JPH06303987A - 細胞への核酸運搬方法 - Google Patents

細胞への核酸運搬方法

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JPH06303987A
JPH06303987A JP4318741A JP31874192A JPH06303987A JP H06303987 A JPH06303987 A JP H06303987A JP 4318741 A JP4318741 A JP 4318741A JP 31874192 A JP31874192 A JP 31874192A JP H06303987 A JPH06303987 A JP H06303987A
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nucleic acid
protein
component
complex
cell
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Anne Dr Stern
スターン アンネ
Irene Hagemann
ハーゲマン イレーネ
Doris Ziegler-Landesberger
ツィーグラー−ランデスベルガー ドリス
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 標的細胞に特異的な“細胞ホーミング因子”
成分および少なくとも１つのポリカチオン成分を含むタ
ンパク質と核酸との非共有結合複合体を形成させること
により核酸を標的細胞へ運搬するための複合体の製造方
法に関する。 【構成】 “細胞ホーミング因子”成分と少なくとも１
つのポリカチオン成分との線状遺伝子融合体を含むタン
パク質を、適当な条件下で、標的細胞へ運搬しようとす
る核酸と接触させ、これにより本質的に核酸とタンパク
質のポリカチオン部分とのイオン相互作用に基づいた複
合体を形成させることからなり、該タンパク質のポリカ
チオン成分がリシンおよびアルギニンから選ばれた少な
くとも３個のアミノ酸を含み、かつ生理学的条件下で核
酸と安定した結合を形成し得るペプチド配列。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標的細胞に対して特異
的な成分とポリカチオン成分とを含むタンパク質と核酸
との非共有結合複合体の形成によって、核酸を標的細胞
に運搬する複合体の製造方法に関する。これに加えて本
発明は、該複合体を標的細胞に運搬する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞内に、特に真核細胞内に核酸
を導入することを目的とする方法が多数開発されてい
る。かかる方法の例としては、例えばリン酸カルシウム
トランスフェクション、ポリブレントランスフェクショ
ン、プロトプラスト融合、電気泳動、リポフェクショ
ン、マイクロインジェクションが挙げられる( 例えば、
Sambrook et al.,(1989)Molecuar Cloning,A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor を参照されたい) 。上記
の方法はインビトロにおいて広く用いられている。しか
しながら、インビボでのそれらの核酸運搬可能性は、例
えば細胞の特異性の欠如、不溶性沈澱の形成、低い効
率、及び実行可能性等の数多くの理由によって非常に限
定されたものとなる。
【０００３】かくして、最近の研究は核酸分子を標的細
胞との干渉なしに細胞内へ効率的かつ特異的に運搬する
概念に基づいた、所謂" 核酸運搬システム" の開発に向
けられている。これらの努力の背景となっているのは、
核酸治療薬、すなわち特定の組織の細胞中に新たな遺伝
情報を伝達したり、アンチセンス分子やリボザイムを伝
達することにより特定の組織における特別の遺伝子の発
現を抑制したりすることに利用することが可能な治療薬
の研究である。
【０００４】この目的で核酸の膜を貫通する能力を向上
させるための数々の試みがなされた。例えば、核酸をポ
リリシンのようなポリカチオンに共有結合させることに
より(Lemaitre et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84(198
7),648) 、又はポリエチレングリコールのような両親媒
性分子に共有結合させることにより(WO 88/09810) 達成
された。なるほど、このようにして核酸の細胞内への取
り込みの効率を向上させることは可能である。しかしな
がら、細胞の特異性に関する問題が依然として残ってい
る。
【０００５】細胞に対して特異的な核酸の運搬システム
を作り出すために、細胞内に運搬しようとする核酸を、
細胞のマーカーを特異的に認識したり、又は表皮成長因
子(EGF)(EP-A 0 273 085) のような特異的細胞レセプタ
ー対し親和性を有する所謂"細胞ホーミング因子" に直
接結合させることが提案された。しかしながらこの方法
には、核酸が遊離の状態で細胞内に取り込まれるのでは
なく、共有結合した複合体の状態で取り込まれるという
欠点が存する。
【０００６】標的細胞に核酸を運搬する別の方法とし
て、タンパク質とポリカチオンの結合体に核酸を非共有
結合的につなぐ方法がある。Wu及びWuによる刊行物(J.B
iol.Chem.(1987),4429-4432;J.Biol.Chem.263(1988),14
621-14624)には、化学的に合成した糖蛋白との共有結合
体により構成される可溶性DNA キャリアーシステムの助
けをかりて、外来DNA が細胞内へ運搬されることについ
て開示されている。EP-A0 388 758 には、トランスフェ
リンレセプターに結合することによって標的細胞内に運
搬され得るポリアニオン性核酸と複合体を形成する、化
学的に合成したトランスフェリンとポリカチオンとの結
合体について開示されている。
【０００７】しかしながら上述したシステムには、結合
体を化学合成するに際して通常は非常に不均一な生成物
が形成される、すなわち結合体は非常に異なる割合の個
々の成分を含むという欠点がある。そのうえ、合成した
結合体の一部分において、結合タンパク質成分の一部の
機能( すなわち、標的細胞に侵入する能力) が損なわれ
てしまうという危険性を有している。これが上述した欠
点のなかでも、特に治療剤の開発に際して不都合な点で
ある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、前述の欠点のうち少なくとも一部が除去された細胞
