BRPI0803381A2 - método para produzir uma proteìna tat-hoxb4h, proteìna tat-hoxb4h, e, métodos para intensificar a mobilização de hscs da medula óssea para o sangue periférico e para melhorar o tempo de recuperação de um paciente que sofreu o transplante de hsc, irradiação ou quimioterapia - Google Patents
método para produzir uma proteìna tat-hoxb4h, proteìna tat-hoxb4h, e, métodos para intensificar a mobilização de hscs da medula óssea para o sangue periférico e para melhorar o tempo de recuperação de um paciente que sofreu o transplante de hsc, irradiação ou quimioterapia Download PDFInfo
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Abstract
MéTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEINA TAT-HOXB4H,PROTEINA TAT-HOXB4H, E, MéTODOS PARA INTENSIFICAR A MOBILIZAçãO DE HSCs DA MEDULA óSSEA PARA O SANGUE PERIFéRICO E PARA MELHORAR O TEMPO DE RECUPERAçãO DE UM PACIENTE QUE SOFREU O TRANSPLANTE DE HSC, IRRADIAçãO OU QUIMIOTERAPIA A presente invenção refere-se a um método novo e não óbvio para produzir a proteína de fusão TAT-HOXB4H marcada por histidina C- terminal, provendo beneficios não esperados de estabilidade e rendimento aumentados para permitir para administração in vivo desta proteína,e composição farmacêutica compreendendo um ingrediente eficaz, TAT- HOXB4H, tendo atividade estimuladora na produção de células hematopoiéticas. Mais especificamente, a proteína TAT-HOXB4H recombinante intensifica enxerto de transplantes de medula óssea, reconstrução hematopoiética, repopulação de medula óssea e número de células tronco circulantes, particularmente após quimioterapia e irradiação.
Description
"MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA TAT-HOXB4H,PROTEÍNA TAT-HOXB4H, E, MÉTODOS PARA INTENSIFICAR AMOBILIZAÇÃO DE HSCs DA MEDULA ÓSSEA PARA O SANGUEPERIFÉRICO E PARA MELHORAR O TEMPO DE RECUPERAÇÃO DEUM PACIENTE QUE SOFREU O TRANSPLANTE DE HSC5IRRADIAÇÃO OU QUIMIOTERAPIA"
Campo da InvençãoA presente invenção diz respeito a um método novo e nãoóbvio de produzir a proteína de fusão TAT-HOXB4 rotulada por histidina determinal C (TAT-HOXB4H) contendo pelo menos 6 resíduos de histidina noterminal C. O método de produção fornece benefícios não esperados deestabilidade e de rendimento aumentados, que permite a administração bemsucedida in vivo desta proteína.
Fundamentos da InvençãoO interesse crescente na medicina regenerativa estimulou apesquisa de células tronco específicas de órgão ou células auto-renovadoras.A população melhor estudada de células auto-renovadoras são as célulastronco hematopoiéticas (HSCs) assim como estas são opções inovadoras parao tratamento de doenças de câncer à doença metabólica à imunodeficiências.
O processo de formação de célula sangüínea, por meio da qual ascélulas sangüíneas vermelhas e brancas são substituídas através da divisão deHSCs localizada na medula óssea é denominado hematopoiese. O HSCs tem aspropriedades chave de serem capazes de se auto-renovar e diferenciar em célulasmaduras tanto de linhagens linfóides quanto mielóides. Entretanto, os mecanismosgenéticos responsíveis para o controle de respostas de auto-renovação ediferenciação de divisões de HSC permanecem grandemente desconhecidos.
Correntemente, o transplante de HSCs humano a partir damedula óssea humana, sangue periférico mobilizado e sangue do cordãoumbilical (UCB) foi usado clinicamente para o tratamento de câncereshematopoiéticos (leucemias e linfomas) e para auxiliar a recuperação dosistema imune da quimioterapia de dose alta de cânceres não hematopoiéticos.Entretanto, o transplante eficiente requer quantidade substancial de HSCs apartir de fontes diferentes e pode requerer expansão.
O HSCs pode ser originado da medula óssea, sangue periféricoe UCB. A extração de células da medula óssea requer cirurgia e, portanto,torna o método menos favorável. O uso de células sangüíneas periféricastambém é um problema por causa da dificuldade de obter HSCs qualificadosdo paciente comprometido pela hematopoiese que sofre de doença ou dequimioterapia. Os UCBs são, relativamente, obtidos de maneira mais fácil e aqualidade do HSCs é muito mais alta, entretanto, o número de HSCs obtidos apartir deste método ainda é limitado. O número de células, a partir de cadaextração é suficiente para uma criança, mas pode ser insuficiente para umadulto. Para superar este problema potencial, um novo método que facilita aproliferação de HSC in vitro pela intervenção do processo de auto-renovaçãode célula tronco é realmente necessário para o transplante de HSC.
Foi indicado que os fatores de transcrição desempenham umpapel crítico na regulação da expressão genética e da diferenciação em célulastronco (Orkin, S. H. Nature Reviews Genetics 1, 57-64, 2000). O fator detranscrição muda vários processos celulares através da ligação ao alvo degene específico e esta regulação também depende de sua concentraçãocelular. Um grupo de fatores de transcrição denominados homeobox deligação de DNA (HOX) foi previamente observado desempenhar um papelprincipal na embriogênese. Recentemente, a família de HOX também éobservada estar envolvida no desenvolvimento de HSCs (Buske, C. et. al., J.Hematol. 71, 301-308, 2000). A regulação da auto-renovação de HSC pelofator de transcrição de HOX foi estudado pelo Dr. Guy Sauvageau daUniversity of Montreal. O grupo de Sauvageau mostrou que o gene homeoboxHOXB4 é critico na regulação de auto-renovação de HSC quanto a suacapacidade de manter a população de HSC na medula óssea. Os genes HOXexpressados nas células sangüíneas foram primeiro observados em linhascelulares humanas e de camundongo. Alguns tipos de genes HOX sãoexpressados ubiqüamente em vários tipos celulares, enquanto outros sãoespecificamente processados em certos tipos de células ou certos pontos detempo durante o desenvolvimento. Por exemplo, oito membros de grupo deHOXB humano são expressados em estágio precoce do desenvolvimento deeritrócito. Entretanto, os genes de HOXB, tais como HOXB4 e HOXB7também são expressados em células T e células Β. O grupo de Sauvageauconfirmou que nove genes HOXA, oito HOXB e quatro HOXC sãoexpressados em célula de medula óssea CD34+. Entre estas, as células demedula óssea CD34+, HOXB2, HOXB9 e HOXAlO são as mais enriquecidasem células progenitoras de eritrócito. Entretanto, nenhum gene HOX éexpressado em células CD34". O gene homeobox B4 (HOXB4) humano foirecentemente demonstrado expandir eficazmente HSCs em uma forma deproteína retro viral ou recombinante. As proteínas TAT-HOXB4recombinantes foram usadas para expandir as células tronco em escala delaboratório sem o risco de inserção retroviral ou co-cultura com célulasestromais da medula óssea (Ver Krosl, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003). Portanto, a proteína HOXB4 é regularmente usada como umestimulante para promover a expansão de HSCs in vitro (Figura 1).
Evidência recente indicou que, pela adição da seqüência tag deproteína TAT no terminal N de HOXB4, HOXB4 exógeno pode ser liberadonas células. Esta seqüência TAT direciona o transporte de HOXB4 do ladoextracelular no lado intracelular. Na entrada do citosol, o HOXB4 pode serredobrado em sua conformação natural por chaperon HSP90. TAT-HOXB4 écapaz de promover a proliferação de HSC de 2 a 6 vezes (Amsellem, S. et. al.,Nature Medicine 9, 1423-1427, 2003; Krosl, J. et. al., Nature Medicine 9,1428-1432, 2003). Entretanto, o rendimento de proteína TAT-HOXB4recombinante de Ε. coli usando-se o procedimento de purificação regular émuito baixo.
Em um esforço para aumentar o rendimento da proteína TAT-HOXB4 recombinante, um método de fabricação de uma proteína TAT-HOXB4H com seis resíduos de histidina adicionais rótulos no terminal C foidesenvolvido, o qual resultou em rendimento de 3 a 4 vezes em comparaçãocom aquele da proteína original após a purificação. A proteína recombinanteresultante (TAT-HOXB4H) contém 6 resíduos de histidina no terminal C. estemétodo foi descrito em detalhes no pedido PCT PCT/CN2006/000646.
Foi mostrado que a proteína recombinante TAT-HOXB4Hpode ser usada para expandir o sangue periférico humano ou células troncoUCB e as células tronco expandidas ainda possuem sua pluripotência. Alémdisso, as células tronco tratadas com a proteína recombinante TAT-HOXB4Hincorporada na medula óssea de camundongos com imunodeficiênciacombinada grave diabéticos não obesos (NOD-SCID) e os leucócitoshumanos foram detectados nas células sangüíneas brancas periféricas,indicando reconstituição imune e de hematopoiese nos camundongos.
