UN VEHÍCULO DE GEN POLIMÉRICO DE POLI-L-LISINA INJERTADA CON
POLIETILENGLICOL CON PORCIÓN DE ENFOQUE HACIA HEPATOCITOS
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/086,072, presentada el día
20 de Mayo de 1998. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una terapia génica. Más particularmente, la invención se refiere a una composición de poli-L-lisina con injerto de polietilenglicol y a una poli-L-lisina injertada con molécula de polietilenglicol que enfoca hepatocitos para la administración de genes a una célula de hepatocito. Hace veinticinco años Friedmann subrayó perspectivas para la terapia génica humana. (T. Friedmann y R. Roblin (1972) Gene
Therapy for Human Genetic Disease? 175 Science 949-955
(1972) . Desde aquel entonces, la terapia génica ha representado un nuevo paradigma para la terapia de enfermedad humana y para la administración de fármacos. El énfasis implícito de la investigación anterior ha sido hacia la determinación de la seguridad de procedimientos de transferencia de genes, colocando frecuentemente la eficacia como una meta secundaria. Un impedimento técnico principal para la transferencia de genes es la falta de un sistema ideal para la administración de genes. Si fuera posible
administrar los genes en las células específicas apropiadas en cantidades suficientes sin efectos colaterales, la terapia génica sería eficaz. Actualmente muy pocos órganos o células pueden ser enfocados específicamente para la administración de genes. Existen muchos protocolos establecidos para la transferencia de genes en células, incluyendo precipitación de fosfato de calcio, electroporación, bombardeo de partículas, administración liposomal, administración por vectores virales, así como administración de gen mediada por receptores. MS Wadhawa, Targeted Gene Delivery with a Low Molecular Weight Glycopeptide Carrier. 6 Bioconj . Chem. 283-291 (1995) . Aun cuando todos estos métodos pueden emplearse para células cultivadas de mamíferos, existen muchas dificultades para introducir genes en células blanco in vivo. Métodos de transfección que emplean vectores retrovirales o adenovirales superan algunas de estas limitaciones. Vectores retrovirales, particularmente han sido empleados exitosamente para introducir genes exógenos en los genomas de células que se dividen activamente de tal manera que se obtienen transformantes estables. D. G. Miller et al., Gene Transfer by Retrovirus Vectors Occurs Only in Cells that are Actively Replicating at the Time of Infection. 10 Mol. Cell Biol. 4239-4242 (1990) . Sistemas de vectores virales involucran frecuentemente la complementación de vectores defectuosos por genes insertados en líneas de células "auxiliares" para
generar el agente infeccioso de transducción. Sin embargo, se sabe que la respuesta inmune del huésped a los adenovirus limita su uso como agente de facilitación de transferencia a una administración única. Para atacar esta limitación, se han empleado péptidos de fusión de la hemaglutinina de virus de influenza para remplazar los adenovirus como agentes líticos endoso ales, pero con éxito limitado. S. Gottschalk et al., A Novel DNA-Peptide Complex for Efficient Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, 3 Gene Ther. 448-457 (1996) . Sin embargo, a pesar de su alta eficiencia de transfección in vitro, la inserción de genes en el genoma de la célula huésped en este método depende de la vía de infección viral. La aplicación de la vía de infección viral en aplicación para terapia génica humana introduce preocupaciones importantes en cuanto a la recombinación de virus endógeno, efectos oncogénicos, así como reacciones inflamatorias o inmunológicas. G Ross et al., Gene Therapy in the United States: A Five-Year Status Report. 7 Hum. Gene Ther., 1781-1790 (1996). Debido a estas preocupaciones, el uso de vectores virales para terapia génica humana ha sido extremadamente limitado. Por otra parte, sistemas de administración de genes no virales como por ejemplo liposomas catiónicos o bien vehículos de gen sintéticos, por ejemplo, poli-L-lisina (PLL), se buscan como alternativas. M.A. Wolfert et al.,
Characterization of Vectors for Gene Therapy Formed by Self-Assembly of DNA with Synthetic Block Co-Poly ers. 7 Hum. Gene. Ther./ 2123-2133 (1996); AV Kabanov & VA Kabanov DNA Complexes with Polycations for the Delivery of Genetic Materials into Cells. 6 Bioconj . Chem., 7-20 (1995). Existen varias ventajas para el uso de terapias génicas basadas en agentes no virales incluyendo su seguridad relativa y su bajo costo de fabricación. La limitación principal de los enfoques basados en plásmidos ha sido tanto la eficiencia de la administración de genes a blancos somáticos importantes (por ejemplo, hígado y pulmón) así como los niveles de expresión de genes in vivo que son menores empleando enfoques no virales que en el caso de los vectores virales. La administración de gen mediada por receptores tiene sus ventajas y -sus limitaciones. J.C. Perales et al., Biochemical and Functional Characterization of DNA Complexes Capable of
Targeting Genes go [sicj Hepatocytes via the
Asialoglycoprotein Receptor. 272 J. Biol. Chem., 7398-7407
(1997). Sus ventajas para su uso en la terapia génica son las siguientes. Primero, el vehículo de administración de genes puede ser diseñado y adecuado para un receptor blanco específico. Segundo, el ADN no tiene que integrarse en el genoma de la célula huésped para ser expresado. Tercero, el sistema de administración es teóricamente no limitado por el tamaño del transgen. Finalmente, la técnica no incluye el uso
de agentes potencialmente infecciosos. Existen también desventajas que deben ser superadas antes del uso rutinario de este procedimiento para terapia génica humana. Por ejemplo, el transgen no se encuentra integrado en los cromosomas de célula huésped, o bien su expresión es transiente. Además, será probablemente necesario someter a los pacientes a varias inyecciones de un gen de interés. Los complejos ADN-ligando son difíciles de preparar y, hasta recientemente, se sabía poco en cuanto a su relación estructura-función. Así mismo, existe solamente una comprensión limitada del proceso biológico involucrado en la transferencia del transgen en la célula y su expresión subsecuente. Estas y otras características de este sistema para terapias de genes han sido revisadas recientemente con detalles. J.C. Perales et al., An Evaluation of receptor-Mediated Gene Transfer Using Synthetic DNA-Ligand Complexes. 226 Eur. J. Biochem., 255-266 (1994). A mediados de los años 1970, se mostró que PLL se condensa con ADN. U.K. Laemmli Characterization of DNA Condensates Induces by Poly (ethylene oxide) and Polylysine. 72 Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 4288-4292 (1975). Desde aquel entonces, PLL modificada con varias sustancias se ha empleado como vehículo para genes. (M.S. Wadhwa et al., Targeted Gene Delivery with a Low Molecular Weight Glycopeptide Carrier. 6 Bioconj . Chem., 283-291 (1995); A. Maruyama et al., (1997)
