ES2242198T3

ES2242198T3 - Poliacrilatos y poli(alquil) acrilatos cationicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en sistemas de transfeccion sinteticos.

Info

Publication number: ES2242198T3
Application number: ES96935575T
Authority: ES
Inventors: Wilhelmus Everhardus Hennink; Petra Van De Wetering
Original assignee: Octoplus BV
Current assignee: Octoplus BV
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2016-10-25
Also published as: US5985573A; JP3957084B2; AU7342296A; EP0859857A1; DE69634697T2; EP0859857B1; WO1997015680A1; JP2001508641A; ATE294875T1; DE69634697D1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN SISTEMA SINTETICO DE TRANSFECCION O DE BLOQUEO QUE COMPRENDE, COMO PORTADOR, UN POLIACRILATO CATIONICO, SOLUBLE EN AGUA O DISPERSABLE EN AGUA, UNA POLIACRILAMIDA, UN POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO, O UNA POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA. ADEMAS, SE REFIERE A UN METODO PARA INTRODUCIR FRAGMENTOS DE ADN EN CELULAS DIANAS, QUE INCLUYE EL CONTACTO DE ESTOS FRAGMENTOS DE ADN CON UN POLIACRILATO, POLIACRILAMIDA, POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO O POLI (C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA, QUE ESTA AL MENOS PARCIALMENTE SUSTITUIDA CON SUSTITUYENTES CATIONICOS Y PONIENDO A CONTINUACION EL SISTEMA DE TRANSFECCION OBTENIDO CON LAS CELULAS DIANA. FINALMENTE, LA INVENCION IMPLICA EL USO DE UN POLIACRILATO, UNA POLIACRILAMIDA, UN POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILATO, O UNA POLI(C 1 - 6 ALQUIL)ACRILAMIDA, QUE ESTA AL MENOS PARCIALMENTE SUSTITUIDA CON SUSTITUYENTES CATIONICOS COMO UN SISTEMA PORTADOR DE ADN.

Description

Poliacritos y poli(alquil)acrilatos catiónicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en sistemas de transfección sintéticos.

La presente invención se refiere al sector de los sistemas de transfección sintéticos adecuados para la distribución de elementos de genes o fragmentos de ADN en las células, especialmente en células de organismos vivos. Más en particular, la presente invención se refiere a polímeros catiónicos que tienen muchas posibilidades de ser modificados o adaptados con el fin de crear un sistema flexible de distribución de ADN o genes, que se pueda utilizar, por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica.

La terapia génica se ve como un método prometedor para corregir defectos hereditarios o para tratar enfermedades mortales, tales como el cáncer y el SIDA. En la terapia génica, los fragmentos de ácidos nucleicos o elementos de genes se introducen en células diana para compensar un gen que falta o para introducir una nueva funcionalidad en dichas células. Estos fragmentos de ácidos nucleicos o elementos de genes se incorporan, preferiblemente, en plásmidos.

Si los plásmidos reconstruidos se aplican a un organismo de por sí, esto conduce, generalmente, a una baja expresión del gen introducido, o a una ausencia de expresión. Hay tres razones principales para esta baja expresión. Primero, los plásmidos apenas alcanzarán la población celular en la que se van a incorporar, debido a procesos de degradación y eliminación. Segundo, si los plásmidos alcanzan las células diana, no pueden pasar de manera simple la membrana celular, debido a la naturaleza fuertemente polar y al tamaño de los plásmidos. Tercero, si un plásmido invade una célula diana, normalmente, será incluido en un endosoma, que lo convertirá en un lisosoma. En el lisosoma, el plásmido se degradará, de manera que el gen incorporado no puede ser expresado.

Por las razones anteriores, en la terapia génica los plásmidos u otros elementos de genes se complejan con un transportador o vehículo.

En los últimos años se han realizado numerosos esfuerzos en la investigación de sistemas de transfección potencialmente adecuados, de origen viral y no viral (lípidos catiónicos y polímeros catiónicos). Estos sistemas de transfección deberían distribuir el gen o fragmento de ADN deseado en la célula diana y provocar su expresión en un alto grado.

Los vectores virales son muy adecuados, debido a su naturaleza adaptada, para introducir plásmidos en las células diana y evitar la degradación de los plásmidos o la transición de endosomas a lisosomas. Sin embargo, los vectores virales presentan varios inconvenientes importantes. Los vectores virales son capaces de realizar la integración del gen introducido en el ADN cromosómico de la célula diana. La posición donde se efectúa esta integración no se puede predecir (todavía) o controlar, lo que puede implicar, por ejemplo, el riesgo de destrucción de genes esenciales y la activación de oncogenes. Además, actualmente es muy difícil proporcionar vectores virales a escala comercial. Además, los vectores virales provocan, generalmente, una respuesta en el sistema inmune de un organismo vivo, que conducirá a respuestas inmunes contra el sistema de transfección cuando se utilice in vivo. Finalmente, los vectores virales establecen, inherentemente, límites en cuanto al tamaño del elemento de gen a incorporar en la célula diana.

Con el fin de superar las desventajas intrínsecas de los vectores virales, los sistemas de transfección sintéticos ofrecerían buenas perspectivas.

