TW202026307A - Ｎ－端標記組胺酸之重組ｔａｔ－ｈｏｘ家族蛋白質及其製造方法 - Google Patents

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謝淑如
龔文玫
陳鈺霖
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Abstract

本發明係關於一種N-端包含標記組胺酸與轉錄激活因子(TAT)片段之重組HOX家族蛋白質，特徵在於其N-端含有至少六個組胺酸殘基與TAT片段。根據本發明製得之N-端標記組胺酸之TAT-HOX家族重組蛋白質(His-TAT-HOX家族蛋白質)包括重組His-TAT-HOXA4、His-TAT-HOXC4、His-TAT-HOXD4、His-TAT-HOXB3與His-TAT-HOXB6蛋白質等，其於大腸桿菌宿主細胞表現並經純化後，具有增生造血幹細胞增生的能力。本發明亦包含該等His-TAT-HOX家族重組蛋白質的製造方法及其組成物。

Description

N-端標記組胺酸之重組TAT-HOX家族蛋白質及其製造方法
本發明係關於一種N-端標記組胺酸之重組TAT-HOX家族蛋白質及其製造方法。更特別地，本發明係關於一種藉由遺傳工程方法製得之N-端含有至少6個組胺酸標記之重組TAT-HOX家族蛋白質，包括重組His-TAT-HOXA4、His-TAT-HOXC4、His-TAT-HOXD4、His-TAT-HOXB3及His-TAT-HOXB6蛋白質。
造血幹細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)是可以分化出所有血細胞的幹細胞。造血幹細胞具有"`多潛能性`"(pluripotent)的特質，能分化成多種特定的血球細胞；能"自我更新"(self-renewal)，即細胞在分裂後的子代中，其中至少一個子代細胞保持與未分裂前相同的特性，並且能不斷地分裂；以及能從骨髓移動到周邊循環血液中以及回歸到骨髓中的能力，這是造血幹細胞移植的重要基礎。
加拿大蒙特婁大學(University of Montreal)的蓋‧薩瓦格(Guy Sauvageau)博士及其團隊針對骨髓中幹細胞數目受限的情況進行研究，其團隊是最早利用人類及老鼠的細胞株證明HOX 基因會在血球細胞表現(Sauvageau,G.et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,Vol.91,No.25,pp.12223-12227,Dec 1994)。Sauvageau團隊也證實，有九個HOXA基因、八個HOXB基因及四個HOXC基因會在CD34+骨髓細胞內表現。
人類的HOXB串群中的八個成員會在紅血球細胞發育出表現，有些HOXB基因包括HOXB4及HOXB7也會在T細胞及B細胞表現。另外，實驗結果也檢測出在CD34-的細胞群中，沒有HOX基因或少量HOX基因表現。目前，HOXB4蛋白已最常被用於作為活體外造血幹細胞(HSC)增生之有效刺激劑。過去研究顯示同源異形基因HOXB4對於造血幹細胞自我更新的調控十分重要，可維持其在骨髓中的群集大小。
2011年，加拿大蒙特婁大學的Janet J.Bijl博士及其團隊發表，HOXA4會促進造血幹細胞增生和體內B細胞祖細胞的潛在用途之製藥策略(Fournier,M.et al.,Stem cell and development,Vol.21,No.1,pp.133-142,Jan 2012,publish online 12 Jul 2011)。另外，法國巴黎研究機構Institut Cochin的Serge Fichelson博士和Isabelle Vigon博士及其團隊於2012年發表，HOXC4蛋白質有效增生造血幹細胞並且引發與HOXB4類似的分子改變(Auvray,C.et al.,Haematologica,Vol.97,No.2,pp.168-178,Feb 2012)。HOX基因家族中，除了HOXB群集，與HOXB4在基因表現上最接近的可能為HOXA4、HOXC4與HOXD4，其位於不同染色體上，但都主控頭部 接近頸部區域。分別比對其與HOXB4基因序列，皆有50%左右的一致性。
此外，加拿大英屬哥倫比亞大學(University of British Columbia)的Stefan Karlsson博士及其團隊研究指出HOXB3與HOXB4皆參與調控造血功能；實驗數據顯示，缺乏HOXB3與HOXB4之小鼠造血器官的細胞減少且內源性造血有缺陷，而缺乏HOXB3和HOXB4的造血幹細胞，其細胞週期動力學減慢，導致對抗有絲分裂藥物的耐受性增加。整體而言，HOXB3與HOXB4直接由生理上進行調節幹細胞增生，並且這些基因是最大增生反應所必需(Björnsson,J.M.et al.,Molecular cell biology,Vol.11,pp.3872-3883,Jun 2003)。