Nanoparticle DNA Carrier with Poly (L-lysine) Grafter Polysaccharide Copolymer and Poly (D, L-lactic acid). 8 Bioconj . Chem., 735-742; G.Y. Wu, y C.H. Wu, Evidence for Targeted Gene Delivery to Hep G2 Hepatoma Cells in vitro., 27 Biochemistry, 887-892 (1988); P. Midoux et al., Specific Gene Transfer Mediated by Lactosylated Poly-L-Lysine into Hepatoma Cells. 21 Nucleic Acids Res., 871-878 (1993); P. Erbacher et al., Glycosylated Polylysine/DNA Complexes: Gene Transfer Efficiency in Relation with the Size and the Sugar Substitution Level of Glycosylated Polylysines and with the Plasmid Size. 6 Bioconj. Chem., 401-410 (1995). PLL misma puede emplearse como condensado de ADN. U.K. Laemmli, Characterization of DNA Condensates Induces by Poly (ethylene oxide) and Polylysine. 72 Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 72, 4288-4292 (1975)). Sin embargo, el uso de PLL sola como vehículo de administración de genes tiene varias desventajas. Primero, su eficiencia de transfección es muy baja, puesto que PLL no tiene grupo funcional excepto el grupo amina empleado en la neutralización de carga. Así mismo, debido a las cargas negativas de la estructura de fosfato de ADN, un incremento del grado de neutralización de carga del ADN resulta frecuentemente en una condensación extensa y en la separación de la fase de ADN en forma de estructuras compactas insolubles. J.C. Perales et al., Biochemical and Functional Characterization of DNA Complexes
Capable of Targeting Genes go [sic] Hepatocytes via the Asialoglycoprotein Receptor. J. Biol. Chem. 272, 7398-7407 (1997); D.E. Olinset al., Model Nucleoprotein Complexes: Studies on the Interaction of Cationic Homopolypeptides with DNA. 24 J. Mol. Biol., 157-176 (1967); J.T. Shapiro et al., Deoxyribonucleic Acid-Polylysine Complexes. Structure and Nucleotide Specificity. 8 Biochemistry, 3219-3232 (1969) . Tomando en cuenta lo anterior, se observará que el suministro de una composición enfocada de terapia génica y un método para su uso sería un avance significativo en la técnica. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención ofrecer una composición que media de manera eficiente la administración de ADN en una célula blanco. Es un objeto adicional de la presente invención ofrecer una composición biocompatible para la administración eficiente de ADN que provoque la transfección no citotóxica en una célula blanco. Es un objeto adicional de la presente invención ofrecer un método para administrar ADN en una célula blanco. Estos y otros objetos se logran a través de la síntesis de una composición que contiene un miembro de polilisina injertado de manera covalente con un cierto porcentaje de miembros de polietilenglicol, que a su vez están unidos covalentemente sobre una porción de enfoque. Además, esta
composición media la transfección de ADN o porciones de gen en células humanas. Este método de transfección y composición logran estos objetivos mientras presentan una toxicidad celular mínima y una eficiencia de transfección significativamente mejorada. Por consiguiente, polímeros para lograr estos objetos fueron sintetizados mediante el acoplamiento de una porción de enfoque (TM) en un extremo de un polímero de PEG y mediante la unión covalente del otro extremo de TM-PEG sobre el grupo épsilon-amino de PLL. La porción de enfoque es de preferencia una lactosa o una galactosa. El propósito de usar la porción de enfoque es para enfocar células para la administración de genes a las células particulares. La relación entre TM-PEG y PLL puede ajustarse cambiando las condiciones de reacción. El vehículo sintetizado, es decir, TM-PEG-PLL, donde de 5 a 30% de grupos amino el PLL son conjugados con TM-PEG con el resto de los grupos amino permaneciendo como grupos amino libres insustituidos, puede formar un complejo estable y soluble con un ácido nucleico que, a su vez, puede presentar una transfección eficiente. La porción de PEG injertada sobre PLL resultó en una mejor solubilidad y en una citotoxicidad reducida del complejo ácido nucleico/vehículo en comparación con PLL sola. En comparación con PLL sin PEG de conformidad con lo divulgado en la Patente Norteamericana 5,733,762, la PLL
injertada con PEG de esta invención ofrece una alta solubilidad de los complejos formados con ADN en suero fisiológico y medio de cultivo de célula, y previene la precipitación y agregación de los complejos (o bien nanopartículas) que se forman, y por consiguiente puede ser administrado in vivo a niveles de dosificación muy altos. La eficiencia de transfección de gen y la citotoxicidad del sistema TM-PEG-PLL fueron investigados y comparados con los de ADN que forma complejo con PLL sola. Células Hep G2, por ejemplo, fueron transfectadas específicamente con un complejo de plásmido de ADN/Lac-PEG-PLL, lo que indica que la lactosa sirve como porción de enfoque para línea de células de hepatomas. La PEG-PLL de esta invención disminuye también la degradación proteolítica de ADN en el sistema circulatorio y en células, e incrementa la fusión de membranas celulares, mejorando así la eficiencia de transfección. Además, PEG funciona también como un enlazador que conecta la estructura de PLL y la porción de enfoque, incrementando así la eficiencia de enfoque de la administración de ADN a las células enfocadas. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el esquema para la síntesis de Lac-PEG-PLL. La figura 2 es una representación de una ilustración de análisis 1H-NMR de Lac-PEG-PLL donde el pico en
aproximadamente 3.5 ppm designa la existencia de PEG en la composición. La figura 3 muestra un ensayo de retardo de banda ilustrativo empleando 30% molar de Lac-PEG-PLL. Banda 1 y banda 10: marcador de peso molecular: banda 2: ADN de plásmido (1 µg) ; banda 3: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (1 µg) ; banda 4: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (0.3 µg) ; banda 5: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (0.5 µg) ; banda 6: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (1 µg) ; banda 7: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (3.0 µg) ; banda 8: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (5.0 µg) ; banda 9: ADN de plásmido (1 µg) + Lac-PEG-PLL (10.0 µg) . La figura 4 muestra los resultados de una prueba de solubilidad de pSV-ß-gal de plásmido y en Lac-PEG-PLL. La figura 5 es una representación gráfica que muestra los resultados de experimento de transfección empleando diferentes grados de sustitución de lactosa-PEG. ( ) 6% molar Lac-PEG; ( ) 12% molar Lac-PEG-PLL; ( ) 22% molar Lac-PEG-PLL; (x) 30% molar de Lac-PEG-PLL. La figura 6 muestra una comparación de eficiencia de transfección de LIPOFECTIN, PLL, PEG-g-PLL, Gal-PEG-PLL, y Lac-PEG-PLL como vehículos de gen poliméricos en células Hep G2. La figura 7 muestra una comparación de la citotoxicidad de medio de control, LIPOFECTIN, PLL, PEG-g-PLL, Gal-PEG-PLL, y
