ES2255659T3 - Derivado cationico de (alquil) acrilamida, polimero basdo en estos derivados, y sistema de transfeccion que comprende dicho polimero. - Google Patents
Derivado cationico de (alquil) acrilamida, polimero basdo en estos derivados, y sistema de transfeccion que comprende dicho polimero.Info
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Abstract
Polímero basado en un monómero de fórmula (I) CH2=C(R1)-C(O)NH-CH2-CHCH3-O-C(O)-O-CH2-CH2-N(CH3)2 (I) en la que R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6.
Description
Derivado catiónico de (alquil)acrilamida,
polímero basado en estos derivados, y sistema de transfección que
comprende dicho polímero.
La presente invención se refiere al sector de los
sistemas de transfección sintéticos o de bloqueo adecuados para la
distribución de construcciones génicas, fragmentos de ARN o ADN en
las células, especialmente en células de organismos vivos. Más en
particular, la presente invención se refiere a polímeros catiónicos
que son adecuados para utilizarse como sistema de distribución de
ADN, ARN o genes, que se puede utilizar, por ejemplo, en
aplicaciones de terapia génica.
En particular, la presente invención se refiere a
derivados catiónicos de acrilamida, y derivados catiónicos de
(alquil)acrilamida. Además, la presente invención se refiere
a polímeros en base de dichos derivados como monómeros. Además, la
presente invención se refiere a un sistema de transfección que
comprende dicho polímero.
La terapia génica se ve como un método prometedor
para corregir defectos hereditarios o para tratar enfermedades
mortales, tales como el cáncer y el SIDA. En la terapia génica, los
fragmentos de ácidos nucleicos o construcciones génicas se
introducen en células diana para compensar la falta de un gen o para
introducir una nueva funcionalidad en dichas células. Estos
fragmentos de ácidos nucleicos o construcciones génicas se
incorporan, preferiblemente, en plásmidos.
Si los plásmidos reconstruidos se aplican a un
organismo de por sí, esto conduce, generalmente, a una baja
expresión del gen introducido o a una ausencia de expresión. Existen
tres razones principales para esta baja expresión. En primer lugar,
los plásmidos apenas alcanzarán la población de la célula a la que
se van a incorporar debido a procesos de degradación y eliminación.
En segundo lugar, si los plásmidos alcanzan las células diana, no
pueden pasar de manera simple la membrana celular debido a la
naturaleza fuertemente polar y al tamaño de los plásmidos. En
tercer lugar, si un plásmido invade una célula diana, normalmente,
será incluido en un endosoma, que lo convertirá en un lisosoma. En
el lisosoma, el plásmido se degradará, de manera que el gen
incorporado no puede ser expresado.
Por las razones anteriores, en la terapia génica
los plásmidos u otras construcciones génicas se complejan con un
transportador o vehículo.
En los últimos años, se han realizado numerosos
esfuerzos en la investigación de sistemas de transfección
potencialmente adecuados, de origen viral y no viral (lípidos
catiónicos y polímeros catiónicos). Estos sistemas de transfección
deberían distribuir el gen o fragmento de ADN deseado en la célula
diana y provocar su expresión en un alto grado.
La presente invención se refiere a sistemas de
transfección sintéticos, y particularmente a sistemas de
transfección dentro de la familia de los poliacrilatos y
poli(alquil)acrilatos catiónicos y las
correspondientes acrilamidas. Esta familia de polímeros catiónicos
se describe en WO-A-97/15680. Dicha
Solicitud de Patente Internacional muestra un sistema de
transfección sintético basado en poliacrilatos, poliacrilamidas,
poli(alquil C_{1-6})acrilatos o
poli(alquil C_{1-6})acrilamidas que
contienen sustituyentes catiónicos. En general, y más en
particular, a sistemas de transfección solubles en agua o
dispersables en agua, en los que los grupos orgánicos catiónicos se
unen al esqueleto de los poliacrilatos o
poli(alquil)acrilatos o al esqueleto de las
correspondientes acrilamidas.