En este sentido, se hace referencia explícita a la investigación llevada a cabo por el grupo de E. Wagner, relacionada con la distribución de genes mediante complejos plásmido-polilisina (Curiel y otros, "Adenovirus Enhancement of Transferrin-Polylysine-Mediated Gene Delivery" ("Incremento de adenovirus de distribución de genes mediada por transferrina-polilisina"), Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991) 8850-8854; Plank y otros, "Gene Transfer into Hepatocytes Using Asialoglycoprotein Receptor Mediated Endocytosis of DNA Complexed with an Artificial Tetra-Antennary Galactose Ligand" ("Transferencia de genes en hepatocitos utilizando la endocitosis de ADN complejado con un ligando de galactosa tetraantenaria artificial mediada por el receptor de la asialoglicoproteína") Bioconj. Chem. 3 (1992) 533-539; Wagner y otros, "Influenza Virus Hemagglutin HA2 N-Terminal Fusogenic Peptides Augment Gene Transfer by Transferrin-Polylysine-DNA Complexes: Toward a Synthetic Virus-like Gene Transfer Vehicle" ("Aumento de la transferencia de genes de péptidos fusogénicos N-terminales de hemaglutinina HA2 del virus de la gripe: hacia un vehículo de transferencia de genes similar a un virus sintético"), Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 7934-7938; y Curiel y otros "Gene transfer to Respiratory Epithelial Cells via the Receptor Mediated Endocytosis Pathway" ("Transferencia de genes a células epiteliales respiratorias a través de la vía de endocitosis mediada por el receptor"), Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, (1992) 247-252). El complejo plásmido-polilisina investigado tras la exposición a ciertas líneas celulares mostró, como mínimo, algo de expresión del gen. Además, se encontró que la eficacia de expresión disminuyó considerablemente debido a la unión de la transferrina con el complejo plásmido-polilisina. La transferrina da lugar a un estrecho contacto célula-complejo con células que comprenden receptores de transferrina; une todo el complejo al receptor de transferrina de las células. Se observó que, posteriormente, una parte, como mínimo, de todo el complejo se incorpora en las células investigadas.

Sin embargo, la eficacia de transfección de estos sistemas de transfección basados en polilisina, así como otros sistemas de transfección sintéticos conocidos, es mucho menor que la eficacia de los vectores virales conocidos.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de transfección sintético eficaz. Con el fin de ser capaz de unir y condensar ADN, por ejemplo, en la forma de un plásmido, en el que se incorpora un elemento de gen, el sistema transportador debería poseer una carga positiva a pH fisiológico.

Actualmente, se ha encontrado que dicho sistema se puede basar en poliacrilatos, poliacrilamidas, poli(C_{1-4}alquil)acrilatos o poli(C_{1-4}alquil)acrilamidas que contienen sustituyentes catiónicos. Más en particular, la presente invención se refiere a un sistema de transfección sintético que comprende (a) como vehículo, un poliacrilato o poli(C_{1-4}alquil)acrilato catiónico soluble en agua o dispersable en agua, o las correspondientes acrilamidas, teniendo dicho poliacrilato, poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las correspondientes acrilamidas un peso molecular desde 1.000 hasta 500.000 Da; y (b) un plásmido, un elemento de gen, un fragmento de ADN o un oligonucleótido, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) se encuentra entre 0,1 y 200.

Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones 2-6.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de un sistema de transfección sintético que comprende poner en contacto (b) fragmentos de polinucleótido con (a) un poliacrilato o poli(C_{1-4}alquil)acrilato catiónico, soluble en agua o dispersable en agua, o las correspondientes poliacrilamidas, tal como se ha definido en el párrafo anterior, teniendo dicho poliacrilato, poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las correspondientes poliacrilamidas un peso molecular desde 1.000 hasta 500.000 Da, bajo condiciones en las que el polímero está cargado positivamente, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) se encuentra entre 0,1 y 200.

En una realización preferida, la puesta en contacto se lleva a cabo en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente sucrosa. Todavía en una realización adicional, la presente invención se refiere a un método de introducción de fragmentos de ADN en células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos de ADN (b) con (a) un poliacrilato, poliacrilamida, poli(C_{1-4}alquil)acrilato o poli(C_{1-4}alquil)acrilamida catiónicos y solubles en agua o dispersables en agua, teniendo dicho poliacrilato, poli(C_{1-4}alquil)acrilato o las correspondientes poliacrilamidas un peso molecular desde 1.000 hasta 500.000 Da, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) se encuen-
tra entre 0,1 y 200, y posteriormente, poniendo en contacto el sistema de transfección obtenido con las células diana.

En otra realización, la presente invención se refiere a la utilización, como sistema transportador de ADN, de un poliacrilato, poli(C_{1-4}alquil)acrilato, poliacrilamida, o poli(C_{1-4}alquil)acrilamida soluble en agua o dispersable en agua, teniendo dicha poliacrilamida, poli(C_{1-4}alquil)acrilamida o las correspondientes acrilamidas un peso molecular de 1.000 a 500.000 Da.

El polímero que forma la base del sistema transportador de la presente invención comprende, esencialmente, un esqueleto de unidades -[-CH_{2}-C(R_{1})(COOR_{2})-]_{n}-, en el que todos los grupos R_{1} pueden ser iguales o diferentes y representan átomos de hidrógeno o grupos alquilo C_{1-4} lineales o ramificados, y en el que todos los grupos R_{2} pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan de manera que la carga neta del polímero corresponde a la carga, como mínimo, del 5% de moles de los grupos catiónicos.