特異的な核酸の運搬システムを提供する方法の開発にあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
標的細胞に特異的な" 細胞ホーミング因子" 成分及び少
なくとも1 つのポリカチオン成分を含むタンパク質と核
酸との非共有結合複合体を形成させることにより核酸を
標的細胞へ運搬するための複合体の製造方法により達成
され、該方法は" 細胞ホーミング因子" 成分と少なくと
も1 つのポリカチオン成分との線状遺伝子融合体を含む
タンパク質を、適当な条件下で、標的細胞へ運搬しよう
とする核酸に接触させ、これにより本質的に核酸とタン
パク質のポリカチオン部分とのイオン相互作用に基づい
た複合体を形成させることからなり、該タンパク質のポ
リカチオン成分がリシン及びアルギニンから選ばれた少
なくとも3 個のアミノ酸を含み、かつ生理学的条件下で
核酸と安定した結合を形成し得るペプチド配列であるこ
とを特徴としている。
【００１０】タンパク質との複合体を形成する核酸は線
状であってもよいし環状であってもよい。また一本鎖で
あっても二本鎖であってもよい。さらにDNA であっても
RNAであってもDNA とRNA とのハイブリッドであっても
よい。また、これに加えてかかる核酸に対しては、タン
パク質のポリカチオン成分へのイオン結合を媒介するホ
スフェートバックボーンの陰電荷が保存される限り、化
学的修飾を施すことも可能である。好適な修飾を行った
核酸の例としては、例えばチオエートやジチオエートを
挙げることができる。この点に関して、別の好適な核酸
誘導体については、" Uhlmann ＆Peymann,Chemical Rev
iews,90(4),544-584(1990)" において言及されている。
【００１１】さらに、ヌクレオチド塩基に化学的修飾を
行った核酸をも用いることが可能である。例えば、RNA
分子における1 個乃至数個のヌクレオチドの2'OH基がO-
アルキル基、ハロゲン、その他の修飾基で置換されたも
のも用いることができる。標的細胞に運搬すべき核酸
は、所望により修飾されるDNA 若しくはRNA であること
が好ましい。例えば、標的細胞に運搬される核酸には、
該標的細胞で発現する遺伝情報を含ませることができ
る。この方法によって、例えば遺伝子- 依存性欠陥を除
去することが可能である。他方では、該標的細胞内で特
定の遺伝子の発現を抑制するために、標的細胞に運搬さ
れる核酸はアンチセンスとしての性質(すなわち、核酸
が標的細胞に現れるm-RNA に対して相補的な核酸であ
る) を有することが可能である。最後に運搬の対象とな
る核酸はリボザイムとしての性質をもつこともでき、す
なわち標的細胞内の特定のRNA 分子を開裂する能力を有
することもできる。かかるリボザイムの例としては、例
えば" Rossi ＆Sarver,Tibtech,8,179-183(1990)" に記
載されたハンマーヘッドリボザイムが挙げられる。特定
の標的細胞に、アンチセンス若しくはリボザイム核酸を
導入すれば、特にAIDSのようなウイルス病の治療に重要
な役割を演じさせることができる。
【００１２】本発明方法で用いるタンパク質は、" 細胞
ホーミング因子" と1 個又は数個のポリカチオン成分と
の直線状遺伝子融合体である。本発明において" タンパ
ク質" とは、そのタンパク質成分の他に、糖鎖、脂質、
及び/ 又はリン酸残基を含むことができる。" 細胞ホー
ミング因子" 成分が有する目的は、好ましくはレセプタ
ーを介しての細胞飲食運動によって、標的細胞の内部に
核酸を輸送することである。" 細胞ホーミング因子" の
本発明における意味は、細胞のマーカーを認識する性質
を有する、若しくは細胞のレセプターに特異的な親和性
を有するタンパク因子のことをいう。該因子は、マーカ
ーやレセプターとの相互作用を及ぼし合った後に内在化
するものが好適である。細胞ホーミング因子成分は好ま
しくは、成長因子、ホルモン、ウイルス抗原、毒素、リ
ポタンパク質、及びインテグリンからなる群より選ばれ
る。かかる細胞ホーミング因子成分として、成長因子が
特に好ましく用いられる。とりわけG-CSF(顆粒球コロニ
ー刺激因子) 又はNGF(神経成長因子) は好ましい。
【００１３】本発明方法に適した細胞ホーミング因子成
分の別の例は、それぞれの増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−
ＲまたはＥＧＦ−Ｒ）と相互作用するＰＤＧＦ（血小板
由来増殖因子）およびＥＧＦ（上皮増殖因子）のような
他の増殖因子である。他の例はウイルス抗原とそれらの
対応受容体との相互作用（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２４
とＴヘルパー細胞上のＣＤ４表面マーカーとの相互作
用）、毒素とそれらの受容体との相互作用（リシンのβ
部分、ジフテリア毒素）、ＬＤＬとＬＤＬ受容体との相
互作用、ホルモンとそれらの受容体との相互作用（例え
ば、インシュリンとインシュリン受容体）、並びにイン
テグリンとそれらの受容体との相互作用（例えば、ビト
ロネクチンと血小板因子 gp IIB/IIIA）である。
【００１４】本発明方法のためのタンパク質のポリカチ
オン成分は、リシンおよびアルギニンから選ばれる少な
くとも３個のアミノ酸を含み、かつ生理学的条件下で核
酸と安定した結合を形成するペプチド配列である。正に
荷電したアミノ酸のリシンとアルギニンのほかに、ポリ
カチオン成分は、その全体的な性質が十分にカチオン性
を保持して生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成
するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。
これは核酸を添加する簡単な実験で検査できる。特に、
本発明方法にとっては、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ中
ｐＨ７−８、室温で２５ｎｇ／μｌの核酸濃度および
０．０１−１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でインキュベ
ーション後に、アガロースゲル電気泳動において核酸バ
ンドの遅延を起こすのに十分なほど安定しているタンパ
ク質−核酸複合体を形成するタンパク質が適している。
この核酸バンドの遅延は、融合体と核酸との複合体がア
ガロースゲル電気泳動の間保持されることを示すもので
ある。
【００１５】タンパク質のポリカチオン成分は少なくと
も３個のリシンまたはアルギニンを含まねばならない
が、上限を定めることはできない。かくして、文献 E.
