JP4755224B2 - インビボ造血刺激剤としてのｔａｔ−ｈｏｘｂ４ｈ組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規的でかつ非自明性のＣ−末端にヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組換えタンパク質（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）（Ｃ末端に６個のヒスチジン残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）を含む）の製造方法に関する。この製造方法は収率増加および安定性増幅という予期せぬ利点を有し、前記タンパク質（およびＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ有効成分を含有する医療用組成物）をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与することができる。

再生医学の発展が目覚しい今日において、器官の特異性幹細胞或いは自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ）細胞を見つけ出す各種研究が盛んに行われている。前記自己再生細胞のうち最も研究が盛んなものは造血幹細胞であるが、それは癌、新陳代謝疾病から免疫不全に至るまで、造血幹細胞が何れも新しい治療の選択肢であることによる。

「造血」とは、血液細胞の生成過程において、骨髄中の造血幹細胞の分裂により赤血球および白血球が置換されることをいう。造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、自己再生能力および全ての血球または免疫細胞に分化する能力を有する細胞である。しかし、造血幹細胞の自己再生および分化を制御する遺伝子メカニズムについては多くがまだ解明されていない。

現時点で、ヒト骨髄、動員された末梢血液および臍帯血から移植されるヒト造血幹細胞は、すでに臨床で血液癌（白血病およびリンパ腫）の治療や、血液癌以外の高用量の化学療法から免疫系統の回復をサポートするために用いられている。しかし、有効な移植には大量の出所の異なる造血幹細胞が必要であり、また幹細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を要する場合もある。

造血幹細胞は骨髄、末梢血液および臍帯血から採取される。骨髄細胞の採取には手術やかなりの苦痛を伴う過程を要し、歓迎されない手段となっている。末梢血液細胞を使用する場合も、造血機能が損なわれる疾病や化学療法を受けている患者から、適合する十分な量の造血幹細胞を採取することは非常に困難であるという課題が存在する。臍帯血は比較的容易に採取でき、造血幹細胞の質も良いが、この方法で採取できる造血幹細胞の量には限界があり、１回に採取できる細胞の量は小児用には十分であるが、成人用としては足りない可能性がある。潜在する課題を克服するためには、幹細胞の自己再生過程に干渉して造血幹細胞のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増殖を加速させる必要がある。

最近になって、転写調節因子が幹細胞の遺伝子発現の調節、および幹細胞の発育過程で重要な役割を担うことが証明されている（Ｏｒｋｉｎ．Ｓ．Ｈ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ １，５７−６４，２０００）。転写調節因子は、標的遺伝子との結合の有無、或いはその濃度により複雑な細胞生理調節メカニズムを構成する。ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｏｍｅｂｏｘ（ＨＯＸ）と呼ばれる転写因子が、胚胎の発育で重要な役割を担うことがわかっており、また近年にはＨＯＸ転写因子ファミリーが、造血幹細胞の発育の上で重要な作用を及ぼすこともわかってきた（Ｂｕｓｋｅ．Ｃ． ｅｔ．ａｌ． Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ． ７１，３０１−３０８，２０００）。

モントリオール大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ）のＧｕｙ Ｓａｕｖａｇｅａｕ博士は、骨髄中の造血幹細胞のＨＯＸ転写因子が造血幹細胞の再生を制御する現象について模索し、その研究の中で、ホメオボックス遺伝子（ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ）ＨＯＸＢ４が、造血幹細胞の自己再生を制御する上で非常に重要であり、造血幹細胞の骨髄中における群集サイズを維持できることを示した。早期において、ＨＯＸ遺伝子が血球細胞で発現することは、ヒトとラットの細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を用いて実証された。

ＨＯＸ遺伝子の中には異なる細胞形態においてはっきりと広範な発現を示すものがあるが、一部のＨＯＸ遺伝子は特定の細胞内でのみ活発に発現する。例えば、ヒトのＨＯＸＢ群中の８個のメンバーは赤血球細胞の発育初期において発現し、一部のＨＯＸＢ遺伝子はＨＯＸＢ４およびＨＯＸＢ７を含み、Ｔ細胞およびＢ細胞でのみ発現する。Ｓａｕｖａｇｅａｕ他は９個のＨＯＸＡ遺伝子、８個のＨＯＸＢ遺伝子および４個のＨＯＸＣ遺伝子が、ＣＤ３４⁺骨髄細胞内で発現することを実証し、このうちＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ９およびＨＯＸＡ１０は、ＣＤ３４⁺の細胞族群における赤血球の元細胞の発現が最多であるとした。また実験結果は、ＣＤ３４^-の細胞群中にＨＯＸ遺伝子の発現がないことを証明している。

こうして「ＨＯＸＢ４」タンパク質は造血幹細胞（ＨＳＣ）をインビトロ増幅する有効な刺激剤として最も常用されるようになった。近年では、ヒトにおいて「ＨＯＸＢ４」遺伝子がウイルスまたは組換えタンパク質の形で造血幹細胞を効果的に増殖できることが実証されている。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質は、実験室レベルで幹細胞増殖用として、逆転写されたウイルスの挿入リスクや骨髄基質細胞と共培養するリスクのないものとして用いられている（Ｋｒｏｓｌ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９， １４２８−１４３２，２００３参照）。このように「ＨＯＸＢ４」タンパク質は造血幹細胞のインビトロ増殖を促す刺激剤として常用される。

最近では、ＨＯＸＢ４のＮ末端にＴＡＴタンパク質配列が加わると、外部由来のＨＯＸＢ４が細胞内に送り込まれることが実証されている。このＴＡＴ配列は、細胞外部から細胞内部へのＨＯＸＢ４の送り込みを導くことができる。細胞質に一旦進入すると、ＨＯＸＢ４はシャペロンタンパク質（Ｃｈａｐｅｒｏｎ）ＨＳＰ９０の助けを借りて再び折り畳まれて原始構造になる。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４は造血幹細胞の増殖を２〜６倍に促進できる（Ａｍｓｅｌｌｅｍ．Ｓ他，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，１４２３−１４２７，２００３、およびＫｒｏｓｌ．Ｊ．他，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ９，１４２８−１４３２，２００３）。しかし、このＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組換えタンパク質は大腸菌宿主からの精製回收率が低い。

当該ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組換えタンパク質の収率を向上させるため、Ｃ−末端に別途６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓ−６）タグを付加したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の製造方法が開発され、その収率は元のタンパク質の精製率よりも３〜５倍高くなった。この製造方法はＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００６４６に詳述されている。

前記ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質は、ヒトの末梢血液または臍帯血の幹細胞増殖に用いることができ、増殖された幹細胞はその多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持している。また、前記ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質で処理した幹細胞を、インシュリン依存型糖尿病に重症複合免疫不全症を合併したマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）の骨髄内に注入すると、その末梢白血球中にヒト白血球が発見されることから、マウスの免疫および造血機能が再生されたことがわかる。

