその他の抗生物質、例えばエリトロマイシン等の効能を高めることもできうる。内毒素中和活性を有するペプチドはグラム陰性菌で全身的に感染され、且つ内毒素ショックの症状、例えば発熱、ショック及びTNF-α放出を示す哺乳動物を処置するのに利用できうる。これらの動物は典型的には１又は複数種のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Pseudomana s）種、Ｅ．コリ（Ｅ．コリ）粗株、封入化Ｅ．コリ及びＥ．コリ平滑株で感染させる。当該内毒素中和ペプチドは公知であり、且つ内毒素ショックを処置するのに利用されるその他の試薬と組合せてよい。いくつかの典型的なペプチドを本発明に従ってデザインし（βpep-1〜βpep-3 0）、そしてそれらペプチドを実施例１に従って合成した。いくつかのこれらのペプチドは様々な生物学的用途を有するようである。一の例において、本発明に従って調製したいくつかのペプチドは内毒素中和活性、殺菌活性又は内毒素中和活性及び殺菌活性の双方を有する。いくつかのペプチドはPF４と比較し、内毒素中和活性を示し（図１参照）、そしてタンパク質Ｂ／PI由来の同等の領域(アミノ酸86−108)と比べて高まった活性を有していた。これらの研究の結果を実施例５、実施例６並びに図５及び６に示す。Ｂ／PIのアミノ酸86−108内のドメインは内毒素中和活性を有することが示され、そしてこれらの研究由来の結果はいくつかのβペプチドが内毒素中和活性を有することを示唆した。内毒素中和活性は当該ペプチドが例えばリムルス・アモエボサイト（Limulus amoebocyte）リゼートアッセイ（LAL，Sigma Chemica ls，St.Louis，MO）又は発色原LAL 1000試験(Biowhittacker，Walkersville，MD )の如きアッセイにおいてリポ多糖の作用を完全に阻害するモル濃度を決定することにより測定できうる。内毒素中和活性は標準の用量応答方法を利用して阻害用量50（LD₅₀）を計算することによっても測定できる。阻害用量50は内毒素の活性を50％阻害できるペプチドの量である。内毒素活性はマクロファージ細胞系からの腫瘍壊死因子アルファー（TNF-α）の放出量を決定することにより、又は動物におけるショック症状を評価することによっても測定できる。TNF-αの産生はMossmanら（Immunological Methods 65:55，1983）に記載の通りにしてアッセイできる。ペプチドは好ましくは内毒素を約１×10^-4Ｍ〜約10^-8Ｍ、より好ましは約10^-5Ｍ〜約10^-6Ｍのモル濃度で中和する。内毒素を10^-4以下のモル濃度で中和しないペプチドは内毒素中和活性をもたないと考える。生物活性を有するペプチドは約10個のアミノ酸〜約100個のアミノ酸、より好ましくは約10〜約50個のアミノ酸のサイズを有する。約20〜約50個のアミノ酸を有するペプチドが好ましく、そして28〜33個のアミノ酸のペプチドが極めて好ましい。本発明により調製したいくつかのペプチドは殺菌活性を有する。殺菌活性は様々な細菌、好ましくはグラム陰性菌に対して評価できるが、細菌のタイプにはシュードモナス種、例えばＰ．アエルギノーザ及びＰ．セパシア（P．cepacia）、Ｅ．コリ株、例えばＥ．コリＢ、サルモネラ（Salmonella）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）及びスタフィロコッカス（Staphylococcus）株、例えばスタフィロコッカス・アウレウス(S．aureus)が挙げられうる。好ましい生物はシュードモナス・アエルギノーザである。細菌活性は、標準方法に従い、細菌の少なくとも60％の死滅をもたらすぺプチドのモル濃度として死滅のための有効用を同定することにより決定する。好ましくは、このペプチドは約１×10^-4 Ｍ〜約１×10^-10Ｍ、そしてより好ましくは１×10^-7Ｍ〜約１×10^-9Ｍの濃度において有効用量を有する。殺菌性でないと考えるペプチドはＰ．アエルギノーザを5.6のpHにおいて10^-4Ｍ以下の濃度で死滅させない。殺菌活性は標準方法を利用して致死用量50（LD₅₀）を計算することによっても決定できる。LD₅₀は標準の用量応答法を利用して測定したときに細菌の50％を死滅させるペプチド又はタンパク質の量である。殺菌性ペプチドは好ましくは約10^-4Ｍ〜約10^-9Ｍ、より好ましくは約10^-7Ｍ〜約10^-9ＭのLD₅₀を有する。これらの結果の観点において、本発明は更に殺菌及び／又は内毒素中和活性を実証するための本発明の方法に従って作製したペプチドの利用にも関連する。当該ペプチドのうちの少なくとも一つはin vivoでTNF-αの作用を中和することもできる。更に、本発明の方法に従って調製したいくつかのペプチドは脈管形成及び／又は内皮細胞増殖を阻害できる。実施例８は本発明の方法に従って調製したペプチドの脈管形成又は内皮増殖阻害能力を試験するための方法を提供する。好適な態様において、βpep-4はコンパクトに折りたたまれることが見い出され、そしてそのNMR溶液構造は四量体を形成する２枚の別々に並んだ６本鎖の逆平行βシート二量体両親媒サンドイッチを含んで成る。βpep-4 βシートサンドイッチ四量体は極めて正に帯電した表層を有し、それはかかるペプチド及びその他のβpep ペプチド(Mayoら、Protein Sci．5:1301-1315，1996)をヘパリン及び細胞表層硫酸ヘパリンの如きアニオン性生体分子への結合のための良好な候補とし、また様々な細胞活性を調節する可能性がある。βpepデザインが基礎とするPF４及びその他のα−ケモカインも比較的高い正味の正表層電荷を有し、ヘパリンのようにポリスルフェート化グリコサミノグリカンに結合し、そして様々な細胞活性を誘導する事実、βpep-4及び近縁の同族体は新規のケモカインである。このため、 βpepペプチド33量体のライブラリーを、親PF４と一緒に、抗脈管形成及び関連の活性について、実施例８に示すようにスクリーニングした。本発明の方法は細菌感染症、内毒素ショックを処置、TNF-αの作用も媒介（実施例７）、内皮細胞増殖を阻害、及びICAM発現を上昇調節（実施例８）するための本発明に従って調製した有効な量のペプチドの利用に関する。本発明のペプチドを含んで成る組成物は培養細胞に加えてよく、又は哺乳動物を処置するのに使用してよい。哺乳動物を処置するのにペプチドを用いるとき、当該ペプチドを薬理学的に許容される担体、例えばペプチド安定性を促進する大型分子又はペプチドのための担体を担う薬理学的に許容されるバッファーを含んで成る薬理組成物に組合せよい。以下の実施例は例示のために提供し、本発明を限定するものではない。実施例１水溶性βシート形成性ペプチドのデザイン及び合成長さ33個のアミノ酸残基のペプチドをMilligen Biosearch 9600自動ペプチドシンセサイザーで合成した。