CN101016540B - C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途 - Google Patents

C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101016540B
CN101016540B CN2006100031081A CN200610003108A CN101016540B CN 101016540 B CN101016540 B CN 101016540B CN 2006100031081 A CN2006100031081 A CN 2006100031081A CN 200610003108 A CN200610003108 A CN 200610003108A CN 101016540 B CN101016540 B CN 101016540B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tat
hoxb4
hoxb4h
recombinant protein
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2006100031081A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101016540A (zh
Inventor
吴国瑞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hexun Life Science Co.,Ltd.
Original Assignee
TAIWAN ADVANCE BIO-PHARM Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TAIWAN ADVANCE BIO-PHARM Inc filed Critical TAIWAN ADVANCE BIO-PHARM Inc
Priority to CN2006100031081A priority Critical patent/CN101016540B/zh
Priority to EP06722298A priority patent/EP1889916A4/en
Priority to PCT/CN2006/000646 priority patent/WO2007090317A1/zh
Priority to JP2008553600A priority patent/JP4958918B2/ja
Publication of CN101016540A publication Critical patent/CN101016540A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101016540B publication Critical patent/CN101016540B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明关于一种经改良的C-端含有组氨酸标记的HOXB4重组蛋白质(即，TAT-HOXB4H)的制造方法，其中该TAT-HOXB4H于C-端含有6个或其以上组氨酸标记。该方法包含构筑得其中于HOXB4开放读框的C端含有至少6个组氨酸编码片段的DNA构建体；将所得构建体转形至宿主细胞中表现该C-端含有至少6个组氨酸标记的HOXB4重组蛋白；以及自该宿主细胞溶解产物纯化该重组蛋白质。更特别地，关于构筑一种用于生产TAT-HOXB4H重组蛋白质的构建体，该重组蛋白于宿主细胞(例如大肠杆菌)产生后，可增加蛋白纯化效率达三至五倍。本发明也关于使用所制造得的TAT-HOXB4H重组蛋白质于活体外干细胞增生的方法及组合物。