しかし、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質は、インビボ造血の刺激剤として使用されたことがなく、特に、造血機能の再構築、増幅、骨髄再生（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）および末梢循環幹細胞数の増幅に用いられたことがなく、とりわけ化学療法や放射線治療後において用いられたことがない。Ｋｒｏｓｌ他（２００３）およびＡｍｓｅｌｌｅｍ他（２００３）は、造血幹細胞を増幅させる臨床研究所が所望する大量で高純度、かつ高度に安定したＨＯＸＢ４タンパク質を得ることができなかった。

本発明の目的は、新規的でかつ非自明性の、収率を増加させ安定性を増幅するＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の製造方法を提供することにある。
本発明は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質を必要とする使用者に投与した場合、骨髄内および末梢血液内の造血幹細胞の数が増加するという研究結果に基づく。

本発明の一態様は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法に関し、以下の（ａ）から（ｅ）工程を含む。まず、（ａ）タンパク質コードを有するキャリアを含む宿主細胞を提供する。次に、（ｂ）宿主細胞内にタンパク質を発現させる。次に、（ｃ）発現したタンパク質の不純溶液を採取する。次に、（ｄ）下記（ｉ）から（ｖｉ）に示す手順で溶液からタンパク質を精製する、（ｉ）前記溶液をニッケルイオン含有のカラムに通入する、（ｉｉ）８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝溶液および１０ｍＭイミダゾールを含む洗浄液でニッケルイオン含有のカラムを洗浄する、（ｉｉｉ）５０−２５０ｍＭイミダゾールおよび８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝溶液を含む溶離緩衝溶液を用いて、一部が精製されたタンパク質をニッケルイオン含有のカラムから溶離させ、一部が精製されたタンパク質溶液を生成する、（ｉｖ）一部が精製されたタンパク質溶液をイオン交換カラムに通入する、（ｖ）４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.５の緩衝溶液を含む洗浄液でイオン交換カラムを洗浄する、（ｖｉ）１．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を含む溶離緩衝溶液を用いて精製されたタンパク質を変性形態にてイオン交換カラムから溶離する。

さらに、（ｅ）疎水性化合物を用いて溶離した変性タンパク質を下記（ｉ）から（ｉｉｉ）に示す手順で新たに折り畳む、（ｉ）前記溶離したタンパク質を変性塩類を含む溶液に溶解することで変性させる。（ｉｉ） 変性タンパク質とポリオキシエチレン−Ｐ−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたは多ベンゼン環化合物を含む疎水性化合物溶液とを混合し、タンパク質−疎水性化合物溶液を生成する、（ｉｉｉ）タンパク質−疎水性化合物溶液を脱塩してタンパク質−疎水性化合物脱塩溶液を得る、（ｉｖ）シクロデキストリンを用いて超ろ過工程を行い、緩衝溶液置換により疎水性化合物を前記タンパク質−疎水性化合物脱塩溶液から除去する、（ｖ）前記精製されたタンパク質をＩＭＤＭ培養基またはＤＭＥＭ培養基中で保存する。

（効果）
本発明で１Ｌの培養液を精製して得られるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の全体量は約６〜１０ｍｇに達するが、従来技術を用いて１Ｌの培養液を精製して得られるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の全体量は約１〜２ｍｇである。従来技術を用いる方法で発現するＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨＯＸＢ４プラスチドは、カナダのモントリオール大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ）のＧｕｙ Ｓａｕｖａｇｅａｕ博士より寄贈を受けたものである。

本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の精製方法は、タンパク質のインビボ投与に要する収率の向上を含む。かつてＫｒｏｓｌ他（２００３）もレポートの中で、血清を４時間培養した後、精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質が大部分失われたと述べている。本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は、血清を４週間培養した後でも、好ましい安定性がはっきりと示されており、このことがＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を臨床研究に用いるためのカギとなる。

（実施形態）
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
（Ｉ．ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質）
本実施形態は新規的でかつ非自明性のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法に関し、収率の増加および安定性の増幅という予期せぬ利点を提供し、前記タンパク質をインビボ投与させる。このＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は３個の遺伝子要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＴＡＴ、ＨＯＸＢ４およびヒスチジンタグ）を含む構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）である。ＨＯＸＢ４は転写調節因子ＨＯＸファミリーの一員であり、造血幹細胞の増殖を促すことができる。

ＴＡＴはＨＯＸＢ４部分を細胞核内に送り込ませる。ヒスチジンタグは組換え発現源の初期精製収率を増加させ、本実施形態の製造方法はタンパク質の収率をさらに向上させる。ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは図２のように構築され、ＤＮＡ配列は図３に示した通りである。図３において、ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ Ｎ−末端およびＣ−末端の過剰な６個のヒスチジン残基を下線で示しかつＴＡＴと記している。
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質とは、Ｃ末端に６個のヒスチジン残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）タグを含む（図４参照）ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４融合タンパク質を指す。

特に明記しない限り、タンパク質のアミノ酸配列（即ちその「一次構造」または「一次配列」）は、アミノ基末端からカルボキシル基末端までである。非生物系統（固相合成法等）においては、タンパク質（ジスルフィド（システイン）結合位置を含む）の一次構造は使用者が定めるものとする。

「削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸（またはヌクレオチド）配列が１個以上のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）を欠失したために起こる変化を指す。「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）または増加」とは、アミノ酸（またはヌクレオチド）配列の変化が一分子またはその発現物で起こり、リファレンス配列（自然存在分子に見られる配列等）と比べて、１個以上のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が増加することを指す。「置換」とは、１個以上のアミノ酸（またはヌクレオチド）が異なるアミノ酸（またはヌクレオチド）で置換されることを指す。

本実施形態の配列と類似または同質（配列が７０％同一等）の配列も、本実施形態の一部を構成する。実施例の幾つかにおいて、配列の同一度（％）は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上となり得る。さらに実質的に同一なものも、核酸フラグメントがその相補株と交雑する場合（高度に厳格な条件下等）に存在する。核酸は全細胞において、細胞溶解物または半精製や精製された形式で出現する。

２配列間の「同質性」または「配列同一性」（ここでは交換使用が可能である）の算出は下記に示した通りである。先ず、配列を比較に最適な方法でアライメントする（例えば第１または第２アミノ酸（または核酸）配列にギャップ（ｇａｐ）を付加して比較に最適にし、かつ比較時に非同質のフラグメントを除去する）。好ましい実施例では、リファレンス配列をアライメント比較に用いる際の長さは、リファレンス配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％であることが好ましい。

