KR100553376B1 - 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 분해성이 우수한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Ax-N-By (N=삼차 아민 그룹; x,y=정수; A와 B는 서로 폴리에스테르를 만들 수 있는 작용기, 예를 들면, A=알콜기, B=카르복시기 또는 A=카르복시기, B=알콜기)형태의 단위체로 초가지성 폴리아미노에스테르를 만든 후 표면아민작용기코팅 또는 내부사차아민(quaternary ammonium)화 반응을 통하여 수용액 상에서 다양이온성을 띠는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 관한 것이다. 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 유전자 전달 및 치료에 이용된다.

Description

다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르{Cationic hyperbranched poly(amino ester)}
도 1은 전구체 고분자의 합성도.
도 2는 표면에 일차아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성도.
도 3은 내부에 사차아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성도.
도 4는 [다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체] 형성 실험을 나타내는 사진.(도면 내 숫자는 고분자 5/DNA 사이의 무게비율(w/w).
도 5는 [다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체]를 이용한 세포형질전환 실험 결과.(도면 내 괄호안의 숫자는 고분자 5/DNA 사이의 무게비율(w/w))
도 6은 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 세포독성 완화 실험 결과.
도 7은 표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성도.
도 8은 [표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아 미노에스테르/유전자 복합체] 형성 실험을 나타내는 사진.(Form I, supercoiled DNA; Form II, nicked circular DNA; Form III, linear DNA)
도 9는 Atomic Force Microscope (AFM)을 이용한 [표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체]의 모양과 크기를 결정한 그림 (A: plasmid DNA, B: 복합체).
도 10은 [표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체]를 이용한 세포형질전환 실험 결과.(도면 내 숫자는 고분자/DNA 사이의 무게비율(w/w)).
도 11은 표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 293 세포주와 HepG2 세포주에서의 세포독성 완화 실험 결과 (RCV, Relative cell viability).
도 12는 chloroquine (C)과 nigericin (N)을 이용하여 표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르가 엔도좀 완충 작용을 일으킨다는 것을 증명하는 실험 결과 (Cp/Ca, C가 있을 때의 transfection efficiency(TE)/C가없을 때의 TE; Na/Np, N이 없을 때의 TE/N이 있을 때의 TE).
본 발명은 생체 분해성이 우수한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Ax-N-By (N=삼차 아민 그룹; x,y=정수; A와 B는 서로 폴리에스테르를 만들 수 있는 작용기, 예를 들면, A=알콜기, B=카르복시기 또는 A=카르복시기, B=알콜기)형태의 단위체로 초가지성 폴리아미노에스테르를 만든 후 표면아민작용기코팅 또는 내부사차아민(quaternary ammonium)화 반응을 통하여 수용액 상에서 다양이온성을 띠는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 관한 것이다. 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 유전자 전달 및 치료에 이용된다.
덴드리머(dendrimer) 또는 초가지성 고분자(hyperbranched polymer)등의 다분화성 고분자(highly branched polymer)는 삼차원적인 구조를 가진 새로운 형태의 고분자로 최근 들어 많은 관심을 받아왔다. 이러한 형태의 고분자는 Flory, P. J. (J. Am. Chem. Soc, 1952 74, 2718, Principles of Polymer Chemistry, Cornell University Press, 1953, pp. 361-70)에 의하여 처음으로 논의되었으며, Ax-R-By 형태의 단위체를 고분자화시켜 만든다. 현재 다분화성 고분자는 조합화학 (combinatorial chemistry), 표면코팅(surface coating), 촉매, 유전자 전달, 약물 전달 등 여러 분야에서 응용되고 있다.
초가지성 고분자(hyperbranched polymer)는 Ax-R-By 형태의 단위체를 단일단계 고분자화반응(One-step polymerization)에 의해 합성한다. 합성된 고분자는 가지구조를 가지고 있으며 표면의 작용기는 필요에 따라서, 표면작용기화반응(surface functionalization reaction)을 통하여 변형시킬 수 있 다.
유전자 치료는 새로운 형태의 질병 치료 방법으로써 현재 활발히 연구되고 있다. 유전자 치료를 위해서는 유전자를 효율적으로 세포내부까지 전달시킬 수 있는 유전자 전달물질(gene delivery carrier)이 필요한데, 이러한 것으로는 현재 바이러스(virus), 리포조옴(liposome), 양이온성 리피드(cationic lipid), 양이온성 고분자(cationic polymer)등이 사용되고 있다.
이 중 양이온성 고분자는 여러 가지 다양한 형태가 이용되고 있는데 그 예로는 다음과 같은 것들이 있다. 폴리-L-라이진, 폴리(에틸렌이민), 폴리(2-디메틸아미노)에틸메타크릴레이트(pDMAEMA), 스타버스트 PAMAM 덴드리머, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄브로마이드)(PVP), 폴리(4-히드록시-L-프롤린에스테르)(PHP ester), 폴리[-(4-아미노부틸)-L-글리콜산](PAGA). 이들 중 PHP 에스테르와 PAGA는 고분자 결합이 생분해성을 띠는 에스테르결합으로 되어 있어서, 아주 낮은 세포독성을 나타낸다는 것이 알려져 있다.