La frase "de manera que la carga neta del polímero corresponde a la carga, como mínimo, del 5% de moles de los grupos catiónicos" significa que, bajo condiciones fisiológicas, como mínimo, el 5% de moles de las unidades tienen un grupo catiónico si las otras unidades son neutras o, como mínimo, un (5 + x)% de moles tiene un grupo catiónico si un x% de moles de las otras unidades tiene un grupo aniónico. Si R_{2} no representa un grupo que sea catiónico en condiciones fisiológicas, se puede seleccionar entre un gran número de grupos diferentes, tales como átomos de hidrógeno, grupos arilo, grupos glicol, grupos alquilo C_{1-6} ramificados o lineales, que pueden estar sustituidos con sustituyentes inertes, tales como átomos de halógenos, etc.

Preferiblemente, los grupos catiónicos R_{2} tienen la fórmula -R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), en la que R_{3} representa un grupo alquileno C_{1-4} o un grupo aromático C_{6}H_{4}, en cuyos grupos los átomos de hidrógeno se pueden sustituir por sustituyentes inertes, y en la que R_{4} y R_{5}, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-4} o un grupo arilo.

Sin embargo, en el esqueleto del polímero puede haber un número restringido de otras unidades diferentes a las unidades -[-CH_{2}-C(R_{1})(COOR_{2})-]_{n}-, tales como unidades de pirrolidona.

En lugar de los grupos acrilato mencionados anteriormente, puede haber presentes grupos acrilamida, preferiblemente grupos con la fórmula C(O)NR_{4}R_{5}.

Con el fin de poder condensar plásmidos, elementos de genes, oligonucleótidos u otros fragmentos de ADN y unirse a ellos, los poliacrilatos, poliacrilamidas, poli(alquil)acrilatos o poli(C_{1-4}alquil)acrilamidas utilizados deben contener, a pH fisiológico, como mínimo, un 5% de moles de grupos catiónicos R_{2} (carga neta) acoplados al esqueleto. En estos casos, la amida de poliacrilato o la amida de poli(alquil)acrilato es capaz de unirse electroestáticamente al ADN y condensar con éste. Además, se observó que dichos complejos de ADN-polímero catiónico son absorbidos en las células diana en una cantidad considerablemente más elevada comparada con los plásmidos de por sí.

Tal como se ha dicho anteriormente en la presente, el grupo catiónico está formado, preferiblemente, por un grupo de fórmula -R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), lo más preferible, por grupos dimetilamino etilo o -(R_{4})(R_{5}) si está acoplado al grupo acrilamida.

Otros sustituyentes catiónicos R_{2} adecuados se derivan, preferiblemente, de grupos orgánicos que poseen un grupo amino. Dichos grupos están cargados positivamente a pH fisiológico. Entre los ejemplos de estos grupos orgánicos se encuentran amino C_{1-10}alcoholes, y amino C_{1-10} alcóxido C_{1-10}alcoholes, así como sus derivados secundarios, terciarios y cuaternarios. Especialmente, se prefieren las aminas terciarias.

Los grupos dimetilamino etilo, así como otras aminas terciarias, estarán, como mínimo, parcialmente protonadas en condiciones fisiológicas, proporcionando una estructura catiónica que es capaz de unir y condensar ADN.

Aunque es importante que el polímero esté cargado positivamente en su totalidad, se prefiere que los sustituyentes R_{2} de las unidades ácido acrílico/(alquil)acrílico o amida en el esqueleto no comprendan totalmente grupos catiónicos. En una realización preferida, parte de las unidades del esqueleto, preferiblemente, como mínimo, un 10% de moles, comprenden otros grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. De esta manera, el sistema de transfección de la presente invención se basa en homopolímeros de acrilatos, acrilamidas, (C_{1-4} alquil)acrilatos o (alquil)acrilamidas, copolímeros que comprenden diferentes unidades de acrilato, acrilamida, (alquil)acrilato o (alquil)acrilamida, y copolímeros de acrilato, acrilamida, (alquil)acrilato o (alquil)acrilamida y otras unidades, tales como metacrilato de metilo, metacrilato de trietilenglicol, y metacrilato de polietilenglicol, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de glicerilo, metacrilato de laurilo, metacrilato de butilo, N-isopropilacrilamida, N-(3-dimetilamino)propil)metacrilamida, etc. Tal como se ha dicho anteriormente en la presente, no es necesario que todas las unidades del esqueleto representen grupos similares a acrilato. Una parte de las unidades puede estar formada por, por ejemplo, N-vinilpirrolidona o acetato de vinilo.

Los copolímeros que contienen unidades de N-isopropilamida tienen un comportamiento LCST (temperatura crítica en solución inferior). Esto significa que el polímero se disuelve bien en agua a una temperatura relativamente baja, mientras que a una temperatura más elevada que la LCST tiene lugar la separación de fases. En este sentido, se hace referencia a H. Fell y otros, Macromolecules 26 (1993), 2496-2500. Los presentes inventores tienen indicaciones de que este comportamiento LCST afecta favorablemente al proceso de condensación de partículas de polímero/plásmido.

De hecho, se obtienen resultados especialmente buenos cuando, como mínimo, un 10% de moles de los sustituyentes R_{2} derivan, esencialmente, de sustituyentes orgánicos hidrofílicos eléctricamente neutros, tales como glicerol, metoxi etoxi etanol y polietilenglicol. Una posible explicación de estos resultados ventajosos es que el plásmido estará unido menos fuertemente al polímero, de manera que se puede disociar más fácilmente en la célula diana. Además, se observa que el PEG evita el reconocimiento de macrófagos.

