JP2024512026A - オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療を目的とした脂質ナノ粒子及びオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)の治療を目的としたmRNA療法に関する。本発明に使用するためのmRNAは、インビボで投与される場合、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)をコードする。本開示のmRNA療法は、対象におけるOTC発現及び/または活性の欠損レベルを増加及び/または回復させる。本開示のmRNA療法は、対象におけるOTC活性の欠損と関連する有毒なアンモニアのレベルをさらに低下させる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2021年3月24日出願の米国仮特許出願第63/165,692号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年3月24日出願の米国仮特許出願第63/165,692号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。2022年3月21日に作成されたASCIIコピーは、45817-0102WO1_SL.txtという名称で、77,611バイトのサイズである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。2022年3月21日に作成されたASCIIコピーは、45817-0102WO1_SL.txtという名称で、77,611バイトのサイズである。
背景技術
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)機能を除去または減少させるOTCの変異によって引き起こされる、まれなX連鎖劣性障害である。OTCDは、尿素サイクルに影響を及ぼす全ての遺伝性障害のほぼ半分の原因である。Caldovic et al.,J.Genet.Genomics 42(5):181-194(2015)。OTCDの症状は大きく異なり得る。OTCの欠損は、高アンモニア血症エピソードを引き起こし得る。脳内でのアンモニアの毒性作用は、反復性嘔吐、神経行動学的変化、発作、さらには死をもたらし得る。OTCDを有する患者の多くは、肝臓のOTCが欠如または著しく欠損しているヘミ接合体男性であり、彼らは出生後1週間以内に急性高アンモニア血症、運動失調、及び嗜眠を呈する。OTCの部分的欠損を有するヘテロ接合体女性及び男性は、成人期を含む後年に症状を呈し得る。OTCDの有病率は、米国では約1:62,000~1:77,000と推定されている。
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)機能を除去または減少させるOTCの変異によって引き起こされる、まれなX連鎖劣性障害である。OTCDは、尿素サイクルに影響を及ぼす全ての遺伝性障害のほぼ半分の原因である。Caldovic et al.,J.Genet.Genomics 42(5):181-194(2015)。OTCDの症状は大きく異なり得る。OTCの欠損は、高アンモニア血症エピソードを引き起こし得る。脳内でのアンモニアの毒性作用は、反復性嘔吐、神経行動学的変化、発作、さらには死をもたらし得る。OTCDを有する患者の多くは、肝臓のOTCが欠如または著しく欠損しているヘミ接合体男性であり、彼らは出生後1週間以内に急性高アンモニア血症、運動失調、及び嗜眠を呈する。OTCの部分的欠損を有するヘテロ接合体女性及び男性は、成人期を含む後年に症状を呈し得る。OTCDの有病率は、米国では約1:62,000~1:77,000と推定されている。
OTCはミトコンドリアの尿素サイクル酵素であり、カルバミルリン酸とオルニチンとの反応を触媒し、シトルリン及びリン酸を形成する。これは、タンパク質異化の神経毒性産物であるアンモニアを無毒の尿素に変換するために不可欠である。ヒトOTC(NM_000531.5)は、354アミノ酸長のタンパク質(NP_000522.3)をコードする。それは肝臓内で発現され、細胞のミトコンドリア及びサイトゾル内に局在する。N末端のリーダー配列がミトコンドリア内で除去されて、322アミノ酸成熟タンパク質を形成する。OTCは3つの活性部位を有するホモ三量体である。
OTC患者は、血漿アンモニアレベルの上昇、血漿グルタミンの上昇、血漿シトルリンの低下または欠如、及び尿中オロチン酸の上昇を呈する。これらの生化学的マーカーは、OTCDと他の尿素サイクル異常症との区別に使用され得る。OTCDの治療選択肢は限られているため、疾患に対する市販の治療薬は存在せず、肝臓移植のみが根治的であると考えられている。
既存のOTCD治療と関連する深刻な問題を考慮すると、OTCD治療の改善について未だ満たされていないニーズが存在する。
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)及び尿素サイクル異常症の治療を目的としたメッセンジャーRNA(mRNA)治療薬を提供する。本発明のmRNA治療薬は、本技術がオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的OTCポリペプチドのデノボ合成をもたらすため、OTCDの治療に特に適している。本発明は、(1)望ましくない免疫活性化(例えば、外来核酸のインビボ導入と関連する自然免疫応答)を最小限に抑え、(2)タンパク質へのmRNAの翻訳効率を最適化するために、治療用mRNA内に修飾ヌクレオチドを組み込むことを特徴とする。本開示の例示的な態様は、自然免疫応答を減少させるためのヌクレオチド修飾と、特にタンパク質発現を増強するためのOTCポリペプチドをコードする治療用mRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)及び非翻訳領域(UTR)内における配列最適化との組合せを特徴とする。
さらなる実施形態では、本開示のmRNA治療技術はまた、脂質ナノ粒子(LNP)送達システムを介したOTCポリペプチドをコードするmRNAの送達も特徴とする。本開示は、イオン化可能なアミノ脂質ベースのLNPを特徴とし、これはOTCポリペプチドをコードするmRNAと組み合わせてインビボで投与される場合に、改善された特性、例えば、細胞取込み、細胞内輸送及び/またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有する。
ある特定の態様では、本開示は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、mRNAを含む組成物及び送達製剤、ならびにそれを投与することによって、OTCDの治療を必要とするヒト対象においてOTCDを治療する方法に関する。
本開示は、OTCポリペプチドをコードするORFを含む、脂質ナノ粒子にカプセル化されたmRNAを含む医薬組成物を提供し、本組成物は、OTCDの治療を必要とするヒト対象への投与に適している。
ある特定の態様では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含む脂質ナノ粒子を提供し、脂質ナノ粒子は、式(II):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’環状は
であり、
R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、ここでn2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
Yaは、C3~6炭素環であり、
R*”aは、C1~15アルキル及びC2~15アルケニルからなる群から選択され、
sは、2または3であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
R’bは、
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、ここでn2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
Yaは、C3~6炭素環であり、
R*”aは、C1~15アルキル及びC2~15アルケニルからなる群から選択され、
sは、2または3であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(II-a):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、ここでn2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、ここでn2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(II-b):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(II-c):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(II-e):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(II-f):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγは、C1~12アルキルであり、
R2及びR3は、各々独立してC1~14アルキルであり、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルであり、
mは、4、5、及び6から選択され、
lは、4、5、及び6から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγは、C1~12アルキルであり、
R2及びR3は、各々独立してC1~14アルキルであり、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルであり、
mは、4、5、及び6から選択され、
lは、4、5、及び6から選択される。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む。ある特定の実施形態では、PEG脂質は、化合物Iである。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、(i)40~50mol%の式(II)の化合物、30~45mol%の構造脂質、5~15mol%のリン脂質、及び1~5mol%のPEG脂質、または(ii)45~50mol%の式(II)の化合物、35~45mol%の構造脂質、8~12mol%のリン脂質、及び1.5~3.5mol%のPEG脂質を含む。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、mRNAは、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、mRNAは、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む。
前述した脂質ナノ粒子のある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、OTCポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’非翻訳領域(UTR)及びオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を提供する。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、OTCポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。ある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:5~15のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。ある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:16のヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’非翻訳領域(UTR)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を提供する。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、OTCポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
ある特定の態様では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を提供し、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、OTCポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含み、OTCポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、mRNAは、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む。
前述したmRNAのある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
ある特定の態様では、本開示は、以下を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を提供する:
(i)5’末端キャップ、
(ii)配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’非翻訳領域(UTR)、
(iii)配列番号:1のオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号:3のヌクレオチド配列を含むORF、
(iv)配列番号:132の核酸配列を含む3’UTR、及び
(v)ポリA領域。
(i)5’末端キャップ、
(ii)配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’非翻訳領域(UTR)、
(iii)配列番号:1のオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号:3のヌクレオチド配列を含むORF、
(iv)配列番号:132の核酸配列を含む3’UTR、及び
(v)ポリA領域。
前述したmRNAのいずれかのある特定の実施形態では、ポリA領域は、A100(配列番号:195)を含む。
前述したmRNAのいずれかのある特定の実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含む。
前述したmRNAのいずれかのある特定の実施形態では、mRNAのウラシルは全て、N1-メチルシュードウラシルである。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、アミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含み、ポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、前述したmRNAのいずれか1つを含む医薬組成物及び薬学的に許容される担体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、前述したポリペプチドのいずれか1つを含む医薬組成物及び薬学的に許容される担体を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、前述したmRNAのいずれか1つを含む脂質ナノ粒子を提供する。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(I):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む。ある特定の実施形態では、PEG脂質は、化合物Iである。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、(i)40~50mol%の式(I)の化合物、30~45mol%の構造脂質、5~15mol%のリン脂質、及び1~5mol%のPEG脂質、または(ii)45~50mol%の式(I)の化合物、35~45mol%の構造脂質、8~12mol%のリン脂質、及び1.5~3.5mol%のPEG脂質を含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、(a)(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(b)(i)化合物VI、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(c)(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(d)(i)化合物VI、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(e)(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、(f)(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、(g)(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(h)(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(i)(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、または(j)(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物Iを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、(a)(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(b)(i)化合物VI、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(c)(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(d)(i)化合物VI、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(e)(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、(f)(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、(g)(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(h)(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(i)(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、(j)(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、(k)(i)化合物A、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、(l)(i)化合物A、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、(m)(i)化合物A、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、または(n)(i)化合物A、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物Iを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物Aを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物A及び化合物Iを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物A、DSPC、コレステロール、及び化合物Iを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物II及び化合物Iを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物B及び化合物Iを含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物Iを含む。
ある特定の態様では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含む脂質ナノ粒子を提供し、脂質ナノ粒子は、式(Ic):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は
であり、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、R’aは、R’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、RaαはC2~12アルキルであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は
であり、
は結合点を示し、R10は、NH(C1~6アルキル)であり、n2は2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。ある特定の実施形態では、式(Ic)の化合物は、
もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体である。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む。ある特定の実施形態では、PEG脂質は、化合物Iである。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、(i)40~50mol%の式(Ic)の化合物、30~45mol%の構造脂質、5~15mol%のリン脂質、及び1~5mol%のPEG脂質、または(ii)45~50mol%の式(Ic)の化合物、35~45mol%の構造脂質、8~12mol%のリン脂質、及び1.5~3.5mol%のPEG脂質を含む。ある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む。ある特定の実施形態では、mRNAは、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。ある特定の実施形態では、mRNAは、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む。ある特定の実施形態では、mRNAは、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、OTCポリペプチドは、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、OTCポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ORFは、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、R’aは、R’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
ある特定の態様では、本開示は、OTCポリペプチドの発現を必要とするヒト対象においてOTCポリペプチドを発現させる方法を提供し、本方法は、有効量の前述したmRNAのいずれか1つ、前述したポリペプチドのいずれか1つ、前述した医薬組成物のいずれか1つ、または前述した脂質ナノ粒子のいずれか1つをヒト対象に投与することを含む。
ある特定の態様では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)の治療、予防、またはその発症及び/または進行の遅延を必要とするヒト対象においてOTCDの発症及び/または進行を治療する、予防する、または遅延させる方法を提供し、本方法は、有効量の前述したmRNAのいずれか1つ、前述したポリペプチドのいずれか1つ、前述した医薬組成物のいずれか1つ、または前述した脂質ナノ粒子のいずれか1つをヒト対象に投与することを含む。
ある特定の態様では、本開示は、アンモニア血中レベルの減少を必要とするヒト対象においてアンモニア血中レベルを減少させる方法を提供し、本方法は、有効量の前述したmRNAのいずれか1つ、前述したポリペプチドのいずれか1つ、前述した医薬組成物のいずれか1つ、または前述した脂質ナノ粒子のいずれか1つをヒト対象に投与することを含む。
ある特定の態様では、本開示は、尿中オロチン酸レベルの減少を必要とするヒト対象において尿中オロチン酸レベルを減少させる方法を提供し、本方法は、有効量の前述したmRNAのいずれか1つ、前述したポリペプチドのいずれか1つ、前述した医薬組成物のいずれか1つ、または前述した脂質ナノ粒子のいずれか1つをヒト対象に投与することを含む。
ある特定の態様では、本開示は、OTC活性の増加を必要とするヒト対象においてOTC活性を増加させる方法を提供し、本方法は、有効量の前述したmRNAのいずれか1つ、前述したポリペプチドのいずれか1つ、前述した医薬組成物のいずれか1つ、または前述した脂質ナノ粒子のいずれか1つをヒト対象に投与することを含む。
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)の治療を目的としたmRNA治療薬を提供する。OTCDは、神経毒性のあるアンモニアを尿素に変換する能力に影響を及ぼすX連鎖劣性尿素サイクル異常症である。OTCDは、OTC遺伝子の変異によって引き起こされ、この遺伝子はオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)という酵素をコードする。OTCが存在しない場合、アンモニアが異常に蓄積し、高アンモニア血症を引き起こし得る。mRNA治療薬は、本技術がOTCをコードするmRNAの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的OTCタンパク質のデノボ合成をもたらすため、OTCDの治療に特に適している。標的細胞内へのmRNAの送達後、所望のOTCタンパク質が細胞自体の翻訳機構によって発現されるため、完全に機能的なOTCタンパク質が、欠損または欠落タンパク質に置き換わる。
核酸ベースの治療薬(例えば、mRNA治療薬)のインビボ送達と関連する1つの課題は、自然免疫応答に起因し、これは身体の免疫系が外来核酸に遭遇する場合に起こり得る。外来mRNAは、toll様受容体(TLR)、特に一本鎖RNA(ssRNA)によって活性化されるTLR7/8を介した認識によって免疫系を活性化し得る。非免疫細胞では、外来mRNAの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)を介して行われ得る。外来mRNAの免疫認識は、インターロイキン-1β(IL-1β)産生、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)分布及び強力なI型インターフェロン(I型IFN)応答を含む、望ましくないサイトカイン効果をもたらし得る。本開示は、免疫活性化を最小限に抑え、タンパク質へのmRNAの翻訳効率を最適化するために、治療用mRNA内に異なる修飾ヌクレオチドを組み込むことを特徴とする。特定の態様は、自然免疫応答を減少させるためのヌクレオチド修飾と、特にタンパク質発現を増強するためのOTCをコードする治療用mRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)内での配列最適化との組合せを特徴とする。
本開示のmRNA治療技術のある特定の実施形態はまた、脂質ナノ粒子(LNP)送達システムを介したOTCをコードするmRNAの送達も特徴とする。脂質ナノ粒子(LNP)は、mRNAを標的細胞に安全かつ効果的に送達するための理想的なプラットフォームである。LNPは、細胞取込み、細胞内輸送及びエンドソーム放出またはエンドソーム脱出を含む機構によって核酸を送達する特有の能力を有する。本発明は、インビボで投与される場合に改善された特性を有する、OTCをコードするmRNAと組み合わせたイオン化可能なアミノ脂質ベースのLNPを特徴とする。理論に束縛されるものではないが、本発明のイオン化可能なアミノ脂質ベースのLNP製剤は、改善された特性、例えば、細胞取込み、細胞内輸送及び/またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有すると考えられている。例えば、初回投与において、全身経路(例えば、静脈内(IV)投与)によって投与されるLNPは、例えば、さらなる投与において、その後に注射されるLNPのクリアランスを加速し得る。本現象は加速血液クリアランス(ABC)として知られていて、特に治療において欠損酵素(例えば、OTC)を置き換える場合に重要な課題である。これは、mRNA治療薬の反復投与が、ほとんどの場合に対象(例えば、OTCDに罹患している対象)の標的組織において必要レベルの酵素を維持するのに不可欠だからである。反復投薬の課題は複数のレベルで対処され得る。mRNA操作及び/またはLNPによる効率的送達は、初回投与後に発現されるタンパク質(例えば、OTC)のレベル増加及び/または持続期間の延長をもたらし得、それにより、初回投与と次の投与との間の時間を延長し得る。ABC現象は少なくとも部分的に、本質的に一過性であり、ABCの基礎となる免疫応答は、全身投与後に十分な時間が経過した後に消失することが知られている。したがって、一態様では、本開示のmRNA治療薬の全身送達後のタンパク質発現及び/または活性の持続時間増加は、ABC現象に効果がある。さらに、LNPは、免疫感知及び/または認識を回避するように操作され得るため、後続または反復投薬時にABCをさらに回避し得る。本開示の例示的な態様は、ABCを減少させるように操作されているLNPを特徴とする。
1.オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)
オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC、EC2.1.3.3)は、尿素サイクル及び細菌アルギニン生合成経路の酵素である。OTCは、カルバミルリン酸とオルニチンとの反応を触媒し、シトルリン及びリン酸を形成する。OTCは、細胞内ではホモ三量体として存在する。
オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC、EC2.1.3.3)は、尿素サイクル及び細菌アルギニン生合成経路の酵素である。OTCは、カルバミルリン酸とオルニチンとの反応を触媒し、シトルリン及びリン酸を形成する。OTCは、細胞内ではホモ三量体として存在する。
オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)は、OTC機能と関連するX連鎖性尿素サイクル異常症であり、アンモニアの尿素への変換が不十分であるため、アンモニアが蓄積し、重症例では高アンモニア血症を引き起こす。ヒトでは様々な変異がOTC機能及び活性に影響を及ぼし得る。大きな欠失、フレームシフト、ナンセンス、及びミスセンス変異は、OTCの酵素活性またはフォールディングを無効にし、ヘミ接合体男性では重篤な新生児発症疾患及びヘテロ接合体女性ではOTCD症状を引き起こし得る。OTC活性は保持するが、タンパク質を不安定化させる、酵素活性を減少させる、または基質親和性を低下させるミスセンス変異は、ヘミ接合体男性では遅発性疾患を引き起こし得る。低形質アレルの女性保因者も、OTCD症状を呈し得る。
野生型OTCカノニカルmRNA配列は、NCBI Reference Sequence database(RefSeq)にアクセッション番号NM_000531.5(「Homo sapiensオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(OTC)、mRNA」)下で記載されている。野生型OTCカノニカルタンパク質配列は、RefSeqデータベースにアクセッション番号NP_000522.3(「オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア前駆体[Homo sapiens]」)下で記載されている。OTCタンパク質は354アミノ酸長であり、分子量は39.9kDaである。N末端リーダー配列がミトコンドリア内で除去され、322アミノ酸成熟タンパク質を形成する。RefSeq配列中の参照タンパク質配列をコードする特定の核酸配列は、各々のRefSeqデータベースエントリーに示されるようなコード配列であることに留意する。
ヒトOTCのアミノ酸配列は、配列番号:1に提供される:
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF。
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF。
置換(配列番号:1に従って番号付け)N47D、A135T、S184G、A217V、A227P、V229I、L245S、及びH255Rを有するバリアントヒトOTCのアミノ酸配列は、配列番号:2に提供される:MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKDFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMTDAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYGSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQVATPKGYEPDPSITKLAEQYAKENGTKLSLTNDPLEAARGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF。
ある特定の態様では、本開示は、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、オープンリーディングフレーム(ORF))を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドは、野生型全長ヒトOTCタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドは、野生型OTC配列に対して置換(例えば、配列番号:2)、ならびに挿入及び/または付加、欠失及び/または共有結合修飾を含有するバリアント、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、例えば、局在化のために、配列タグまたはアミノ酸が、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列に(例えば、N末端またはC末端で)付加され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を任意に欠失させて断片をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、1つ、2つ、3つまたは3つを超える置換を含み得る、ヒトOTC配列の置換バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、1つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、配列番号:2のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
OTCタンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、バリアント、及び相同タンパク質(オルソログ)もまた、本開示のOTCポリペプチドの範囲内である。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例は、配列番号:1に示される。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの別の非限定的な例は、配列番号:2に示される。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン(N)以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含むヒトOTCをコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン(N)以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含むヒトOTCをコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、N47D、A135T、S184G、A217V、A227P、V229I、L245S、及びH255R(配列番号:1に従って番号付け)からなる群から選択される1つ以上の置換を含むヒトOTCをコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、置換N47D、A135T、S184G、A217V、A227P、V229I、L245S、及びH255R(配列番号:1に従って番号付け)を含むヒトOTCをコードする。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:2のアミノ酸配列を含むヒトOTCをコードする。
本開示で提示されるある特定の組成物及び方法は、野生型ヒトOTCのタンパク質またはポリヌクレオチド配列を指す。そのような開示は、当該技術分野において既知の、または本明細書に記載されるOTCの任意の他のバリアント(例えば、配列番号:2)にも等しく適用可能である。
2.ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム(ORF)
本発明は、OTCDの治療または予防に使用するためのmRNAを特徴とする。本発明に使用するために特徴付けられるmRNAは、対象に投与され、インビボでヒトOTCタンパク質をコードする。したがって、本発明は、ヒトOTC(配列番号:1)、そのアイソフォーム、そのバリアント(例えば、配列番号:2)、その機能的断片、及びOTCを含む融合タンパク質をコードする連結ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAに関する。特に、本発明は、ヒトOTC(もしくはそのバリアント、例えば、配列番号:2)のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
本発明は、OTCDの治療または予防に使用するためのmRNAを特徴とする。本発明に使用するために特徴付けられるmRNAは、対象に投与され、インビボでヒトOTCタンパク質をコードする。したがって、本発明は、ヒトOTC(配列番号:1)、そのアイソフォーム、そのバリアント(例えば、配列番号:2)、その機能的断片、及びOTCを含む融合タンパク質をコードする連結ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAに関する。特に、本発明は、ヒトOTC(もしくはそのバリアント、例えば、配列番号:2)のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
ある特定の態様では、本発明は、1つ以上のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコードされたOTCポリペプチドは、以下から選択され得る:
(i)全長OTCポリペプチド(例えば、野生型OTCと同じ長さか、もしくは本質的に同じ長さを有する、例えば、配列番号:1)、
(ii)本明細書に記載されるOTCの機能的断片(例えば、OTCよりも短い切断(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、もしくは内部領域の欠失)配列であるが、依然としてOTC酵素活性を保持している)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つ以上のアミノ酸が置換されている全長もしくは切断OTCタンパク質、例えば、参照タンパク質に対してポリペプチドのOTC活性の全てもしくはほとんどを保持するバリアント(例えば、当該技術分野において既知の、もしくは本明細書に記載される任意の天然もしくは人工バリアント(例えば、配列番号:2)))、または
(iv)(i)全長OTCタンパク質(例えば、配列番号:1)、そのアイソフォームもしくはそのバリアント(例えば、配列番号:2)、及び(ii)異種タンパク質を含む融合タンパク質。
(i)全長OTCポリペプチド(例えば、野生型OTCと同じ長さか、もしくは本質的に同じ長さを有する、例えば、配列番号:1)、
(ii)本明細書に記載されるOTCの機能的断片(例えば、OTCよりも短い切断(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、もしくは内部領域の欠失)配列であるが、依然としてOTC酵素活性を保持している)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つ以上のアミノ酸が置換されている全長もしくは切断OTCタンパク質、例えば、参照タンパク質に対してポリペプチドのOTC活性の全てもしくはほとんどを保持するバリアント(例えば、当該技術分野において既知の、もしくは本明細書に記載される任意の天然もしくは人工バリアント(例えば、配列番号:2)))、または
(iv)(i)全長OTCタンパク質(例えば、配列番号:1)、そのアイソフォームもしくはそのバリアント(例えば、配列番号:2)、及び(ii)異種タンパク質を含む融合タンパク質。