Description

C-端含有组氨酸标记的HOXB4重组蛋白质的制造方法及用途
技术领域
本发明关于通过构筑一种用于制造C-端含有组氨酸标记的HOXB4重组蛋白质(TAT-HOXB4H)的DNA构建体，而提高该重组蛋白纯化效率的方法，其中该TAT-HOXB4H于C-端含有6个或其以上组氨酸标记。本发明还进一步关于使用所制造得的TAT-HOXB4H重组蛋白质于活体外干细胞增生的方法及组合物。
背景技术
脐带血(umbilical cord blood；UCB)是指在婴儿出生时，于脐带及胎盘内所存留的血。脐带血中富含“零岁”的原始干细胞，其功用与骨髓相当，是人体制造血液及免疫系统的主要来源。脐带血的干细胞又称为全能细胞，因为它类似胚胎一般，是”年轻”而较未分化的细胞，可以发展成不同型态的细胞或组织，可用于治疗癌症、血液疾病，甚至先天代谢疾病等。脐带血干细胞的数量和品质都比其他干细胞优良，因为脐带血中的造血干细胞以及母细胞的浓度比骨髓内的多10-20倍，它的增生能力也比较高。再者，由于脐带血造血干细胞比较不成熟(primitive；immature)，它的T细胞辨识“自我”与“非我(non-self)”的能力就比骨髓或周边血的成熟造血干细胞要差，因此可以减少移植物抗宿主疾病(graft versus host disease；GVHD)及排斥反应(rejection)的发生，还可以增加少数族群移植的机会。此外，脐带血干细胞配对的要求比较低，非亲属间的骨髓移植，会要求六个白血球抗原(HLA)都符合，脐带血干细胞移植只要五个甚至四个抗原相同就可以移植。
脐带血干细胞采集数量有限，对于婴孩童时期使用尚可，但如果用于成人，则可能会稍有不足。加拿大蒙特利尔大学(University of Montreal)的盖·萨瓦格(Guy Sauvageau)博士曾经探讨骨髓中干细胞数目受限制的现象，他的研究显示同位序列基因(homeobox gene)HOXB4对于造血干细胞自我更新的调控十分重要，可维持它在骨髓中的群集大小。最早证明HOX基因会在血球细胞表现，是利用人类及老鼠的细胞株(cell line)而证实的。有些HOX基因在不同的细胞形态有明显广泛的表现，有些HOX基因则只活化表现于特定细胞中。例如，人类的HOXB串群中的八个成员会在红血球细胞发育初表现，有些HOXB基因包括HOXB4及HOXB7也会在T细胞及B细胞表现。Sauvageau等人证实有九个HOXA基因、八个HOXB基因及四个HOXC基因会在CD34+骨髓细胞内表现，其中又以HOXB2、HOXB9及HOXA10在CD34+的细胞族群内的红血球原始细胞表现最多。另外，实验结果也检测出在CD34-的细胞群中，没有HOX基因或少量HOX基因表现。因此，“HOXB4”蛋白已最常被用于做为活体外造血干细胞(HSC)增生的有效刺激剂。
已知通过遗传工程所产制的重组“HOXB4”蛋白质，是为了使蛋白能进入细胞而在“HOXB4”蛋白质的N端接上了一段TAT的蛋白序列，该TAT序列能使“HOXB4”蛋白质进入细胞后，通过热休克蛋白90的协助而将“HOXB4”蛋白质折叠成有活性的构形。而且，于其N-端含有一段含6个组氨酸(His-6)的组氨酸标记，以利进行该重组蛋白质的纯化及回收。已证实，此外源性“TAT-HOXB4”重组蛋白能够促进造血干细胞增生达2-6倍(Amsellem，S.等人，Nature Medicine 9，1423-1427，2003；及Krosl，J.等人，Nature Medicine 9，1428-1432，2003)。然而，该TAT-HOXB4重组蛋白质自大肠杆菌宿主的纯化回收产率偏低，故为得到足够供干细胞增生的TAT-HOXB4重组蛋白质量，必须培养大量的大肠杆菌表现细胞，以及使用更繁复的纯化步骤。
于是，本发明针对欲提高TAT-HOXB4重组蛋白质的回收产量提出解决方案，其主要是通过构筑一种用于生产C-端含组氨酸标记的HOXB4(TAT-HOXB4H)重组蛋白质的构建体，其中于所表现的重组TAT-HOXB4蛋白C-端另具有一段至少6个组氨酸残基的标记，而提高该重组蛋白纯化效率的方法。
发明内容
于一方面，本发明关于一种制备C-端含有至少6个组氨酸标记的HOXB4重组蛋白质(TAT-HOXB4H)的方法，该方法包含构筑其中于HOXB4开放读框(ORF)的C端含有至少6个组氨酸编码片段的DNA构建体；将所得构建体转形至宿主细胞中表现该TAT-HOXB4H重组蛋白；以及纯化该重组蛋白质。
术语“表现载体”、“聚核苷酸载体”、“DNA构建体”及“载体构建体”于本文中可交替使用而意指任何用于基因转殖的构建体，如熟悉本项技术的人员所了解。