상기한 양이온성 고분자의 타 전달시스템(바이러스, 리포조옴, 양이온성 리피드)과 비교되는 장점으로는 대량생산에의 적합성, 낮은 면역반응, 최적화의 용이함 등이 있지만, 아직은 세포독성 그리고 유전자 전달효율 측면에서 아직 개선해야 할 여지가 많다.
본 발명의 목적은 생분해성인 에스테르결합으로 되어 있어 생체적합성이 뛰 어나며, 다양이온성을 띠며, 고분자 내부에 다수의 삼차아민 그룹을 가지고 있는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르를 제공하는데 있다. 이에 본 발명자는 Ax-N-By (N= 삼차 아민 그룹; x,y=정수)형태의 폴리에스테르를 만들 수 있는 두 개의 작용기(예를 들면, A=알콜기, B=카르복시기 또는 A=카르복시기, B=알콜기)를 가지는 단위체를 고분자화시켜 일차적인 초가지성 폴리아미노에스테르를 형성시킨 후, 표면작용기화반응으로 고분자 표면에 다수의 일차, 이차, 삼차, 또는 사차 아민그룹을 형성시키거나, 내부의 삼차 아민의 일부 혹은 전부를 사차 아민화시켜 다양이온성을 가지는 유전자 전달 및 치료용 고분자 및 그 제조방법을 개시하고자 한다.
본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 전구체 고분자로부터 만들어진 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르를 포함한다.
(1) 전구체 고분자
(a) 전구체 고분자 1
다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르 전구체(전구체 고분자 1)는 다음의 일반식 1을 만족하는 단위체를 중합반응에 의하여 만들어진 분자량 500~20,000,000의 고분자를 포함한다.
[X(R1)p]qR0N[(R2)mY]2 (1)
상기에서 m과 p는 0 또는 1의 정수이며, q는 1에서 3까지의 정수이다. N은 질소를 의미한다.
상기에서 R0, R1, R2은 알리파틱(aliphatic) 또는 아로마틱(aromatic) 및 이들 유도체로부터 선택되며 바람직하기로는 탄소수 0 내지 20을 포함한다.
상기 X와 Y는 서로 에스테르화 반응을 할 수 있는 작용기이다(예를 들면, X=알콜기, Y=카르복시기, 또는 X=카르복시기, Y=알콜기 등을 포함한다).
상기에서 q가 2 또는 3인 경우 전구체 고분자는 그물모양의 구조를 가지게 된다(도 7참조).
(b) 전구체 고분자 2
또한 본 발명에서의 전구체 고분자는 상기 일반식(1)의 단위체와 중심형성분자(core-forming molecule)를 공중합하여 만든 분자량 1,000~50,000,000의 고분자(전구체 고분자 2a)와, 단위체를 중합한 후 만들어진 고분자(상기한 전구체 고분자 1)와 중심형성분자를 반응시켜 만든 분자량 1,000~50,000,000의 고분자(전구체 고분자 2b)를 포함한다. 이때 바람직하기로 중심형성분자와 단위체사이는 에스테르 또는 펩타이드 결합을 통하여 연결된다.
상기한 중심 형성 분자는 다음의 일반식을 만족한다.
R5[(R6)aZ]b (2)
(상기에서 a는 0 또는 1의 정수. b는 R5가 질소일 경우 2또는 3이고, R5가 탄소일 경우 2에서 4까지의 정수를 포함).
상기에서 R5는 질소 또는 탄소이다. R6은 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, 바람직하기로는 탄소수 0 내지 20을 포함한다.
상기에서 Z는 알콜기, 아민기, 카르복시기, 또는 알킬에스테르기로부터 선택된다.
(2) 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르
본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 상기한 전구체 고분자 1 또는 전구체 고분자 2에 아민 표면작용기화반응 및/또는 내부 사차아민화반응을 하여 형성된 고분자를 포함한다. 아민 표면작용기화 반응이란 고분자 외부의 작용기(알콜기, 카르복시기 또는 알킬에스테르기 등을 포함)에 아민기를 가지는 물질을 에스테르 결합 또는 펩타이드 결합을 통하여 연결시키는 것을 의미한다.
아민 표면작용기화반응에 의한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르
상기 아민 표면작용기화반응에 의한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 상기한 전구체 고분자 1 또는 전구체 고분자 2의 표면을 -C(O)OR7N(R8)c(R 9)d (3), -OC(O)R7N(R8)c(R9)d (4), -C(O)NHR7 N(R8)c(R9)d (5), -OR7N(R8)c (R9)d (6)에서 선 택된 1종의 형태로 전부 또는 일부를 아민기로 작용기화한 것을 포함한다.
일반식 (3)과 (4)에서 전구체 고분자와 표면 아민기 사이에는 에스테르 결합으로 연결되어 있고, 일반식 (5)와 (6)에서 전구체 고분자와 표면 아민기 사이에는 펩티드 결합을 통하여 연결되어 있다.