Wagner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3410-3
414) から、ポリカチオン成分は最高４５０個のアミノ
酸を含むことができ、それでもなお機能することが知ら
れている。しかしながら、ポリカチオン成分の長さは５
−１００個のアミノ酸であることが好ましい。ポリカチ
オン成分の鎖中のカチオン性アミノ酸の割合は、好まし
くは４０モル％以上であるべきであり、特に６０モル％
以上であることが有利である。しかし、これより低い割
合のＡｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を含むポリカチオ
ン成分も核酸と安定した結合を形成し得る。
【００１６】タンパク質のポリカチオン成分は少なくと
も４個の、最高２０個までのＡｒｇおよび／またはＬｙ
ｓ残基を含むことが特に好適である。さらに、ポリカチ
オン成分は一連の少なくとも３個の連続したＡｒｇおよ
び／またはＬｙｓ残基を有し、特に少なくとも４個の連
続したＡｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を有することが
好ましい。
【００１７】本発明方法で使用するタンパク質は、細胞
ホーミング因子成分とポリカチオン成分の線状遺伝子融
合体に相当する構成成分を含む。この融合体において
は、タンパク質のポリカチオン成分が細胞ホーミング因
子成分のＮ末端および／またはＣ末端に結合されること
が好適である。しかしながら、細胞ホーミング因子成分
の末端ではなく、その内部にポリカチオン成分を導入す
ることも可能である。本発明方法のこの実施態様は、と
りわけ、四次構造中に外側へ突き出るドメインの存在す
ることが知られ、一方でポリカチオン鎖が挿入される場
合にその機能を保持するが、他方で核酸と結合する能力
を獲得するタンパク質のために使用される。さらに、タ
ンパク質は複数のポリカチオン成分を、例えば細胞ホー
ミング因子成分のＮ末端とＣ末端に、含むことももちろ
ん可能である。
【００１８】本発明方法で使用するタンパク質は組み換
えＤＮＡ技術により簡単な方法で得ることができる。か
くして、ポリカチオン鎖をコードするＤＮＡ断片は、
“細胞ホーミング因子”をコードする遺伝子の一端、両
端および／または内部に、適当なＤＮＡアダプターとの
連結反応により、または in vitro 突然変異誘発により
結合される。かかる遺伝子操作法は分子生物学の分野で
当業者によく知られており、ここで詳細に説明するには
及ばない。実施例では、ポリカチオン鎖をコードする遺
伝情報が、化学合成されたＤＮＡアダプター分子の連結
により、細胞ホーミング因子の遺伝子に結合される。し
かし、当業者には、他の方法も同じ融合遺伝子へ導き得
ることが明らかであるだろう。
【００１９】本発明はさらに、上記タンパク質と核酸の
複合体を、該複合体または該核酸の内在化へ導く適当な
条件下で、標的細胞と接触させることを特徴とする、標
的細胞への核酸の運搬方法に関する。好ましくは、真核
細胞が標的細胞として使用される。標的細胞による核酸
の取込みは、標的細胞への運搬のために放射性標識核酸
を使うことにより、簡単な方法で試験することができ
る。複合体または核酸の内在化へ導く適当な条件は、標
的細胞が生存可能で、細胞ホーミング因子を内在化し得
る条件であると理解すべきである。
【００２０】最後に、本発明はまた、生理学的条件下で
安定しているタンパク質−核酸複合体を製造するため
の、細胞−特異的細胞ホーミング因子成分と少なくとも
１つのポリカチオン成分の線状遺伝子融合体を構成する
タンパク質であって、該ポリカチオン成分がアルギニン
およびリシンより成る群から選ばれる少なくとも３個の
アミノ酸を含むペプチド配列である該タンパク質の使用
に関する。
【００２１】
【実施例】以下の実施例および配列番号１−９により、
本発明をさらに詳しく説明することにする。本出願にお
いて開示したプラスミドおよび微生物は“Deutsche Sam
mlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DS
M) ”(Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig) に
寄託され、次の受託番号を有する： pKK177-3-G-CSF-Bg DSM 5867 PACYC 177 DSM 3693 p E. coli C 600 DSM 5447 E. coli C 600 + DSM 5443 E. coli C 600 + 中の pUBS 520 DSM 6786 E. coli C 600 + 中の pNGF1/pUBS 520 DSM 6785
【００２２】実施例１ ＤＮＡ結合の試験系 タンパク質がＤＮＡ結合特性を有するかどうかを調べる
ための試験は次の通りである：最初に、試験すべきタン
パク質溶液の希釈系列を調製する。希釈緩衝液として２
５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌを使用する。タンパク質濃度
が１ｍｇ／ｍｌから０．０１ｍｇ／ｍｌの範囲のタンパ
ク質溶液を調製する。試験ＤＮＡとして HindIIIで再切
断したラムダＤＮＡを使用する。制限切断後、ＤＮＡ溶
液を２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌで５０ｎｇ／μｌの濃
度へ希釈する。試験を行うために、それぞれの場合に６
μｌのＤＮＡ溶液を６μｌのタンパク質溶液と慎重に混
合し、２５℃で３０分間インキュベートする。
【００２３】異なる濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍ
ｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌ）のポリリシン（陽性対
照）およびポリグルタメート（陰性対照）を混合し、上
記のようにラムダＤＮＡとインキュベートする。ＤＮＡ
結合の分析はアガロースゲル電気泳動で複合体を分離す
ることにより行う。安定したタンパク質−ＤＮＡ複合体
が存在する場合は、再切断ＤＮＡのバンドの泳動挙動が
変化する。ＤＮＡとタンパク質の複合体は、複合体を形
成していないＤＮＡと比較して、遅い移動度特性を示
す。
【００２４】実施例２ “細胞ホーミング因子”成分としてＧ−ＣＳＦを有する
タンパク質の製造 1. ベクターの構築 1.1 Ｎ末端融合体 ベクターpKK177-3-G-CSF-Bg (DSM 5867)中のＧ−ＣＳＦ
遺伝子を合成ＤＮＡアダプターで修飾し、Ｎ末端に次の
追加のアミノ酸を含むＧ−ＣＳＦ誘導体を形成させる：
【００２５】
【化１】
【００２６】(1.) = 配列番号：１ (2.) = 配列番号：２ (3.) = 配列番号：３ 融合体を構築するために、ベクターpKK177-3-G-CSF-Bg
(DSM 5867)を EcoRIとApaIで部分消化し、オリゴヌクレ
