JP2010142247A - Il−6レセプター・il−6直結融合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】IL−6レセプターを構成するアミノ酸残基の一つとIL−6を構成するアミノ酸残基の一つが直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質
【選択図】図1
Description
前記以外に例えば、医薬品等のようにプロテアーゼ存在下でIL−6R・IL−6融合蛋白質の生物活性を長時間持続させる目的でも、本願発明のプロテアーゼ抵抗性IL−6R・IL−6融合蛋白質は有効である。このようなIL−6R・IL−6融合蛋白質を製造するためには、IL−6R・IL−6融合蛋白質が生物活性を発揮すべき環境に共存するプロテアーゼを取得し、該プロテアーゼにより変異導入前のIL−6R・IL−6融合蛋白質においてどの部位が切断作用を受けるかを検出し、当該部分に前記のように変異させれば良い。
次に、プライマーp6RAB20L(配列番号45)とプライマーp6RF320S(配列番号46)を用いてIL−6R遺伝子(cDNA)を増幅し、XhoIで切断した。これを、予めXhoIとEcoRVで切断したpBSに挿入することにより、プラスミドpBS6Rを得た。
次に、オリゴマー320S333Ab(配列番号49)と320S333Af(配列番号50)を通常の方法でアニールさせた。これを、予めBgl IIとKpn Iで切断したプラスミドpBS6R6Sに挿入することにより、pBS6R6Lを得た。得られたpBS6R6Lの構造を図4に示す。
アニール配列2(323AG4S2A);センス側は配列番号3のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号4のオリゴヌクレオチド。
アニール配列3(334LPA);センス側は配列番号5のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側;配列番号6のオリゴヌクレオチド。
アニール配列4(333AΔA);センス側は配列番号7のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側;配列番号8のオリゴヌクレオチド。
アニール配列5(323AΔA);センス側は配列番号9のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側;配列番号10のオリゴヌクレオチド。
アニール配列7(333AG4S2A);センス側は配列番号13のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号14のオリゴヌクレオチド。
アニール配列8(343IG4S2A);センス側は配列番号15のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号16のオリゴヌクレオチド。
アニール配列9(333AG4S3A);センス側は配列番号17のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号18のオリゴヌクレオチド。
アニール配列10(333AG2A);センス側は配列番号19のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号20のオリゴヌクレオチド。
アニール配列11(333AG4A);センス側は配列番号21のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号22のオリゴヌクレオチド。
アニール配列12(343IG2A);センス側は配列番号23のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号24のオリゴヌクレオチド。
アニール配列13(343IG4A);1センス側は配列番号25のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号26のオリゴヌクレオチド。
アニール配列14(361SΔA);センス側は配列番号27のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号28のオリゴヌクレオチド。
アニール配列15(358DΔA);センス側は配列番号29のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号30のオリゴヌクレオチド。
アニール配列16(352TΔA);センス側は配列番号31のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号32のオリゴヌクレオチド。
アニール配列17(346RΔA);センス側は配列番号33のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号34のオリゴヌクレオチド。
アニール配列18(343IΔA);センス側は配列番号35のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号36のオリゴヌクレオチド。
アニール配列19(338KΔA);センス側は配列番号37のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号38のオリゴヌクレオチド。
アニール配列20(335TΔA);センス側は配列番号39のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号40のオリゴヌクレオチド。
アニール配列21(343IΔP);センス側は配列番号41のオリゴヌクレオチド、アンチセンス側は配列番号42のオリゴヌクレオチド。
アニール配列22(338KΔP);センス側は配列番号43のオリゴヌクレオチド、 アンチセンス側は配列番号44のオリゴヌクレオチド。
各誘導体ごとの、得られた形質転換体の数とmuts菌株の数を表1に示す。各発現プラスミドで形質転換された菌株ごとに、平均9.4個のmuts菌株(最低4種、最高17種、合計216種)を取得した。