利用した手順はFmoc-BOP化学を利用するMerrifield 固相合成に基づく(Stewartら、1984 Solid phase peptide synthesis第２版Rock ford，Illinois，Pierce Chemical Co．pp.125-135)。配列が得られた後、ペプチド支持体及び側鎖保護基を酸切断した（トリフルオロ酢酸及びスキャベンジャー混合物）。粗ペプチドを逆相C18 VyDacカラムを利用してHewlett-Packard 109 0 M分析用HPLCで純度について分析した。ペプチドは一般に約90％の純度であった。更なる精製と水中の0.1％のトリフルオロ酢酸を伴う０〜60％のアセトニトリルの溶出勾配を利用して調製逆相HPLC C-18カラムで実施した。次にペプチドを６ＮのHCl、110℃で18〜20時間サンプルを完全加水分解することによりBeckma n 6300アミノ酸分析器でアミノ酸組成について分析した。Ｎ末端配列決定はペプチド純度を確認にした。４種類のペプチドのアミノ酸配列及び組成を表１に示し、そしてこのペプチドの組成を表２に示す。βpep-11は肩文字Ｄで表示の通りＤ形態のアミノ酸を含む。表１ βペプチドのアミノ酸配列この配列における「Ｘ」は異常アミノ酸ノルロイシンである。合成ペプチドはヒトPF４残基22〜54、IL-8残基22〜54及ひGro-α残基24〜56の部分を使用する。Ｃ末端アスパラギン酸残基Ｃαカルボキシレートはアミド形態にした。システイン酸化に係る潜在的な問題を回避するため、天然配列にあるシステインをセリンに置き換えた。PF４(DeuelらProc.Natl.Acad.Sci ．USA 74:22 56-2258，1 977)、IL-8(HoltらSem.Hematol. 22:151-163，1985)及びGRO(Anisowiezら、Proc .Natl.Acad.Sci ．USA 84:7199-7192，1987)ペプチドフラグメントの天然配列を図１に示す。 βpep-5は主にα−ケモカイン血小板因子４（PF４）及びインターロイキン− ８（IL-8）由来の配列より成る。ターン／ループ１及び２はPF４に由来する。ターン２はPF４ペプチド折りたたみ開始部位である。３本のストランドはほとんど IL-8に由来し、わずかな変異がある。Ｎ末端ジペプチドVTを潜在ストランド１− ２疎水性V25-L45対合を設けるために含ませた；スレオニンを26位に設置し、β シート傾向を高め、且つ溶解性を保った。IL-8ペプチドのＫ44及びＥ50位はＫ50 を有するPF４に似るようにスイッチし、潜在的な塩形成対合から任意の折りたたみ安定性を維持した。 βpep-8，βpep-11及びβpep-1はループ／ターン開始配列及び第一ターン／ループにおける別の配列を有するα−ケモカイン配列（主にストランド２及び３由来）と、本研究室の別のポリペプチドに一部由来するストランド１との組合せを利用する。α−ケモカインポリペプチドPF４，IL-8及び増殖関連ポリペプチド（ Gro-α）の類似のβシートアラインメントも一般に４種のペプチド全てにおいて保存されていた。βpep-8はIL-8配列I41-D54（IIVKLSDGRELSLD）を有し、配列の残りは殺菌性／浸透性増大ポリペプチドのβシートドメインに由来する。ストランド１に由来する３個のＮ末端残基24，26及び28をストランド２残基との適正な疎水性対合のためにＩ，Ｌ，Ｖと置き換えた。ターン１における残基の数は１増えており、従ってα−ケモカインと比べ対合残基についてのＮ末端番号を１ずらしている。 βpep-11はβpep-8とは第一ターン／ループにおいて、残基34−39のみで相違する。βpep-11において、ソマトスタチンに由来するＤ−トリプトファンを含むタイトターンモチーフ、即ちY^DWKVを使用した。２個のシステイン（システインへと以降の酸化のため）がソマトスタチンのようにβ pep-11において存在しているが、それらは還元状態に保たれている（10^-4Ｍの過重水素化(perdeuterated)メルカプトエタノールを溶液に加えた）。βpep-1はβ pep-8を基礎とし、残基L26，V28，M30-F33及びK38-D54は同じである。βpep-1 Ｎ末端(S22-S29)は別のα−ケモカインポリペプチド好中球活性化ペプチド−２( NAP-2)に由来し、そしてターン／ループ残基34−37はβpep-8におけるものの保存的置換体である。表２．βシート形成性ペプチドのアミノ酸組成実施例２ β−ペプチドシリーズの円二色性（CD）円二色性（CD）はβ−シート構造の形成を測定する一手段である。CDスペクトルをデータープロセッサーの付いたJASCO JA-710（Jasco，Eastern，Maryland）自動記録スペクトロポラリメーターで測定した。曲線をデジタル記録し、そしてシグナルの平均化及び基底値の差し引きのためにデータープロセッサーに通した。スペクトルを10mMのリン酸カリウムの存在下で５℃から65°に至るまで、185n mから250nmに至る域にわたり、0.5mmの距長の加熱ジャケット付き石英キュベットを用いて記録した。温度はNesLab湯浴を用いてコントロールした。ペプチド濃度を0.014〜0.14mMで変えた。スキャンスピードは20mm／minとした。スペクトルを８回シグナル平均化し、そして等しいシグナル平均化溶媒基底値を差し引いた。これらの実験は当業界においては周知である。 βpep-5について、CDデーターはβシート形成性PF４ペプチドについて認められたものに似ていた。CDデーターのみに基づき、βpep-5はβシートを全く形成しないようであった。13pep-5を除く全てのβペプチドについてのCDデーターは βシート構造の形成を示唆する217nmでの主要バンドを示した。これらのペプチドはほとんどβシート構造より成る。βpep-1に関し、通常の「ランダムコイル」204〜208nm CDバンドもが主に得られるNMR結果であることは驚くべきことであり、これはβpep-1が30種のペプチド全体のうち最も安定且つコンパクトなβシート構造の一つを形成することを示唆する。217nmのβシートバンドがよりネガティブになるにつれ204nmから208nmへとずれるこのバンドは安定なターン構造の結果でありうる。これらのβpepペプチドにおける温度調節式βシート折りたたみを実証するため、βpep-8，βpep-11及びβpep-1についての217nmでのモル楕円率を図２に示すように温度に対してプロットした。温度を５℃から上昇させると、217nmのバンドはよりネガティブとなり（特にβpep-11及びβpep-1に関して）、そして35 ℃と50℃との間で下降し、βシート集団の増大を示唆した。この「低温溶融」は βシートコンホメーション集団の安定化における疎水性効果の役割を実証した。特にβpep-8に関し、217nmのバンドは温度が更に上昇するにつれ一層はるかにポジティブとなった。この結果はより伝統的な構造的「溶融」を反映する。しかしながら、βpep-11及びβpep-1に関し、65°にまでの温度の上昇はβシート集団に対しての効果をあまり示さなかった。