术语“Histidine tag(组氨酸标记，His tag)”于本文中所指为至少6个的组氨酸残基。于本发明的一项具体方式中，通过聚合酶链反应(PCR)方法扩增得其C-端引入一段含有7个组氨酸编码片段的HOXB4开放读框，并将此DNA片段克隆入适当宿主细胞中进行表现。于另一具体方式中，以可表现TAT-HOXB4重组蛋白质的载体为模板，通过PCR方法于扩增时将一段较原始TAT-HOXB4多出5个组氨酸的编码序列导入C-端核苷酸序列中，而使最终表现得的TAT-HOXB4H重组蛋白质的C-端含有7个组氨酸标记。经此构建体转形至大肠杆菌中表现制得TAT-HOXB4H重组蛋白质，经纯化后的产量较原始TAT-HOXB4重组蛋白质高出3-5倍。
于另一方面，本发明关于一种用于增加TAT-HOXB4H重组蛋白质产量的DNA构建体，其特征在于，TAT-HOXB4开放读框的C-端已导入7个组氨酸标记。于一具体方式中，本发明的DNA构建体是质体pTAT-HOXB4H。
经本发明方法制得的TAT-HOXB4H重组蛋白质同样可用于干细胞增生。经实验证明，其可于活体外使脐带血干细胞增生达6倍，与原始TAT-HOXB4重组蛋白质相比较功效相当，表示根据本发明方法将5个组氨酸导入TAT-HOXB4重组蛋白质的C-端所制得的经改良TAT-HOXB4H重组蛋白质，不仅能增加于宿主细胞的纯化效率(及纯化后的产量)，也可有效用于干细胞增生。
因此，本发明的另一方面是关于包含所制得新颖TAT-HOXB4H重组蛋白质于干细胞增生的干细胞增生培养基及其使用方法。即，一种用于干细胞增生的培养基，其包含5-100nM根据本发明的方法所制得的TAT-HOXB4H重组蛋白质，及适用于干细胞增生的细胞营养物质、细胞因子与抗生素。于本发明的一项具体方式中，该用以增生的干细胞是脐带血干细胞。于另一项具体方式中，该用以增生的干细胞是脐带血造血干细胞。
术语“干细胞”指具有增殖、自我修复及大量制造分化后代能力的细胞。干细胞具有分化或转变成其他细胞的能力，这群细胞通常来自胚胎发育初期，在适当的环境下能够转变成特定的组织与器官。
由本申请实施例的纯化及干细胞增生实验数据显示，经由本发明制法所得的TAT-HOXB4H重组蛋白质产量，较原始TAT-HOXB4重组蛋白质的纯化效率(及纯化后的产量)高出3-5倍，且具有与TAT-HOXB4重组蛋白质相当的干细胞增生促进能力。
附图说明
图1表示本发明新颖C-端含7个组氨酸标记的构建体pTAT-HOXB4H的构筑流程。
图2为pTAT-HOXB4H构建体的DNA序列(序列：4)，其中划横线处以(6)表示的CAT序列代表经添加于pTAT-HOXB4H构建体中的C-端组氨酸标记编码序列。
图3表示经纯化后，本发明的TAT-HOXB4H与已知TAT-HOXB4的产量比较结果。箭头所指为TAT-HOXB4H及TAT-HOXB4的蛋白质电泳位置，显示TAT-HOXB4H较TAT-HOXB4的纯化产量增加大约4倍。
图4表示以TAT-HOXB4H(空圆形)及TAT-HOXB4(三角形)促进活体外脐带血干细胞增生的比较结果，其以CD34+细胞数量的测量值表示。对照组以BSA(牛血清白蛋白)处理(实心圆)。
具体实施方式
下列实施例用以说明本发明的技术内容即可达成的功效，但非以限制本发明。凡依本发明所作的任何均等变化及修饰，皆属本发明权利要求书所界定的范畴。
实施例1：质体pTAT-HOXB4H的构筑
将质体pTAT-HOXB4(Nature Medicine 9，1428-1432(2003))，通过使用下列引物对的PCR反应进行扩增：
5’-ctccatggctatgagttcttttttg-3’(序列：1)及
5’-atgatgatgatga tgatgatggagcgcgcgg-3’(序列：2)，
而得一段于该HOXB4开放读框(ORF)的C-端含有多出四个组氨酸残基的片段(参见图2)。将此经扩增得的片段再以下列引物对进行PCR反应扩增：
5’-ctccatggctatgagttcttttttg-3’(序列：1)及
5’-cagaattcctaatg atgatgatgatga-3’(序列：3)，
而得一段于3’端具有一个新产生的EcoRI切位的片段。接着将此片段以限制酶NcoI与EcoRI进行切割，并亚克隆至经该二相同酶切割并回收得的原始pTAT-HOXB4质体的骨架(接至其上的NcoI与EcoRI切位)，而制得新颖质体pTAT-HOXB4H。本发明中，将具有上述特征的重组pTAT-HOXB4蛋白质称为pTAT-HOXB4H。
