ES2242198T3 - Poliacrilatos y poli(alquil) acrilatos cationicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en sistemas de transfeccion sinteticos. - Google Patents
Poliacrilatos y poli(alquil) acrilatos cationicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en sistemas de transfeccion sinteticos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN SISTEMA SINTETICO DE TRANSFECCION O DE BLOQUEO QUE COMPRENDE, COMO PORTADOR, UN POLIACRILATO CATIONICO, SOLUBLE EN AGUA O DISPERSABLE EN AGUA, UNA POLIACRILAMIDA, UN POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO, O UNA POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA. ADEMAS, SE REFIERE A UN METODO PARA INTRODUCIR FRAGMENTOS DE ADN EN CELULAS DIANAS, QUE INCLUYE EL CONTACTO DE ESTOS FRAGMENTOS DE ADN CON UN POLIACRILATO, POLIACRILAMIDA, POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO O POLI (C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA, QUE ESTA AL MENOS PARCIALMENTE SUSTITUIDA CON SUSTITUYENTES CATIONICOS Y PONIENDO A CONTINUACION EL SISTEMA DE TRANSFECCION OBTENIDO CON LAS CELULAS DIANA. FINALMENTE, LA INVENCION IMPLICA EL USO DE UN POLIACRILATO, UNA POLIACRILAMIDA, UN POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO, O UNA POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA, QUE ESTA AL MENOS PARCIALMENTE SUSTITUIDA CON SUSTITUYENTES CATIONICOS COMO UN SISTEMA PORTADOR DE ADN.
Description
Poliacritos y poli(alquil)acrilatos
catiónicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en
sistemas de transfección sintéticos.
La presente invención se refiere al sector de los
sistemas de transfección sintéticos adecuados para la distribución
de elementos de genes o fragmentos de ADN en las células,
especialmente en células de organismos vivos. Más en particular, la
presente invención se refiere a polímeros catiónicos que tienen
muchas posibilidades de ser modificados o adaptados con el fin de
crear un sistema flexible de distribución de ADN o genes, que se
pueda utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica.
La terapia génica se ve como un método prometedor
para corregir defectos hereditarios o para tratar enfermedades
mortales, tales como el cáncer y el SIDA. En la terapia génica, los
fragmentos de ácidos nucleicos o elementos de genes se introducen en
células diana para compensar un gen que falta o para introducir una
nueva funcionalidad en dichas células. Estos fragmentos de ácidos
nucleicos o elementos de genes se incorporan, preferiblemente, en
plásmidos.
Si los plásmidos reconstruidos se aplican a un
organismo de por sí, esto conduce, generalmente, a una baja
expresión del gen introducido, o a una ausencia de expresión. Hay
tres razones principales para esta baja expresión. Primero, los
plásmidos apenas alcanzarán la población celular en la que se van a
incorporar, debido a procesos de degradación y eliminación.
Segundo, si los plásmidos alcanzan las células diana, no pueden
pasar de manera simple la membrana celular, debido a la naturaleza
fuertemente polar y al tamaño de los plásmidos. Tercero, si un
plásmido invade una célula diana, normalmente, será incluido en un
endosoma, que lo convertirá en un lisosoma. En el lisosoma, el
plásmido se degradará, de manera que el gen incorporado no puede ser
expresado.
Por las razones anteriores, en la terapia génica
los plásmidos u otros elementos de genes se complejan con un
transportador o vehículo.
En los últimos años se han realizado numerosos
esfuerzos en la investigación de sistemas de transfección
potencialmente adecuados, de origen viral y no viral (lípidos
catiónicos y polímeros catiónicos). Estos sistemas de transfección
deberían distribuir el gen o fragmento de ADN deseado en la célula
diana y provocar su expresión en un alto grado.
Los vectores virales son muy adecuados, debido a
su naturaleza adaptada, para introducir plásmidos en las células
diana y evitar la degradación de los plásmidos o la transición de
endosomas a lisosomas. Sin embargo, los vectores virales presentan
varios inconvenientes importantes. Los vectores virales son capaces
de realizar la integración del gen introducido en el ADN
cromosómico de la célula diana. La posición donde se efectúa esta
integración no se puede predecir (todavía) o controlar, lo que puede
implicar, por ejemplo, el riesgo de destrucción de genes esenciales
y la activación de oncogenes. Además, actualmente es muy difícil
proporcionar vectores virales a escala comercial. Además, los
vectores virales provocan, generalmente, una respuesta en el sistema
inmune de un organismo vivo, que conducirá a respuestas inmunes
contra el sistema de transfección cuando se utilice in vivo.
Finalmente, los vectores virales establecen, inherentemente,
límites en cuanto al tamaño del elemento de gen a incorporar en la
célula diana.
Con el fin de superar las desventajas intrínsecas
de los vectores virales, los sistemas de transfección sintéticos
ofrecerían buenas perspectivas.
En este sentido, se hace referencia explícita a
la investigación llevada a cabo por el grupo de E. Wagner,
relacionada con la distribución de genes mediante complejos
plásmido-polilisina (Curiel y otros, "Adenovirus
Enhancement of
Transferrin-Polylysine-Mediated Gene
Delivery" ("Incremento de adenovirus de distribución de genes
mediada por transferrina-polilisina"), Proc.