その後、対応位置上のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）を比較する。第１配列および第２配列の対応位置が、同一のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）である時、即ちこの位置のものは同一である（ここではアミノ酸（または核酸）の「同一」は、アミノ酸（または核酸）の「同質」と同等である）。２配列間の同一度（％）は、２配列間が共有する同一位置の数の関数であり、最適にアライメントするために付加するギャップの数と各ギャップの長さを考慮に入れる必要がある。

２配列間の配列比較と同一度（％）は、数学の演算法で達成できる。好ましい実施例において、２つのアミノ酸配列間の同一度（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ）ＧＡＰプログラムに取り入れられたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８:４４４−４５３）演算法で決定でき、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｍａｔｒｉｘまたはＰＡＭ ２５０ ｍａｔｒｉｘおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重と１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用する。

別の好ましい実施例において、２つのアミノ酸配列間の同一度（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ）で決定でき、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ ｍａｔｒｉｘおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重と１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用する。一組の特に優れたパラメータ群（一分子が本実施形態と同一または同質の配列であるかを決定するのに何れのパラメータを用いてよいかを決められない場合は、このパラメータを使用できる）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘおよび１２のギャップペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ）、４のギャップ延長ペナルティと５のフレームシフト（ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ）ギャップペナルティを使用している。

２つのアミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の同一度（％）にも、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒ．２．０）に取り入れられたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）演算法を用いて決定でき、ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅおよび１２のギャップ長ペナルティと４のギャップペナルティを使用する。

（ＩＩ．ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の製造方法）
Ａ．クローンおよび発現
各種宿主細胞におけるタンパク質のクローンと発現に用いられる系統は、本分野では周知のものである。タンパク質の製造に適用される細胞は、例えばＦｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓに記載されている。

簡単に言えば、適合する宿主細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および原核細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ等）が含まれる。本分野で異種タンパク質の発現に用いられる哺乳動物細胞には、リンパ細胞株（ＮＳＯ等）、ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ ｃｅｌｌｓ、ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ、ベビーハムスター腎臓細胞、卵母細胞および遺伝子導入動物由来の細胞（乳腺上皮細胞等）が含まれる。

適合するキャリアは適切な調節配列を含有して構築され、これにはプロモーター配列、因子終了配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、標識遺伝子および他の配列が含まれる。キャリアはプラスチドまたはウイルスフレームを含んでいてもよい。詳細はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。キャリアの関連技術の多くは、操作、製造、変異形成、配列解読およびＤＮＡトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含んでおり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９２）に記載がある。

本実施形態はさらに、ヌクレオチドを宿主細胞に送り込む方法を提供する。原核細胞に対して、適合するトランスフェクション技術には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、電気穿孔、リポゾーム仲介トランスフェクションおよび逆転写ウイルスまたは他のウイルス（ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ）やバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））の利用が含まれる。細菌細胞に対して適合する技術には、塩化カルシウム転化（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、電気穿孔およびリポゾーム仲介トランスフェクションの利用およびバクテリオファージトランスフェクションの利用が含まれる。ＤＮＡを送り込んだ後、次いで方法（薬剤耐性等）を選んでヌクレオチドを含む細胞を選択する。

Ｂ．精製および折り畳み
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は、本分野で既知の適切な手段を用いて組換え宿主細胞から単離することができる。例えばタンパク質が分泌され得るとすれば、細胞上清液から分離できる。或いはタンパク質は細胞溶解物中から分離できる。

ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は下記のようなクロマトグラフィ法で精製できる。（ａ）細胞溶解物または細胞上清液（タンパク質が分泌され得る場合）をＨｉｓＴｒａｐカラムに通入する、（ｂ）緩衝溶液でニッケルイオン含有のカラムとしてのＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）カラムを洗浄する、（ｃ）前記一部が精製されたタンパク質を前記ＨｉｓＴｒａｐカラムから溶離する、（ｄ）ＨｉｓＴｒａｐカラムからの一部が精製されたタンパク質をイオン交換カラムとしてのＭｏｎｏＳＰ（登録商標）カラムに通入する、（ｅ）緩衝溶液で前記ＭｏｎｏＳＰカラムを洗浄する、（ｆ）精製したタンパク質をＭｏｎｏＳＰカラムから溶離する。

細胞溶解物または細胞上清液（タンパク質が分泌され得る場合）は、４℃において２０，０００ｘｇで３０分遠心分離して清澄する。上清液を１０ｍＭイミダゾールに調節し、ＨｉｓＴｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加える。８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０緩衝溶液および１０ｍＭイミダゾールでカラムを洗浄し、未結合のタンパク質を除去する。一部が精製されたタンパク質は、高濃度のイミダゾールおよび塩で前記ＨｉｓＴｒａｐカラムから溶離できる。

さらなる精製は、ＨｉｓＴｒａｐカラムからの一部が精製されたタンパク質をＭｏｎｏＳＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通入する。４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝溶液でカラムを洗浄し、未結合のタンパク質を除去する。結合したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは、高濃度の塩を用いて溶離できる。この精製手順で得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は変性形態を呈する。

次いで、疏水性化合物でＨｉｓＴｒａｐカラムから溶離した変性形態のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を下記手順で新たに折り畳む。（ｉ）前記溶離した変性タンパク質と疏水性化合物溶液とを混合してタンパク質−疏水性化合物溶液を生成する、（ｉｉ）前記タンパク質と疏水性化合物溶液を脱塩してタンパク質−疏水性化合物脱塩溶液を得る、（ｉｉｉ）超ろ過工程により前記疏水性化合物を前記タンパク質−疏水性化合物脱塩溶液から除去する。

本実施形態において「疎水性化合物」とは、変性脱塩手順においてタンパク質を保護し不溶性沈殿を発生させないあらゆる疎水性化合物を指す。本実施形態に適用される疎水性化合物は、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００４）７１，２２−２６に記載がある。適合する疎水性化合物には、これに限らないが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）（ポリオキシエチレン−Ｐ−イソオクチルフェノール）、ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）または多ベンゼン環化合物が含まれる。前記超ろ過工程または緩衝溶液転化は、タンパク質濃縮カラム（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）またはタンパク質超ろ膜（ｓｔｉｒ ｃｅｌｌ）により実施できる。前記超ろ過工程または緩衝溶液転化の条件はタンパク質の種類に応じて定める。

本発明の一実施例において、ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を含む脱塩溶液中の疏水性化合物は、５〜１０回の緩衝溶液転化（毎回１０００〜２５００ｘｇで１０分間遠心分離する）により除去され、前記緩衝溶液転化は、低濃度から高濃度まで各種の巨大分子疏水性物質（シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）等）溶液で実施され、これにより変性されたＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を折り畳んで自然な形（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）に復元する。

一実施例において、精製されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質はＩＭＤＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）培養基（保存緩衝溶液１）に４℃または−２０℃において保存される。
別の一実施例において、精製されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質はＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）培養基（保存緩衝溶液２）に４℃または−２０℃において保存される。