Lac-PEG-PLL como vehículos de gen polimérico en células Hep G2. La figura 8 muestra una comparación de eficiencia de transfección de la composición de la presente invención en varias líneas de células; barras sombreadas: células Hep G2; barras sólidas: células NIH3T3; barras punteadas: células A7R5. La figura 9 muestra el efecto de la cantidad de ADN sobre la transfección; barras sombreadas - ADN: composición de polímero es : 1:2; barras sólidas - ADN: composición de polímeros es 1:3. La figura 10 muestra el efecto del tiempo de incubación sobre la eficiencia de la transfección. La figura 11 muestra los efectos del tiempo de incubación sobre la expresión de genes de células transfectadas. La figura 12 muestra otro esquema para la síntesis de Lac-PEG-PLL. La figura 13 muestra el esquema para la síntesis de Gal-PEG-PLL. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de divulgar y describir la composición y método de la presente invención para la administración de genes, se debe entender que esta invención no se limita a las configuraciones, pasos de proceso y materiales particulares divulgados aquí, puesto que tales configuraciones, pasos de
proceso, y materiales pueden variar en alguna medida. Se debe de entender también que la terminología empleada aquí se emplea para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no tiene el propósito de limitar el alcance de la presente invención puesto que el alcance de la presente invención será limitado solamente por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes. Se observará que, como se emplea en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "la" y "el" incluyen referentes plurales a menos ' que el contexto nos indique claramente lo contrario. Esta invención se refiere a una composición capaz de formar complejos solubles estables con ácidos nucleicos y el método de preparación de los mismos que comprende un miembro de polilisina (PLL) unido covalentemente a un miembro de polietilenglicol (PEG-PLL) , que a su vez se encuentra unido covalentemente a una porción de enfoque (TM} , que puede ser reconocida por receptores de membrana celular. Los complejos pueden, al disociarse, liberar el ácido nucleico para transfectar varios tipos de células y la porción de enfoque (TM) hace la transfección selectiva celular que contienen los receptores de la porción de enfoque. Esta invención ofrece también un método para la transfección específica de células in vitro o in vivo. La porción de enfoque es de preferencia una lactosa o una galactosa que enfoca selectivamente una
célula de hepatoma. La invención, en una de sus definiciones más generales, se refiere a un complejo entre por lo menos un ácido nucleico cargado negativamente y por lo menos un conjugado polimérico cargado positivamente, la asociación entre el ácido nucleico y el conjugado polimérico es de naturaleza electrostática, dicho conjugado polimérico cargado positivamente consiste esencialmente de poli-L-lisina (PLL) y PEG, donde aproximadamente de 5 a 30% de NH3+ de la PLL (20-30K peso molecular) se encuentra unido covalentemente a PEG (0.5-20K peso molecular) , que a su vez se encuentra unido también de manera covalente a una porción de enfoque (TM) . El vehículo de gen PEG-PLL de esta invención permite una condensación del ADN que permanece muy fuerte como resultado de un fenómeno de cooperación entre las cargas positivas de la PLL y las cargas negativas del ácido nucleico. Además, la adición de PEG en parte de los grupos amino de la PLL impide la precipitación y agregación de los complejos (o bien nanopartículas) que se forman mediante PEG-PLL y ácido nucleico, incrementando así la solubilidad de los complejos. El PEG enlazado a PLL funciona también para fusionar las membranas celulares y evitar la degradación proteolítica del ácido nucleico, incrementando así la eficiencia de la transfección. Además, puesto que PEG puede servir como enlazador que conecta una estructura de PLL y la porción de enfoque (TM) , incrementa la
eficiencia de enfoque de los complejos. En la composición de esta invención, la porción de enfoque (TM) debería ser cualquier miembro de señal que es reconocida por un receptor de membrana de célula, de preferencia, TM es una galactosa que contiene sacárido que se une específicamente a células hepáticas o bien células de hepatoma. De preferencia, la galactosa que contiene sacárido es un miembro seleccionado dentro del grupo que consiste de lactosa y galactosa. La composición de la presente invención puede formar complejos estables y solubles con ácidos nucleicos que pueden transfectar efectivamente células de mamífero. El ácido nucleico puede seleccionarse entre los siguientes elementos: a) marcadores de gen, por ejemplo gen de luciferasa, gen de ß-galactosidasa, gen de cloranfenicolacetiltransferasa, genes que proporcionan la resistencia a un antibiótico como por ejemplo higromicina o neomicina; b) genes para propósitos terapéuticos tales como el gen que codifica receptores de lipoproteína de baja densidad, deficientes en el caso de la hipercolesterolemia (hígado) , factores de coagulación, genes supresores de tumores, proteínas de histocompatibilidad mayor, antioncogenes, ARN de sentido y antisentido, así como ribozimas; y c) genes para propósitos de vacuna, como por ejemplo genes que codifican antígenos virales. PEG empleado en la presente invención tiene un peso molecular
de 0.5 a 20 K, de preferencia de 0.5 a 5K dalton con unidades repetitivas de 11 a 114. La PLL empleada en la presente invención tiene un peso molecular de 2 a 100 K, de preferencia de 15 a 50 K con unidades repetitivas de 10 a 250. El plásmido que lleva un gen a suministrar fue administrado en células de hígado enfocadas empleando la composición de la presente invención con eficiencia de transfección incrementada, en comparación con la eficiencia de transfección de PLL sola. El plásmido pSV-ß-gal que es una modificación del vector de pRSV-ß-galactosidasa, se emplea frecuentemente como gen marcador para monitorear la expresión de gen en células de mamífero. Promega Co . pSV-fi-galactosidase Control Vector Map and Sequence. TB094 Promega Technical Bulletin 1 (1994). El promotor inicial y realzador SV40 impulsan la transfección del gen lacZ en células de mamífero. La ß-galactosidasa en una enzima reportero excelente. N Rosenthal, (1987) Identification of Regulatory Elements of Cloned Genes with Functional Assays. 152 Methl . 704-720 (1987), y puede ensayarse rápida y directamente en extractos de células empleando un ensayo espectrofotométrico. Se mostró que PLL modificada con lactosa-PEG tiene la capacidad de formar complejos con pSV-ß-gal a partir de ensayos de retardación de banda (figura 3). El desplazamiento de la banda de pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL durante la