Preferiblemente, los grupos catiónicos unidos al
grupo carboxilo tienen la fórmula
-R_{3}-N(R_{4})(R_{5}), en la que
R_{3} representa un grupo alquileno C_{1-6} o
puede sustituirse por sustituyentes inertes, y en la que R_{4} y
R_{5}, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo
de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} o un grupo
arilo. En lugar de los grupos acrilato mencionados anteriormente, en
WO-A-97/15680 también puede haber
grupos acrilamida, preferiblemente grupos con la fórmula
C(O)NR_{4}R_{5}.
Más preferiblemente, el grupo catiónico comprende
un grupo dimetilaminoetilo. Los grupos dimetilaminoetilo, así como
otras aminas terciarias, presentes en polímeros de base acrilo,
estarán, como mínimo, parcialmente protonados en condiciones
fisiológicas, dando lugar a una estructura catiónica que es capaz de
unir electroestáticamente estructuras de ácidos nucleicos, tales
como ARN y ADN, y de este modo condensar los ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona una mejora con
respecto a los sistemas de transfección catiónicos conocidos
descritos en WO-A-97/15680 en la que
se proporcionan polímeros para utilizar en sistemas de transfección
en los que los polímeros tienen una velocidad de degradación
elevada en condiciones fisiológicas, y especialmente en un medio
acuoso a una temperatura de 35-39ºC y a un pH de
6,5-8. Esta mejora se consigue mediante un grupo
concreto de derivados catiónicos de poliacrilamida y
poli(alquil)acrilamida.
Particularmente, en un primer aspecto, la
presente invención se refiere a un polímero basado en un monómero de
fórmula (I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de
hidrógeno, o un grupo alquilo C_{1-6}; y
preferiblemente, un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-3}, y más preferiblemente un grupo metilo. En
una realización preferida, el polímero es un
homopolímero.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere al monómero, tal como se ha definido en el párrafo
anterior. En la realización más preferida, el compuesto tiene como
sustituyente R^{1} un grupo metilo; este compuesto se identifica
de aquí en adelante en la presente invención como
HPMA-DMAE.
Este monómero se puede preparar de forma adecuada
mediante una síntesis de dos etapas, en la que en la etapa (i) se
activa el N,N'-dimetilaminoetanol (DMAE) mediante
1,1'-carbonildiimidazol; en la etapa (ii) se hace
reaccionar el alcohol activado con
N-(2-hidroxipropil)-(R^{1}-sustituido)
acrilamida (HPR^{1} A). Este proceso forma un aspecto adicional de
la presente invención.
Se presume que las propiedades de degradación
ventajosas del monómero de la presente invención se atribuyen al
grupo de carbonilo introducido entre el grupo de dimetilaminoetanol
de partida y el compuesto de acrilamida de partida. En el Ejemplo
3, a continuación en la presente invención, se muestran las
características de degradación del HPMA-DMAE. En
los Ejemplos 5 y 6 se muestra la degradación del polímero complejado
con ADN, en los que se utiliza como referencia el comportamiento de
degradación del metacrilato de poli(dimetilaminoetilo)
(p(DMAEMA), uno de los polímeros más preferidos dentro del
alcance de WO-A-97/15680.
Adicionalmente, se muestra que este comportamiento de degradación
se retiene en la forma polimerizada. En la figura 7 se muestra el
posible proceso de degradación. La degradación se basa en la
hidrólisis del enlace
-O-C(O)-O-. Esta hidrólisis
no tiene lugar o sustancialmente no tiene lugar a un pH de
aproximadamente 5 ni en un medio que no favorezca la hidrólisis, tal
como en DMSO.
Por esta razón, el polímero de la presente
invención se puede preparar de forma adecuada mediante la
polimerización radicalaria del monómero de fórmula (I) y,
opcionalmente, otros monómeros (véase a continuación) en un medio
acuoso que tenga un pH de aproximadamente 5,0, pH que se puede
ajustar, por ejemplo, utilizando HCl; o alternativamente en DMSO u
otro disolvente apolar aprótico. Cuando no se utiliza agua como
medio de reacción, un iniciador de polimerización adecuado es el
2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN). En G. Odian,
"Principles of Polymeration" ("Principios de
polimerización"), capítulo 3 "Radical Chain
Polymerization" ("Polimerización radicalaria en
cadena"), John Wiley and Sons, Inc. Nueva York (1991), así como
en las referencias a las que hace referencia este manual, se
describen algunas técnicas de preparación adecuadas.