Entretanto, a proteína recombinante TAT-HOXB4Hs nunca foiusada antes como o estimulador de hematopoiese in vivo, especificamente,para intensificar a reconstituição hematopoiética, expansão, re-população damedula óssea e para aumentar o número de células tronco circulantesperiféricas, particularmente, após a quimioterapia ou irradiação. Krosl et al.(2003) e Amsellem et al. (2003) não foram capazes de obter grandesquantidades de proteína de HOXB4 altamente estáveis a serem usadas emestudos clínicos para expandir HSCs. Na presente invenção, a quantidade totalda proteína TAT-HOXB4H obtida após a purificação, no geral, varia de 6 a10 mg por 1 litro de cultura, enquanto a quantidade total de proteína TAT-HOXB4 obtida após a purificação a partir de um litro de cultura usando-se osmétodos da técnica anterior, no geral, varia de 1 a 2 mg. O plasmídeo pTAT-ΗΑ-ΗΟΧΒ4 usado para a expressão de proteína TAT-HOXB4 usando-se osmétodos da técnica anterior foi um donativo de Dr. Guy Sauvageau,University of Montreal, Canadá. O método de purificar a proteína TAT-HOXB4H usando-se a presente invenção claramente indica o rendimentoaumentado de proteína necessária para a administração in vivo. Krosl et al.(2003) também relatou que a maioria de sua proteína TAT-HOXB4 foiperdida após 4 h de incubação no meio com soro. A presente invenção mostrauma estabilidade significantemente alta de proteína TAT-HOXB4H mesmoapós 4 semanas, que é um fator chave para o uso de proteína TAT-HOXB4em estudos clínicos.
Sumário da InvençãoA presente invenção está fundamentada no método novo e nãoóbvio de produzir a proteína TAT-HOXB4H com rendimento e estabilidadealtos e na descoberta que a proteína recombinante TAT-HOXB4H, quandoadministrada a um indivíduo em necessidade deste, aumenta o número deHSCs tanto na medula óssea quanto no sangue periférico in vivo.
Um aspecto da invenção diz respeito a um método de produziruma proteína TAT-HOXB4H. O método compreende: (a) fornecer uma célulahospedeira que compreende um vetor que codifica a proteína; (b) expressar aproteína na célula hospedeira; (c) coletar uma solução impura da proteínaexpressada; (d) purificar a proteína da solução por: (i) aplicação da solução auma coluna HisTrap; (ii) lavar a coluna HisTrap; (iii) eluir a proteínaparcialmente purificada da coluna HisTrap para formar uma solução deproteína parcialmente purificada; (iv) aplicar a solução de proteínaparcialmente purificada a uma coluna MonoSP; (v) lavar a coluna MonoSP;(vi) eluir a proteína purificada da coluna MonoSP da forma desnaturada; (e)dobrar novamente a proteína desnaturada eluída usando-se compostoshidrofóbicos por (i) combinação da proteína desnaturada eluída e uma soluçãode compostos hidrofóbicos para formar uma solução de proteína e compostoshidrofóbicos; (ii) dessalinizar a solução de proteína e compostos hidrofóbicospara obter uma proteína dessalinizada e solução de composto hidrofóbico; (iii)remover os compostos hidrofóbicos da solução de proteína dessalinizadausando-se ultrafiltração.
Um aspecto da invenção diz respeito a um método paraintensificar a mobilização de HSCs da medula óssea para o sangue periférico.O método compreende: a) administrar uma quantidade eficaz de um proteínaTAT-HOXB4H produzida pelos métodos descritos neste a um indivíduo emnecessidade deste e b) deixar a proteína TAT-HOXB4H aumentar o númeroabsoluto das células tronco hematopoiéticas na medula óssea do indivíduodesse modo, intensificando a mobilização das células tronco hematopoiéticasao sangue periférico do indivíduo.
Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método para amelhora do tempo de recuperação de um paciente que sofreu transplante deHSC5 irradiação ou quimioterapia. O método compreende: a) administrar umaquantidade eficaz de um proteína TAT-HOXB4H produzida pelos métodosdescritos neste a um indivíduo em necessidade deste e b) deixar a proteínaTAT-HOXB4H aumentar o número absoluto de HSCs na medula óssea doindivíduo.
Um aspecto da invenção diz respeito a uma composiçãofarmacêutica para a mobilização de HSCs da medula óssea para o sangueperiférico em um indivíduo em necessidade deste. A composiçãofarmacêutica da invenção inclui uma quantidade eficaz de uma proteína TAT-HOXB4H produzida pelos métodos descritos neste suficiente para aumentar onúmero absoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo desse modo,intensificando a mobilização of HSCs ao sangue periférico do indivíduo.
A composição farmacêutica da invenção pode ser administradaa um paciente que sofreu transplante de HSC autólogo para a melhora dotempo de recuperação após o transplante de HSC.A composição farmacêutica da invenção pode ser administradaa um paciente insensível ao fator estimulador da colônia de granulócito (G-CSF) como um substituto do G-CSF para a mobilização de HSCs para osangue periférico.
A composição farmacêutica da invenção pode ser administradaa um doador de HSC desse modo, permitindo que uma quantidade suficientede HSCs seja coletada para o transplante em um procedimento muito menosinvasivo a partir do sangue periférico no lugar da medula óssea do ditodoador.
Um outro aspecto da invenção diz respeito ao tratamento dedoenças causadas pela deficiência de HSC hereditária pela administraçãosistêmica de uma quantidade eficaz de uma proteína recombinante TAT-HOXB4H produzida pelos métodos descritos neste ou de uma composiçãofarmacêutica que compreende o mesmo a uma indivíduo que sofre dasdoenças. A proteína recombinante TAT-HOXB4H administrada desse modo,aumenta o número absoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo.
Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método para amelhora do tempo de recuperação após o transplante de HSC pelaadministração sistêmica de uma quantidade eficaz de um proteínarecombinante TAT-HOXB4H produzida pelos métodos descritos neste ou deuma composição farmacêutica que compreende a mesma a um indivíduo emnecessidade deste.
Ainda, um outro aspecto da invenção diz respeito a um métodopara intensificar a recuperação de HSC de um paciente que recebe irradiaçãoou quimioterapia pela administração sistêmica de uma quantidade eficaz deum proteína recombinante TAT-HOXB4H produzida pelos métodos descritosneste ou de uma composição farmacêutica que compreende o mesmo a umindivíduo em necessidade deste.
Breve Descrição das FigurasOs aspectos precedentes e as vantagens desta invençãotornam-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada com referênciaaos desenhos anexos em que:
A Figura 1 mostra uma representação esquemática demobilização de HSCs das células CD34 para o sangue periférico (PB) pelaexpansão in vivo.
A Figura 2 mostra a representação esquemática de construçãoe clonagem de pTAT-HOXB4H no vetor pET21b modificado.
A Figura 3 representa a seqüência de DNA de pTAT-HOXB4H. Os 6 resíduos de histidina adicionais introduzidos nos terminais N-e C em pTAT-H0XB4H são sublinhados e TAT é realçados.
A Figura 4 mostra uma seqüência de proteína de proteínaTAT-H0XB4H.
A Figura 5 mostra 10 % de SDS-gel de poliacrilamida (1,5mm) demonstração da purificação de TAT-HOXB4H. O SDS-gel depoliacrilamida foi tingido com coomassie blue. Coluna 1, marcadores de pesomolecular (M)5 0,3 μg de proteína; coluna 2, lisado celular de célulasBL21(DE3)pLysS não induzidas que expressam proteína TAT-HOXB4H, 1μg de proteína; coluna 3, lisado celular de células BL21(DE3)pLysSinduzidas que expressam a proteína TAT-HOXB4H com 1 mM de IPTG, 1μg de proteína; coluna 4, TAT-HOXB4H purificada, 0,7 mg de proteína;coluna 5, TAT-HOXB4 purificada (0,2 mg de proteína). O plasmídeo pTAT-HA-HOXB4 usado para expressar a proteína TAT-HOXB4 (coluna 5) foi umdonativo de Dr. Guy Sauvageau, University of Montreal, Canadá. O volumeigual de frações que foi coletado da coluna MonoSP, foi carregado nascolunas 4 e 5.
A Figura 6 mostra a análise de SDS-gel de poliacrilamida daestabilidade de proteína TAT-HOXB4H purificada armazenada em PBS por 0horas (A) e 16 horas (B) a 4o C, M representa marcadores de peso molecular, 0representa O horas de incubação a 4o C, 16 representa 16 horas de incubação a4° C.
A Figura 7 mostra a estabilidade de proteína TAT-HOXB4Harmazenada a 4° C e -20° C em PBS e tampão de armazenagem, IMDM,analisado por 10 % SDS-poliacrilamida seguido pelo tingimento porcoomassie. As setas indicam faixas de proteína TAT-HOXB4H.
A Figura 8A mostra um efeito estimulador de G-CSF nonúmero de células tronco CD34+ na medula óssea de camundongos analisadospor um citômetro de fluxo.
A Figura 8B mostra um efeito de PBS no número de célulastronco CD34+ na medula óssea de camundongos analisados por um citômetrode fluxo.
A Figura 8C mostra um efeito estimulador de TAT-HOXB4Hno número de células tronco CD34+ na medula óssea de camundongosanalisados por um citômetro de fluxo.