これらのデーターはβpep-11及びβpep- 1におけるβシートがβpep-8におけるものよりも比較的「安定」であることを示唆した。βpep-14〜βpep-30を比較的安定でコンパクトなβシートを形成した。当業者はβpep-5，βpep-8，βpep-11及びβpep-1についての実施した分析を本発明の30種のβpepペプチドの全て及び本発明の方法を利用して調製した全てのペプチドのために容易に実施できうることを容易に理解するであろう。実施例３ β−ペプチドシリーズの核磁共鳴(NMR) CDデーターは約40℃において最大βシート形成を示唆するため、βpep-5，βp ep-8，βpep-11及びβpep-1並びにその他のペプチドについてpH 6.3、20mMのNaC l及び40℃でNMRスペクトル（図３）を集めた。NMR測定のため、凍結乾燥させたペプチドをD₂O又はH₂O／D₂O(９：１)の中に溶かした。ポリペプチド濃度は通常１〜５nMの範囲とした。pHはμｌ量のNaOD又はDClをペプチドサンプルに添加することにより調整した。NMRスペクトルをBruker AMX-600（Bruker Instrument， Inc.，Bruker，Massachusetts）又はAMX-500NMRスペクトロメーターで獲得した。共鳴アサインメントのため、ダブル・クオンタム・フィルターCOSY(Piantimi らJ.Am.Chem.Soc.104：6800-6801，1982)及び２Ｄ−ホモ核磁気トランスファー（HOHAHA）スペクトル（最大時間60msでMLEV-17配列によりスピンロッキングによって獲得）をスピンシステムを同定するために用いた(Baxら、J.Magn.Reson ． 65:355-360，1985)。NOESY実験（Jeenerら、J.Chem.Phys. 71:4546-4553，19 79及びWiderらJ.Magn.Reson ． 56:207-234，1984)をスピンシステムを連続的につなげるため及びNOE接続を同定するために実施した。2D NMRスペクトルは：967-974，1983)又はStates-TPPI(Statesら、J.Magn.Reson ． 48：286-292，1 982)フェーズ・センシティブ(phase sensitive)モードで獲得した。水共鳴はスキャン間のリラクション・ディレーの際及びNOESY実験における混合時間の際の水フリケンシーにおいての直接照射(0.8ｓ)により抑制した。これらの実験は当業界において周知である。 2D-NMRスペクトルを256〜400tl実験として、それぞれ１ｋ又は２ｋの複合データー点で６kHzのスペクトル幅にわたり、双方のディメンジョンにおいて、キャリヤーを水共鳴に載せながら集めた。 HOHAHA（COSY）及びNOESYスペクトル（通常はそれぞれ16及び64スキャン）をtl 実験毎に時間平均した。データーをBruker AMX-600X-32で直接、又はBruker UXN MRプログラムによりBruker Aspect-1ワークステーションでオフラインで処理した。データーセットをフーリエ変換の前に30−60度シフトサイン−ベル関数により両方向においてマルチプライし、そしてtlディメンジョンにおいて１ｋへとゼロフィル(zero-filled)した。 NMRデーターは、βpep-1がβpep-5，βpep-8，βpep-11及びβpep-1のうちで、比較的よく規定されたダウンフィールドシフトされたαＨ及びNH共鳴の存在によりコンパクトな三本鎖βシートペプチド四量体を形成するのに最良であることを示唆する。類似のβシートアラインメント及びダウンフィールドシフトαＨ共鳴の数（13〜16）が任意の天然α−ケモカインにおいて認められる通りであると仮定し、そして芳香族共鳴領域へと標準化（10プロトン）することにより、この αＨ共鳴領域は完全に折りたたまれたβpep-1を示すことが推定された。ベーターベリン14Ｄと比べ、ベーターベリン14Ｄについてのβシート折りたたみ状態の NMR共鳴はそのサイズの二量体について予測されるものよりも広く、大きめの凝集体の形成を示唆する。更に、ベーターベリン14Ｄの折りたたみはβpep-1において認められるほどに明らかにコンパクトでなかった。 βpep-5，βpep-8及びβpep-11についてのNMRスペクトルもダウンフィールドシフトαＨ及びNH共鳴を示し、βシート形成が示唆される。CDデーターはβpep- 8及びβpep-11についての90％以上のβシート構造を示唆するが、NMRデーターは若干少ない量を示した。しかしながら、CDデーターはたとえ溶融球状様又は非コンパクト状態において非常に一過性であるにしても、有意なβシート構造についての徴候を示すであろう。従って、ダウンフィールド・シフト NMR αＨ共鳴の存在は比較的よく形成されたβシートコンホメーションの集団を示唆し、それらは遅い化学的交換にあり（600MHzのNMR化学シフト時間スケール）、「非コンパクト」又は「ほどけ」コンホメーション状態であり、そのαＨプロンはよりアップフィールドで共鳴する。βpep-11に関して、ダウンフィールドシフトNHが長時間(４時間)D₂Oの中に存在し、一部の構造安定性の概念を裏づけている。しかしながら、ダウンフィールドシフトpH及びNH共鳴は非常に広く、全エンベロープが約500Hzのハーフハイト(half height)であった。この共鳴の広がりは、この交換過程の結果でありうるが、似たように折りたたまれたβシートコンホメーション間での中間的な交換又は凝集状態間での交換の可能性も調べた。実施例４ β−ペプチドシリーズペプチドのパルスフィールド勾配（PFG）NMR自己拡散測定パルスフィールド勾配（PFG）NMR拡散測定(Gibbsら、J.Magn.Reson ． 93:395 -402，1991)を自己会合特性を調べるためにβpepペプチドに対して実施した。パルスフィールド勾配（PFG）NMR自己拡散測定はBruker AMX-600でGRASP勾配ユニットを用いて行った。拡散係数Ｄの測定のためのNMRスペクトルは強力にシールドされたＺ勾配コイルの付いた５mmのトリプル共鳴プローブを用いて獲得した。勾配の最大のマグニチュードは製造者（Bruker）の標準の手順により較正し、そして60Ｇ／cmとされ、それは既知の拡散定数を用いての水に対するPGFデーターの分析から得られる61Ｇ／cmの値と一致する。PFG縦渦巻−カレント・ディレーパルス−配列を全ての自己拡散測定のために用い、それはD₂Oの中で275°Ｋ〜31 0°Ｋの温度範囲で実施した。ペプチド濃度は３mg／ml〜10mg／mlに範囲させた。イソトロピック液中での分子の無制限な拡散のため、勾配パルスの非存在下で得られたシグナルへと標準化したPFG NMRシグナルアンプリチュードを下記式により換算する：Ｒ＝exp〔−γ²ｇ²δ²Ｄ（Δ−δ／３）〕ここでγは観察される核の回転磁気率であり；ｇ及びδは磁場−勾配パルスのマグニチュード及び時間のそれぞれであり、そしてΔは勾配パルス間の時間である。