实施例2：TAT-HOXB4H重组蛋白质与TAT-HOXB4重组 蛋白质的纯化及产量比较
将pTAT-HOXB4(或pTAT-HOXB4H)载体转形至大肠杆菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen)。令经转形的细胞于37℃下生长过夜。将过夜培养物稀释成起始OD600值(在600nm的光密度值)为0.05，并置于37℃下生长至OD600值为0.5，接着以1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)于37℃下进行诱导表现3小时，期间伴随剧烈摇晃。于诱导作用后，将细胞以离心收集并再悬浮于缓冲液A(8M尿素，20mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，0.5mM DTT(二硫苏糖醇)及100mM NaCl，pH8.0)中。将细胞悬浮液通过法兰西压榨器(French press)挤压三次，并将胞溶产物以20,000×g于4℃下离心30分钟使其澄清。将上清液调整至10mM咪唑并加样至HisTrap螯合管柱(AmershamPharmacia)。将结合的蛋白以50、100及250mM配制于缓冲液A中的咪唑进行溶析。将含有HOXB4(或HOXB4H)的流份加样至存在缓冲液B(4M尿素，20mM HEPES及50mM NaCl，pH6.5)的MonoSP管柱，以1.5M NaCl及20mM HEPES(pH8.0)溶析并置于PD-10 Sephadex G-25管柱去盐。以PBS(磷酸缓冲液)将HOXB4(或HOXB4H)蛋白质从PD-10 Sephadex G-25管柱溶析出，流份纯度＞99％。将全部溶析物加入以1％BSA及10％甘油，分装并于-80℃下急速冷冻。
由图3的电泳结果显示，经本发明方法所产制的C-端新增5个组氨酸的TAT-HOXB4H重组蛋白质，在大肠杆菌宿主的回收产量较原始TAT-HOXB4重组蛋白质的产量增加大约3-5倍。通过Bradford assay分析法定量重组蛋白质的产量，其以OD595对BSA已知浓度做图，并利用此标准曲线以内插法计算出样本中的蛋白质含量，得知TAT-HOXB4H重组蛋白质的产量为5.5mg/L，而TAT-HOXB4重组蛋白质的产量为1.2mg/L。
实施例3：TAT-HOXB4H重组蛋白质对于造血干细胞增生的 能力
将人类脐带血中的红血球通过于4℃下于含有0.1％碳酸氢钠的0.83％氯化铵(pH 7.0)中进行溶解而去除。将经收集的白血球部份与磁珠结合的特定抗体与细胞共同培养后，通过Stemsep管柱分离方式进行磁性细胞分离程序以收集带CD34+细胞，并除去表现成熟人类白血球细胞的部分，将经纯化的细胞于干细胞培养基(DMEM，含10％FCS(胎牛血清)，5ng/ml白介素-3，10ng/ml白介素-6，100ng/ml STF(干细胞生长因子)，青霉素100单位/ml及100μg/ml链霉素)中培养2天，然后置于含有15nM HOXB4(或HOXB4H)或1％BSA的干细胞培养基中培养4天。于培养第3天(以处理当天为第0天)，将4×105细胞/毫升再悬浮于补充以BSA或HOXB4(或HOXB4H)的干细胞培养基中。然后于每3个小时添加新鲜的BSA或HOXB4(或HOXB4H)蛋白质(含50％最初蛋白质量溶于5％总培养基)。经12小时后，加入FCS与细胞因子以校正其于稀释浓度达20％的培养基中所含的正确量。经24小时后，将细胞再悬浮于含有目标蛋白质的新鲜培养基中。于处理的第0、2及4天以ISHAGE方法(CD45/CD34染色加正向与侧向散射光)计数干细胞量。
由图4的结果证明，本发明的TAT-HOXB4H重组蛋白质对于脐带血干细胞的增生可达约6倍，此效能与已知TAT-HOXB4重组蛋白质相当。表示，根据本发明所制得于C-端含有额外5个组氨酸的TAT-HOXB4H重组蛋白质，相较于原始TAT-HOXB4重组蛋白质的干细胞增生能力并无影响。
此外，将经与TAT-HOXB4H蛋白共培养增生的人类CD34+脐带血干细胞(每只小鼠施予5000个细胞)与5×104CD34-经放射线照射的辅助细胞一起注射入经放射线照射(2.5Gy)的NOD-LtSz-scid/scid(NOD-SCID)小鼠中。经移植后七周，通过流式细胞计量术分析取自该经移植动物的血液细胞中人类CD45+细胞的存在量。结果，相较于相同数量以BSA-处理的脐带血干细胞，经本发明TAT-HOXB4H蛋白处理的干细胞能够混入NOD-SCID小鼠的骨髓内，而在该小鼠的周边小鼠白血球细胞中相当于含有0.05％至0.07％人类CD45阳性白血球细胞。表示，该经增生的干细胞仍保有多潜能性(pluripotency)。