상기에서 R7는 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, 바람직하기로는 탄소수는 0 내지 20을 포함한다.
또한 R8, R9는 수소(H)이거나, 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며 바람직하기로는 탄소수 1 내지 20을 포함한다.
단 상기에서 c+d는 2 또는 3으로 한다 (c,d는 1 또는 2이다)
상기에 따른 표면작용기화반응에 의한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 예를 들면 하기와 같다.
<예시 1> c+d가 2고 R8, R9가 모두 수소(H)인 경우: 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르 표면의 아민기는 일차아민기가 된다.
<예시 2> c+d가 2고 R8, R9가 모두 알킬기(alkyl)인 경우: 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르 표면의 아민기는 삼차아민기가 된다.
<예시 3> c+d가 3고 R8, R9가 모두 알킬기(alkyl)인 경우: 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르 표면의 아민기는 사차아민기가 된다.
상기와 같은 방법으로 형성된 고분자 표면의 아민기는 수용액에서 양성 전하를 띠게 되어, 수용액에서 음성 전하를 띠는 DNA와 정전기적 인력에 의한 고분자/유전자 복합체(폴리플렉스, polyplex)의 형성을 가능하게 한다. 유전자 치료를 위해서는 세포내부(세포핵)에서 DNA가 가진 유전자정보를 이용하여 치료용 단백질로 발현시켜야 한다(세포형질전환,transfection). DNA 단독으로는 세포 내부로 침투되기 어렵기 때문에, DNA 자체로는 세포형질전환이 어렵다. 그 이유는 세포막이 전체적으로 음성전하를 띠기 때문에, 전기적 반발력으로 음성 전하를 띤 DNA가 세포 내부로 들어가기 어렵기 때문이다. 따라서 상기 아민 표면작용기화 방법에 의한 본 발명에 의한 폴리플렉스는 전체적으로 중성 또는 양이온성을 띠게 되므로 세포 내부로의 침투가 용이하므로 유전자전달용 벡터로서 사용할 수 있다.
내부 사차아민화반응에 의한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르
또한 본 발명의 내부 사차아민화반응에 의한 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 상기한 전구체 고분자 1 또는 전구체 고분자 2의 내부의 삼차 아민 그룹에 바람직하기로는 R10X (X: 염소 또는 브롬 또는 요드)그룹을 화학반응시켜 제조할 수 있다. 이때 상기 R10은 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, 바람직하기로는 탄소수 1 내지 20을 포함한다.
고분자의 사차아민기는 수용액에서 양성 전하를 띠기 때문에, 수용액에서 음성 전하를 띠는 DNA와 정전기적 인력의 의한 폴리플렉스 형성을 가능하게 한다.
또한 상기 본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 작용기(아민기, 알콜기, 카르복시기 또는 알킬에스테르기 등을 포함)에 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체의 혈액순환시간을 연장하는데 효과적인 친수성 고분자사슬을 결합시킬 수 있다(예를 들면 그래프트 중합을 이용). 상기 친수성 고분자로는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리글리코산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린 등을 포함할 수 있다. 상기 친수성 고분자로 바람직하기로는 폴리에틸렌글리콜로 상기 화합물은 에틸렌글리콜을 중합시켜 얻어지는 고분자로 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자내에 소수부분과 친수부분이 존재하는 양친매성 물질로서 본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체에 화학적으로 결합하면 항원성이 감소되는 효과를 지닌다.
상기 본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 거대분자와 함께 복합체를 형성함으로써 목적으로 하는 세포 내로의 유전자 전달을 행할 수 있다. 상기 복합체를 형성하는 거대 분자로는 올리고뉴클레오티드와 올리고머 등을 포함하며, 이때 올리고뉴클레오티드로는 단일사슬 또는 이중사슬의 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid) 및 플라즈미드를 포함한다.
상기 올리고뉴클래오티드로는 DNA 또는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라즈미드, RNA일 수 있으며 RNA는 mRNA, tRAN, rRAN 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA 또는 RNA 서열과 상보적인 엔티센스 RNA 및 리보자임(Rybozyme)을 포함한다.
상기 단백질을 코딩하는 유전자로는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 각종 호르몬, 조직적합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포의 효소 및 이들의 절편 등을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 올리고뉴클레오티드로는 유전자발현조절인자, 예를 들면 전사 프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 타겟이 되는 세포에 특이적으로 결합될 수 있도록 상기 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 특이적인 '마커'(marker) 또는 리간드를 부가할 수 있다. 상기 마커 또는 리간드로는 각종 항체, 트랜스페린, 비오틴, 엽산, 저비중 지단백질(low-density lipoprotein, LDL), 탄수화물로서 단당류인 만노스, 글루코스, 갈락토스 및 이당류인 락토오스가 바람직하다. 상기 식별자들은 세포마다 상이하며 각 세포에는 대응하는 수용체가 존재하여 특이적으로 반응하게 된다. 특정 세포에 대한 상기 식별자는 본 발명의 기재로부터 당업자라면 필요에 따라 선택적으로 부가할 수 있는 사항으로 더 이상의 자세한 설명은 피하기로 한다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 예시에 불과하며 이들이 본 발명의 권리범위 를 제한하는 어떠한 의미로도 사용되어서는 아니된다.