electroforesis depende de la relación pSV-ß-gal : Lac-PEG-PLL que altera la carga neta compleja así como de su tamaño y densidad. A.V. Kabanov & VA Kabanov, DNA Complexes with Polycations for the Delivery of Genetic Materials into Cells. 6 Bioconj. Chem., 7-20 (1995). La disminución de la movilidad electroforética del complejo pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL fue acompañado por un incremento del contenido de Lac-PEG-PLL en el sistema, y se debe a la neutralización de la carga negativa de ADN por la carga positiva del vehículo. Se observó también la formación de un complejo ADN-vehículo en un ensayo de desplazamiento de color. Un método para la transfección in vitro o in vivo de la presente invención incluye la introducción de un complejo de ácidos nucleicos y de un vehículo polimérico de PLL injertado con PEG en un medio que contiene células a transfectar en condiciones tales que se observe: el pasaje del complejo desde el medio hacia el citoplasma de las células, la liberación del ácido nucleico del complejo antes mencionado en el citosol de las células, la transcripción y expresión de ácido nucleico en las células transfectadas. Como se mencionó arriba, uno de los problemas de PLL no modificada como vehículo de gen es que la formación de complejos entre PLL y ADN resulta frecuentemente en la formación de precipitados finos, limitando la concentración que puede emplearse. T.D. McKee et al., Preparation of
Asialoorosomucoid-polylysine Conjugates. 5 Bioconj. Chem., 306-311 (1994) . Por consiguiente, la formación de complejos de pSV-ß-gal con PLL en 20 mM HEPES (pH 7.4) con NaCl 0.15 M resultó en precipitados a 50 µg/mL de pSV-ß-gal. Mientras que PEG-g-PLL y TM-PEG-PLL de la presente invención mantuvieron la solubilidad de pSV-ß-gal cuando formaron complejos con ADN en esta concentración. Por consiguiente, es aparente que la porción PEG unida hace que los complejos de vehículo pSV-ß-gal/gen sean sustancialmente más solubles y por consiguiente más funcionales. La invención se refiere también a un proceso para la preparación de la composición de PLL injertado con PEG como vehículo de gen polimérico descrito arriba. Como ejemplos, el proceso para sintetizar Lac-PEG-PLL y Gal-PEG-PLL se describen en las figuras y en los ejemplos 1, 15, y 1 6. La invención se refiere también al uso de un complejo formado por ácido nucleico y el vehículo de gen polimérico de conformidad con "la presente invención para la transfección de células que pueden seleccionarse entre las siguientes: células de cepas hematopoyéticas; células hepáticas; células de músculos esqueletales; células cutáneas tales como fibroblastos, queratinocitos, células dendríticas, o melanocitos; células de las paredes vasculares tales como células endoteliales o bien células de músculo liso; células epiteliales del tracto respiratorio; células del sistema
nervioso central; células de cáncer; células del sistema inmune, como por ejemplo linfocitos, macrófagos, células NK, etc. La capacidad de administración de gen de los vehículos sintetizados Lac-PEG-PLL como ejemplo de la -presente invención y su especificidad fueron investigados. Células Hep G2 fueron seleccionadas para la prueba de especificidad porque tienen receptores de lactosa específicos en su superficie. El reconocimiento de la lactosa es mediada por receptores de lactosa en células hepáticas. L. Stryer, Carbohydrates. Biochemistry (3rd ed.) p. 345, WH Freeman and Company, New York (1988) . Se emplean para la remoción de glicoproteínas de la sangre. Muchas glicoproteínas sintetizadas recientemente como por ejemplo inmunoglobulina y hormonas de péptido, contienen unidades carbohidrato con residuos de galactosa y ácido siálico terminales. Durante horas o días, según la proteína particular, residuos de ácido siálico terminales son removidos por sialilasas en la superficie de vasos sanguíneos. Los residuos de galactosa expuestos de estas proteínas recortadas son detectados por los receptores de asialoglicoproteína en las membranas plasmáticas de células hepáticas. El complejo de la asialoglicoproteína y su receptor es después internalizado en la célula hepática, a través de un proceso de endocitosis, para remover la glicoproteína recortada de la sangre. La
presente divulgación muestra que la porción lactosa en el vehículo puede servir como material de enfoque para la línea de células de hepatoma. Se sintetizó Lac-PEG-PLL a través de un esquema que comprende dos reacciones, la síntesis de lactosa-diácido de PEG y la síntesis de Lac-PEG-PLL de polímero en forma de peine a partir de lactosa-diácido de PEG y PLL (figura 1 y figura 15) . En la primera reacción, cloroformato de isobutilo (IBCF) y un ácido carboxílico en el diácido de PEG formaron un éster activo, y se liberó una molécula de ácido clorhídrico. Se empleó trietanolamina (TEA) como base para neutralizar el ácido clorhídrico que se había formado durante la reacción. El grupo amino en p-aminofenil-alfa-D-lactopiranosido reaccionó con el grupo quetona en PEG, formando una" unión de amida entre el azúcar y PEG. Después de una reacción de 4 horas, los productos fueron precipitados empleando un exceso de éter etílico. Los precipitados fueron después residueltos en agua destilada y dializados empleando una membrana de diálisis, 1,000 MWCO, para remover el p-aminofenil-alfa-D-lactopiranosido sin reaccionar. Una columna con A-Sepharose se empleó para remover PEG sin reaccionar. Lactosa-diácido de PEG fue disociado de la columna con A-Sepharose a través de la aplicación de un amortiguador que contenía metil-alfa-D-manopiranosido 0.1 M a la composición. La fracción lactosa-PEG-lactosa en donde ambos lados de ácido carboxílico del
diácido de PEG habían sido esterificados con una porción de lactosa fue eluida con lactosa-diácido de PEG, pero no se requirió de ninguna purificación adicional, puesto que lactosa-PEG-lactosa no reacciona en las condiciones de la segunda reacción. Así mismo, lactosa-PEG-lactosa fue removido totalmente durante la diálisis en la segunda reacción. En la segunda reacción, IBCF activó el ácido carboxílico en lactosa-PEG, facilitando la formación de un enlace de amida entre el grupo amino en PLL y un ácido carboxílico o éster. Los polímeros Lac-PEG-PLL de esta invención forman un complejo con pSV-ß-gal. El compuesto Lac-PEG-PLL de esta invención hace el complejo soluble, mientras que el complejo entre pSV-ß-gal y PLL solos formó un precipitado fino. El complejo vehículo Lac-PEG-PLL/ADN presenta un incremento de más de 10 veces en cuanto a eficiencia de transfección en comparación con lo que se observa en el caso de un complejo PLL en células Hep G2. Este incremento puede deberse al efecto de enfoque celular de la porción de lactosa, y parcialmente a partir del efecto fusogénico de PEG. El grupo PEG unido permite también que Lac-PEG-PLL y el complejo pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL sea menos citotóxico que PLL. La porción lactosa sirve específicamente como porción de enfoque para la transfección en células de hepatocito. Esto se demostró a través de dos elementos de evidencia. Primero, la lactosa libre inhibió la transfección en concentraciones milimolares.