Natl. Acad. Sci. 88 (1991) 8850-8854; Plank
y otros, "Gene Transfer into Hepatocytes Using Asialoglycoprotein
Receptor Mediated Endocytosis of DNA Complexed with an Artificial
Tetra-Antennary Galactose Ligand"
("Transferencia de genes en hepatocitos utilizando la endocitosis
de ADN complejado con un ligando de galactosa tetraantenaria
artificial mediada por el receptor de la asialoglicoproteína")
Bioconj. Chem. 3 (1992) 533-539; Wagner y
otros, "Influenza Virus Hemagglutin HA2
N-Terminal Fusogenic Peptides Augment Gene Transfer
by Transferrin-Polylysine-DNA
Complexes: Toward a Synthetic Virus-like Gene
Transfer Vehicle" ("Aumento de la transferencia de genes de
péptidos fusogénicos N-terminales de hemaglutinina
HA2 del virus de la gripe: hacia un vehículo de transferencia de
genes similar a un virus sintético"), Proc. Natl. Acad. Sci.
89 (1992) 7934-7938; y Curiel y otros "Gene
transfer to Respiratory Epithelial Cells via the Receptor Mediated
Endocytosis Pathway" ("Transferencia de genes a células
epiteliales respiratorias a través de la vía de endocitosis mediada
por el receptor"), Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6,
(1992) 247-252). El complejo
plásmido-polilisina investigado tras la exposición a
ciertas líneas celulares mostró, como mínimo, algo de expresión del
gen. Además, se encontró que la eficacia de expresión disminuyó
considerablemente debido a la unión de la transferrina con el
complejo plásmido-polilisina. La transferrina da
lugar a un estrecho contacto célula-complejo con
células que comprenden receptores de transferrina; une todo el
complejo al receptor de transferrina de las células. Se observó
que, posteriormente, una parte, como mínimo, de todo el complejo se
incorpora en las células investigadas.
Sin embargo, la eficacia de transfección de estos
sistemas de transfección basados en polilisina, así como otros
sistemas de transfección sintéticos conocidos, es mucho menor que
la eficacia de los vectores virales conocidos.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un sistema de transfección sintético eficaz. Con el fin
de ser capaz de unir y condensar ADN, por ejemplo, en la forma de
un plásmido, en el que se incorpora un elemento de gen, el sistema
transportador debería poseer una carga positiva a pH
fisiológico.
Actualmente, se ha encontrado que dicho sistema
se puede basar en poliacrilatos, poliacrilamidas,
poli(C_{1-4}alquil)acrilatos o
poli(C_{1-4}alquil)acrilamidas que
contienen sustituyentes catiónicos. Más en particular, la presente
invención se refiere a un sistema de transfección sintético que
comprende (a) como vehículo, un poliacrilato o
poli(C_{1-4}alquil)acrilato
catiónico soluble en agua o dispersable en agua, o las
correspondientes acrilamidas, teniendo dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las
correspondientes acrilamidas un peso molecular desde 1.000 hasta
500.000 Da; y (b) un plásmido, un elemento de gen, un fragmento de
ADN o un oligonucleótido, y la proporción de peso de (a) respecto a
(b) se encuentra entre 0,1 y 200.
Las realizaciones preferidas se definen en las
reivindicaciones 2-6.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un método de preparación de un sistema de transfección
sintético que comprende poner en contacto (b) fragmentos de
polinucleótido con (a) un poliacrilato o
poli(C_{1-4}alquil)acrilato
catiónico, soluble en agua o dispersable en agua, o las
correspondientes poliacrilamidas, tal como se ha definido en el
párrafo anterior, teniendo dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las
correspondientes poliacrilamidas un peso molecular desde 1.000 hasta
500.000 Da, bajo condiciones en las que el polímero está cargado
positivamente, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) se
encuentra entre 0,1 y 200.
En una realización preferida, la puesta en
contacto se lleva a cabo en presencia de una sustancia que aumenta
la viscosidad, preferiblemente sucrosa. Todavía en una realización
adicional, la presente invención se refiere a un método de
introducción de fragmentos de ADN en células diana, que comprende
poner en contacto estos fragmentos de ADN (b) con (a) un
poliacrilato, poliacrilamida,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato o
poli(C_{1-4}alquil)acrilamida
catiónicos y solubles en agua o dispersables en agua, teniendo
dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las
correspondientes poliacrilamidas un peso molecular desde 1.000
hasta 500.000 Da, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) se
encuen-
tra entre 0,1 y 200, y posteriormente, poniendo en contacto el sistema de transfección obtenido con las células diana.
tra entre 0,1 y 200, y posteriormente, poniendo en contacto el sistema de transfección obtenido con las células diana.
En otra realización, la presente invención se
refiere a la utilización, como sistema transportador de ADN, de un
poliacrilato,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato,
poliacrilamida, o
poli(C_{1-4}alquil)acrilamida
soluble en agua o dispersable en agua, teniendo dicha
poliacrilamida,
poli(C_{1-4}alquil)acrilamida o las
correspondientes acrilamidas un peso molecular de 1.000 a 500.000
Da.
El polímero que forma la base del sistema
transportador de la presente invención comprende, esencialmente, un
esqueleto de unidades
-[-CH_{2}-C(R_{1})(COOR_{2})-]_{n}-,
en el que todos los grupos R_{1} pueden ser iguales o diferentes
y representan átomos de hidrógeno o grupos alquilo
C_{1-4} lineales o ramificados, y en el que todos
los grupos R_{2} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan
de manera que la carga neta del polímero corresponde a la carga,
como mínimo, del 5% de moles de los grupos catiónicos.
La frase "de manera que la carga neta del
polímero corresponde a la carga, como mínimo, del 5% de moles de
los grupos catiónicos" significa que, bajo condiciones
fisiológicas, como mínimo, el 5% de moles de las unidades tienen un
grupo catiónico si las otras unidades son neutras o, como mínimo,
un (5 + x)% de moles tiene un grupo catiónico si un x% de moles de
las otras unidades tiene un grupo aniónico. Si R_{2} no
representa un grupo que sea catiónico en condiciones fisiológicas,
se puede seleccionar entre un gran número de grupos diferentes,
tales como átomos de hidrógeno, grupos arilo, grupos glicol, grupos
alquilo C_{1-6} ramificados o lineales, que pueden
estar sustituidos con sustituyentes inertes, tales como átomos de
halógenos, etc.
