ES2567780T3 - Método para la producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo - Google Patents
Método para la producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo Download PDFInfo
- Publication number
- ES2567780T3 ES2567780T3 ES12152269.2T ES12152269T ES2567780T3 ES 2567780 T3 ES2567780 T3 ES 2567780T3 ES 12152269 T ES12152269 T ES 12152269T ES 2567780 T3 ES2567780 T3 ES 2567780T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- solution
- tat
- hoxb4h
- hydrophobic compounds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title abstract 2
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 abstract description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 12
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 8
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 8
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102100028404 Homeobox protein Hox-B4 Human genes 0.000 description 3
- 101000839788 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B4 Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- CREXVNNSNOKDHW-UHFFFAOYSA-N azaniumylideneazanide Chemical group N[N] CREXVNNSNOKDHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 2
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 2
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000008355 dextrose injection Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007915 intraurethral administration Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Una composición farmacéutica para la administración in vivo para mejorar la movilización de Células Madre Hematopoyéticas (CMH) desde la médula ósea a la sangre periférica, que comprende una proteína TAT-HOXB4H que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en que la proteína TAT-HOXB4H es producida a través de un método que comprende: (a) proporcionar una célula huésped que comprende un vector que codifica la proteína; (b) expresar la proteína en la célula huésped; (c) recoger una solución impura de la proteína expresada; (d) purificar la proteína de la solución mediante: (i) aplicar la solución a una columna HisTrap; (ii) lavar la columna HisTrap; (iii) eluir la proteína parcialmente purificada de la columna HisTrap para formar una solución de proteína parcialmente purificada; (iv) aplicar la solución de proteína parcialmente purificada a una columna MonoSP; (v) lavar la columna MonoSP; (vi) eluir la proteína purificada de la columna MonoSP; (e) replegar la proteína desnaturalizada eluida utilizando compuestos hidrófobos mediante: (i) la combinación de la proteína desnaturalizada eluida y una solución de compuestos hidrófobos para formar una solución de la proteína y compuestos hidrófobos, en que los compuestos hidrófobos son capaces de proteger la proteína TAT-HOXB4H de la formación de agregados insolubles durante la fase de eliminación de sal de desnaturalización; (ii) la desalación de la solución de la proteína y compuestos hidrófobos para obtener una proteína desalada y una solución de compuesto hidrófobo; (iii) la eliminación de los compuestos hidrófobos de la solución de la proteína desalada utilizando ultrafiltración mediante un tubo de filtro centrífugo o una célula de agitación; y (f) el almacenamiento de la proteína purificada en medio IMDM o en medio DMEM.
Description
Resulta especialmente ventajoso formular composiciones en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformizar la dosificación. Forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adaptadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características exclusivas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las vías habituales de administración incluyen, sin limitación, oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o bucal), sublingual, rectal, vaginal, e intranasal. El término parenteral tal como se utiliza en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula para permitir que los ingredientes activos contenidos en la misma se encuentren biodisponibles después de la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se pueden administrar a un paciente toman la forma de una o más unidades de dosificación, donde por ejemplo, un comprimido puede ser una sola unidad de dosificación, y un contenedor de uno o más compuestos de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación.
Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína TAT-HOXB4H, el agente de unión puede ser en forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido como por ejemplo una gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula y polvo contiene aproximadamente desde un 5 a un 95% de agente de unión y preferiblemente aproximadamente desde un 25 a 90% de agente de unión. Los ejemplos son sacarosa, caolín, glicerina, dextrinas de almidón, alginato de sodio, carboximetilcelulosa y etilcelulosa. Pueden encontrarse presentes agentes colorantes y / o aromatizantes. Se puede emplear una cáscara de revestimiento. Cuando se administra en forma líquida, se puede añadir un vehículo líquido como por ejemplo agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal como por ejemplo aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles como por ejemplo etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene aproximadamente desde un 0.5 a un 90% en peso del agente de unión, y preferiblemente de aproximadamente 1 a 50% del agente de unión.
Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína TAT-HOXB4H se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión puede ser en forma de una solución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de dichas soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, entra dentro de los conocimientos en la técnica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea puede contener, además de agente de unión, un vehículo isotónico como por ejemplo inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Lactato de Ringer, u otro vehículo tal como es conocido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, u otro aditivo conocido por los expertos en la técnica.
En la práctica del método de tratamiento o utilización de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína TAT-HOXB4H a un sujeto, por ejemplo, un mamífero (por ejemplo, un ser humano). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que resulta suficiente para mostrar un beneficio significativo del paciente, por ejemplo, mejora de los síntomas, curación, o aumento en la tasa de curación de dichas condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, si se administra en combinación, en serie o simultáneamente.
La cantidad de proteína TAT-HOXB4H en la composición farmacéutica de la presente invención puede depender de la naturaleza y la gravedad de la afección a tratar, y de la naturaleza de tratamientos anteriores que el paciente ha experimentado, y de la edad y sexo del paciente. En última instancia, el médico tratante puede decidir la cantidad de ingrediente activo con el que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico tratante puede administrar dosis bajas de ingrediente activo y observar la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis más grandes de ingrediente activo hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosis no se incrementa más en general. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar el método de la presente invención pueden contener aproximadamente entre 1 µg a aproximadamente 1 mg de
"Transformación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la inserción: por ejemplo, transformación mediante captación directa, transfección, infección, y similares. Para los métodos particulares de transfección, véase más adelante. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped.
En general, el término "proteína" se refiere a cualquier polímero de dos o más aminoácidos individuales (ya sea o no de origen natural) unidos a través de enlaces peptídicos, tal como ocurre cuando el átomo de carbono carboxilo del grupo de ácido carboxílico unido al α -carbono de un aminoácido (o al resto de aminoácido) se convierte en unido covalentemente con el átomo de amino nitrógeno del grupo amino unido al α-carbono de un aminoácido adyacente. Estos vínculos de enlace peptídico, y los átomos que los contienen (es decir, los átomos de α-carbono, los átomos de carbono carboxilo (y sus átomos de sustituyente de oxígeno), y los átomos de amino nitrógeno (y sus átomos de sustituyente de hidrógeno)) forman la "columna vertebral de polipéptido" de la proteína. Además, tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" se entiende que incluye los términos "polipéptido" y "péptido" (que, a veces, pueden utilizarse indistintamente en la presente memoria). Del mismo modo, en el presente documento los fragmentos de proteínas, análogos, derivados y variantes se pueden denominar "proteínas", y se les considerará como una "proteína" a menos que se indique lo contrario. El término "fragmento" de una proteína se refiere a un polipéptido que comprende menos de todos los residuos de aminoácidos de la proteína. Tal como se puede apreciar, un "fragmento" de una proteína puede ser una forma de la proteína truncada en el extremo amino, el extremo carboxi terminal, y / o internamente (como por ejemplo, por corte y empalme natural), y también puede ser variante y / o derivada. Un "dominio" de una proteína es también un fragmento, y comprende los residuos de aminoácidos de la proteína necesarios para conferir una actividad bioquímica que corresponde a la proteína de origen natural.
"Recombinante" tal como se utiliza en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, de cADN, viral, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación no está asociado con todo o con una parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante" tal como se utiliza con respecto a una proteína o a un polipéptido significa un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante.
Una molécula "aislada", "purificada", "sustancialmente aislada" o "sustancialmente pura" (como por ejemplo un polipéptido o un polinucleótido) es una molécula que se ha manipulado para existir en una concentración mayor de la que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína sujeto es aislada, purificada, sustancialmente aislada, o sustancialmente purificada cuando al menos un 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de los materiales de la proteína no sujeto con los que está asociada en la naturaleza han sido eliminados. Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula "aislada", "purificada", "sustancialmente aislada" o "sustancialmente purificada" incluye moléculas recombinantes.