これらの研究に関して、実験条件はδ＝４ms、ｇ＝１〜45Ｇ／cm、Δ＝34.2 ms、そして縦渦巻−カレントディレ−Te＝100msとした。各拡散定数を種々のｇ値を利用して得た一連の15通りの一次元PFGスペクトルから決定した。実験衰退曲線を単一外挿として近似した。ペプチドについての拡散係数を球状ポリペプチドリゾチーム、リボヌクレアーゼ及びユビキチンに対する同一のPFG NMR自己拡散測定を実施することにより較正した。ここで、PFG測定値はリゾチームについては20℃で10.1×10^-7cm²／ｓのＤ値、リボヌクレアーゼについては10.2×10^-7cm²／ｓのＤ値、そしてユビキチンについては14.3×10^-7cm²／ｓのＤ値を供した。これらのＤ値は論文における値の範囲内である。無限希釈への外挿により光散乱により得られるリゾチームについての10.6×10^-7cm²／ｓ；無限希釈への外挿により光散乱より得られるリボヌクレアーゼについての10.7×10^-7cm²／ｓ、及び類似のPFG NMR測定を利用して得られるユビキチンについての14.9×10^-7cm²／ｓ(Altieriら、J.Am.Chem.Soc. 117 ：7566-7567，1995)。拡散係数におけるこの比較的良好な一致はPGF縦渦巻− カレントディレーパルス配列が正確な拡散定数値の誘導を可能にすることを示唆する。 Stokes-Einstein関係Ｄ＝K_B T／６πηRをＤを巨大分子半径Ｒに関連づけるために用い、Ｒは見かけ上の分子量の平方根Mapp^1/ ²に比例するものと考えられている(Cantorら、1980，The behavior of biologi cal macromolecules ，Biophysical Chemistry，part III，New York:W.H.Freema n pp.979-1039)。従って、ＤはMapp^-1/2に比例する。このような単純な関係から、比Ｄ_dimer／Ｄ_monomerは0.71であり、これは２つの球状二量体について理論的に推定される0.72に非常に近い(Willsら、J.Phys.Chem. 85:3978-3984，1981) 。Stokes-Einstein関係の利用は硬質球体に特異的に由来し、そして各ペプチド凝集体の実際の分子形状が拡散係数に影響するにもかかわらず、比Ｄ_aggregate ／Ｄ_monomerの最大変化は不適正な線形ペプチド四量体の場合において約20％であろう。ペプチドについてのMappは既知の分子量のモノマーについての標準品としてのリゾチーム、リボヌクレアーゼ及びユビキチンのＤ値を利用して計算した。拡散係数の温度依存性を図４にプロットした。リゾチーム、ユビキチン及びリボヌクレアーゼに基づく拡散データーでの較正により、30℃でのこれらのペプチドの平均分子量を決定した：βpep-5＝12,750；βpep-8＝9,490；βpep-11＝41, 200、そしてβpep-1＝13,700。更に、βpep-5，βpep-8及びβpep-1について、温度依存性は直線状であり、そして水の自己拡散について予測される活性化エネルギーに従った。しかしながら、凝集状態分布はβpep-8については10℃以下で、そしてβpep-11については調べた全ての温度範囲にわたって変化した。βpep- 5及びβpep-1について、これらの拡散定数に由来する平均分子量を計算したモノマー分子量（表１）で徐し、6.3の比を得た。拡散定数の温度依存性は直線状であるため、凝集状態分布はそのままであり、単一の凝集状態が存在していることが示唆された。βpep-1はコンパクトなβシート構造を示し、βpep-5はあまりはっきりしなかった。これらの見かけ上の分子量が形状及び静電気効果について補正していない事実により、誘導凝集分子量は若干変動しうる。従って、βpep-1はコンパクトな四量体として折りたたまれることがあり、一方βpep-5も四量体でありうるが、モノマーの二量体−四量体の若干の分布がありうる。一般に、これらのペプチドは四量体を形成した。凝集状態の分布はβpep-8及びβpep-11に存在していた。βpep-8スロープは10 ℃〜40℃では直線状であり続け、そして低めの温度で直線性がずれた。見かけ上の分子量、対、その計算分子量の比（表１参照）は10℃までは2.4であり、そして２℃で3.7に変化した。これらのデーターはβpep-8が平均して二量体であり、そして低温でその凝集状態をおそらくは四量体へと増大させることを示唆する。 βpep-11は最も異常な拡散特性を示した。その凝集状態の分布は温度とともに連続変化した。低温では、その平均分子量は四量体のそれであり、一方高温では、オクマーに至る大型凝集体が形成するようであった。実施例５ βpep-5，βpep-8，βpep-11及びβpep-1の内毒素中和活性及び殺菌活性これらのペプチドを内毒素を中和するその能力について試験した。これらのペプチドについての定量内毒素活性をリムルス・アモエボサイトリゼートアッセイにより測定した。細菌：Ｐ．アエルギノーザタイプ１は実験室において保存した臨床単離体である。この単離体は平滑株であり続け、そしてHommaのスキームによりセロタイプした。シュードモナス株は血液アガープレート上で毎月移し換えることにより維持した。Ｂ／PIの精製：Ｂ／PIを３段階クロマトグラフィー工程で精製した。最終段階において、サンプルを0.5ＭのNaClを含む0.05Ｍのグリシンバッファー（pH 2.5）で平衡にした１×180cmのToyopearl HW55S(Toso Ha as，Philadelphia PA)の分子量ふるいカラムに適用した。ポリペプチド濃度はHa rtee（Analytical Biochem．48:422-427(1972)）に従って決定した。純度は１mg の精製BP55ポリペプチドのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び当業界公知の技術を利用するゲルの銀染色による目視化により確認した。リムルス・アモエボサイト・リゼートアッセイ：内毒素を中和する合成ペプチドの能力をSigma Chemicals(St.Louis，MO)により製造されたE-TOXATEキットにより検定した。0.04単位（又は0.01ng）のＥ．コリ055：B5 LPSにより誘導されるリムルス・アモエボサイト・リゼートの凝集を完全に阻害するのに必要なペプチドの濃度は用量応答によりSigma Chemicalsのtechnical bulletion No.210に概略の通りに決定した。ペプチド又はＢ／PIをLPSと室温で５分、１：２にパイロジェンフリー食塩水（pH 6.4）で希釈した100μｌの容量でインキュベーションした。反応は100μｌのアモエボサイトリゼートの添加により開始し、そして最終容量は200μｌとした。LPSについて10,000の分子量とみなして、Ｂ／PI：LP Sの中和での適正なモル比は3000、対、１であった。