Preferiblemente, los grupos catiónicos R_{2}
tienen la fórmula
-R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), en la que
R_{3} representa un grupo alquileno C_{1-4} o
un grupo aromático C_{6}H_{4}, en cuyos grupos los átomos de
hidrógeno se pueden sustituir por sustituyentes inertes, y en la
que R_{4} y R_{5}, que pueden ser iguales o diferentes,
representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
C_{1-4} o un grupo arilo.
Sin embargo, en el esqueleto del polímero puede
haber un número restringido de otras unidades diferentes a las
unidades
-[-CH_{2}-C(R_{1})(COOR_{2})-]_{n}-,
tales como unidades de pirrolidona.
En lugar de los grupos acrilato mencionados
anteriormente, puede haber presentes grupos acrilamida,
preferiblemente grupos con la fórmula
C(O)NR_{4}R_{5}.
Con el fin de poder condensar plásmidos,
elementos de genes, oligonucleótidos u otros fragmentos de ADN y
unirse a ellos, los poliacrilatos, poliacrilamidas,
poli(alquil)acrilatos o
poli(C_{1-4}alquil)acrilamidas
utilizados deben contener, a pH fisiológico, como mínimo, un 5% de
moles de grupos catiónicos R_{2} (carga neta) acoplados al
esqueleto. En estos casos, la amida de poliacrilato o la amida de
poli(alquil)acrilato es capaz de unirse
electroestáticamente al ADN y condensar con éste. Además, se
observó que dichos complejos de ADN-polímero
catiónico son absorbidos en las células diana en una cantidad
considerablemente más elevada comparada con los plásmidos de por
sí.
Tal como se ha dicho anteriormente en la
presente, el grupo catiónico está formado, preferiblemente, por un
grupo de fórmula
-R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), lo más
preferible, por grupos dimetilamino etilo o -(R_{4})(R_{5}) si
está acoplado al grupo acrilamida.
Otros sustituyentes catiónicos R_{2} adecuados
se derivan, preferiblemente, de grupos orgánicos que poseen un
grupo amino. Dichos grupos están cargados positivamente a pH
fisiológico. Entre los ejemplos de estos grupos orgánicos se
encuentran amino C_{1-10}alcoholes, y amino
C_{1-10} alcóxido
C_{1-10}alcoholes, así como sus derivados
secundarios, terciarios y cuaternarios. Especialmente, se prefieren
las aminas terciarias.
Los grupos dimetilamino etilo, así como otras
aminas terciarias, estarán, como mínimo, parcialmente protonadas en
condiciones fisiológicas, proporcionando una estructura catiónica
que es capaz de unir y condensar ADN.
Aunque es importante que el polímero esté cargado
positivamente en su totalidad, se prefiere que los sustituyentes
R_{2} de las unidades ácido acrílico/(alquil)acrílico o
amida en el esqueleto no comprendan totalmente grupos catiónicos. En
una realización preferida, parte de las unidades del esqueleto,
preferiblemente, como mínimo, un 10% de moles, comprenden otros
grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. De esta manera, el sistema de
transfección de la presente invención se basa en homopolímeros de
acrilatos, acrilamidas, (C_{1-4}
alquil)acrilatos o (alquil)acrilamidas, copolímeros
que comprenden diferentes unidades de acrilato, acrilamida,
(alquil)acrilato o (alquil)acrilamida, y copolímeros
de acrilato, acrilamida, (alquil)acrilato o
(alquil)acrilamida y otras unidades, tales como metacrilato
de metilo, metacrilato de trietilenglicol, y metacrilato de
polietilenglicol, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de
glicerilo, metacrilato de laurilo, metacrilato de butilo,
N-isopropilacrilamida,
N-(3-dimetilamino)propil)metacrilamida,
etc. Tal como se ha dicho anteriormente en la presente, no es
necesario que todas las unidades del esqueleto representen grupos
similares a acrilato. Una parte de las unidades puede estar formada
por, por ejemplo, N-vinilpirrolidona o acetato de
vinilo.
Los copolímeros que contienen unidades de
N-isopropilamida tienen un comportamiento LCST
(temperatura crítica en solución inferior). Esto significa que el
polímero se disuelve bien en agua a una temperatura relativamente
baja, mientras que a una temperatura más elevada que la LCST tiene
lugar la separación de fases. En este sentido, se hace referencia a
H. Fell y otros, Macromolecules 26 (1993),
2496-2500. Los presentes inventores tienen
indicaciones de que este comportamiento LCST afecta favorablemente
al proceso de condensación de partículas de polímero/plásmido.
De hecho, se obtienen resultados especialmente
buenos cuando, como mínimo, un 10% de moles de los sustituyentes
R_{2} derivan, esencialmente, de sustituyentes orgánicos
hidrofílicos eléctricamente neutros, tales como glicerol, metoxi
etoxi etanol y polietilenglicol. Una posible explicación de estos
resultados ventajosos es que el plásmido estará unido menos
fuertemente al polímero, de manera que se puede disociar más
fácilmente en la célula diana. Además, se observa que el PEG evita
el reconocimiento de macrófagos.
El polímero utilizado, según la presente
invención, es de naturaleza catiónica, y es soluble en agua o
dispersable en agua. Más en particular, se obtienen muy buenos
resultados si el 5-100% de moles de los
sustituyentes R_{2} representa un grupo catiónico y un
95-0% de moles de los sustituyentes R_{2}
representa un grupo aniónico o neutro, teniendo en cuenta que la
carga neta total debería ser catiónica.