Preferiblemente, la polimerización radicalaria se
lleva a cabo en presencia de un reactivo de transferencia de
cadena, por ejemplo, \beta-mercaptoetanol,
2-aminoetanotiol o ácido mercaptoacético. Los
copolímeros se pueden obtener mezclando los monómeros en las
proporciones y cantidades deseadas y sometiendo posteriormente esta
mezcla a polimerización radicalaria.
El polímero basado en monómeros de fórmula (I)
puede, como parte del esqueleto del polímero, comprender otros
grupos hidrofóbicos e hidrofílicos. Por lo tanto, la presente
invención comprende tanto homopolímeros de acrilamidas y (alquil
C_{1-6})acrilamidas como copolímeros de
estas amidas, que comprenden diferentes unidades de acrilato,
acrilamida, (alquil)acrilato o (alquil)acrilamida, y
otras unidades, tales como el metacrilato de metilo, metacrilato de
trietilenglicol, y metacrilato de polietilenglicol, metacrilato de
hidroxietilo, metacrilato de glicerilo, metacrilato de laurilo,
metacrilato de butilo, N-isopropilacrilamida,
metacrilato de N-(3-dimetilamino)propilo,
etcétera. Además, no es necesario que todas las unidades del
esqueleto tengan grupos similares a acrilamida. Una parte de las
unidades pueden estar formadas por, por ejemplo,
N-vinilpirrolidona o acetato de vinilo.
En todavía un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a un sistema de transfección sintético que
comprende como vehículo, como mínimo, un polímero de la presente
invención, catiónico y soluble o dispersable en agua, y que
comprende adicionalmente un fragmento de ácido nucleico, tal como un
fragmento de ARN o ADN, por ejemplo, en forma de plásmido,
construcción génica u oligonucleótido. Los oligonucleótidos se
pueden utilizar como estructuras de bloqueo, por ejemplo, para
controlar la síntesis de proteínas, en las células.
El sistema de transfección de la presente
invención se forma mediante la incubación de moléculas de ácido
nucleico y polímeros de la presente invención. Este proceso se
muestra esquemáticamente en la parte izquierda de la figura 8; la
parte derecha de dicha figura 8 muestra la degradación del complejo
en condiciones fisiológicas. Además, la figura 9 muestra la
liberación del ácido nucleico del complejo en una vista
esquemática.
Más en particular, los sistemas de distribución
por sí mismos se pueden preparar fácilmente poniendo en contacto
los polímeros de la presente invención y los fragmentos de ácidos
nucleicos, tales como fragmentos de ADN en las condiciones en las
que el polímero está cargado positivamente, preferiblemente a un pH
de 7,2 en un sistema tampón adecuado (por ejemplo, un tampón de PBS
o HEPES) a temperatura ambiente.
En una realización preferida, los complejos
polímero-polinucleótido se preparan en presencia de
una sustancia que aumenta la viscosidad, preferiblemente en
presencia de sacarosa. La adición de una sustancia que aumenta la
viscosidad posibilita la obtención de partículas más pequeñas.
La preparación del sistema de distribución se
completa, normalmente, en un tiempo de complejación de 10 minutos.
La etapa de preparación puede ir seguida de una etapa de separación
en la que el complejo ácido nucleico-polímero se
separa del polímero no enlazado. En una etapa posterior, el complejo
que comprende el ácido nucleico y el polímero transportador de la
presente invención se puede liofilizar, preferiblemente en
presencia de un crioprotector farmacéuticamente aceptable, tal como
sacarosa o manitol. En las condiciones de liofilización el complejo
se puede guardar durante un largo periodo de tiempo.
Los grupos catiónicos representados en la figura
8 y el esqueleto del polímero no son tóxicos para las células, y se
excretan o por el contrario se eliminan del sistema, en el que los
complejos se utilizan como sistema de transfección.