オチド
【００２７】
【化２】
【００２８】を約3450bpの長さの線状化ベクター断片に
挿入する。
【００２９】
【化３】
【００３０】ギャップに挿入される各ＤＮＡ配列は上記
のアミノ酸の遺伝暗号を表し、つまり、例えばアミノ酸
配列 LysAlaLysArgPheLysLysHisProArgProPro ( ＝配列
番号：１、Met を含まず）の遺伝暗号を有するオリゴヌ
クレオチドは構築物Ｇ−ＣＳＦ（６＋）のために使用さ
れた。切断ベクターへのオリゴヌクレオチドの連結によ
り得られたプラスミドは E. coli HB101に形質転換され
る。さらに、Ｇ−ＣＳＦ（４＋）変異体は、ＯｍｐＴプ
ロテアーゼ（Ｌｙｓ｜Ａｒｇ切断）を発現するE. coli
細胞（例えば、E. coli C600 (DSM 5447) ）にＧ−ＣＳ
Ｆ（６＋）の発現用構築物を形質転換することにより得
ることができる。ｔａｃプロモーターの調節能を確実に
向上させるために、細胞はｌａｃＩq 遺伝子を含む pBP
010 （作製についてはEP-A 0 464 832参照）と適合性の
プラスミドでさらに形質転換された。ｌａｃＩq 遺伝子
は以前から当分野で知られており、容易に入手すること
ができる。pBP010と適合する適当なプラスミドは、例え
ばｌａｃＩq 遺伝子が挿入されているpACYC 177 (DSM 3
693P) またはそれから誘導されるプラスミド (例えば、
Gene 85 (1989), 109-114 および EP-A 0 373 365 参
照) である。両方のプラスミドで形質転換された陽性ク
ローンをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）／アンピシリ
ン（５０μｇ／ｍｌ）上で選択し、制限分析によって同
定する。EcoRIと EcoRVによる切断は長さが約3.15kbお
よび約0.3 kbの断片 (それぞれの構築物を含む) をもた
らす。
【００３１】1.2 Ｃ末端融合体 発現プラスミドpKK177-3 CG10 を使ってＣ末端融合体を
クローニングした。このプラスミドは突然変異誘発によ
りプラスミドpKK177-3-G-CSF-Bg (DSM 5867)から構築す
ることができる。このために、成熟Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の
最初の３つのアミノ酸のコドンを、各コドンがもとのヌ
クレオチドの代わりに第３ヌクレオチド位置にＡを含む
ように、プラスミドpKK177-3 Bg における部位特異的突
然変異誘発により変更した。突然変異誘発法は Moringa
et al., Biotechnology 21 (1984) 634に記載される方
法に従って実施した。突然変異誘発のために次のオリゴ
ヌクレオチドを使用した：
【００３２】
【化４】
【００３３】ポジティブに突然変異誘発されたクローン
は配列解析により確認した。化学合成した二本鎖ＤＮＡ
アダプターを発現プラスミドpKK177-3 CG10 中に存在す
るＧ−ＣＳＦ遺伝子に結合させた。このＤＮＡアダプタ
ーは以下に示してあり、Ｇ−ＣＳＦのＣ末端と８個のア
ルギニン残基と１個のプロリン残基をコードする：
【００３４】
【化５】
【００３５】（配列番号：７は、５’−３’鎖が塩基１
−９５からなり、その相補鎖が５−９９に相補的な塩基
からなる化学合成した二本鎖ＤＮＡアダプターの配列を
示す）。このために、プラスミドpKK177-3 CG10 を２種
の制限エンドヌクレアーゼNheIとHindIII で切断した。
制限混合物をゲル電気泳動で分離し、形成された２つの
断片の大きい方を単離した。Ｇ−ＣＳＦを含むベクター
は上記ＤＮＡアダプターと連結させた。そのために、１
μｇのベクター断片と１μｇのアダプターを２０μｌの
連結緩衝液（１０ｘ緩衝液は０．５ｍｏｌ／ｌトリスＨ
Ｃｌ、ｐＨ７．６、１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウ
ム、１００ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトールおよび５０
０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンに相当する）中に加え
た。連結反応は１ＵのＴ４リガーゼを添加した後１６℃
で一夜行った。この連結調製物で E. coli (C600+, pUB
S520) を形質転換した。クローンが正しいことは配列解
析により確かめた。このクローンにより発現されたＧ−
ＣＳＦ誘導体はＧ−ＣＳＦ（８＋）と命名された。
【００３６】2. Ｇ−ＣＳＦ誘導体の精製 2.1 発酵 1.1 または1.2 により同定された陽性クローンは、カナ
マイシンとアンピシリン（それぞれの濃度５０μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢ培地の５ｍｌ培養基中で、５５０ｎｍで
の光学密度（ＯＤ）が０．５になるまで増殖させ、５ｍ
ｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で３時間インキ
ュベートした。１０ ＯＤに対応するこの誘導培養物を
回収し、これから全細胞抽出物を調製した。全細胞抽出
物はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。目的タンパク質
が発現されたことが明らかな場合は、培養を１リットル
規模で繰り返し行い、細胞を回収し、不溶性画分（incl
usion bodies：ＩＢ）を調製する。
【００３７】2.2 ＩＢの調製 細胞を遠心により回収し、１００ｍｌのトリス−マグネ
シウム緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌトリス、ｐＨ８．０、
１ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2 ）中に加え、リゾチーム
（０．３ｍｇ／ｍｌ）で溶解した。
【００３８】それらを３７℃で１５分間インキュベート
し、フレンチプレスに１回通過させた（１２００ｐｓ
ｉ）。その後ＤＮａｓｅ消化（２ｍｇのＤＮａｓｅＩ）
を３７℃で３０分間行った。２０ｍｌの０．５ｍｏｌ／
ｌ ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０および３ｍｌの２０％トリトン（Triton: 登録名）Ｘ
１００を加え、２５℃で１０分間インキュベートした。
【００３９】この懸濁体を１５０００ｒｐｍ、４℃で１
０分間遠心した。ペレットを３０ｍｌの５０ｍｍｏｌ／
ｌトリス、ｐＨ８．０、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡお
よび０．５％トリトンＸ１００に加え、超音波で処理し
た。再度遠心し、再懸濁し、超音波で処理した。この方