ある特定の実施形態では、コードされたOTCポリペプチドは、ヒトOTCポリペプチドなどの哺乳動物OTCポリペプチド、その機能的断片またはバリアントである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、それらの細胞中に導入される場合、細胞中のOTCタンパク質発現レベル及び/または検出可能なOTC酵素活性レベルを、本発明のポリヌクレオチド投与前における細胞中のOTCタンパク質発現レベル及び/または検出可能なOTC酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加させる。OTCタンパク質発現レベル及び/またはOTC酵素活性は、当該技術分野における既知の方法に従って測定され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビトロで細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビボで細胞中に導入される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、野生型ヒトOTC、例えば、配列番号:1、またはそのアイソフォームをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、バリアントヒトOTC、例えば、配列番号:2、またはそのアイソフォームをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、コドン最適化核酸配列を含み、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム(ORF)は、野生型OTC配列(例えば、野生型ヒトOTC)に由来する。例えば、OTCをコードする配列最適化ORFを含む本発明のポリヌクレオチドの場合、対応する野生型配列は、天然ヒトOTCである。同様に、ヒトOTCの機能的断片をコードする配列最適化mRNAの場合、対応する野生型配列は、ヒトOTCからの対応する断片である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、ヒトOTCの全長配列(すなわち、イニシエーターメチオニンを含む、アミノ酸1~354)を有するOTCをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、変異体OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCアミノ酸配列内に少なくとも1つの点変異を含み、OTC酵素活性を保持するOTCポリペプチドをコードするORFを含む。いくつかの実施形態では、変異体OTCポリペプチドは、対応する野生型OTC(例えば、配列番号:1)のOTC活性の少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%であるOTC活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体OTCポリペプチドをコードするORFを含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化されている。いくつかの実施形態では、変異体OTCポリペプチドは、配列番号:2である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTC酵素活性を変化させない変異を有するOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。そのような変異体OTCポリペプチドは、機能中立と称され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つ以上の機能中立点変異を含む変異体OTCポリペプチドをコードするORFを含む。
いくつかの実施形態では、変異体OTCポリペプチドは、対応する野生型OTCよりも高いOTC酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体OTCポリペプチドは、対応する野生型OTC(すなわち、同じOTCタンパク質であるが、変異(複数可)を含まない)の活性よりも、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%高いOTC活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、機能的OTC断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、例えば、1つ以上の断片が、野生型OTCポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、OTC酵素活性を保持する。いくつかの実施形態では、OTC断片は、対応する全長OTCのOTC活性の少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%であるOTC活性を有する。いくつかの実施形態では、機能的OTC断片をコードするORFを含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化されている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、対応する全長OTCよりも高いOTC酵素活性を有するOTC断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。したがって、いくつかの実施形態では、OTC断片は、対応する全長OTCのOTC活性よりも、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%高いOTC活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、野生型OTCよりも少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%または25%短いOTC断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列と少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列に対して90%~100%、95%~100%、97%~100%、98%~100%、90%~95%、90%~97%、90%~98%、95%~97%、95%~98%、または95%~99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列に対して90%~100%、95%~100%、97%~100%、98%~100%、90%~95%、90%~97%、90%~98%、95%~97%、95%~98%、または95%~99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列に対して90%~100%、95%~100%、97%~100%、98%~100%、90%~95%、90%~97%、90%~98%、95%~97%、95%~98%、または95%~99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列に対して90%~100%、95%~100%、97%~100%、98%~100%、90%~95%、90%~97%、90%~98%、95%~97%、95%~98%、または95%~99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:3の配列と90%~100%同一、91%~99%同一、92%~98%同一、93%~97%同一、または94%~96%同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号:4の配列と90%~100%同一、91%~99%同一、92%~98%同一、93%~97%同一、または94%~96%同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、約1,00~約100,000ヌクレオチド(例えば、1,000~2,500、1,000~2,600、1,000~2,700、1,000~2,800、1,000~2,900、1,000~3,000、1,000~5,000、1,000~10,000、1,000~25,000、1,000~50,000、1,000~70,000、1,000~100,000、1062~2,700、1062~2,800、1062~2,900、1062~5,000、1062~7,000、1062~10,000、1062~25,000、1062~50,000、1062~70,000、または1062~100,000)を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列(例えば、ORF)の長さは、少なくとも500ヌクレオチド長(例えば、少なくとも、もしくは約500、600、700、80、900、1,000、1,050、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,635、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000超または最大で100,000ヌクレオチドを含む)である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF、例えば、配列番号:3または4)を含み、5’-UTR(例えば、配列番号:58)及び3’-UTR(例えば、配列番号:132)をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:3の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:4の配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’末端キャップ(例えば、m7Gp-ppGm-A、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’-フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体)及びポリA尾部領域(例えば、約100ヌクレオチド長)を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、ポリA尾部を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、50~150(配列番号:197)、75~150(配列番号:198)、85~150(配列番号:199)、90~120(配列番号:193)、90~130(配列番号:194)、または90~150(配列番号:192)ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ポリA尾部は、100ヌクレオチド長(配列番号:195)である。いくつかの場合では、ポリA尾部は保護される(例えば、逆位デオキシチミジンによって)。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、非コード、例えば、マイクロRNA結合部位である少なくとも1つの核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’-UTR(例えば、配列番号:58)及び3’UTR(例えば、配列番号:132)をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:3の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:4の配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’末端キャップ(例えば、m7Gp-ppGm-A、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’-フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体)及びポリA尾部領域(例えば、約100ヌクレオチド長、例えば、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211))を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、ポリA尾部を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、50~150(配列番号:197)、75~150(配列番号:198)、85~150(配列番号:199)、90~120(配列番号:193)、90~130(配列番号:194)、または90~150(配列番号:192)ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ポリA尾部は、100ヌクレオチド長(配列番号:195)である。いくつかの場合では、ポリA尾部は保護される(例えば、逆位デオキシチミジンによって)。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、非コード、例えば、マイクロRNA結合部位である少なくとも1つの核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’-UTR(例えば、配列番号:50~79の配列から選択される)及び3’UTR(例えば、配列番号:100~136の配列から選択される)をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:3の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:4の配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’末端キャップ(例えば、m7Gp-ppGm-A、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’-フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体)及びポリA尾部領域(例えば、約100ヌクレオチド長、例えば、配列番号:195)を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、配列番号:132の核酸配列を含む3’UTRを含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、ポリA尾部を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、50~150(配列番号:197)、75~150(配列番号:198)、85~150(配列番号:199)、90~120(配列番号:193)、90~130(配列番号:194)、または90~150(配列番号:192)ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ポリA尾部は、100ヌクレオチド長(配列番号:195)である。いくつかの場合では、ポリA尾部は保護される(例えば、逆位デオキシチミジンによって)。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF、例えば、配列番号:3または配列番号:4の配列)を含み、5’-UTR(例えば、配列番号:50~79の配列から選択される)及び3’-UTR(例えば、配列番号:100~136の配列から選択される)をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:3の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:4の配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、5’末端キャップ(例えば、m7Gp-ppGm-A、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’-フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体)及びポリA尾部領域(例えば、約100ヌクレオチド長)を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、ポリA尾部を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、50~150(配列番号:197)、75~150(配列番号:198)、85~150(配列番号:199)、90~120(配列番号:193)、90~130(配列番号:194)、または90~150(配列番号:192)ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ポリA尾部は、100ヌクレオチド長(配列番号:195)である。いくつかの場合では、ポリA尾部は保護される(例えば、逆位デオキシチミジンによって)。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:59のヌクレオチド配列を含む5’UTR及び配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:59のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:59のヌクレオチド配列を含む5’UTR及び配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:59のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR及び配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR及び配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTR及び配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:1のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTR及び配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTR、配列番号:2のOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、及び配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、一本鎖または二本鎖である。
いくつかの実施形態では、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む本発明のポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、RNAである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、mRNAであるか、またはmRNAとして機能する。いくつかの実施形態では、mRNAは、少なくとも1つのOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボでコードされたOTCポリペプチドを産生するために翻訳されることが可能である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント、例えば、配列番号:3及び配列番号:4を参照のこと)をコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルである。他の実施形態では、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位及び/またはmiR-126に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物IIもしくは化合物B、式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物VIもしくは化合物I、またはそれらの任意の組合せを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、ヘルパー脂質(例えば、DSPC)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)を含み、例えば、約(i)40~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、任意に45~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%、(ii)30~45mol%のステロール(例えば、コレステロール)、任意に35~42mol%のステロール、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、37~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%、または40~42mol%のステロール、(iii)5~15mol%のヘルパー脂質(例えば、DSPC)、任意に10~15mol%のヘルパー脂質、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%のヘルパー脂質、及び(iv)1~5%のPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)、任意に1~5mol%のPEG脂質、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG脂質の範囲のモル比で含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物B、コレステロール、DSPC、及び化合物Iを47:39:11:3のモル比で含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、LNP-4を含む送達剤と共に製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:3のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長、例えば、配列番号:195)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤はLNP、例えば、LNP-4である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長、例えば、配列番号:195)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤はLNP、例えば、LNP-4である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:50~79のいずれか1つ)、配列番号:3のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:100~136のいずれか1つ)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長、例えば、配列番号:195)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤はLNP、例えば、LNP-4である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:50~79のいずれか1つ)、配列番号:4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:100~136のいずれか1つ)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長、例えば、配列番号:195)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤はLNP、例えば、LNP-4である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:3のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物IIまたは化合物VI及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物IIまたは化合物VI及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:3のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物B及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:58)、配列番号:4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:132)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物B及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:50~79のいずれか1つ)、配列番号:3または4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:100~136のいずれか1つ)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物IIまたは化合物VI及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’末端キャップ(例えば、Cap1、例えば、m7Gp-ppGm-A)、5’UTR(例えば、配列番号:50~79のいずれか1つ)、配列番号:3または4のORF配列、3’UTR(例えば、配列番号:100~136のいずれか1つ)、及びポリA尾部(例えば、約100nt長)を含むmRNAであり、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質として化合物B及びPEG脂質としてPEG-DMGまたは化合物Iを含む。
3.シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)はまた、コードされたポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進する追加の特徴をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送に役立つそのような1つの特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。それらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含む、様々な名称で知られている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、本明細書に記載されるOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)はまた、コードされたポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進する追加の特徴をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送に役立つそのような1つの特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。それらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含む、様々な名称で知られている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、本明細書に記載されるOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
いくつかの実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、約30~210ヌクレオチド長、例えば、約45~80または15~60ヌクレオチド(例えば、約20、30、40、50、60、または70アミノ酸)長であり、それぞれコード領域またはポリペプチドの5’(またはN末端)で任意に組み込まれる。それらの配列の付加によって、コードされたポリペプチドが、1つ以上の標的化経路を介して小胞体またはミトコンドリアなどの所望の部位に輸送されることになる。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後、例えば、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする5’核酸配列をさらに含む。
4.融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、目的のポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列(例えば、ORF)を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする単一ORFを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、2つ以上のORF、例えば、OTCポリペプチド(目的の第1ポリペプチド)、機能的断片、またはそのバリアントをコードする第1ORF、及び目的の第2ポリペプチドを発現する第2ORFを含み得る。いくつかの実施形態では、2つ以上の目的のポリペプチドを遺伝的に融合し得る、すなわち、2つ以上のポリペプチドが同じORFによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー(例えば、G4S(配列番号:200)ペプチドリンカーまたは当該技術分野において既知の別のリンカー)をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、目的のポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列(例えば、ORF)を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする単一ORFを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、2つ以上のORF、例えば、OTCポリペプチド(目的の第1ポリペプチド)、機能的断片、またはそのバリアントをコードする第1ORF、及び目的の第2ポリペプチドを発現する第2ORFを含み得る。いくつかの実施形態では、2つ以上の目的のポリペプチドを遺伝的に融合し得る、すなわち、2つ以上のポリペプチドが同じORFによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー(例えば、G4S(配列番号:200)ペプチドリンカーまたは当該技術分野において既知の別のリンカー)をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、各々が目的のポリペプチドを発現する、2つ、3つ、4つ、またはそれを超えるORFを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチドをコードする第1核酸配列(例えば、第1ORF)及び目的の第2ポリペプチドをコードする第2核酸配列(例えば、第2ORF)を含み得る。
リンカー及び切断可能なペプチド
ある特定の実施形態では、本開示のmRNAは、2つ以上のOTCドメインまたは異種ドメインをコードし、本明細書では多量体構築物と称される。多量体構築物のある特定の実施形態では、mRNAは、各ドメイン間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、F2Aリンカー、P2Aリンカー、T2Aリンカー、E2Aリンカー、及びそれらの組合せからなる群から選択される。2Aペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野において記載されている(例えば、Kim,J.H.et al.(2011)PLoS ONE 6:e18556を参照のこと)。ある特定の実施形態では、リンカーは、F2Aリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、GGGS(配列番号:201)リンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、(GGGS)n(配列番号:202)リンカーであり、式中、n=2、3、4、または5である。ある特定の実施形態では、多量体構築物は、介在するリンカーと共に3つのドメイン、すなわち、構造:ドメイン-リンカー-ドメイン-リンカー-ドメイン、例えば、OTCドメイン-リンカー-OTCドメイン-リンカー-OTCドメインを有するものを含有する。
ある特定の実施形態では、本開示のmRNAは、2つ以上のOTCドメインまたは異種ドメインをコードし、本明細書では多量体構築物と称される。多量体構築物のある特定の実施形態では、mRNAは、各ドメイン間に位置するリンカーをさらにコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、F2Aリンカー、P2Aリンカー、T2Aリンカー、E2Aリンカー、及びそれらの組合せからなる群から選択される。2Aペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野において記載されている(例えば、Kim,J.H.et al.(2011)PLoS ONE 6:e18556を参照のこと)。ある特定の実施形態では、リンカーは、F2Aリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、GGGS(配列番号:201)リンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、(GGGS)n(配列番号:202)リンカーであり、式中、n=2、3、4、または5である。ある特定の実施形態では、多量体構築物は、介在するリンカーと共に3つのドメイン、すなわち、構造:ドメイン-リンカー-ドメイン-リンカー-ドメイン、例えば、OTCドメイン-リンカー-OTCドメイン-リンカー-OTCドメインを有するものを含有する。
一実施形態では、切断可能なリンカーは、F2Aリンカー(例えば、アミノ酸配列GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(配列番号:189)を有する)である。他の実施形態では、切断可能なリンカーは、T2Aリンカー(例えば、アミノ酸配列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(配列番号:190)を有する)、P2Aリンカー(例えば、アミノ酸配列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号:191)を有する)またはE2Aリンカー(例えば、アミノ酸配列GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(配列番号:216)を有する)である。当業者は、当該技術分野において認識されている他のリンカーが、本発明の構築物(例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる)での使用に適している可能性があると理解することになる。当業者は、同様に他のマルチシストロン性構築物も本発明での使用に適している可能性があると理解することになる。例示的な実施形態では、構築物設計は、およそ等モル量の、本発明の構築物によってコードされる細胞内抗体(intrabody)及び/またはそのドメインをもたらす。
一実施形態では、自己切断ペプチドは、2Aペプチドであってもよいが、これに限定されない。様々な2Aペプチドが当該技術分野において既知かつ利用可能であり、例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス2Aペプチド、Thosea asignaウイルス2Aペプチド、及びブタテッショウウイルス-1の2Aペプチドを含むものが使用されてよい。2Aペプチドは、リボソームスキッピングによって1つの転写物から2つのタンパク質を生成するために、いくつかのウイルスによって使用され、その結果、正常なペプチド結合が2Aペプチド配列で損なわれ、1つの翻訳イベントから2つの不連続なタンパク質が産生されるようになる。非限定的な例として、2Aペプチドは、配列番号:191のタンパク質配列、その断片またはバリアントを有する場合がある。一実施形態では、2Aペプチドは、最後のグリシンと最後のプロリンの間で切断する。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:191の断片またはバリアントのタンパク質配列を有する2Aペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでよい。2Aペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、GGAAGCGGAGCUACUAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCUGGAGACGUGGAGGAGAACCCUGGACCU(配列番号:217)である。例示的な一実施形態では、2Aペプチドは、以下の配列:5’-UCCGGACUCAGAUCCGGGGAUCUCAAAAUUGUCGCUCCUGUCAAACAAACUCUUAACUUUGAUUUACUCAAACUGGCTGGGGAUGUAGAAAGCAAUCCAGGTCCACUC-3’(配列番号:218)によってコードされる。2Aペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法及び/または当該技術分野において既知の方法によって修飾またはコドン最適化されてよい。
一実施形態では、本配列は、2つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を分離するために使用されてよい。非限定的な例として、F2Aペプチドをコードする配列は、第1コード領域Aと第2コード領域Bとの間に存在してよい(A-F2Apep-B)。F2Aペプチドの存在によって、F2Aペプチド配列の末端でグリシンとプロリンとの間の長い1つのタンパク質が切断されることになり(NPGP(配列番号:205)が切断されてNPG及びPになる)、したがって、別個のタンパク質A(F2Aペプチドの21個のアミノ酸が結合し、NPGで終わる)及び別個のタンパク質B(F2Aペプチドの1個のアミノ酸、Pが結合する)が生じる。同様に、他の2Aペプチド(P2A、T2A及びE2A)については、長いタンパク質中にペプチドが存在すると、2Aペプチド配列の末端のグリシンとプロリンとの間で切断が生じる(NPGP(配列番号:205)が切断されてNPG及びPになる)。タンパク質A及びタンパク質Bは、同じか、または異なる目的のペプチドまたはポリペプチド(例えば、全長ヒトOTCなどのOTCポリペプチド)であってよい。
5.OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、任意に目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’-UTR、3’-UTR(5’UTRまたは3’UTRは、任意に少なくとも1つのマイクロRNA結合部位を含む)、任意にリンカーをコードするヌクレオチド配列、ポリA尾部、またはそれらの任意の組合せ)を含み、ORF(複数可)は、配列最適化されている。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、任意に目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’-UTR、3’-UTR(5’UTRまたは3’UTRは、任意に少なくとも1つのマイクロRNA結合部位を含む)、任意にリンカーをコードするヌクレオチド配列、ポリA尾部、またはそれらの任意の組合せ)を含み、ORF(複数可)は、配列最適化されている。
配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、OTCポリペプチドをコードするコドン最適化mRNA配列は、参照配列(例えば、OTCポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列)に対して少なくとも1つの同義の核酸塩基置換を含む配列である。
配列最適化ヌクレオチド配列は、参照配列と部分的にまたは完全に配列が異なり得る。例えば、UCUコドンによって均一にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、その核酸塩基の100%を置換する(各コドンについて、1位のUをAで置き換え、2位のCをGで置き換え、3位のUをCで置き換える)ことによって配列最適化され、AGCコドンによって均一にコードされることになるポリセリンをコードする配列を得ることができる。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の全体的なペアワイズアラインメントから得られる配列同一性のパーセンテージは0%となる。しかしながら、両方の配列からのタンパク質産物は、100%同一となる。
一部の配列最適化(コドン最適化と称される時もある)方法は、当該技術分野において既知であり(以下でより詳細に説明され)、1つ以上の所望の結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果としては、例えば、確実に適切なフォールディングが行われるために、ある特定の組織標的及び/または宿主生物におけるコドン頻度を一致させること、mRNA安定性を増加させるか、もしくは二次構造を減少させるためにG/C含有量を偏らせること、遺伝子の構築もしくは発現を障害し得るタンデムリピートコドンもしくは一連の塩基を最小限に抑えること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフリングすること、制限部位を挿入もしくは削除すること、リボソーム結合部位及びmRNA分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれるように翻訳速度を調整すること、及び/またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を減少もしくは除去することが挙げられ得る。配列最適化ツール、アルゴリズム及びサービスが当該技術分野において既知であり、非限定的な例としては、GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)のサービス及び/または独自の方法が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、OTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、配列最適化ヌクレオチド配列によってコードされるOTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントは、改善された特性(例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされるOTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントと比較して)、例えば、インビボ投与後の発現有効性に関連する改善された特性を有する。そのような特性としては、核酸安定性(例えば、mRNA安定性)の改善、標的組織における翻訳有効性の増加、発現される切断型タンパク質数の減少、発現タンパク質のフォールディング改善またはミスフォールディング防止、発現産物の毒性の減少、発現産物によって引き起こされる細胞死の減少、タンパク質凝集の増加及び/または低減が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化され、当該技術分野における問題のうち1つ以上を回避する構造的及び/または化学的特徴、例えば、構造的及び機能的完全性を保持しながら、核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達を最適化する、発現の閾値を克服する、発現率、半減期及び/またはタンパク質濃度を改善する、タンパク質の局在化を最適化する、ならびに免疫応答及び/または分解経路などの有害な生体応答を回避するのに有用な特徴を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、以下を含む方法に従って配列最適化されるヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’-UTR、3’-UTR、マイクロRNA結合部位、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組合せ)を含む:
(i)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを代替コドンで置換し、ウリジン含有量を増加もしくは低減させてウリジン修飾配列を生成すること、
(ii)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを、同義コドンセット中でより高いコドン頻度を有する代替コドンで置換すること、
(iii)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを代替コドンで置換し、G/C含有量を増加させること、または
(iv)それらの組合せ。
(i)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを代替コドンで置換し、ウリジン含有量を増加もしくは低減させてウリジン修飾配列を生成すること、
(ii)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを、同義コドンセット中でより高いコドン頻度を有する代替コドンで置換すること、
(iii)参照ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)中の少なくとも1つのコドンを代替コドンで置換し、G/C含有量を増加させること、または
(iv)それらの組合せ。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチドをコードするORF)は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも1つの改善された特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化方法はマルチパラメトリックであり、本明細書に開示される1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれを超える方法及び/または当該技術分野において既知の他の最適化方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態において有益であると考えられ得る特徴は、ポリヌクレオチドの領域によって、またはその領域内でコードされ得、そのような領域は、OTCポリペプチドをコードする領域の上流(5’)、下流(3’)、またはその領域内に存在し得る。それらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム(ORF)の配列最適化前及び/または配列最適化後にポリヌクレオチド中に組み込まれ得る。そのような特徴の例としては、非翻訳領域(UTR)、マイクロRNA配列、Kozak配列、オリゴ(dT)配列、ポリA尾部、及び検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、XbaI認識を有し得るマルチクローニングサイトを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、5’UTR、3’UTR及び/またはマイクロRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の5’UTR及び/または3’UTRを含み、それらは同じ配列か、または異なる配列であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上のマイクロRNA結合部位を含み、それらは同じ配列か、または異なる配列であり得る。5’UTR、3’UTR、及び/またはマイクロRNA結合部位の任意の部分(何も含まない場合も含む)が配列最適化され得、配列最適化前及び/または配列最適化後に、独立して1つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。
いくつかの実施形態では、最適化後、ポリヌクレオチドは再構成され、限定されないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などのベクター中に形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドが再構成され、化学的にコンピテントなE.coli、酵母、neurospora、トウモロコシ、drosophilaなどの中に形質転換され得、高コピープラスミド様または染色体構造が、本明細書に記載される方法によって生じる。
6.OTCポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、ORFは配列最適化されている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、ORFは配列最適化されている。
ヒト全長OTCをコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号:3として示される。ヒト全長OTCをコードする別の例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号:4として示される。いくつかの実施形態では、配列最適化OTC配列、断片、及びそのバリアントは、本明細書に開示される方法を実施するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端までに以下を含む:
(i)本明細書に提供されるような5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:58、
(iii)OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号:3または配列番号:4として示されるOTCをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(3’UTRの5’末端に存在しない場合)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:132、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部(例えば、配列番号:195)。
(i)本明細書に提供されるような5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:58、
(iii)OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号:3または配列番号:4として示されるOTCをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(3’UTRの5’末端に存在しない場合)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:132、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部(例えば、配列番号:195)。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端までに以下を含む:
(i)本明細書に提供されるような5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:50~79のうち1つ、
(iii)OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号:3または配列番号:4として示されるOTCをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(3’UTRの5’末端に存在しない場合)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:100~136のうち1つ、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部(例えば、配列番号:195)。
(i)本明細書に提供されるような5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:50~79のうち1つ、
(iii)OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号:3または配列番号:4として示されるOTCをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(3’UTRの5’末端に存在しない場合)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に提供される配列など、例えば、配列番号:100~136のうち1つ、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部(例えば、配列番号:195)。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシル(G5)である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド中の全てのウラシルが、5-メトキシウラシル(G6)である。
本明細書に開示される配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、特有の組成特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、OTCポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする)におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の割合は、参照野生型ヌクレオチド配列内のウラシルまたはチミン核酸塩基の割合に対して改変される(例えば、減少する)。そのような配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含有率は、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって決定され得る。いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列は、参照野生型配列中におけるウラシルまたはチミン含有量よりも少ないウラシルまたはチミン含有量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列中におけるウラシルまたはチミン含有量は、参照野生型配列中におけるウラシルまたはチミン含有量よりも多く、参照野生型配列と比較した場合に有益な効果、例えば、発現の増加及び/またはToll様受容体(TLR)応答の減少を依然として維持している。
コドン使用の最適化方法は、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書で提供される配列のうちいずれか1つ以上のORFがコドン最適化されてよい。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、確実に適切なフォールディングが行われるために、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させる、mRNA安定性を増加させるか、もしくは二次構造を減少させるためにGC含有量を偏らせる、遺伝子の構築もしくは発現を障害する場合があるタンデムリピートコドンもしくは一連の塩基を最小限に抑える、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズする、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去する、コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加する、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフリングする、制限部位を挿入もしくは削除する、リボソーム結合部位及びmRNA分解部位を修飾する、タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれるように翻訳速度を調整する、またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を減少もしくは除去するために使用されてよい。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスが当該技術分野において既知であり、非限定的な例としては、GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)のサービス及び/または独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム(ORF)配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
7.配列最適化核酸の特徴付け
本発明のいくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、少なくとも1つの核酸配列特性(例えば、ヌクレアーゼに曝露される場合の安定性)または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されているかどうかを決定するために試験され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、少なくとも1つの核酸配列特性(例えば、ヌクレアーゼに曝露される場合の安定性)または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されているかどうかを決定するために試験され得る。
本明細書で使用される場合、「発現特性」は、インビボ(例えば、合成mRNAを必要とする対象への投与後における合成mRNAの翻訳有効性)またはインビトロ(例えば、インビトロモデル系で試験される合成mRNAの翻訳有効性)のいずれかにおける核酸配列の特性を指す。発現特性としては、投与後にOTCポリペプチドをコードするmRNAによって産生されるタンパク質の量、及び産生される可溶性タンパク質またはさもなければ機能性タンパク質の量が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列最適化核酸は、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存率によって評価され得る。
所与の実施形態では、非最適化参照核酸配列に対してコドン置換を含有する、本明細書に開示される複数の配列最適化核酸(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、目的の特性、例えば、インビトロモデル系における発現特性、または標的組織もしくは細胞内におけるインビボでの発現特性を測定するために機能的に特徴付けられ得る。
a.核酸配列固有特性の最適化
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、インビボまたはインビトロ安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、所与の標的組織または細胞内における発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるその分解を防止することによって、その血漿半減期を増加させるために配列最適化される。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、インビボまたはインビトロ安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、所与の標的組織または細胞内における発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるその分解を防止することによって、その血漿半減期を増加させるために配列最適化される。
他の実施形態では、核酸配列は、溶液中での加水分解に対するその耐性を増加させるために、例えば、配列最適化核酸または配列最適化核酸を含む医薬組成物が、水性条件下において最小限の分解だけで保存され得る時間を延長するために配列最適化される。
他の実施形態では、配列最適化核酸は、乾燥保存条件における加水分解に対するその耐性を増加させるために、例えば、配列最適化核酸が、凍結乾燥後に最小限の分解だけで保存され得る時間を延長するために最適化され得る。
b.タンパク質発現のために配列最適化される核酸
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示される配列最適化配列によってコードされるOTCポリペプチドの発現レベルである。タンパク質発現レベルは、1つ以上の発現系を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、CHO細胞またはHEK293細胞において測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物から調製されるインビトロ発現系、または精製された個々の成分の集合体によって調製されるインビトロ発現系を使用して測定され得る。他の実施形態では、タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サルなどで測定される。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示される配列最適化配列によってコードされるOTCポリペプチドの発現レベルである。タンパク質発現レベルは、1つ以上の発現系を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、CHO細胞またはHEK293細胞において測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物から調製されるインビトロ発現系、または精製された個々の成分の集合体によって調製されるインビトロ発現系を使用して測定され得る。他の実施形態では、タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サルなどで測定される。
いくつかの実施形態では、溶液形態でのタンパク質発現が望ましい場合があり得る。したがって、いくつかの実施形態では、参照配列は、可溶型での発現タンパク質の最適化レベルを有する配列最適化核酸配列を得るために配列最適化され得る。タンパク質発現のレベル及び他の特性、例えば、溶解度、凝集レベル、及び切断産物(すなわち、タンパク質分解、加水分解、または翻訳欠陥による断片)の存在などは、当該技術分野において既知の方法に従って、例えば、電気泳動(例えば、ネイティブもしくはSDS-PAGE)またはクロマトグラフィー法(例えば、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィーなど)を使用して測定され得る。
c.標的組織または標的細胞生存率の最適化
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織または細胞中で有害作用を有し、タンパク質収量を減少させるか、または発現産物の品質を低下させる(例えば、タンパク質断片の存在もしくは封入体中の発現タンパク質の沈殿によって)か、または毒性を引き起こし得る。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織または細胞中で有害作用を有し、タンパク質収量を減少させるか、または発現産物の品質を低下させる(例えば、タンパク質断片の存在もしくは封入体中の発現タンパク質の沈殿によって)か、または毒性を引き起こし得る。
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列、例えば、OTCポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化は、配列最適化核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を増加させるために使用され得る。
異種タンパク質発現はまた、自家移植または異種移植用の核酸配列でトランスフェクトした細胞にも有害となり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化は、配列最適化核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を増加させるために使用され得る。細胞または組織の生存率、毒性、及び他の生理的反応の変化は、当該技術分野において既知の方法に従って測定され得る。
d.免疫応答及び/または炎症反応の減少
いくつかの場合には、OTCポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を誘発し得、これは(i)治療剤(例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNA)、もしくは(ii)そのような治療剤の発現産物(例えば、mRNAによってコードされるOTCポリペプチド)、または(iv)それらの組合せによって引き起こされ得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列(例えば、mRNA)の配列最適化は、OTCポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはそのような核酸によってコードされるOTCの発現産物によって誘発される免疫応答または炎症反応を低減させるために使用され得る。
いくつかの場合には、OTCポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を誘発し得、これは(i)治療剤(例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNA)、もしくは(ii)そのような治療剤の発現産物(例えば、mRNAによってコードされるOTCポリペプチド)、または(iv)それらの組合せによって引き起こされ得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列(例えば、mRNA)の配列最適化は、OTCポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはそのような核酸によってコードされるOTCの発現産物によって誘発される免疫応答または炎症反応を低減させるために使用され得る。
いくつかの場合には、炎症反応は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ELISAを使用して、1つ以上の炎症性サイトカインのレベル増加を検出することによって測定され得る。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症反応において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン-6(IL-6)、CXCL1(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(GROαとしても知られる)、インターフェロン-γ(IFNγ)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターフェロンγ誘導タンパク質10(IP-10)、または顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)が挙げられる。炎症性サイトカインという用語は、当該技術分野において既知の炎症反応と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-12(IL-12)、インターロイキン-13(Il-13)、インターフェロンα(IFN-α)なども含む。
8.OTCポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学修飾核酸塩基、例えば、化学修飾ウラシル、例えば、シュードウラシル、N1-メチルシュードウラシル、5-メトキシウラシルなどを含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、OTCポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、mRNAは、化学修飾核酸塩基、例えば、化学修飾ウラシル、例えば、シュードウラシル、N1-メチルシュードウラシル、または5-メトキシウラシルを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学修飾核酸塩基、例えば、化学修飾ウラシル、例えば、シュードウラシル、N1-メチルシュードウラシル、5-メトキシウラシルなどを含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、OTCポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、mRNAは、化学修飾核酸塩基、例えば、化学修飾ウラシル、例えば、シュードウラシル、N1-メチルシュードウラシル、または5-メトキシウラシルを含む。
本発明のある特定の態様では、修飾ウラシル塩基がリボース糖に結合し、ポリヌクレオチド中に存在する場合、得られる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾ウリジンと称される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または約100%が修飾ウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも95%が修飾ウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、100%が修飾ウラシルである。
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも95%が修飾ウラシルである実施形態では、免疫応答をほとんどまたは全く誘導することなく、mRNAが好適なタンパク質発現レベルを提供するように、全体的なウラシル含有量が調整され得る。いくつかの実施形態では、ORFのウラシル含有量は、対応する野生型ORF中における理論的最小ウラシル含有量(%UTM)の約100%~約150%、約100%~約110%、約105%~約115%、約110%~約120%、約115%~約125%、約120%~約130%、約125%~約135%、約130%~約140%、約135%~約145%、約140%~約150%である。他の実施形態では、ORFのウラシル含有量は、%UTMの約121%~約136%または123%~134%である。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするORFのウラシル含有量は、%UTMの約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、または約150%である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、修飾ウラシル及び/または天然に存在するウラシルを指し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含有量は、ORF中の総核酸塩基含有量の約30%、約25%、約20%、約15%、または約10%未満である。いくつかの実施形態では、ORF中のウラシル含有量は、ORF中の総核酸塩基含有量の約10%~約20%である。他の実施形態では、ORF中のウラシル含有量は、ORF中の総核酸塩基含有量の約10%~約25%である。一実施形態では、OTCポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含有量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含有量の約20%未満である。これに関連して、「ウラシル」という用語は、修飾ウラシル及び/または天然に存在するウラシルを指し得る。
さらなる実施形態では、修飾ウラシル及び調整されたウラシル含有量を有するOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、シトシン(C)、グアニン(G)、またはグアニン/シトシン(G/C)含有量(絶対または相対)が増加している。いくつかの実施形態では、ORFのC、G、またはG/C含有量(絶対または相対)の全体的な増加は、野生型ORFのG/C含有量(絶対または相対)と比較して、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%である。いくつかの実施形態では、ORF中のG、C、またはG/C含有量は、OTCポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論最大値のG、C、またはG/C含有量(%GTMX、%CTMX、または%G/CTMX)の約100%未満、約90%未満、約85%未満、または約80%未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるG及び/またはC含有量(絶対または相対)の増加は、G、C、またはG/C含有量が低い同義コドンを、より高いG、C、またはG/C含有量を有する同義コドンで置き換えることによって行われ得る。他の実施形態では、G及び/またはC含有量(絶対または相対)の増加は、Uで終わるコドンをGまたはCで終わる同義コドンで置き換えることによって行われる。
さらなる実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、修飾ウラシルを含み、OTCポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも、少ないウラシル対(UU)及び/またはウラシルトリプレット(UUU)及び/またはウラシルクアドルプレット(UUUU)を含有する調整されたウラシル含有量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、ウラシル対及び/またはウラシルトリプレット及び/またはウラシルクアドルプレットを含有しない。いくつかの実施形態では、ウラシル対及び/またはウラシルトリプレット及び/またはウラシルクアドルプレットは、OTCポリペプチドをコードするmRNAのORF中においてある特定の閾値未満、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以下に減少している。特定の実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1未満の非フェニルアラニンウラシル対及び/またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、OTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、非フェニルアラニンウラシル対及び/またはトリプレットを含有しない。
さらなる実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、修飾ウラシルを含み、OTCポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも、少ないウラシルリッチクラスターを含有する調整されたウラシル含有量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするmRNAのORFは、OTCポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチクラスターよりも、長さが短いウラシルリッチクラスターを含有する。
さらなる実施形態では、低頻度の代替コドンが用いられる。修飾ウラシルを含むmRNAのOTCポリペプチドをコードするORF中におけるコドンの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が代替コドンで置換されていて、各代替コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する。ORFはまた、上に記載されるように調整されたウラシル含有量を有する。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするmRNAのORF中の少なくとも1つのコドンが、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替コドンで置換されている。
いくつかの実施形態では、調整されたウラシル含有量の、修飾ウラシルを含むmRNAのOTCポリペプチドをコードするORFは、哺乳動物細胞に投与される場合、対応する野生型mRNAからのOTCの発現レベルよりも高いOTCの発現レベルを示す。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、HeLa細胞、BJ線維芽細胞、または末梢血単核細胞(PBMC)である。いくつかの実施形態では、OTCは、mRNAがインビボで哺乳動物細胞に投与される場合に、対応する野生型mRNAからのOTCの発現レベルよりも高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、mRNAは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスはヌルマウスである。いくつかの実施形態では、mRNAは、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、または0.2mg/kgまたは約0.5mg/kgの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、mRNAは、静脈内または筋肉内に投与される。他の実施形態では、mRNAがインビトロで哺乳動物細胞に投与される場合、OTCポリペプチドが発現される。いくつかの実施形態では、発現は、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約500倍、少なくとも約1500倍、または少なくとも約3000倍増加する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、60%、約70%、約80%、約90%、または約100%増加する。
いくつかの実施形態では、調整されたウラシル含有量の、修飾ウラシルを含むmRNAのOTCポリペプチドをコードするORFは、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAは、同じ条件下の対応する野生型mRNAの安定性と比較して、細胞内で安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、及び/または二次構造の安定化の増加を含む、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAによって示される安定性の増加は、mRNAの半減期(例えば、血漿、血清、細胞、もしくは組織試料中)を決定すること、及び/またはmRNAによるタンパク質発現(例えば、インビトロもしくはインビボ)の経時的な曲線下面積(AUC)を決定することによって測定される。半減期及び/またはAUCが、同じ条件下で対応する野生型mRNAの半減期及び/またはAUCよりも大きい場合、mRNAは安定性が増加していると同定される。
いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは、同じ条件下で対応する野生型mRNAによって誘導される免疫応答と比較して、検出可能な低い免疫応答(例えば、自然または獲得)を誘導する。他の実施形態では、本開示のmRNAは、同じ条件下でOTCポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないmRNAによって誘導される免疫応答と比較して、または同じ条件下でOTCポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調整されたウラシル含有量を有しないmRNAによって誘導される免疫応答と比較して、検出可能な低い免疫応答(例えば、自然または獲得)を誘導する。自然免疫応答は、炎症性サイトカインの発現増加、細胞内PRR(RIG-I、MDA5など)の活性化、細胞死、及び/またはタンパク質翻訳の終了もしくは減少によって現れ得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の減少は、1型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、及びIFN-ζ)の発現もしくは活性レベルもしくはtoll様受容体(例えば、TLR7及びTLR8)などのインターフェロン制御遺伝子の発現によって、及び/または本発明のmRNAを細胞に1回以上投与した後の細胞死の低減によって測定され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のmRNAに応答する哺乳動物細胞による1型インターフェロンの発現は、対応する野生型mRNA、OTCポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないmRNA、またはOTCポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調整されたウラシル含有量を有しないmRNAと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、または99.9%を超えて減少する。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、IFN-βである。いくつかの実施形態では、本開示のmRNAを哺乳動物細胞に投与することによって引き起こされる細胞死の頻度は、対応する野生型mRNA、OTCポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないmRNA、またはOTCポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調整されたウラシル含有量を有しないmRNAで観察される細胞死の頻度よりも、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または95%を超えて低い。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、BJ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトの細胞である。一実施形態では、本開示のmRNAは、mRNAが導入される哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
9.ポリヌクレオチドの修飾方法
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、mRNA)を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾及び/または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが化学的及び/または構造的に修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、mRNA)を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾及び/または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが化学的及び/または構造的に修飾される場合、ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、1つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むために、任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的、または組換え的方法などによって合成され得る。ポリヌクレオチドは、連結ヌクレオシドの領域(複数可)を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合に、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むことになる。