La proporción en peso de los polímeros
transportadores con respecto a los fragmentos de ácidos nucleicos,
y especialmente con respecto a los fragmentos de ADN o ARN, parece
crítica. Se obtienen resultados adecuados cuando se utilizan
proporciones en peso de polímero con respecto a fragmentos de ácidos
nucleicos entre 0,1 y 200; preferiblemente entre 1 y 20, más
preferiblemente entre 2 y 5. El peso molecular y/o el número de los
polímeros utilizados se pueden ajustar fácilmente a la naturaleza
del plásmido a transportar. Habitualmente, los polímeros que tienen
un peso molecular entre 1.000 y 500.000 se pueden utilizar de forma
adecuada como transportadores de ADN o ARN. Preferiblemente, el
peso molecular de los polímeros catiónicos utilizados según la
presente invención es superior a 80.000 Da, más preferiblemente
superior a 100.000 Da, lo más preferible superior a 250,000 Da. El
peso molecular de los polímeros utilizados en la presente invención
se puede controlar utilizando y manteniendo unas condiciones de
reacción adecuadas en el proceso de polimerización.
Cabe destacar que las partículas condensadas que
comprenden el polímero de la presente invención y los fragmentos de
ácidos nucleicos se pueden incluir o incorporar en sistemas
conocidos de distribución de fármacos, por ejemplo, en liposomas o
hidrogeles.
Los genes a incorporar en los sistemas
transportadores o vehículos a utilizar en el sistema de
transfección sintético son, entre otros, los documentados en:
- -
- Mckusick, V.A., "Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes" ("Herencia mendeliana en el hombre, catálogos de fenotipos de autosómico dominate, autosómico recesivo, ligados a X"). Octava edición. John Hopkins University Press (1988).
- -
- Stanbury, J.B., Wyngaarden, J.B., Frederickson, D.S., Goldstein, J.L. y Brown, M.S., "The metabolic basis of inherited disease" ("La base metabólica de la enfermedad hereditaria"). Quinta edición. McGraw Hill (1983).
Entre los vehículos a utilizar en las
realizaciones de la presente invención se incluyen elementos
reguladores virales y no virales de la expresión y/o
replicación.
Estos vehículos son conocidos en el sector.
Los sistemas de transfección adecuados son
capaces de reconocer una construcción génica en la población
celular objetivo. Por lo tanto, el sistema de transfección de la
presente invención comprende, preferiblemente, como mínimo, un
grupo que reconoce selectivamente las proteínas asociadas a la
superficie de las células diana. Dichos grupos de reconocimiento o
dispositivos de focalización son conocidos por los técnicos en la
materia y comprenden, por ejemplo, clúster de glicósidos tri y
tetra antenarios, transferrina u otras construcciones proteicas,
anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana celular,
ligandos para receptores asociados a la superficie celular y
fragmentos de unión de derivados de dichos grupos de reconocimiento.
Si el sistema de poliacrilamida o
poli(alquil)acrilamida de la presente invención se
acopla a fragmentos génicos transportados, se distribuyen en los
hepatocitos a través del receptor de galactosa de los hepatocitos.
Además, la presencia de estructuras reconocibles acopladas
covalentemente o no covalentemente a la parte de polímero de un
complejo polímero-ácido nucleico, facilita la incorporación del
fragmento de ácido nucleico, por ejemplo, una construcción génica,
en la célula diana.
Además, el sistema de transfección se puede
adaptar para permitir que la construcción génica libere endosomas
en el sistema celular. A estas estructuras desestabilizadoras de
membrana, en particular fragmentos de polipéptidos, se conjugan los
sistemas de polímeros catiónicos y solubles en agua o dispersables
en agua de la presente invención. Esto desestabiliza los sistemas
de membranas endosómicas. Los plásmidos que incorporan una
construcción génica alcanzan así el citoplasma de la célula diana,
en la que la construcción génica se puede expresar en el núcleo.
Algunos ejemplos de dichas estructuras desestabilizadoras de
membrana, que se utilizan de forma adecuada según la presente
invención, son estructuras fusogénicas, por ejemplo, ciertos
péptidos y (partes de) proteínas de recubrimiento viral, por
ejemplo, péptidos derivados de la proteína hemaglutinina del virus
de la gripe (véase en este sentido, por ejemplo, Plank y otros,
"The influence of Endosome-Disruptive Peptides
on Gene Transfer Using Synthetic Virus-Like Gene
Transfer Systems" ("La influencia de los péptidos
disruptivos de endosomas en la transferencia de genes utilizando
sistemas sintéticos de transferencia de genes utilizando sistemas
sintéticos de transferencia de genes de tipo virus"), J. Biol.