A Figura 9A mostra um efeito estimulador de G-CSF nonúmero de células tronco CD34+ na medula óssea de Macacos resusanalisados por um citômetro de fluxo.
A Figura 9B mostra um efeito estimulador de TAT-HOXB4Hjunto com G-CSF no número de células tronco CD34+ na medula óssea deMacacos resus analisados por um citômetro de fluxo.
A Figura 9C mostra um efeito estimulador de TAT-HOXB4Hno número de células tronco CD34+ na medula óssea de Macacos resusanalisados por um citômetro de fluxo.
A Figura 9D mostra um efeito de PBS no número de célulastronco CD34+ na medula óssea de Macacos resus analisados por um citômetrode fluxo.
A Figura 10 mostra efeito de proteína TAT-HOXB4H narecuperação hematopoiética em camundongos NOD-SCID.A Figura 11 mostra efeito de proteína TAT-HOXB4H narecuperação hematopoiética em camundongos Balb/c após a quimioterapiacom cisplatina.
Descrição Detalhada
I. Proteína TAT-HOXB4H
A presente invenção diz respeito a um método novo e nãoóbvio de produzir a proteína TAT-HOXB4H, fornecendo benefícios nãoesperados de estabilidade e rendimento não aumentados, que permite aadministração in vivo desta proteína. A proteína TAT-HOXB4H é umaconstrução que compreende três elementos: TAT, HOXB4 e um rótulo dehistidina. HOXB4 é um membro da família HOX de fatores de transcrição epromove a expansão de HSC. TAT permite que a porção de HOXB4 sejatransportada na célula. O rótulo de histidina permite o rendimento aumentadoinicial de fontes de expressão de recombinação, embora o método deprodução ainda aumente o rendimento da proteína. pTAT-HOXB4H foiconstruído como mostrado na Figura 2 e a seqüência de DNA é mostrada naFigura 3. A proteína recombinante TAT-HOXB4H refere-se a uma proteínade fusão TAT-HOXB4 com seis resíduos de histidina adicionais rotulados noterminal C (Figura 4)
A não ser que indicado de outra maneira, uma seqüência deaminoácido da proteína (isto é, sua "estrutura primária" ou "seqüênciaprimária") pode ser escrita a partir do terminal amino até o terminal carbóxi.Em sistemas não biológicos (por exemplo, aqueles que utilizam síntese emestado sólido), a estrutura primária de uma proteína (que também inclui locaisde ligação de bissulfeto (cisteína)) pode ser determinada pelo usuário.
Uma "anulação" refere-se a uma mudança em uma seqüênciade aminoácido ou de nucleotídeo devido à ausência de um ou mais resíduosde aminoácido ou de nucleotídeos. Os termos "inserção" ou "adição" refere-se à mudanças em uma seqüência de aminoácido ou nucleotídeo além de umou mais resíduos de aminoácido ou nucleotídeos, respectivamente, a umamolécula ou representação destes, em comparação com uma seqüência dereferência, por exemplo, a seqüência encontrada na molécula de ocorrêncianatural. Uma "substituição" refere-se à substituição de um ou maisaminoácidos ou nucleotídeos por aminoácidos ou nucleotídeos diferentes,respectivamente.
Seqüências similares ou homólogas (por exemplo, pelo menoscerca de 85 % de identidade de seqüência) às seqüências divulgadas nestetambém são parte deste pedido. Em algumas formas de realização, aidentidade de seqüência pode ser de cerca de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais alto. Alternativamente, identidadesubstancial existe quando os segmentos de ácido nucléico podem hibridizarsob condições de hibridização seletivas (por exemplo, condições dehibridização altamente estringentes), para o complemento do filamento. Oácidos nucléicos podem estar presentes em todas as células, em um lisadocelular ou em uma forma pura parcialmente purificada ou substancialmentepura.
Os cálculos de "homologia" ou "identidade de seqüência"entre duas seqüências (os termos são usados de maneira intercambiável neste)são realizados como segue. As seqüências são alinhadas para os propósitos decomparação ótimos (por exemplo, fendas podem ser introduzidas em um ouambos de um primeiro e uma segunda seqüência de aminoácido ou ácidosnucléico para o alinhamento ótimo e seqüências não homogêneas podem serdesconsideradas para os propósitos de comparação). Em uma forma derealização preferida, o comprimento de uma seqüência de referência alinhadapara os propósitos de comparação é de pelo menos 30 %, preferivelmentepelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %, ainda maispreferivelmente pelo menos 60 % e ainda mais preferivelmente, pelo menos70 %, 80 %, 90 %, 100 % do comprimento da seqüência de referência. Osresíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácidocorrespondentes ou posições de nucleotídeo são então comparadas. Quandouma posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo deaminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usadoneste, a "identidade" de aminoácido ou ácido nucléico é equivalente à"homologia" de aminoácido ou de ácido nucléico). A identidade deporcentagem entre as duas seqüências e uma função do número de posiçõesidênticas divididas pelas seqüências, levando-se em conta o número de fendas e o comprimento de cada fenda, que necessita ser introduzido para oalinhamento ótimo das duas seqüências.
A comparação das seqüências e a determinação da identidadepercentual entre as duas seqüências pode ser realizada usando-se umalgoritmo matemático. Em uma forma de realização preferida, a identidade percentual entre as duas seqüências de aminoácido é determinada usando-se oalgoritmo de Needleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) quefoi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível emhttp://www.gcg.com), usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matrizPAM250 e um peso de fenda de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Ainda em uma outra forma de realizaçãopreferida, a identidade percentual entre duas seqüências de nucleotídeo édeterminada usando-se o programa GAP no pacote de software GCG(disponível em http://www.gcg.com), usando-se uma NWSgapdna.CMP e umpeso de fenda de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5 ou 6. Um ajuste particularmente preferido de parâmetros (e o único quepode ser usado se o prático estiver incerto sobre quais parâmetros podem seraplicados para determinar se uma molécula está dentro de uma identidade deseqüência ou limitação de homologia) são uma matriz de registro Blossum 62com uma penalidade de fenda de 12, uma penalidade estendida de fenda de 4e uma penalidade de fenda de mudança de estrutura de 5. Um percentual deidentidade entre dois aminoácidos ou seqüências de nucleotídeo tambémpodem ser determinados usando-se o algoritmo de E. Meyers and W. Miller((1989) CABIOS, 4:11-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso PAMl20, uma penalidade decomprimento de fenda de 12 e uma penalidade de fenda de 4.
II. Métodos de Fabricação de Proteína TAT-HOXB4H RecombinanteA. Clonagem e Expressão
Os sistemas para a clonagem e para as proteínas de expressãoem uma variedade de células hospedeiras são conhecidos na técnica. Ascélulas adequadas para a produção de proteínas são descritas em, porexemplo, Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press,eds. Em síntese, as células hospedeiras adequadas incluem células demamíferos, células de insetos, células vegetais, células de levedura ou célulasprocarióticas, por exemplo, E. coli. As células de mamíferos disponíveis natécnica para a expressão de proteína heteróloga incluem linhas de célulaslinfocíticas (por exemplo, NSO), células HEK293, células de ovário dehamster chinês (CHO), células COS, células HeLa, células renais de hamsterjovem, células de oócito e células de um animal transgênico, por exemplo,células epiteliais de mamífero. Os vetores adequados podem ser escolhidos ouconstruídos para conter seqüências reguladoras apropriadas, incluindoseqüências promotoras, seqüências terminadoras, seqüências depoliadenilação, seqüências intensificadoras, genes marcadores e outrasseqüências. Os vetores também podem conter cadeia principal de plasmídeoou viral. Para detalhes, ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muitas técnicasestabelecidas usadas com os vetores, incluído a manipulação, preparação,mutagênese, seqüenciamento e transfecção de DNA, são descritos em CurrentProtocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., JohnWiley & Sons (1992).
Um outro aspecto da divulgação fornece um método deintroduzir o ácido nucléico em uma célula hospedeira. Para célulaseucarióticas, as técnicas de transfecção adequadas podem incluir fosfato decálcio, DEAE-Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma etransdução usando-se retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vacínia oubaculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluirtransformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando-sebacteriófago. A introdução de DNA pode ser seguida por um método deseleção (por exemplo, resistência a medicamento) para selecionar células quecontêm o ácido nucléico.
B. Purificação e Redobramento
A proteína TAT-HOXB4H pode ser inicialmente isolada apartir da célula hospedeira recombinante por quaisquer meio apropriadosconhecidos na técnica. Por exemplo, a proteína pode ser removida dosobrenadante celular, se a proteína for capaz de ser excretada ou a proteínapode ser removida de um lisado celular.
A proteína TAT-HOXB4H pode ser purificada os métodoscromatográficos que compreendem: (a) aplicar um lisado celular ousobrenadante celular, se a proteína estiver sendo secretada na solução, a umacoluna HisTrap; b) lavar a coluna HisTrap com um tampão; (c) eluir aproteína parcialmente purificada da coluna HisTrap (d) aplicar a proteínaparcialmente purificada obtida da coluna HisTrap a uma coluna MonoSP; (e)lavar a coluna MonoSP com um tampão; (f) eluir a proteína TAT-HOXB4Hpurificada da coluna MonoSP.