Segundo, se monitoreó una eficiencia de transfección muy baja cuando se emplearon otras líneas de células deficientes en receptores de lactosa para transfección. La existencia de FBS y cloroquina mejoró la transfección, demostrando adicionalmente que la transfección se realizaba a través de un mecanismo de endocitosis. Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar el proceso de preparación de la composición y método para usar la composición de la presente invención. Ejemplo 1 Síntesis de Lac-diácido PEG La síntesis de lactosa-diácido PEG se efectuó de la siguiente manera. Seiscientos miligramos (1.0 mM) de diácido de PEG
(peso molecular = 600; Fluka, Ronkonkoma, NY) se disolvieron en 1.5 mL de N, N-dimetilformamida seca (DMF; Aldrich) que contenía 1.0 mM de trietilamina (TEA: Aldrich) en un baño de hielo-agua bajo una atmósfera de nitrógeno. Un mM de cloroformato de isobutilo (IBCF; Aldrich) disuelto en 1.0 mL de DMF seca se agregó gota a gota, y la mezcla fue agitada durante 15 minutos en un baño de hielo-agua. IBCF sirvió como el activador del ácido carboxílico. Después p-aminofenil-alfa-D-lactopiranosido (1.0 M; Sigma) disuelto en 1.0 mL de DMF se agregó, y la mezcla fue agitada durante 30 minutos en un baño de hielo-agua y después durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente. El producto fue precipitado en un
exceso de éter seco (25 mL) . Después el precipitado fue disuelto en 20 mL de agua destilada, dializada contra agua destilada (tubo de diálisis con MWCO 1,000; Spectrum; Houston; TX) , y liofilizado. El producto fue purificado mediante la remoción de diácido de PEG sin reaccionar con una columna Con A-Sepharose (Sigma) . Se disolvieron cuarenta miligramos del producto liofilizado en 40 L de amortiguador Tris 0.02 M (pH 7.4), NaCl 0.5 M, 3 mM de CaCl2 y 3 mM de MnC12 y se cargó en una columna Con A-Sepharose a un régimen de flujo de 0.10 mL/min. La columna fue eluida hasta que la absorbencia a 280 nm bajó por debajo de 0.01, y después se aplicó un amortiguador similar pero que contenía metil-alfa-D-manopiranosido (Sigma) 0.1 M. El pico eluido específicamente de la mezcla lactosa-PEG y lactosa-PEG-lactosa fue detectado mediante el monitoreo a 280 nm, recogido, dializado contra agua destilada, y finalmente liofilizado. El contenido de ácido carboxílico fue ensayado por titulación. La relación molar entre lactosa-PEG y lactosa-PEG-lactosa fue de aproximadamente 2:1. Ejemplo 2 Injerto de lactosa-diácido de PEG sobre PLL En este ejemplo, se describe la síntesis de lac-PEG-PLL con lactosa-PEG al 30% (mol/mol%) . Mezcla de lactosa-PEG y lactosa-PEG-lactosa (51.5 mg; que contienen 0.042 m de lactosa-PEG) preparada de conformidad con el procedimiento
del ejemplo 1 fue disuelta en 0.5 mL de DMF seca en una atmósfera de nitrógeno en un baño de hielo-agua. IBCF (0.036 m) disuelto en 0.5 mL de DMF fue agregado a la solución anterior gota a gota. La mezcla fue agitada durante 30 minutos en un baño de hielo-agua y después se agregó gota a gota a 1 mL de dimetiisulfóxido seco (DMSO; Aldrich) que contenía 25 mg de PLL-HBr (120 unidades repetitivas; peso molecular = 25,000; Sigma) y 10 µL de TEA, que había sido purgado con nitrógeno durante 10 minutos en un baño de hielo-agua, y después agitado durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente. El producto fue precipitado en 100 mL de éter seco, y el precipitado fue disuelto en 10 mL de agua destilada. Se sometió a diálisis (tubo de diálisis con MWCO 25,000) contra una solución de NaHC03 0.01 M, y después contra una solución de HCl 0,.01 M, y después contra agua destilada. El producto de dializado fue finalmente liofilizado. Las relaciones molares entre lactosa-PEG y el grupo amina en PLL se calcularon a partir de 1H-NMR. Ejemplo 3 Análisis 1H-NMR de lactosa-PEG-PLL Un análisis 1H-NMR de Lac-PEG-PLL, preparada de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1 y del ejemplo 2 se efectuó en H20. El espectro 1H-NMR de 30% molar Lac-PEG-PLL aparece en la figura 2. El pico a aproximadamente 3.5 ppm es indicativo de la presencia de PEG en las composiciones. El
contenido de PEG fue calculado a partir del espectro de NMR relacionando el pico de PEG (-CH2CH2- . s .3.4- 3.7 ppm) y la cadena lateral del pico de PLL (-CH2CH2 CH2- .m.1.1-1.8 ppm). A partir de este método las proporciones de contenido de lactosa-PEG de cuatro composiciones de vehículo ilustrativas preparadas de conformidad con la presente invención fueron verificadas de la siguiente manera: 6% molar, 12% molar, 20% molar y 30% molar, respectivamente. Ejemplo 4 Caracterización fisicoquímica: ensayo de retardo de banda Se efectuaron experimentos para investigar si la composición Lac-PEG-PLL de conformidad con la presente invención formaba complejos con el ADN de plásmido pSV-ß-gal (Promega Corp. Madison, Wisconsin; No. de acceso EMBL X65335) . Varias cantidades de Lac-PEG-PLL preparada de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1 y 2, dentro de un rango de 0.1 a 10 µg, fueron agregadas a 1 µg de ADN de plásmido ¿= incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregó un amortiguador de muestra de electroforesis en gel a cada muestra, y las muestras fueron después fraccionadas por electroforesis en 1% de gel de agarosa (peso/volumen) durante 90 minutos a 100 V empleando el Sistema de Electroforesis Easy-Cast® (Owl Scientific Inc., Woburn, MA) . Se empleó un amortiguador TBE (45 M de Tris-borato, 1 mM de EDTA, pH 8.0) como amortiguador de electroforesis. El gel fue teñido con
bromuro de etidio (0.5 µg/mL) durante 30 minutos e iluminado con un iluminador de UV para mostrar la ubicación del ADN. Lambda ADN (Promega), que fue digerido por Eco Rl, se empleó como un marcador de tamaño de ADN. Ejemplo 5 Caracterización fisicoquímica: solubilidad La solubilidad de complejo vehiculo/ADN de plásmido fue determinada mediante un método desarrollado por Wadha et al. (MS Madhwa et al., Targeted Gene Delivery with a Low Molecular Weight Glycopeptide Carrier. 6 Bioconj. Chem., 283-291 (1995), con una ligera modificación. El ADN de plásmido pSV-ß-gal y vehículo Lact-PEG-PLL, preparado de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1 y del ejemplo 2 fueron mezclados en 1 mL de amortiguador que contenía 20 mM de HEPES, NaCl 0.15 M, pH 7.4, con una concentración final de 50 µg/mL en tubos de centrifugación de 1.5 mL. Después de incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, los tubos fueron centrifugados durante 5 minutos a 10,000 rpm. El sobrenadante fue tomado y se midió su absorbencia a 260 nm para la determinación del ADN que permanece en la solución. Una muestra de ADN sin vehículo fue empleada como estándar. Complejos comparativos fueron formados mediante la mezcla de ADN ya sea con PLL o bien con PEG-g-PLL (preparado de conformidad con el documento Norteamericano No. de Serie 60/069,351, que se incorpora aquí por referencia).