Un "ratón con SCID" es un modelo de ratón para el síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que causa graves defectos en el desarrollo del sistema inmunológico. Estos ratones son deficientes en, o carecen completamente de, los linfocitos T y B. La mutación del SCID parece dañar la recombinación de genes del receptor de antígeno, causando una falta de linfocitos T y B funcionales. Otros tipos de células hematopoyéticas parecen desarrollarse y funcionar normalmente. Los ratones con SCID soportan fácilmente la diferenciación de linfocitos normales y pueden reconstituirse con linfocitos normales de singénico o alogénico de ratones, o con linfocitos humanos. Estos ratones también soportan el crecimiento de tumores alogénicos y xenogénicos. Por lo tanto, los ratones con SCID, que permiten el crecimiento diseminado de un cierto número de tumores humanos, en particular los trastornos hematológicos y el melanoma maligno, se pueden utilizar para investigar tumores malignos.
Los términos "sujeto", "individuo", "huésped" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un animal vivo, incluyendo un ser humano y un animal no humano. El sujeto puede, por ejemplo, ser un organismo que posee las células inmunes capaces de responder a la estimulación antigénica, y a la transducción de señales de estimulación e inhibición a través de la unión de receptores de superficie celular. El sujeto puede ser un mamífero, como por ejemplo un mamífero humano o no humano, por ejemplo, perros, gatos, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, ratas y ratones. El término "sujeto" no excluye a los individuos que son completamente normales con respecto a una enfermedad, o normales en todos los aspectos.
El término "tratamiento" se refiere a una medida terapéutica o preventiva. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tiene un trastorno médico o que en última instancia puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o de un trastorno recurrente, o con el fin para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad del compuesto sujeto que puede provocar una respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal, o ser humano que se busca, por ejemplo, por parte de un investigador, un veterinario, un doctor en medicina, u otro médico.
Los siguientes ejemplos específicos se deben interpretarse como meramente ilustrativos, y no limitativo del resto de la descripción en modo alguno.
Ejemplo 1: Construcción del Plásmido pET21b-His-pTAT-HOXB4-His
El vector de expresión pET21b que contiene etiqueta His N-terminal y un péptido de señal TAT se generó mediante la inserción de oligonucleótidos 5'-TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCG CCGGCG-3' (sentido) y 5'-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCC GTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA3'(antisentido) en el plásmido pET21b. La etiqueta His C-terminal ya se encuentra presente en el vector pET21b.
Un fragmento de ADN que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de HOXB4 y una secuencia de codificación de 6 histidinas adicionales se obtuvo mediante amplificación por PCR utilizando el plásmido MGC54130 (GeneDiscovery, Taipei, Taiwan. Cat. Nº 5533346) como modelo, y el fragmento de cADN HOXB4 generado por PCR se subclonó en el vector de expresión pET21b modificado. La construcción del plásmido y las secuencias de ácido nucleico se muestran en las Figuras 2 y 3.
El vector de expresión pET21b-His-TAT-HOXB4-His se transformó en cepa de E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen). Las células transformadas se hicieron crecer durante la noche a 37 °C. Los cultivos cultivados durante una noche se diluyeron a una OD600 inicial de 0.05. Los cultivos se hicieron crecer hasta una OD600 de 0.5 a 37 °C, inducidos con 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 37 °C durante 3 horas, con agitación vigorosa.
A continuación de la inducción, las células fueron cosechadas por centrifugación y se re-suspendieron en Tampón A (8 M de Urea, 20 mM de HEPES, 0.5 mM de DTT y 100 mM de NaCl, pH 8.0). La suspensión celular se pasó tres veces a través de una prensa francesa, y el lisado celular fue aclarado por centrifugación a 20,000 x g durante 30 min a 4 °C, se ajustó el sobrenadante a 10 mM de imidazol y se cargó en las columnas de quelación HisTrap (Amersham Pharmacia). Las proteínas unidas se eluyeron con 50, 100 y 250 mM de imidazol en tampón A. Las fracciones que contenían TAT-HOXB4H se cargaron en una columna MonoSP en Tampón B (4 M de urea, 20 mM de HEPES y 50 mM de NaCl, pH 6.5), eluido con 1.5 M de NaCl y 20 mM de HEPES (pH 8.0).