O lisado celular ou o sobrenadante celular, se a proteína forcapaz de ser secretada na solução, podem ser clareados por centrifugação a20.000 χ g por 30 minutos a 4o C, o sobrenadante ajustado a 10 mM deimidazol e carregado nas colunas de quelação HisTrap (AmershamPharmacia). A coluna pode ser lavada com 8 M de uréia, 20 mM de HEPES,0,5 mM de DTT, 10 mM de NaCl, pH 8,0 e 10 mM de imidazol para removeras proteínas não ligadas. A proteína TAT-HOXB4 parcialmente pura pode sereluída da coluna HisTrap com uma concentração alta de imidazol e sal.
Para purificação adicional, a proteína parcialmente purificadaobtida da coluna HisTrap pode ser aplicada à coluna MonoSP (AmershamPharmacia). A coluna pode ser lavada com 4 M de uréia, 20 mM de HEPES,50 mM de NaCl, pH 6,5 para remover proteínas não ligadas. TAT-HOXB4Hligada pode ser eluída com sal alto. A proteína TAT-HOXB4H purificadacoletada deste procedimento de purificação está na forma desnaturada.
Além disso, a proteína TAT-HOXB4H desnaturada eluída dacoluna MonoSP pode ser dobrada novamente usando-se compostoshidrofóbicos por (i) combinação da proteína desnaturada eluída e uma soluçãode compostos hidrofóbicos para formar uma solução de proteína e compostoshidrofóbicos; (ii) dessalinizar a solução de proteína e compostos hidrofóbicospara obter uma proteína dessalinizada e solução de composto hidrofóbico e(iii) remover os compostos hidrofóbicos da solução de proteína dessalinizadausando-se ultrafiltração.
Como usado na presente invenção, o termo "compostoshidrofóbicos" refere-se a quaisquer compostos hidrofóbicos capazes deproteger a proteína desejada a partir da formação de agregados insolúveisdurante a etapa de remoção de sal de desnaturação. Os compostoshidrofóbicos adequados para o uso na presente invenção são descritos emOganesyan et al., Pharmagenomics (2004) 71, 22-26. Os compostoshidrofóbicos adequados incluem, mas não limitam-se a, Triton X-100, tween-20 ou compostos de polibenzeno. A ultrafiltração ou a troca de tampão podeser realizada por um centricon ou célula agitadora. As condições para aultrafiltração ou troca de tampão pode variar, como reconhecido por aqueleshabilitados na técnica, dependendo dos tipos de proteína desejada.Em uma forma de realização da invenção da presenteinvenção, o composto hidrofóbico na solução dessalinizada contendo aproteína HOXB4H é removida por 5 a 10 vezes de troca de tampão (cada umrealizado por centrifugação de 1000 a 2500 χ g por 10 minutos) com soluçãocontendo concentrações de baixas a altas de compostos hidrofóbicos grandes,tais como beta-ciclodextrina desse modo, a proteína HOXB4H desnaturada édobrada novamente na sua forma natural.
Em uma forma de realização, proteína TAT-HOXB4Hpurificada pode ser armazenada em meio IMDM (HyClone) comercialmentedisponível (tampão de armazenagem 1) a 4o C ou -20° C.
Em uma outra forma de realização, a proteína TAT-HOXB4Hpurificada pode ser armazenada em meio DMEM (HyClone) comercialmentedisponível (tampão de armazenagem 2) a 4o C ou -20° C.
Em uma forma de realização, o rótulo His no terminal C deTAT-HOXB4H pode ser removido antes da administração in vivo.
Em uma outra forma de realização o rótulo His no terminal Nde TAT-HOXB4H pode ser removido antes da administração in vivo.
Em uma outra forma de realização tanto os rótulos His nosterminais C quanto N podem ser removidos antes da administração in vivo.
C. Preparação de uma Composição Farmacêutica
A TAT-HOXB4H pode ser usada como uma composiçãofarmacêutica quando combinada com um carregador farmaceuticamenteaceitável. Uma tal composição pode conter, além da proteína TAT-HOXB4He do carregador, vários diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizadores,solubilizadores e outros materiais bem conhecidos na técnica. O termo"farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que nãointerfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos. Ascaracterísticas do carregador pode depender da via de administração.
É especialmente vantajoso formular composições na forma deunidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade dedosagem. A forma de unidade de dosagem como usada neste refere-se aunidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para oindivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidadepredeterminada do composto ativo calculado para a produção do efeitoterapêutico desejado em associação com o carregador farmacêutico requerido.A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção sãoditadas por e diretamente dependentes das características únicas do compostoativo e do efeito terapêutico particular a ser atingido e as limitações inerentesna técnica de composição de um tal composto ativo para o tratamento deindivíduos.
As vias típicas de administração incluem, sem limitação, oral,tópica, parenteral (por exemplo, sublingual ou bucal), sublingual, retal,vaginal e intranasal. O termo parenteral como usado neste inclui injeçõessubcutâneas, intravenosa, intramuscular, intrasternal, intracavernosa,intratecal, intrameatal, injeção intrauretral ou técnicas de infusão. Acomposição farmacêutica é formulada a fim de permitir que os ingredientesativos contidos neste sejam biodisponíveis na administração da composição aum paciente. As composições que podem ser administradas a um pacientetomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, umtablete pode ser uma unidade de dosagem simples e um recipiente de um oumais compostos da invenção na forma de aerossol pode manter umapluralidade de unidades de dosagem.
Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de umaproteína TAT-HOXB4H é administrada oralmente, o agente de ligação podeestar na forma de um tablete, cápsula, pó, solução ou elixir. Quandoadministrado na forma de tablete, a composição farmacêutica da invençãopode conter, adicionalmente, um carregador sólido, tal como uma gelatina ouum adjuvante. O tablete, cápsula e o pó contém de cerca de 5 a 95 % deagente de ligação e, preferivelmente, de cerca de 25 a 90 % de agente deligação. Os exemplos são sacarose, caulim, glicerina, dextrinas de amido,alginato de sódio, carboximetilcelulose e etil celulose. Os agentes corantese/ou flavorizantes podem estar presentes. Uma casca de revestimento pode serutilizada. Quando administrado na forma líquida, um carregador líquido talcomo água, petróleo, óleos de origem animal ou vegetal, tal como óleo deamendoim, óleo mineral, óleo de soja ou óleo de gergelim ou óleos sintéticospodem ser adicionados. A forma líquida da composição farmacêutica aindapode conter solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeoou glicóis, tais como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol.Quando administrado na forma líquida, a composição farmacêutica contém decerca de 0,5 a 90 % em peso do agente de ligação, e preferivelmente de cercade 1 a 50 % do agente de ligação.
Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteínaTAT-HOXB4H é administrada pela injeção intravenosa, cutânea ousubcutânea, o agente de ligação pode estar na forma de uma solução aquosaparenteralmente aceitável isento de pirogênio. A preparação de tais soluçõesde proteína parenteralmente, tendo devido respeito ao pH, isotonicidade,estabilidade e outros, está dentro da técnica habilitada. Em algumas formas derealização, a composição farmacêutica para a injeção intravenosa, cutânea ousubcutânea pode conter, além do agente de ligação, um veículo isotônico, talcomo Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose,Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer Lactada ou outroveículo como conhecido na técnica. A composição farmacêutica da presenteinvenção também pode conter estabilizantes, conservantes, tampões,antioxidantes ou outros aditivos conhecidos por aqueles habilitados natécnica.
Na prática do método de tratamento ou uso da presenteinvenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína TAT-ΗΟΧΒ4Η é administrada a um indivíduo, por exemplo, mamífero (porexemplo, um ser humano). Como usado neste, o termo "quantidadeterapeuticamente eficaz" significa a quantidade total de cada componenteativo da composição farmacêutica ou método que é suficiente para mostrarum significativo, por exemplo, melhora de sintomas de, cura de ou aumentona taxa de cura de tais condições. Quando aplicado a um ingrediente ativoindividual, administrado sozinho, o termo refere-se àquele ingrediente apenas.Quando aplicado a uma condição, o termo refere-se à quantidadescombinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico,administrado em combinação, serial ou simultaneamente.