Complejos ADN de plásmido/vehículo fueron definidos como solubles si la centrifugación en las condiciones seleccionadas no removían el ADN del sobrenadante. La figura 4 muestra que la formación de complejos entre pSV-ß-gal y PLL en una concentración final de 50 µg/mL provoca la formación de un precipitado fino que se sedimentó al someterse a centrifugación a 10,000 rpm durante 5 minutos. Sin embargo, cuando la PLL modificada con PEG fue empleada para preparar el complejo con pSV-ß-gal, aproximadamente el 98% del ADN permaneció en el sobrenadante después de la centrifugación. La modificación del extremo del grupo PEG con una porción de lactosa no proporcionó más que un 10% de disminución de la solubilidad en comparación con la de complejos de pSV-ß-gal/PEG-g-PLL. Así, los grupos PEG situados sobre PLL evitan que los complejos pSV-ß-gal/vehículo formen precipitados finos y se vuelvan insolubles. Ejemplo 6 Transfección La eficiencia de transfección in vitro de Lac-PEG-PLL sintetizado de conformidad con el ejemplo 1 y con el ejemplo 2 fue evaluada empleando una línea de células Hep G2 (No. A TCC HB 8065) . Células Hep G2, una línea de células de hepatoma humano (carcinoma hepático) , que tiene un receptor de lactosa en su superficie. Las células fueron mantenidas en un medio MEM complementado con 1 mM de piruvato de sodio y
10% de FBS (Hyclone, Logan, UT) a una temperatura de 37° C en un incubador Ñapeo® de C02 al 5% (Precisión Scientific Inc., Chicago, IL) . Para experimentos de transfección, se formularon varios complejos pSV-ß-gal/PEG-g-PLL con una cantidad fija de pSV-ß-gal (10 µg/mL) y cantidades crecientes de Lac-PEG-PLL (1-100 µg/mL) . El medio de cultivo celular si FBS fue empleado como medio de mezcla. La transfección in vitro en general fue efectuada de la siguiente manera. Células Hep G2 fueron sembradas en una densidad de 20 x 104 células/mL, 100 µL/pozo, en placas de microensayo de 96 pozos de fondo plano (Falcon Co., Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ) , y dichas células fueron incubadas durante 24 horas antes de la adición ya sea del complejo ADN de plásmido/vehículo o bien del vehículo solamente. Los vehículos Lac-PEG-PLL fueron sonicados durante 6-8 minutos empleando un sonicador de tipo de sonda (Sonifer 250, Branson) antes de la transfección. Todos los reactivos empleados en los experimentos de transfección fueron esterilizados por filtración a través de filtros de membrana de policarbonato de 0.22 µm. Complejos de plásmido pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL fueron preparados mediante la mezcla de 1 µg de pSV-ß-gal y varias cantidades de vehículo en 100 µl de medio de cultivo de célula sin FBS, y fueron incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron FBS y
cloroquina en una concentración final de 10% (volumen/volumen) y 100 µM, respectivamente. El medio de cada pozo de la placa de 96 pozos fue remplazado con 10 µL de mezcla de transfección. Las células fueron después incubadas durante 4 horas a una temperatura de 37° C en un incubador de C02 al 5%. Después de 4 horas, las mezclas de transfección fueron removidas y se agregaron 100 µL de medio fresco que contenía 10% de FBS a cada pozo. Las células fueron incubadas durante 48 horas adicionales a una temperatura de 37° C. Se ensayó la eficiencia de transfección mediante la medición de la actividad ß-galactosidasa introducida en las células por pSV-ß-gal. La actividad ß-galactosidasa en células transfectadas fue determinada de manera espectrofotométrica a 420 nm empleando O-nitrofenil-b-D-galactopiranosido (ONPG; Sigma) con una ligera modificación. J.R. Saneset al., Use of a Recombinant Retrovirus to Study Post-Implantation Cell Lineage in Mouse Embryos. 5 EMBO J., 3133-3142 (1986), que se incorpora aquí por referencia. El medio de crecimiento fue removido de las células en las placas de 96 pozos a ensayar, y las células fueron lavadas cuidadosamente dos veces con IX PBS para evitar el desprendimiento de células adherentes. Las células fueron usadas mediante la adición de 60 µL de IX amortiguador de lisis reportero (Promega, Madison Wl) a las células y mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, sacudiendo la placa a la mitad del
período de incubación, seguido por el raspado de las células. Se agregaron sesenta microlitros de ONPG (1.33 mg/mL) en 2X amortiguador de ensayo (Promega, Madison, Wl) a las células usadas y las células fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 4 horas. La reacción fue terminada mediante la adición de 150 µL de una solución de carbonato de sodio 1 M a cada pozo y la absorbencia a 420 nm fue leída con un lector de microplacas Bio-Tek EL-311 (Bio-Tek Instrument Co., Winooski, VT) para determinar la actividad ß-galactosidasa. Se evaluó la eficiencia de transfección de Lac-PEG-PLL sintetizado empleando una línea de células Hep G2 in vitro. Una célula Hep G2, una línea de células de hepatoma, tiene un receptor de lactosa específico en su superficie. Para los experimentos de transfección, varios complejos pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL fueron formulados con una cantidad fija de pSV-ß-gal
(10 µg/mL) y cantidades crecientes de Lac-PEG-PLL (1-100 µg/mL) . El medio de cultivo de célula sin FBS fue empleado como medio de mezcla. Lac-PEG-PLL mostró capacidad de transfección en células Hep G2 (figura 5). Debajo de una relación ponderal 1:1 de pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL (0.3 o 0.5 mg de vehículo) se observó una eficiencia de transfección muy débil o bien ninguna eficiencia de transfección independientemente del uso de cualquier vehículo lactosilado. En relaciones ponderales ADN/vehículo de 1:2 y 1:3, estos vehículos con la cantidad