当該ペプチドを上記の方法に従って試験した。PF４（図１参照）をネガティブコントロールとして用い、そして内毒素中和活性がないことが実証された。BG38 LはＢ／PIのアミノ酸86−108に相当し、そしてＢ／PI内のドメインは内毒素中和活性を発揮することが示された。BG38Lをこれらの実験におけるポジティブコントロールとして用いた。この内毒素中和データーを下記に示す：表３内毒素中和活性 ^a0.02Ｕの％の中和（Ｅ．コリ055：Ｂ５由来の0.2pgの内毒素） ^b５×10⁵のＰ．アエルギノーザの死滅％ ^c有効Ｍ用量（％）このデーターは本発明のβペプチドが内毒素活性の中和において有効であることを示す。実施例６殺菌活性の決定のためのアッセイ当該ペプチドはシュードモナス・アエルギノーザタイプ１、Ｐ．セバシアATCC 25608、Ｅ．コリＢ及びスタフィロコッカス・アウレウス502Aの如き様々な生物に対して標準方法により殺菌活性についてアッセイできる。シュードモナス−アエルギノーザタイプ１は臨床単離である。その単離体は平滑株であり続け、そしてHomma(Jpn.J.Exp.Med．46:329，1976)のスキームによりセロタイプした。粗株Ｅ．コリＢ及びＳ．アウレウス502AはPaul Quie、ミノネタ大学(Minneapolis，MN)より得た。Ｓ．アウレウス株の特性決定はShinefield ら(Amer.J.Dis.Chil．105:646，1963)に記載の通りにされている。シュードモナス・セパシアATCC 25608はATCCより購入できる。Ｓ．アウレウス及びＥ．コリは栄養アガープレート上で保存し、そしてシュードモナス株は血液アガープレート上で保存した。以下のアッセイ及び方法全てにわたりパイロジェンフリー溶液を使用した。対数期の細菌を脳心臓インフェージョン培地(Hovdeら、Infect.Immun．54:142-148 ，1986)の培養物から調製し、そして細菌を食塩水で洗い、そして650nmの光学密度にまで調整して再懸濁し、約３×10⁸CFU／mlの収率を得た。細菌を0.0Ｍのクエン酸リン酸バッファーpH 5.6又はpH 7.0に１：10で希釈し、アッセイに用いた。Ｓ．アウレウスはpH 5.6バッファーの中で急速に生存率が低下し、従ってpH 7 .0のみで研究した。細菌活性を約1.2×10^-4Ｍ〜約4.1×10^-9Ｍに範囲するペプチド濃度で用量応答により決定した。殺菌活性は用量応答により、好ましくは直線回帰によりLD₅₀を決定することにより決定した。結果は下記の通りである：表４ βペプチドの内毒素中和活性及び殺菌活性ａ＝0.02Ｕの％中和（Ｅ．コリ055：Ｂ５由来の0.2pgの内毒素）ｂ＝５×10⁵のＰ．アエルギノーザの死滅ｃ＝有効Ｍ用量（％）実施例７内毒素作動因子としてのβpep-3 全てのペプチド、BG22（27量体、BPI aa 82-108）、βpep-3(SEQ ID NO:６)及びBG16(LPS結合ドメインのないBPIの一部に由来するコントロールペプチドaa 17 0-199)をミネソタ大学マイクロケミカル施設において発表の通り（Mayoら、Prot ein Science 5:1301-1315，1996)mMillgren bioresearch 9600ペプチドシンセサイザーを用いて合成した。当該ペプチドのアミノ酸組成を気相エドマン分解により、逆相C18カラムの付いたApplied Biosystems 470A気相シーケネーターを用いて確認した。精製ペプチドは全ての実験において利用する前にパイロジェンフリーPBSの中に再懸濁した。βpep-3の構造は二次元核磁気共鳴及び円二色性スペクトロスコピーによりIlyine E．ら(Biochem.J．306：407-419，1995)に記載の通りにして確認した。 ^*下線付アミノ酸配列はBPIのLPS結合ドメインを示す。 ^*イタリック配列は天然IL-8のβ−ターンの開始を司るアミノ酸残基に由来する。Ｐ．アエルギノーザ及びＥ．コリ0111：Ｂ４又は055：Ｂ５に由来するLPSをLi st Biological Laboratories（Campbell，CA)より購入し、そして使用するまで４℃で保存した。市販の発色原リムルス・アメボサイトリゼート試験(Whittaker ，Walkersville，MD)を全ての溶液及び血清サンプル中の内毒素レベルを測定するために用いた。ペプチド溶液中の内毒素レベルは約0.1ng／mlと決定された。Ｅ．コリ055：Ｂ５内毒素をin vitroで中和するBG22，βpep-3及びBG16の能力を、0.01ngのLPSを５×10^-6Ｍの各ペプチドと混合することにより決定し、そして結果を0.01ngのLPSのみについて認められたものと比較した。５×10^-5のRAW 264.7細胞を24穴培養プレートの各ウェルに入れ、そして接着させた。LPS刺激の直前に、培地を除き、そして細胞を無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMDM）で洗った。細胞を37℃で10％のCO₂雰囲気の中で３時間、１）DMEMのみ、２）Ｅ．コリ0111：B4 LPSのみ、又は３）BG22，βpep-3もしくはB G16とプレインキュベーションしたＥ．コリ0111：B4 LPSとインキュベーションした。全てのグループにおいて使用したLPSの濃度は200ng／mlとした。LPS誘導T NF-α分泌の非特異的阻害を回避するため、10^-5Ｍの各ペプチドを実験ウェルにおいて利用した。インキュベーション時間の終了時に、マクロファージ上清液を集め、そしてTNF-α濃度についてアッセイした。 TNF-α濃度はBattafaranoら（前掲）に記載の通りに測定した。簡単には、RAW 細胞上清液（in vitro）又は血清(in vivo動物モデル)のいづれか全てのアッセイにおいてTNF-α感受性細胞系WEHIを使用した。濃度は精製TNF-α（Genzyme，C ambridge，MA）の希釈に基づく標準曲線から外挿し、そして全てのサンプルを三重測定した。WEHI細胞の生存率を光度計により590nmでの細胞結晶紫外光の吸収の程度を測定することにより評価した。このアッセイにおいて、吸収はWEHI細胞のTNF-αに対する曝露による細胞死及び溶解と反比例した。各実験サンプル中の TNF-αの量を標準曲線から外挿入した。哺乳動物における内毒素症を調べるため、500μｇの各ペプチドを2.0mlのパイロジェンフリー緩衝食塩水(PBS)の中の８μｇのシュードモナス・アエルギノーザLPSにex vivoで加え、そしてシェーカー上で室温にて30分インキュベーションした。各マウスに尾静脈を介して0.5mlのこの混合物を注射した(マウス当り、125μｇのBG22，BG16又はβpep-3及び２μｇのLPS)。マウスを注射の30,60，90及び120分後に安楽死させ、そして死亡する直接に集めた血液を内毒素レベル及びTNF-α濃度について分析した。各実験において全てのTNF-α及び内毒素測定は二重又は三重で行った。