La proteína TAT-HOXB4H en las fracciones eluidas se solubilizó y se desnaturalizó en una solución que contenía sal desnaturalizante (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina) y a continuación se mezcló con tampón de D-PBS-T (0.1% de Triton X-100 en 2× PBS). La relación de la solución de proteína TAT-HOXB4H por tampón D-PBS-T fue de 1:4. La mezcla resultante se añadió a un tubo de filtro centrífugo de 10K (50 ml o 15 ml) pretratado con agua (10 ml o 3 ml), y a continuación se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. En este paso, la sal de desnaturalización se sustituye por tampón de D-PBS-T en el que Triton X100 es capaz de unirse con la región hidrófoba de la proteína HOXB4H.
Esta etapa de ultrafiltración o de intercambio de tampón utilizando un tubo de filtro centrífugo de 10K se realizó diez veces con una solución que contenía diferentes concentraciones de beta-ciclodextrina (dos veces de cada una de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM y 5 mM de beta-ciclodextrina en tampón de almacenamiento IMDM por centrifugación a 1000-2500 x g durante 10 min. Se recogió la muestra restante en el tubo de filtro centrífugo de 10K y se almacenó a -80 °C.
5
10
15
20
25
30
35
La homogeneidad de la proteína TAT-HOXB4H purificada se analizó mediante gel de SDS-poliacrilamida seguido por tinción de Coomassie (Figura 5). Tal como se muestra en la Figura 5, la TAT-HOXB4H purificada a partir de HisTrap y MonoSP dio como resultado un rendimiento 3-4 veces superior en comparación con el de la proteína TAT-HOXB4. El plásmido pTAT-HA-HOXB4 fue un obsequio del Dr. Guy Sauvageau, Universidad de Montreal, Canadá. Este plásmido se transformó en BL21(DE3)pLysS (Novagen) y la purificación de la proteína TAT-HOXB4 se realizó tal como se describe en Krosl et al, 2003.
La estabilidad de la proteína TAT-HOXB4H se midió por análisis en gel de SDS-poliacrilamida. A través de la conservación, la TAT-HOXB4H completa puede ser degradada en fragmentos de 30 kD y 10 kD. Tal como se muestra en la Figura 6, la proteína TAT-HOXB4H producida por el método de esta invención se mantuvo estable incluso después de 16 horas almacenada en PBS a 4 °C.
Además, la estabilidad de la proteína TAT-HOXB4H almacenada a 4 °C y -20 °C en PBS y tampón de almacenamiento IMDM se analizó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% seguido por tinción con Coomassie. Tal como se muestra en la Figura 7, cuando se utilizó IMDM como tampón de almacenamiento, la estabilidad de la proteína TAT-HOXB4H se mantuvo incluso después de 4 semanas.
Los ratones Balb / c se utilizan para investigar el posible efecto de la proteína TAT-HOXB4H recombinante en la movilización de células madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre periférica. La proteína recombinante TAT-HOXB4H en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se administró por inyección subcutánea cuatro veces al día durante 4 días. Para examinar la respuesta a la dosis, los grupos experimentales (n = 21) recibieron una dosis que oscilaba entre 1 µg, 5 µg, 10 µg, 15 µg. . . hasta 100 µg por kg de peso corporal por ratón. Un grupo separado de ratones de control recibieron solución salina tamponada de fosfato solamente, y otro grupo de ratones de control fueron inyectados por vía subcutánea dos veces al día durante 4 días con una dosis de 5 µg por kg de peso corporal de G-CSF por ratón.
Se recogió la sangre periférica de todos los ratones y se analizó mediante un citómetro de flujo para obtener el porcentaje de células madre CD34+ en células mononucleares (MNC). Los resultados se presentan como la media ± s.d. en la Tabla 1.
Grupo (Experimental / Control)
El porcentaje cosechado de células CD34+ / MNC en sangre periférica de los ratones tratados se muestra
5 en la Tabla 1. Los grupos experimentales 3-21 tratados con TAT-HOXB4H (que recibieron una dosis de 10 µg o más por kg de peso corporal) mostraron sustancialmente el mismo efecto de movilización que el grupo de control tratado con G-CSF.