本明細書に開示される修飾ポリヌクレオチドは、様々な別個の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、1つ、2つ、またはそれを超える(任意に異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態では、細胞中に導入された修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較した場合に、1つ以上の望ましい特性、例えば、タンパク質発現の改善、免疫原性の減少、または細胞内での分解の減少を示し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、構造的に修飾される。本明細書で使用される場合、「構造」修飾は、ヌクレオチドそれ自体に影響を与える化学修飾を加えることなく、2つ以上の連結ヌクレオシドがポリヌクレオチド内で挿入、欠失、複製、逆転またはランダム化される修飾である。化学結合は必然的に破壊され、構造修飾を行うために再編成されることになるため、構造修飾は化学的性質のものであり、それゆえ化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、ヌクレオチドの異なる配列をもたらすことになる。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT-5meC-G」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドが、「ATCG」から「ATCCCG」に構造的に修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「CC」が挿入されていて、これがポリヌクレオチドに構造修飾をもたらす。
本開示の治療用組成物は、いくつかの実施形態では、OTCをコードするオープンリーディングフレーム(例えば、配列番号:3)を有する少なくとも1つの核酸(例えば、RNA)を含み、核酸は標準的な(非修飾)、または当該技術分野において既知であるように修飾され得るヌクレオチド及び/またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドまたは天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドであり得る。そのような修飾は、当該技術分野において認識されているようなヌクレオチド及び/またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当該技術分野において一般に既知の、または認識されているようなものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているMODOMICSデータベース内で見出され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然には存在しない修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当該技術分野において一般に既知の、または認識されているようなものである。そのような天然には存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開された米国出願第PCT/US2012/058519号、第PCT/US2013/075177号、第PCT/US2014/058897号、第PCT/US2014/058891号、第PCT/US2014/070413号、第PCT/US2015/36773号、第PCT/US2015/36759号、第PCT/US2015/36771号、または第PCT/IB2017/051367号(それらの全てが参照によって本明細書に組み込まれる)内で見出され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)は、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なヌクレオシド残基、例えば、転写RNA内に存在する残基(例えば、A、G、C、またはU)などを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的なデオキシリボヌクレオシド、例えば、DNA内に存在するデオキシリボヌクレオシド(例えば、dA、dG、dC、またはdT)などを含む。
したがって、本開示の核酸(例えば、DNA核酸及びRNA核酸、例えば、mRNA核酸など)は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
本開示の核酸(例えば、DNA核酸及びRNA核酸、例えば、mRNA核酸など)は、いくつかの実施形態では、様々な(2つ以上の)異なる種類の標準的な、及び/または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、1つ、2つまたはそれを超える(任意に異なる)種類の標準的な、及び/または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含有する。
いくつかの実施形態では、細胞または生物中に導入される修飾RNA核酸(例えば、修飾mRNA核酸)は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、細胞または生物のそれぞれで分解の低減を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物中に導入される修飾RNA核酸(例えば、修飾mRNA核酸)は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、細胞または生物のそれぞれで免疫原性の減少(例えば、自然応答の減少)を示す場合がある。
核酸(例えば、RNA核酸、例えば、mRNA核酸など)は、いくつかの実施形態では、核酸の合成中または合成後に導入され、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖上に存在する場合がある。修飾は、化学合成によって、またはポリメラーゼ酵素によって鎖の末端または鎖中のいずれか他の箇所に導入されてよい。核酸の領域のいずれも化学的に修飾されてよい。
本開示は、核酸(例えば、RNA核酸、例えば、mRNA核酸など)の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、1つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むために、任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的、または組換え的方法などによって合成されてよい。核酸は、連結ヌクレオシドの領域(複数可)を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有してよい。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合に、核酸はヌクレオチドの領域を含むことになる。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデノシン-チミン、アデノシン-ウラシル、またはグアノシン-シトシン塩基対だけでなく、非標準的な、または修飾塩基を含むヌクレオチド及び/または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置によって、例えば、少なくとも1つの化学修飾を有するそれらの核酸などにおいて、非標準的な塩基と標準的な塩基との間で、または2つの相補的で非標準的な塩基構造間での水素結合が可能となる。そのような非標準的な塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基/糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示の核酸中に組み込まれてよい。
いくつかの実施形態では、核酸(例えば、RNA核酸、例えば、mRNA核酸など)中の修飾核酸塩基は、N1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、1-エチル-シュードウリジンン(e1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、及び/またはシュードウリジン(ψ)を含む。いくつかの実施形態では、核酸(例えば、RNA核酸、例えば、mRNA核酸など)中の修飾核酸塩基は、5-メトキシメチルウリジン、5-メチルチオウリジン、1-メトキシメチルシュードウリジン、5-メチルシチジン、及び/または5-メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、上述した修飾核酸塩基(化学修飾を含むが、これらに限定されない)のいずれかの少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つまたはそれを超える)の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNA核酸は、核酸の1つ以上または全てのウリジン位置にN1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNA核酸は、核酸の1つ以上または全てのウリジン位置にN1-メチルシュードウリジン(m1ψ)置換及び核酸の1つ以上または全てのシチジン位置に5-メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNA核酸は、核酸の1つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン(ψ)置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNA核酸は、核酸の1つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン(ψ)置換及び核酸の1つ以上または全てのシチジン位置に5-メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のRNA核酸は、核酸の1つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、核酸(例えば、RNA核酸、例えば、mRNA核酸など)は、特定の修飾について均一に修飾される(例えば、完全に修飾される、すなわち、全配列を通して修飾される)。例えば、核酸は、N1-メチル-シュードウリジンで均一に修飾され得、これはmRNA配列中の全てのウリジン残基が、N1-メチル-シュードウリジンで置き換えられていることを意味する。同様に、核酸は、上述したものなどの修飾残基による置換によって配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾されてよい。例えば、1つ以上もしくは全てまたは所与の種類のヌクレオチド(例えば、プリンもしくはピリミジン、またはA、G、U、Cのいずれか1つ以上もしくは全て)が、本開示の核酸内、またはその所定の配列領域内(例えば、ポリA尾部を含むか、もしくはそれを除くmRNA内)で均一に修飾されてよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸内(またはその配列領域内)の全てのヌクレオチドXが修飾ヌクレオチドであり、ここでXは、ヌクレオチドA、G、U、Cのいずれか1つ、または組合せA+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+CもしくはA+G+Cのいずれか1つであってよい。
核酸は、約1%~約100%の修飾ヌクレオチド(全体的なヌクレオチド含有量に関して、または1つ以上の種類のヌクレオチド、すなわち、A、G、UもしくはCのうちいずれか1つ以上に関してのいずれか)、あるいは任意の介在するパーセンテージ(例えば、1%~20%、1%~25%、1%~50%、1%~60%、1%~70%、1%~80%、1%~90%、1%~95%、10%~20%、10%~25%、10%~50%、10%~60%、10%~70%、10%~80%、10%~90%、10%~95%、10%~100%、20%~25%、20%~50%、20%~60%、20%~70%、20%~80%、20%~90%、20%~95%、20%~100%、50%~60%、50%~70%、50%~80%、50%~90%、50%~95%、50%~100%、70%~80%、70%~90%、70%~95%、70%~100%、80%~90%、80%~95%、80%~100%、90%~95%、90%~100%、及び95%~100%)を含有してよい。いずれの残りのパーセンテージも、非修飾A、G、U、またはCの存在によって説明されると理解されることになる。
核酸は、最低でも1%~最大100%の修飾ヌクレオチド、または任意の介在するパーセンテージ、例えば、少なくとも5%の修飾ヌクレオチド、少なくとも10%の修飾ヌクレオチド、少なくとも25%の修飾ヌクレオチド、少なくとも50%の修飾ヌクレオチド、少なくとも80%の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも90%の修飾ヌクレオチドなどを含有してよい。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含有してよい。いくつかの実施形態では、核酸内のウラシルの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%が、修飾ウラシル(例えば、5-置換ウラシル)で置き換えられる。修飾ウラシルは、特有の単一構造を有する化合物で置き換えられ得るか、または異なる構造(例えば、2つ、3つ、4つもしくはそれを超える特有の構造)を有する複数の化合物で置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、核酸内のシトシンの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%が、修飾シトシン(例えば、5-置換シトシン)で置き換えられる。修飾シトシンは、特有の単一構造を有する化合物で置き換えられ得るか、または異なる構造(例えば、2つ、3つ、4つもしくはそれを超える特有の構造)を有する複数の化合物で置き換えられ得る。
10.非翻訳領域(UTR)
非翻訳領域(UTR)は、開始コドン前(5’UTR)及び終止コドン後(3’UTR)の翻訳されないポリヌクレオチドの核酸セクションである。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、UTR(例えば、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはそれらの組合せ)をさらに含む。
非翻訳領域(UTR)は、開始コドン前(5’UTR)及び終止コドン後(3’UTR)の翻訳されないポリヌクレオチドの核酸セクションである。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、UTR(例えば、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはそれらの組合せ)をさらに含む。
UTR(例えば、5’UTRまたは3’UTR)は、ポリヌクレオチド内のコード領域に対して同種または異種であり得る。いくつかの実施形態では、UTRは、OTCポリペプチドをコードするORFと同種である。いくつかの実施形態では、UTRは、OTCポリペプチドをコードするORFに対して異種である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の5’UTRまたはその機能的断片を含み、それらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の3’UTRまたはその機能的断片を含み、それらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組合せが、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルを含む。
UTRは、調節的役割、例えば、安定性、局在化及び/または翻訳効率の増加または低減を提供する特徴を有し得る。UTRを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与され得、1つ以上の調節的特徴が日常的な方法を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、5’UTRまたは3’UTRの機能的断片は、それぞれ全長5’UTRまたは3’UTRの1つ以上の調節的特徴を含む。
天然5’UTRは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られているKozak配列のような特性を保持している。Kozak配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGG(配列番号:214)を有し、ここでRは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、その後に別の「G」が続く。5’UTRはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
特定の標的器官で豊富に発現される遺伝子に通常見られる特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強し得る。例えば、肝臓発現mRNA、例えば、アルブミン、血清アミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第VIII因子などの5’UTRの導入によって、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現が増強され得る。同様に、その組織における発現を改善するための、他の組織特異的mRNAからの5’UTRの使用は、筋肉(例えば、MyoD、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、Herculin)に、内皮細胞(例えば、Tie-1、CD36)に、骨髄細胞(例えば、C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)に、白血球(例えば、CD45、CD18)に、脂肪組織(例えば、CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)に、及び肺上皮細胞(例えば、SP-A/B/C/D)に対して可能である。
いくつかの実施形態では、UTRは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、タンパク質のファミリー(すなわち、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する)に属し得、これらは特定の細胞、組織または発生中のある時期に発現される。遺伝子またはmRNAのいずれかに由来するUTRは、タンパク質の同じまたは異なるファミリーの任意の他のUTRと交換され、新しいポリヌクレオチドを作製し得る。
いくつかの実施形態では、5’UTR及び3’UTRは、異種であり得る。いくつかの実施形態では、5’UTRは、3’UTRとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、3’UTRは、5’UTRとは異なる種に由来し得る。
共同所有の国際特許出願第PCT/US2014/021522号(公開第WO/2014/164253号、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)は、ORFに対するフランキング領域として本発明のポリヌクレオチド内で利用され得る例示的なUTRの一覧を提供する。
本出願の追加の例示的なUTRとしては、以下の核酸配列に由来する1つ以上の5’UTR及び/または3’UTRが挙げられるが、これらに限定されない:グロビン、例えば、α-またはβ-グロビンなど(例えば、Xenopus、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン)、強力なKozak翻訳開始シグナル、CYBA(例えば、ヒトシトクロムb-245αポリペプチド)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン7)、HSD17B4(ヒドロキシステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ)、ウイルス(例えば、タバコエッチウイルス(TEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、デングウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、CMV前初期1(IE1))、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス)、シンドビスウイルス、またはPAVオオムギ黄萎ウイルス)、熱ショックタンパク質(例えば、hsp70)、翻訳開始因子(例えば、elF4G)、グルコース輸送体(例えば、hGLUT1(ヒトグルコース輸送体1))、アクチン(例えば、ヒトαまたはβアクチン)、GAPDH、チューブリン、ヒストン、クエン酸回路酵素、トポイソメラーゼ(例えば、5’TOPモチーフ(オリゴピリミジントラクト)を欠くTOP遺伝子の5’UTR)、リボソームタンパク質Large32(L32)、リボソームタンパク質(例えば、ヒトまたはマウスのリボソームタンパク質、例えば、rps9など)、ATPシンターゼ(例えば、ATP5A1またはミトコンドリアH+-ATPシンターゼのβサブユニット)、成長ホルモンe(例えば、ウシ(bGH)またはヒト(hGH))、伸長因子(例えば、伸長因子1α1(EEF1A1))、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)、筋細胞エンハンサー因子2A(MEF2A)、β-F1-ATPase、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、コラーゲン(例えば、I型コラーゲンアルファ2(Col1A2)、I型コラーゲンアルファ1(Col1A1)、VI型コラーゲンアルファ2(Col6A2)、VI型コラーゲンアルファ1(Col6A1))、リボフォリン(例えば、リボフォリンI(RPNI))、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(例えば、LRP1)、カルジオトロフィン様サイトカイン因子(例えば、Nnt1)、カルレティキュリン(Calr)、プロコラーゲン-リジン、2-オキソグルタル酸5-ジオキシゲナーゼ1(Plod1)、及びヌクレオバインディン(例えば、Nucb1)。
いくつかの実施形態では、5’UTRは、βグロビン5’UTR、強力なKozak翻訳開始シグナルを含有する5’UTR、シトクロムb-245αポリペプチド(CYBA)5’UTR、ヒドロキシステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ(HSD17B4)5’UTR、タバコエッチウイルス(TEV)5’UTR、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(TEEV)5’UTR、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス(RV)RNAの5’近位オープンリーディングフレーム、デングウイルス(DEN)5’UTR、熱ショックタンパク質70(Hsp70)5’UTR、eIF4G 5’UTR、GLUT1 5’UTR、それらの機能的断片及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、3’UTRは、βグロビン3’UTR、CYBA 3’UTR、アルブミン3’UTR、成長ホルモン(GH)3’UTR、VEEV 3’UTR、B型肝炎ウイルス(HBV)3’UTR、α-グロビン3’UTR、DEN 3’UTR、PAVオオムギ黄萎ウイルス(BYDV-PAV)3’UTR、伸長因子1α1(EEF1A1)3’UTR、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)3’UTR、ミトコンドリアH(+)-ATPシンターゼのβサブユニット(β-mRNA)3’UTR、GLUT1 3’UTR、MEF2A 3’UTR、β-F1-ATPase 3’UTR、それらの機能的断片及びそれらの組合せ からなる群から選択される。
任意の遺伝子またはmRNAに由来する野生型UTRは、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、UTRは、例えば、ORFに対してUTRの方向もしくは位置を変化させることによって、または付加ヌクレオチド、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位の包含によって、バリアントUTRを産生するために野生型または天然UTRに対して改変され得る。いくつかの実施形態では、5’UTRまたは3’UTRのバリアントが利用され得、例えば、野生型UTRの変異体、または1つ以上のヌクレオチドがUTRの末端に付加されているか、もしくは末端から除去されているバリアントである。
さらに、1つ以上の合成UTRが、1つ以上の非合成UTRと組み合わせて使用され得る。例えば、Mandal and Rossi,Nat.Protoc.2013 8(3):568-82を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
UTRまたはその一部は、それらが選択された転写物と同じ方向に配置され得るか、または方向もしくは位置が変更され得る。したがって、5’UTR及び/または3’UTRは、逆転、短縮、延長され得るか、または1つ以上の他の5’UTRもしくは3’UTRと組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のUTR、例えば、二重、三重または四重5’UTRまたは3’UTRを含む。例えば、二重UTRは、直列または実質的に直列のいずれかで同じUTRの2つのコピーを含む。例えば、二重ベータ-グロビン3’UTRが使用され得る(US2010/0129877を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含み得る。例えば、ORFには、強力なKozak翻訳開始シグナルを含む5’UTR及び/またはポリA尾部の鋳型付加のためのオリゴ(dT)配列を含む3’UTRが隣接し得る。5’UTRは、同じ及び/または異なるUTRからの第1ポリヌクレオチド断片及び第2ポリヌクレオチド断片を含み得る(例えば、US2010/0293625を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
他の非UTR配列は、本発明のポリヌクレオチド内の領域または小領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれ得る。イントロン配列の組込みは、タンパク質産生に加えてポリヌクレオチド発現レベルを増加させ得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、UTRの代わりに、またはUTRに加えて内部リボソーム進入部位(IRES)を含む(例えば、Yakubov et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.2010 394(1):189-193を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、5’UTR配列の代わりにIRESを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ORF及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、非合成3’UTRと組み合わせて合成5’UTRを含む。
いくつかの実施形態では、UTRはまた、少なくとも1つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント(複数可)(総称して「TEE」、これはポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す)を含み得る。非限定的な例として、TEEは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、5’UTRはTEEを含む。
一態様では、TEEは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳などの核酸の翻訳活性を促進し得る、UTR中の保存エレメントである。
a.5’UTR配列
5’UTR配列は、mRNAへのリボソーム動員に重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている(Hinnebusch A,et al.,(2016)Science,352:6292:1413-6)。
5’UTR配列は、mRNAへのリボソーム動員に重要であり、翻訳において役割を果たすことが報告されている(Hinnebusch A,et al.,(2016)Science,352:6292:1413-6)。
本明細書で開示されるのは、とりわけ、OTCポリペプチド(例えば、配列番号:1または配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAであり、ポリヌクレオチドは、本ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、またはポリヌクレオチド自体の半減期の増加、発現の増加及び/または活性の増加を付与する5’UTRを有する。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、(a)5’-UTR(例えば、表2に提供されるようなもの、またはそのバリアントもしくは断片)、(b)終止エレメントを含むコード領域(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、及び(c)3’-UTR(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、ならびにこれらを含むLNP組成物を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、表2に提供される配列またはそのバリアントもしくは断片(例えば、その機能的バリアントもしくは断片)を含む5’-UTRを含む。
一実施形態では、表2に提供される5’UTR配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの半減期の増加、例えば、ポリヌクレオチドの半減期の約1.5~20倍の増加を有する。一実施形態では、半減期の増加は、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍もしくは20倍、またはそれを超える。一実施形態では、半減期の増加は、約1.5倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約2倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約3倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約4倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約5倍以上である。
一実施形態では、表2に提供される5’UTR配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び/または活性、例えば、産生量の増加をもたらす。一実施形態では、5’UTRは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び/または活性、例えば、産生量の約1.5~20倍の増加をもたらす。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍もしくは20倍、またはそれを超える。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約1.5倍以上である。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約2倍以上である。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約3倍以上である。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約4倍以上である。一実施形態では、レベル及び/または活性の増加は、約5倍以上である。
一実施形態では、増加は、5’UTRを有しないか、異なる5’UTRを有するか、あるいは表2に記載される5’UTRまたはそのバリアントもしくは断片を有しない、他の類似したポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドの半減期の増加は、ポリヌクレオチドの半減期を測定するアッセイによって測定される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び/または活性、例えば、産生量の増加は、ポリペプチドのレベル及び/または活性を測定するアッセイによって測定される。
一実施形態では、5’UTRは、表2に提供される配列または表2に提供される5’UTR配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列、あるいはそのバリアントまたは断片を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:50、配列番号:51、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列番号:56、配列番号:57または配列番号:58に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、5’UTRは、配列番号:50に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:51に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:52に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:53に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:54に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:55に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:56に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:57に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:58に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、5’UTRは、配列番号:58の配列を含む。一実施形態では、5’UTRは、配列番号:58の配列からなる。
一実施形態では、5’UTRは、配列番号:50のバリアントを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、式A:
G G A A A U C G C A A A A (N2)X (N3)X C U (N4)X (N5)X C G C G U U A G A U U U C U U U U A G U U U U C U N6 N7 C A A C U A G C A A G C U U U U U G U U C U C G C C (N8 C C)x (配列番号:59)
の核酸配列を含み、
式中、
(N2)xはウラシルであり、xは0~5の整数であり、例えば、式中x=3または4であり、
(N3)xはグアニンであり、xは0~1の整数であり、
(N4)xはシトシンであり、xは0~1の整数であり、
(N5)xはウラシルであり、xは0~5の整数であり、例えば、式中x=2または3であり、
N6は、ウラシルまたはシトシンであり、
N7は、ウラシルまたはグアニンであり、
N8は、アデニンまたはグアニンであり、xは0~1の整数である。
G G A A A U C G C A A A A (N2)X (N3)X C U (N4)X (N5)X C G C G U U A G A U U U C U U U U A G U U U U C U N6 N7 C A A C U A G C A A G C U U U U U G U U C U C G C C (N8 C C)x (配列番号:59)
の核酸配列を含み、
式中、
(N2)xはウラシルであり、xは0~5の整数であり、例えば、式中x=3または4であり、
(N3)xはグアニンであり、xは0~1の整数であり、
(N4)xはシトシンであり、xは0~1の整数であり、
(N5)xはウラシルであり、xは0~5の整数であり、例えば、式中x=2または3であり、
N6は、ウラシルまたはシトシンであり、
N7は、ウラシルまたはグアニンであり、
N8は、アデニンまたはグアニンであり、xは0~1の整数である。
一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは0である。一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは1である。一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは2である。一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは3である。一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは4である。一実施形態では、(N2)xはウラシルであり、xは5である。
一実施形態では、(N3)xはグアニンであり、xは0である。一実施形態では、(N3)xはグアニンであり、xは1である。
一実施形態では、(N4)xはシトシンであり、xは0である。一実施形態では、(N4)xはシトシンであり、xは1である。
一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは0である。一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは1である。一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは2である。一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは3である。一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは4である。一実施形態では、(N5)xはウラシルであり、xは5である。
一実施形態では、N6はウラシルである。一実施形態では、N6はシトシンである。
一実施形態では、N7はウラシルである。一実施形態では、N7はグアニンである。
一実施形態では、N8はアデニンであり、xは0である。一実施形態では、N8はアデニンであり、xは1である。
一実施形態では、N8はグアニンであり、xは0である。一実施形態では、N8はグアニンであり、xは1である。
一実施形態では、5’UTRは、配列番号:50のバリアントを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも50%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも60%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも70%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも96%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも97%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも98%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、配列番号:50に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも5%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも10%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも20%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも30%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも40%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも50%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも60%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも70%のウリジン含有量を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも80%のウリジン含有量を含む。
一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個または7個の連続したウリジン(例えば、ポリウリジントラクト)を含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアント中におけるポリウリジントラクトは、少なくとも1~7個、2~7個、3~7個、4~7個、5~7個、6~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、2~6個、または3~5個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアント中におけるポリウリジントラクトは、4個の連続したウリジンを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアント中におけるポリウリジントラクトは、5個の連続したウリジンを含む。
一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、または15個のポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、3個のポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、4個のポリウリジントラクトを含む。一実施形態では、配列番号:50のバリアントは、5個のポリウリジントラクトを含む。
一実施形態では、ポリウリジントラクトのうち1個以上が、異なるポリウリジントラクトに隣接している。一実施形態では、ポリウリジントラクトの各々、例えば、全てが互いに隣接し、例えば、ポリウリジントラクトの全てが連続している。