A quantidade de proteína TAT-HOXB 4H na composiçãofarmacêutica da presente invenção pode depender da natureza e da gravidadeda condição sendo tratada e da natureza dos tratamentos anteriores que opaciente sofreu e da idade e do sexo do paciente. Ultimamente, o médicoatendente pode decidir a quantidade de ingrediente ativo com o qual trata cadapaciente individual. Inicialmente, o médico atendente pode administrar dosesbaixas de ingrediente ativo e observar a resposta do paciente. Doses grandesde ingrediente ativo podem ser administradas até o efeito terapêutico ótimoser obtido para o paciente e ponto no qual a dosagem ainda não é geralmenteaumentada. E considerado que as várias composições farmacêuticas usadaspara a prática do método da presente invenção pode conter cerca de 1 μg acerca de 1 mg proteína TAT-HOXB4H por kg de peso corporal. Os exemplosde faixas de dosagens que podem ser administradas a um paciente podem serescolhidas de: 1 μg/kg a 1 mg/kg, 1 μ g/kg a 0,5 mg/kg, 1 μg/kg a 0,1 mg/kg,10 μ g/kg a 0,5 mg/kg, 10 μg/kg a 0,1 mg/kg, 100 μg a 0,5 mg/kg, 250 μg/kg a0,5 mg/kg. Além disso, os exemplos de faixas de dosagem que podem serescolhidas de: 50 μg a 100 mg, 100 μg a 50 mg, 500 μg a 50 mg, 1 mg a 50mg. A duração da terapia intravenosa usando-se a composição farmacêuticada presente invenção pode variar, dependendo da gravidade da doença sendotratada e da condição e da resposta idiossincrática potencial de cada pacienteindividual. Em uma forma de realização, é considerado que a duração de cadaaplicação da proteína TAT-HOXB4H pode estar na faixa de 12 a 24 horas deadministração intravenosa contínua. Em uma outra forma de realização, aduração da aplicação de proteína TAT-HOXB4H pode durar assim como aradiação ou a quimioterapia continua. A proteína TAT-HOXB4 pode seradministrada na faixa de 10 a 100 μg/kg intravenosamente, duas vezes ao diapor 4,5 a 5 dias. Um ciclo do tratamento pode ser o bastante para expandirHSCs in vivo. Ultimamente, o médico atendente pode decidir a duraçãoapropriada de terapia intravenosa usando-se a composição farmacêutica dapresente invenção.
A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos podemser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão em culturascelulares ou animais experimentais, por exemplo, para a determinação doLD50 (a dose letal a 50 % da população) e o ED50 (a dose terapeuticamenteeficaz em 50 % da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos eterapêuticos é o índice terapêutico pode ser expressado como a razãoLD50/ED50. Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura celular e estudosanimais podem ser usados na avaliação de uma faixa de dosagem para o usoem seres humanos. A dosagem de tais compostos pode estar dentro de umafaixa de concentrações de recirculação que incluem o ED50 com pouca ounenhuma. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma dedosagem e da via de administração utilizada. A dose terapeuticamente eficazde TAT-HOXB4H pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios decultura celular. A dose pode ser formulada em modelos animais para atingiruma faixa de concentração de plasma circulante que inclui o IC50 (isto é, aconcentração da proteína de teste que atinge uma inibição média-máxima desintomas) como determinado na cultura celular. Os níveis no plasma podemser medidos, por exemplo, pela cromatografia líquida de alto desempenho. Osefeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorados por umbioensaio adequado. Os exemplos de bioensaios adequados incluem, mas nãolimitado a, medir as células tronco CD34+ na célula molecular usando-seanticorpos rotulados com sonda fluorescente (por exemplo, FITC) com ascélulas tronco CD34+ e medição da porcentagem de células LY5 no sangueperiférico ou HSCs de medula óssea pela citometria de fluxo. Opolinucleotídeo e as proteínas da presente invenção são esperados apresentarum ou mais dos usos ou atividades biológicas (incluindo aqueles associadoscom os ensaios citados neste) identificados abaixo. Os usos ou atividadedescritas para as proteínas da presente invenção podem ser fornecidas pelaadministração ou uso de tais proteínas ou pela administração ou uso depolinucleotídeos que codificam tais proteínas (tais como, por exemplo, nasterapias genéticas ou vetores adequados para a introdução de DNA).III. Métodos de Estimular Hematopoiese In Vivo
A. Pacientes em Necessidade de Tratamento
As composições farmacêuticas da invenção podem ser usadaspara tratar doenças que incluem, mas não limitam-se a, distúrbios autoimunes,distúrbios de imunodeficiência e distúrbios hematológicos. Adicionalmente,as composição farmacêuticas da invenção podem ser usadas para melhorar otempo de recuperação após o transplante de HSC.
A composição farmacêutica da invenção inclui, mas nãolimita-se ao tratamento do paciente que sofre de ou que é suscetível aolinfomas, leucemias, doença de Hodgkin e distúrbios mieloproliferativos.adicionalmente, as doenças hereditárias causadas pela deficiência de HSC eanemia aplástica podem ser tratadas pela composição farmacêutica dapresente invenção.
Além disso, a composição farmacêutica da presente invençãopode ser utilizada pelos doadores de HSC e pacientes insensíveis ao G-CSF.
Em uma forma de realização da invenção, TAT-HOXB4H é oúnico agente ativo administrado para a mobilização de HSCs e fluorouracila(5-FU) não é administrada ao doador, como o pré-tratamento ou um esquemade terapia de combinação.
As doenças ou condições adicionais associadas com asobrevivência celular aumentada, que podem ser tratadas com umacomposição farmacêutica da invenção incluem, mas não limitam-se àprogressão e/ou metástase de malignidades e distúrbios relacionados, taiscomo leucemia (incluindo a leucemia aguda (por exemplo, leucemialinfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluindo mieloblástica,promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia)) e leucemiascrônicas (por exemplo, leucemia mielocítica crônica (granulocítica) eleucemia linfocítica crônica)), síndrome de policitemia mielodisplástica vera,linfomas (por exemplo, doença de Hodgkin e doença que não de Hodgkin),mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrõm e tumores sólidos queincluem, mas não limitam-se a sarcomas e carcinomas, tais comofibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcomaosteogênica, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma,linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing,leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático,câncer de mama, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma de célulaescamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândulasudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar,adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular,carcinoma broncogênica, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma doduto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm,câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmãode célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma,astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma,hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma,melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.
A presente invenção não é limitada à metodologia particular,protocolos, linhas celulares, espécies ou gêneros animais e reagentes descritosabaixo. A terminologia usada para descrever formas de realização particularesnão é pretendida para limitar o escopo da presente invenção, que pode serlimitado apenas pelas reivindicações anexas. Como usado neste, as formassingulares "um", "e" e "o" incluem referência plural a não ser que o contextodite claramente o contrário. Desta maneira, por exemplo, referência a "umacélula" é uma referência a uma ou mais células e inclui equivalentes destesconhecidos por aqueles habilitados na técnica.
A não ser que definido de outra maneira, todos os termostécnicos e científicos usados neste tem o mesmo significado como comumenteentendido por uma pessoa de habilidade na técnica à qual esta invençãopertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ouequivalentes àqueles descritos neste podem ser usados na prática ou teste dainvenção, os métodos preferidos, dispositivos e materiais são descritos agora.Todas as publicações e patentes mencionadas neste são, deste modo,incorporadas neste por referência para os propósitos de descrever e divulgar,por exemplo, as construções e metodologias que são descritas nas publicaçõesque devem ser usadas em conexão com a invenção presentemente descrita emconexão com a invenção presentemente descrita. As publicações debatidasacima e por todo o texto são fornecidos unicamente para a sua divulgaçãoanterior para os dados eficazes do presente pedido. Aqui, nada deve serconstruído como uma admissão de que os inventores não sejam intituladospara atender tal divulgação em virtude da invenção anterior.
Definições
Uma "célula tronco" é uma célula pluripotente ou multipotentecom a capacidade para auto-renovação, para permanecer não diferenciado epara tornar-se diferenciado. As células tronco podem se dividir sem limite,pelo menos pelo tempo de vida do animal em que estas naturalmente residem.As células tronco não são terminalmente diferenciadas, isto é, estas nãodevem estar no final de um caminho de diferenciação. Quando uma célulatronco divide-se, cada célula filha pode permanecer uma célula tronco ou estapode embarcar em um curso que leva à diferenciação terminal. Uma célulatronco "quimérica" é uma célula tronco com uma porção de seu DNA quepertence a um organismo heterólogo.
Uma célula "hematopoiética" é uma célula envolvida noprocesso de hematopoiese, isto é, o processo de formar células sangüíneasmaduras de células precursoras. No adulto, a hematopoiese acontece namedula óssea. Anteriormente no desenvolvimento, a hematopoiese aconteceem locais diferentes durante estágios diferentes do desenvolvimento; ascélulas sangüíneas primitivas aumentam na bolsa de gema de ovo e, depois, ascélulas sangüíneas são formadas no fígado, baço e medula óssea. A regulaçãode complexo sofre hematopoiese, incluindo a regulação por hormônios, porexemplo, eritropoietina; fatores de desenvolvimento, por exemplo, fatoresestimuladores de colônia e citocinas, por exemplo, interleucinas.
O termo "vetor", como usado neste, é pretendido referir a umamolécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico aoqual este foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a umarco de DNA de filamento duplo circular em que os segmentos de DNAadicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em queos segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certosvetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira emque estes são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo umaorigem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outrosvetores (por exemplo, vetores mamíferos não-epissomais) podem serintegrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célulahospedeira e, desse modo, são replicado junto com o genoma hospedeiro.Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão dos genesaos quais estes são operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos nestecomo "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores deexpressão"). No geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas deDNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Nopresente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados demaneira intercambiável como o plasmídeo é a forma mais comumente usadado vetor. Entretanto, a invenção é pretendida incluir tais outras formas devetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, os retrovírusdefeituosos de replicação, adenovírus e vírus adeno-associadas), quefornecem funções equivalentes.