El polímero utilizado, según la presente invención, es de naturaleza catiónica, y es soluble en agua o dispersable en agua. Más en particular, se obtienen muy buenos resultados si el 5-100% de moles de los sustituyentes R_{2} representa un grupo catiónico y un 95-0% de moles de los sustituyentes R_{2} representa un grupo aniónico o neutro, teniendo en cuenta que la carga neta total debería ser catiónica.

El peso molecular y/o el número de polímeros utilizados se pueden ajustar fácilmente a la naturaleza del plásmido a transportar. Los polímeros con un peso molecular de 1.000 a 500.000 se utilizan como transportadores de ADN.

La proporción de peso de los polímeros transportadores respecto a los fragmentos de ADN parece crítica. Cuando se utilizan proporciones de peso entre 0,1 y 200 se obtienen resultados adecuados; se utiliza una proporción de peso, preferiblemente, entre 1 y 20, lo más preferible, entre 2 y 5. El peso molecular de los polímeros de acrilato o (alquil)acrilato se puede controlar utilizando y manteniendo unas condiciones de reacción adecuadas en el proceso de polimerización. Preferiblemente, el peso molecular de los polímeros catiónicos utilizados, según la presente invención, es superior a 80.000 Da, preferiblemente superior a 100.000 Da, y lo más preferible, superior a 250.000 Da.

El sistema de transfección sintético de la presente invención, que comprende como transportador, como mínimo, un poliacrilato, poliacrilamida, poli(C_{1-4}alquil)acrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilamida catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, comprende, además, un fragmento de ADN, tal como un plásmido, un elemento de gen o un oligonucleótido. Los oligonucleótidos se pueden utilizar como estructuras bloqueadoras, por ejemplo, para controlar la síntesis de proteínas en las células.

Se observa que las partículas condensadas que comprenden el polímero basado en un poliacrilato y los fragmentos de ADN se pueden incluir o incorporar en sistemas conocidos de distribución de fármacos, por ejemplo, en liposomas o hidrogeles.

Los genes a incorporar en sistemas transportadores o vehículos a utilizar en el sistema de transfección sintético son, entre otros, los documentados en:

-: McKusick, V.A. "Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked pheno-types." ("Herencia mendeliana en el hombre, catálogos de fenotipos autosómico dominante, autosómico recesivo y ligado a X"), Octava edición. John Hopkins University Press (1988).

-: Stanbury, J.B., Wyngaarden, J.B., Frederickson, D.S., Goldstein, J.L. y Brown, M.S. "The metabolic basis of inherited disease" ("Base metabólica de la enfermedad hereditaria"). Quinta edición. McGraw-Hill (1993).

Los vehículos a utilizar en las realizaciones de la presente invención incluyen elementos reguladores virales y no virales de la expresión y/o replicación. Estos vehículos son conocidos en el sector.

Los sistemas de transfección adecuados son capaces de reconocer un elemento de gen en la población celular objetivo. De este modo, el sistema de transfección de la presente invención basado en poliacrilato, poliacrilamida, poli(alquil)acrilato o poli(alquil)acrilamida, comprende, preferiblemente, como mínimo, un grupo que reconoce selectivamente proteínas asociadas a la superficie de las células diana. Dichos grupos de reconocimiento o dispositivos de focalización son conocidos por los técnicos y comprenden, por ejemplo, clúster de glicósidos tri y tetra antenario, transferrina u otros elementos de proteínas, anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana celular, ligandos para receptores asociados a la superficie celular y fragmentos de unión de derivados de dichos grupos de reconocimiento, etc. Si, por ejemplo, los grupos de galactosa se acoplan al sistema de poliacrilato o poli(alquil)acrilato de la presente invención, los fragmentos génicos se distribuyen en los hepatocitos a través del receptor de galactosa de los hepatocitos. Además, la presencia de estructuras reconocibles acopladas covalentemente o no covalentemente al polímero parte de un complejo polímero-ADN, facilita la incorporación del fragmento de ADN, por ejemplo, un elemento de gen, en la célula diana.

Además, el sistema de transfección se puede adaptar para permitir que el elemento de gen libere endosomas en el sistema celular. A estas estructuras desestabilizadoras de membrana, en particular fragmentos de polipéptido, se conjugan los sistemas poliméricos catiónicos, solubles en agua o dispersables en agua, de la presente invención. Dichas estructuras desestabilizadoras deberían ser capaces de alterar o desestabilizar los sistemas de membranas endosómicas. Los plásmidos que incorporan un elemento de gen alcanzan así el citoplasma de la célula diana, en la que el elemento de gen se puede expresar en el núcleo. Entre los ejemplos de dichas estructuras desestabilizadoras de membrana que se utilizan de manera adecuada, según la presente invención, se incluyen estructuras fusogénicas, por ejemplo, ciertos péptidos y (partes de) proteínas de recubrimiento viral, por ejemplo, péptidos derivados de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (véase en este sentido, por ejemplo, Plank y otros, "The influence of Endosome-Disruptive Peptides on Gene Transfer Using Synthetic Virus-Like Gene Transfer Systems" ("La influencia de péptidos disruptores de endosomas en la transferencia de genes utilizando sistemas sintéticos de transferencia de genes de tipo virus"), J. Biol. Chem. 269 (1994), 12918-12924).