más alta de lactosa presentaron una eficiencia más alta. Lac-PEG-PLL 30% molar fue el mejor vehículo entre los 4 vehículos lactosilados ambos en estas relaciones. Aun cuando esta invención no se limita a ninguna explicación científica propuesta, esta eficiencia incrementada puede deberse a la capacidad de enfoque de lactosa hacia células Hep G2, lo que indica una tendencia relativamente diferente del caso de PEG-g-PLL. Como se comentó previamente, PEG-g-PLL 10% molar presentó una eficiencia mayor que PEG-g-PLL 25% molar. Empleando el vehículo Lac-PEG-PLL 30% molar, se logró la mayor eficiencia de transfección en una relación ponderal 1:3, pero la relación ponderal 1:2 reveló transfección de casi la misma magnitud. Se mostró que entre mayor el grado de sustitución de lactosa-PEG en el vehículo, mayor es la cantidad de vehículo que se requiere para lograr la más alta eficiencia de transfección. Cuando se empleó Lac-PEG-PLL 5% molar, un complejo con una proporción 1:1 mostró la mayor eficiencia. En el caso de Lac-PEG-PLL 30% molar, el complejo de proporción 1:3 mostró la mayor eficiencia. Esto puede explicarse por la capacidad del vehículo de gen de formar complejos con pSV-ß-gal. Lac-PEG-PLL sustituido más elevados tiene menos amina libre para interactuar con cargas negativas en el ADN. Por consiguiente, se requiere de más vehículo para hacer un complejo con ADN de la misma magnitud que un Lac-PEG-PLL que contiene una cantidad menor de interacciones de
amina libre. La figura 6 resume los resultados para la transfección empleando PLL y PLL modificada. El reactivo LIPOFECTIN (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) fue empleado para la comparación de eficiencia de transfección. Entre los vehículos empleados en este experimento, PLL, PEG-g-PLL, y Lac-PEG-PLL- y LIPOFECTIN, Lac-PEG_PLL mostró la mejor eficiencia para células Hep G2. Lac-PEG-PLL mostró una eficiencia de transfección mejorada en comparación con PLL y PEG-g-PLL. Entre Lac-PEG-PLLs con proporciones modificadas diferentes, Lac-PEG-PLL 30% molar logró la mayor eficiencia en una relación ponderal 1:3 con relación a PSV-ß-gal. Esto demuestra que la porción lactosa en el extremo de PEG proporciona capacidad de enfoque de células a complejos pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL. Además, la capacidad fusogénica de PEG puede servir como otro factor para el incremento observado de la eficiencia de transfección. Esta aceleración es soportada por el hecho que se sabe que PEG se asocia con el grupo de cabeza de fosfolípido de membranas celulares, ayudando a las proteínas modificadas a penetrar en las membranas celulares. M. Yamazaki & T. Ito, Deformation and Instability in Membrane Structure of Phospholipid Vesicles Caused by Osmophobic Association: Mechanical Stress Model for the Mechanism of Poly (ethylene glycol) -induced fusión. 29 Biochemistry, 1309-
1314 (1990) . Ejemplo 7 Citotoxicidad En este ejemplo, las células Hep G2 fueron transfectadas con pSV-ß-gal/Lac-PEG-PLL de conformidad con los procedimientos del ejemplo 6. Se probaron varios vehículos de genes, empleando una concentración de 3 µg por pozo de una placa de 96 pozos (30 µg/mL en medio de cultivo celular) . Los vehículos de genes fueron incubados durante 4 horas con células a una temperatura de 37° C, y después se determinó la viabilidad celular mediante el método de Y. H. Choi et al, Polyethylene Glyco-grafted Poly-L-Lysine as Polymeric Gene Carrier, J. Control. Reí. (1997), que se incorpora aquí por referencia. La citotoxicidad de los vehículos sintetizados para células Hep G2 aparece en la figura 7. Las células Hep G2 fueron incubadas en presencia de 30 µg/mL de vehículo de gen durante 4 horas. La concentración de 30 µg/mL fue seleccionada debido a que PEG-PLL y Lac-PEG-PLL presentaron su mejor eficiencia de transfección en esta concentración. Para Lac-PEG-PLL, no se observó ninguna citotoxicidad en células Hep G2 mientras que PLL mostró una citotoxicidad moderada a elevada. La diferencia en cuanto a la proporción de sustitución lactosa-PEG no proporcionó ningún cambio significativo en cuanto a viabilidad celular. Mediante la observación microscópica de contraste de fase se soportó
adicionalmente que la incubación de Lac-PEG-PLL con células Hep G2 no tuvo ninguna influencia significativa sobre la viabilidad celular. La incubación de PLL durante 4 horas con las células transformó la morfología celular, pero PEG-g-PLL o Lac-PEG-PLL en la misma concentración y tiempo de incubación no alteraron de manera significativa la morfología celular. Ejemplo 8 Influencia de la cantidad de ADN sobre la transfección La influencia de la cantidad de ADN de plásmido sobre la transfección fue ensayada. La transfección se efectuó de conformidad con el procedimiento de los ejemplos anteriores. Se empleó Lac-PEG-PLL 30% molar. La cantidad de pSV-ß-gal varió de 0.1 a 5 µg. La relación ponderal entre ADN y vehículo fue de 1:2 o 1:3. Las condiciones de transfección incluyeron FBS al 10% y cloroquina 100 M. Después de transfección y cultivo subsecuente durante' 48 horas, las células fueron lisadas y ensayadas para determinar la actividad ß-galactosidasa. Los resultados aparecen en la figura 9 y muestran que 1 µg de ADN de plásmido proporcionó los mejores resultados en estas condiciones. Ejemplo 9 Influencia del tiempo sobre la transfección El efecto del tiempo sobre la transfección se examinó. La transfección fue efectuada de conformidad con el
procedimiento descrito en los ejemplos anteriores. Se empleó Lac-PEG-PLL 30% molar para transformar células Hep G2 con 1 µg de pSV-ß-gal en una relación 1:3 entre plásmido y Lac-PEG-PLL. El tiempo de transfección varió de 0.5 a 6 horas en presencia de FBS al 10% y 100 µM de cloroquina. Después de la transfección, las células fueron incubadas durante 48 horas y después ensayadas para determinar la actividad ß-galactosidasa. Los resultados aparecen en la figura 10 e indican que la mejor eficiencia de transfección fue obtenida con una incubación de 4 horas. Ejemplo 10 Influencia del tiempo sobre la expresión de genes Se empleó ya sea el reactivo LIPOFECTIN o bien Lac-PEG-PLL 30% molar como vehículo para genes. La transfección fue efectuada de conformidad con el procedimiento del ejemplo anterior. La cantidad de pSV-ß-gal fue de 1 µg en una relación 1:3 entre ADN de plásmido y vehículo. Después de 4 horas de incubación con células Hep G2, el medio de transfección fue removido y las células fueron incubadas. En tiempos de 1 a 4 días, las células fueron lisadas y ensayadas para determinar la actividad ß-galactosidasa. Los resultados aparecen en la figura 11 e indican que la presencia de Lac-PEG-PLL fue mucho más eficiente que la presencia del reactivo LIPOFECTI para mediar la transfección en estas condiciones. En el caso de ambos vehículos, la actividad ß-galactosidasa