由以上所示的产量分析及干细胞增生实验结果，证明本发明的TAT-HOXB4H重组蛋白不仅可在大肠杆菌宿主获得高纯化产率，且不影响其对干细胞增生的能力。在重组TAT-HOXB4H蛋白的制造生产方面，实为极具进步性的突破。
序列表
<110>台湾尖端先进生技医药股份有限公司
<120>C-端含有组氨酸标记的HOXB4重组蛋白质的制造方法及用途
<160>4
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ctccatggct atgagttctt ttttg    25
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
atgatgatga tgatgatgat ggagcgcgcg g    31
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cagaattcct aatgatgatg atgatga         27
<210>4
<211>1053
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>(1010)…(1024)
<223>经添加于pTAT-HOXB4H构建体中的C-端组氨酸标记编码序列
<400>4
gtttcctcta gaataatttt gtttacttta agaaggagat atacatatgc ggggttctca     60
tcatcatcat catcatggta tggctagcat gactggtgga cagcaaatgg gtcgggatct    120
gtacgacgat gacgataagg atcgatgggg atccaagctt ggctacggcc gcaagaaacg    180
ccgccagcgc cgccgcggtg gatccaccat gtccggctat ccatatgacg tcccagacta    240
tgctggctcc atggctatga gttctttttt gatcaactca aactatgtcg accccaagtt    300
ccctccatgc gaggaatatt cacagagcga ttacctaccc agcgaccact cgcccgggta    360
ctacgccggc ggccagaggc gagagagcag cttccagccg gaggcgggct tcgggcggcg    420
cgcggcgtgc accgtgcagc gctacgcggc ctgccgggac cctgggcccc cgccgcctcc    480
gccaccaccc ccgccgcccc cgccaccgcc cggtctgtcc cctcgggctc ctgcgccgcc    540
acccgccggg gccctcctcc cggagcccgg ccagcgctgc gaggcggtca gcagcagccc    600
cccgccgcct ccctgcgccc agaaccccct gcaccccagc ccgtcccact ccgcgtgcaa    660
agagcccgtc gtctacccct ggatgcgcaa agttcacgtg agcacggtaa accccaatta    720
cgccggcggg gagcccaagc gctctcggac cgcctacacg cgccagcagg tcttggagct    780
ggagaaggaa tttcactaca accgctacct gacacggcgc cggagggtgg agatcgccca    840
cgcgctctgc ctctccgagc gccagatcaa gatctggttc cagaaccggc gcatgaagtg    900
gaaaaaagac cacaagttgc ccaacaccaa gatccgctcg ggtggtgcgg caggctcagc    960
cggagggccc cctggccggc ccaatggagg cccccgcgcg ctccatcatc atcatcatca   1020
tcattaggaa ttcaaagctt gatccggctg cta                                1053