El peso molecular y/o el número de polímeros
utilizados se pueden ajustar fácilmente a la naturaleza del
plásmido a transportar. Los polímeros con un peso molecular de
1.000 a 500.000 se utilizan como transportadores de ADN.
La proporción de peso de los polímeros
transportadores respecto a los fragmentos de ADN parece crítica.
Cuando se utilizan proporciones de peso entre 0,1 y 200 se obtienen
resultados adecuados; se utiliza una proporción de peso,
preferiblemente, entre 1 y 20, lo más preferible, entre 2 y 5. El
peso molecular de los polímeros de acrilato o
(alquil)acrilato se puede controlar utilizando y manteniendo
unas condiciones de reacción adecuadas en el proceso de
polimerización. Preferiblemente, el peso molecular de los polímeros
catiónicos utilizados, según la presente invención, es superior a
80.000 Da, preferiblemente superior a 100.000 Da, y lo más
preferible, superior a 250.000 Da.
El sistema de transfección sintético de la
presente invención, que comprende como transportador, como mínimo,
un poliacrilato, poliacrilamida,
poli(C_{1-4}alquil)acrilato o
poli(C_{1-4} alquil)acrilamida
catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, comprende,
además, un fragmento de ADN, tal como un plásmido, un elemento de
gen o un oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden utilizar
como estructuras bloqueadoras, por ejemplo, para controlar la
síntesis de proteínas en las células.
Se observa que las partículas condensadas que
comprenden el polímero basado en un poliacrilato y los fragmentos de
ADN se pueden incluir o incorporar en sistemas conocidos de
distribución de fármacos, por ejemplo, en liposomas o
hidrogeles.
Los genes a incorporar en sistemas
transportadores o vehículos a utilizar en el sistema de
transfección sintético son, entre otros, los documentados en:
- -
- McKusick, V.A. "Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked pheno-types." ("Herencia mendeliana en el hombre, catálogos de fenotipos autosómico dominante, autosómico recesivo y ligado a X"), Octava edición. John Hopkins University Press (1988).
- -
- Stanbury, J.B., Wyngaarden, J.B., Frederickson, D.S., Goldstein, J.L. y Brown, M.S. "The metabolic basis of inherited disease" ("Base metabólica de la enfermedad hereditaria"). Quinta edición. McGraw-Hill (1993).
Los vehículos a utilizar en las realizaciones de
la presente invención incluyen elementos reguladores virales y no
virales de la expresión y/o replicación. Estos vehículos son
conocidos en el sector.
Los sistemas de transfección adecuados son
capaces de reconocer un elemento de gen en la población celular
objetivo. De este modo, el sistema de transfección de la presente
invención basado en poliacrilato, poliacrilamida,
poli(alquil)acrilato o
poli(alquil)acrilamida, comprende, preferiblemente,
como mínimo, un grupo que reconoce selectivamente proteínas
asociadas a la superficie de las células diana. Dichos grupos de
reconocimiento o dispositivos de focalización son conocidos por los
técnicos y comprenden, por ejemplo, clúster de glicósidos tri y
tetra antenario, transferrina u otros elementos de proteínas,
anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana celular,
ligandos para receptores asociados a la superficie celular y
fragmentos de unión de derivados de dichos grupos de reconocimiento,
etc. Si, por ejemplo, los grupos de galactosa se acoplan al sistema
de poliacrilato o poli(alquil)acrilato de la presente
invención, los fragmentos génicos se distribuyen en los hepatocitos
a través del receptor de galactosa de los hepatocitos. Además, la
presencia de estructuras reconocibles acopladas covalentemente o no
covalentemente al polímero parte de un complejo
polímero-ADN, facilita la incorporación del
fragmento de ADN, por ejemplo, un elemento de gen, en la célula
diana.
Además, el sistema de transfección se puede
adaptar para permitir que el elemento de gen libere endosomas en el
sistema celular. A estas estructuras desestabilizadoras de membrana,
en particular fragmentos de polipéptido, se conjugan los sistemas
poliméricos catiónicos, solubles en agua o dispersables en agua, de
la presente invención. Dichas estructuras desestabilizadoras
deberían ser capaces de alterar o desestabilizar los sistemas de
membranas endosómicas. Los plásmidos que incorporan un elemento de
gen alcanzan así el citoplasma de la célula diana, en la que el
elemento de gen se puede expresar en el núcleo. Entre los ejemplos
de dichas estructuras desestabilizadoras de membrana que se utilizan
de manera adecuada, según la presente invención, se incluyen
estructuras fusogénicas, por ejemplo, ciertos péptidos y (partes
de) proteínas de recubrimiento viral, por ejemplo, péptidos
derivados de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (véase
en este sentido, por ejemplo, Plank y otros, "The influence of
Endosome-Disruptive Peptides on Gene Transfer Using
Synthetic Virus-Like Gene Transfer Systems"
("La influencia de péptidos disruptores de endosomas en la
transferencia de genes utilizando sistemas sintéticos de
transferencia de genes de tipo virus"), J. Biol. Chem. 269
(1994), 12918-12924).
Otros compuestos útiles, según la presente
invención, son los compuestos desestabilizadores de endosomas, tales
como la cloroquina. Se destaca que la cloroquina se utiliza
solamente en aplicaciones in vitro, debido a su toxicidad
in vivo. Dado que la presente invención está dirigida a
aplicaciones in vivo e in vitro, esta realización
está dentro del alcance de la presente invención.