in viv o実験は２回実施し、再現性を確認した。得られる結果を不対合スチューデント検定を利用して比較した。図５はRAW 264.7細胞によるin vitroでのTNF-αのLPS誘導分泌を抑制するβpe p-3の能力を決定する研究の結果を示す。BG22及びβpep-3は、内毒素中和能力を全くもたないBG16と比べて内毒素を中和した（それぞれ37％及び81％、対、０％；ｐ＜0.05）。興味深いことに、βpep-3はLPSをBG22よりも有意に高い程度で中和した（表５参照：ｐ＜0.05）。注目すべきは、βpep-3とのプレインキュベーションが、BG22について認められたものと比べ、TNF-α分泌における有意に強い抑制を引き起こした（ｐ＝0.04、図５）。静脈内（IV）負荷前のLPSとペプチドBG22及びβpep-3とのプレインキュベーションは、ペプチド抜きのBG16又はLPSと比べ、測定した時点全てにおいて（30，6 0，90及び120分）血清内毒素レベルの類似の有意な低下を招いた（ｐ＜0.05、表６）。同様に、iv注射前のBG22又はβpep-3とLPSとのプレインキュベーションは、ぺプチド抜きのLPSを受容したマウスと比べ、負荷の90分後に低下した血清TNF -αレベルを供した（ｐ＜0.05、図６）。BG22又はβpep-3注射はいづれもペプチド抜きのLPSを受容したマウスと比べ低まった血清TNF-αレベルを供した。BG22 と比べβpep-3を受容したマウスにおいてTNF-αのより大きい阻害が認められたが、その差は統計学的に有意でなかった。 PBIの内毒素結合ドメインは交互の帯電及び疎水性アミノ酸残基を有する両親媒性βターンを形成する。この二次構造はペプチドとLPSとの間の結合相互作用を及ぼすのに重要でありうる。βpep-3はβターンを伴って生理pH で折りたたまれる。 βpep-3及びBG22は共に内毒素に結合するが、βpep-3はBG22と比べin vitroで内毒素を中和するうえで有意により効果的である。事実、この発見はβpepがin vitroでのマクロファージによるLPS誘導TNF-α分泌をより効果的に阻害するという能力と相関する。本発明を限定するつもりはないが、in vitroでのβpep-3の高まった抗内毒素特性を担いうる要因がその折りたたみ方にあり、即ち、それが天然抗LPSタンパク質のLPS結合ドメインに一層近似していることにあるようである。 BG22及びβpep-3はマウス内毒素症の際の循環内毒素の低下及び減じられたTNF -α分泌により実証される通り、in vivoで類似の効能を示した。いくつかの要因、例えば内因性タンパク質（例えばLBP、リポ多糖結合性タンパク質等）によるL PS結合に対する競合、並びに２）小ペプチド急速浄化又は短い半減期がマウスモデルにおけるこれらのペプチド間の有意な相違の認定のしにくさの原因でありうる。βpep-3の結合親和力はアミノ酸における部位特異的変化を介して強めることができ、そしてこのペプチドの生物半減期は本発明の方法により調製したその他のものと共に、これらのペプチドをより大きな安定担体タンパク質、例えばキーホールリンペットへモンアニンに接合させることにより増大させることができる。表５：in vitroで内毒素を中和する抗内毒素ペプチドBG22及びβpep-3の能力の決定。13pep-3はBG22又はBGl6と比べ高まった内毒素中和力を示した。表６：in vivoで内毒素症を減じめる抗内毒素ペプチドBG22及びβpep-3の能力の決定。BG22及びβpep-3は共にコントロールペプチドBG16と比べ有意に内毒素症を減じめた。 ^*ｐ＜0.05 実施例８脈管形成阻害剤としてのβペプチドシーズペプチド脈管形成因子が内皮接着分子の脈管形成媒介下降調節、脈管形成及び内皮細胞増殖を妨害又は阻害しうるとの仮説を試験するため、最も有能な脈管形成阻害剤の一つPF４及びその近縁βpep-ペプチドを内皮細胞（EC）からの内皮接着分子発現に対するその効果について試験した。天然PF４と同様に、βpep-14及びβpep- 16ペプチドはin vitroでのEC増殖の測定による決定に従い脈管形成性であることが認められた（表７）。我々は細胞間接着分子−１（ICAM-1）の発現に対するペプチドの効果も調べ、なぜなら当初の研究において、ブロッキング抗体の利用を介し、ICAM-1／LFA-1相互作用が白血球／EC接着及び管外遊出において最も重要あることが示されているからである。第一の実験シリーズにおいて、PF４及びβpepペプチドをbFGF（線維芽細胞増殖因子）媒介式ICAM-1下降調節を妨害するその能力について試験した。脈管形成及び内皮細胞増殖の阻害はbFGF媒介式ICAM-1下降調節の完全な阻止をもたらすことがわかった。ECと10ng／mlのbFGFとの３日間のプレインキュベーションはICAM -1の著しい調節をもたらした。同時に、100μｇ／mlの各PF４，βpep-14，βpep -16又は培地を添加した。平均ICAM-1蛍光強度値を決定した。100μｇ／mlのPF４の添加はICAM-1の発現を高めた。bFGF及びPF４の同時添加はICAM-1発現の消失をもたらさなかった。また、PF４近縁ペプチドβpep-14及びβpep-16の添加はbFGF 媒介式下降調節の完全阻止を供した。腫瘍関連ECの in vivo状態はICAM-1の低発現又は非存在さえも包括するため、次の実験セットはbFBFプレインキュベーション後のICAM-1発現を再誘導する能力を研究することを担いとした。bFGF媒介式ICAM-1下降調節の長さは７日以上であることが事前に実証されている。下降調節されたICAM-1レベルを実現するECの10 0μｇ／mlのPF４による処理は、bFGFの存在下でさえも、ICAM-1の再誘導をもたらした。βpep-14及びβpep-16は類似の結果を示した。これらの実験において、 HUVECをbFGFで３日間予備処理し、その後PF４を３日間加えておき、そして表示している場合は最後の16時間の培養においてTNF-αを加えた。ヒト臍帯静脈由来の内皮細胞(HUVEC)を正常なヒト臍帯から既に発表の通り0.125％のトリプシン／ EDTAによる灌流により集めた。細胞を培養培地(RPMI-1640、20％のヒト血清（HS ）、２mMのグルタミン並びに100Ｕ／mlのペニシリン及び0.1mg ／mlのストレプトマイシン)中でフィブロネクチン（FN）コート組織培養フラスコの中で培養した。間接PE接合試薬を利用する免疫蛍光は３回の独立インキュベーションを要する。１×10⁵のECを１％のパラホルムアルデヒドの中で１時間固定し、20μｌの適当に希釈したMAbの中に再懸濁し、そして氷上で１時間インキュベーションした。次いで細胞をPBS／BSA（0.1％）の中で２回洗い、そしてビオチニル化ウサギ−抗マウスIgG（Dako，Glostrup，Denmark）と更に30分インキュベーションした。更に２回洗浄後、細胞をストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Dako）とインキュベーションした。