一実施例において、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＣ末端のヒスチジンタグは、インビボ投与を行う前に除去できる。
別の一実施例において、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＮ末端のヒスチジンタグは、インビボ投与を行う前に除去できる。
さらに一実施例において、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＮ末端およびＣ末端のヒスチジンタグは、インビボ投与を行う前に除去できる。

Ｃ．医療用組成物の製造
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは薬学的に許容されうるキャリア剤と結合するとき、医療用組成物として使用できる。この医療用組成物はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質とキャリア剤のほか、様々な希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定剤、助溶剤および本分野で既知の他の材料を含んでいてもよい。「薬学的に許容されうる」とは、活性剤の生物活性の有効性に干渉することのない無毒の材料を指す。キャリア剤の特性は、投与方法に応じて定める。

用量の均一性および服用の利便性から、組成物を用量ユニット形式に調製することが有利である。ここでの用量ユニット形式とは、治療を受ける対象のユニット用量に用いる物理的に分けることの可能なユニットを指す。各ユニットには所定量の活性剤を含み、必要とする医薬キャリアと結合させて、所望する治療効果を生むために用いられる。本実施形態の用量ユニット形式の規格は、活性剤の独特な性質、達成を望む特定の治療効果に応じて定める。

典型的な投与経路には、これに限らないが、内服、外用、腸管外（舌下または口含等）、舌下、直腸、陰道および鼻腔内を含む。「腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）」には、ここではこれに限らないが、皮下の（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内の（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、静脈内の（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、胸骨内の（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、陰茎海綿体内部注射、鞘内｛しょうない｝の（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、耳道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａ）、尿道内（ｉｎｔｒａｕｒｅｔｈｒａｌ）注射およびあらゆる適切な注入技術を含む。

医療用組成物は、含有される活性剤を患者に投与する際に生物利用可能性を有し得るように調製する。医療用組成物は１個または１個以上の用量ユニットで患者に投与できる。例えば１個の錠剤は単一の用量ユニットであってもよく、または噴霧剤形式の容器に複数個の用量ユニットが含有されていてもよい。

内服で治療有効量のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を投与する場合、結合剤は錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）の形式にしてもよい。錠剤形式で投与する場合、本実施形態の医療用組成物はさらに、固体キャリア剤、例えばゼラチンまたは佐剤を含んでいてもよい。錠剤、カプセル、粉末は、５〜９５％の結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含有でき、好ましくは２５〜９０％の結合剤を含有する。

さらに顕色剤や矯味剤を添加してもよく、コーティングを使用することもできる。液体形式で投与する場合、例えば水、石油（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、動物油や植物油（落花生油、鉱物油、大豆油、ゴマ油等）または合成油等の液体キャリア剤を添加してもよい。液体形式の医療用組成物はさらに、生理食塩水、ブドウ糖や他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のジオールを含有していてもよい。液体形式で投与する場合、医療用組成物は０．５〜９０％の結合剤を含有していてもよく、好ましくは１〜５０％を含有する。

静脈、皮膚または皮下注射で治療有効量のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を投与する場合、発熱物質となり得ない腸管外（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）の許容されうる水溶液の態様としてもよい。適切なｐＨ値、等張性、安定性を有する腸管外の許容されうるタンパク質溶液の製造は、当該技術分野の周知技術に属する。一実施例において、静脈、皮膚または皮下注射に用いる医療用組成物には、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液または本技術で周知の他のキャリアなどの等張性キャリアを含有していてもよい。本実施形態の医療用組成物はさらに、安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤または本技術で周知の他の添加剤を含有していてもよい。

本実施形態の治療方法を実施するまたは本実施形態を使用する場合、治療有効量のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を、哺乳類動物（例えばヒト）等の使用者に投与する。「治療有効量」とは、ここでは当該医療用組成物中の活性剤の全体量が、患者にとって有意なベネフィット、例えば症状の軽減、治癒、治癒率向上等を発生させるに足るものをいう。単一活性剤に用いられかつ単独で投与される場合、「治療有効量」とは単に当該活性剤を指す。組み合わせて用いられる場合、「治療有効量」とは全活性剤の、治療効果を発生させるに足る全体量を指し、当該活性剤が系列的な組合せで投与されるか同時的に投与されるかを問わない。

ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の本実施形態における医療用組成物中の含有量は、治療する症状の重篤性と本質、患者がこれまで受けていた治療の本質および患者の年齡や性別に応じて定め、最後に主治医が個々の患者の活性剤投与量を決定する。初めのうちは、主治医は低用量の活性剤を与え、患者の反応を観察してもよい。患者が適度な治療効果を得るまで大用量の活性剤を投与する場合は、通常は用量をさらに増やすことはしない。

本実施形態の方法を実施するための医療用組成物には、体重１キロ当たり約１μｇ〜約１ｍｇのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を含有することができる。使用者に投与する用量の範囲は、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇから選択できる。

さらに、用量の範囲は、５０μｇ〜１００ｍｇ、１００μｇ〜５０ｍｇ、５００μｇ〜５０ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇから選択できる。本実施形態の医療用組成物を使用する静脈注射の時間は、治療する疾病の重篤性および個々の患者の特異反応に応じて定める。一実施例において、本実施形態のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を施す時間は、１２〜２４時間の連続静脈注射であってもよい。別の一実施例において、本実施形態のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は、患者が化学療法または放射線治療を継続中であれば、持続的に使用してもよい。

ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は、１０〜１００μｇ／ｋｇを１日２回、４．５〜５日間静脈注射することができる。１回の治療サイクルで、インビボにおける造血幹細胞増進が足りるはずである。最後に主治医が本実施形態の医療用組成物を使用する適切な静脈注射の時間を決定する。

化合物の毒性および治療力価は、例えばＬＤ₅₀（５０％致死用量）およびＥＤ₅₀（５０％有効治療用量）等の、標準的な薬剤学プログラムに基づき細胞培養または実験動物で決定する。毒性および治療期間の用量の比率が治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀で示すことができる。細胞培養と実験動物のデータは、ヒトに用いる用量の範囲を評価するために用いられる。化合物の用量は、ＥＤ₅₀を有しかつ毒性の小さいまたは無毒である循環濃度の範囲内とすることができる。

使用する剤形と投与方法に応じて、用量は前記範囲内で変更できる。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈの有効治療用量は、細胞培養試験により初歩的に予測することができる。動物モデルにおいて、用量はＩＣ５０（即ちタンパク質が症状を最大限抑制したその半分の濃度を測定する）を含む循環血漿中濃度に達する範囲とすることができ、細胞培養の決定方法と同じである。血漿中濃度は高効果液相クロマトグラフィで測定できる。特定用量の効果はすべて、適切な生物検定法（Ｂｉｏａｓｓａｙ）でモニタリングできる。