一実施形態では、ポリウリジントラクトのうち1個以上が、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、2個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個または60個のヌクレオチドによって分離されている。一実施形態では、ポリウリジントラクトの各々、例えば、全てが1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、2個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個または60個のヌクレオチドによって分離されている。
一実施形態では、第1ポリウリジントラクト及び第2ポリウリジントラクトが、互いに隣接している。
一実施形態では、後続の、例えば、第3、第4、第5、第6もしくは第7、第8、第9、または第10ポリウリジントラクトは、第1ポリウリジントラクト、第2ポリウリジントラクト、または後続のポリウリジントラクトのいずれか1つから1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、2個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個または60個のヌクレオチドによって分離されている。
一実施形態では、第1ポリウリジントラクトは、後続のポリウリジントラクト、例えば、第2、第3、第4、第5、第6もしくは第7、第8、第9、または第10ポリウリジントラクトから1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、2個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個または60個のヌクレオチドによって分離されている。一実施形態では、後続のポリウリジントラクトのうち1個以上が、異なるポリウリジントラクトに隣接している。
一実施形態では、5’UTRは、Kozak配列、例えば、GCCRCCヌクレオチド配列(配列番号:79)を含み、式中、Rはアデニンまたはグアニンである。一実施形態では、Kozak配列は、5’UTR配列の3’末端に配置される。
一態様では、OTCポリペプチド(例えば、配列番号:1または配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームを含み、本明細書に開示される5’UTR配列を含むポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、LNPとして製剤化される。一実施形態では、LNP組成物は、(i)イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、(ii)ステロールまたは他の構造脂質、(iii)非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び(iv)PEG脂質を含む。
別の態様では、本開示のLNP組成物は、対象においてOTCDを治療する方法に使用される。
一態様では、例えば、本明細書に記載されるような、OTCポリペプチドをコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むLNP組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、追加の薬剤と共に投与され得る。
b.3’UTR配列
3’UTR配列は、mRNAの翻訳、半減期、及び細胞内局在化に影響を及ぼすことが示されている(Mayr C.,Cold Spring Harb Persp Biol 2019 Oct 1;11(10):a034728)。
3’UTR配列は、mRNAの翻訳、半減期、及び細胞内局在化に影響を及ぼすことが示されている(Mayr C.,Cold Spring Harb Persp Biol 2019 Oct 1;11(10):a034728)。
本明細書で開示されるのは、とりわけ、OTCポリペプチド(例えば、配列番号:1または配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAであり、ポリヌクレオチドは、本ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの、またはポリヌクレオチド自体の半減期の増加、発現の増加及び/または活性の増加を付与する3’UTRを有する。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、(a)5’-UTR(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、(b)終止エレメントを含むコード領域(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、及び(c)3’-UTR(例えば、表3に提供されるようなもの、またはそのバリアントもしくは断片)、ならびにこれらを含むLNP組成物を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、表3に提供される配列またはそのバリアントもしくは断片を含む3’-UTRを含む。
一実施形態では、表3に提供される3’UTR配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの半減期の増加、例えば、ポリヌクレオチドの半減期の約1.5~10倍の増加をもたらす。一実施形態では、半減期の増加は、約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、またはそれを超える。一実施形態では、半減期の増加は、約1.5倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約2倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約3倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約4倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約5倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約6倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約7倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約8倍である。一実施形態では、半減期の増加は、約9倍以上である。一実施形態では、半減期の増加は、約10倍以上である。
一実施形態では、表3に提供される3’UTR配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、10超の平均半減期スコアを有するポリヌクレオチドをもたらす。
一実施形態では、表3に提供される3’UTR配列またはそのバリアントもしくは断片を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのレベル及び/または活性、例えば、産生量の増加をもたらす。
一実施形態では、増加は、3’UTRを有しないか、異なる3’UTRを有するか、あるいは表3の3’UTRまたはそのバリアントもしくは断片を有しない、他の類似したポリヌクレオチドと比較される。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、表3に提供される3’UTR配列または表3に提供される3’UTR配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列、あるいはその断片を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:100、配列番号:101、配列番号:102、配列番号:103、配列番号:104、配列番号:105、配列番号:106、配列番号:107、配列番号:108、配列番号:109、配列番号:110、配列番号:111、配列番号:112、配列番号:113、配列番号:114、または配列番号:115に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、3’UTRは、配列番号:100の配列、または配列番号:100に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:101の配列、または配列番号:101に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:102の配列、または配列番号:102に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:103の配列、または配列番号:103に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:104の配列、または配列番号:104に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:105の配列、または配列番号:105に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:106の配列、または配列番号:106に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:107の配列、または配列番号:107に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:108の配列、または配列番号:108に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:109の配列、または配列番号:109に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:110の配列、または配列番号:110に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:111の配列、または配列番号:111に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:112の配列、または配列番号:112に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:113の配列、または配列番号:113に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:114の配列、または配列番号:114に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:115の配列、または配列番号:115に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、3’UTRは、例えば、本明細書に記載されるようなマイクロRNA(miRNA)結合部位を含み、これはヒト細胞内に存在するmiRに結合する。一実施形態では、3’UTRは、配列番号:212、配列番号:174、配列番号:152またはそれらの組合せのmiRNA結合部位を含む。一実施形態では、3’UTRは、複数のmiRNA結合部位、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つのmiRNA結合部位を含む。一実施形態では、複数のmiRNA結合部位は、同じまたは異なるmiRNA結合部位を含む。
miR122bs=CAAACACCAUUGUCACACUCCA(配列番号:212)
miR-142-3p bs=UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA(配列番号:174)
miR-126bs=CGCAUUAUUACUCACGGUACGA(配列番号:152)
miR122bs=CAAACACCAUUGUCACACUCCA(配列番号:212)
miR-142-3p bs=UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA(配列番号:174)
miR-126bs=CGCAUUAUUACUCACGGUACGA(配列番号:152)
一態様では、本明細書に開示されるのは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、(a)例えば、本明細書に記載されるような5’-UTR、(b)終止エレメントを含むコード領域(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、及び(c)3’-UTR(例えば、本明細書に記載されるようなもの)を含む。
一態様では、OTCポリペプチド(例えば、配列番号:1または配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームを含み、本明細書に開示される3’UTRを含むポリヌクレオチドを含むLNP組成物は、(i)イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、(ii)ステロールまたは他の構造脂質、(iii)非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び(iv)PEG脂質を含む。
別の態様では、本開示のLNP組成物は、対象におけるOTCDを治療する方法に使用される。
一態様では、例えば、本明細書に記載されるような、OTCポリペプチドをコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むLNP組成物は、例えば、本明細書に記載されるような、追加の薬剤と共に投与され得る。
11.マイクロRNA(miRNA)結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対して偽受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むとみなされる。
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対して偽受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むとみなされる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、1つ以上のmiRNA結合部位(複数可)をさらに含む。miRNA結合部位(複数可)の包含または組込みは、天然に存在するmiRNAの組織特異的及び/または細胞型特異的発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチドの制御をもたらし、それにより、それらからコードされるポリペプチドの制御をもたらす。
本発明はまた、上に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤も提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化核酸配列に対して高い配列同一性を有するポリヌクレオチド(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、結合するmiRNA結合部位をさらに含む。
miRNA、例えば、天然に存在するmiRNAは、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドの安定性を減少させるか、または翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する19~25ヌクレオチド長の非コードRNAである。miRNA配列は「シード」領域、すなわち、成熟miRNAの2~8位の領域内における配列を含む。miRNAシードは、成熟miRNAの2~8位または2~7位を含み得る。
マイクロRNAは、RNA転写物の、それらが折り畳まれて、多くの場合にプレmiRNA(前駆体miRNA)と称される短いヘアピン構造を形成している領域から酵素的に生じる。プレmiRNAは通常、その3’末端に2ヌクレオチドオーバーハングを有し、3’ヒドロキシル基及び5’リン酸基を有する。この前駆体mRNAは核内で処理され、続いて細胞質に輸送されてDICER(RNaseIII酵素)によってさらに処理され、およそ22ヌクレオチドの成熟マイクロRNAを形成する。次いで、成熟マイクロRNAはリボ核粒子に組み込まれ、遺伝子サイレンシングを媒介するRNA誘導サイレンシング複合体であるRISCを形成する。成熟miRNAに関する当該技術分野において認識されている命名法は通常、成熟miRNAが由来するプレmiRNAのアームを指定し、「5p」は、マイクロRNAがプレmiRNAヘアピンの5プライムアームに由来することを意味し、「3p」は、マイクロRNAがプレmiRNAヘアピンの3プライム末端に由来することを意味する。本明細書で数字によって言及されるmiRは、同じプレmiRNAの対向するアームに由来する2つの成熟マイクロRNAのいずれか(例えば、3pまたは5pマイクロRNAのいずれか)を指し得る。本明細書で言及される全てのmiRは、3pまたは5pの指定によって特に指定されない限り、3p及び5pアーム/配列の両方を含むことを意図している。
本明細書で使用される場合、「マイクロRNA(miRNAまたはmiR)結合部位」という用語は、ポリヌクレオチド内、例えば、DNA内またはRNA転写物内(5’UTR及び/または3’UTR内を含む)の配列を指し、これはmiRNAと相互作用するか、miRNAと会合するか、またはmiRNAに結合するために、miRNAの全部または領域に対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするORFを含む本発明のポリヌクレオチドは、1つ以上のmiRNA結合部位(複数可)をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))の5’UTR及び/または3’UTRは、1つ以上のmiRNA結合部位(複数可)を含む。
miRNAに対して十分な相補性を有するmiRNA結合部位は、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介調節、例えば、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介翻訳抑制または分解を促進するのに十分な相補性の程度を指す。本発明の例示的な態様では、miRNAに対して十分な相補性を有するmiRNA結合部位は、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介分解、例えば、mRNAのmiRNA誘導RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)媒介切断を促進するのに十分な相補性の程度を指す。miRNA結合部位は、例えば、19~25ヌクレオチド長のmiRNA配列、19~23ヌクレオチド長のmiRNA配列、または22ヌクレオチド長のmiRNA配列に対して相補性を有し得る。miRNA結合部位は、miRNAの一部にのみ、例えば、天然に存在するmiRNA配列の全長の1、2、3、もしくは4ヌクレオチド未満の部分、または天然に存在するmiRNA配列よりも短い1、2、3、もしくは4ヌクレオチド未満の部分に相補的であり得る。完全な(full)、または完全な(complete)相補性(例えば、天然に存在するmiRNAの全長の全てまたはかなりの部分に対する完全な(full)相補性または完全な(complete)相補性)は、所望の調節がmRNA分解である場合に好ましい。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列と相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列と相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列と完全な相補性を有する配列を含む。他の実施形態では、配列は完全に相補的ではない。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、1つ、2つ、または3つのヌクレオチド置換、末端付加、及び/または切断を除いて、miRNA配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAと同じ長さである。他の実施形態では、miRNA結合部位は、5’末端、3’末端、または両方において対応するmiRNAよりも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12ヌクレオチド(複数可)短い。さらに他の実施形態では、マイクロRNA結合部位は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNAよりも2ヌクレオチド短い。対応するmiRNAよりも短いmiRNA結合部位は、依然として、miRNA結合部位のうち1つ以上を組み込んだmRNAを分解できるか、またはmRNAの翻訳を阻止できる。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、Dicerを含有する活性RISCの一部である、対応する成熟miRNAと結合する。別の実施形態では、miRNA結合部位がRISC内の対応するmiRNAと結合すると、miRNA結合部位を含有するmRNAが分解されるか、またはmRNAの翻訳が阻止される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、miRNAに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチド内で不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12のミスマッチ(複数可)を有する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAの少なくとも約10個、少なくとも約11個、少なくとも約12個、少なくとも約13個、少なくとも約14個、少なくとも約15個、少なくとも約16個、少なくとも約17個、少なくとも約18個、少なくとも約19個、少なくとも約20個、または少なくとも約21個の連続ヌクレオチドにそれぞれ相補的な、少なくとも約10個、少なくとも約11個、少なくとも約12個、少なくとも約13個、少なくとも約14個、少なくとも約15個、少なくとも約16個、少なくとも約17個、少なくとも約18個、少なくとも約19個、少なくとも約20個、または少なくとも約21個の連続ヌクレオチドを有する。
1つ以上のmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことにより、問題となっているmiRNAが利用可能であることを条件として、ポリヌクレオチドが分解のために、または翻訳減少のために標的とされ得る。これによって、ポリヌクレオチド送達時のオフターゲット効果が減少し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドが組織または細胞に送達されることを意図していないが、その組織または細胞に到達してしまう場合には、miRNAの1つまたは複数の結合部位が、ポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRに組み込まれる場合、組織または細胞内の豊富なmiRNAが、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のmRNAに対する1つ以上のmiRNA結合部位の組込みは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険性を減少させ、及び/またはmRNAによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異的制御を可能にする場合がある。さらに他の実施形態では、本開示のmRNAに対する1つ以上のmiRNA結合部位の組込みは、インビボでの核酸送達時に免疫応答を調節し得る。さらなる実施形態では、本開示のmRNAに対する1つ以上のmiRNA結合部位の組込みは、本明細書に記載される脂質を含む化合物及び組成物の加速血液クリアランス(ABC)を調節し得る。
逆に、miRNA結合部位は、それらが特定の組織内でタンパク質発現の増加を自然に生じさせるポリヌクレオチド配列から除去され得る。例えば、特定のmiRNAの結合部位は、miRNAを含有する組織または細胞内でタンパク質発現を改善するために、ポリヌクレオチドから除去され得る。
複数の組織内における発現の制御は、1つ以上のmiRNA結合部位、例えば、1つ以上の異なるmiRNA結合部位の導入または除去によって達成され得る。miRNA結合部位を除去または挿入するかどうかの決定は、発生及び/または疾患における組織及び/または細胞でのmiRNA発現パターン及び/またはそれらのプロファイリングに基づいて行われ得る。miRNA、miRNA結合部位、ならびにそれらの生物学における発現パターン及び役割の同定が報告されている(例えば、Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11:943-949、Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176、Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356)、Bartel Cell 2009 136:215-233、Landgraf et al,Cell,2007 129:1401-1414、Gentner and Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403及び当該文献における全ての参考文献、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
miRNAがmRNAを制御することによって、タンパク質発現を制御することが知られている組織の例としては、肝臓(miR-122)、筋肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮細胞(miR-17-92、miR-126)、骨髄細胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪組織(let-7、miR-30c)、心臓(miR-1d、miR-149)、腎臓(miR-192、miR-194、miR-204)、及び肺上皮細胞(let-7、miR-133、miR-126)が挙げられるが、これらに限定されない。
特に、miRNAは、免疫細胞(造血細胞とも呼ばれる)、例えば、抗原提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞及びマクロファージ)、マクロファージ、単球、Bリンパ球、Tリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて差次的に発現されることが知られている。免疫細胞特異的miRNAは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症に加えて、遺伝子治療及び組織/臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的miRNAはまた、造血細胞(免疫細胞)の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの側面を制御する。例えば、miR-142及びmiR-146は、免疫細胞内でのみ発現され、特に骨髄樹状細胞内に多く存在する。ポリヌクレオチドに対する免疫応答が、ポリヌクレオチドの3’-UTRにmiR-142結合部位を付加することによって遮断され得、これにより、組織及び細胞内でより安定した遺伝子導入が可能になることが実証されている。miR-142は、抗原提示細胞内で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する(例えば、Annoni A et al.,blood,2009,114,5152-5161、Brown BD,et al.,Nat med.2006,12(5),585-591、Brown BD,et al.,blood,2007,110(13):4144-4152、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
抗原媒介免疫応答は、外来抗原によって誘発される免疫応答を指し得、抗原が生物内に侵入すると、抗原提示細胞によって処理されて抗原提示細胞の表面上に提示される。T細胞は提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導し得る。
本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRに1つ以上(例えば、1つ、2つ、または3つ)のmiR-142結合部位を導入することによって、miR-142媒介分解を介して抗原提示細胞内での遺伝子発現が選択的に抑制され、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)における抗原提示を制限し、それによってポリヌクレオチドの送達後の抗原媒介免疫応答を阻止し得る。次いで、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を誘発することなく、標的組織または細胞内で安定に発現される。
いくつかの実施形態では、複数のmiRで同じ細胞型を標的とし、3p及び5pアームの両方が豊富な場合には、その各々に結合部位を組み込むことが有益な場合がある(例えば、miR-142-3p及びmiR142-5pの両方が、造血幹細胞内で豊富である)。したがって、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、(i)miR-142、miR-144、miR-150、miR-155及びmiR-223(これらは多くの造血細胞内で発現される)からなる群、もしくは(ii)miR-142、miR150、miR-16及びmiR-223(これらはB細胞内で発現される)からなる群、またはmiR-223、miR-451、miR-26a、miR-16(これらは前駆造血細胞内で発現される)からなる群に由来する2つ以上の(例えば、2つ、3つ、4つの、またはそれを超える)miR結合部位を含有する。
いくつかの実施形態では、複数の目的の細胞型が同時に標的とされるように、様々なmiRを組み合わせることも有益な場合がある(例えば、造血系及び内皮細胞の多くの細胞を標的とするためのmiR-142及びmiR-126)。したがって、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、2つ以上の(例えば、2つ、3つ、4つの、またはそれを超える)miRNA結合部位を含み、(i)miRのうち少なくとも1つが、造血系の細胞を標的とし(例えば、miR-142、miR-144、miR-150、miR-155もしくはmiR-223)、miRのうち少なくとも1つが、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする(例えば、miR-126)か、または(ii)miRのうち少なくとも1つが、B細胞を標的とし(例えば、miR-142、miR150、miR-16もしくはmiR-223)、miRのうち少なくとも1つが、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする(例えば、miR-126)か、または(iii)miRのうち少なくとも1つが、前駆造血細胞を標的とし(例えば、miR-223、miR-451、miR-26aもしくはmiR-16)、miRのうち少なくとも1つが、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする(例えば、miR-126)か、または(iv)miRのうち少なくとも1つが、造血系の細胞を標的とし(例えば、miR-142、miR-144、miR-150、miR-155もしくはmiR-223)、miRのうち少なくとも1つがB細胞を標的とし(例えば、miR-142、miR150、miR-16もしくはmiR-223)、miRのうち少なくとも1つが、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする(例えば、miR-126)か、あるいは前述した4つのクラスのmiR結合部位(すなわち、造血系を標的とするもの、B細胞を標的とするもの、前駆造血細胞を標的とするもの、及び/または形質細胞様樹状細胞/血小板/内皮細胞を標的とするもの)の任意の他の可能な組合せである。
一実施形態では、免疫応答を調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはTLR7及び/またはTLR8を発現し、炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する任意の細胞内において(例えば、末梢リンパ器官及び/または脾細胞及び/または内皮細胞の免疫細胞内において)発現される1つ以上のmiRに結合する1つ以上のmiRNA結合配列を含み得る。現在、従来の免疫細胞またはTLR7及び/またはTLR8を発現し、炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する任意の細胞内において(例えば、末梢リンパ器官及び/または脾細胞及び/または内皮細胞の免疫細胞内において)発現される1つ以上のmiRのmRNAに対する組込みが、免疫細胞活性化(例えば、活性化B細胞の頻度によって測定されるような、B細胞の活性化)及び/またはサイトカイン産生(例えば、IL-6、IFN-γ及び/またはTNFαの産生)を減少させるか、または阻害することが発見されている。さらに、現在、従来の免疫細胞またはTLR7及び/またはTLR8を発現し、炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する任意の細胞内において(例えば、末梢リンパ器官及び/または脾細胞及び/または内皮細胞の免疫細胞内において)発現される1つ以上のmiRのmRNAに対する組込みが、mRNAによってコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体(ADA)応答を減少させ得るか、または阻害し得ることが発見されている。
別の実施形態では、脂質を含む化合物または組成物内の送達されるポリヌクレオチドの加速血液クリアランスを調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはTLR7及び/またはTLR8を発現し、炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する任意の細胞内において(例えば、末梢リンパ器官及び/または脾細胞及び/または内皮細胞の免疫細胞内において)発現される1つ以上のmiRNAに結合する1つ以上のmiR結合配列を含み得る。現在、1つ以上のmiR結合部位のmRNAに対する組込みが、mRNAの送達に使用するための脂質を含む化合物または組成物の加速血液クリアランス(ABC)を減少させるか、または阻害することが発見されている。さらに、現在、mRNAに対する1つ以上のmiR結合部位の組込みが、抗PEG抗IgMの血清レベルを減少させ(例えば、B細胞によってポリエチレングリコール(PEG)を認識するIgMの急性産生を減少させるか、もしくは阻害する)、及び/またはmRNAを含む脂質を含む化合物もしくは組成物の投与後における形質細胞様樹状細胞の増殖及び/または活性化を減少させるか、もしくは阻害することが発見されている。
いくつかの実施形態では、miR配列は、米国公開第US2005/0261218号及び米国公開第US2005/0059005号(その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に教示されるものを含むが、これらに限定されない、免疫細胞内で発現される任意の既知のマイクロRNAに対応してよい。免疫細胞内で発現されるmiRの非限定的な例としては、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、B細胞、T細胞及び/またはマクロファージ内で発現されるものが挙げられる。例えば、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24及びmiR-27は骨髄細胞内で発現され、miR-155は樹状細胞、B細胞及びT細胞内で発現され、miR-146はTLR刺激時にマクロファージ内で上方制御され、miR-126は形質細胞様樹状細胞内で発現される。ある特定の実施形態では、miR(複数可)は、免疫細胞内で豊富に、または選択的に発現される。例えば、miR-142(miR-142-3p及び/またはmiR-142-5p)、miR-126(miR-126-3p及び/またはmiR-126-5p)、miR-146(miR-146-3p及び/またはmiR-146-5p)ならびにmiR-155(miR-155-3p及び/またはmiR155-5p)は、免疫細胞内で豊富に発現される。これらのマイクロRNA配列は、当該技術分野において既知であり、それゆえ当業者であれば、ワトソン・クリック相補性に基づいてこれらのマイクロRNAが結合することになる結合配列または標的配列を容易に設計し得る。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じmiRNA結合部位の3つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じmiR結合部位の3つのコピーの使用は、単一miRNA結合部位の使用と比較した場合に有益な特性を示し得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現される少なくとも2つの異なるmiR結合部位の2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ)のコピーを含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現されるマイクロRNAに対して少なくとも2つのmiR結合部位を含み、miR結合部位のうち1つは、miR-142-3pに対するものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miR-142-3p及びmiR-155(miR-155-3pもしくはmiR-155-5p)、miR-142-3p及びmiR-146(miR-146-3もしくはmiR-146-5p)、またはmiR-142-3p及びmiR-126(miR-126-3pもしくはmiR-126-5p)に対する結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現されるマイクロRNAに対して少なくとも2つのmiR結合部位を含み、miR結合部位のうち1つは、miR-126-3pに対するものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miR-126-3p及びmiR-155(miR-155-3pもしくはmiR-155-5p)、miR-126-3p及びmiR-146(miR-146-3pもしくはmiR-146-5p)、またはmiR-126-3p及びmiR-142(miR-142-3pもしくはmiR-142-5p)に対する結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現されるマイクロRNAに対して少なくとも2つのmiR結合部位を含み、miR結合部位のうち1つは、miR-142-5pに対するものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miR-142-5p及びmiR-155(miR-155-3pもしくはmiR-155-5p)、miR-142-5p及びmiR-146(miR-146-3もしくはmiR-146-5p)、またはmiR-142-5p及びmiR-126(miR-126-3pもしくはmiR-126-5p)に対する結合部位を含む。