美國山姆強森醫學研究中心(Samual C.Johnson Medical Research Center)Claudia Kappen博士針對HOXB6進行研究，為了確認HOXB6在正常造血系統中的角色，以HOXB6基因缺陷的小鼠進行實驗，研究結果指出HOXB6控制紅血球組細胞的生成、增殖或存活(Kappen,C.,American Journal of Hematology,Vol.65,No.2,pp.111-118,Oct 2000)。
PCT/CN2006/000646已公開一種於C-端標記組胺酸之重組TAT-HOXB6蛋白質(TAT-HOXB4H)，其中該TAT-HOXB4H於C-端含有6個或以上組胺酸標記。於是，本發明係針對5個HOX家族成員HOXA4、HOXC4、HOXD4、HOXB3以及HOXB6經由遺傳工程技術於其N-端接上組胺酸標記與TAT片段，進行重組HOX家族 蛋白質之製造與純化，以及維持其對於造血幹細胞增生的能力。
於一方面，本發明係關於一種於其N-端含有至少6個組胺酸與一轉錄激活因子(transactivator of transcription,TAT)片段的重組HOX家族蛋白質，其中該HOX家族蛋白質係至少一選自由HOXA4、HOXC4、HOXD4、HOXB3及HOXB6組成之組群的蛋白質。
於本發明之一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXA4重組蛋白質，具有SEQ ID No.2之胺基酸序列。於本發明之另一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXC4重組蛋白質，具有SEQ ID No.3之胺基酸序列。於本發明之另一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXD4重組蛋白質，具有SEQ ID No.4之胺基酸序列。於本發明之另一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB3重組蛋白質，具有SEQ ID No.5之胺基酸序列。於本發明之另一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB6重組蛋白質，具有SEQ ID No.6之胺基酸序列。
本發明之另一方面，係關於一種製備N-端含有6個組胺酸標記與TAT片段之重組HOX家族蛋白質的方法，包含：利用基因工程技術進行選殖製得一於該HOX家族基因序列之開放讀框之3’-端含有編碼至少6個組胺酸與TAT片段之DNA構體；將所得之DNA構體轉型至宿主細胞；在重組之宿主細胞內表現該重組蛋白質；以及自宿主細胞裂解產物純化得該重組蛋白質。
於本發明之一些實施例，所述之純化步驟包含將細胞裂解產物經過管柱純化，及緩衝液透析方式使蛋白質再摺疊之步驟而得到重組蛋白質。於本發明之一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXC4或His-TAT-HOXD4重組蛋白質，係通過HisTrap親和性管柱(GE Healthcare)與HiTrap SP陽離子交換層析管柱(GE Healthcare)進行純化。於本發明之一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXA4，係依序通過HiTrap TALON親和性管柱(GE Healthcare)、HiTrap SP陽離子交換層析管柱、HiTrap Octyl辛基疏水性層析管柱(GE Healthcare)及最後以分子篩層析管柱(GE Healthcare)純化。於本發明之一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB3，係通過親和性管柱HisTrap與HiTrap Heparin管柱(GE Healthcare)純化。於本發明之一實施例，所述之重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB6，係通過HisTrap親和性管柱與HiTrap SP陽離子交換層析管柱進行純化。
本發明之又一方面，係關於一種用於活體外幹細胞增生之培養基，其特徵在於包含本發明之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，及適用於幹細胞增生之細胞營養物質、細胞因子與抗生素。於本發明之一實施例，所述之幹細胞為臍帶血幹細胞。於本發明之一實施例，所述之幹細胞為造血幹細胞。
圖1為質體pTAT-HOXB4之質體圖譜。
圖2係顯示His-TAT-HOX家族重組蛋白質，於大腸桿菌表現系統經由IPTG誘導大量表現並純化後，以SDS-PAGE電泳分析之結果，箭頭所指為目標蛋白質於電泳膠體上的位置。