"Transformação", como usado neste, refere-se à inserção deum polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, irrespectivo dométodo usado para inserção: por exemplo, transformação pela absorçãodireta, transfecção, infecção e outros. Para os métodos particulares detransfecção, ainda ver abaixo. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantidocomo um vetor não integrado, por exemplo, uma epissoma oualternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro.
No geral, o termo "proteína" refere-se a quaisquer polímerosde dois ou mais aminoácidos individuais (se ou não de ocorrência natural)ligado por intermédio de ligações de peptídeo, como ocorre quando o átomode carboxil carbono do grupo de ácido carboxílico ligado ao α-carbono de umaminoácido (ou resíduo de aminoácido) torna-se covalentemente ligado aoátomo de amino nitrogênio do grupo amino ligado ao α-carbono de umaminoácido adjacente. Estas ligações de ligação de peptídeo e os átomos queas compreendem (isto é, átomos de α-carbono, átomos de carboxil carbono (eseus átomos de oxigênio substituintes) e átomos de amino nitrogênio (e seusátomos de hidrogênio substituintes)) formam "cadeia principal depolipeptídeo" da proteína. Além disso, como usado neste, o termo "proteína"é entendido incluir os termos "polipeptídeo" e "peptídeo" (que, as vezes, podeser usado intercambeavelmente neste). Similarmente, os fragmentos proteína,análogos, derivados e variantes podem ser referidos neste como "proteínas" edevem ser considerados ser uma "proteína" a não ser que indicado de outramaneira. O termo "fragmento" de uma proteína refere-se a um polipeptídeoque compreende menos do que todos os resíduos de aminoácido da proteína.Como pode ser estimado, um "fragmento" de uma proteína pode ser umaforma proteína da proteína truncada no terminal amino, no terminal carbóxi, oterminal carbóxi e/ou internamente (tal como pela divisão natural), e tambémpode ser uma variante e/ou derivado. Um "domínio" de uma proteína tambémé um fragmento e compreende os resíduos de aminoácido da proteínarequeridos para conferir atividade bioquímica correspondente à proteína deocorrência natural.
"Recombinante" como usado neste para descrever umamolécula de ácido nucléico significa um polinucleotídeo de origem genômica,cDNA, viral, semi-sintética ou sintética, em virtude de sua ou manipulaçãonão está associado com todo ou uma porção do polinucleotídeo com o qualestá associado em estado natural. O termo "recombinante" como usado comrespeito à proteína ou polipeptídeo significa um polipeptídeo produzido pelaexpressão de um polinucleotídeo recombinante.
Uma molécula "isolada," "purificada," "substancialmenteisolada" ou "substancialmente pura" (tal como um polipeptídeo oupolinucleotídeo) é um que foi manipulado para existir em uma concentraçãomais alta do que em estado natural. Por exemplo, uma proteína de objetivo éisolada, purificada, substancialmente isolada ou substancialmente purificadaquando pelo menos 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de materiais de proteína quenão do assunto com os quais está associada em estado natural foremremovidos. Como usado neste, uma molécula "isolada," "purificada,""substancialmente isolada" ou "substancialmente purificada" inclui moléculasrecombinantes.
Um "camundongo SCID" é um modelo de camundongo paradiversas síndromes de imunodeficiência combinadas (SCID), que causadiversos efeitos no desenvolvimento do sistema imune. Estes camundongossão deficientes ou carecem completamente tanto de linfócitos T quanto Β. Amutação SCID parece prejudicar a recombinação de genes receptores deantígeno, causando uma perda de linfócitos TeB funcionais. Outros tiposcelulares hematopoiéticos parecem se desenvolver e funcionar normalmente.
Os camundongos SCID suportam facilmente a diferenciação de linfócitonormal e podem ser reconstituídos com os linfócitos normais de camundongossingenêicos ou alogenêicos ou com os linfócitos humanos. Estescamundongos também suportam o desenvolvimento de tumores alogenêicos exenogenêicos. Portanto, os camundongos SCID, que permitem odesenvolvimento disseminado de diversos tumores humanos, particularmentedistúrbios hematológicos e melanoma maligno, podem ser usados parainvestigar malignidades.
Os termos "paciente", "indivíduo", "hospedeiro" e "paciente"são usados de maneira intercambiável neste refere-se a um animal vivente,incluindo um humano e um animal não humano. O indivíduo pode, porexemplo, um organismo que possui células imunes capazes de responder aoestímulo antigênico e à transdução de sinal estimuladora e inibidora atravésda ligação do receptor de superfície celular. O indivíduo pode ser ummamífero, tal como um ser humano ou um mamífero não humano, porexemplo, cães, gatos, porcos, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, ratos ecamundongos. O termo "indivíduo" não evita que os indivíduos sejamtotalmente normais com respeito a uma doença ou normais em todos osaspectos.
O termo "tratamento" refere-se a uma medida terapêutica oupreventiva. O tratamento pode ser administrado a um indivíduo tendo umdistúrbio médico ou que, ultimamente, pode contrair o distúrbio, a fim deevitar, curar, atrasar, reduzir a gravidade de ou melhorar um ou mais sintomasde um distúrbio ou distúrbio recorrente ou a fim de prolongar a sobrevivênciade um indivíduo além daquela esperada na ausência de tal tratamento.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa aquantidade do composto do indivíduo que pode evitar uma resposta desejada,por exemplo, uma resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animalou ser humano que é procurado, por exemplo, por um pesquisador, veterinárioou médico ou outro clínico.
Exemplos
Os seguintes exemplos específicos devem ser construídoscomo meramente ilustrativos e não limitantes do remanescente da divulgaçãode qualquer maneira que houver. Sem elaboração adicional, acredita-se queuma pessoa habilitada na técnica pode, com base na descrição neste, utilizar apresente invenção até seu grau mais completo.
Exemplo 1: Construção de Plasmídeo pET21b-His-pTAT-HOXB4-His
(a) A modificação de plasmídeo pET21b contendo His Tag de terminal NeCe peptídeo de sinal TAT.
O vetor de expressão pET21b contendo o His tag de terminal
N e um peptídeo de sinal foi gerado pela inserção de oligonucleotídeos5'-TATGC ACC ACC ACC ACC ACC ACTACGGCCGC AAG AAACGCCGCCAGCGC CGCCGGCG-3' (sentido) e 5'-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3' (antisentido) noplasmídeo pET21b. O His-Tag de terminal C já está presente no vetorpET21b.
(b) Clonagem de HOXB4 em vetor de expressão pET21b modificado
Um fragmento de DNA contendo a estrutura de leitura aberta(ORF) de HOXB4 e a seqüência codificadora de histidina 6 adicional foiobtida pela amplificação de PCR usando-se o plasmídeo MGC54130(GeneDiscovery, Taipei, Taiwan. Cat. N° 5533346) como o padrão e ofragmento de cDNA HOXB4 gerado por PCR foi subclonado no vetor deexpressão de pET21b modificado. A construção de plasmídeo e de seqüênciasde ácido nucléico é mostrada nas Figuras 2 e 3.
Exemplo 2: Expressão de proteína TAT-HOXB4H Recombinante em E. coli
O vetor de expressão pET21b-His-TAT-HOXB4-His foitransformado em cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen). As célulastransformadas foram desenvolvidas durante a noite a 37° C. As culturas dedesenvolvimento durante a noite foram diluídas a um ODóOO inicial de 0,05.As culturas foram então desenvolvidas a um ODóOO de 0,5 a 37° C, induzidocom 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) a 37° C por 3hora, com agitação vigorosa.
Exemplo 3: Purificação de Proteína Recombinante TAT-HOXB4H
Seguindo a indução, as células foram coletadas porcentrifuação e recolocadas em suspensão em Tampão A (8 M de uréia, 20mM de HEPES, 0,5 mM de DTT e 100 mM de NaCl, pH 8,0). A suspensãocelular foi passada três vezes através de uma prensa de French e o lisadocelular purificado por centrifugação a 20.000 χ g por 30 minutos a 4o C,ajustou o sobrenadante a 10 mM de imidazol carregado nas colunas dequelação HisTrap (Amersham Pharmacia). As proteínas ligadas foram eluídascom 50, 100 e 250 mM de imidazol em tampão A. As frações contendo TAT-HOXB4H foram carregadas em uma coluna MonoSP em tampão B (4 M deuréia, 20 mM de HEPES e 50 mM de NaC1, pH 6,5), eluído com 1,5 M deNaC1 e 20 mM de HEPES (pH 8,0).
Exemplo 4: Renaturação de proteína de Proteína de TAT-HOXB4H ofRecombinante
A proteína TAT-HOXB4H nas frações eluídas foi solubilizadae desnaturada em uma solução contendo sal de desnaturação (por exemplo,cloridreto de guanidina) e então este foi misturado com tampão de D-PBS-T(0,1 % de Triton X-IOO em 2 χ de PBS). A razão da solução da proteína TAT-HOXB4H para o tampão de D-PBS-T foi de 1:4. A mistura resultante foiadicionada a um tubo de centricon de 10K (50 ml ou 15 ml) pré-tratada comágua (10 ml ou 3 ml) e depois centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. Nestaetapa, o sal de desnaturação é substituído por tampão de D-PBS-T em que oTriton X-IOO é capaz de ligar-se com a região hidrofóbica da proteínaHOXB4H.