法をさらに２回繰り返した。次いで、これを遠心し、得
られたペレットをＩＢとして可溶化／再生のために使用
した。 2.3 可溶化／再生 2.3.1 可溶化 可溶化緩衝液： ６ｍｏｌ／ｌ グアニジン塩酸塩 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス緩衝液、ｐＨ８．０ １ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ １００ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール） 透析緩衝液（１）： ６ｍｏｌ／ｌ グアニジン塩酸塩 ３ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ３．０ １ｇの不溶性画分を３０ｍｌの可溶化緩衝液に加え、超
音波で５分間ホモジナイズし、室温で１時間インキュベ
ートした。ＨＣｌをｐＨが３．０になるまで加えた。そ
の後不溶性物質を遠心により除いた。ＤＴＥが完全に除
去されるまで（≦１ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＥ）これを透析
緩衝液（１）に対して透析した。
【００４０】2.3.2 パルス再活性化 再生緩衝液： ０．５ｍｏｌ／ｌ アルギニン塩酸塩 ０．１ｍｏｌ／ｌ トリス緩衝液、ｐＨ８．０ ０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＧＳＨ ０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＧＳＳＧ １ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ 透析緩衝液（２）： １０ｍｍｏｌ／ｌ トリス緩衝液、ｐＨ８．０ １ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ パルス再活性化はEP-A 0 241 022に記載されるように行
った。EP-A 0 241 022の図５に示された装置を使用し
た。このために、反応容量（１００ｍｌの再生緩衝液）
中のタンパク質濃度がパルスあたり５０μｇ／ｍｌずつ
増加するように、３０分おきにタンパク質を反応容量に
加えた。合計２０回のパルスを与えた（最終濃度約１ｍ
ｇ／ｍｌ反応容量）。パルス再活性化後、遠心して反応
容量から濁りを除き、アルギニンが除かれるまで（≦５
０ｍｍｏｌ／ｌ）全反応容量を透析緩衝液（２）に対し
て透析した。
【００４１】3. Ｇ−ＣＳＦ誘導体の活性の測定 Ｇ−ＣＳＦの活性は、Biochem. J. 253 (1988) 213-21
8; Exp. Hematol. 17 (1989) 116-119; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 83 (1986) 5010に記載されるように、Ｇ
−ＣＳＦに完全に依存するマウス白血病細胞系ＮＦＳ６
０を用いて試験した。細胞の因子−依存性を維持するた
めに、維持培養物の培地（ＲＰＭＩ培地、Boehringer M
annheim GmbH、注文番号 2099445、10% ウシ胎児血清を
含む）は永久に１０００Ｕ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを含む。
【００４２】この試験では、Ｇ−ＣＳＦにより刺激され
たＮＦＳ６０細胞の増殖を 3Ｈ−チミジンの取込みによ
り直接測定した。試験は次のように行った：指数増殖期
（最大細胞密度１ｘ１０5 細胞／ｍｌ）のＮＦＳ６０細
胞をマイクロタイタープレート（１ｘ１０4 細胞／ウェ
ル）に移し、次第にＧ−ＣＳＦ濃度を低下させながら培
養した。ウェル１中のＧ−ＣＳＦの最大量は維持培養物
中の濃度（１０００Ｕ／ｍｌ、比活性１ｘ１０8 Ｕ／ｍ
ｇタンパク質）に一致する。１０段階で希釈を行った。
【００４３】約２４時間のインキュベーション後、 3Ｈ
−チミジン（０．１μＣｉ／ウェル）を加えた。その
後、細胞をさらに１６時間インキュベートした。試験を
評価するために、細胞をマイクロタイタープレート中で
冷凍し、それらを溶解した。細胞溶解物をガラス繊維フ
ィルター上に吸引し、洗い、乾燥し、シンチレーション
カウンターで計測した。 3Ｈ−チミジンの取込みはＮＦ
Ｓ６０細胞のＧ−ＣＳＦ−誘導増殖に比例した。
【００４４】4. ＤＮＡ結合の定量 実施例１に記載した試験によりＤＮＡ結合を定量した。
この実験の結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】5. 細胞への複合体の結合を調べる試験 次の検定は、核酸と融合タンパク質の複合体が受容体を
発現する細胞の表面上の対応受容体に結合するかどうか
を試験するために行った。
【００４７】5.1 複合体の製造 HindIII で再切断した１０μｇのラムダＤＮＡを１０の
細胞試験あたりランダムプライミング（Boehringer Man
nheim GmbH、カタログ番号 1004760）を用いて 35Ｓ−ｄ
ＡＴＰで標識した。複合体の形成のために、標識ＤＮＡ
を１００μｇの融合タンパク質と２５℃で混合した。そ
の後同一温度で３０分間インキュベーションを行った。
【００４８】5.2 細胞試験 それぞれの試験のために、放射性標識核酸と複合体を形
成した融合タンパク質１−１０μｇを０．２ｍｌのＲＰ
ＭＩ培地（１０％ＦＣＳを含む）中で 1 x 100,000個の
ＮＦＳ６０細胞と混合した。この調製物を３７℃、５％
ＣＯ2 で２時間、４時間、または２２時間インキュベー
トした。評価のために、細胞を２０００ｒｐｍで１５分
間遠心し、上清をデカントし、細胞を１ｍｌのＰＢＳ
（１０ｍｍｏｌ／ｌ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．
５、１４０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）中に入れた。再度
の遠心後、細胞ペレットを１００μｌのＰＢＳに懸濁
し、−２０℃で１時間急速冷凍して細胞を溶解した。そ
の後細胞をシンチレーションカウンターで計測した。
【００４９】次の対照実験を平行して行った： − タンパク質の存在しない標識ＤＮＡと細胞とのイン
キュベーション。 − 上記のように標識ＤＮＡとインキュベートした天然
Ｇ−ＣＳＦ（ｗｔ）と細胞とのインキュベーション。 上記細胞試験を実施した。この試験の結果を表２に要約
する。
【００５０】
【表２】
【００５１】表２は明らかに、放射活性つまり核酸の細
胞への取込みが修飾Ｇ−ＣＳＦ（６＋）の存在下でのみ
測定されることを示している。 1) １分間あたりのカウント数
【００５２】実施例３ “細胞ホーミング因子”成分としてＮＧＦを有するタン
パク質の製造 1. ベクターの構築 Ｎ末端に主として正に荷電したアミノ酸を有する融合成
分を含むＮＧＦ誘導体を製造するために、発現プラスミ