<실시예 1> 전구체 고분자(전구체 고분자 2a)의 합성
메탄올에 녹아있는 에탄올아민(ethanolamine, 5 mL, 82 mmol)을 교반하고 있는 과량의 메틸아크릴레이트(methyl acrylate, 148 mL, 1.64 mol)용액에 넣은 후, 35℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 용매를 증발시킨 후 도 1에 기재한 단위체 1을 얻었다(수득율: 99%). 다음으로 상기 단위체 1(3 g, 12.9 mmol)과 도 1기재의 중심 원자 3(17.7 mg, 64.3 μmol), 그리고 촉매인 Al(OiPr)3(27 mg, 1 mol %)을 고분자 반응용기에 넣어 섞은 후, 교반하면서 진공 상태를 유지하였다. 온도를 2시간동안에 걸쳐) 120℃까지 상승시킨 후 10시간 동안 유지시켰다. 그런 다음, 온도를 140℃로 상승시키고 다시 10시간 동안 유지시킨 후, 그 생성물을 디에틸에테르에 침전시켜 도 1기재의 전구체 고분자 4를 얻었다(수득율: 67%). 이상의 반응과정은 도 1에 도시한 바와 같다.
단위체 1의 특성: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 2.47 (t, 4H, -CH2C H 2COO-), 2.59 (t, 2H, HOCH2CH 2N-), 2.79 (t, 4H, -CH 2CH2COO-), 3.59 (t, 2H, HOCH 2CH2N-), 3.68 (s, 6H, -CH 3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) 32.50 (-CH2 CH2COO-), 49.14 (-CH2CH2COO-), 51.48 (-CH3), 55.88 (HOCH2 CH2N-), 59.03 (HOCH 2CH2N-), 172.87 (-COO-). MS (MALDI) Calc'd for C10H19NO5 (M+H)+ 234.273; found 234.298.
전구체 고분자 4의 특성: 1H NMR (300 MHz, CDCl3) 2.45 (br t, -CH2 CH 2COO-), 2.71 (br t, -COOCH2CH 2N-), 2.82 (br t, -CH 2CH2COO-), 3.66 (br s, -CH 3), 4.10 (br t, -COOCH 2CH2N-). 13C NMR (150 MHz, INVGATE, CDCl3 ) 32.65-32.80 (-CH2 CH2COO-), 49.64-49.83 (-CH2CH2COO-), 51.58 (-CH3), 51.96-52.11 (-COOCH2 CH2N-), 62.43 (-COOCH2CH2N-), 172.20-172.76 (ester carbonyl carbons). 분자량: Mw =42,500 (by GPC, relative to PAMAM standard), PDI(polydispersity index=1.43
<실시예 2> 표면에 일차 아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성
고분자 반응용기에 전구체고분자 4(1.53 g)와 시비지에탄올아민(N-cbz-ethanolamine, 1.47 g), 그리고 촉매인 Al(OiPr)3(25 mg)을 넣은 후 140℃, 진공조건 하에서 5시간 동안 반응시킨 후, 그 생성물을 디에틸에테르에 침전시켜 전구체 고분자 표면에 시비지 에탄올아민이 결합된 고분자를 얻었다(수득율: 67%). 이 고 분자에서 보호기인 시비지(cbz)기를 팔라듐 촉매 (10 % Pd/C)하에서 가수소분해시켜 표면에 일차 아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르인 고분자 5를 얻었다(수득율: 62%). 이상의 반응 과정은 도 2에 도시한 바와 같다.
고분자 5의 특성: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) 2.34 (br, -CH2C H 2COO-), 2.70 (br, -COOCH2CH 2N-), 2.88 (br, -CH 2CH2COO-), 3.22 (br, -OCH2CH 2NH2), 3.62 (br, -CH 3), 4.07 (br, -COOCH 2CH2-).
<실시예 3> 내부에 사차 아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성
전구체고분자 4내부의 삼차 아민기를 사차 아민기로 치환하는 반응은, 전구체고분자 4(1 g)에 메틸아이오다이드(methyl iodide)(2 mL)를 첨가함으로써 수행하였다. 반응 후 용매를 증발하여 내부에 사차 아민기를 가지는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르인 고분자 6을 얻었다(수득율: 99%). 이상의 반응 과정은 도 3에 도시한 바와 같다.
고분자 6의 특성: 1H NMR (300 MHz, D2O) 2.73-3.25 (br m, -CH2C H 2COO-, -CH 2CH2COO- ), 3.73 (s, -COOCH 3), 3.77 (s, -NCH3 ), 3.87 (br, -COOCH2CH 2N-), 4.34- 4.69 (br m, -COOCH 2CH2-).
<실시예 4> 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체 형성실험.