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞内で発現されるマイクロRNAに対して少なくとも2つのmiR結合部位を含み、miR結合部位のうち1つは、miR-155-5pに対するものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miR-155-5p及びmiR-142(miR-142-3pもしくはmiR-142-5p)、miR-155-5p及びmiR-146(miR-146-3もしくはmiR-146-5p)、またはmiR-155-5p及びmiR-126(miR-126-3pもしくはmiR-126-5p)に対する結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を含み、miRNA結合部位は、miRNA結合部位配列のうち任意の1つ以上の、1つ以上のコピーを含む、表4から選択される1つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、表4から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれを超える同じまたは異なるmiRNA結合部位(それらの任意の組合せを含む)をさらに含む。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-142に結合するか、またはmiR-142に相補的である。いくつかの実施形態では、miR-142は、配列番号:172を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-142-3pまたはmiR-142-5pに結合する。いくつかの実施形態では、miR-142-3p結合部位は、配列番号:174を含む。いくつかの実施形態では、miR-142-5p結合部位は、配列番号:210を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、配列番号:174または配列番号:210と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-126に結合するか、またはmiR-126に相補的である。いくつかの実施形態では、miR-126は、配列番号:150を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-126-3pまたはmiR-126-5pに結合する。いくつかの実施形態では、miR-126-3p結合部位は、配列番号:152を含む。いくつかの実施形態では、miR-126-5p結合部位は、配列番号:154を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、配列番号:152または配列番号:154と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおいてポリヌクレオチドの任意の位置(例えば、5’UTR及び/または3’UTR)に挿入される。いくつかの実施形態では、5’UTRは、miRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、3’UTRは、miRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、5’UTR及び3’UTRは、miRNA結合部位を含む。ポリヌクレオチド中の挿入部位は、ポリヌクレオチド内でのmiRNA結合部位の挿入が、対応するmiRNAが存在しない場合は機能的ポリペプチドの翻訳に干渉しない限り、ポリヌクレオチド中のいずれの箇所にも存在し得、miRNAが存在する場合は、ポリヌクレオチド内でのmiRNA結合部位の挿入及びmiRNA結合部位と対応するmiRNAとの結合は、ポリヌクレオチドを分解できるか、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻止できる。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、ORFを含む本発明のポリヌクレオチド内においてORFの終止コドンから少なくとも約30ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド内においてORFの終止コドンから少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約35ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約45ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約55ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約65ヌクレオチド、少なくとも約70ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、少なくとも約80ヌクレオチド、少なくとも約85ヌクレオチド、少なくとも約90ヌクレオチド、少なくとも約95ヌクレオチド、または少なくとも約100ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド内においてORFの終止コドンから約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、約20ヌクレオチド~約90ヌクレオチド、約30ヌクレオチド~約80ヌクレオチド、約40ヌクレオチド~約70ヌクレオチド、約50ヌクレオチド~約60ヌクレオチド、約45ヌクレオチド~約65ヌクレオチド下流に挿入される。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、mRNA内のコード領域の終止コドン直後の3’UTR内に挿入される。いくつかの実施形態では、構築物中に終止コドンの複数コピーが存在する場合、最後の終止コドンの直後にmiRNA結合部位が挿入される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、終止コドンのさらに下流に挿入され、その場合、終止コドンとmiR結合部位(複数可)との間に3’UTR塩基が存在する。
いくつかの実施形態では、1つ以上のmiRNA結合部位が、5’UTR内の1つ以上の可能な挿入部位に配置され得る。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、終止コドン後1~100ヌクレオチドの3’UTR内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、終止コドン後30~50ヌクレオチドの3’UTR内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、終止コドン後、少なくとも50ヌクレオチドの3’UTR内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、終止コドン直後の3’UTR内に、または終止コドン後15~20ヌクレオチドの3’UTR内に、または終止コドン後70~80ヌクレオチドの3’UTR内に位置する。他の実施形態では、3’UTRは、2つ以上のmiRNA結合部位(例えば、2~4つのmiRNA結合部位)を含み、各miRNA結合部位間にスペーサー領域(例えば、10~100、20~70または30~50ヌクレオチド長)が存在し得る。別の実施形態では、3’UTRは、miRNA結合部位(複数可)の末端とポリA尾部ヌクレオチドとの間にスペーサー領域を含む。例えば、10~100、20~70または30~50ヌクレオチド長のスペーサー領域が、miRNA結合部位(複数可)の末端とポリA尾部の先頭との間に位置し得る。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、開始コドン前(その上流)の1~100ヌクレオチドの5’UTR内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、開始コドン前(その上流)の10~50ヌクレオチドの5’UTR内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、開始コドン前(その上流)の少なくとも25ヌクレオチドの5’UTR内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞内で発現されるmiRに対する少なくとも1つのマイクロRNA結合部位が、開始コドン直前の5’UTR内に、または開始コドン前の15~20ヌクレオチドの5’UTR内に、または開始コドン前の70~80ヌクレオチドの5’UTR内に位置する。他の実施形態では、5’UTRは、2つ以上のmiRNA結合部位(例えば、2~4つのmiRNA結合部位)を含み、各miRNA結合部位間にスペーサー領域(例えば、10~100、20~70または30~50ヌクレオチド長)が存在し得る。
一実施形態では、3’UTRは2つ以上の終止コドンを含み、少なくとも1つのmiRNA結合部位が、終止コドンの下流に位置する。例えば、3’UTRは、1つ、2つまたは3つの終止コドンを含み得る。使用され得る三重終止コドンの非限定的な例としては、UGAUAAUAG(配列番号:182)、UGAUAGUAA(配列番号:183)、UAAUGAUAG(配列番号:184)、UGAUAAUAA(配列番号:185)、UGAUAGUAG(配列番号:186)、UAAUGAUGA(配列番号:187)、UAAUAGUAG(配列番号:188)、UGAUGAUGA(配列番号:179)、UAAUAAUAA(配列番号:180)、及びUAGUAGUAG(配列番号:181)が挙げられる。3’UTR内では、例えば、1つ、2つ、3つまたは4つのmiRNA結合部位、例えば、miR-142-3p結合部位が、終止コドン(複数可)にすぐ隣接して、または最終終止コドンの任意の数のヌクレオチド下流に配置され得る。3’UTRが複数のmiRNA結合部位を含む場合、これらの結合部位は、構築物中で互いに直接隣接して(すなわち、1つずつ順に)配置され得るか、または代わりに、スペーサーヌクレオチドが各結合部位間に配置され得る。
一実施形態では、3’UTRは、第3終止コドンの下流に位置する単一のmiR-142-3p結合部位を有する3つの終止コドンを含む。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、5’UTR、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞内で発現されるmiRに対して少なくとも1つのmiRNA結合部位を含む3’UTR、及び連結ヌクレオシドの3’テーリング領域を含む。様々な実施形態では、3’UTRは、免疫細胞内で発現される、好ましくは免疫細胞内で豊富に、または選択的に発現されるmiRに対して1~4つ、少なくとも2つ、1つ、2つ、3つまたは4つのmiRNA結合部位を含む。
一実施形態では、免疫細胞内で発現される少なくとも1つのmiRNAは、miR-142-3pマイクロRNA結合部位である。一実施形態では、miR-142-3pマイクロRNA結合部位は、配列番号:174に示される配列を含む。
一実施形態では、免疫細胞内で発現される少なくとも1つのmiRNAは、miR-126マイクロRNA結合部位である。一実施形態では、miR-126結合部位は、miR-126-3p結合部位である。一実施形態では、miR-126-3pマイクロRNA結合部位は、配列番号:152に示される配列を含む。
本開示のマイクロRNA結合部位(複数可)が結合し得るmiRの非限定的で例示的な配列としては、以下が挙げられる:miR-142-3p(配列番号:173)、miR-142-5p(配列番号:175)、miR-146-3p(配列番号:155)、miR-146-5p(配列番号:156)、miR-155-3p(配列番号:157)、miR-155-5p(配列番号:158)、miR-126-3p(配列番号:151)、miR-126-5p(配列番号:153)、miR-16-3p(配列番号:159)、miR-16-5p(配列番号:160)、miR-21-3p(配列番号:161)、miR-21-5p(配列番号:162)、miR-223-3p(配列番号:163)、miR-223-5p(配列番号:164)、miR-24-3p(配列番号:165)、miR-24-5p(配列番号:166)、miR-27-3p(配列番号:167)及びmiR-27-5p(配列番号:168)。免疫細胞内で発現される(例えば、免疫細胞内で豊富に、または選択的に発現される)他の好適なmiR配列が、当該技術分野において既知かつ利用可能であり、例えば、University of ManchesterのマイクロRNAデータベースであるmiRBaseから利用可能である。上述したmiRのいずれかと結合する部位は、miRに対するワトソン・クリック相補性、典型的にはmiRとの100%の相補性に基づいて設計され、本明細書に記載されるような本開示のmRNA構築物中に挿入され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、及びmRNA、例えば、その3’UTR)は、少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み、それによって、例えば、B細胞による、例えば、PEGに対するIgMの産生を減少もしくは阻害すること、及び/またはpDCの増殖及び/または活性化を減少もしくは阻害することによって、加速血液クリアランスを減少または阻害し得、コードされた目的のタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。
miRNA遺伝子調節は、miRNAを取り囲む配列、例えば、限定されないが、周辺配列の種、配列の種類(例えば、異種、同種、外因性、内因性、もしくは人工)、周辺配列内の調節エレメント及び/または周辺配列内の構造エレメントなどに影響され得る。miRNAは、5’UTR及び/または3’UTRに影響され得る。非限定的な例として、非ヒト3’UTRは、同じ配列種類のヒト3’UTRと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するmiRNA配列の調節効果を増加させ得る。
一実施形態では、5’UTRの他の調節エレメント及び/または構造エレメントは、miRNA媒介遺伝子調節に影響を与え得る。調節エレメント及び/または構造エレメントの一例は、5’UTR内の構造化IRES(内部リボソーム進入部位)であり、これはタンパク質翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。EIF4A2が、5’-UTR内のこの二次構造化エレメントに結合することは、miRNA媒介遺伝子発現に必要である(Meijer HA et al.,Science,2013,340,82-85、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロRNA媒介遺伝子調節を増強するために、この構造化5’UTRをさらに含み得る。
少なくとも1つのmiRNA結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に組み込まれ得る。これに関連して、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、またはそれを超えるmiRNA結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に組み込まれ得る。例えば、1~10、1~9つ、1~8つ、1~7つ、1~6つ、1~5つ、1~4つ、1~3つ、2つ、または1つのmiRNA結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に組み込まれ得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれるmiRNA結合部位は、同じであり得るか、または異なるmiRNA部位であり得る。本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれる異なるmiRNA結合部位の組合せは、異なるmiRNA部位のいずれかの2つ以上のコピーが組み込まれる組合せを含み得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれるmiRNA結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織を標的とし得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの3’-UTRにおける組織、細胞型、または疾患特異的miRNA結合部位の導入によって、特定の細胞型(例えば、骨髄細胞、内皮細胞など)における発現の程度が減少し得る。
一実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド内における3’UTRの5’末端付近、3’UTRの5’末端と3’末端との間の中間辺り、及び/または3’UTRの3’末端付近で組み込まれ得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端付近及び3’UTRの5’末端と3’末端との間の中間辺りに組み込まれ得る。別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの3’末端付近及び3’UTRの5’末端と3’末端との間の中間辺りに組み込まれ得る。さらに別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端付近及び3’UTRの3’末端付近で組み込まれ得る。
別の実施形態では、3’UTRは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10のmiRNA結合部位を含み得る。miRNA結合部位は、miRNA、miRNAシード配列、及び/またはシード配列に隣接するmiRNA配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチド中に少なくとも1つのセンサー配列を組み込み、投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって制御され得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を組み込み、本明細書に記載される脂質のいずれかを含む、イオン化可能なアミノ脂質を含む脂質ナノ粒子中でポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞を標的とし得る。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるmiRNAの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件でより標的化された発現をするように操作され得る。組織特異的miRNA結合部位の導入によって、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞内において、または生物学的条件との関連において最適なタンパク質発現のために設計され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のmiRNAシード配列に対して100%の同一性を有するか、またはmiRNAシード配列に対して100%未満の同一性を有するいずれかのmiRNA結合部位を組み込むように設計され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のmiRNAシード配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するmiRNA結合部位を組み込むように設計され得る。miRNAシード配列は、miRNA結合親和性を低減させるために部分的に変異され、そのため、ポリヌクレオチドの下方調節の低下をもたらし得る。要するに、miRNA結合部位とmiRNAシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度は、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力をより細かく調整するためのレオスタットとして機能し得る。加えて、miRNA結合部位の非シード領域における変異も、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力に影響を及ぼし得る。
一実施形態では、miRNA配列は、ステムループのループ中に組み込まれ得る。
別の実施形態では、miRNAシード配列が、ステムループのループ中に組み込まれ得、miRNA結合部位は、ステムループの5’または3’ステム中に組み込まれ得る。
一実施形態では、5’UTR内のmiRNA配列は、本明細書に記載される本発明のポリヌクレオチドを安定化させるために使用され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR内におけるmiRNA配列は、限定されないが、開始コドンなどの翻訳開始部位への接近しやすさを低減させるために使用され得る。例えば、Matsuda et al.,PLoS One.2010 11(5):e15057(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照するが、これは最初の開始コドン(AUG)に対する接近しやすさを低下させるために、アンチセンスロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチド及び開始コドン周辺のエクソン接合部複合体(EJC)(AUGコドンのAが+1である場合、-4から+37)を使用した。Matsudaは、LNAまたはEJCで開始コドン周辺の配列を変化させると、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響を与えることを示した。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始部位への接近しやすさを低下させるために、Matsuda et alによって記載されたLNAまたはEJC配列の代わりに、翻訳開始部位付近にmiRNA配列を含み得る。翻訳開始部位は、miRNA配列の前、後または配列内に存在し得る。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのmiRNA配列内に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を弱めるために、少なくとも1つのmiRNAを含み得る。miRNAは、完全なmiRNA配列、miRNAシード配列、シードを含まないmiRNA配列、またはそれらの組合せであり得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれるmiRNAは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を弱めるために本発明のポリヌクレオチド中に組み込まれるmiRNAは、miR-142-3pである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞内でコードされたポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも1つのmiRNAを含み得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つのmiR-142-3p結合部位、miR-142-3pシード配列、シードを含まないmiR-142-3p結合部位、miR-142-5p結合部位、miR-142-5pシード配列、シードを含まないmiR-142-5p結合部位、miR-146結合部位、miR-146シード配列及び/またはシード配列を含まないmiR-146結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、治療薬送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することを目的として免疫細胞内でmRNA治療薬を選択的に分解するために、3’UTR内に少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、抗原提示細胞内で本発明のポリヌクレオチドをより不安定にさせ得る。これらのmiRNAの非限定的な例としては、miR-142-5p、miR-142-3p、miR-146a-5p、及びmiR-146-3pが挙げられる。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、RNA結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域内に少なくとも1つのmiRNA配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、(i)OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)ならびに(ii)miRNA結合部位(例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位)及び/またはmiR-126に結合するmiRNA結合部位を含む。
12.5’キャップを有する領域
本開示はまた、5’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド(例えば、発現されるOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。
本開示はまた、5’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド(例えば、発現されるOTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。
天然mRNAの5’キャップ構造は核外輸送に関与してmRNAの安定性を増加させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)と結合し、CBPがポリ(A)結合タンパク質と会合して成熟環状mRNA種を形成することによって、細胞内でのmRNA安定性及び翻訳能力に関与する。キャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近位イントロンの除去を助ける。
内因性mRNA分子は、末端グアノシンキャップ残基とmRNA分子の5’末端転写センスヌクレオチドとの間に5’-ppp-5’-三リン酸結合を生成して5’末端キャップされ得る。次いで、この5’-グアニル酸キャップがメチル化され、N7-メチル-グアニル酸残基を生成し得る。mRNAの5’末端の末端及び/または末端前(anteterminal)転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に2’-O-メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による5’-デキャッピングは、分解のためにmRNA分子などの核酸分子を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、デキャッピングを阻止し、それゆえmRNAの半減期を増加させる非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、5’-ppp-5’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドが使用され得る。例えば、New England Biolabs(Ipswich,MA)のVaccinia Capping Enzymeが、製造業者の指示に従ってα-チオ-グアノシンヌクレオチドと共に使用され、5’-ppp-5’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成し得る。追加の修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α-メチル-ホスホネート及びセレノリン酸ヌクレオチドなどが使用され得る。
追加の修飾としては、糖環の2’-ヒドロキシル基上におけるポリヌクレオチドの5’末端及び/または5’末端前ヌクレオチドのリボース糖の2’-O-メチル化(上述した通り)が挙げられるが、これに限定されない。複数の異なる5’-キャップ構造が、mRNA分子として機能するポリヌクレオチドなどの核酸分子の5’-キャップを生成するために使用され得る。本明細書において合成キャップ類似体、ケミカルキャップ、ケミカルキャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、キャップ機能を保持しながら、その化学構造において天然の(すなわち、内因性、野生型または生理学的)5’-キャップとは異なる。キャップ類似体は、本発明のポリヌクレオチドに化学的に(すなわち、非酵素的に)または酵素的に合成及び/または連結され得る。
例えば、抗リバースキャップ類似体(ARCA)キャップは、5’-5’-トリホスフェート基によって連結された2つのグアニンを含有し、1つのグアニンが、N7メチル基に加えて3’-O-メチル基を含有する(すなわち、N7,3’-O-ジメチル-グアノシン-5’-トリホスフェート-5’-グアノシン(m7G-3’mppp-G、これは同様に3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)Gとも称され得る)。他方の非修飾グアニンの3’-O原子は、キャップされたポリヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドに連結される。N7-及び3’-O-メチル化グアニンは、キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはmCAPであり、これはARCAに類似しているが、グアノシン上に2’-O-メチル基を有する(すなわち、N7,2’-O-ジメチル-グアノシン-5’-トリホスフェート-5’-グアノシン、m7Gm-ppp-G)。
別の例示的なキャップは、m7G-ppp-Gm-Aである(すなわち、N7,グアノシン-5’-トリホスフェート-2’-O-ジメチル-グアノシン-アデノシン)。
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)基を用いて異なるリン酸位置で修飾され得、例えば、米国特許第8,519,110号(その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体などである。
別の実施形態では、キャップは、当該技術分野において既知の、及び/または本明細書に記載されるキャップ類似体のN7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体である。キャップ類似体のN7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、N7-(4-クロロフェノキシエチル)-G(5’)ppp(5’)G及びN7-(4-クロロフェノキシエチル)-m3’-OG(5’)ppp(5’)Gキャップ類似体が挙げられる(例えば、Kore et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574(その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている様々なキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照のこと)。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、4-クロロ/ブロモフェノキシエチル類似体である。
本発明のポリヌクレオチドはまた、より真正な5’-キャップ構造を生成するために、酵素を使用して(IVTまたは化学合成のいずれであっても)製造後にキャップされ得る。本明細書で使用される場合、「より真正な」という語句は、内因性または野生型の特徴を構造的または機能的のいずれかで厳密に反映または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体などと比較した場合に、内因性、野生型、天然もしくは生理学的細胞機能及び/または構造をより良く代表するか、または1つ以上の点で対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的特徴よりも優れている。本発明のより真正な5’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野において既知の合成5’キャップ構造と(または野生型、天然もしくは生理学的5’キャップ構造と)比較した場合に、キャップ結合タンパク質の結合を増強し、半減期を増加させ、5’エンドヌクレアーゼに対する感受性を減少させ、及び/または5’デキャッピングを減少させるようなものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え2’-O-メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に古典的な5’-5’-三リン酸結合を作成し得、キャップグアニンは、N7メチル化を含有し、mRNAの5’末端ヌクレオチドは2’-O-メチルを含有する。そのような構造は、Cap1構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野において既知の他の5’キャップ類似体構造と比較した場合に、より高い翻訳能力及び細胞安定性、ならびに細胞性炎症性サイトカインの活性化の減少をもたらす。キャップ構造としては、7mG(5’)ppp(5’)N1pN2p(キャップ0)、7mG(5’)ppp(5’)N1mpNp(キャップ1)、及び7mG(5’)-ppp(5’)N1mpN2mp(キャップ2)が挙げられるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドを製造後にキャップすると、キメラポリヌクレオチドのほぼ100%がキャップされ得るため、より効率的であり得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約80%とは対照的である。
本発明によれば、5’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、5’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、及び2-アジド-グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書では、RNAポリメラーゼ、例えば、野生型RNAポリメラーゼまたはそのバリアント、例えば、本明細書に記載されるようなバリアントなどを使用して、リボ核酸(RNA)合成のための共転写キャッピング方法に使用され得るものを含む例示的なキャップもまた提供される。一実施形態では、キャップは、RNAが「ワンポット」反応で生成される場合に、別個のキャッピング反応を必要とすることなく付加され得る。したがって、本方法は、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型を、インビトロ転写反応条件下においてRNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させて、RNA転写物を生成することを含む。
本明細書で使用される場合、「キャップ」という用語は逆位Gヌクレオチドを含み、逆位Gヌクレオチドの3’側に1個以上の追加のヌクレオチド、例えば、逆位Gヌクレオチドの3’側及び5’~5’UTR、例えば、本明細書に記載される5’UTRに1個、2個、3個、またはそれを超えるヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、キャップは、式(I)
の化合物、またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩を含み、式中、
環B1は、修飾または非修飾グアニンであり、
環B2及び環B3は各々独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
X2は、O、S(O)p、NR24またはCR25R26であり、ここでpは0、1、または2であり、
Y0は、OまたはCR6R7であり、
Y1は、O、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、ここでnは0、1、または2であり、
各---は単結合であるか、または存在せず、ここで各---が単結合である場合、YiはO、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、各---が存在しない場合、Y1は無効であり、
Y2は、(OP(O)R4)m(ここでmは0、1、もしくは2である)、または-O-(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-(ここでQ0は、結合、O、S(O)r、NR44、もしくはCR45R46であり、rは0、1、もしくは2であり、u及びvの各々は、独立して1、2、3、もしくは4である)であり、
各R2及びR2’は、独立してハロ、LNA、またはOR3であり、
各R3は、独立してH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルであり、R3は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルである場合、ハロ、OH及び1つ以上のOHまたはOC(O)-C1~C6アルキルで任意に置換されるC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換され、
各R4及びR4’は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -であり、
R6、R7、及びR8の各々は、独立して-Q1-T1であり、ここで、Q1は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T1は、H、ハロ、OH、COOH、シアノ、またはRs1であり、ここでRs1は、C1~C3アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C1~C6アルコキシル、C(O)O-C1~C6アルキル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs1は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換され、
R10、R11、R12、R13R14、及びR15の各々は、独立して-Q2-T2であり、ここでQ2は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T2は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、Rs2、またはORs2であり、ここでRs2は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NHC(O)-C1~C6アルキル、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs2は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4員~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換されるか、あるいはR12はR14と共にオキソであるか、またはR13はR15と共にオキソであり、
R20、R21、R22、及びR23の各々は、独立して-Q3-T3であり、ここでQ3は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T3は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、RS3、またはORS3であり、ここでRS3は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NHC(O)-C1~C6アルキル、モノ-C1~C6アルキルアミノ、ジ-C1~C6アルキルアミノ、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs3は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1~C6アルキルアミノ、ジ-C1~C6アルキルアミノ、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換され、
R24、R25、及びR26の各々は独立して、HまたはC1~C6アルキルであり、
R27及びR28の各々は、独立してHもしくはOR29であるか、またはR27及びR28が共にO-R30-Oを形成し、各R29は、独立してH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルであり、R29は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルである場合、ハロ、OH及び1つ以上のOHまたはOC(O)-C1~C6アルキルで任意に置換されるC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換され、
R30は、ハロ、OH及びC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C6アルキレンであり、
R31、R32、及びR33の各々は、独立してH、C1~C6アルキル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、
R40、R41、R42、及びR43の各々は、独立してH、ハロ、OH、シアノ、N3、OP(O)R47R48、もしくは1つ以上のOP(O)R47R48で任意に置換されるC1~C6アルキルであるか、または1つのR41及び1つのR43が、それらが結合している炭素原子及びQ0と共にC4~C10シクロアルキル、4~14員ヘテロシクロアルキル、C6~C10アリール、もしくは5~14員ヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または5~6員ヘテロアリールの各々は、OH、ハロ、シアノ、N3、オキソ、OP(O)R47R48、C1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシル、C1~C6ハロアルコキシル、アミノ、モノ-C1~C6アルキルアミノ、及びジ-C1~C6アルキルアミノのうち1つ以上で任意に置換され、
R44は、H、C1~C6アルキル、またはアミン保護基であり、
R45及びR46の各々は、独立してH、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意に置換されるC1~C6アルキルであり、
R47及びR48の各々は、独立してH、ハロ、C1~C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -である。
環B2及び環B3は各々独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
X2は、O、S(O)p、NR24またはCR25R26であり、ここでpは0、1、または2であり、
Y0は、OまたはCR6R7であり、
Y1は、O、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、ここでnは0、1、または2であり、
各---は単結合であるか、または存在せず、ここで各---が単結合である場合、YiはO、S(O)n、CR6R7、またはNR8であり、各---が存在しない場合、Y1は無効であり、
Y2は、(OP(O)R4)m(ここでmは0、1、もしくは2である)、または-O-(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-(ここでQ0は、結合、O、S(O)r、NR44、もしくはCR45R46であり、rは0、1、もしくは2であり、u及びvの各々は、独立して1、2、3、もしくは4である)であり、
各R2及びR2’は、独立してハロ、LNA、またはOR3であり、
各R3は、独立してH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルであり、R3は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルである場合、ハロ、OH及び1つ以上のOHまたはOC(O)-C1~C6アルキルで任意に置換されるC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換され、
各R4及びR4’は独立して、H、ハロ、C1~C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -であり、
R6、R7、及びR8の各々は、独立して-Q1-T1であり、ここで、Q1は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T1は、H、ハロ、OH、COOH、シアノ、またはRs1であり、ここでRs1は、C1~C3アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C1~C6アルコキシル、C(O)O-C1~C6アルキル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs1は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換され、