Esta etapa de ultrafiltração ou troca de tampão usando-secentricon IOK foi realizado dez vezes com solução contendo concentrações debeta-ciclodextrina (duas vezes de cada 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM e 5 mM debeta-ciclodextrina em tampão de armazenagem IMDM pela centrifugação de1000 a 2500 χ g por 10 minutos. A amostra remanescente no tubo centricon10K foi coletado a armazenado a -80°C. Mareio
A homogeneidade da proteína TAT-HOXB4H purificada foianalisada por SDS-gel de poliacrilamida seguido pelo tingimento coomassie(figura 5). Como mostrado na figura 5, a TAT-HOXB4H purificada a partirdo HisTrap e MonoSP resultou em rendimento de 3 a 4 vezes em comparaçãocom aquele da proteína TAT-HOXB4. O plasmídeo pTAT-HA-HOXB4 foium donativo do Dr. Guy Sauvageau, University of Montreal, Canadá. Esteplasmídeo foi realizado em BL21(DE3)pLysS (Novagen) e a purificação daproteína TAT-HOXB4 foi realizada como descrito em Krosl et al, 2003.Exemplo 5: Estabilidade de Proteína recombinante TAT-HOXB4H
A estabilidade da TAT-HOXB4H foi medida pela análise deSDS-gel de poliacrilamida. Na armazenagem, a TAT-HOXB4H decomprimento total pode ser degradada em fragmentos de 30 kD e de 10 kD.Como mostrado na Figura 6, a proteína TAT-HOXB4H produzida pelométodo desta invenção foi estável mesmo após 16 horas armazenada em PBSa 4° C.Além disso, a estabilidade da proteína TAT-HOXB4Harmazenada em 4° C e -20° C em PBS e tampão de armazenagem IMDM foianalisado por eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida a 10 % seguido pelotingimento com coomassie. Como mostrado na Figura 7, quando o IMDM foiusado como um tampão de armazenagem, a estabilidade da proteína TAT-HOXB4H foi mantida mesmo após 4 semanas.
Exemplo 6: Efeito da Proteína TAT-HOXB4H Recombinante nahematopoiese em Camundongos Balb/c tipo selvagem
Os camundongos Balb/c foram usados para investigar o efeitopossível de proteína recombinante TAT-HOXB4H na mobilização de HSCsda medula óssea para o sangue periférico. A proteína recombinante TAT-H0XB4H na solução salina tamponada por fosfato (PBS) foi administradapor injeção subcutânea quatro vezes por dia por 4 dias. Para examinar aresponsividade da dose, os grupos experimentais (n = 21) receberam umadose que variou de 1 μg, 5 μg, 10 μg, 15 μg ... a 100 μg por kg de BW porcamundongo. Um grupo separado de camundongos de controle recebeusolução salina tamponada por fosfato apenas e um outro grupo decamundongos de controle foram injetados subcutaneamente duas vezes pordia por 4 dias com uma dose de 5 μg per kg de BW de G-CSF porcamundongo.
O sangue periférico foi coletado de todos os camundongos eanalisados por um citômetro de fluxo para obter a porcentagem de célulastronco CD34+ na célula mononuclear (MNC). Os resultados são relatadoscomo a média ± s.d. na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>
A porcentagem de CD34+/MNC no sangue periférico coletadoa partir dos camundongos tratados é mostrada na Tabela 1. Os gruposexperimentais tratados com TAT-HOXB4H 3 a 21 (receberam uma dose de10 μg ou acima por kg de BW) apresentou substancialmente o mesmo efeitode mobilização como o grupo de controle tratado com G-CSF.
A medula óssea de camundongos tratados com TAT-HOXB4H(o Grupo Exp. 3 recebeu uma dose de 10 μg por kg de BW), camundongostratados com G-CSF e camundongos injetados com PBS ainda foramsubmetidos à fenotipagem usando-se o anticorpo conjugado com FITC aoCD34+ (Becton Dickinson) e analisados por um citômetro de fluxo. A medulaóssea de camundongos tratados com TAT-H-OXB4H (Figura 5C) parecem sermais ricos em células tronco CD34+ do que a medula óssea de camundongosinjetados com G-CSF (Figura 5A) e PBS (Figura 5B). Portanto, estesresultados indicam que a injeção de proteína recombinante TAT-HOXB4Hsresulta em número aumentado de HSCs tanto na medula óssea quanto nosangue periférico em camundongos.
Exemplo 7: Efeito de Proteína TAT-HOXB4H Recombinante naHematopoiese em Macacos resus
Macacos resus adultos foram usados para investigar a eficáciade proteína recombinante TAT-HOXB4H em macacos. O grupo experimentalI (n = 5) foram injetados intravenosamente com 10 μg por kg de BW deproteína recombinante TAT-HOXB4H quatro vezes por dia por 4 dias. Ogrupo experimental II (n = 5) foram injetados intravenosamente com 10 μgpor kg de BW de TAT-HOXB4H quatro vezes por dia e injetadossubcutaneamente com 5 μg por kg de BW de G-CSF por 4 dias. O grupo decontrole I recebeu PBS apenas e o grupo de controle II foi injetadosubcutaneamente duas vezes por dia por 4 dias com uma dose de 5 μg por kgde BW de G-CSF. O sangue periférico foi coletado de todos os macacos eanalisados por um citômetro de fluxo para obter a porcentagem de célulastronco CD34+ na célula mononuclear (MNC). Os resultados são apresentadosna Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Como mostrado na tabela 2, macacos (grupo experimental I)tratados com TAT-HOXB4H mostraram apenas um efeito de mobilizaçãosignificantemente melhor do que os macacos tratados com G-CSF (grupo decontrole II). Os macacos tratados com TAT-HOXB4H e G-CSF (grupoexperimental II) apresentaram um efeito de mobilização levemente menor doque os macacos tratados com G-CSF (grupo de controle II).
Os espécimens de medula óssea de macacos tratados comTAT-HOXB4H, G-CSF ou PBS ainda foram submetidos à fenotipagemusando-se o anticorpo conjugado com FITC ao CD34+ (Becton Dickinson) eanalisados por um citômetro de fluxo. Os espécimens de medula óssea demacacos tratados com TAT-HOXB4H (Figura 6C) parecem significantementemais ricos em células tronco CD34+ do que os espécimens de medula óssea deG-CSF (Figura 6A), macacos injetados com TAT-HOXB4H + G-CSF (Figura6Β) e PBS (Figura 6D).
Exemplo 8: Efeito de Proteína TAT-HOXB4H Recombinante na RecuperaçãoHematopoiética em camundongos NOD-SCID
104 células Lin̄/CD34+ humanas foram injetadas em5 camundongos (2,5 Gy) NOD-LtSz-scid/scid (NOD-SCID) irradiados, juntocom IO5 células auxiliares irradiadas CD34". Os camundongos foramdivididos em dois grupos de maneira aleatória: um grupo (n = 28) foi injetadointravenosamente com 10 μg por kg de BW de proteína recombinante TAT-HOXB4H duas vezes por dia e o outro (n = 28) recebeu PBS duas vezes pordia. A presença de células CD45+ humanas nas células sangüíneas periféricasde todos os camundongos foi medida periodicamente pela citometria de fluxoapós o transplante. A recuperação hematopoiética foi avaliada como o númerode camundongos cujas células CD45+ humanas atingiram níveis de > 0,1 %no sangue periférico (PB) após o transplante. Como mostrado na Figura 7, arecuperação hematopoiética melhorada foi observada nos camundongosinjetados com proteína recombinante TAT-HOXB4H.
Exemplo 9: Efeito de Proteína TAT-HOXB4H Recombinante na RecuperaçãoHematopoiética em camundongos Balb/c após a quimioterapia com CisplatinaCamundongos Balb/c de 5 semanas de idade foramrepetidamente injetados de maneira intravenosa com cisplatina até o númerode células de Ly5 (CD45 murino) no sangue periférico dos camundongosdiminuir a aproximadamente 10 % do número original. Os camundongostratados com cisplatina são divididos em dois grupos: um grupo (n = 28) foiinjetado intravenosamente com 10 μg por kg de BW de proteína recombinanteTAT-HOXB4H duas vezes por dia e o outro (n = 28) recebeu PBS duas vezespor dia. A presença de células Ly5 nas células sangüíneas periféricas de todosos camundongos foi medido perifericamente pela citometria de fluxo após otransplante. A taxa de recuperação hematopoiética foi avaliada como aporcentagem do número de células Ly5 no sangue periférico ao númerooriginal. Como mostrado na Figura 8, a recuperação hematopoiéticamelhorada foi observada no camundongo injetado com a proteínarecombinante TAT-HOXB4H.
Os modelos animais nestes experimentos foram reconhecidosna técnica como predição de resultados que serão obtidos em pacienteshumanos. Ver, por exemplo, Broxmeyer et ai. (2005) The Journal ofExperimental Medicine, 201, 1307-1318; Larochelle et al. (2006) Blood 107,3772-3778.