Chem. 269 (1994), 12918-12924), y
particularmente el INF-7.
Otros compuestos útiles según la presente
invención son los compuestos desestabilizadores de endosomas, tales
como la cloroquina. Cabe destacar que la cloroquina se utiliza
solamente en aplicaciones in vitro, debido a su toxicidad
in vivo. Dado que la presente invención está dirigida a
aplicaciones in vivo e in vitro, esta realización
está dentro del alcance de la presente invención.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a un método para introducir fragmentos de
ácidos nucleicos en células diana, que comprende poner en contacto
estos fragmentos de ácidos nucleicos con un polímero de la presente
invención y, posteriormente, poner en contacto el sistema de
transfección obtenido con las células
diana.
diana.
El sistema transportador de la presente invención
se puede utilizar en aplicaciones tanto in vivo como in
vitro.
La presente invención se describe adicionalmente
en los dibujos, en los que:
La figura 1 muestra el comportamiento de
degradación del HPMA-DMAE (\ding{169}) y la
correspondiente formación de HPMA (\blacksquare) con el tiempo a
37ºC a pH = 10,0 (A), a pH = 7,4 (B) y a pH 5,0 (C);
la figura 2 muestra la degradación del
p(HPMA-DMAE) con el tiempo a 37ºC y a pH =
7,4;
la figura 3 muestra un número de características
biofísicas de poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE), y particularmente el tamaño de
partícula. (Zave; diámetro promedio Z, determinado mediante
dispersión dinámica de luz (DLS)) (\ding{169}) y potencial zeta
(\blacksquare) en función de la proporción de polímero con
respecto a ADN;
la figura 4 muestra la degradación de poliplejos
basados en p(HPMA-DMAE) a pH = 7,4
(\blacktriangle) y a pH = 5,0 (\blacksquare), así como basados
en p(DMAEMA) (\ding{169}); en la figura 4(A) se
monitoriza el tamaño de partícula; en la figura 4(B) se sigue
la intensidad de señal con el tiempo;
la figura 5 muestra los resultados de
electroforesis en gel de poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) a pH = 7,4 y a pH = 5,0 y de
poliplejos basados en p(DMAEMA) a pH = 7,4, incubados a 37ºC;
banda 1: ADN libre; bandas
2-7: poliplejos basados en p(DMAEMA) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, bandas 8-13: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, y bandas 14-19: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 5,0), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente;
2-7: poliplejos basados en p(DMAEMA) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, bandas 8-13: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 7,4), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente, y bandas 14-19: poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) (pH = 5,0), tiempo de incubación 0, 2, 4, 7, 24 y 48 horas, respectivamente;
la figura 6 muestra la eficacia de transfección
(A) y la toxicidad (B) de poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) sin (\blacksquare) y con
(\blacktriangle) el péptido disruptivo de membrana
INF-7; como referencia se utiliza el
p(DMAEMA) (\ding{169});
la figura 7 muestra la degradación del
p(HPMA-DMAE) en fórmulas químicas;
la figura 8 muestra la complejación de ADN
circular mediante p(HPMA-DMAE) y el proceso
de degradación; y
la figura 9 muestra de forma esquemática la
liberación del ADN tras la degradación del polímero.
A continuación, se describirá la presente
invención basándose en los siguientes ejemplos no limitantes. En
los ejemplos, así como en la descripción anterior, todos los
porcentajes son porcentajes en peso respecto a la composición total,
a menos que se indique lo contrario.
La síntesis del monómero se llevó a cabo en dos
etapas. En la primera etapa se activó el
N,N'-dimetilaminoetanol mediante
1,1'-carbonildiimidazol con un rendimiento bueno del
68% y una pureza buena (> 97% por RMN). En la segunda etapa, la
reacción entre el alcohol activado y la
N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) se
siguió en el tiempo hasta que no se detectó HPMA libre con
^{1}H-RMN.