Los poliacrilatos, poliacrilamidas,
poli(C_{1-4} alquil)acrilatos o
-acrilamidas que se utilizan como transportadores de ADN, según la
presente invención, se conocen de por sí. Esto también afecta a los
métodos de preparación de estos polímeros. Un método preferido de
preparación de estos polímeros es la polimerización radicalaria de
derivados de los ácidos acrílico o (C_{1-4}
alquil)acrílico, por ejemplo, mediante la utilización de
2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) como iniciador, en
un disolvente adecuado, tal como tolueno, acetonitrilo, DMSO, o
THF. Además, se puede utilizar agua como disolvente, sin embargo, en
tal caso, no se puede utilizar AIBN. Las técnicas de preparación
adecuadas se describen en G. Odian, "Principles of
Polymerization" ("Principios de polimerización"), Capítulo 3
"Radical Chain Polymerization" ("Polimerización radicalaria
en cadena"), John Wiley and Sons, Inc. New York (1991), así como
en las referencias a las que hace referencia este manual.
Preferiblemente, la polimerización radicalaria se
lleva a cabo en presencia de un reactivo de transferencia de cadena,
por ejemplo, \beta-mercaptoetanol,
2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético. Los
copolímeros se pueden obtener mezclando los monómeros en las
proporciones y cantidades deseadas y, posteriormente, sometiendo
esta mezcla a polimerización radicalaria.
El método descrito tiene la ventaja adicional de
proporcionar polímeros o copolímeros que contienen grupos
funcionales terminales, tales como grupos OH-,-NH_{2} o COOH.
Estos grupos funcionales se pueden utilizar de manera adecuada en
una etapa de acoplamiento posterior, en la que se introduce un
dispositivo de focalización, tal como un anticuerpo monoclonal, o
una estructura fusogénica.
Los péptidos fusogénicos y las moléculas de
reconocimiento se pueden unir a los
poli(alquil)acrilatos utilizando técnicas conocidas,
por ejemplo, utilizando grupos tiol introducidos en el polímero y
grupos maleimida introducidos en el péptido o molécula de
reconocimiento. El dispositivo de focalización y/o los péptidos
fusogénicos también se pueden acoplar al complejo de
polímero-plásmido a través de la conocida técnica
de acoplamiento avidina-biotina.
Los sistemas de distribución se pueden preparar
fácilmente poniendo en contacto los polímeros y los fragmentos de
ADN en condiciones en las que el polímero está cargado
positivamente, preferiblemente a un pH de 7,2 en un sistema tampón
adecuado (por ejemplo, un tampón de PBS o HEPES) a temperatura
ambiente.
En una realización preferida, los complejos
polímero-polinucleótido se preparan en presencia de
una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente, en
presencia de sucrosa. La adición de una sustancia que aumenta la
viscosidad posibilita la obtención de partículas más pequeñas, tal
como se muestra en el Ejemplo 6.
\global\parskip0.940000\baselineskip
La preparación del sistema de distribución se
completa, normalmente, en un tiempo de complejación de 10 minutos.
La etapa de preparación puede ir seguida de una etapa de separación
en la que el complejo de ADN y polímero se separa del polímero no
enlazado. En una etapa posterior, el complejo que comprende el ADN
y el polímero transportador de la presente invención se puede
liofilizar, preferiblemente, en presencia de un crioprotector
farmacéuticamente aceptable, tal como sucrosa o manitol. El
complejo liofilizado se puede guardar durante un largo periodo de
tiempo.
Tal como se ha comentado, la presente invención
también se refiere a un método de preparación de un sistema de
transfección sintético que comprende poner en contacto fragmentos de
polinucleótido con un poliacrilato o
poli(C_{1-4} alquil)acrilato
catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las
correspondientes acrilamidas, en condiciones en las que el polímero
está cargado positivamente. Preferiblemente, la puesta en contacto
se realiza en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad,
preferiblemente sucrosa. Adicionalmente, la presente invención se
refiere a las partículas de polinucleótido/polímero obtenidas de
esta manera.
Tal como se ha comentado, la presente invención
también se refiere al método de introducción de fragmentos de ADN
en células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos
de ADN con un poliacrilato, una poliacrilamida, un
poli(alquil)acrilato, o una
poli(alquil)acrilamida, y posteriormente, poner en
contacto el sistema de transfección obtenido con las células
diana.
Finalmente, la presente invención se refiere a la
utilización como vehículo de transfección del poliacrilato,
poliacrilamida, poli(C_{1-4}
alquil)acrilato o poli(C_{1-4}
alquil)acrilamida, descritos anteriormente.
El sistema transportador de la presente invención
se puede utilizar en aplicaciones tanto in vivo como en
in vitro.
La presente invención se describirá con más
detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo
1
Se sintetizaron de manera rutinaria homo y
copolímeros de P(DMAEMA) mediante polimerización radicalaria
de DMAEMA, y, opcionalmente, comonómeros, utilizando
2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) como iniciador, en
tolueno como disolvente.
En detalle, el DMAEMA (Fluka, nº de catálogo
64140) se purificó mediante destilación a presión reducida. 5 ml de
DMAEMA purificado se mezclaron con 20 ml de tolueno y se
transfirieron a una botella (volumen 30 ml) que, posteriormente, se
cerró con un septum de goma de silicona y se hizo pasar N_{2}. Se
añadió AIBN (Fluka, nº de catálogo 11630) y la solución de
polimerización se incubó, mientras se agitaba, a 60ºC durante 22
horas.
Se sintetizaron copolímeros de DMAEMA
sustituyendo parte del DMAEMA por otro monómero. Los siguientes
comonómeros se copolimerizaron con DMAEMA:
- metacrilato de metilo (MMA: Fluka, nº de catálogo 64200),
- N-vinil-2-pirrolidona (NVP: Acros, nº de catálogo 1409227), metacrilato de etoxitrietilenglicol (triEGMA; PolySciences, nº de catálogo 18556), y
- monometacrilato de poli(etilenglicol)monometiléter (PEGMA, PolySciences, nº de catálogo 16664).