ドを次のように構築した：このために、３つの調製物を
連結させた。調製物Ａは約４．６ｋｂの大きさの、プラ
スミドpBTac1 (Boehringer Mannheim GmbH、カタログ番
号 1081365) のEcoRI/BamHI 断片である。調製物Ｂはプ
ラスミドpUC18-NGF (British Biotechnology, Code BBG
26) を酵素 BspMIと BamHIで制限することにより構築さ
れた。ＮＧＦをコードする領域を含む３６０ｂｐの大き
い BspMI/BamHI断片が得られた。調製物Ｃは次の合成ア
ダプターを表す：
【００５３】
【化６】
【００５４】（配列番号：８は、５’−３’鎖が塩基１
−４０からなり、その相補鎖が５−４４に相補的な塩基
からなる合成アダプターの配列を示す。そのアミノ酸配
列は配列番号：９に示してある）。３つの調製物は公知
方法に従って連結し、その際調製物ＡとＢがそれぞれ５
００ｎｇの濃度で、調製物Ｃが１μｇの濃度であった。
連結調製物はプラスミドpUBS520 (Brinkmann et al., 1
989) (DSM 6786) を含む E. coli C600+ (DSM 5443) に
形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）とカナ
マイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む栄養培地で選択する
ことにより目的のクローンを得ることができた。得られ
たプラスミドpNGF1 は追加の ScaI 切断部位の存在によ
って最初のベクターと相違する。プラスミドpNGF1 は宿
主株E. coli C600+ 中のpUBS520 とのプラスミド混合物
としてDSM 6785のもとに寄託された。
【００５５】2. 精製 2.1 不溶性画分（＝ＩＢ）の調製 ｒｅｃ．ＮＧＦを含むＩＢを調製するために、プラスミ
ドpNGF1 とpUBS520 を担持する、実施例3.1 に記載した
発現菌株E. coli C600+ を１０リットル発酵槽で８時間
発酵させた。ＮＧＦ誘導体の発現は発酵開始の約４時間
後の対数増殖期にＩＰＴＧを加えることにより誘導し
た。８時間の発酵後、遠心により６９０ｇのバイオマス
を回収した。バイオマスを３．５Ｌの０．１ｍｏｌ／ｌ
トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７中に懸濁し、０．３ｇのリゾ
チームの添加後、それを０℃で２０分間インキュベート
した。続いて、６００バールでの高圧分散により細胞を
完全に溶解した。溶解物溶液にＤＮａｓｅを０．１ｍｇ
／ｍｌの最終濃度で、そしてＭｇＳＯ4 を２ｍｍｏｌ／
ｌの最終濃度で加え、この溶液を２０℃で３０分間イン
キュベートした。ＤＮａｓｅ処理後、溶液を同量の０．
１ｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ、６％トリトンＸ１０
０、１．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、６０ｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で希釈し、氷浴中で２０分間イン
キュベートした。その後、不溶性成分（ＩＢ）を遠心に
より分離した。沈殿物を１Ｌの０．５ｍｏｌ／ｌ塩化グ
アニジニウム（ＧｄｍＣｌ）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ４．５中に懸濁した。２０℃で２０分インキ
ュベーション後、ＩＢを遠心により回収した。この沈殿
物を１．５Ｌの０．１ｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ、２
０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中に再懸濁し
た。２０℃で３０分インキュベーション後、遠心により
ＩＢを沈殿物として得た。
【００５６】2.2 ｒｅｃ．ＮＧＦのパルス再生 ２０ｇのＩＢ物質を４００ｍｌの６ｍｏｌ／ｌ Ｇｄｍ
Ｃｌ、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ、０．１ｍｏ
ｌ／ｌ ＤＴＥ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
５中に溶解し、２０℃で１時間インキュベートした。そ
の後、溶液のｐＨを２５％ＨＣｌでｐＨ３に調整し、３
ｘ１０Ｌの６ｍｏｌ／ｌ ＧｄｍＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ、ｐＨ３に対して４℃で透析した。それぞれ
の場合の１００ｍｌ透析物を１２−１６時間の間隔で３
０分以内に２０Ｌの０．７ｍｏｌ／ｌアルギニン、２ｍ
ｏｌ／ｌ尿素、０．１ｍｏｌ／ｌトリス、２ｍｍｏｌ／
ｌＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／ｌシステアミン、１ｍｍｏｌ
／ｌシステアミン、ｐＨ９．１中に４℃でポンプ輸送し
た。 2.3 再生溶液からの生物学的に活性なｒｅｃ．ＮＧＦ
の精製 固体の硫酸アンモニウムを再生溶液に２０％飽和になる
まで少しずつ加え、氷上で１時間攪拌した。次に、この
溶液のｐＨを２５％ＨＣｌでｐＨ３に調整した。３０分
インキュベーション後、それを７ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ
でｐＨ８に滴定した。遠心（２００００ｇ、４℃で１時
間）または低タンパク質吸着の膜（例えば、日本のKawa
sumi Laboratories のEvaflux A 4 中空繊維カートリッ
ジ）を通す濾過を行って濁りを除いた。その後、ＮＧＦ
を含む透明な溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣ
ｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の
２０％飽和、ｐＨ７．５で予め平衡化したＴＳＫ−ブチ
ルカラム（Pharmacia 社）に添加した。試料の添加完了
後、５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／
ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で洗った。溶離は５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ酢酸Ｎａ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．
５中の５０％エチレングリコールを用いて行った。溶離
した画分はそれらのＮＧＦ含有量について試験した。Ｎ