La médula ósea de los ratones tratados con TAT-HOXB4H (el Grupo Exp. 3 recibió una dosis de 10 µg
10 por kg de peso corporal), de los ratones tratados con G-CSF, y de los ratones inyectados con PBS fue fenotipado todavía más utilizando anticuerpo conjugado con FITC a CD34+ (Becton Dickinson) y fue analizado mediante un citómetro de flujo. La médula ósea de ratones tratados con TAT-HOXB4H (Figura 8C) parece ser más rica en células madre CD34+ que la médula ósea de ratones inyectados con G-CSF (Figura 8A) y PBS (Figura 8B). Por lo tanto, estos resultados indican que la inyección de proteínas TAT
15 HOXB4H recombinante da como resultado un aumento del número de CMH tanto en la médula ósea como en la sangre periférica en ratones.
Se utilizaron monos rhesus macho adultos para investigar la eficacia de la proteína TAT-HOXB4H
5 recombinante en monos. El grupo experimental I (n = 5) fue inyectado por vía intravenosa con 10 µg por kg de peso corporal de la proteína TAT-HOXB4H recombinante cuatro veces al día durante 4 días. El grupo experimental II (n = 5) fue inyectado por vía intravenosa con 10 µg por kg de peso corporal de TAT-HOXB4H cuatro veces al día y fue inyectado por vía subcutánea con 5 µg por kg de peso corporal de G-CSF durante 4 días. El grupo de control I recibió PBS solamente, y el grupo de control II fue inyectado por
10 vía subcutánea dos veces al día durante 4 días con una dosis de 5 µg por kg de peso corporal de G-CSF. Se recogió la sangre periférica de todos los monos y se analizó mediante un citómetro de flujo para obtener el porcentaje de células madre CD34+ en células mononucleares (MNC). Los resultados se presentan en la Tabla 2.
15 Tabla 2
Tal como se muestra en la Tabla 2, los monos (grupo experimental I) tratados con TAT-HOXB4H sólo mostraron un efecto de movilización significativamente mejor que los monos tratados con G-CSF (grupo 20 de control II). Los monos tratados con TAT-HOXB4H y G-CSF (grupo experimental II) mostraron un efecto de movilización ligeramente mejor que los monos tratados con G-CSF (grupo de control II).
Las muestras de médula ósea de monos tratados con TAT-HOXB4H, G-CSF o PBS fueron fenotipadas adicionalmente usando anticuerpo conjugado con FITC a CD34+ (Becton Dickinson) y se analizaron
25 mediante un citómetro de flujo. Los especímenes de médula ósea de monos tratados con TAT-HOXB4H (Figura 9C) aparecen como significativamente más ricos en células madre CD34+ que los especímenes de médula ósea de monos inyectados con G-CSF (Figura 9A), TAT-HOXB4H + G-CSF (Figura 9B) y PBS (Figura 9D).
104 células Lin-/ CD34+ humanas fueron inyectadas en ratones irradiados (2,5 Gy) NOD-LtSz-scid / scid (NOD-SCID), junto con 105 células accesorias irradiadas CD34-. Los ratones se dividieron en dos grupos 35 de forma aleatoria: un grupo (n = 28) fue inyectado por vía intravenosa con 10 µg por kg de peso corporal de la proteína TAT-HOXB4H recombinante dos veces al día, y el otro (n = 28) recibió PBS dos veces al día. La presencia de células humanas CD45+ en las células de sangre periférica de todos los ratones se midió periódicamente por citometría de flujo después del trasplante. La recuperación hematopoyética se evaluó como el número de ratones cuyas células CD45+ humanas alcanzaron niveles de > 0.1% en la
40 sangre periférica (PB) después del trasplante. Tal como se muestra en la Figura 10, se observó una mejora en la recuperación hematopoyética en los ratones inyectados con la proteína TAT-HOXB4H recombinante.