Claims (8)

1.一种用于制造C-端含有至少6个组氨酸的HOXB4重组蛋白质的方法，其中该所制得的重组蛋白质是命名为TAT-HOXB4H重组蛋白质，该方法包含：构筑于TAT-HOXB4中的HOXB4开放读框的C端含有至少6个组氨酸编码片段的DNA建构体；将所得的DNA建构体转化至宿主细胞中，以使该TAT-HOXB4H重组蛋白在经转化的宿主细胞中被表达；以及自该宿主细胞溶解产物纯化得到该TAT-HOXB4H重组蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用于制造C-端含有至少6个组氨酸的HOXB4重组蛋白质的方法，其特征在于，该DNA构建体通过聚合酶链反应方法将编码额外5个组氨酸标记的DNA片段导入TAT-HOXB4开放读框的C-端，而使最终表现得的TAT-HOXB4H重组蛋白质的C-端含有7个组氨酸。
3.根据权利要求1所述的用于制造C-端含有至少6个组氨酸的HOXB4重组蛋白质的方法，其特征在于，该宿主细胞为大肠杆菌。
4.一种用于增加根据权利要求2所述的TAT-HOXB4H重组蛋白质产量的DNA构建体，其特征在于，TAT-HOXB4开放读框的C-端含有编码额外5个组氨酸标记的D NA片段。
5.根据权利要求4所述的用于增加TAT-HOXB4H重组蛋白质产量的DNA构建体，其特征在于，该DNA构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4的核苷酸序列，且该质体经命名为pTAT-HOXB4H。
6.一种用于干细胞增生的培养基，该培养基包含5nM～100nM根据权利要求1所述的方法所制得的TAT-HOXB4H重组蛋白质，及适用于干细胞增生的细胞营养物质、细胞因子与抗生素。
7.根据权利要求6所述的用于于细胞增生的培养基，其特征在于，该干细胞为脐带血干细胞。
8.根据权利要求6所述的用于干细胞增生的培养基，其特征在于，该干细胞为造血干细胞。
CN2006100031081A 2006-02-10 2006-02-10 C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途 Active CN101016540B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100031081A CN101016540B (zh) 2006-02-10 2006-02-10 C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途
EP06722298A EP1889916A4 (en) 2006-02-10 2006-04-11 PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A RECOMBINANT HOXB4 PROTEIN WHOSE TERMINATION C HAS A HIS LABEL AND USE THEREOF
PCT/CN2006/000646 WO2007090317A1 (fr) 2006-02-10 2006-04-11 Procédé de production d'une protéine hoxb4 recombinée dont la terminaison c présente une étiquette his et son utilisation
JP2008553600A JP4958918B2 (ja) 2006-02-10 2006-04-11 Ｈｏｘｂ４組み換えタンパク質の製造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100031081A CN101016540B (zh) 2006-02-10 2006-02-10 C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101016540A CN101016540A (zh) 2007-08-15
CN101016540B true CN101016540B (zh) 2010-04-07