実施例4 形質転換体の培養実施例3で取得されたmuts菌(合計216種)とIL−6RのN末端344番目のロイシンとIL−6のN末端28番目のアラニンをSSELVというリンカーを介して融合した融合蛋白質を発現するmuts菌(平成10年特許願第2921号に記載)をそれぞれ試験管を用いて5%(V/V)のメタノールを含むBMGY培地(1%(W/V)酵母エキス、2%(W/V)ペプトン、1.34%(W/V)YNB wo AA(Yeast Nitrogen BaseWithout Amino Acid)、0.4mg/lビオチン、100mMリン酸カリウム(pH6.0)、1%(W/V)グリセロール3mlで、30℃で120時間培養した。各培養液から120時間目の培養液をサンプリングし、遠心により上清を取得した。
更に図7から、323番目のアラニン残基、333番目のアラニン残基、334番目のロイシン残基、335番目のトレオニン残基、338番目のリジン残基、又は343番目のイソロイシン残基のいずれかのC末端にIL−6のN末端のアミノ酸残基が結合したIL−6R・IL−6融合蛋白質である323AΔA、333AΔA、334LΔV、335TΔA 、338KΔP、338KΔA、343IΔP又は343IΔAは、グリシン残基やセリン残基のような自由度の高いアミノ酸残基が5から15個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたIL−6R・IL−6融合蛋白質である323AG4SA、333AG4SA、323AG4S2A、333AG4S2A、343IG4S2A、333AG4S3Aや、アミノ酸残基が1から4個つながったペプチドから成るリンカーを介して融合されたIL−6R・IL−6融合蛋白質である334LPA、333AG2A、333AG4A、343IG2A、343IG4Aと比較して、ほぼ同等かやや低い程度の活性を有することが分かる。これにより、323番目のアラニン残基、333番目のアラニン残基、334番目のロイシン残基、335番目のトレオニン残基、338番目のリジン残基、343番目のイソロイシン残基の6個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のC末端にIL−6のN末端のアミノ酸残基が結合した本発明のIL−6R・IL−6融合蛋白質が、中でも特に好ましいことが分かる。
実施例10 融合蛋白質の糖鎖部分の分子量の分析実施例5に記載の本発明の融合蛋白質333AΔAを実施例7に記載した方法で精製したもの(以下FP6と略記)を用いて以下の実験を行った。
反応が停止した上記各溶液にブロモフェニルブルーで着色した72%グリセロール、10%2−メルカプトエタノールを3μl加えた。これをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲル中の蛋白質はコマジーブリリアントブルーR250で染色して検出した。
2週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行った。結果を図11に示す。コロニーは顆粒球コロニー(G)、マクロファージコロニー(M)、顆粒球・マクロファージの混合コロニー(GM)、芽球コロニー(Blast)、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニー(Mix)、赤芽球コロニー(BFU−E)の6種類に分類した。
図11から明らかなように、既に報告されている条件である1と2では、既存の報告(Suiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92、2589頁、1995年参照)とほぼ同等のコロニー形成能が観察された。一方、本発明の条件である3(FP6(300ng/ml))では、同濃度のIL−6とIL−6Rの組み合わせである2(IL−6(100ng/ml)とIL−6R(200ng/ml)を大きく上回るコロニー形成能が観察された。さらに、図には表されていないが、本発明の条件である3あるいは4により形成された混合コロニーのサイズは、既に報告されている条件である1と2のそれよりも、著しく大きいものであった。これらのことは、本発明の融合蛋白質は、既に報告されているIL−6とIL−6Rの組み合わせよりも優れた造血幹細胞のex vivo増幅効果を有することを示す。
図12から明らかなように、1μg以上のFP6を投与した群(第3−5群)ではFP6未投与群(第1群)に比べ、有意な血小板増多が観察された。一方、FP6(分子量約84kDa)1μgの2倍の分子数であるIL−6(分子量約21kDa)0.5μgを同条件で投与した場合は有意な血小板増多が観察されなかったことが報告されている(Ishibashiら、Blood、74、1241頁、1989年参照)。このことは、本発明の融合蛋白質は、IL−6よりも優れたin vivoでの血小板増多効果を有することを示す。
C57BL6マウス(雄性、8週齢)を1群15匹、全2群を用い、第1群をFP6未投与群(対照群)として300μlのPBS、1%牛血清アルブミン(BSA)を投与する群、第2群を5μgのFP6を含む300μlのPBS、1%牛血清アルブミン(BSA)を投与する群とした。全群とも150mg/kgの5FUを尾静脈から投与し、上記薬剤を12時間置きに1日2回、2日目から6日目まで5日間連続腹腔内に投与した。7日目にから9日目までの3日間連続で、各群5匹ずつのマウスの下行動脈より全採血し、血小板数を血球測定器CC−180A(東亜医用電子株式会社製)で計数した。
図13から明らかなように、FP6を投与した群(第2群)ではFP6未投与群(第1群)に比べ、8日目と9日目に有意な血小板回復が観察された。このことは、本発明の融合蛋白質は5FU投与による血小板産生機能の低下に対し、in vivoでの回復効果を有することを示す。
図14から明らかなように、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質112VAA及び116EAAは、イムノグロブリン様領域を有する融合蛋白質333AΔAとほぼ同等の活性を有した。
実施例1のようにして得られたpBS6R6LからプライマーpKN6B38D(配列番号55)とプライマーpIL6F2(配列番号56)を用いてIL−6遺伝子(cDNA)を増幅し、NruIとNotIで切断した。これを、予めEco47IIIとNotIで切断したpBS6R6Lに挿入することにより、プラスミドpBS6R6L−38Dを得た。