ＧＦ含有画分をプールし、０．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸Ｎａ、１０％グリセロー
ル、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０で予め平衡
化したセファクリルＳ２００カラム（Pharmacia 社、ス
ウェーデン）にかけた。カラムを同一緩衝液で溶離し
た。ＮＧＦを含む溶離液の画分は１５ｍＳの伝導率へ水
で希釈し、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸Ｎａ、１ｍｍｏｌ／
ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０で予め平衡化したＳ−セファ
ロースカラム（Pharmacia 社）にかけた。次に、平衡緩
衝液で洗った。溶離は上記緩衝液中の１．２ｍｏｌ／ｌ
ＮａＣｌまでの勾配を用いて行った。ＮＧＦ含有画分
をプールし、必要ならば更なる分析のために、透析によ
り再緩衝する。
【００５７】3. ＮＧＦ融合タンパク質の活性の測定 ＮＧＦ融合タンパク質の活性を測定するために、初め
に、保温したニワトリの卵から後根神経節を取り出し
た。このために、８日間保温したニワトリの卵に７０％
エタノールをスプレーして消毒し、頂部を鋭くないピン
セットで破いて開き、卵の殻と薄皮を除いた。その後、
胚を鋭いピンセットで取り出し、ペトリ皿に移し、頭を
除いた。次いで、胚を２番目のペトリ皿に移し、あお向
けに置き、鋭くないピンセットで首のところで固定し
た。小型の切開バサミを使って尾から胸腔まで切開し、
腸を鋭いピンセットで取り除いて脊髄を露出させた。そ
の後、胚を無菌ＰＢＳですすぎ、時計屋のピンセットを
使って後根神経節を露出する交感神経幹を除いた。その
ピンセットを脊髄の縁に沿って尾の方に走らせ、神経節
を剥がして回収した。出来るかぎり無傷の神経節を、無
菌ＰＢＳを満たした氷上の小ペトリ皿に集めた。調製し
た神経節は１５ｍｌのチューブに移し、２ｍｌの容量に
なるまで無菌ＰＢＳをを加え、その後それらを水浴中で
８０μｌの２．５％トリプシン溶液と共に３７℃で３０
分間インキュベートし、その間５分毎に少しの間振とう
した。続いて、神経節沈殿物を５ｍｌのＦ１４培地（組
成については下記参照）を入れたチューブに移し、少し
の間振とうした。神経節を再度沈殿させた。この洗浄法
を２回繰り返した。その後、神経節をピペットで十分に
再懸濁させ、混濁した細胞懸濁体をＴ２５培養フラスコ
に移し、チューブからの残存細胞を培地ですすぐことに
より、神経節を解離させた。次に、細胞をプレ−プレー
トするために、培養フラスコをインキュベーター（２７
℃、相対湿度５０％、ＣＯ2 ７．５％）内に２時間置い
た。プレ−プレーティング（この間に非ニューロン細胞
が培養フラスコの底に沈殿した）の後、オルニチンとラ
ミニンを被覆した２４ウェルまたは９６ウェルのマイク
ロタイタープレートにニューロン細胞を移した。
【００５８】ポリ−ＤＬ−オルニチンの被覆は、０．１
５ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液中の５００μｇ／ｍｌポリ−
ＤＬ−オルニチン（臭化水素酸塩、分子量３０００−１
５０００、Sigma 社、注文番号 P 8638 ）の溶液３００
μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、振
とう器上４℃でインキュベートすることにより実施し
た。その後、ポリ−ＤＬ−オルニチン溶液を吸引し、プ
レートを滅菌再蒸留水で２回洗った。次に、ＰＢＳ中の
３．４μｇ／ｍｌラミニン（Boehringer Mannheim Gmb
H、カタログ番号 1243217) の溶液３００μｌをマイク
ロタイタープレートの各ウェルに加え、振とう器上室温
で４時間インキュベートすることにより、ラミニン被覆
を行った。プレートの最終的な作製はプレ−プレーティ
ングの終了前に行った。このために、ラミニン溶液を吸
引し、８００μｌの培地をすぐに加えた。その後、試験
すべき１００μｌの試料（培地で希釈した）を加え、２
時間のプレ−プレーティングの完了後、１００μｌのニ
ューロン細胞を加えた。
【００５９】樹状突起が形成された細胞の数を生物学的
活性の指標として定量した。マウスの顎下腺からの２．
５Ｓ ＮＧＦの既知濃度の溶液（Boehringer Mannheim
GmbH、カタログ番号 1179195) を基準として使用した。 Ｆ１４培地：（改変Ｆ１２培地、Boehringer Mannheim GmbH、 カタログ番号 210 161） 1. F12 培地 (粉末) 10.91 g 2. L-グルタミン、200 mmol/l (Boehringer Mannheim GmbH 、 10 ml カタログ番号 210 277) 3. ピルビン酸ナトリウム、100 mmol/l 20 ml (Biochrom KG: L 0473) 4. 非必須アミノ酸 (Boehringer Mannheim GmbH 、 20 ml カタログ番号 210 293) 5. ウマ血清 (不活性化) 100 ml 6. ストレプトマイシン- ペニシリン (Boehringer Mannheim GmbH 、 2 ml カタログ番号 210 404) 7. 23.5 mmol/l NaHCO3 (Merck 6329) 1.97 g 8. 11 mmol/l グルコース (Merck 4074) 2.18 g 9. 5 mmol/l 塩化カリウム (Merck 4936) 373 mg 10. 2 mmol/l CaCl2 x 2 H2O (Merck 2382) 294 mg 11. 0.85 mmol/l MgCl2 x 6 H2O (Merck 5833) 173 mg 12. 0.15 mmol/l MgSO4 x 7 H2O (Merck 5886) 37 mg 13. 0.085 mmol/l アスコルビン酸 (Sigma A 4034) 17 mg 14. 0.5μmol/l ZnSO4 x H2O (Merck 8882) 9 mg/10 ml 200 μl 4. ＤＮＡ結合試験 ＤＮＡ結合試験は実施例１に記載するように行った。試
験の結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
【配列表】
（１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）名称：ベーリンガー マンハイム ゲーエムベー
ハー （Ｂ）通り：サンドホファー シュトラーセ １１６ （Ｃ）都市：６８００ マンハイム ３１ （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６８００ （Ｇ）電話：０６２１／７５９−３１９７ （Ｈ）ファクシミリ：０６２１／７５９−４４５７ （ｉｉ）発明の名称：細胞への核酸運搬方法 (Verfahre