다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르(도 2의 고분자 5)를 다양한 농도로 완충 용액(Hepes 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4)에 녹인 후 플라즈미드 수용액과 섞었다. 1 시간동안 복합체가 형성되기를 기다린 후 0.7% 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동을 실시하였다. 100 볼트에서 1 시간동안 전기영동 후 플라즈미드의 이동 정도를 에티듐브로마이드(ethidium bromide)로 검출하여 복합체 형성을 확인하였다(도 4).
<실시예 5> 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체의 세포형질전환 실험
293세포 (embryonic human kidney cells)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)이 들어있는 MEM (Minimal Essential Medium)에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에서 키웠다. 96-well plate에 적당량 세포를 나누어 키운 다음, 루시퍼레이즈 (lucuferase) 효소를 합성하는 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA(pGL3-Control Vector, Promega, USA)와 고분자 5를 섞어서 폴리플렉스를 형성하여 세포에 37℃에서 4시간동안 트랜스펙션을 실시하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이 고분자 5(polymer 5)는 기존에 개발된 생분해성 양이온성 고분자인 PAGA (Lim, Y. et al. J. Am. Chem. Soc. 2000)에 비하여 10배 이상의 높은 유전자 전달 효율을 가지고 있음을 확인하였다. 이것은 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 삼차원적인 구조와 내부의 삼차아민기에 의한 복합효과에서 비롯되며 이러한 결과는 다음으로부터 설명되어질 수 있다. 폴리플렉스는 세포막을 통과할 때 엔도좀이라는 베시클(vesicle)에 둘러 쌓이게 된다. 폴리플렉스는 엔도좀을 깨뜨리고 나와서 세포핵에 도달하여야만 유전자를 발현할 수 있게 된다. 고분자 내부의 삼차아민기는 엔도좀의 산성 pH (약 5~6)조건에서 양이온화 되고(생체 pH인 약알칼리성- 약 7.4 에서는 거의 양이온화 되지 않는다), 양이온화 된 삼차아민기들이 서로 반발하여 삼차원적 구조가 팽윤(swelling)하게 되어 엔도좀을 깨뜨린다 (엔도좀 완충 효과). 즉, 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 엔도좀 완충 효과에 의하여 높은 유전자 효율을 나타낼 수 있는 것으로 설명할 수 있다.
<실시예 6> 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 세포독성 완화 실험
293세포를 96-well plate에서 10% FBS를 함유하는 MEM을 배지로 하여 배양한 다음, 고분자 5 그리고 다른 양이온성 고분자들(PAGA, PAMAM, 그리고 PEI)을 24시간 동안 처리하였다. 그 후 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 2시간, 그리고 추출 완충 용액(20% w/v of SDS in a solution of 50% DMF, pH 4.7)을 24시간 처리한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6에서 볼 수 있듯이 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르인 고분자 5는, 분해가 잘 되지 않는 양이온성 고분자인 PEI 그리고 PAMAM 등에 비하여 현저히 낮은 세포 독성을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. 이것은 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 골격이 생분해성인 에스테르 결합으로 이루어져, 수용액 상태에서 쉽게 분해되는 성질이 있기 때문이다.
<실시예 7> 표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 합성.
45℃에서 메틸아크릴레이트 150mL(1.67 mol)의 교반 용액에 메탄올 250mL에 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 5g(41 mmol)을 녹인 용액을 가하였다. 반응 혼합액은 45℃에서 24시간 교반하였다. 메탄올과 여분의 메틸아크릴레이트를 증발시켜 노란색 기름의 도 7에 기재한 단위체 7(12g, 41 mmol, 수득률: 99%)를 얻었다.
축중합 반응을 위해 바이얼에 들어 있는 단위체 7(5g)을 실리콘 배스에 넣었다. 중합과정은 일정유량의 아르곤의 조건하에 170℃에서 수행되었다. 반응의 온도는 10℃/분의 비율로 증가하였다. 5시간 반응경과 후에 생성된 그물 구조의 전구체 고분자 8(상온에서는 고체상태)을 얻었다.
실온에서 전구체 고분자 8(0.73g)과 Fmoc-6-아미노헥산산(Fmoc-eAhx, 0.91g, 2.58 mmol)을 DMF 용액(7mL)에 녹인 혼합물을 DCC(1.06g, 5.15mmol), DMAP(0.16g, 1.29mmol) 및 PTSA(0.23g, 1.2mmol)로 처리하였다. 실온에서 15시간 경과 후에 상기 반응 혼합물을 여과시켜 DCU를 제거하였다. 고분자는 DMAP와 PTSA를 제거하기 위해 과량의 물에 침전시키는 방법으로 먼저 정제하였다(3번). 다음으로 침전물을 수거하여 CHCl3에 용해하고, 잔류 DCC와 Fmoc-eAhx를 제거하기 위해 과량의 EtOAc/에테르(1:1)용액에 침전시켜 (3번) 반고체상의 점성이 있는 고분자를 얻었다.