Ratones Balb / c de 5 semanas de edad fueron inyectados por vía intravenosa varias veces con cisplatino hasta que el número de células Ly5 (murinas CD45) en la sangre periférica de los ratones disminuyeron a aproximadamente un 10% del número original. Los ratones tratados con cisplatino se dividieron en dos 50 grupos aleatorios: un grupo (n = 28) fueron inyectados por vía intravenosa con 10 µg por kg de peso corporal de la proteína TAT-HOXB4H recombinante dos veces al día, y el otro (n = 28) recibió PBS dos veces por día. La presencia de células Ly5 en las células de sangre periférica de todos los ratones se midió periódicamente por citometría de flujo después del trasplante. La tasa de recuperación hematopoyética se evaluó como el porcentaje del número de células Ly5 en la sangre periférica con
55 respecto al número original. Tal como se muestra en la Figura 11, se observó una mejora en la recuperación hematopoyética en los ratones inyectados con la proteína TAT-HOXB4H recombinante.
Claims (1)
-
imagen1
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12/042,097 US8222206B2 (en) | 2008-03-04 | 2008-03-04 | Method of enhancing the mobilization of hematopoietic stem cells using TAT-HOXB4H |
| US42097 | 2008-03-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2567780T3 true ES2567780T3 (es) | 2016-04-26 |
Family
ID=40627112
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES12152269.2T Active ES2567780T3 (es) | 2008-03-04 | 2008-03-31 | Método para la producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo |
| ES08153854.8T Active ES2464777T3 (es) | 2008-03-04 | 2008-03-31 | Método de producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES08153854.8T Active ES2464777T3 (es) | 2008-03-04 | 2008-03-31 | Método de producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8222206B2 (es) |
| EP (2) | EP2455099B1 (es) |
| JP (2) | JP4755224B2 (es) |
| KR (1) | KR101160381B1 (es) |
| CN (3) | CN101524527B (es) |
| BR (1) | BRPI0803381A2 (es) |
| CA (1) | CA2658231C (es) |
| ES (2) | ES2567780T3 (es) |
| HK (2) | HK1130290A1 (es) |
| HU (1) | HUE027513T2 (es) |
| MY (1) | MY164521A (es) |
| PL (2) | PL2455099T3 (es) |
| PT (1) | PT2100968E (es) |
| RU (1) | RU2401863C2 (es) |
| TW (1) | TWI414598B (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8222206B2 (en) * | 2008-03-04 | 2012-07-17 | Taiwan Advance Bio-Pharm Inc. | Method of enhancing the mobilization of hematopoietic stem cells using TAT-HOXB4H |
| US10354407B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-07-16 | Spatial Cam Llc | Camera for locating hidden objects |
| US10896327B1 (en) | 2013-03-15 | 2021-01-19 | Spatial Cam Llc | Device with a camera for locating hidden object |
| EP3260533B1 (en) * | 2011-03-22 | 2019-09-11 | Pluristem Ltd. | Methods for treating radiation or chemical injury |
| RU2495125C2 (ru) * | 2011-12-07 | 2013-10-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина" Минздрава России) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOK-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ ОСТ4 И KLF4 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕНАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
| US9783783B2 (en) * | 2013-01-30 | 2017-10-10 | Cornell University | Compositions and methods for the expansion of stem cells |
| CA2908739A1 (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-09 | Claudia Zylberberg | Matrix metalloproteinases and uses thereof |
| TWI548748B (zh) * | 2015-04-16 | 2016-09-11 | 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司 | 造血幹／先驅細胞之體外放大培養方法及其立即可使用之組成物 |