n zur Einschleusungvon Nukleinsaeuren in Zellen) （ｉｉｉ）配列の数：９ （ｉｖ）コンピューター読み取り形態 （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機 （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリーズ＃１．
０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ） （ｖｉ）先行出願データ （Ａ）出願番号：ＤＥ Ｐ ４１ ３９ ００１．６ （Ｂ）出願日：１９９１年１１月２７日 （２）配列番号：１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１３ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００６２】
【化７】
【００６３】（２）配列番号：２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：９ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００６４】
【化８】
【００６５】（２）配列番号：３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１４ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００６６】
【化９】
【００６７】（２）配列番号：４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００６８】
【化１０】
【００６９】（２）配列番号：５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００７０】
【化１１】
【００７１】（２）配列番号：６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００７２】
【化１２】
【００７３】（２）配列番号：７の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：９９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列
【００７４】
【化１３】
【００７５】（２）配列番号：８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：４４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：８．．４０ （ｘｉ）配列
【００７６】
【化１４】
【００７７】（２）配列番号：９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列
【００７８】
【化１５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドリス ツィーグラー−ランデスベルガー ドイツ連邦共和国 8033 プラネーク ア インシュタインシュトラーセ ７

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的細胞に特異的な“細胞ホーミング因
    子”成分と少なくとも１つのポリカチオン成分を含むタ
    ンパク質と核酸との非共有結合複合体を形成させること
    により核酸を標的細胞へ運搬するための複合体の製造方
    法であって、 “細胞ホーミング因子”成分と少なくとも１つのポリカ
    チオン成分の線状遺伝子融合体を含むタンパク質を、適
    当な条件下で、標的細胞へ運搬しようとする核酸と接触
    させて、本質的に核酸とタンパク質のポリカチオン部分
    とのイオン相互作用に基づいた複合体を形成させること
    からなり、該タンパク質のポリカチオン成分がリシンお
    よびアルギニンから選ばれる少なくとも３個のアミノ酸
    を含みかつ生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成
    し得るペプチド配列であることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 成長因子、特にＧ−ＣＳＦまたはＮＧＦ
    を“細胞ホーミング因子”成分として使用することを特
    徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ中で２５ｎ
    ｇ／μｌの核酸濃度の存在下にｐＨ７−８、２５℃でイ
    ンキュベーション後に、０．０１−１ｍｇ／ｍｌのタン
    パク質濃度でタンパク質−核酸複合体を形成するタンパ
    ク質を使用し、該複合体がその後のアガロースゲル電気
    泳動において核酸バンドの遅延を起こすのに十分なほど
    安定していることを特徴とする、請求項１または２記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 タンパク質のポリカチオン成分が少なく
    とも３個のＡｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を含み、Ａ
    ｒｇとＬｙｓの割合が少なくとも４０％であることを特
    徴とする、請求項１−３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 【請求項５】 ポリカチオン成分が一連の少なくとも４
    個の連続したＡｒｇおよび／またはＬｙｓ残基を含むこ
    とを特徴とする、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 標的細胞へ運搬しようとする核酸が一本
    鎖または二本鎖の非修飾もしくは修飾デオキシリボ核酸
    またはリボ核酸であることを特徴とする、請求項１−５
    のいずれか１つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１−６のいずれか１つに記載した
    方法により製造した複合体を、該複合体または核酸の内
    在化へ導く適当な条件下で、標的細胞と接触させること
    を特徴とする、標的細胞への核酸の運搬方法。
  8. 【請求項８】 生理学的条件下で安定しているタンパク
    質−核酸複合体を製造するための、細胞−特異的“細胞
    ホーミング因子”成分と少なくとも１つのポリカチオン
    成分の線状遺伝子融合体からなり、該ポリカチオン成分
    がリシンおよびアルギニンより成る群から選ばれる少な
    くとも３個のアミノ酸を含むペプチド配列であることを
    特徴とするタンパク質の使用。
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