Para ajustar el peso molecular de los
(co)polímeros, se aplicaron diferentes proporciones de
monómero/iniciador, o más eficazmente, se utilizó un reactivo de
transferencia de cadena (\beta-mercaptoetanol,
2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético). El último
método tiene una ventaja adicional, ya que proporciona
(co)polímeros que contienen un grupo funcional terminal (OH,
NH_{2} o COOH) que se puede utilizar para el acoplamiento
posterior de un dispositivo focalizador (por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal) o estructuras fusogénicas (por ejemplo, péptidos).
Los polímeros se precipitaron en la mezcla de
reacción utilizando un no disolvente adecuado (por ejemplo, éter de
petróleo o dietiléter) y se recogieron mediante filtración. Tras el
secado a presión reducida, los polímeros se disolvieron en agua
ácida acidificada con ácido acético y se dializaron extensivamente
frente a agua para eliminar (trazas de) disolventes orgánicos y
monómero. A continuación, el polímero se recogió mediante
liofilización. Si la reacción de polimerización se realiza en DMSO,
la mezcla se puede verter, simplemente, sobre agua. La mezcla acuosa
se evapora y se liofiliza, según las maneras conocidas.
Los polímeros se caracterizaron por CPG y
RMN.
El análisis por CPG (cromatografía de permeación
en gel) se realizó para determinar los pesos moleculares (relativos
a poliestireno (disolvente THF) o dextrano (disolvente 0,7 M de
NaNO_{3}, 0,1 M de Tris/HCl, pH 7,0 en agua); número promedio,
M_{n} y peso promedio, M_{w}) y la distribución de pesos
moleculares de los homo y copolímeros de P(DMAEMA). El
análisis por RMN (resonancia magnética nuclear) se utilizó para
establecer la composición del copolímero.
En la siguiente tabla se muestran, con más
detalle, las condiciones y los resultados de polimerización.
Ejemplo
2
Se cultivaron células COS (derivadas de células
de riñón de mono Africano, proporcionadas por J.C. Clevers,
Departamento de Inmunología, Hospital Académico de Utrecht) en medio
esencial modificado de Dubelcco (DMEM, Gilbco, nº de catálogo 31885)
que contenía 3,7 g/l de bicarbonato sódico, 0,58 g/l de
L-glutamina y 1 g/l de glucosa y que estaba
complementado con 100 U/ml de penicilina; 100 \mug/ml de
estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B (Gilbco, nº de
catálogo 15240) y un 5% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por
calor (FBS, Bockneck).
Para asegurar un crecimiento de la fase log, las
células se diluyeron dos días antes de la transfección, pasando,
aproximadamente, a un 50% de su máxima densidad. 24 horas antes de
la transfección, estas células se sembraron en 3\cdot10^{4}
células por cm^{2} en placas de 96 pocillos (1,14\cdot10^{4}
células por pocillo).
El plásmido p(CMV.LacZ) se obtuvo de A.
Bout (IntroGene Rijswijk). Este plásmido se describe en Exp. Lung
Res. 19 (1993) 193-202. Este plásmido
contiene el gen LacZ controlado por el promotor/potenciador del
citomegalovirus. Este gen codifica la
\beta-galactosidasa.
El plásmido se propagó en E.coli, se
purificó utilizando un kit de Qiagen 2500 (Qiagen, nº de catálogo
12181) y se diluyó hasta 2 mg/ml con tampón 10 mM Tris/1 mM EDTA
(TE, pH 8). Posteriormente, se guardó a -20ºC
ó 4ºC.
ó 4ºC.
Los sistemas de transfección se prepararon
mediante la incubación del transportador y el plásmido en una
solución tampón (pH 7,2) a temperatura ambiente durante un periodo
de tiempo variable. Se utilizaron los siguientes polímeros,
preparados en el Ejemplo 1:
P(DMAEMA),
P(DMAEMA-co-NVP),
P(DMAEMA-co-MMA),
P(DMAEMA-co-triEGMA),
P(DMAEMA-co-PEGMA). Respecto
a esto, se hace referencia a los esquemas 1 y 2 de los dibujos.
Como transportadores de referencia se utilizaron
dextrano DEAE (Pharmacia, nº de catálogo,
17-0350-01) y
poli-L-lisina (sintetizada a través
de una polimerización de abertura del anillo de
NCA-lisina iniciada con trietilamina en dioxano
seco, esencialmente, según E. R. Blout, J. Am. Chem. Soc. 83,
709-712, 1961; M_{w} = 1,2 10^{5} g/mol).
También se utilizó una formulación lipídica catiónica comercial
(Lipofectina®, Gibco, nº de catálogo 18292).
Con detalle, los polímeros se disolvieron en PBS
(solución salina tamponada con fosfato, NaCl 0,9%, fosfato 10 mM, pH
7,2) en una concentración de 1-2,5 mg/ml y se
diluyeron con medio de transfección (HEPES normal tamponado con RPMI
1640 (Gibco, nº de catálogo 22511) al 2% v/v de FBS y 100 \muM de
cloroquina hasta una concentración de 100 \mug/ml. La solución
madre de plásmido (2 mg/ml; véase anteriormente) se diluyó con
medio de transfección hasta una concentración de 20 \mug/ml.
En un tubo Eppendorf se pipetearon x \mul de
esta solución, se añadieron y \mul de medio de transfección,
seguido de z \mul de solución de polímero; la concentración final
de plásmido varía entre 0 y 5 \mug/ml; de 0 a 200 \mug/ml de
polímero. Se permitió que se formaran los complejos
plásmido/transportador durante 15-60 minutos a
temperatura
ambiente.
ambiente.
Inmediatamente antes de la transfección, se
aspiró el medio de cultivo de las células. Las células se lavaron
con RPMI y se cubrieron con 285 \mul de complejo
plásmido/transportador.