La polimerización radicalaria del monómero
formado en el Ejemplo 1 se llevó a cabo en una solución acuosa de
HCl 1 M, con el pH ajustado a pH 5 para evitar la degradación del
monómero; y también se formaron polímeros en DMSO con un
rendimiento del 75% (en agua) y 80% (en DMSO). El rendimiento más
elevado en DMSO se puede explicar debido a que en DMSO se evita la
degradación del monómero en un mayor grado. El peso molecular
promedio en peso fue de 160 kDa (en agua) y 63 kDa (en DMSO), el
peso molecular promedio en número fue de 20 kDa (en agua) y 14 kDa
(en DMSO).
La degradación del monómero se siguió mediante
RP-HPLC a 37ºC. Las áreas de pico relativas del
monómero y su producto de degradación HPMA en función del tiempo se
representan en la figura 1(A) para pH 10, 1(B) para
pH 7,4 y 1(C) para pH 5,0. A partir de estas curvas se puede
calcular la vida media del monómero a estos pH, siendo de 1,1 hora,
9,6 horas y 380 horas, respectivamente.
Para comprobar si el polímero formado en el
Ejemplo 2 en agua tenía la misma velocidad de degradación que el
monómero, se siguió por ^{1}H-RMN la degradación
en D_{2}O tamponada con Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} a pH
7,4. La degradación se siguió mediante la integral del pico a 4,8
ppm de HPMA-DMAE, que se desplaza cuando el alcohol
se elimina mediante hidrólisis. La figura 2 muestra la integral del
pico de este protón en función del tiempo. Dado que la degradación
se siguió durante 19 horas, a partir de esta curva se pudo estimar
una vida media de 12 horas. Esta vida media estimada corresponde a
la vida media del monómero a pH 7,4, indicando de este modo que la
velocidad de degradación del polímero es la misma que la del
monómero.
Las propiedades de unión y condensación de ADN
del p(HPMA-DMAE) se examinaron mediante
dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones del potencial zeta en
función de la proporción de polímero con respecto a ADN.
Más en detalle, estas características físicas de
los poliplejos basados en p(HPMA-DMAE) se
examinaron en función de la proporción del
polímero-nitrógeno con respecto a
ADN-fosfato (N/P). El plásmido de ADN, plásmido
pCMVLacZ, que contenía un gen bacterial LacZ precedido por una señal
de localización nuclear bajo el control de un promotor CMV
adquirido de Sanvertech (Heerhugowaard, Holanda), se diluyó en
tampón de HEPES 20 mM, pH 7,4, a una concentración de 75 \mug/l.
Una solución madre del polímero (5 mg/ml) se diluyó en el mismo
tampón a varias concentraciones (7-450 \mug/ml).
Los poliplejos se formaron mediante la adición de 700 \mul de una
solución de polímero a 175 \mul de solución de ADN, se mezclaron
completamente y se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Los diámetros promedio Z de los poliplejos formados se
determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) a 25ºC y las
mediciones del potencial Z se llevaron a cabo tal como ha descrito
Van de Wetering y otros en Bioconjugate Chem. 10 (1999),
589-597. Los diámetros promedio Z de los poliplejos
se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) a 25ºC con
un sistema Malvern 4700 utilizando un láser de ion argón (488 nm)
que funcionaba a 10,4 mW (Unifase) y con un software PCS
(espectrometría de correlación de fotones) para Windows versión
1.34 (Malvern, Reino Unido). Para el análisis de los datos, se
utilizó la viscosidad y el índice de refracción del agua. El
sistema se calibró con una dispersión de poliestireno que contenía
partículas de 100 nm. Para el potencial zeta, se realizaron
mediciones a 25ºC en una celda 5001 con DTS acuoso con una unidad
Zetasizer 2000 (Malvern, Reino Unido) y con un software PCS versión
1.34 (Malvern, Reino Unido). Para la calibración del instrumento,
se utilizó una dispersión de poliestireno con un potencial zeta
conocido.