R10、R11、R12、R13R14、及びR15の各々は、独立して-Q2-T2であり、ここでQ2は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T2は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、Rs2、またはORs2であり、ここでRs2は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NHC(O)-C1~C6アルキル、NR31R32、(NR31R32R33)+、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs2は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4員~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換されるか、あるいはR12はR14と共にオキソであるか、またはR13はR15と共にオキソであり、
R20、R21、R22、及びR23の各々は、独立して-Q3-T3であり、ここでQ3は、結合またはハロ、シアノ、OH及びC1~C6アルコキシのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C3アルキルリンカーであり、T3は、H、ハロ、OH、NH2、シアノ、NO2、N3、RS3、またはORS3であり、ここでRS3は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、NHC(O)-C1~C6アルキル、モノ-C1~C6アルキルアミノ、ジ-C1~C6アルキルアミノ、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、Rs3は、ハロ、OH、オキソ、C1~C6アルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、シアノ、C1~C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1~C6アルキルアミノ、ジ-C1~C6アルキルアミノ、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、及び5員または6員ヘテロアリールからなる群から選択される1つ以上の置換基で任意に置換され、
R24、R25、及びR26の各々は独立して、HまたはC1~C6アルキルであり、
R27及びR28の各々は、独立してHもしくはOR29であるか、またはR27及びR28が共にO-R30-Oを形成し、各R29は、独立してH、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルであり、R29は、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、またはC2~C6アルキニルである場合、ハロ、OH及び1つ以上のOHまたはOC(O)-C1~C6アルキルで任意に置換されるC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換され、
R30は、ハロ、OH及びC1~C6アルコキシルのうち1つ以上で任意に置換されるC1~C6アルキレンであり、
R31、R32、及びR33の各々は、独立してH、C1~C6アルキル、C3~C8シクロアルキル、C6~C10アリール、4~12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、
R40、R41、R42、及びR43の各々は、独立してH、ハロ、OH、シアノ、N3、OP(O)R47R48、もしくは1つ以上のOP(O)R47R48で任意に置換されるC1~C6アルキルであるか、または1つのR41及び1つのR43が、それらが結合している炭素原子及びQ0と共にC4~C10シクロアルキル、4~14員ヘテロシクロアルキル、C6~C10アリール、もしくは5~14員ヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または5~6員ヘテロアリールの各々は、OH、ハロ、シアノ、N3、オキソ、OP(O)R47R48、C1~C6アルキル、C1~C6ハロアルキル、COOH、C(O)O-C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシル、C1~C6ハロアルコキシル、アミノ、モノ-C1~C6アルキルアミノ、及びジ-C1~C6アルキルアミノのうち1つ以上で任意に置換され、
R44は、H、C1~C6アルキル、またはアミン保護基であり、
R45及びR46の各々は、独立してH、OP(O)R47R48、または1つ以上のOP(O)R47R48で任意に置換されるC1~C6アルキルであり、
R47及びR48の各々は、独立してH、ハロ、C1~C6アルキル、OH、SH、SeH、またはBH3 -である。
本明細書に提供されるようなキャップ類似体は、2017年4月20日公開の国際公開WO2017/066797(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されているキャップ類似体のいずれかを含む場合があると理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、B2の中央位置は、非リボース分子、例えば、アラビノースなどであり得る。
いくつかの実施形態では、R2は、エチルに基づく。
いくつかの実施形態では、Rは、アルキル(例えば、C1~C6アルキル)である。いくつかの実施形態では、Rは、メチル基(例えば、C1アルキル)である。いくつかの実施形態では、Rは、エチル基(例えば、C2アルキル)である。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、及びGUU。いくつかの実施形態では、キャップはGAAを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGACを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGAGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGAUを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGCAを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGCCを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGCGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGCUを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGGAを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGGCを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGGGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGGUを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGUAを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGUCを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGUGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGUUを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、及びm7GpppUpU。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppApAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppApCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppApGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppApUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppCpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppCpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppCpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppCpUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppGpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppGpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppGpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppGpUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppUpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppUpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppUpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppUpUを含む。
キャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7G3’OMepppApA、m7G3’OMepppApC、m7G3’OMepppApG、m7G3’OMepppApU、m7G3’OMepppCpA、m7G3’OMepppCpC、m7G3’OMepppCpG、m7G3’OMepppCpU、m7G3’OMepppGpA、m7G3’OMepppGpC、m7G3’OMepppGpG、m7G3’OMepppGpU、m7G3’OMepppUpA、m7G3’OMepppUpC、m7G3’OMepppUpG、及びm7G3’OMepppUpU。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppApAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppApCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppApGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppApUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppCpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppCpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppCpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppCpUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppGpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppGpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppGpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppGpUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppUpAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppUpCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppUpGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppUpUを含む。
キャップは、他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7G3’OMepppA2’OMepA、m7G3’OMepppA2’OMepC、m7G3’OMepppA2’OMepG、m7G3’OMepppA2’OMepU、m7G3’OMepppC2’OMepA、m7G3’OMepppC2’OMepC、m7G3’OMepppC2’OMepG、m7G3’OMepppC2’OMepU、m7G3’OMepppG2’OMepA、m7G3’OMepppG2’OMepC、m7G3’OMepppG2’OMepG、m7G3’OMepppG2’OMepU、m7G3’OMepppU2’OMepA、m7G3’OMepppU2’OMepC、m7G3’OMepppU2’OMepG、及びm7G3’OMepppU2’OMepU。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppA2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppA2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppA2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppA2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppC2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppC2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppC2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppC2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppG2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppG2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppG2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppG2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppU2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppU2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppU2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7G3’OMepppU2’OMepUを含む。
キャップは、さらに他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7GpppA2’OMepA、m7GpppA2’OMepC、m7GpppA2’OMepG、m7GpppA2’OMepU、m7GpppC2’OMepA、m7GpppC2’OMepC、m7GpppC2’OMepG、m7GpppC2’OMepU、m7GpppG2’OMepA、m7GpppG2’OMepC、m7GpppG2’OMepG、m7GpppG2’OMepU、m7GpppU2’OMepA、m7GpppU2’OMepC、m7GpppU2’OMepG、及びm7GpppU2’OMepU。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppA2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppA2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppA2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppA2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppC2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppC2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppC2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、m7GpppC2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppG2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppG2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppG2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppG2’OMepUを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppU2’OMepAを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppU2’OMepCを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppU2’OMepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppU2’OMepUを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7Gpppm6A2’OmepGを含む。いくつかの実施形態では、キャップは、m7Gpppe6A2’OmepGを含む。
いくつかの実施形態では、キャップはGAGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGCGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGUGを含む。いくつかの実施形態では、キャップはGGGを含む。
いくつかの実施形態では、キャップは、m7GpppN1N2N3を含み、ここでN1、N2、及びN3は任意であり(すなわち、存在し得ないか、または1つ以上が存在し得る)、独立して天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、m7Gは、例えば、3’位でさらにメチル化される。いくつかの実施形態では、m7Gは、3’位にO-メチルを含む。いくつかの実施形態では、N1、N2、及びN3は、存在する場合、任意に独立してアデニン、ウラシル、グアニジン、チミン、またはシトシンである。いくつかの実施形態では、N1、N2、及びN3のうち1つ以上(または全て)が、存在する場合、例えば、2’位でメチル化される。いくつかの実施形態では、N1、N2、及びN3のうち1つ以上(または全て)が、存在する場合、2’位にO-メチルを有する。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の構造:
を含み、
式中、B1、B2、及びB3は、独立して天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基であり、R1、R2、R3、及びR4は、独立してOHまたはO-メチルである。いくつかの実施形態では、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R3及びR4は、O-メチルである。いくつかの実施形態では、R4はO-メチルである。いくつかの実施形態では、R1はOHであり、R2はOHであり、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R1はOHであり、R2はOHであり、R3はO-メチルであり、R4はO-メチルである。いくつかの実施形態では、R1及びR2のうち少なくとも1つがO-メチルであり、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R1及びR2のうち少なくとも1つがO-メチルであり、R3はO-メチルであり、R4はO-メチルである。
式中、B1、B2、及びB3は、独立して天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基であり、R1、R2、R3、及びR4は、独立してOHまたはO-メチルである。いくつかの実施形態では、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R3及びR4は、O-メチルである。いくつかの実施形態では、R4はO-メチルである。いくつかの実施形態では、R1はOHであり、R2はOHであり、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R1はOHであり、R2はOHであり、R3はO-メチルであり、R4はO-メチルである。いくつかの実施形態では、R1及びR2のうち少なくとも1つがO-メチルであり、R3はO-メチルであり、R4はOHである。いくつかの実施形態では、R1及びR2のうち少なくとも1つがO-メチルであり、R3はO-メチルであり、R4はO-メチルである。
いくつかの実施形態では、B1、B3、及びB3は、天然ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、B1、B2、及びB3のうち少なくとも1つが、修飾または非天然塩基である。いくつかの実施形態では、B1、B2、及びB3のうち少なくとも1つが、N6-メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、B1は、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。いくつかの実施形態では、B1はアデニンであり、B2はウラシルであり、B3はアデニンである。いくつかの実施形態では、R1及びR2はOHであり、R3及びR4はO-メチルであり、B1はアデニンであり、B2はウラシルであり、B3はアデニンである。
いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:GAAA、GACA、GAGA、GAUA、GCAA、GCCA、GCGA、GCUA、GGAA、GGCA、GGGA、GGUA、GUCA、及びGUUA。いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:GAAG、GACG、GAGG、GAUG、GCAG、GCCG、GCGG、GCUG、GGAG、GGCG、GGGG、GGUG、GUCG、GUGG、及びGUUG。いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:GAAU、GACU、GAGU、GAUU、GCAU、GCCU、GCGU、GCUU、GGAU、GGCU、GGGU、GGUU、GUAU、GUCU、GUGU、及びGUUU。いくつかの実施形態では、キャップは、以下の配列から選択される配列を含む:GAAC、GACC、GAGC、GAUC、GCAC、GCCC、GCGC、GCUC、GGAC、GGCC、GGGC、GGUC、GUAC、GUCC、GUGC、及びGUUC。
キャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7G3’OMepppApApN、m7G3’OMepppApCpN、m7G3’OMepppApGpN、m7G3’OMepppApUpN、m7G3’OMepppCpApN、m7G3’OMepppCpCpN、m7G3’OMepppCpGpN、m7G3’OMepppCpUpN、m7G3’OMepppGpApN、m7G3’OMepppGpCpN、m7G3’OMepppGpGpN、m7G3’OMepppGpUpN、m7G3’OMepppUpApN、m7G3’OMepppUpCpN、m7G3’OMepppUpGpN、及びm7G3’OMepppUpUpN(式中、Nは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である)。
キャップは、他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7G3’OMepppA2’OMepApN、m7G3’OMepppA2’OMepCpN、m7G3’OMepppA2’OMepGpN、m7G3’OMepppA2’OMepUpN、m7G3’OMepppC2’OMepApN、m7G3’OMepppC2’OMepCpN、m7G3’OMepppC2’OMepGpN、m7G3’OMepppC2’OMepUpN、m7G3’OMepppG2’OMepApN、m7G3’OMepppG2’OMepCpN、m7G3’OMepppG2’OMepGpN、m7G3’OMepppG2’OMepUpN、m7G3’OMepppU2’OMepApN、m7G3’OMepppU2’OMepCpN、m7G3’OMepppU2’OMepGpN、及びm7G3’OMepppU2’OMepUpN(式中、Nは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である)。
キャップは、さらに他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7GpppA2’OMepApN、m7GpppA2’OMepCpN、m7GpppA2’OMepGpN、m7GpppA2’OMepUpN、m7GpppC2’OMepApN、m7GpppC2’OMepCpN、m7GpppC2’OMepGpN、m7GpppC2’OMepUpN、m7GpppG2’OMepApN、m7GpppG2’OMepCpN、m7GpppG2’OMepGpN、m7GpppG2’OMepUpN、m7GpppU2’OMepApN、m7GpppU2’OMepCpN、m7GpppU2’OMepGpN、及びm7GpppU2’OMepUpN(式中、Nは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である)。
キャップは、他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7G3’OMepppA2’OMepA2’OMepN、m7G3’OMepppA2’OMepC2’OMepN、m7G3’OMepppA2’OMepG2’OMepN、m7G3’OMepppA2’OMepU2’OMepN、m7G3’OMepppC2’OMepA2’OMepN、m7G3’OMepppC2’OMepC2’OMepN、m7G3’OMepppC2’OMepG2’OMepN、m7G3’OMepppC2’OMepU2’OMepN、m7G3’OMepppG2’OMepA2’OMepN、m7G3’OMepppG2’OMepC2’OMepN、m7G3’OMepppG2’OMepG2’OMepN、m7G3’OMepppG2’OMepU2’OMepN、m7G3’OMepppU2’OMepA2’OMepN、m7G3’OMepppU2’OMepC2’OMepN、m7G3’OMepppU2’OMepG2’OMepN、及びm7G3’OMepppU2’OMepU2’OMepN(式中、Nは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である)。
キャップは、さらに他の実施形態では、以下の配列から選択される配列を含む:m7GpppA2’OMepA2’OMepN、m7GpppA2’OMepC2’OMepN、m7GpppA2’OMepG2’OMepN、m7GpppA2’OMepU2’OMepN、m7GpppC2’OMepA2’OMepN、m7GpppC2’OMepC2’OMepN、m7GpppC2’OMepG2’OMepN、m7GpppC2’OMepU2’OMepN、m7GpppG2’OMepA2’OMepN、m7GpppG2’OMepC2’OMepN、m7GpppG2’OMepG2’OMepN、m7GpppG2’OMepU2’OMepN、m7GpppU2’OMepA2’OMepN、m7GpppU2’OMepC2’OMepN、m7GpppU2’OMepG2’OMepN、及びm7GpppU2’OMepU2’OMepN(式中、Nは、天然、修飾、または非天然ヌクレオシド塩基である)。
13.ポリA尾部
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリA尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリA尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリA尾部は、デス-3’ヒドロキシル尾部を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリA尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリA尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリA尾部は、デス-3’ヒドロキシル尾部を含む。
RNAプロセシングに、アデニンヌクレオチドの長鎖(ポリA尾部)が、安定性を増加させるためにmRNA分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の3’末端が切断されて3’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリAポリメラーゼが、RNAにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれる本プロセスによって、例えば、およそ80~およそ250残基長、例えば、およそ80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250残基長を含むものであり得るポリA尾部が付加される。一実施形態では、ポリA尾部は、100ヌクレオチド長である(配列番号:195)。
ポリA尾部はまた、構築物が核から排出された後に付加され得る。
本発明によれば、ポリA尾部上の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス-3’ヒドロキシル尾部を含み得る。それらはまた、Junjie Li,et al.(Current Biology,Vol.15,1501-1507,August 23,2005、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)によって教示されるような構造部分または2’-Oメチル修飾を含み得る。
本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンmRNAを含む代替ポリA尾部構造を有する転写物をコードするように設計され得る。Norburyによれば、「末端ウリジル化は、ヒト複製依存性ヒストンmRNA上でも検出されている。これらのmRNAの代謝回転は、染色体DNA複製の完了または阻害後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積の防止に重要であると考えられている。これらのmRNAは、3’ポリ(A)尾部の欠如によって区別され、その代わりに安定したステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質(SLBP)がその機能を担っていて、後者は、ポリアデニル化mRNA上のPABPと同じ機能を行う」(Norbury,“Cytoplasmic RNA:a case of the tail wagging the dog,”Nature Reviews Molecular Cell Biology;AOP、2013年8月29日にオンライン公開、doi:10.1038/nrm3645)(その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
特有のポリA尾部の長さは、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を提供する。一般に、ポリA尾部の長さは、存在する場合、30ヌクレオチド長よりも長い。別の実施形態では、ポリA尾部は、35ヌクレオチド長より長い(例えば、少なくとも、または約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、及び3,000ヌクレオチドよりも長い)。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約30~約3,000ヌクレオチド(例えば、30~50、30~100、30~250、30~500、30~750、30~1,000、30~1,500、30~2,000、30~2,500、50~100、50~250、50~500、50~750、50~1,000、50~1,500、50~2,000、50~2,500、50~3,000、100~500、100~750、100~1,000、100~1,500、100~2,000、100~2,500、100~3,000、500~750、500~1,000、500~1,500、500~2,000、500~2,500、500~3,000、1,000~1,500、1,000~2,000、1,000~2,500、1,000~3,000、1,500~2,000、1,500~2,500、1,500~3,000、2,000~3,000、2,000~2,500、及び2,500~3,000)を含む。
いくつかの実施形態では、ポリA尾部は、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。
これに関連して、ポリA尾部は、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも長さが10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%長くなり得る。ポリA尾部はまた、それが属するポリヌクレオチドの一部として設計され得る。これに関連して、ポリA尾部は、構築物の全長、構築物領域またはポリA尾部を除く構築物の全長の10、20、30、40、50、60、70、80、または90%以上であり得る。さらに、ポリA結合タンパク質に対するポリヌクレオチドの結合部位及び複合化を操作することによって、発現が増強され得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチドが、ポリA尾部の3’末端の修飾ヌクレオチドを使用して、3’末端によってPABP(ポリA結合タンパク質)を介して共に連結され得る。トランスフェクション実験が関連する細胞株で行われ得、タンパク質産生が、トランスフェクション後12時間、24時間、48時間、72時間及び7日目にELISAによってアッセイされ得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリA-G4重鎖領域を含むように設計される。G4重鎖は、DNA及びRNAの両方のGリッチ配列によって形成され得る、4個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合配列である。本実施形態では、G4重鎖は、ポリA尾部の末端に組み込まれる。得られたポリヌクレオチドは、様々な時点での安定性、タンパク質産生及び半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ポリA-G4重鎖は、120ヌクレオチドのポリA尾部(配列番号:196)を単独で使用した場合に見られるタンパク質産生の少なくとも75%に相当するmRNAからのタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
いくつかの実施形態では、ポリA尾部は、代替ヌクレオシド、例えば、逆位チミジンを含む。代替ヌクレオシド、例えば、逆位チミジンを含むポリA尾部は、本明細書に記載されるように生成されてよい。例えば、mRNA構築物は、ポリ(A)尾部を安定化させるためにライゲーションによって修飾されてよい。ライゲーションは、0.5~1.5mg/mLのmRNA(5’Cap1、3’A100)、50mMのTris-HCl(pH7.5)、10mMのMgCl2、1mMのTCEP、1000単位/mLのT4 RNAリガーゼ1、1mMのATP、20w/v%ポリエチレングリコール8000、及び5:1モル比の修飾オリゴ対mRNAを使用して実施されてよい。修飾オリゴは、5’-リン酸-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(逆位デオキシチミジン(idT)(配列番号:209))の配列を有する(以下を参照のこと)。ライゲーション反応物を混合し、室温(約22℃)で、例えば、4時間インキュベートする。安定した尾部mRNAは、例えば、dT精製、逆相精製、ヒドロキシアパタイト精製、水への限外濾過、及び滅菌濾過によって精製される。得られた安定した尾部含有mRNAは、3’末端にポリA領域から始まる以下の構造を含有する:A100-UCUAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-逆デオキシチミジン(配列番号:211)。
いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。いくつかの場合では、ポリA尾部は、A100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)からなる。
14.開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似しているか、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
本発明はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似しているか、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンAUGではないコドン上で開始し得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定されないが、ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG(Touriol et al.Biology of the Cell 95(2003)169-178及びMatsuda and Mauro PLoS ONE,2010 5:11を参照し、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)などの代替開始コドン上で開始し得る。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンACG上で開始する。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンCTGまたはCUG上で開始する。さらに別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンGTGまたはGUG上で開始する。
限定されないが、開始コドンまたは代替開始コドンなどの翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び/または構造に影響を及ぼすことが知られている(例えば、Matsuda and Mauro PLoS ONE,2010 5:11を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることは、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び/または構造を変化させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、マスクされた開始コドンまたは代替開始コドンでの翻訳開始の確率を減少させることを目的として、コドンをマスクするか、または隠すために、マスキング剤が開始コドンまたは代替開始コドン近傍で使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸(LNA)ポリヌクレオチド及びエクソン接合部複合体(EJC)が挙げられる(例えば、Matsuda and Mauroが、マスキング剤LNAポリヌクレオチド及びEJCについて記載している(PLoS ONE,2010 5:11)のを参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