染色した細胞をFACSca nフローサイトメーターで分析した。データー分析はPCLysysソフトウェア（Bect on Dickinson，Mountain View，CA）を用いて実施した。観察された相違の統計学的な有意性をスチューデントｔ検定を利用して決定した。炎症性サイトカインを刺激するECのアネルギーを次の一連の実験にかけた。これらの実験に関し、HUVEC(ヒト血管内皮細胞)を10ng／mlのbFGFで３日間予備処理した。次に細胞を３日間100μｇ／mlのbFGFと共にPF４の存在下で継代培養した。培養の最後の16時間において４ng／mlのTNFαを加え、ICAM-1の上昇調節を誘導した。脈管形成刺激化ECの減少した炎症応答はPF４による同時処理により解消されることがわかり、そして類似の結果がβpep-14及びβpep-16について認められた。タンパク質レベルでのICAM-1の調節はICAM-1メッセージの検出のためのノーザンブロット分析で確認した。これらの実験において、HUVECをbFGFと３日間培養し、そしてPF４（100μｇ／ml）で最後の４及び24時間にて処理した。TNF αをRNAの単離の２時間前に加えた。様々な時点でのbFGFとインキュベーションした半集密EC培養物(75cm²のペトリ皿)由来のRNAをRNA-201キット（Campro Scie ntific，Houston，TX）を用いて単離した。各サンプルについての全RNA(10μｇ)を0.8％のホルムアルデヒド変性ゲルで分け、ニトロセルロース（Hybond N⁺，Amersham International，Amersham，UK）に移し、そしてヒトICAM-1遺伝子の機能配列を含む³²Ｐ−ラベル化1.9kbのcDNAプローブ（Dr．B.Seedからの贈呈品）とハイブリダイズさせた。膜を0.2×SSC、0.1％のS DS、50℃の高ストリンジェンシーで１時間洗浄した。フィルターをＸ線フィルム（Kodak X-Omat，Eastman Kodak Company，Rochester，NY）に増感スクリーンを用い−80℃で12hr以上曝露した。オートラジオグラフをレーザーデンシトメーター（Model GS670，Bio-Rad，Hercules，CA）を用いるスキャニングにかけ、そしてデーターをMolecular Analyst PC（商標）ソフトウェアで分析した。主要ICAM -1 mRNA転写物の強度をコントロールとして用いるアクチンmRNA発現に対して標準化した。観察される現象に対する機能的影響を先に発表の通りにして(Griffioenら、Ca ncer Res．56:1111-1117，1996)白血球／EC接着アッセイにより示した。培養HUV ECに対する白血球接着のbFGF媒介阻害はPF４又は近縁ペプチドの存在下で完全に消失した。PF４の存在下でのbFGFプレインキュベーションしたHUVECに対する接着のTNF媒介式上昇調節はTNF処理コントロール細胞に対する接着と似ていた。PH A活性化末梢血液Ｔリンパ球を37℃で１時間TNF-α（４ng／ml）、bFGF（10ng／m l）＋PF４（100μｇ／ml）処理、又はコントロール(HUVEC)に対して接着させた。接着しなかった細胞を除き、そして接着細胞を倒立顕微鏡で数えた。３回のうちの一回の代表実験の値を高力場当りの接着細胞数として表わす。統計学的な有意性をスチューデントｔ検定により決定する。これらの結果は固形腫瘍の外成長及び転移を阻止するものと実証されている脈管形成及び内皮細胞増殖の阻害が接着分子の下降調節及び炎症性サイトカインによる刺激によるアネルギーを解消できることを示唆する。脈管形成のその他の阻害剤の効果を記すための実験においてトロンボスポンジン−１及びIP-10について同じ結果が得られた。しかしながら、EC増殖にin vi troで影響を及ぼさないメタロプロティナーゼ阻害剤BB-94(バチマスタット)及びタリドミドはICAM-1発現に影響を及ぼさなかった。我々はICAM-1調節がEC増殖に関する調節機構と一致すると考えた。本結果は効率的な白血球浸潤の形成に必要な接着分子が脈管形成因子の調節下にあるだけでなく、脈管形成阻害の条件下でも誘導されることを示唆した。in vivoでのEC増殖及びEAMの調節の特異的な阻害は癌治療における強力な手段である。合成非内因性活性ペプチド（例えばβpep 型ペプチド、例えばβpep-14）の規定はこのアプローチに寄与するであろう。表７．種々の脈管形成阻害剤によるEC増殖(³H)チミジン組込の阻害 EC増殖は³〔Ｈ〕チミジン組込みアッセイを利用して測定した。して培養培地の中で３日間増殖させた。一部の培養物において、ECの増殖は10ng ／mlのbFGFとのインキュベーションにより高まった。アッセイの最後の６時間の間、培養物に0.5μCiの〔メチル−³Ｈ〕チミジン／ウェルをパルスした。結果を三重培養物で１分当りの数平均カウントとして表示する。 βペプチド１〜24を³Ｈチミジン組込みを利用して内皮細胞増殖アッセイで試験した。ペプチドの少なくとも半分は内皮細胞増殖の抑制において2.1マイクロモラーで若干活性であった。これらの結果を表７に示す。βpep-23及びβpep-24 は0.26マイクロモラーで約30％有効であった。これらのペプチドは細胞間接着分子（ICAM）発現を調節することもできる。このレセプターは腫瘍を下降調節し、そしてICAMを上昇調節するのに有効な試薬は腫瘍増殖を制御する潜在的に有用な治療剤である。最も脈管形成性であったものはICAM調節においてほとんど有効でなかった。βペプチドが同じ又は類似の正電荷、対、負量比を有するか、同じ活性を共存しないことは、ペプチドが特異的に機能することを示唆する。例えば、βpe p-8はごくわずかな細胞増殖活性を示し、一方βpep-24は細胞増殖の制御において非常に良好であった。当業者はここに記載のアッセイ及び開示のβpep配列を、本発明に係る更なるペプチドを作製するための方法と共に、ICAM上昇調節活性を有するペプチド及び内皮細胞増殖活性を有するペプチドをめんどうな実験をすることなく同定するのに容易に利用することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/04 Ｃ０７Ｋ 1/04 1/06 1/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者マヨ，ケビンアメリカ合衆国，ミネソタ 55305，ミネトンカ，クラウンヒルレーン 13800 (72)発明者グリフィオエン，アルジャンダブリュ. オランダ国，エヌエル―6202 エーゼットマーストリッチ，ピー．デビーラーン 25，ユニバーシティホスピタルマーストリッチ，トゥモーアンジオジェネシスラボラトリー，デパートメントオブインターナルメディスン

Claims