위 고분자 (Fmoc-eAhx가 결합된 고분자 8) 0.5g에 DMF에 녹아있는 20%(v/v) 피페리딘을 처리하여 Fmoc 보호그룹을 제거하였다. 5분간의 보호그룹 제거반응을 거친 후에 혼합물은 과량의 EtOAc/에테르(1:1)용액에 1방울씩 첨가하여 (3번) 백색 고체상의 n-PAE(0.21g)를 얻었다.
단위체 7 특성: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 2.39 (t, 4H, CH2C H 2COO), 2.75 (t, 4H, CH 2CH2COO), 3.28 (s, 6H, HOCH 2), 3.57 (s, 6H, CH 3). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) 35.41 (CH2 CH2COO), 36.93 (CH2CH2COO), 51.41 (CH3), 59.98 (quaternary carbon), 61.05 (HOCH2), 173.16 (ester carbonyl carbons). MS (MALDI) Calc'd for C12H23NO7 (M+H)+ 294.325; found 294.323.
전구체 고분자 8의 특성: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.41-2.77 (br m, CH 2CH 2COO and CH 2CH2COO), 3.24-3.42 (br m, HOCH 2), 3.50-3.57 (br m, CH 3), 4.01-4.10 (br m, COOCH 2-). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) 33.63-35.83 (CH2 CH2COO), 36.61-37.79 (CH2CH2COO), 51.60 (CH3), 59.32, 62.62 (quaternary carbons), 60.86, 61.44, 64.27 (HOCH2), 165.13-173.53 (ester carbonyl carbons).
n-PAE(고분자 9)의 특성: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.24-1.47 (br m, CH2(CH 2)3CH2COO), 2.27 (br, CH2(CH2 )3CH 2COO), 2.66 (br, CH 2(CH2)3 CH2COO), 3.21-3.40 (br m, HOCH 2), 3.51-3.55 (br m, CH 3), 3.85-4.15 (br m, COOC H 2).
<실시예 8> [표면에 일차아민기를 가지는 그물모양의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체] 형성 실험
다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르(고분자 9)를 다양한 농도로 완충 용액(Hepes 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4)에 녹인 후 플라즈미드 수용액과 섞었다. 1 시간동안 복합체가 형성되기를 기다린 후 0.7% 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동을 실시하였다. 100 볼트에서 1 시간동안 전기영동 후 플라즈미드의 이동 정도를 에티듐브로마이드(ethidium bromide)로 검출하여 복합체 형성을 확인하였다(도 8*).
*도 8에서 복합체는 n-PAE/DNA 무게(w/w) 비율 a) 2, b)는 5, c)는 10, d)는 20에서 형성함. Form I = supercoiled, form II = nicked circular, 그리고 form III = linear DNA.
<실시예 9> Atomic Force Microscope (AFM)을 이용한 n-PAE(고분자 9)/유전자 복합체의 모양과 크기결정.
DNA이미지를 얻기 위해 Hepes-Mg(25mM Hepes, 10mM MgCl2, pH 7.6)완충용액에 1μg/mL 농도로 DNA(pGL3-조절벡터)를 용해하였다. 2μL의 용액을 갓 쪼개진 운모기판위에 적층하였다. 용액을 2분간 흡수시킨 다음 증류수 1mL로 세척하고 재빨리 N2 개스로 건조하였다. 이미지 형성을 위해 폴리플렉스는 물속에 용해된 플라즈미드 용액(5μg/mL)과 동일 부피의 폴리머 용액과 혼합하여 제조하였다. 2μL의 폴리플렉스 용액을 갓 쪼개진 운모기판에 적층하고 용액을 2분 동안 건조처리하였다. 그런 다음 여분의 액체는 여과지를 통해 제거하였다. 이미지를 형성하기 이전에 용액을 실온에서 건조시켰다.
AFM은 E스캐너가 장착된 나노스코프 Ⅲa 장비(Digital instruments, Santa Babara, CA) 이용해 수행하였다. 모든 AFM 이미지는 512×12 화소에서 약 5Hz의 스캔속도를 가지는 전형적인 앰비언트 태핑모드에서 얻었다.
AFM 관찰결과 n-PAE와 DNA사이에 폴리플렉스가 형성된 것을 가시적으로 확인할 수 있었으며, 대부분의 플라즈미드 DNA는 슈퍼코일 또는 닉이 형성된 환형 DNA로 구성되어 있었다(도 9A). n-PAE/DNA 폴리플렉스의 AFM 이미지는 모든 플라즈미드 DNA가 n-PAE와 복합체를 형성하여 다소 이종 개체의 환형입자를 형성하고 있음을 보여준다(도 9B). 폴리플렉스는 폴리머/DNA 무게비 5로 형성되었다.
<실시예 10> n-PAE(고분자 9)/유전자 복합체를 이용한 세포형질전환 실험.