Embora a invenção seja explicada em relação a suas váriasmodalidades, deve ser entendido que muitas outras modificações possíveis evariações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invençãocomo reivindicado a seguir.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> WU, KOU-JUEYHUANG, CHI-HUNG
<120> MÉTODO PARA PRODUZIR PROTEÍNA TAT-H0XB4H PARA USO COMO UMESTIMULANTE DE HEMATOPOIESE IN VIVO
<130> 10712.0001-00000
<140> 12/042,097
<141> 2008-03-04
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da seqüência artificial: oligonucleotideo sintético
<400> 1
tatgcaccac caccaccacc actacggccg caagaaacgc cgccagcgcc gccggcg 57<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da seqüência artificial: oligonucleotideo sintético
<400> 2
ctagcggcgc tggcggcgtt tcttgcggcc gtagtggtgg tggtggtggt gca 53
<210> 3<211> 840<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da seqüência artificial: polinucleotideo sintético
<400> 3
atgcaccacc accaccacca ctacggccgc aagaaacgcc gccagcgccg ccgcgctagc 60atggctatga gttctttttt gatcaactca aactatgtcg accccaagtt ccctccatgc 120gaggaatatt cacagagcga ttacctaccc agcgaccact cgcccgggta ctacgccggc 180ggccagaggc gagagagcag cttccagccg gaggcgggct tcgggcggcg cgcggcgtgc 240accgtgcagc gctacgcggc ctgccgggac cctgggcccc cgccgcctcc gccaccaccc 300ccgccgcccc cgccaccgcc cggtctgtcc cctcgggctc ctgcgccgcc acccgccggg 360gccctcctcc cggagcccgg ccagcgctgc gaggcggtca gcagcagccc cccgccgcct 420ccctgcgccc agaaccccct gcaccccagc ccgtcccact ccgcgtgcaa agagcccgtc 480gtctacccct ggatgcgcaa agttcacgtg agcacggtaa accccaatta cgccggcggg 540gagcccaagc gctctcggac cgcctacacg cgccagcagg tcttggagct ggagaaggaa 600tttcactaca accgctacct gacacggcgc cggagggtgg agatcgccca cgcgctctgc 660ctctccgagc gccagatcaa gatctggttc cagaaccggc gcatgaagtg gaaaaaagac 720cacaagttgc ccaacaccaa gatccgctcg ggtggtgcgg caggctcagc cggagggccc 780cctggccggc ccaatggagg cccccgcgcg ctcctcgagc accaccacca ccaccactga 840<210> 4
<211> 279
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da seqüência artificial: polipeptideo sintético
<400> 4
Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
1 5 10 15
Arg Arg Ala Ser Met Ala Met Ser Ser Phe Leu Ile Asn Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Asp Pro Lys Phe Pro Pro Cys Glu Glu Tyr Ser Gln Ser Asp Tyr
35 40 45
Leu Pro Ser Asp His Ser Pro Gly Tyr Tyr Ala Gly Gly Gln Arg Arg50 55 60 Glu Ser Ser Phe Gln Pro Glu Ala Gly Phe Gly Arg Arg Ala Ala Cys65 70 75 80Thr Val Gln Arg Tyr 85 Ala Ala Cys Arg Asp 90 Pro Gly Pro Pro Pro 95 ProPro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ser Pro Arg 100 105 110 Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Gly Ala Leu Leu Pro Glu Pro Gly Gln 115 120 125 Arg Cys 130 Glu Ala Val Ser Ser 135 Ser Pro Pro Pro Pro 140 Pro Cys Ala GlnAsn Pro Leu His Pro Ser Pro Ser His Ser Ala Cys Lys Glu Pro Val145 150 155 160Val Tyr Pro Trp Met Arg Lys Val His Val Ser Thr Val Asn Pro Asn 165 170 175 Tyr Ala Gly Gly Glu Pro Lys Arg Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Gln 180 185 190 Gln Val Leu 195 Glu Leu Glu Lys Glu 200 Phe His Tyr Asn Arg 205 Tyr Leu ThrArg Arg 210 Arg Arg Val Glu Ile 215 Ala His Ala Leu Cys 220 Leu Ser Glu ArgGln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp225 230 235 240His Lys Leu Pro Asn Thr Lys Ile Arg Ser Gly Gly Ala Ala Gly Ser 245 250 255 Ala Gly Gly Pro Pro Gly Arg Pro Asn Gly Gly Pro Arg Ala Leu Leu 260 265 270 Glu His His 275 His His His His
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da seqüência artificial: 6x sintético 6x his tag
<400> 5
His His His His His His1 5
Claims (27)
1. Método para produzir uma proteína TAT-HOXB4H,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma célula hospedeira que compreende um vetorque codifica a proteína;(b) expressar a proteína na célula hospedeira;(c) coletar uma solução impura da proteína expressada;(d) purificar a proteína da solução por:(i) aplicação da solução a uma coluna HisTrap;(ii) lavar a coluna HisTrap;(iii) eluir a proteína parcialmente purificada da coluna HisTrappara formar uma solução de proteína parcialmente purificada;(iv) aplicar a solução de proteína parcialmente purificada auma coluna MonoSP;(v) lavar a coluna MonoSP;(vi) eluir a proteína purificada da coluna MonoSP da formadesnaturada;(e) dobrar novamente a proteína desnaturada eluída usando-secompostos hidrofóbicos por:(i) combinação da proteína desnaturada eluída e uma soluçãode compostos hidrofóbicos para formar uma solução de proteína e compostoshidrofóbicos;(ii) dessalinizar a solução de proteína e compostoshidrofóbicos para obter uma proteína dessalinizada e solução de compostohidrofóbico;(iii) remover os compostos hidrofóbicos da solução de proteínadessalinizada usando-se ultrafiltração.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de lavagem de coluna HisTrap compreende uréia 8 M,HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0 e imidazol 10 mM.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de eluição para eluir a proteína parcialmente purificadada coluna HisTrap compreende pelo menos 50 mM de imidazol em 8 M deuréia, HEPES 20 mM, DTT 0,5 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de eluição para eluir a proteína parcialmente purificadada coluna HisTrap compreende de 50 a 100 mM de imidazol.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de eluição para eluir a proteína parcialmente purificadada coluna HisTrap compreende 100 a 250 mM de imidazol.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de lavagem de coluna MonoSP compreende 4 M deuréia, HEPES 20 mM e 50 mM de NaCl, pH 6,5.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o tampão de eluição para eluir uma proteína purificada da colunaMonoSP compreende 1,5 M de NaCl e HEPES 20 mM, pH 8,0.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os compostos hidrofóbicos compreendem Triton X-100, tween-20ou compostos de polibenzeno.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o processo de ultrafiltração realizado pelo tubo centricon ou umacélula de agitação.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a proteína purificada foi armazenada em IMDM ou DMEM.
11. Proteína TAT-HOXB4H, caracterizada pelo fato de que éproduzida pelo método como definido na reivindicação 1.
12. Método para intensificar a mobilização de HSCs damedula óssea para o sangue periférico, caracterizado pelo fato de quecompreende:a) administrar, a um indivíduo em necessidade do mesmo, umaquantidade eficaz de uma proteína TAT-HOXB4H produzida pelo métodocomo definido na reivindicação 1 eb) deixar a proteína TAT-HOXB4H aumentar o númeroabsoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo desse modo, intensificando amobilização das células tronco hematopoiéticas ao sangue periférico doindivíduo.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um doador de HSC.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um paciente quesofreu transplante de HSC autólogo.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um pacienteinsensível ao G-CSF.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o indivíduo sofre de doenças causadas por deficiência deHSC hereditária.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o indivíduo de anemia aplástica hereditária.
18. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o indivíduo sofre de qualquer um dos distúrbioshematológicos, tumores sólidos e distúrbios imunológicos.
19. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que os distúrbios hematológicos é selecionado do grupo queconsiste de linfomas, leucemias, doenças de Hodgkin e distúrbiosmieloproliferativos.
20. Método para melhorar o tempo de recuperação de umpaciente que sofreu o transplante de HSC, irradiação ou quimioterapia,caracterizado pelo fato de que compreende:a) administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, umaquantidade eficaz de uma proteína TAT-HOXB4H produzida pelo métodocomo definido na reivindicação 1 eb) deixar a proteína TAT-HOXB4H aumentar o númeroabsoluto de HSCs na medula óssea do indivíduo.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um doador de HSC.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um paciente quesofreu transplante de HSC autólogo.
23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o indivíduo em necessidade do mesmo é um pacienteinsensível ao G-CSF.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o indivíduo sofre de doenças causadas por deficiência deHSC hereditária.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o indivíduo sofre de anemia aplástica hereditária.
26. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que o indivíduo sofre de qualquer um dos distúrbioshematológicos, tumores sólidos e distúrbios imunológicos.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que os distúrbios hematológicos são selecionados do grupo queconsiste de linfomas, leucemias, doenças de Hodgkin e distúrbiosmieloproliferativos.
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B06G | Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette] |
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