【特許請求の範囲】１．約35％以上の疎水性側鎖をもつアミノ酸を有する水溶性ペプチドを合成するための方法であって、帯電した側鎖を有するアミノ酸及び無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を疎水性側鎖を有するアミノ酸と組合せることを含んで成り、ここで当該帯電した側鎖を有するアミノ酸は少なくとも約２：１の正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比において供与されている、方法。２．（ａ）前記水溶性ペプチドが約35〜約55％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を有し；そして（ｂ）前記疎水性側鎖を有するアミノ酸のうちの少なくとも２個が、この疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸がβシート構造を形成するよう対合態様で並ぶことができるような状況で介在ターン配列をもつ当該ペプチド内に配置されている；請求項１記載の方法。３．前記ターン配列がLXXGRであり、ここで各Ｘは独立してＫ，Ｎ，Ｓ及びＤより成る群から選ばれる、請求項２記載の方法。４．正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比が約５：１以下である、請求項２記載の方法。５．前記ペプチドが約50％未満の無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項２記載の方法。６．前記ペプチドが約20％未満の無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項２記載の方法。７．前記疎水性側鎖が脂肪族基もしくは芳香族基、又はそれらの組合せを含む、請求項２記載の方法。８．前記ペプチドが約40％〜約50％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項２記載の方法。９．前記疎水性側鎖を有するアミノ酸のうちの少なくとも３個が、この疎水性基を有する３個のアミノ酸がβシート構造を形成するよう対合態様で並ぶことができるような状況で２つの介在ターン配列をもつ当該ペプチド内に配置されている、請求項２記載の方法。 10．前記疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸の間に少なくとも３個の介在アミノ酸がある、請求項２記載の方法。 11．前記疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸の間に約16個以下のアミノ酸がある、請求項10記載の方法。 12．前記介在アミノ酸が疎水性側鎖、帯電した側鎖又は無帯電の極性側鎖を有する、請求項10記載の方法。 13．前記アミノ酸が実質的に疎水性の表層を形成するよう折りたたまれたペプチド内に立体的に配置されている、請求項２記載の方法。 14．前記アミノ酸が折りたたまれたペプチド内に立体的配置され、一のペプチド分子が多量体を形成する別のペプチド分子と自己会合できるようになっている、請求項13記載の方法。 15．請求項１記載の方法により製造された水溶性ペプチド。 16．請求項２記載の方法により製造された水溶性ペプチド。 17．約35％以上の疎水性側鎖を有する水溶性ペプチドを合成するための方法であって、帯電した側鎖を有するアミノ酸及び約20％未満の無帯電の極性側鎖を有するアミノ酸を疎水性側鎖を有するアミノ酸と組合せることを含んで成り、ここで：（ａ）当該帯電した側鎖を有するアミノ酸は少なくとも約２：１の正に帯電した側鎖を有するアミノ酸、対、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸の比において供与されており；そして（ｂ）当該水溶性ペプチドは約35〜約55％の疎水性側鎖を有するアミノ酸を有し；そして（ｃ）当該疎水性側鎖を有するアミノ酸のうちの少なくとも２個は、この疎水性側鎖を有する２個のアミノ酸がβシート構造を形成するよう対合態様で並ぶことができるような状況で介在ターン配列をもつ当該ペプチド内に配置されており；そして（ｄ）当該ターン配列はLXXGRであり、ここで各Ｘは独立してＫ，Ｎ，Ｓ及びＤより成る群から選ばれる；方法。 18．請求項17記載の方法により製造された水溶性ペプチド。 19．長さにおいて約20〜50個のアミノ酸である、請求項18記載の水溶性ペプチド。 20．長さにおいて約28〜33個のアミノ酸である、請求項18記載の水溶性ペプチド。 21．βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜30）より成る群から選ばれる、水溶性ペプチド。 22．細菌感染症又は内毒素ショックを処置するための方法であって、哺乳動物に細菌感染症を抑制する又は内毒素を中和するのに有効な量の薬理組成物を投与することを含んで成り；ここで当該組成物は（ａ）βpep-1〜βpep-30（SEQID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる殺菌活性又は内毒素中和活性を示すペプチド；及び（ｂ）薬理学的に許容される担体；を含んで成る、方法。 23．前記ペプチドが内毒素を中和する、請求項22記載の方法。 24．前記ペプチドが殺菌性である、請求項22記載の方法。 25．前記ペプチドが殺菌性であり、且つ内毒素を中和する、請求項22記載の方法。 26．前記ペプチドが内毒素中和活性を有し、そしてβpep-8及びβpep-23より成る群から選ばれる、請求項22記載の方法。 27．前記ペプチドが細菌活性を有し、そしてβpep-19，βpep-7，βpep-4，β pep-22及びβpep-1より成る群から選ばれる、請求項22記載の方法。 23．哺乳動物のTNF-αレベルを抑制するための方法であって、（ａ）βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる細菌活性又は内毒素中和活性を示すペプチド；及び（ｂ）薬理学的に許容される担体；を含んで成る治療的に有効な量の薬理組成物を投与することを含んで成る方法。 29．前記ペプチドがβpep-3である、請求項28記載の方法。 30．内皮細胞増殖を抑制するための方法であって、 βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる内皮細胞増殖抑制を示すペプチドを含んで成る有効量の組成物を投与することを含んで成る方法。 31．前記組成物が（ａ）βpep-14又はβpep-16より成る群から選ばれるペプチド；及び（ｂ）薬理学的に許容される担体を含んで成る治療的に有効な量の薬理組成物である、請求項30記載の方法。 32．細胞間接着分子発現を促進するための方法であって、 βpep-1〜βpep-30（SEQ ID NO:１〜SEQ ID NO:30）より成る群から選ばれる細胞間接着分子発現を促進するペプチドを含んで成る有効量の組成物を投与することを含んで成る方法。