| US11564942B2 (en) | 2016-02-19 | 2023-01-31 | The General Hospital Corporation | Methods for generating universal and custom MHC/HLA-compatible hematopoietic progenitor cells |
| KR20240031427A (ko) | 2018-09-24 | 2024-03-07 | 보스톤 싸이엔티픽 싸이메드 인코포레이티드 | 조직 보유력이 개선된 공격적인 특징의 클립 |
| TW202026307A (zh) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司 | Ｎ－端標記組胺酸之重組ｔａｔ－ｈｏｘ家族蛋白質及其製造方法 |
| TWI756518B (zh) * | 2019-02-27 | 2022-03-01 | 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司 | 突變型ｈｏｘｂ４重組蛋白質之製造方法與用途 |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2838867B2 (ja) * | 1986-01-22 | 1998-12-16 | 中外製薬株式会社 | 幹細胞増殖促進剤 |
| JPH0276820A (ja) * | 1988-06-15 | 1990-03-16 | Ajinomoto Co Inc | 骨髄移植療法支持剤 |
| JPH06133780A (ja) * | 1992-10-23 | 1994-05-17 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 新規なｔ−ＰＡ改変体 |
| US5837507A (en) | 1995-11-13 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Hox-induced enhancement of in vivo and in vitro proliferative capacity and gene therapeutic methods |
| US6303337B1 (en) * | 1999-08-25 | 2001-10-16 | Amber Gen. Inc. | N-terminal and C-terminal markers in nascent proteins |
| US20040072298A1 (en) | 2000-02-23 | 2004-04-15 | Guy Sauvageau | Stem cell expansion enhancing factor and method of use |
| CA2337574C (en) | 2000-02-23 | 2013-01-22 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal/Ircm | Hematopoietic stem cell expansion enhancing factor and method of use |
| US20040082003A1 (en) | 2000-02-23 | 2004-04-29 | Guy Sauvageau | Stem cell expansion enhancing factor and method of use |
| DE10050935A1 (de) * | 2000-10-11 | 2002-05-02 | Tegenero Gmbh | Verwendung CD28 spezifischer monoklonaler Antikörper zur Stimulation von Blutzellen, welche kein CD28 tragen |
| CN1668637B (zh) * | 2002-07-17 | 2010-05-26 | 希托斯生物技术股份公司 | 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列 |
| JP2006501829A (ja) * | 2002-10-08 | 2006-01-19 | アンスティテュ ドゥ ルシェルシュ クリニーク ドゥ モレアル | Ｈｏｘで誘導される増殖を制限する遺伝子をブロックする幹細胞増殖因子およびその方法 |
| US20040229330A1 (en) | 2003-02-27 | 2004-11-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Integrated method for capture and purification of tagged proteins |
| JP5517394B2 (ja) * | 2003-07-03 | 2014-06-11 | ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | 造血におけるｉｌ−１２の使用 |
| WO2005026196A2 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-24 | Novexin Limited | Methods for folding proteins and reducing protein aggregation |
| TW200517398A (en) | 2003-11-21 | 2005-06-01 | Ind Tech Res Inst | Method for recombinant protein purification, modification and immobilization |
| US20080299095A1 (en) * | 2004-07-09 | 2008-12-04 | Bc Cancer Agency | Nup98-Hox Fusions for Expansion of Hemopoietic Stem Cells |
| TWI328036B (en) * | 2005-07-01 | 2010-08-01 | Taiwan Advance Bio Pharm Inc | Process for producing c-termial histidine tagged hoxb4 and the use thereof in expanding stem cells |
| CN101016540B (zh) | 2006-02-10 | 2010-04-07 | 台湾尖端先进生技医药股份有限公司 | C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途 |
| KR20090045886A (ko) * | 2006-04-14 | 2009-05-08 | 어드밴스드 셀 테크놀로지, 인코포레이티드 | 혈관 콜로니 형성 세포 |
| TWI311562B (en) | 2006-05-09 | 2009-07-01 | Northern Taiwan Bio Pharm Inc | One step rapid desalting and protein refolding process |
| TWI369990B (en) | 2006-09-05 | 2012-08-11 | Taiwan Advance Bio Pharminc | Hsc proliferated with c-histidine labeled hoxb4h and use thereof |
| US8222206B2 (en) * | 2008-03-04 | 2012-07-17 | Taiwan Advance Bio-Pharm Inc. | Method of enhancing the mobilization of hematopoietic stem cells using TAT-HOXB4H |