Family

ID=38344850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006100031081A Active CN101016540B (zh) 2006-02-10 2006-02-10 C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1889916A4 (zh)
JP (1) JP4958918B2 (zh)
CN (1) CN101016540B (zh)
WO (1) WO2007090317A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8222206B2 (en) 2008-03-04 2012-07-17 Taiwan Advance Bio-Pharm Inc. Method of enhancing the mobilization of hematopoietic stem cells using TAT-HOXB4H
SG169254A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-30 Taiwan Advance Bio Pharm Inc Method of producing recombinant tat-hoxb4h protein for use as a stimulant of hematopoiesis in vivo
TWI756518B (zh) * 2019-02-27 2022-03-01 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司 突變型ｈｏｘｂ４重組蛋白質之製造方法與用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1624122A (zh) * 2003-12-05 2005-06-08 霍夫曼—拉罗奇有限公司 重组表达的羧肽酶b及其纯化

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2131018B1 (es) * 1997-09-25 2000-04-01 Antibioticos Sau Un procedimiento enzimatico para preparar acido 7beta-(4-carboxibutanamido)cefalosporanico utilizando la enzima d-aminoacido oxidasa de trigonopsis variabilis modificada producida en escherichia coli.
WO2004029231A1 (en) * 2002-09-26 2004-04-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions and methods for amplification of human stem cells
CN1560229A (zh) * 2004-03-09 2005-01-05 复旦大学 一种制备d-氨基酸氧化酶的方法
WO2006005153A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-19 Bc Cancer Agency Nup98-hox fusions for expansion of hemopoietic stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1624122A (zh) * 2003-12-05 2005-06-08 霍夫曼—拉罗奇有限公司 重组表达的羧肽酶b及其纯化

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尹卫国等.SARS 冠状病毒S1 蛋白的原核表达与鉴定.中国人兽共患病杂志21 3.2005,21(3),218-224页.
尹卫国等.SARS 冠状病毒S1 蛋白的原核表达与鉴定.中国人兽共患病杂志21 3.2005,21(3),218-224页. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1889916A1 (en) 2008-02-20
JP2009525731A (ja) 2009-07-16
WO2007090317A1 (fr) 2007-08-16
JP4958918B2 (ja) 2012-06-20
CN101016540A (zh) 2007-08-15
EP1889916A4 (en) 2008-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2001021767A3 (en) Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof
DK1218489T3 (da) Pluripotente embryonlignende stamceller, præparater, fremgangsmåder og anvendelse deraf
CN110845603A (zh) 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途
JPH06303987A (ja) 細胞への核酸運搬方法
CN101016540B (zh) C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途
CN109182262A (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
JPH04228066A (ja) 外来遺伝子発現用培養細胞
JP2003506077A5 (zh)
Sun et al. Purification and in vitro cultivation of archaeocytes (stem cells) of the marine sponge Hymeniacidon perleve (Demospongiae)
JPH05503631A (ja) 組換えポリペプチド類の精製法
US20220243193A1 (en) Cell lines for high level production of protein
JPS61275229A (ja) ヒト血清アルブミンの微生物学的調製法
JPS6344897A (ja) ペプチド類の生産法
Castagnola et al. Cartilage associated protein (CASP) is a novel developmentally regulated chick embryo protein
CN104263747B (zh) 一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法
TWI328036B (en) Process for producing c-termial histidine tagged hoxb4 and the use thereof in expanding stem cells
CN112941032A (zh) 以修饰的msc培养记忆型t细胞的方法
AU2019450349B2 (en) Cell lines for high level production of protein-based pharmaceuticals
CN111620938B (zh) 突变型hoxb4重组蛋白质及其制备方法与用途
CN102304518A (zh) 人甲状旁腺激素1-34的制备方法
CN107384861B (zh) 一种体外扩增造血干细胞和增强其归巢能力的培养方法
KR20150136961A (ko) Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법
JP2024091682A (ja) タンパク質ベースの医薬品の高レベル生産のための細胞株
KR20230082372A (ko) 무단백질 세포 배양 배지 조성물 및 이의 용도
TW202026307A (zh) Ｎ－端標記組胺酸之重組ｔａｔ－ｈｏｘ家族蛋白質及其製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220111

Address after: Taiwan, Taoyuan City, China Taoyuan District, 1490 Spring Road 6 and 1490, 3, 6 floor

Patentee after: Hexun Life Science Co.,Ltd.

Address before: Taiwan Taipei County Chinese Sijhih city Corelle Street 169 No. 25 Lane 12 building

Patentee before: Taiwan Advance Bio-Pharm Inc.

TR01 Transfer of patent right