適合する生物検定法には、これに限らないが、タグに蛍光プローブ（ＦＩＴＣ等）を有するＣＤ３４⁺幹細胞抗体を用いて単核細胞内のＣＤ３４⁺幹細胞を測定し、およびフローサイトメトリーで末梢血液または骨髄の造血幹細胞中のＬＹ５細胞比率を測定する。本実施形態のポリヌクレオチドとタンパク質は、下記の１個または１個以上の用途または生体活性を表すことが予想される。

本実施形態のタンパク質の用途または活性は、このタンパク質を投与または使用する形式で提供でき、或いはこのタンパク質のポリヌクレオチドを投与またはコードする形式（例えば遺伝子療法またはＤＮＡを送り込むキャリアに用いる等）で提供できる。

（ＩＩＩ．インビボ造血刺激方法）
Ａ．治療を要する患者
本実施形態の医療用組成物は、これに限らないが、自己免疫疾病、免疫不全症および血液疾病を含む治療に用いることができる。さらに、本実施形態の医療用組成物は造血幹細胞移植後の回復時間を改善するために用いることができる。また本実施形態の医療用組成物は、これに限らないが、リンパ腫、白血病、ホジキン病および骨髄増殖性疾病の罹患患者を含む治療に用いることができる。さらに、造血幹細胞欠乏が引き起こす先天性の疾病および再生不良貧血も本実施形態の医療用組成物で治療できる。

この他、本実施形態の医療用組成物は、造血幹細胞のドナーおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に反応しない患者にも適用できる。
本発明の一実施例において、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは造血幹細胞を動員する唯一の活性剤として用いられ、かつ前処理でも複合治療レジメンとしても、フルオロウラシル（５−ＦＵ）はドナーに投与しない。

本実施形態の医療用組成物を用いて治療できる特別な疾病または細胞生存の増進に関する症状には、これに限らないが、悪性腫瘍および疾病に係る進行および／または転移がある。例えば、前骨髄球性白血病（急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄球、前骨髄球、顆粒球、単球、赤白血病を含む）を含む）および慢性白血病（慢性顆粒球（顆粒細胞）白血病および慢性リンパ球性白血病等）を含む）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒ・ｍｅ）、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ）、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病等）、多発性骨髄腫、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、および充実性腫瘍が含まれ、これに限らないが、肉腫および癌腫（繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、脾臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、骨髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆道癌、絨毛癌、精母細胞腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽球腫、頭蓋咽頭管腫、上衣腫、松果腺腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、神経膠腫、ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫等）を含む。

本実施形態は特定の方法、実験計画、細胞株、動物の種類や属性または下記試剤に限定されない。特定の実施例を表すために用いる用語は、本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。ここで使用する単数形の「一」および「前記」は、特に注記する場合を除き複数を含む。例を挙げれば、「一細胞」とは、１個または複数個の細胞を指し、かつ本技術分野で既知の均等物を含む。

別途定義する場合を除き、技術および科学で用いられる全語彙は、本実施形態が属する技術分野においてこの技術を熟知した者の理解と同一の意味を有する。ここで記載されたものと類似するまたは等しい全ての方法、要素および材料は、いずれも本実施形態を実践または試験するために用いることができる。好ましい方法、要素および材料についてはここで記載する。ここに記載された刊行物および特許は全て、説明および開示のために編入されたものであり、例を挙げれば、刊行物に記載された構造および方法は、現在記載される発明と結合している。以前におよび本文中で検討した刊行物は、本件の有効期日より以前の開示として挙げただけである。何れも発明者が従来の発明によらなければこの開示を予見できないことを認めたと解釈してはならない。

（定義）
「幹細胞」とは多能細胞または潜在的な多能細胞であり、自己再生能を有して、未分化を維持し、および分化となる。幹細胞は、少なくとも動物が自然に存在する一生において無限に分裂する。幹細胞は末期分化ではなく、即ち分化ルートの末端ではない。幹細胞が分裂するとき、子細胞の各々は依然として一幹細胞であることができ、または末期分化へと繋がる道へ進むことができる。「キメラ」幹細胞とは幹細胞の一部のＤＮＡが異種生物体に属することをいう。

「造血」細胞とは、造血過程（即ち、前駆体細胞が成熟した血液細胞を形成する過程）に関係する細胞を指す。成人では造血は骨髄で起こる。発育初期においては、様々な発育階段で造血は異なる場所で起こる。原始血液細胞は卵黄嚢で出現し、後に、血液細胞は肝臓、脾臓および骨髄で形成される。造血は、ホルモン（例えばエリスロポエチン、生長因子（例えばコロニー形成刺激因子および細胞因子（インターロイキン等）））を含む複雑な調節を有する。

ここで使用する「キャリア」とは他の核酸を輸送できる核酸分子を指し、この他の核酸は当該核酸分子に連結される。さらに別のキャリアは「プラスチド」であり、円形の二株のＤＮＡ環を指し、過剰のＤＮＡフラグメントはその中に接合される。別のタイプのキャリアはウイルスキャリアであり、過剰のＤＮＡフラグメントは、ウイルス遺伝子体に接合される。キャリアの中には送り込まれた宿主細胞中で自己複製能を有するものがある（細菌複製由来の細菌キャリアやエピソームプラスミド（ｅｐｉｓｏｍａｌ）哺乳動物キャリア等）。

その他のキャリア（非エピソームプラスミド哺乳動物キャリア等）は、宿主細胞に送り込まれるときに宿主細胞の遺伝子体中へ整合し、宿主遺伝子体にしたがって複製することができる。この他、キャリアの中には連結した遺伝子の発現を指揮する能力を有するものがある。これらのキャリアをここでは「組換え発現キャリア」（または単に「発現キャリア」）と称する。一般に、ＤＮＡ組換え技術に用いられる発現キャリアは、通常プラスチドの形態をとる。

プラスチドは最も常用されるキャリア形式であるため、本実施形態では「プラスチド」と「キャリア」は互換使用される。但し、本実施形態は同等機能を有する他の形式の発現キャリア、例えばウイルスキャリア（欠陥を複製する逆転写ウイルス、腺ウイルスおよび腺関連ウイルス等）等も包含する。

ここで使用する「転化」とは、外部由来のポリヌクレオチドを宿主細胞に送り込むことを指し、如何なる方法で送り込むかは問わない。例を挙げれば、直接吸收転化、トランスフェクションおよび感染等である。所定のトランスフェクション法は下記を参照されたい。外部由来のポリヌクレオチドは、キャリア未挿入の形態（プラスミド等）であるか、または宿主遺伝子体内へ整合されることができる。