Tras 1-1,5 horas de incubación a
37ºC (5% de CO_{2}, atmósfera humidificada), el medio de
transfección se sustituyó por 100 \mul del medio de cultivo
(37ºC). Los experimentos se realizaron por duplicado, utilizando dos
placas separadas.
Después de 48 horas adicionales de incubación,
una placa se utilizó para establecer la viabilidad y proliferación
celular (ensayo XTT, véase a continuación); la otra placa se
utilizó para determinar el número de células transfectadas (tinción
de \beta-galactosidasa).
Para determinar el número de células
transfectadas, las células se lavaron con 100 \mul de tampón PBS
y, posteriormente, se fijaron con 75 \mul de una solución al
0,25% de glutaraldehído (Fluka, nº de catálogo 49630) en PBS a 4ºC.
Después de un tiempo de incubación de 5 minutos, se eliminó el
fijador y las células se lavaron dos veces con PBS y el incubado
con 50 \mul de una solución de tinción que contenía 1 mg/ml de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
(X-Gal, Gibco, nº de catálogo 15520), ferrocianuro
potásico 5 mM (Merck, nº de catálogo 104984), ferricianuro potásico
5 mM (BDH, nº de catálogo 10204) y cloruro magnésico 2 mM (Merck, nº
de catálogo 5833) en tampón de fosfato sódico 0,2 M (pH 7,4). Tras
la incubación durante 30-50 minutos a 37ºC, las
células se lavaron con PBS (cubiertas con éste, como conservante) y
se examinaron microscópicamente.
Los núcleos transfectados eran claramente
visibles, como manchas azules, utilizando un microscopio. El número
de células transfectadas por pocillo (0,38 cm^{2}) se determinó
mediante recuento.
Para determinar la influencia del complejo
plásmido/transportador sobre la viabilidad y la proliferación
celular, se midió el número de células vivas utilizando un ensayo
colorimétrico XTT, esencialmente, según el protocolo de Boehringer
(Kit de proliferación celular II (XTT), nº de catálogo 1465015).
En cada pocillo se añadieron 50 \mul de una
mezcla de marcaje XTT que contenía 0,3 mg/ml de ácido
3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis(4-metoxi-6-nitro)bencensulfónico
hidrato (XTT, Sigma, nº de catálogo
X4251) y 2,6 \mul/ml de N-metildibenzopiracina metil sulfato (PMS, Sigma, nº de catálogo p9625) en RPMI normal (volumen total 150 \mul). Las células se incubaron durante 1-3 horas (37ºC, 5% CO_{2} y atmósfera humidificada) y el colorante formazan formado se cuantificó espectrofotométricamente utilizando un lector de placas ELISA, midiendo la absorbancia a 490 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Se estableció una curva de calibración con células nuevas (vivas) (0-15*10^{4} células por pocillo) y se utilizó para calcular el número de células viables tras la transfección.
X4251) y 2,6 \mul/ml de N-metildibenzopiracina metil sulfato (PMS, Sigma, nº de catálogo p9625) en RPMI normal (volumen total 150 \mul). Las células se incubaron durante 1-3 horas (37ºC, 5% CO_{2} y atmósfera humidificada) y el colorante formazan formado se cuantificó espectrofotométricamente utilizando un lector de placas ELISA, midiendo la absorbancia a 490 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Se estableció una curva de calibración con células nuevas (vivas) (0-15*10^{4} células por pocillo) y se utilizó para calcular el número de células viables tras la transfección.
Ejemplo
2a
La figura 1 muestra los resultados de un
experimento de transferencia de genes en el que se comparó el
P(DMAEMA) con dos polímeros de transferencia de genes
conocidos (dextrano DEAE y polilisina). En este experimento se fijó
la concentración de plásmido a 1,67 \mul/ml; la concentración de
polímero se varió. A partir de esta figura, se puede concluir que
el P(DMAEMA) es un transportador polimérico mucho mejor para
la transferencia de genes que la p(lys) y el
dextrano-DEAE. El número de células transfectadas en
condiciones óptimas (proporción PDAEMA/plásmido alrededor de 5) es,
aproximadamente, de 700, lo que significa que un
1-2% del número total de células está realmente
transfectado.
La figura 2 muestra el número total de células
vivas en función de la proporción de transportador/plásmido. Se
puede ver claramente que la p(lys) es mucho más citotóxica
que el P(DMAEMA). Solamente se observa marginalmente
citotoxicidad a la concentración de P(DMAEMA) en la que tiene
lugar una transfección óptima. El dextrano-DEAE
tiene una citotoxicidad baja, sin embargo, la eficacia de
transfección de este polímero es baja, comparada con el
P(DMAEMA).
Ejemplo
2b
La figura 3 muestra los resultados de un
experimento de transferencia de genes en el que se compara la
eficacia de dos copolímeros de P(DMAEMA),
P(DMAEMA-co-NVP),
(composición de copolímero DMAEMA/NVP de 0,3 mol/mol y
P(DMAEMA-co-tri-EGMA),
proporción de moles 0,8 mol/mol) con homo P(DMAEMA). La
figura 4 muestra el número total de células vivas en función de la
proporción transportador/plásmido. A partir de estas figuras se
observa que la eficacia de transfección de los copolímeros se
reduce, comparada con el P(DMAEMA). Sin embargo, estos
polímeros también muestran una citotoxicidad sustancialmente
reducida.
Ejemplo
2c
La figura 5 muestra el efecto del suero sobre la
eficacia de transfección de un complejo PDMAEMA/plásmido. Como
referencia, se utilizó Lipofectina®. Se muestra claramente que la
presencia de suero durante la transfección reduce el número de
células transfectadas. Sin embargo, la lipofectina es mucho más
sensible al suero que el P(DMAEMA): con un 2% de suero sólo
se encontraron 10-30 células transfectadas/0,38
cm^{2} (proporción de lipofectina/plásmido 3/1; concentración de
plásmido: 1,6 y 5,0 \mug/ml).