La figura 3 muestra que cuando se adiciona un
exceso de polímero, el polímero es capaz de condensar ADN en
pequeñas partículas con un tamaño aproximado de 110 nm, dando un
potencial zeta positivo de aproximadamente +19 mV. Esto es
comparable a los poliplejos compuestos de ADN y otros polímeros
catiónicos, tales como
pDMAEMA, pDAMA (polidiaminometacrilato y particularmente poli-(éster 2-[(2-dimetil)aminoetil)-metilamino]-etílico del ácido 2-metacrílico) y polifosfacenos (preparados según el Ejemplo 1 de WO-A-97/07226).
pDMAEMA, pDAMA (polidiaminometacrilato y particularmente poli-(éster 2-[(2-dimetil)aminoetil)-metilamino]-etílico del ácido 2-metacrílico) y polifosfacenos (preparados según el Ejemplo 1 de WO-A-97/07226).
La desestabilización de poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) (preparados tal como se describe
en el Ejemplo 4 (véase a continuación)) se examinó a pH 5,0 y 7,4 a
37ºC mediante dispersión dinámica de luz. La figura 4 representa el
tamaño de partícula de los poliplejos (A) y la intensidad de la
señal (B) en función del tiempo.
Aunque el tamaño de partícula de los poliplejos
basados en p(HPMA-DMAE) a pH 5,0 o pDMAEMA a
pH 7,4 se mantuvieron (casi) igual durante el periodo de tiempo
estudiado, el tamaño de partícula de los poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) a pH 7,4 aumentó de manera
espectacular con el tiempo. Esto indica que el
p(HPMA-DMAE) en realidad se degrada, y que
debido a la disminución de la interacción entre el polímero y el
ADN, las partículas se hacen más grandes. Con el tiempo, la
intensidad de señal también disminuyó a pH 7,4 para el
p(HPMA-DMAE), mientras que permaneció (casi)
igual a pH 5,0 y para el pDMAEMA (figura 4B), indicando de nuevo la
degradación del p(HPMA-DMAE) a pH 7,4 y no a
pH 5,0.
Para investigar si el ADN liberado mediante la
degradación de los poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) se encuentra todavía en su
forma intacta, los poliplejos, preparados según el Ejemplo 4 se
incubaron a 37ºC durante diferentes tiempos y, posteriormente, se
sometieron a electroforesis en gel.
Particularmente, los poliplejos de
p(HPMA-DMAE) y ADN plásmido se formaron
mezclando 10 \mul de solución de plásmido de 200 \mug/ml con 40
\mul de una solución de pHPMA-DMAE, 200 \mug/ml,
que corresponden con una proporción N/P de 5,4 y se incubaron
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto se realizó en HEPES
10 mM a pH 7,4 o acetato sódico 10 mM a pH 5, la fuerza iónica
ajustada a 150 mM con NaCl. Como control, también se examinaron
poliplejos basados en pDMAEMA a pH 7,4. Estas dispersiones de
poliplejo se incubaron posteriormente a 37ºC durante 0, 2, 4, 7, 24
ó 48 horas. Después de enfriarlas hasta temperatura ambiente, se
añadieron 10 \mul del correspondiente tampón y 3 \mul del tampón
de muestra (0,4% (peso/volumen) de azul de bromofenol, EDTA 10 mM,
50% (v/v) de glicerol en agua) a 20 \mul de cada dispersión de
poliplejo. Treinta \mul de estas soluciones se aplicaron a un gel
de agarosa del 0,7% que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio
y se procesaron a 100 V.
La muestra de poliplejos basados en
p(HPMA-DMEA) incubada durante 2 horas a pH
7,4 se perdió aparentemente durante el procesado. La figura 5
muestra los patrones electroforéticos de los poliplejos. Para el
pDMAEMA a pH 7,4 o el p(HPMA-DMAE) a pH 5,0,
todo el ADN permaneció en la ranura de partida, indicando que todo
el ADN estaba todavía complejado con el polímero. A pH 7,4 y 48
horas de incubación, todo el ADN se liberó de los poliplejos
basados en p(HPMA-DMAE), indicando que el
polímero estaba degradado hasta tal punto, que la complejación no
tenía lugar. A las 24 horas y 7 horas de incubación, no se detectó
más ADN. Esto mismo se observó para los poliplejos cuando se
seleccionó una proporción de polímero con respecto a ADN N/P = 3 en
los que se forman agregados grandes, probablemente porque el bromuro
de etidio no es capaz de acceder al ADN. De este modo,
probablemente a estos tiempos, el
p(HPMA-DMAE) estaba parcialmente degradado y
debido a la menor interacción entre el ADN y el polímero se
formaron agregados grandes. Este fenómeno también se describe para
los poliplejos de pEI-ADN en Bieber y otros, J.