Otros compuestos útiles, según la presente invención, son los compuestos desestabilizadores de endosomas, tales como la cloroquina. Se destaca que la cloroquina se utiliza solamente en aplicaciones in vitro, debido a su toxicidad in vivo. Dado que la presente invención está dirigida a aplicaciones in vivo e in vitro, esta realización está dentro del alcance de la presente invención.

Los poliacrilatos, poliacrilamidas, poli(C_{1-4} alquil)acrilatos o -acrilamidas que se utilizan como transportadores de ADN, según la presente invención, se conocen de por sí. Esto también afecta a los métodos de preparación de estos polímeros. Un método preferido de preparación de estos polímeros es la polimerización radicalaria de derivados de los ácidos acrílico o (C_{1-4} alquil)acrílico, por ejemplo, mediante la utilización de 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) como iniciador, en un disolvente adecuado, tal como tolueno, acetonitrilo, DMSO, o THF. Además, se puede utilizar agua como disolvente, sin embargo, en tal caso, no se puede utilizar AIBN. Las técnicas de preparación adecuadas se describen en G. Odian, "Principles of Polymerization" ("Principios de polimerización"), Capítulo 3 "Radical Chain Polymerization" ("Polimerización radicalaria en cadena"), John Wiley and Sons, Inc. New York (1991), así como en las referencias a las que hace referencia este manual.

Preferiblemente, la polimerización radicalaria se lleva a cabo en presencia de un reactivo de transferencia de cadena, por ejemplo, \beta-mercaptoetanol, 2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético. Los copolímeros se pueden obtener mezclando los monómeros en las proporciones y cantidades deseadas y, posteriormente, sometiendo esta mezcla a polimerización radicalaria.

El método descrito tiene la ventaja adicional de proporcionar polímeros o copolímeros que contienen grupos funcionales terminales, tales como grupos OH-,-NH_{2} o COOH. Estos grupos funcionales se pueden utilizar de manera adecuada en una etapa de acoplamiento posterior, en la que se introduce un dispositivo de focalización, tal como un anticuerpo monoclonal, o una estructura fusogénica.

Los péptidos fusogénicos y las moléculas de reconocimiento se pueden unir a los poli(alquil)acrilatos utilizando técnicas conocidas, por ejemplo, utilizando grupos tiol introducidos en el polímero y grupos maleimida introducidos en el péptido o molécula de reconocimiento. El dispositivo de focalización y/o los péptidos fusogénicos también se pueden acoplar al complejo de polímero-plásmido a través de la conocida técnica de acoplamiento avidina-biotina.

Los sistemas de distribución se pueden preparar fácilmente poniendo en contacto los polímeros y los fragmentos de ADN en condiciones en las que el polímero está cargado positivamente, preferiblemente a un pH de 7,2 en un sistema tampón adecuado (por ejemplo, un tampón de PBS o HEPES) a temperatura ambiente.

En una realización preferida, los complejos polímero-polinucleótido se preparan en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente, en presencia de sucrosa. La adición de una sustancia que aumenta la viscosidad posibilita la obtención de partículas más pequeñas, tal como se muestra en el Ejemplo 6.

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La preparación del sistema de distribución se completa, normalmente, en un tiempo de complejación de 10 minutos. La etapa de preparación puede ir seguida de una etapa de separación en la que el complejo de ADN y polímero se separa del polímero no enlazado. En una etapa posterior, el complejo que comprende el ADN y el polímero transportador de la presente invención se puede liofilizar, preferiblemente, en presencia de un crioprotector farmacéuticamente aceptable, tal como sucrosa o manitol. El complejo liofilizado se puede guardar durante un largo periodo de tiempo.

Tal como se ha comentado, la presente invención también se refiere a un método de preparación de un sistema de transfección sintético que comprende poner en contacto fragmentos de polinucleótido con un poliacrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilato catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las correspondientes acrilamidas, en condiciones en las que el polímero está cargado positivamente. Preferiblemente, la puesta en contacto se realiza en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente sucrosa. Adicionalmente, la presente invención se refiere a las partículas de polinucleótido/polímero obtenidas de esta manera.

Tal como se ha comentado, la presente invención también se refiere al método de introducción de fragmentos de ADN en células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos de ADN con un poliacrilato, una poliacrilamida, un poli(alquil)acrilato, o una poli(alquil)acrilamida, y posteriormente, poner en contacto el sistema de transfección obtenido con las células diana.

Finalmente, la presente invención se refiere a la utilización como vehículo de transfección del poliacrilato, poliacrilamida, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilamida, descritos anteriormente.

El sistema transportador de la presente invención se puede utilizar en aplicaciones tanto in vivo como en in vitro.

La presente invención se describirá con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

La síntesis de homo y copolímeros de poli(dimetil aminoetil metacrilato) (P(DMAEMA))

Se sintetizaron de manera rutinaria homo y copolímeros de P(DMAEMA) mediante polimerización radicalaria de DMAEMA, y, opcionalmente, comonómeros, utilizando 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) como iniciador, en tolueno como disolvente.

En detalle, el DMAEMA (Fluka, nº de catálogo 64140) se purificó mediante destilación a presión reducida. 5 ml de DMAEMA purificado se mezclaron con 20 ml de tolueno y se transfirieron a una botella (volumen 30 ml) que, posteriormente, se cerró con un septum de goma de silicona y se hizo pasar N_{2}. Se añadió AIBN (Fluka, nº de catálogo 11630) y la solución de polimerización se incubó, mientras se agitaba, a 60ºC durante 22 horas.