-
2008
- 2008-03-04 US US12/042,097 patent/US8222206B2/en active Active
- 2008-03-31 ES ES12152269.2T patent/ES2567780T3/es active Active
- 2008-03-31 ES ES08153854.8T patent/ES2464777T3/es active Active
- 2008-03-31 EP EP12152269.2A patent/EP2455099B1/en active Active
- 2008-03-31 PL PL12152269T patent/PL2455099T3/pl unknown
- 2008-03-31 PL PL08153854T patent/PL2100968T3/pl unknown
- 2008-03-31 EP EP08153854.8A patent/EP2100968B1/en active Active
- 2008-03-31 PT PT81538548T patent/PT2100968E/pt unknown
- 2008-03-31 HU HUE12152269A patent/HUE027513T2/en unknown
- 2008-04-30 TW TW097115961A patent/TWI414598B/zh active
- 2008-05-27 CN CN200810111350.XA patent/CN101524527B/zh active Active
- 2008-05-27 CN CN201210275514.9A patent/CN102805859B/zh active Active
- 2008-05-27 CN CN201410854099.1A patent/CN104650210B/zh active Active
- 2008-06-26 JP JP2008167504A patent/JP4755224B2/ja active Active
- 2008-08-20 RU RU2008134247/10A patent/RU2401863C2/ru active
- 2008-08-28 BR BRPI0803381-1A patent/BRPI0803381A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-02-25 KR KR1020090015907A patent/KR101160381B1/ko active IP Right Grant
- 2009-03-03 CA CA2658231A patent/CA2658231C/en active Active
- 2009-09-03 MY MYPI20093652A patent/MY164521A/en unknown
- 2009-10-12 HK HK09109417.7A patent/HK1130290A1/xx unknown
- 2009-10-12 HK HK12111667.5A patent/HK1170933A1/zh unknown
-
2010
- 2010-10-18 US US12/906,613 patent/US8124377B2/en active Active
- 2010-10-18 US US12/906,435 patent/US8222207B2/en active Active
-
2011
- 2011-03-22 JP JP2011062807A patent/JP5738636B2/ja active Active
-
2012
- 2012-06-15 US US13/524,293 patent/US8450458B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2567780T3 (es) | Método para la producción de proteína TAT-HOXB4H recombinante para su utilización como estimulante de la hematopoyesis in vivo | |
| ES2289778T3 (es) | Proteinas de fusion de la region constante de la inmunoglobulina/receptor tgf-beta tipo ii. | |
| EP2841086B1 (en) | Compositions for use in treating neural injury by inhibiting the activity of lar family phosphatases | |
| ES2819866T3 (es) | Polipéptido ANGPTL8 y su uso para el tratamiento de condiciones asociadas con triglicéridos elevados | |
| JP2015506373A (ja) | 成長分化因子１５（ｇｄｆ−１５）ポリペプチド | |
| ES2791778T3 (es) | Mitigación del daño tisular y la fibrosis a través de anticuerpos anti-LTBP4 | |
| ES2602629T3 (es) | Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso | |
| KR20200090889A (ko) | Cdkl5 발현 변이체 및 cdkl5 융합 단백질 | |
| ES2657049T3 (es) | IL-6 para la terapia o prevención de neuropatías inducidas por quimioterapia | |
| CA2797247C (en) | Methods and uses of tie2 binding and/or activating agents | |
| de Jesús Jiménez-Chávez et al. | B19-VLPs as an effective delivery system for tumour antigens to induce humoral and cellular immune responses against triple negative breast cancer | |
| US10898550B2 (en) | Compositions and methods of treating root avulsion injury | |
| US20230295658A1 (en) | Compositions and methods for in vivo gene transfer | |
| CA2562957A1 (en) | Adrenomedullin and adrenomedullin binding protein for ischemia/reperfusion treatment | |
| ES2540862T3 (es) | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos bovino y sus variantes | |
| ES2743426T3 (es) | Proteína para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos y usos de esta | |
| EP2731964A2 (en) | Micro-utrophin polypeptides and methods | |
| JP2011529452A (ja) | 抗血管新生薬としての可溶性ｉｇｆ受容体 | |
| WO2018162722A1 (en) | Dpp-4 inhibitors for use in treating bone fractures |