Control. Release 82 (2002), 441-454.
La figura 6 muestra la eficacia de la
transfección y la toxicidad de los poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE) en células
CDS-7 en ausencia o presencia del péptido disruptivo
de membrana INF-7 en función de la proporción de
polímero con respecto a ADN.
Más en detalle, los estudios de transfección se
realizaron en células COS-7 utilizando el plásmido
de pCMVLacZ como gen indicador, tal como se describe. Brevemente,
se sembraron placas de 96 pocillos con células a una densidad de 3
x 104/cm, 24 horas antes de la transfección. El día de la
transfección, los poliplejos se prepararon tal como se indica a
continuación: se añadieron 150 \mul de solución de polímero
(varias concentraciones) a 50 \mul de solución de plásmido (50
\mug/ml), y tras la incubación durante 30 minutos a temperatura
ambiente, se añadieron 50 \mul de tampón o bien, solución de
INF-7 (150 \mug/ml) y los poliplejos se incubaron
durante otros 15 minutos antes de la adición a las células. Después
de lavar la células con HBS, se incubaron 100 \mul de dispersión
de poliplejo y 100 \mul del medio de cultivo (con o sin un 10% de
suero) con las células durante 1 hora. Después de eliminar el medio
del poliplejo, se añadió medio de cultivo nuevo y las células se
incubaron durante otras 48 horas. Todos los experimentos de
transfección se realizaron en dos series idénticas en placas de 96
pocillos separadas. Una serie se ensayó para la expresión del gen
indicador (\beta-galactosidasa) mediante un
ensayo colorimétrico ONPG, la otra serie se utilizó para determinar
el número de células viables utilizando un ensayo colorimétrico
XTT. Como referencia se utilizaron poliplejos de pDMAEMA preparados
a la misma concentración de ADN y proporción de N/P de 6. La
actividad de transfección de esta formulación de poliplejo se ajustó
a 1.
El p(HPMA-DMAE) no es
tóxico para las células en todas las concentraciones probadas y es
capaz de transfectar células, en cierto grado, especialmente a
proporciones elevadas de polímero con respecto a ADN. Las bajas
eficacias de transfección pueden ser debidas a la incapacidad de los
poliplejos para escapar del endosoma.
Para incrementar el escape del endosoma se pueden
utilizar péptidos disruptivos de membrana. Cuando se utilizó el
péptido desestabilizador de membrana INF-7 en un
experimento de transfección con poliplejos basados en
p(HPMA-DMAE), se observó un incremento en la
eficacia de transfección. Al mismo tiempo, se observó cierta
toxicidad, pero esta toxicidad es independiente de la proporción de
polímero con respecto a ADN y, por lo tanto, probablemente está
provocada por el péptido.
Claims (9)
1. Polímero basado en un monómero de fórmula
(I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}.
2. Polímero, según la reivindicación 1, que es un
homopolímero.
3. Polímero, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-3}.
4. Polímero, según la reivindicación 3, en el que
R^{1} es un grupo metilo.
5. Compuesto de fórmula (I)
(I)\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
CH_{2}=C(R^{1})-C(O)NH-CH_{2}-CHCH_{3}-O-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-N(CH_{3})_{2}\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong\talloblong
en la que R^{1} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}.
6. Compuesto, según la reivindicación 5, en el
que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-3}.
7. Compuesto, según la reivindicación 6, en el
que R^{1} es un grupo metilo.
8. Método para preparar el compuesto, según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende la
activación del N,N'-dimetilaminoetanol mediante el
1,1'-carbonildiimidazol; y en la siguiente etapa
(ii) el alcohol activado se hace reaccionar con
N-(2-hidroxipropil)-(R^{1}-sustituido)
acrilamida.
9. Sistema de transfección sintético que
comprende, como mínimo, un polímero catiónico soluble en agua o
dispersable en agua, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
como transportador, y que comprende adicionalmente un fragmento de
ácido nucleico.
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