se elevó con el paso del tiempo. Sin embargo, Lac-PEG-PLL proporcionó una actividad ß-galactosidasa en el día 1 igual a la obtenida con el reactivo LIPOFECTIN en el día 4 de incubación. La expresión fue mantenida durante el período de observación de 96 horas. El mantenimiento de la expresión de genes durante hasta 96 horas es una ventaja de los vehículos de genes de la presente invención para transfección en células cultivadas puesto que dicho vigor de expresión ofrece una ventana durante la cual puede ocurrir manipulación de células transfectadas. Se sabe que la actividad luciferasa transfectada en macrófago humano con PLL manosilado/ADN llegó a un máximo después de solamente 24 horas, disminuyendo después rápidamente hasta un nivel de solamente 2% después de 72 horas. Ejemplo 11 Proceso alternativo de síntesis para Lac-PEG-PLL Una vía alternativa de síntesis para Lac-PEG-PLL se ilustra en la figura 12 y se describe a continuación: 1) síntesis de Lac-diácido de PEG con peso molecular de PEG de 3,400: se disolvieron 1.08 g de amina de tert-butilcarbonato-succinimida de metilcarboxi de polietilenglicol (Shearwater Polymer, Inc.) en 20 L de DMF que contenía 50 mg de TEA y se purgó con nitrógeno. Se agregó 0.14 g (0.33 micro mol) de p-
amino-fenil-lactopiranoide (PAPL, Sigma) y se agitó durante la noche. La DMF, PAPL no alcanzado, hidroxisuccinimida y TEA fueron removidos por diálisis contra agua desionizada con membrana Spectrum con MWCO de 1,000. El producto fue obtenido por liofilización. 2) Síntesis de amino-PEG-Lac: El producto anterior fue disuelto en ácido trifluoroacético que contenía 10% (volume /volumen) de anisol a una temperatura de -5° C purgado con nitrógeno y agitado durante una hora. El producto fue precipitado con éter dietílico y filtrado. El precipitado fue lavado con éter tres veces. Finalmente, el producto fue purificado adicionalmente por diálisis contra agua desionizada con membrana Spectrum con MWCO 1,000. Se obtuvo amino-PEG-Lac mediante liofilización. 3) Síntesis de ácido succínico-PEG-Lac: El amino-PEG-Lac fue convertido en ácido succínico PEG-Lac mediante la reacción de amino-PEG-Lac con anhídrido succínico
(Aldrich). Se disolvió 0.76 g de amino-PEG-Lac en 10 ml de tolueno que contenía 22.0 mg de anhídrido succínico y sometido a reflujo durante 6 horas. El polímero Suc-PEG-Lac fue después precipitado con exceso de éter. El precipitado fue lavado con éter tres veces, finalmente el producto fue secado en vacío durante tres días. Se disolvió 0.39 g de Suc-PEG-Lac en 2 mL de DMF que contenía 12.7 mg de N-hidroxisuccinimida. Después se
agregaron 22.7 mg de DDC y 15 mg de TEA y se agitó durante la noche. El precipitado fue removido por filtración. El producto HOSu-Suc-PEG-Lac fue totalmente secado en vacío durante 2 días. 4) Síntesis de Lac-PEG-PLL: A título de ejemplo, se describió la síntesis de Lac-PEG-PPL con 5% de Lac-PEG. 23.7 mg (0.11 micro mol) de Suc-PEG-Lac disueltos en 0.5 mL de DMSO se agregaron gota a gota a 2 L de DMSO que contenía 25 mg (0.11 micro mol) de PLL en 5 minutos y se agitó durante 5 horas adicionales. El producto fue después dializado contra agua desionizada para remover el DMSO, N-hidroxisuccinimida y PEG no alcanzado mediante el uso de membrana Spectrum con MWCO 25,000 durante 2 días. El producto final fue obtenido por liofilización y almacenado a una temperatura de -20° C. Ejemplo 12 Proceso de síntesis para Gal-PEG-PLL Una vía alternativa de síntesis para Lac-PEG-PLL se ilustra en la figura 13 y se describe a continuación: 1) Síntesis de HOSu-diácido de PEG: Se disolvieron 1.20 g (2.0 micro mol) de diácido de PEG (peso molecular, 600, Fluka, Ronkonloma, NY) en 20 ml de acetato de etilo (Aldrich) a temperatura ambiente. Después se agregaron 69.0 mg (0.6 micro mol) de N-hidroxisuccinimida (Aldrich) y 144.4 mg (0.70 micro mol) de N, N' -diciclohexilcarbonimida
(Aldrich) y 300 µL. La solución anterior fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. Después de la reacción, la diciclohexilurea que se precipitó fue removida por filtración empleando una membrana de filtro Durapore con tamaño de poro de 0.22 µm, y se lavó tres veces con acetato de etilo. El acetato de etilo fue removido por Rotovap en vacío. El residuo fue disuelto en bicloruro de metileno y después el producto de PEG fue precipitado con éter dietílico a una temperatura de -20° C. El precipitado fue recogido por centrifugación a una temperatura de -20° C y mediante decantación del sobrenadante. Finalmente, el HOSu-diácido de PEG fue totalmente secado a temperatura ambiente en vacío durante varios días. 2) Síntesis de Gal-PEG: Se disolvieron 350 mg (0.5 micro mol) de HOSu-diácido de PEG, 107.8 mg (0.5 micro mol) de D (+) -galactosamina (Sigma), 101 mg (1.0 micro mol) de trietilamina (TEA, Aldrich) en 2 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO, Aldrich) a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La galactosamina no alcanzada, DMSO, TEA y N-hidroxisuccinimida fueron removidos mediante precipitación de los derivados de PEG a una temperatura de -70° C y el precipitado fue obtenido por centrifugación. El diácido de PEG producido por hidrólisis de HOSu-PEG fue removido por columna de intercambio de iones. El complejo galactosa-PEG (Gal-PEG) fue purificado adicionalmente contra
agua desionizada y obtenido por liofilización. 3) Injerto de Gal-diácido de PEG sobre PLL: Un proceso de injerto similar de Lac-PEG-PLL descrito en ejemplo 2 se empleó para injertar Gal-diácido de PEG sobre PLL. Los ejemplos anteriores se presentan solamente para propósitos ilustrativos y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Se pueden efectuar varias modificaciones a los compuestos y métodos de la presente invención sin salirse del espíritu o alcance de dicha invención y se entiende que la invención es limitada solamente por lo definido en las reivindicaciones anexas.