圖3係顯示以重組His-TAT-HOX家族蛋白質體外增生造血幹細胞之比較結果，以其CD34+細胞數量之測量值表示。對照組係以BSA處理。
除非另有定義，本說明書所使用的所有技術以及科學術語與屬於本發明所屬領域之習知技藝者通常理解之含義相同。
於本發明所稱之“HOX家族蛋白質”係指一群稱為“DNA binding homeobox(HOX)”的轉錄因子，已被發現在胚胎發育扮演重要角色，並且在近年來發現HOX轉錄因子家族在造血幹細胞發育上也扮演了重要角色。人類的同源異形基因(homeobox gene；hox gene)家族共分成A、B、C、D四個基因群集，分別位於7、17、12及2號染色體上，這些基因可分成13個平行同源家族，以數字表示，例如HOXA1、HOXA2、…、HOXA13等。其中1-4主控頭部，5-6、7-8以及9-13則分別會影響頸部、軀幹以及四肢的發育。
本發明之其他特徵與優點將於以下實施例中做進一步舉例說明。本文所述之實施例為用於說明，並非用以限制本發明之範圍。
實施例一、HOX家族重組蛋白質表現質體之構築
本案發明人先前已藉由基因工程技術構築一段於N-端含有六個組胺酸殘基，且同時含有可自由穿越細胞膜之HIV-1轉錄激活因子(transactivator of transcription,TAT)片段之質體pTAT-HOXB4(SEQ ID No.1，圖譜參見圖1所示)。以此質體為模板，利用限制酵素NdeI與XhoI進行切割，取得含有兩端切位NdeI與XhoI之pTAT質體模板XhoI-質體-6xHis-TAT-NdeI。
同時以基因工程技術在編碼HOXA4、HOXC4、HOXD4、HOXB3及HOXB6等HOX家族蛋白之基因序列前後分別設計NdeI與XhoI限制酵素切位，接著與前述之質體模板XhoI-質體-6xHis-TAT-NdeI進行黏合，並經大腸桿菌轉型選殖後，再經由基因定序確認，得到可用來分別產製重組蛋白質His-TAT-HOXA4(SEQ ID No.2)、His-TAT-HOXC4(SEQ ID No.3)及His-TAT-HOXD4(SEQ ID No.4)、His-TAT-HOXB3(SEQ ID No.5)與His-TAT-HOXB6(SEQ ID No.6)之DNA表現構體pTAT-HOXA4、pTAT-HOXC4、pTAT-HOXD4、pTAT-HOXB3與pTAT-HOXB6。
實施例二、HOX家族重組蛋白質之純化
His-TAT-HOXC4與His-TAT-HOXD4重組蛋白之表現及純化
將pTAT-HOXC4與pTAT-HOXD4分別轉型至大腸桿菌菌株BL21-codonplus®(DE3)-RP(Agilent)。經轉型後之大腸桿菌細胞於37℃以150rpm旋轉震盪培養16小時。將此培養液以1：50比例稀釋至新鮮培養液，起始於波長600nm下之吸光值OD600約為0.05，並於 37℃以200rpm旋轉震盪生長，直至OD600值為0.7-0.8，接著利用異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)進行蛋白質誘導，加入最終濃度為1mM之異丙基硫代-β-D-半乳糖，於37℃以轉速200rpm旋轉震盪3小時。
於誘導作用後，將細胞離心收集，並以緩衝液A(8M尿素，20mM HEPES,100mM NaCl,pH 8.0)回溶菌體。將此細胞懸浮液以高壓差均質機French Press擠壓三次，並將細胞裂解產物以18,000rpm轉速，於4℃離心30分鐘使其澄清，並收取上清液。
將上清液調整至10mM咪唑(imidazole)，並將樣品加至HisTrap親和性管柱，將結合之蛋白以含有50、100、150、300、500及1000mM咪唑之緩衝液A進行溶析。收集含有目標蛋白His-TAT-HOXC4或His-TAT-HOXD4之溶析樣品，加至HiTrap SP陽離子交換層析管柱，並以不含咪唑與尿素之緩衝液B(20mM HEPES,1M NaCl,pH 8.0)利用梯度進行溶析。收集含有目標蛋白His-TAT-HOXC4或His-TAT-HOXD4之溶析樣品，並以含有DMEM或IMDM培養基之緩衝液(pH 7.5)，利用透析方式進行蛋白質再摺疊。將再摺疊的蛋白樣品分裝，並以液態氮急速冷凍後，保存於-80℃。
His-TAT-HOXA4、His-TAT-HOXB3與His-TAT-HOXB6重組蛋白之表現及純化
將pTAT-HOXA4、pTAT-HOXB3與pTAT-HOXB6以與上述表現His-TAT-HOXC4及His-TAT-HOXD4重組蛋白相同方式，進 行表現質體轉型及誘導蛋白表現。將細胞離心收集、並以高壓差均質機French Press擠壓三次打破菌體，並將細胞裂解產物以18,000rpm轉速，於4℃離心30分鐘使其澄清，並收取上清液。之後，依下列方法分別純化得His-TAT-HOXA4、His-TAT-HOXB3與His-TAT-HOXB6重組蛋白質。