293세포 (embryonic human kidney cells) 또는 HepG2세포 (Human liver cell)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)이 들어있는 MEM (Minimal Essential Medium)에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에서 키웠다. 96-well plate에 적당량 세포를 나누어 키운 다음, 루시퍼레이즈 (lucuferase) 효소를 합성하는 유전자를 발현하는 플라스미드 DNA(pGL3-조절벡터, Promega, USA)와 n-PAE를 섞어서 폴리플렉스를 형성하여 세포에 37℃에서 4시간동안 트랜스펙션을 실시한 후, 루시퍼레이즈 효소의 활성을 측정하여 트랜스펙션 효율(TE)을 측정하였다.
도 10에서 볼 수 있듯이 n-PAE는 상당이 높은 효율의 TE를 가지고 있음을 알 수 있었다. 즉, n-PAE의 TE는 현재까지 가장 유전자 조절 효율이 좋다고 알려져 있는 PEI의 TE와 대등함을 알 수 있다. 또한 n-PAE는 PAGA보다 293세포와 HepG2세포에서 각각 106 그리고 318배 높은 TE를 보여주었다. 이것은 n-PAE가 유전자 전달을 아주 잘 한다는 것을 보여준다.
<실시예 11> n-PAE(고분자 9)의 293 세포주와 HepG2 세포주에서의 세포독성 완화 실험
293세포 또는 HepG2세포를 96-well plate에서 10% FBS를 함유하는 MEM을 배지로 하여 배양한 다음, n-PAE (◇), 고분자 8(□), PEI (○), 그리고 PAGA (∇)를 4시간 동안 처리하였다. 그 후
3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 2시간, 그리고 추출 완충 용액(20% w/v of SDS in a solution of 50% DMF, pH 4.7)을 24시간 처리한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 11은 n-PAE의 독성이 아주 작다는 것을 보여준다. n-PAE는 200μg/mL의 아주 높은 농도에서도 293세포와 HepG2세포에서 각각 93% 그리고 87%이상의 세포생존율을 유지시켰다. 하지만 PEI로 처리된 세포들은 거의 대부분 생존하지 못하여 PEI가 아주 강한 독성을 가짐을 보여주었다.
<실시예 12> n-PAE(고분자 9)의 엔도좀 완충작용
실시예 10과 동일한 방법으로 세포에 폴리플렉스를 처리할 때, 부가적으로 클로로퀸(chloroquine) 50μM 또는 니제리신(nigericin) 5μM을 같이 처리하였다. 클로로퀸은 엔도좀 버퍼 역할을 하는 물질이고, 니제리신은 엔도좀이 외부와 이온교환을 하는 것을 방해하는 물질이다. 도 12를 보면 클로로퀸을 처리하였을때 PEI와 n-PAE의 TE는 각각 감소하거나 약간만이 증가하는 것을 볼 수 있다. 하지만 PAGA의 TE는 클로로퀸을 처리하였을 때 상당히 많이(899배) 증가하는 것을 볼 수 있다. 이것은 PEI와 n-PAE는 이미 엔도좀 버퍼 역할을 그들 자체로 수행하기 때문에 엔도좀 버퍼인 클로로퀸의 영향을 거의 받지 않는 것을 보여준다. 그와는 반대로 PAGA는 고분자 자체로 엔도좀 버퍼 역할을 하지 못하기 때문에, 엔도좀 버퍼 역할을 하는 클로로퀸의 도움을 받았을 때 상당히 TE가 높아지는 것을 보여준다. 니제리신의 역할은 클로로퀸과 반대이기 때문에, PEI와 n-PAE의 TE는 니제리신을 처 리하지 않았을 때가 처리하였을 때 보다 아주 높은 것을 알 수 있었고, PAGA는 그 반대의 경향성을 보여주었다. 이들 결과를 종합할 때 n-PAE의 높은 유전자 전달 능력은 엔도좀 완충 효과에 기인한다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 상기 살핀 바와 같이 음이온성을 가지는 유전자와 정전기적 인력에 의한 복합체(폴리플렉스)를 형성함이 가능하므로 유전자 전달용 물질로서 매우 우수함을 알 수 있다. 또한 상기 본 발명에 의한 고분자는 엔도좀 완충 효과를 이용하여 유전자 전달 효율이 뛰어나고, 뿐만 아니라 생분해성을 가지고 있어서 세포 독성이 상당히 작은 효과가 있다.

Claims (23)

  1. 하기 일반식 1을 단위체로 하는 분자량 500~20,000,000의 전구체 고분자 표면의 전부 또는 일부가 아민작용기화한 유전자전달용 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
    [X(R1)p]qR0N[(R2)mY]2 (1)
    (단, m과 p는 0 또는 1의 정수, q는 1~3의 정수, N은 질소, R0, R1, R2은 탄소수 0~20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, X와 Y는 서로 에스테르화 반응을 할 수 있는 작용기로서 X=알콜기, Y=카르복시기, 또는 X=카르복시기, Y=알콜기를 포함)
  2. 제 1항에 있어서,
    아민표면작용기화는 -C(O)OR7N(R8)c(R9)d, -OC(O)R 7N(R8)c(R9)d, -C(O)NHR7N(R8)c(R9)d, -OR7N(R8 )c(R9)d에서 선택된 1종의 구조임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
    단, 상기에서 R7는 탄소수 0~20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되고, R8, R9는 H 또는 탄소수 1~20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유 도체로부터 선택된다.