Se sintetizaron copolímeros de DMAEMA sustituyendo parte del DMAEMA por otro monómero. Los siguientes comonómeros se copolimerizaron con DMAEMA:

: metacrilato de metilo (MMA: Fluka, nº de catálogo 64200),

: N-vinil-2-pirrolidona (NVP: Acros, nº de catálogo 1409227), metacrilato de etoxitrietilenglicol (triEGMA; PolySciences, nº de catálogo 18556), y

: monometacrilato de poli(etilenglicol)monometiléter (PEGMA, PolySciences, nº de catálogo 16664).

Para ajustar el peso molecular de los (co)polímeros, se aplicaron diferentes proporciones de monómero/iniciador, o más eficazmente, se utilizó un reactivo de transferencia de cadena (\beta-mercaptoetanol, 2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético). El último método tiene una ventaja adicional, ya que proporciona (co)polímeros que contienen un grupo funcional terminal (OH, NH_{2} o COOH) que se puede utilizar para el acoplamiento posterior de un dispositivo focalizador (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o estructuras fusogénicas (por ejemplo, péptidos).

Los polímeros se precipitaron en la mezcla de reacción utilizando un no disolvente adecuado (por ejemplo, éter de petróleo o dietiléter) y se recogieron mediante filtración. Tras el secado a presión reducida, los polímeros se disolvieron en agua ácida acidificada con ácido acético y se dializaron extensivamente frente a agua para eliminar (trazas de) disolventes orgánicos y monómero. A continuación, el polímero se recogió mediante liofilización. Si la reacción de polimerización se realiza en DMSO, la mezcla se puede verter, simplemente, sobre agua. La mezcla acuosa se evapora y se liofiliza, según las maneras conocidas.

Los polímeros se caracterizaron por CPG y RMN.

El análisis por CPG (cromatografía de permeación en gel) se realizó para determinar los pesos moleculares (relativos a poliestireno (disolvente THF) o dextrano (disolvente 0,7 M de NaNO_{3}, 0,1 M de Tris/HCl, pH 7,0 en agua); número promedio, M_{n} y peso promedio, M_{w}) y la distribución de pesos moleculares de los homo y copolímeros de P(DMAEMA). El análisis por RMN (resonancia magnética nuclear) se utilizó para establecer la composición del copolímero.

En la siguiente tabla se muestran, con más detalle, las condiciones y los resultados de polimerización.

1

2

3

Ejemplo 2

Experimento de transfección que compara los polímeros de la presente invención con dextrano DEAE, poli-lisina y Lipofectina®

Se cultivaron células COS (derivadas de células de riñón de mono Africano, proporcionadas por J.C. Clevers, Departamento de Inmunología, Hospital Académico de Utrecht) en medio esencial modificado de Dubelcco (DMEM, Gilbco, nº de catálogo 31885) que contenía 3,7 g/l de bicarbonato sódico, 0,58 g/l de L-glutamina y 1 g/l de glucosa y que estaba complementado con 100 U/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de anfotericina B (Gilbco, nº de catálogo 15240) y un 5% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, Bockneck).

Para asegurar un crecimiento de la fase log, las células se diluyeron dos días antes de la transfección, pasando, aproximadamente, a un 50% de su máxima densidad. 24 horas antes de la transfección, estas células se sembraron en 3\cdot10^{4} células por cm^{2} en placas de 96 pocillos (1,14\cdot10^{4} células por pocillo).

El plásmido p(CMV.LacZ) se obtuvo de A. Bout (IntroGene Rijswijk). Este plásmido se describe en Exp. Lung Res. 19 (1993) 193-202. Este plásmido contiene el gen LacZ controlado por el promotor/potenciador del citomegalovirus. Este gen codifica la \beta-galactosidasa.

El plásmido se propagó en E.coli, se purificó utilizando un kit de Qiagen 2500 (Qiagen, nº de catálogo 12181) y se diluyó hasta 2 mg/ml con tampón 10 mM Tris/1 mM EDTA (TE, pH 8). Posteriormente, se guardó a -20ºC
ó 4ºC.

Los sistemas de transfección se prepararon mediante la incubación del transportador y el plásmido en una solución tampón (pH 7,2) a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo variable. Se utilizaron los siguientes polímeros, preparados en el Ejemplo 1:

P(DMAEMA), P(DMAEMA-co-NVP), P(DMAEMA-co-MMA), P(DMAEMA-co-triEGMA), P(DMAEMA-co-PEGMA). Respecto a esto, se hace referencia a los esquemas 1 y 2 de los dibujos.

Como transportadores de referencia se utilizaron dextrano DEAE (Pharmacia, nº de catálogo, 17-0350-01) y poli-L-lisina (sintetizada a través de una polimerización de abertura del anillo de NCA-lisina iniciada con trietilamina en dioxano seco, esencialmente, según E. R. Blout, J. Am. Chem. Soc. 83, 709-712, 1961; M_{w} = 1,2 10^{5} g/mol). También se utilizó una formulación lipídica catiónica comercial (Lipofectina®, Gibco, nº de catálogo 18292).

Con detalle, los polímeros se disolvieron en PBS (solución salina tamponada con fosfato, NaCl 0,9%, fosfato 10 mM, pH 7,2) en una concentración de 1-2,5 mg/ml y se diluyeron con medio de transfección (HEPES normal tamponado con RPMI 1640 (Gibco, nº de catálogo 22511) al 2% v/v de FBS y 100 \muM de cloroquina hasta una concentración de 100 \mug/ml. La solución madre de plásmido (2 mg/ml; véase anteriormente) se diluyó con medio de transfección hasta una concentración de 20 \mug/ml.