His-TAT-HOXA4重組蛋白係依序經HiTrap TALON親和性管柱(以含有40、100及200mM咪唑之緩衝液A進行溶析)、HiTrap SP陽離子交換層析管柱(不含咪唑與尿素之緩衝液B利用梯度進行溶析)、HiTrap Octyl辛基疏水性層析管柱(以HEPES緩衝液進行溶析)、以及最後的HiLoad Superdex 200分子篩層析管柱(以含有尿素之HEPES緩衝液進行溶析)純化，收集含有目標蛋白His-TAT-HOXA4之溶析樣品。
His-TAT-HOXB3重組蛋白係經親和性管柱HisTrap親和性管柱(以含有100、300、500及1000mM咪唑之緩衝液A進行溶析)與HiTrap Heparin層析管柱(以不含咪唑與尿素之緩衝液B利用梯度進行溶析)純化，收集含有目標蛋白His-TAT-HOXB3之溶析樣品。
His-TAT-HOXB6重組蛋白係經HisTrap親和性管柱(以含有100、300、500及1000mM咪唑之緩衝液A進行溶析)純化，收集含有目標蛋白His-TAT-HOXB6之溶析樣品。
以上分別收集含有各別目標蛋白之溶析樣品後，以緩衝液(含有DMEM或IMDM培養基之緩衝液，pH 7.5)置換方式進行 蛋白質再摺疊。將再摺疊的蛋白樣品分裝，並以液態氮急速冷凍後，保存於-80℃。
由圖2之電泳分析結果顯示，根據本發明之方法，皆可利用所構築、選殖的表現質體，於大腸桿菌表現系統經由IPTG誘導大量表現，並以上述流程進行純化，而獲得各種His-TAT-HOX家族重組蛋白質。
實施例三、His-TAT-HOX家族重組蛋白質的活體外造血幹細胞增生能力評估
將人類臍帶血中之紅血球藉由於4℃下於含有0.1%碳酸氫鈉之0.83%氯化銨(pH 7.0)中進行溶解而去除。將經收集之白血球部分與磁珠結合之特定抗體與細胞共同培養後，藉由Stemsep管柱分離方式進行磁性細胞分離程序以收集帶CD34+細胞，並除去表現成熟人類白血球細胞之部分。取特定密度之細胞於六孔盤培養，並於早晚加入特定濃度之BSA或所製備得之各種His-TAT-HOX家族重組蛋白質，連續進行4天，於第5天以ISHAGE方法(LIN/CD34染色加正向與側向散射光)計數幹細胞數量並進行分析。
由圖3之結果證明，根據本發明所製得之重組蛋白質可增生造血幹細胞，與對照組BSA相比，CD34+細胞數在第5天呈現1.3至1.7倍的成長，表示本發明製得之N-端標記組胺酸之重組TAT-HOX家族蛋白質確實具有促進造血幹細胞增生的能力。其中，以His-TAT-HOXC4與His-TAT-HOXD4之促進造血幹細胞增生能力為最佳，分別為1.7與1.62倍。而針對CD34+細胞的純度(purity)分 析結果顯示，則以His-TAT-HOXC4培養獲得的CD34+細胞比例最高，其次以His-TAT-HOXA4與His-TAT-HOXD4培養獲得的CD34+細胞比例則略低於His-TAT-HOXB4組。
由上述實驗結果證明，本發明已成功藉由遺傳工程技術，於HOX家族蛋白之N-端接上組胺酸標記與TAT胜肽片段，並可經由大腸桿菌系統大量表現，而獲得重組His-TAT-HOX家族蛋白質，且純化得到的重組蛋白質具有促進造血幹細胞增生的能力。
<110> 台灣尖端先進生技醫藥股份有限公司
<120> N-端標記組胺酸之重組TAT-HOX家族蛋白質及其製造方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pTAT-HOXB4
<400> 1
Figure 108101164-A0101-12-0012-1
Figure 108101164-A0101-12-0013-2
Figure 108101164-A0101-12-0014-3
<210> 2
<211> 344
<212> PRO
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TAT-HOXA4
<400> 2
Figure 108101164-A0101-12-0015-4
Figure 108101164-A0101-12-0016-5
<210> 3
<211> 288
<212> PRO
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TAT-HOXC4
<400> 3
Figure 108101164-A0101-12-0016-7
Figure 108101164-A0101-12-0017-8
<210> 4
<211> 279
<212> PRO
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TAT-HOXD4
<400> 4
Figure 108101164-A0101-12-0017-9
Figure 108101164-A0101-12-0018-10
<210> 5