  3. 제 1항에 있어서,
    내부에 사차아민구조가 형성된 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    작용기에 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체의 혈액순환시간을 연장하는데 효과적인 친수성 고분자사슬이 결합된 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  5. 제 4항에 있어서,
    친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리락트산, 폴리글리코산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린의 군으로부터 선택되는 적어도 1종임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  6. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 타겟이 되는 세포에 특이적으로 결합될 수 있도록 상기 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 특이적인 마커(marker) 또는 리간드가 부가된 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  7. 제 6항에 있어서,
    마커 또는 리간드는 항체, 트랜스페린, 비오틴, 엽산, 저비중 지단백질, 탄수화물로서 단당류인 만노스, 글루코스, 갈락토스 및 이당류인 락토오스로부터 선택되는 적어도 1종임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  8. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,
    유전자는 DNA, PNA, 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 플라즈미드, RNA의 군으로부터 선택되는 적어도 1종임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  9. 제 8항에 있어서,
    RNA는 mRNA, tRAN, rRAN, 임의의 세포의 타겟 DNA 또는 RNA 서열과 상보적인 엔티센스 RNA 및 리보자임의 군에서 선택된 적어도 1종임을 특징으로 하는 유전자전달용 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  10. 제 8항에 있어서,
    임의의 단백질을 코딩하는 유전자는 질병의 치료 또는 진단에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 유전자전달용 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법에 있어서,
    하기 일반식(1)의 단위체와 하기 일반식(2)의 중심형성분자를 에스테르 결합 또는 펩타이드 결합으로 공중합하여 분자량 1,000∼50,000,000의 전구체 고분자를 제조하는 단계와,
    상기 전구체 고분자 표면의 전부 또는 일부를 아민작용기화하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전자 전달용 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
    [X(R1)p]qR0N[(R2)mY]2 (1)
    (상기 일반식(1)에서 m과 p는 0 또는 1의 정수, q는 1∼3의 정수, N은 질소, R0, R1, R2은 탄소수 0∼20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, X와 Y는 서로 에스테르화 반응을 할 수 있는 작용기로서 X=알콜기, Y=카르복시기, 또는 X=카르복시기, Y=알콜기를 포함)
    R5[(R6)aZ]b (2)
    (상기 일반식(2)에서 R5는 질소 또는 탄소, R6은 탄소수 0∼20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, a는 0 또는 1의 정수, b는 R5가 질소일 경우 2 또는 3이고, R5가 탄소일 경우 2∼4까지의 정수, Z는 알콜기, 아민기, 카르복시기, 또는 알킬에스테르기의 군으로부터 선택되는 작용기)
  14. 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법에 있어서,
    청구항 1의 전구체 고분자와 하기 일반식(2)의 중심형성분자를 에스테르 결합 또는 펩타이드 결합으로 공중합하여 분자량 1,000∼50,000,000의 전구체 고분자를 제조하는 단계와,
    상기 전구체 고분자 표면의 전부 또는 일부를 아민작용기화하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 유전자 전달용 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
    R5[(R6)aZ]b (2)
    (상기 일반식 (2)에서 R5는 질소 또는 탄소, R6은 탄소수 0∼20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택되며, a는 0 또는 1의 정수, b는 R5가 질소일 경우 2 또는 3이고, R5가 탄소일 경우 2∼4까지의 정수, Z는 알콜기, 아민기, 카르복시기, 또는 알킬에스테르기의 군으로부터 선택되는 작용기)
  15. 제 13항에 있어서,
    전구체 고분자의 내부에 사차아민구조를 형성하는 단계가 추가로 구비됨을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    전구체 고분자의 내부에 사차아민구조를 형성하는 단계가 추가로 구비됨을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법
  17. 제 13항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서,
    내부사차아민화는 R10X (X: 염소 또는 브롬 또는 요드)그룹을 전구체 고분자의 내부 삼차아민그룹과 화학반응시켜 형성함을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
    단, R10은 탄소수 1~20의 알리파틱 또는 아로마틱 및 이들 유도체로부터 선택된다.
  18. 제 13항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서,
    작용기에 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르/유전자 복합체의 혈액순환시간을 연장하는데 효과적인 친수성 고분자사슬을 결합하는 단계가 추가로 구비됨을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리락트산, 폴리글리코산, 폴리비닐피 롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린의 군으로부터 선택되는 적어도 1종임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
  20. 제 13항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서,
    다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르는 타겟이 되는 세포에 특이적으로 결합될 수 있도록 상기 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르에 특이적인 마커(marker) 또는 리간드를 부가하는 단계가 추가로 구비됨을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    마커 또는 리간드는 항체, 트랜스페린, 비오틴, 엽산, 저비중 지단백질, 탄수화물로서 단당류인 만노스, 글루코스, 갈락토스 및 이당류인 락토오스로부터 선택되는 적어도 1종임을 특징으로 하는 다양이온 초가지성 폴리아미노에스테르의 제조방법.
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