プライマーp6RAB112V(配列番号57)とプライマーp344F(配列番号58)を用いてIL−6R遺伝子を増幅し、XhoIとXbaIで切断した。これを予めXhoIとAvrIIで切断したpPIC9に挿入することにより、pPIC9−112VLを得た。pPIC9−112VLをXhoIとPmaCIで切断して得られた断片を予めXhoIとPmaCIで切断したpPIC9−20LAAに挿入し、イムノグロブリン様領域欠失型融合蛋白質112VAA(N末端がIL−6RのN末端112番目のバリンで、IL−6RのN末端333番目のアラニンとIL−6のN末端28番目のアラニンをリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質)をコードする発現プラスミドpPIC9−112VAAを作製した。
更に、pPIC9−20LADをXhoIとPmaCIで切断してIL−6Rをコードする遺伝子を取得し、予めXhoIとPmaCIで切断したpPIC9−112VAAに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質112VAD(N末端がIL−6RのN末端112番目のバリンで、IL−6RのN末端333番目のアラニンとIL−6のN末端38番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質)をコードする発現プラスミドpPIC9−112VADを、予めXhoIとPmaCIで切断したpPIC9−116EAAに挿入することにより、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質116EAD(N末端がIL−6RのN末端116番目のグルタミン酸で、IL−6RのN末端333番目のアラニンとIL−6のN末端38番目のアスパラギン酸をリンカーを介さずに直接融合した融合蛋白質)をコードする発現プラスミドpPIC9−116EADをそれぞれ作製した。
実施例16に記載の5種類の発現プラスミド(pPIC9−20LAD、pPIC9−112VAA、pPIC9−116EAA、pPIC9−112VAD、pPIC9−116EAD)を実施例3に記載の方法でそれぞれピキア酵母に導入した。その結果、pPIC9−20LADにより形質転換されたmuts株を10株、pPIC9−112VAAにより形質転換されたmuts株を7株、pPIC9−116EAAにより形質転換されたmuts株を10株、pPIC9−112VADにより形質転換されたmuts株を1株、pPIC9−116EADにより形質転換されたmuts株を6株を取得した。これを実施例4に記載の方法で培養して上清を取得し、実施例5に示す方法で生物活性を測定した結果、pPIC9−20LADにより形質転換されたmuts株では10株中10株、pPIC9−112VAAにより形質転換されたmuts株では7株中7株、pPIC9−116EAAにより形質転換されたmuts株では10株中7株、pPIC9−112VADにより形質転換されたmuts株では1株中1株、pPIC9−116EADにより形質転換されたmuts株では6株中6株が生物活性を有していた。この結果は、IL−6のN末端28番目のアラニンから37番目リジンまでを欠失させても生物活性は影響を受けないことを示すものである。
図15から明らかなように、20LAA、116EAA、112VAAでは、それぞれのIL−6領域のN末端37番目のリジンのC末端で切断されて生じたと思われる分子量18kDのバンドが鮮明に検出されたが、本願発明のプロテアーゼ抵抗性融合蛋白質20LAD、116EAD、112VADでは検出されないか、或いはほとんど検出されなかった。この結果から、IL−6のN末端28番目から37番目までの10アミノ酸を失欠させる変異を導入したことにより、プロテアーゼ抵抗性を付与できたことが分かる。
Claims (8)
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質をコードする遺伝子。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)種の酵母。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするL−6レセプター・IL−6融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)種の酵母を培養し、当該培養物からIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質を分泌型蛋白質として採取することを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質の製造法。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)種の酵母をメタノールを含まず天然物由来の炭素源を含む培地で培養し、途中でメタノールを添加して培養することを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質の製造法。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質を含有する溶液を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの3種類のクロマトグラフィーにかけ、IL−6レセプター・IL−6融合蛋白質を採取することを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質の製造法。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質を含むことを特徴とする造血幹細胞のex vivo増幅剤。
- IL−6レセプターのN末端112番目のバリンから333番目のアラニン残基にIL−6のN末端から38番目のアスパラギン残基が直接に結合していることを特徴とするIL−6レセプター・IL−6融合蛋白質を主成分として含む血小板増多剤。
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