<211> 455
<212> PRO
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TAT-HOXB3
<400> 5
Figure 108101164-A0101-12-0018-11
Figure 108101164-A0101-12-0019-12
<210> 6
<211> 248
<212> PRO
<213> 人工序列
<220>
<223> His-TAT-HOXB6
<400> 6
Figure 108101164-A0101-12-0020-13

Claims (18)

  1. 一種重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其特徵在於該HOX家族蛋白質的N-端包含至少6個組胺酸與一轉錄激活因子(transactivator of transcription,TAT)片段。
  2. 如請求項1所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該HOX家族蛋白質係至少一選自由HOXA4、HOXC4、HOXD4、HOXB3及HOXB6組成之組群的蛋白質。
  3. 如請求項1或2所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXA4重組蛋白質，包含SEQ ID No.2之胺基酸序列。
  4. 如請求項1或2所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXC4重組蛋白質，包含SEQ ID No.3之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或2所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXD4重組蛋白質，包含SEQ ID No.4之胺基酸序列。
  6. 如請求項1或2所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB3重組蛋白質，包含SEQ ID No.5之胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB6重組蛋白質，包含SEQ ID No.6之胺基酸序列。
  8. 一種製備如請求項1所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質的方法，其特徵在於包含：構築HOX家族基因序列於一開放讀框之N端含有6個組胺酸編碼片段之DNA質體，利用基因工程技術進行選殖；將選殖後所得之構體轉型至宿主細胞；在該經轉型之宿主細胞內表現該重組蛋白質；及 自宿主細胞裂解產物經過管柱純化與蛋白質再摺疊步驟，得到該重組蛋白質。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXC4或His-TAT-HOXD4，且該管柱純化步驟包含將細胞裂解產物通過HisTrap親和性管柱(GE Healthcare)與HiTrap SP陽離子交換層析管柱純化。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXA4重組蛋白質，且該管柱純化步驟包含將細胞裂解產物通過HiTrap TALON親和性管柱、HiTrap SP陽離子交換層析管柱、HiTrap Octyl辛基疏水性層析管柱及HiLoad superdex 200分子篩層析管柱純化。
  11. 如請求項8所述之方法，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB3重組蛋白質，且該管柱純化步驟包含將細胞裂解產物通過親和性管柱HisTrap與HiTrap Heparin管柱純化。
  12. 如請求項8所述之方法，其中該重組HOX家族蛋白質為His-TAT-HOXB6重組蛋白質，且該管柱純化步驟包含將細胞裂解產物通過HisTrap親和性管柱純化。
  13. 一種用於活體外幹細胞增生之培養基，其特徵在於包含如請求項1所述之重組His-TAT-HOX家族蛋白質，及適用於幹細胞增生之細胞營養物質、細胞因子與抗生素。
  14. 如請求項13所述之培養基，其中該幹細胞為臍帶血幹細胞。
  15. 如請求項13所述之培養基，其中該幹細胞為週邊血幹細胞。
  16. 如請求項13所述之培養基，其中該幹細胞為骨髓幹細胞。
  17. 如請求項13所述之培養基，其中該幹細胞為造血幹細胞。
  18. 如請求項13所述之培養基，其中該HOX家族蛋白質係至少一選自由HOXA4、HOXC4、HOXD4、HOXB3及HOXB6組成之組群的蛋白質。
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