一般に「タンパク質」とは、２個以上の単独アミノ酸がペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）により接合した重合体を指す（自然発生か否かを問わない）。当該ペプチド結合とは、アミノ酸（またはアミノ酸残基）のα炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子と、隣接アミノ酸（またはアミノ酸残基）のα炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子とが形成する共有結合である。前記ペプチド結合の連結およびそれが含む原子（即ちα炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびその酸素原子置換基）およびアミノ窒素原子（およびその水素原子置換基））はタンパク質の「ポリペプチドフレーム」を形成する。

さらに、ここで使用する「タンパク質」は、「ポリペプチド」および「ペプチド」を含むと理解してよい（交互使用する場合もある）。同様に、タンパク質フラグメント、類似物、誘導体および変異物はここでは「ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と呼び、特に説明のない場合、「タンパク質」であると見なされるべきである。タンパク質「フラグメント」とは、１タンパク質の全アミノ酸残基よりも少ないポリペプチドを含むものを指す。タンパク質「フラグメント」は、Ｎ末端、Ｃ末端または内部で（例えば自然的スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって）切断されたタンパク質であると理解でき、変異物および／または誘導体であってもよい。タンパク質「機能ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」も１つのフラグメントであり、タンパク質の生化学活性の付与に必要な、自然に存在するタンパク質に対応するアミノ酸残基を含む。

「組換え」とは、ここでは核酸分子、遺伝子群、遺伝子、ウイルス、半合成または合成した、その一部または全部のポリヌクレオチドが自然のものではないことを指す。「組換え」はタンパク質またはポリペプチドにとっては、ポリヌクレオチド組換え発現で生成されたポリペプチドを指す。

「単離した」、「精製した」、「実質的に単離した」または「実質的に精製した」分子（ポリペプチドまたはヌクレオチドのような）とは、人為的操作により自然状態よりも高い濃度を持つものを指す。例を挙げると、標的タンパク質が単離、精製、実質的に単離または実質的に精製されるとき、少なくとも５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の自然に存在する非標的タンパク質物質が除去されたことを指す。ここで使用する「単離した」、「精製した」、「実質的に単離した」または「実質的に精製した」分子には組換え分子を含む。

ＳＣＩＤ「マウス」とは、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のマウスモデルを指し、ＳＣＩＤは免疫系統の発育に重大な欠陥をもたらす。Ｔリンパ球もＢリンパ球も、これらのマウスは何れも不足または完全に欠乏している。当該ＳＣＩＤの変異は抗原受容体遺伝子の組換えを損傷するようであり、機能性に欠けるＴリンパ球およびＢリンパ球をもたらす。他の造血細胞のタイプは正常な発展と運用ができる。ＳＣＩＤマウスは随時正常なリンパ球の分化をサポートし、かつ同じ遺伝子または異なる遺伝子由来のマウスの正常なリンパ球と組換えでき、またはヒトリンパ球と組換えできる。これらのマウスは異なる遺伝子および異種遺伝子腫瘍の生長を助ける。したがって、ＳＣＩＤマウスはヒト腫瘍、特に血液系統疾病および悪性黒色腫の拡散増長を許容するので、悪性腫瘍の研究に使用できる。

「使用者」、「個人」、「宿主」および「患者」はここでは互換使用され、ヒトおよびヒト以外の動物を含む活きた動物を指すのに用いる。使用者とは、例を挙げると、免疫細胞を有する有機体であり、前記免疫細胞は抗原刺激に対して反応を発生させ、かつ細胞表面の受容体結合により伝達される刺激および抑制信号に対して反応を発生させる。使用者は哺乳類動物であってもよく、例えばヒトまたはヒト以外の哺乳動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウス等）を含む。「使用者」は、疾病や各方面に対して完全に正常な個人を排除しないものとする。

「治療」とは治療性または予防性の措置を指す。治療は医療疾病を有する使用者または最終的に疾病を有する者に施すことができ、予防、治療、遅延、重篤性の軽減または１個または１個以上の疾病または反復発生する疾病の症状の改善、或いは使用者の生存期間を延長し治療しない場合に予想される生存期間を超えるようにすることを指す。

「治療有効量」とは、主化合物が引き起こすことのできる予期した反応（例えば研究員、獣医、医者または他の臨床医が認定する組織、制度、動物、動物またはヒトの生物または医学反応）の量を指す。

（実施例）
下記に示した具体例は説明のためのものであり、如何なる状況にあっても本件で開示する他の部分を限定するものではない。詳細な説明がない場合は、本技術において通常の技術を有する者は、ここでの説明により本発明を十分に利用できるものと確信する。

（実施例１）
ｐＥＴ２１ｂ−Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４−Ｈｉｓプラスチドの構築
（ａ）Ｎ−末端およびＣ−末端にヒスチジンタグおよびＴＡＴ信号ペプチドを含有するｐＥＴ２１ｂプラスチドの修正
Ｎ−末端にヒスチジンタグおよびＴＡＴ信号ペプチドを含有するｐＥＴ２１ｂ発現キャリアは、ｐＥＴ２１ｂプラスチドに下記オリゴヌクレオチドを挿入して得られる。
５’−ＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧ−３’（配列番号１）（センス（ｓｅｎｓｅ））および
５’−ＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号２）（アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ））。Ｃ−末端ヒスチジンタグは、ｐＥＴ２１ｂプラスチド中に元から存在する。

（ｂ）ＨＯＸＢ４を修正後のｐＥＴ２１ｂ発現プラスチドにクローンする
ＨＯＸＢ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および過剰の６組のヒスチジンコード配列を含有するＤＮＡフラグメントは、ＭＧＣ５４１３０プラスチド（ＧｅｎｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ．Ｃａｔ．Ｎｏ．５５３３３４６）をテンプレートとし、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅して得られ、ＰＣＲで得られたＨＯＸＢ４ ｃＤＮＡフラグメントを修正後のｐＥＴ２１ｂ発現プラスチドへサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）する。構築したプラスチドおよび核酸配列を図２および図３（配列番号３）に示した。

（実施例２）
大腸菌にてＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質を発現する
ｐＥＴ２１ｂ−Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４−Ｈｉｓ発現プラスチドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）大腸菌株に転化する。転化した細胞を３７℃において１晩生長させる。翌日に培養物を希釈し初期ＯＤ₆₀₀値を０．０５とし、３７℃においてＯＤ₆₀₀値が０．５になるまで生長させ、次いで１ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトース（ＩＰＴＧ）で３７℃において３時間発現を誘導し、その間、激しく揺動させた。