Ejemplo
3
La figura 6 muestra el efecto del número de
células transfectadas en función de la concentración del plásmido.
El plásmido se complejó con P(DMAEMA) a una proporción de
peso fija de plásmido y polímero. Se puede mostrar que hasta una
concentración de plásmido de 15 \mug/ml, una concentración mayor
de complejo plásmido/polímero resultó en un mayor número de células
transfectadas. A concentraciones superiores a los 15 \mug/ml, el
número de células transfectadas disminuye, lo cual está asociado
con un número de células vitales (aproximadamente un 20% de las
células son vitales). La citotoxicidad observada se debe,
probablemente, al polímero libre (= polímero no complejado con el
plásmido).
Ejemplo
4
Se estableció la eficacia de transfección del
P(DMAEMA) con diferentes pesos moleculares (relativos a
dextrano) en células COS (véase el ejemplo 1) y células
OVCAR-3 (Dr. Hamilton, Instituto Nacional del
Cáncer, Bethseda, MD, Estados Unidos, R.C. Hamilton y otros, Cáncer
Res. 43, 5379-5389, 1983). Ambos tipos de células se
cultivaron, tal como se describió en el ejemplo 1. La eficacia de
transfección se normalizó respecto al número de células
transfectadas después de la incubación con plásmido (1,7 \mug/ml
en RPMI) complejado con P(DMAEMA) con un peso molecular
promedio de 156 KDa. Los resultados se muestran en la figura 7. Tal
como se puede observar, los polímeros con un peso molecular superior
a 100 KDa son mejores transfectantes que los polímeros de bajo peso
molecular. Las mediciones de dispersión de luz dinámica mostraron
que estos polímeros de alto peso molecular son mejores agentes de
condensación que los polímeros de bajo peso molecular (proporción
polímero/plásmido 5/1 (peso/peso); véase la figura 8).
Ejemplo
5
Se estableció el efecto de un péptido disruptor
de endosomas sobre complejos P(DMAEMA)/plásmido en células
COS-7, utilizando el protocolo proporcionado en el
ejemplo 1. El péptido utilizado fue el INF4-di
(véase C. Plank y otros, J. Biol. Chem.
12918-12924, 1994).
El M_{w} del P(DMAEMA) era de 360 KDa.
En la siguiente tabla 2 se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La siguiente tabla 3 proporciona el tamaño de
partícula de complejos polímero/plásmido preparados en diferentes
condiciones.
Polímero M_{w} = 360 KDa; tiempo de incubación
de 30 minutos a temperatura ambiente, tamaño de partícula
determinado por difracción de luz dinámica; el plásmido y el
polímero se disolvieron en RPMI o HEPES 20 mM, pH 7,4.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (10)
1. Sistema de transfección sintético que
comprende (a) como transportador, un poliacrilato o
poli(C_{1-4} alquil)acrilato
catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las
correspondientes acrilamidas, y dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4} alquil)acrilato o
correspondientes poliacrilamidas tienen un peso molecular de 1.000 a
500.000 Da; y (b) un plásmido, un elemento de gen, un fragmento de
ADN o un oligonucleótido, y la proporción de peso de (a) respecto a
(b) es de 0,1 a 200.
2. Sistema, según la reivindicación 1, en el que
el transportador es un homo o copolímero de metacrilato de
dimetilaminoetilo.
3. Sistema, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que las partículas condensadas que comprenden el polímero
transportador y los fragmentos de ADN están incluidas en sistemas de
distribución de fármacos, tales como liposomas o hidrogeles.
4. Sistema, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polímero transportador
está acoplado a un dispositivo de focalización.
5. Sistema, según la reivindicación 4, en el que
el dispositivo de focalización es un anticuerpo monoclonal que es
capaz de reconocer una proteína presente en la membrana celular de
la célula diana.
6. Sistema, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polímero transportador
está acoplado a una estructura fusogénica.
7. Método de preparación de un sistema de
transfección sintético que comprende poner en contacto (b)
fragmentos de polinucleótidos con (a) un poliacrilato o
poli(C_{1-4} alquil)acrilato
catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las
correspondientes acrilamidas, tal se como definió en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, y dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4} alquil)acrilato o
correspondientes poliacrilamidas tienen un peso molecular desde
1.000 hasta 500.000 Da, en condiciones en las que el polímero está
cargado positivamente, y la proporción de peso de (a) respecto a (b)
es de 0,1 a 200.
8. Método, según la reivindicación 7, en el que
el contacto se realiza en presencia de una sustancia que aumenta la
viscosidad, preferiblemente sucrosa.
9. Método de introducción de fragmentos de ADN en
células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos de
ADN (b) con (a) un poliacrilato, poliacrilamida,
poli(C_{1-4} alquil)acrilato o
poli(C_{1-4} alquil)acrilamida
catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, teniendo dicho
poliacrilato, poli(C_{1-4}
alquil)acrilato o las correspondientes acrilamidas, un peso
molecular de 1.000 a 500.000 Da, y la proporción de peso de (a)
respecto a (b) es de 0,1 a 200, y posteriormente, poniendo en
contacto el sistema de transfección obtenido con las células
diana.
10. Utilización de un poliacrilato,
poliacrilamida, poli(C_{1-4}
alquil)acrilato o poli(C_{1-4}
alquil)acrilamida catiónico y soluble en agua o dispersable
en agua, teniendo dicho poliacrilato,
poli(C_{1-4} alquil)acrilato o las
correspondientes poliacrilamidas un peso molecular de 1.000 a
500.000 Da, como sistema transportador de ADN.
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