En un tubo Eppendorf se pipetearon x \mul de esta solución, se añadieron y \mul de medio de transfección, seguido de z \mul de solución de polímero; la concentración final de plásmido varía entre 0 y 5 \mug/ml; de 0 a 200 \mug/ml de polímero. Se permitió que se formaran los complejos plásmido/transportador durante 15-60 minutos a temperatura
ambiente.

Inmediatamente antes de la transfección, se aspiró el medio de cultivo de las células. Las células se lavaron con RPMI y se cubrieron con 285 \mul de complejo plásmido/transportador.

Tras 1-1,5 horas de incubación a 37ºC (5% de CO_{2}, atmósfera humidificada), el medio de transfección se sustituyó por 100 \mul del medio de cultivo (37ºC). Los experimentos se realizaron por duplicado, utilizando dos placas separadas.

Después de 48 horas adicionales de incubación, una placa se utilizó para establecer la viabilidad y proliferación celular (ensayo XTT, véase a continuación); la otra placa se utilizó para determinar el número de células transfectadas (tinción de \beta-galactosidasa).

Para determinar el número de células transfectadas, las células se lavaron con 100 \mul de tampón PBS y, posteriormente, se fijaron con 75 \mul de una solución al 0,25% de glutaraldehído (Fluka, nº de catálogo 49630) en PBS a 4ºC. Después de un tiempo de incubación de 5 minutos, se eliminó el fijador y las células se lavaron dos veces con PBS y el incubado con 50 \mul de una solución de tinción que contenía 1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-Gal, Gibco, nº de catálogo 15520), ferrocianuro potásico 5 mM (Merck, nº de catálogo 104984), ferricianuro potásico 5 mM (BDH, nº de catálogo 10204) y cloruro magnésico 2 mM (Merck, nº de catálogo 5833) en tampón de fosfato sódico 0,2 M (pH 7,4). Tras la incubación durante 30-50 minutos a 37ºC, las células se lavaron con PBS (cubiertas con éste, como conservante) y se examinaron microscópicamente.

Los núcleos transfectados eran claramente visibles, como manchas azules, utilizando un microscopio. El número de células transfectadas por pocillo (0,38 cm^{2}) se determinó mediante recuento.

Para determinar la influencia del complejo plásmido/transportador sobre la viabilidad y la proliferación celular, se midió el número de células vivas utilizando un ensayo colorimétrico XTT, esencialmente, según el protocolo de Boehringer (Kit de proliferación celular II (XTT), nº de catálogo 1465015).

En cada pocillo se añadieron 50 \mul de una mezcla de marcaje XTT que contenía 0,3 mg/ml de ácido 3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis(4-metoxi-6-nitro)bencensulfónico hidrato (XTT, Sigma, nº de catálogo
X4251) y 2,6 \mul/ml de N-metildibenzopiracina metil sulfato (PMS, Sigma, nº de catálogo p9625) en RPMI normal (volumen total 150 \mul). Las células se incubaron durante 1-3 horas (37ºC, 5% CO_{2} y atmósfera humidificada) y el colorante formazan formado se cuantificó espectrofotométricamente utilizando un lector de placas ELISA, midiendo la absorbancia a 490 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Se estableció una curva de calibración con células nuevas (vivas) (0-15*10^{4} células por pocillo) y se utilizó para calcular el número de células viables tras la transfección.

Ejemplo 2a

La figura 1 muestra los resultados de un experimento de transferencia de genes en el que se comparó el P(DMAEMA) con dos polímeros de transferencia de genes conocidos (dextrano DEAE y polilisina). En este experimento se fijó la concentración de plásmido a 1,67 \mul/ml; la concentración de polímero se varió. A partir de esta figura, se puede concluir que el P(DMAEMA) es un transportador polimérico mucho mejor para la transferencia de genes que la p(lys) y el dextrano-DEAE. El número de células transfectadas en condiciones óptimas (proporción PDAEMA/plásmido alrededor de 5) es, aproximadamente, de 700, lo que significa que un 1-2% del número total de células está realmente transfectado.

La figura 2 muestra el número total de células vivas en función de la proporción de transportador/plásmido. Se puede ver claramente que la p(lys) es mucho más citotóxica que el P(DMAEMA). Solamente se observa marginalmente citotoxicidad a la concentración de P(DMAEMA) en la que tiene lugar una transfección óptima. El dextrano-DEAE tiene una citotoxicidad baja, sin embargo, la eficacia de transfección de este polímero es baja, comparada con el P(DMAEMA).

Ejemplo 2b

La figura 3 muestra los resultados de un experimento de transferencia de genes en el que se compara la eficacia de dos copolímeros de P(DMAEMA), P(DMAEMA-co-NVP), (composición de copolímero DMAEMA/NVP de 0,3 mol/mol y P(DMAEMA-co-tri-EGMA), proporción de moles 0,8 mol/mol) con homo P(DMAEMA). La figura 4 muestra el número total de células vivas en función de la proporción transportador/plásmido. A partir de estas figuras se observa que la eficacia de transfección de los copolímeros se reduce, comparada con el P(DMAEMA). Sin embargo, estos polímeros también muestran una citotoxicidad sustancialmente reducida.