（実施例３）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の精製
誘導作用後、細胞を遠心分離して収集し、緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴおよび１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に懸濁させる。細胞懸濁液をＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓに３回通し、細胞溶解物を２０，０００ｇにて４℃において３０分遠心分離して清澄する。上清液を１０ｍＭイミダゾールへと調節しＨｉｓＴｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサンプル添加する。結合したタンパク質を５０、１００および２５０ｍＭの緩衝液Ａ中に配合したイミダゾールで溶離させる。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを含有する留分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を緩衝液Ｂ（４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．５）が存在するＭｏｎｏＳＰカラムにサンプル添加し、１．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で溶離した。

（実施例４）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の復元（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）
溶離留分中のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を溶解させ、変性塩類（グアニジン塩酸塩（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等）を含有する溶液にて変性し、次いでＤ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する２倍リン酸塩緩衝溶液）と混合する。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質溶液とＤ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝溶液との比率を１：４とした。生成された混合液を水（１０ｍｌまたは３ｍｌ）で前処理した１０Ｋタンパク質濃縮カラム（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）（５０ｍｌまたは１５ｍｌ）に加え、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。この工程において、変性塩類はＤ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で置換され、Ｄ−ＰＢＳ−Ｔ緩衝液中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００はＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の疏水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）領域と結合できる。

次いで１０Ｋタンパク質濃縮カラム（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ｔｕｂｅ）で超ろ過するかまたは緩衝溶液置換工程を１０回行い、１０００〜２５００ｇ／ｍｉｎの分離速度で、緩衝液を１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭおよび５ｍＭのβ−シクロデキストリン（ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を含むＩＭＤＭ保存緩衝液に順次置換する。ここでは各遠心分離速度下において各種濃度で２回ずつ置換分離する。濃縮カラムに残ったサンプルを収集し、−２０℃の冷蔵庫で保存する。

精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の均一性は、ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルおよびｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色で分析する。図５は、１０％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル（１．５ｍｍ）でＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の精製を実証し、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ染色で分析してｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈのタンパク質配列を示した図である。

図５において、Ｌａｎｅ１：分子量タグ（Ｍ）、０．３μｇ、ｌａｎｅ２：未誘導のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質発現細胞由来の細胞溶解物、１μｇタンパク質、ｌａｎｅ３：誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質発現細胞由来の細胞溶解物、１μｇタンパク質、ｌａｎｅ４：精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ、０．７μｇタンパク質、ｌａｎｅ５：精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４（０．２μｇタンパク質）、である。

図５に示したように、ＨｉｓＴｒａｐとＭｏｎｏＳＰで精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは、元のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質に比べて収率が約３〜５倍増加した。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨＯＸＢ４プラスチドは、カナダのモントリオール大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ）のＧｕｙ Ｓａｕｖａｇｅａｕ博士より寄贈を受けた。ｌａｎｅ４およびｌａｎｅ５は同一体積のＭｏｎｏＳＰカラムで收集した留分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を加えた。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ＨＯＸＢ４プラスチドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に転化した。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質の精製は、Ｋｒｏｓｌ他（２００３）の記載がある。

（実施例５）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の安定性
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈの安定性は、ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルで分析する。保存時に、全長のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈは３０ｋＤおよび１０ｋＤのフラグメントに分解されるはずである。図６に示したように、本実施例のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質はＰＢＳ、−４℃において１６時間保存しても尚安定している。ここで、図６において、Ｍは分子量タグを、０は４℃において０時間を、１６は４℃において１６時間を表す。

さらに、−４℃および−２０℃において、ＰＢＳおよびＩＭＤＭ緩衝液で保存されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを、１０％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル電気泳動およびｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色で分析する。図７に示したように、ＩＭＤＭ保存緩衝液中で保存したとき、本実施例のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質は４週間維持された。なお、図７において矢印は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質ｂａｎｄを示す。

（実施例６）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質のＢａｌｂ／ｃマウスの造血に対する影響
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の、造血幹細胞の骨髄から末梢血液への動員に対する可能的影響は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いて研究できる。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質（ＰＢＳ中）を１日４回、４日間マウスに皮下注射した。用量の反応性を解明するため、試験グループ（Ｎ＝２１）の用量を、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ……〜１００μｇ／ｋｇ体重とする。比較グループにはＰＢＳのみを施し、別の比較グループには、５μｇ／ｋｇ体重のＧ−ＣＳＦを１日２回、４日間皮下注射した。

各グループの末梢血液を採取し、フローサイトメトリーで分析すると、ＣＤ３４⁺幹細胞の単核細胞（ＭＮＣ）中の比率が得られる。結果を平均値±標準偏差の形で表１に示した。

末梢血液内ＣＤ３４⁺／ＭＮＣの比率は表１に示した通りである。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを取り入れた第３−２１実験グループ（用量は少なくとも１０μｇ／ｋｇ体重以上）はＧ−ＣＳＦを注射した比較グループの動員効果に類似していることがわかる。

実験グループ３（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ用量１０μｇ／ｋｇ体重）のマウスの骨髄と、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＢＳを注射した比較グループのマウスの骨髄を採取し、ＣＤ３４⁺ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で型を表し、かつフローサイトメトリーにて分析した。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを注射したマウスの骨髄（図５Ｃ）のＣＤ３４⁺幹細胞は、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＢＳを注射したマウスの骨髄よりも多かった。これらの結果より、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質を注射した場合、マウスの骨髄中および末梢血液中の造血幹細胞を同時に増加できることがわかる。

（実施例７）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質のアカゲザルの造血に対する影響
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質のサル類における効力を、成年の雄アカゲザルを用いて研究した。試験グループＩ（ｎ＝５）は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質（用量１０μｇ／ｋｇ体重）を１日４回、４日間静脈注射した。試験グループＩＩ（ｎ＝５）は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質（用量１０μｇ／ｋｇ体重）および皮下注射Ｇ−ＣＳＦ（用量５μｇ／ｋｇ体重）を１日４回、４日間静脈注射した。比較グループＩにはＰＢＳのみを施し、比較グループＩＩにはＧ−ＣＳＦ（用量５μｇ／ｋｇ体重）を１日２回、４日間皮下注射した。全サルの末梢血液を採取し、フローサイトメトリーで分析して、ＣＤ３４⁺幹細胞の単核細胞（ＭＮＣ）中の比率を出し、結果を表２に示した。

表２に示したように、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈのみを注射したサル（実験グループＩ）は、Ｇ−ＣＳＦを注射したサル（比較グループＩＩ）よりも優れた動員効果が見られた。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨとＧ−ＣＳＦを同時に注射したサル（実験グループＩＩ）は、Ｇ−ＣＳＦを注射したサル（比較グループＩＩ）よりも動員効果はやや優れていた。

ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ、Ｇ−ＣＳＦおよびＰＢＳを注射したサルの骨髄サンプルを採取し、ＣＤ３４⁺ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で型を表し、かつフローサイトメトリーで分析した。ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを注射したサルの骨髄（図６Ｃ）は、そのＣＤ３４⁺幹細胞が、Ｇ−ＣＳＦを注射したサルの骨髄（図６Ａ）、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ＋Ｇ−ＣＳＦを注射したサルの骨髄（図６Ｂ）およびＰＢＳを注射したサルの骨髄（図６Ｄ）中のＣＤ３４⁺幹細胞よりもはるかに多かった。

（実施例８）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの造血回復に対する影響
１０⁴ＬiＮ^-／ＣＤ３４⁺細胞および放射線照射した１０⁵ＣＤ３４^-補助細胞をＮＯＤ−ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウス（放射線２．５Ｇｙを照射）に注射した。上記マウスはランダムに２組に分け、１組（ｎ＝２８）は１日２回、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質（用量１０μｇ／ｋｇ体重）を静脈注射し、別の１組（ｎ＝２８）は、ＰＢＳを１日２回注射した。植立後、ヒトＣＤ４５⁺細胞がマウス類末梢血液中に存在する比率が０．１％以上のマウスの数により造血回復を評価した。図７に示したように、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質を注射したマウスは比較的好ましい造血回復が観察された。

（実施例９）
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質の、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ化学療法後のＢａｌｂ／ｃマウスの造血回復に対する影響
ｃｉｓｐｌａｔｉｎ静脈注射を５週間、その末梢血液中のＬｙ５（ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４５）細胞数が元の数の１０％になるまで、Ｂａｌｂ／ｃマウスに繰り返した。ｃｉｓｐｌａｔｉｎを注射したマウスをランダムに２組に分け、１組（ｎ＝２８）は１日２回、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質（用量１０μｇ／ｋｇ体重）を静脈注射し、別の１組（ｎ＝２８）はＰＢＳを１日２回注射した。フローサイトメトリーで、周期的に全マウスの末梢血液中に存在するＬｙ５細胞を測定分析した。造血回復率は、末梢血液中のＬｙ５細胞数の、元の数に対する比率で評価した。図８に示したように、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組換えタンパク質を注射したマウスは、好ましい造血回復が観察された。

これらの実験で使用した動物モデルは、本技術分野ではヒト患者の結果予測に使用できると確認されているものである（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ他（２００５）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１，１３０７−１３１８、Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ他（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７，３７７２−３７７８等）。
本発明では前記実施例を開示したが、各種の追加、修正および置換えは、本発明の実施例に使用可能であり、特許請求の範囲が定める本発明の原理の主旨および範囲を逸脱しないことを理解すべきである。

造血幹細胞がインビボ増幅により末梢血液（ＰＢ）に動員されることを示す説明図。 修正したｐＥＴ２１ｂプラスチド内におけるｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈのクローンと構築を示す説明図。 ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨのＤＮＡ配列を示す図。 ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈのタンパク質配列を示す図。 １０％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル（１．５ｍｍ）でＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の精製を実証し、ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ染色で分析してｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈのタンパク質配列を示した図。 ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルで、精製したＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の安定性を分析し、ＰＢＳに４℃において０時間（Ａ）および１６時間（Ｂ）保存したときの特性図。 ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルおよびｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色でＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質を分析し、−４℃および−２０℃において保存し、ＰＢＳおよびＩＭＤＭ緩衝液の安定性を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、Ｇ−ＣＳＦのマウス骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、ＰＢＳのマウス骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のマウス骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、Ｇ−ＣＳＦのアカゲザル骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質に加えてＧ−ＣＳＦのアカゲザル骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のアカゲザル骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 フローサイトメトリーで、ＰＢＳのアカゲザル骨髄中のＣＤ３４⁺幹細胞数に対する刺激効果を分析した特性図。 ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの造血回復に対する影響を示した特性図。 ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ化学療法を受けた後のＢａｌｂ／ｃマウスの造血回復に対する影響を示した特性図。

Claims (7)

1. ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法であって、
   （ａ）前記タンパク質コードを有するキャリアを含む宿主細胞を提供する工程と、
   （ｂ）前記宿主細胞内に前記タンパク質を発現する工程と、
   （ｃ）前記発現タンパク質の不純溶液を得る工程と、
   （ｄ）前記溶液から前記タンパク質を精製する工程であって、
   （ｉ）前記溶液をニッケルイオン含有のカラムに通し、
   （ｉｉ）８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝溶液および１０ｍＭイミダゾールを含む洗浄液で前記ニッケルイオン含有のカラムを洗浄し、
   （ｉｉｉ）５０−２５０ｍＭイミダゾールおよび８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝溶液を含む溶離緩衝溶液を用いて、前記一部が精製されたタンパク質を前記ニッケルイオン含有のカラムから溶離し、一部が精製されたタンパク質溶液を生成し、
   （ｉｖ）前記一部が精製されたタンパク質溶液をイオン交換カラムに通し、
   （ｖ）４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.５の緩衝溶液を含む洗浄液で前記イオン交換カラムを洗浄し、
   （ｖｉ）１．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を含む溶離緩衝溶液を用いて精製されたタンパク質を変性形態にて前記イオン交換カラムから溶離する工程と、
   （ｅ）疎水性化合物を用いて溶離した変性タンパク質を新たに折り畳む工程であって、
   （ｉ）前記溶離したタンパク質を変性塩類を含む溶液に溶解することで変性させ、
   （ｉｉ）前記変性タンパク質とポリオキシエチレン−Ｐ−イソオクチルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたは多ベンゼン環化合物を含む疎水性化合物溶液とを混合し、タンパク質−疎水性化合物溶液を生成し、
   （ｉｉｉ）前記タンパク質−疎水性化合物溶液を脱塩してタンパク質−疎水性化合物脱塩溶液を得て、
   （ｉｖ）シクロデキストリンを用いて超ろ過工程を行い、緩衝溶液置換により前記疎水性化合物を前記タンパク質−疎水性化合物脱塩溶液中から除去し、
   （ｖ）前記精製されたタンパク質をＩＭＤＭ培養基またはＤＭＥＭ培養基中で保存する工程と、
   を含むことを特徴とするＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
2. 前記一部が精製されたタンパク質を前記ニッケルイオン含有のカラムから溶離する溶離緩衝溶液は、５０〜１００ｍＭのイミダゾールを含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
3. 前記一部が精製されたタンパク質を前記ニッケルイオン含有のカラムから溶離する溶離緩衝溶液は、１００〜２５０ｍＭのイミダゾールを含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
4. 前記超ろ過工程は、タンパク質濃縮カラムまたはタンパク質超ろ膜により行われることを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
5. ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＮ−末端のヒスチジンタグを除去する行程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
6. ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＣ−末端のヒスチジンタグを除去する行程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。
7. ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質のＮ−末端及びＣ−末端のヒスチジンタグを除去する行程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造方法。