Ejemplo 2c

La figura 5 muestra el efecto del suero sobre la eficacia de transfección de un complejo PDMAEMA/plásmido. Como referencia, se utilizó Lipofectina®. Se muestra claramente que la presencia de suero durante la transfección reduce el número de células transfectadas. Sin embargo, la lipofectina es mucho más sensible al suero que el P(DMAEMA): con un 2% de suero sólo se encontraron 10-30 células transfectadas/0,38 cm^{2} (proporción de lipofectina/plásmido 3/1; concentración de plásmido: 1,6 y 5,0 \mug/ml).

Ejemplo 3

La figura 6 muestra el efecto del número de células transfectadas en función de la concentración del plásmido. El plásmido se complejó con P(DMAEMA) a una proporción de peso fija de plásmido y polímero. Se puede mostrar que hasta una concentración de plásmido de 15 \mug/ml, una concentración mayor de complejo plásmido/polímero resultó en un mayor número de células transfectadas. A concentraciones superiores a los 15 \mug/ml, el número de células transfectadas disminuye, lo cual está asociado con un número de células vitales (aproximadamente un 20% de las células son vitales). La citotoxicidad observada se debe, probablemente, al polímero libre (= polímero no complejado con el plásmido).

Ejemplo 4

Se estableció la eficacia de transfección del P(DMAEMA) con diferentes pesos moleculares (relativos a dextrano) en células COS (véase el ejemplo 1) y células OVCAR-3 (Dr. Hamilton, Instituto Nacional del Cáncer, Bethseda, MD, Estados Unidos, R.C. Hamilton y otros, Cáncer Res. 43, 5379-5389, 1983). Ambos tipos de células se cultivaron, tal como se describió en el ejemplo 1. La eficacia de transfección se normalizó respecto al número de células transfectadas después de la incubación con plásmido (1,7 \mug/ml en RPMI) complejado con P(DMAEMA) con un peso molecular promedio de 156 KDa. Los resultados se muestran en la figura 7. Tal como se puede observar, los polímeros con un peso molecular superior a 100 KDa son mejores transfectantes que los polímeros de bajo peso molecular. Las mediciones de dispersión de luz dinámica mostraron que estos polímeros de alto peso molecular son mejores agentes de condensación que los polímeros de bajo peso molecular (proporción polímero/plásmido 5/1 (peso/peso); véase la figura 8).

Ejemplo 5

Se estableció el efecto de un péptido disruptor de endosomas sobre complejos P(DMAEMA)/plásmido en células COS-7, utilizando el protocolo proporcionado en el ejemplo 1. El péptido utilizado fue el INF4-di (véase C. Plank y otros, J. Biol. Chem. 12918-12924, 1994).

El M_{w} del P(DMAEMA) era de 360 KDa. En la siguiente tabla 2 se muestran los resultados.

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TABLA 2

4

Ejemplo 6

La siguiente tabla 3 proporciona el tamaño de partícula de complejos polímero/plásmido preparados en diferentes condiciones.

Polímero M_{w} = 360 KDa; tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, tamaño de partícula determinado por difracción de luz dinámica; el plásmido y el polímero se disolvieron en RPMI o HEPES 20 mM, pH 7,4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

5

Claims

1. Sistema de transfección sintético que comprende (a) como transportador, un poliacrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilato catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las correspondientes acrilamidas, y dicho poliacrilato, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o correspondientes poliacrilamidas tienen un peso molecular de 1.000 a 500.000 Da; y (b) un plásmido, un elemento de gen, un fragmento de ADN o un oligonucleótido, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) es de 0,1 a 200.

2. Sistema, según la reivindicación 1, en el que el transportador es un homo o copolímero de metacrilato de dimetilaminoetilo.

3. Sistema, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las partículas condensadas que comprenden el polímero transportador y los fragmentos de ADN están incluidas en sistemas de distribución de fármacos, tales como liposomas o hidrogeles.

4. Sistema, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polímero transportador está acoplado a un dispositivo de focalización.

5. Sistema, según la reivindicación 4, en el que el dispositivo de focalización es un anticuerpo monoclonal que es capaz de reconocer una proteína presente en la membrana celular de la célula diana.

6. Sistema, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polímero transportador está acoplado a una estructura fusogénica.

7. Método de preparación de un sistema de transfección sintético que comprende poner en contacto (b) fragmentos de polinucleótidos con (a) un poliacrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilato catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, o las correspondientes acrilamidas, tal se como definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y dicho poliacrilato, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o correspondientes poliacrilamidas tienen un peso molecular desde 1.000 hasta 500.000 Da, en condiciones en las que el polímero está cargado positivamente, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) es de 0,1 a 200.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que el contacto se realiza en presencia de una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente sucrosa.

9. Método de introducción de fragmentos de ADN en células diana, que comprende poner en contacto estos fragmentos de ADN (b) con (a) un poliacrilato, poliacrilamida, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilamida catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, teniendo dicho poliacrilato, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o las correspondientes acrilamidas, un peso molecular de 1.000 a 500.000 Da, y la proporción de peso de (a) respecto a (b) es de 0,1 a 200, y posteriormente, poniendo en contacto el sistema de transfección obtenido con las células diana.

10. Utilización de un poliacrilato, poliacrilamida, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o poli(C_{1-4} alquil)acrilamida catiónico y soluble en agua o dispersable en agua, teniendo dicho poliacrilato, poli(C_{1-4} alquil)acrilato o las correspondientes poliacrilamidas un peso molecular de 1.000 a 500.000 Da, como sistema transportador de ADN.