別の実施形態では、翻訳が代替開始コドン上で開始されることになる可能性を増加させるために、マスキング剤がポリヌクレオチドの開始コドンをマスクするために使用され得る。いくつかの実施形態では、翻訳が、マスクされた開始コドンまたは代替開始コドンの下流の開始コドンまたは代替開始コドン上で開始されることになる可能性を増加させるために、マスキング剤が最初の開始コドンまたは代替開始コドンをマスクするために使用され得る。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンは、miRNA結合部位の完全相補体内に位置し得る。miRNA結合部位の完全相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び/または構造の制御を助け得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替開始コドンは、miRNA結合部位の完全相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替開始コドンは、第1ヌクレオチド、第2ヌクレオチド、第3ヌクレオチド、第4ヌクレオチド、第5ヌクレオチド、第6ヌクレオチド、第7ヌクレオチド、第8ヌクレオチド、第9ヌクレオチド、第10ヌクレオチド、第11ヌクレオチド、第12ヌクレオチド、第13ヌクレオチド、第14ヌクレオチド、第15ヌクレオチド、第16ヌクレオチド、第17ヌクレオチド、第18ヌクレオチド、第19ヌクレオチド、第20ヌクレオチドまたは第21ヌクレオチド後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンではないコドン上で開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンが、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドン後のコドン上、または下流の開始コドンもしくは代替開始コドン上で開始し得る。非限定的な例では、下流の開始コドンまたは代替開始コドン上で翻訳を開始させるために、開始コドンATGまたはAUGが、ポリヌクレオチド配列の最初の3ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ及び/またはポリヌクレオチドの構造を制御するか、または制御しようと試みるために、下流の開始コドン及び/または代替開始コドンに対する少なくとも1つのマスキング剤をさらに含み得る。
15.終止コドン領域
本発明はまた、終止コドン領域及び本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、DNAの場合にはTGA、TAA及びTAGから、またはRNAの場合にはUGA、UAA及びUAGから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合に終止コドンTGA、またはRNAの場合に終止コドンUGA、及び1つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、TAAまたはUAAであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続した終止コドン、4つの終止コドン、またはそれを超える終止コドンを含む。
本発明はまた、終止コドン領域及び本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、DNAの場合にはTGA、TAA及びTAGから、またはRNAの場合にはUGA、UAA及びUAGから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合に終止コドンTGA、またはRNAの場合に終止コドンUGA、及び1つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、TAAまたはUAAであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続した終止コドン、4つの終止コドン、またはそれを超える終止コドンを含む。
16.mRNAエレメントの組合せ
本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれも、以下のエレメントのうち1つ、2つ、3つ、または全てを含み得る:(a)例えば、本明細書に記載されるような5’-UTR、(b)終止エレメントを含むコード領域(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、(c)3’-UTR(例えば、本明細書に記載されるようなもの)及び任意に(d)例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域。それを含むLNP組成物もまた、本明細書で開示される。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれも、以下のエレメントのうち1つ、2つ、3つ、または全てを含み得る:(a)例えば、本明細書に記載されるような5’-UTR、(b)終止エレメントを含むコード領域(例えば、本明細書に記載されるようなもの)、(c)3’-UTR(例えば、本明細書に記載されるようなもの)及び任意に(d)例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域。それを含むLNP組成物もまた、本明細書で開示される。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、(a)表2に記載される5’UTRまたはそのバリアントもしくは断片及び(b)本明細書に提供される終止エレメントを含むコード領域を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるようなキャップ構造、または例えば、本明細書に記載されるようなポリA尾部をさらに含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域をさらに含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、(a)表2に記載される5’UTRまたはそのバリアントもしくは断片及び(c)表3に記載される3’UTRまたはそのバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるようなキャップ構造、または例えば、本明細書に記載されるようなポリA尾部をさらに含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域をさらに含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、(c)表3に記載される3’UTRまたはそのバリアントもしくは断片及び(b)本明細書に提供される終止エレメントを含むコード領域を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、表5に提供される配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるようなキャップ構造、または例えば、本明細書に記載されるようなポリA尾部をさらに含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域をさらに含む。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、(a)表2に記載される5’UTRまたはそのバリアントもしくは断片、(b)本明細書に提供される終止エレメントを含むコード領域、及び(c)表3に記載される3’UTRまたはそのバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるようなキャップ構造、または例えば、本明細書に記載されるようなポリA尾部をさらに含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるような3’安定化領域をさらに含む。
17.OTCポリペプチドをコードするmRNAを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端までに以下を含む:
(i)上で提供されるものなどの5’キャップ、
(ii)上で提供される配列などの5’UTR、
(iii)ヒトOTCポリペプチドをコードするORFであって、ORFが、配列番号:3の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するORF、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)上で提供される配列などの3’UTR、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端までに以下を含む:
(i)上で提供されるものなどの5’キャップ、
(ii)上で提供される配列などの5’UTR、
(iii)ヒトOTCポリペプチドをコードするORFであって、ORFが、配列番号:3の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するORF、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)上で提供される配列などの3’UTR、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端までに以下を含む:
(i)上で提供されるものなどの5’キャップ、
(ii)上で提供される配列などの5’UTR、
(iii)ヒトOTCポリペプチドをコードするORFであって、ORFが、配列番号:4の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するORF、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)上で提供される配列などの3’UTR、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部。
(i)上で提供されるものなどの5’キャップ、
(ii)上で提供される配列などの5’UTR、
(iii)ヒトOTCポリペプチドをコードするORFであって、ORFが、配列番号:4の配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するORF、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)上で提供される配列などの3’UTR、及び
(vi)上で提供されるポリA尾部。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miRNA-142に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、5’UTRは、miRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、3’UTRは、miRNA結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ヒトOTCのタンパク質配列(配列番号:1)と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトOTCのタンパク質配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、(1)上で提供されるものなどの5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、(2)5’UTR、(3)配列番号:3のヌクレオチド配列ORF、(3)終止コドン、(4)3’UTR、及び(5)上で提供されるポリA尾部、例えば、配列番号:195またはA100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)のポリA尾部を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、(1)上で提供されるものなどの5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、(2)5’UTR、(3)配列番号:4のヌクレオチド配列ORF、(3)終止コドン、(4)3’UTR、及び(5)上で提供されるポリA尾部、例えば、配列番号:195またはA100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)のポリA尾部を含む。
例示的なOTCヌクレオチド構築物が、以下に記載される:
配列番号:5は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:114の3’UTRからなる。
配列番号:6は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:133の3’UTRからなる。
配列番号:7は、5’末端から3’末端までに配列番号:58の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:133の3’UTRからなる。
配列番号:8は、5’末端から3’末端までに配列番号:30の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:133の3’UTRからなる。
配列番号:9は、5’末端から3’末端までに配列番号:31の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:133の3’UTRからなる。
配列番号:10は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:134の3’UTRからなる。
配列番号:11は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:130の3’UTRからなる。
配列番号:12は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:131の3’UTRからなる。
配列番号:13は、5’末端から3’末端までに配列番号:5の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:132の3’UTRからなる。
配列番号:14は、5’末端から3’末端までに配列番号:58の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:132の3’UTRからなる。
配列番号:15は、5’末端から3’末端までに配列番号:58の5’UTR、配列番号:3のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:135の3’UTRからなる。
配列番号:16は、5’末端から3’末端までに配列番号:58の5’UTR、配列番号:4のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:132の3’UTRからなる。
配列番号:17は、5’末端から3’末端までに配列番号:62の5’UTR、配列番号:4のOTCヌクレオチドORF、及び配列番号:132の3’UTRからなる。
ある特定の実施形態では、配列番号:14を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルによって置換される。ある特定の実施形態では、配列番号:14を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルによって置換される。
ある特定の実施形態では、配列番号:16を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1メチルシュードウラシルによって置換される。ある特定の実施形態では、配列番号:16を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1メチルシュードウラシルによって置換される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、(1)上で提供されるものなどの5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、(2)配列番号:14のヌクレオチド配列、及び(3)上で提供されるポリA尾部、例えば、約100残基のポリA尾部、例えば、配列番号:195またはA100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。ある特定の実施形態では、配列番号:14を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1メチルシュードウラシルによって置換される。ある特定の実施形態では、配列番号:14を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、5-メトキシウラシルによって置換される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、(1)上で提供されるものなどの5’キャップ、例えば、m7Gp-ppGm-A、(2)配列番号:16のヌクレオチド配列、及び(3)上で提供されるポリA尾部、例えば、約100残基のポリA尾部、例えば、配列番号:195またはA100-UCUAG-A20-逆位デオキシチミジン(配列番号:211)を含む。ある特定の実施形態では、配列番号:16を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、N1-メチルシュードウラシルによって置換される。ある特定の実施形態では、配列番号:16を有する構築物において、その中の全てのウラシルが、5-メトキシウラシルによって置換される。
18.ポリヌクレオチドの作製方法
本開示はまた、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)またはその相補体を作製する方法も提供する。
本開示はまた、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)またはその相補体を作製する方法も提供する。
いくつかの態様では、本明細書に開示され、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、インビトロ転写(IVT)を使用して構築され得る。他の態様では、本明細書に開示され、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、オリゴヌクレオチド合成を使用して化学合成によって構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示され、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IVT、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野において既知の任意の他の方法のうち1つ以上の組合せによって作製される。
天然に存在するヌクレオチド、天然には存在しないヌクレオシド、またはそれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列内に存在する天然に存在するヌクレオシドを全体的または部分的に置換し得、OTCポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)中に組み込まれ得る。次いで、得られたポリヌクレオチド、例えば、mRNAは、タンパク質を産生する、及び/または治療結果をもたらすそれらの能力について検査され得る。
a.インビトロ転写/酵素合成
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補体を作製する方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、インビトロ転写を使用して構築され得る。
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補体を作製する方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、インビトロ転写を使用して構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、オリゴヌクレオチド合成を使用して化学合成によって構築され得る。他の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、IVT、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野において既知の任意の他の方法のうち1つ以上の組合せによって作製される。
天然に存在するヌクレオチド、天然には存在しないヌクレオシド、またはそれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列内に存在する天然に存在するヌクレオシドを全体的または部分的に置換し得、OTCポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、mRNA)中に組み込まれ得る。次いで、得られたmRNAは、OTCを産生する、及び/または治療結果をもたらすそれらの能力について検査され得る。
RNAは、当該技術分野において周知の方法を使用して合成的に作製され得るが、一実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、RNA転写物の産生をもたらす条件下で、DNA鋳型をRNAポリメラーゼ(例えば、T7RNAポリメラーゼまたはT7RNAポリメラーゼバリアント)と接触させることによって合成される。
いくつかの態様では、本開示は、IVT(インビトロ転写)反応を実施する方法を提供し、本方法は、RNA転写物の産生をもたらす条件下で、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下においてDNA鋳型をRNAポリメラーゼ(例えば、T7RNAポリメラーゼ、例えば、T7RNAポリメラーゼバリアントなど)と接触させることを含む。
本開示の他の態様は、キャッピング方法、例えば、共転写キャッピング方法または当該技術分野において既知の他の方法を提供する。一実施形態では、キャッピング方法は、ポリヌクレオチド鋳型を、インビトロ転写反応条件下においてT7RNAポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させて、RNA転写物を生成することを含む。
IVT条件には通常、プロモーターを含有する精製した線状DNA鋳型、ヌクレオシド三リン酸、ジチオスレイトール(DTT)及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにRNAポリメラーゼが必要である。転写反応に使用される正確な条件は、特定の用途に必要なRNAの量に依存する。典型的なIVT反応は、DNA鋳型をRNAポリメラーゼならびにGTP、ATP、CTP、及びUTPを含むヌクレオシド三リン酸(またはヌクレオチド類似体)と共に転写緩衝液中でインキュベートすることによって実施される。5’末端グアノシン三リン酸を有するRNA転写物が、この反応から産生される。
デオキシリボ核酸(DNA)は、単にRNAポリメラーゼに対する核酸鋳型である。DNA鋳型は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。DNA鋳型は、いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’側に位置し、そのポリヌクレオチドに機能的に連結されるRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、T7RNAポリメラーゼプロモーター)を含む。DNA鋳型はまた、目的の遺伝子の3’末端に位置するポリアデニル化(ポリA)尾部をコードするヌクレオチド配列も含む場合がある。
目的のポリペプチドとしては、生物製剤、抗体、抗原(ワクチン)、及び治療用タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。「タンパク質」という用語は、ペプチドを包含する。
RNA転写物は、いくつかの実施形態では、IVT反応の産物であり、当業者には理解されることになるように、RNA分子を作製するためのDNA鋳型は、塩基の相補性に基づいて既知である。RNA転写物は、いくつかの実施形態では、ポリA尾部に連結された目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むメッセンジャーRNA(mRNA)である。いくつかの実施形態では、mRNAは修飾mRNA(mmRNA)であり、これは少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む。
ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖(リボースまたはデオキシリボース)、及び少なくとも1つのリン酸基を含む。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸を含む。ヌクレオシド一リン酸(NMP)は、リボース及び1つのリン酸に連結した核酸塩基を含み、ヌクレオシド二リン酸(NDP)は、リボース及び2つのリン酸に連結した核酸塩基を含み、ヌクレオシド三リン酸(NTP)は、リボース及び3つのリン酸に連結した核酸塩基を含む。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの一般構造を有するか、またはヌクレオチドと構造的に類似している化合物である。ヌクレオチド類似体としては、例えば、ヌクレオチドの核酸塩基の類似体、糖の類似体及び/またはリン酸基(複数可)の類似体が挙げられる。
ヌクレオシドは、窒素塩基及び五炭糖を含む。したがって、ヌクレオシドにリン酸基を付加するとヌクレオチドになる。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドの一般構造を有するか、またはヌクレオシドと構造的に類似している化合物である。ヌクレオシド類似体としては、例えば、ヌクレオシドの核酸塩基の類似体及び/または糖の類似体が挙げられる。
「ヌクレオチド」という用語は、別段の指示がない限り、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドを含むと理解されるべきである。本明細書に提供されるような、例えば、IVT反応におけるRNAの産生に使用される、天然に存在するヌクレオチドの例としては、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、ウリジン三リン酸(UTP)、及び5-メチルウリジン三リン酸(m5UTP)が挙げられる。いくつかの実施形態では、アデノシン二リン酸(ADP)、グアノシン二リン酸(GDP)、シチジン二リン酸(CDP)、及び/またはウリジン二リン酸(UDP)が使用される。
ヌクレオチド類似体の例としては、抗ウイルスヌクレオチド類似体、リン酸類似体(可溶性または固定化、加水分解性または非加水分解性)、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えば、キャップ類似体、または酵素キャッピングの前駆体/基質(ワクシニアもしくはリガーゼ)、キャップまたは5’部分(IRES)のライゲーション/複合化を促進するための官能基で標識されたヌクレオチド、キャップまたは5’部分のライゲーションを促進するための5’PO4で標識されたヌクレオチド、あるいは化学的または酵素的に切断され得る官能基/保護基で標識されたヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルスヌクレオチド/ヌクレオシド類似体の例としては、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン及びシドフォビルが挙げられるが、これらに限定されない。
修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含む場合がある。例えば、本開示のRNA転写物(例えば、mRNA転写物)としては、シュードウリジン(ψ)、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、1-エチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン(mo5U)及び2’-O-メチルウリジンから選択される修飾核酸塩基が挙げられてよい。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、前述した修飾核酸塩基のうち少なくとも2つの(例えば、2つ、3つ、4つまたはそれを超える)組合せを含む。
本明細書に提供されるようなヌクレオシド三リン酸(NTP)は、非修飾もしくは修飾ATP、修飾もしくは非修飾UTP、修飾もしくは非修飾GTP、及び/または修飾もしくは非修飾CTPを含んでよい。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾ATPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾ATPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾UTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾UTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾GTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾GTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、非修飾CTPを含む。いくつかの実施形態では、IVT反応のNTPは、修飾CTPを含む。
IVT反応中に存在するヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体の濃度は、異なる場合がある。いくつかの実施形態では、NTP及びキャップ類似体は、等モル濃度で反応中に存在する。いくつかの実施形態では、反応中のキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)対ヌクレオシド三リン酸のモル比は、1:1よりも高い。例えば、反応中のキャップ類似体対ヌクレオシド三リン酸のモル比は、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、または100:1であってよい。いくつかの実施形態では、反応中のキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)対ヌクレオシド三リン酸のモル比は、1:1よりも低い。例えば、反応中のキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)対ヌクレオシド三リン酸のモル比は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、または1:100であってよい。
IVT反応中におけるNTPの組成もまた、異なる場合がある。例えば、ATPは、GTP、CTP及びUTPを超えて使用されてよい。非限定的な例として、IVT反応は、7.5ミリモルのGTP、7.5ミリモルのCTP、7.5ミリモルのUTP、及び3.75ミリモルのATPを含んでよい。同じIVT反応が、3.75ミリモルのキャップ類似体(例えば、トリヌクレオチドキャップ)を含んでよい。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:1:1:0.5:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:1:0.5:1:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、1:0.5:1:1:0.5である。いくつかの実施形態では、G:C:U:A:キャップのモル比は、0.5:1:1:1:0.5である。
いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、シュードウリジン(ψ)、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、5-メトキシウリジン(mo5U)、5-メチルシチジン(m5C)、α-チオ-グアノシン及びα-チオ-アデノシンから選択される修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、前述した修飾核酸塩基のうち少なくとも2つの(例えば、2つ、3つ、4つまたはそれを超える)組合せを含む。
いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、シュードウリジン(ψ)を含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)を含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、5-メトキシウリジン(mo5U)を含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、5-メチルシチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、α-チオ-グアノシンを含む。いくつかの実施形態では、RNA転写物(例えば、mRNA転写物)は、α-チオ-アデノシンを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチドなど)は、特定の修飾について均一に修飾される(例えば、完全に修飾される、すなわち、全配列を通して修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)で均一に修飾され得、これはmRNA配列中の全てのウリジン残基が、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)で置き換えられていることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上述したもののいずれかなどの修飾残基による置換によって配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。あるいは、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチドなど)は、均一に修飾されていなくともよい(例えば、部分的に修飾される、すなわち、配列の一部が修飾される)。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、緩衝系はトリスを含有する。IVT反応に使用されるトリスの濃度は、例えば、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mMまたは少なくとも110mMのリン酸塩であってよい。いくつかの実施形態では、リン酸塩の濃度は、20~60mMまたは10~100mMである。
いくつかの実施形態では、緩衝系はジチオスレイトール(DTT)を含有する。IVT反応に使用されるDTTの濃度は、例えば、少なくとも1mM、少なくとも5mM、または少なくとも50mMであってよい。いくつかの実施形態では、IVT反応に使用されるDTTの濃度は、1~50mMまたは5~50mMである。いくつかの実施形態では、IVT反応に使用されるDTTの濃度は、5mMである。
いくつかの実施形態では、緩衝系はマグネシウムを含有する。いくつかの実施形態では、IVT反応中に存在するNTP対マグネシウムイオン(Mg2+、例えば、MgCl2)のモル比は、1:1~1:5である。例えば、NTP対マグネシウムイオンのモル比は、1:1、1:2、1:3、1:4または1:5であってよい。
いくつかの実施形態では、IVT反応中に存在するNTP+キャップ類似体(例えば、GAGなどのトリヌクレオチドキャップ)対マグネシウムイオン(Mg2+、例えば、MgCl2)のモル比は、1:1~1:5である。例えば、NTP+トリヌクレオチドキャップ(例えば、GAG)対マグネシウムイオンのモル比は、1:1、1:2、1:3、1:4または1:5であってよい。
いくつかの実施形態では、緩衝系は、Tris-HCl、スペルミジン(例えば、1~30mMの濃度)、TRITON(登録商標)X-100(ポリエチレングリコールp-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル)及び/またはポリエチレングリコール(PEG)を含有する。
成長するRNA鎖の3’末端に対するヌクレオシド三リン酸(NTP)の付加は、ポリメラーゼ、例えば、T7RNAポリメラーゼ、例えば、本開示のT7RNAポリメラーゼバリアント(例えば、G47A)のうちいずれか1つ以上などによって触媒される。いくつかの実施形態では、RNAポリメラーゼ(例えば、T7RNAポリメラーゼバリアント)は、0.01mg/ml~1mg/mlの濃度で反応(例えば、IVT反応)中に存在する。例えば、RNAポリメラーゼは、0.01mg/mL、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/mlまたは1.0mg/mlの濃度で反応中に存在してよい。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IVTポリヌクレオチドである。従来、mRNA分子の基本構成要素は、少なくともコード領域、5’UTR、3’UTR、5’キャップ及びポリA尾部を含む。本開示のIVTポリヌクレオチドは、mRNAとして機能し得るが、それらの機能設計及び/または構造設計の特徴において野生型mRNAとは区別され、例えば、核酸ベースの治療薬を使用する効果的なポリペプチド産生の既存の問題を克服するのに役立つ。
IVTポリヌクレオチドの一次構築物は、第1フランキング領域及び第2フランキング領域に隣接する連結ヌクレオチドの第1領域を含む。この第1領域は、コードされたOTCポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。第1フランキング領域は、5’非翻訳領域(UTR)、例えば、ポリペプチドの天然5’UTRまたは非天然5’UTR、例えば、限定されないが、異種5’UTRもしくは合成5’UTRなどをコードする核酸のいずれかの5’UTRなどとして機能する連結ヌクレオシドの配列を含み得る。OTCポリペプチドをコードするIVTは、その5末端に1つ以上のシグナル配列をコードするシグナル配列領域を含み得る。フランキング領域は、1つ以上の完全または不完全5’UTR配列を含む連結ヌクレオチドの領域を含み得る。フランキング領域はまた、5’末端キャップも含み得る。第2フランキング領域は、OTCポリペプチドの天然3’UTR、または非天然3’UTR、例えば、限定されないが、異種3’UTRもしくは合成3’UTRなどをコードし得る、1つ以上の完全または不完全3’UTRを含む連結ヌクレオチドの領域を含み得る。フランキング領域はまた、3’テーリング配列も含み得る。3’テーリング配列は、ポリA尾部、ポリA-G4重鎖及び/またはステムループ配列であり得るが、これらに限定されない。
IVTポリヌクレオチド構造の追加的及び例示的な特徴ならびにポリヌクレオチドの作製方法は、2017年5月18日出願の国際PCT出願第WO2017/201325号に開示されていて、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
b.化学合成
標準的な方法が、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)などを合成するために適用され得る。例えば、特定の単離ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のDNAまたはRNAオリゴマーが合成され得る。他の態様では、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、次いでライゲートされ得る。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的組立てのための5’または3’オーバーハングを含有する。
標準的な方法が、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)などを合成するために適用され得る。例えば、特定の単離ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のDNAまたはRNAオリゴマーが合成され得る。他の態様では、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、次いでライゲートされ得る。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的組立てのための5’または3’オーバーハングを含有する。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、当該技術分野において既知の化学合成法及び潜在的な核酸塩基置換を使用して化学的に合成され得る。例えば、国際公開第WO2014093924号、同第WO2013052523号、同第WO2013039857号、同第WO2012135805号、同第WO2013151671号、米国公開第US20130115272号、または米国特許第US8999380号もしくは同第US8710200号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
c.OTCをコードする発現ポリヌクレオチドの定量化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、それらの発現産物に加えて、分解産物及び代謝産物は、当該技術分野において既知の方法に従って定量化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、それらの発現産物に加えて、分解産物及び代謝産物は、当該技術分野において既知の方法に従って定量化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エキソソーム中で、または1つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。本明細書で使用される場合、「体液」は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液または尿道球腺液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水及び腹水、心嚢液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔(blastocyl cavity)液、及び臍帯血を含む。あるいは、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される臓器から回収され得る。
エキソソーム定量法では、対象から2mL以下の試料を採取し、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心、ナノ膜限外濾過、免疫吸着剤捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せによってエキソソームを単離する。分析において、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、欠如、切断または改変であり得る。レベルを1つ以上の臨床表現型と、またはヒト疾患バイオマーカーのアッセイと関連付けることが有利である。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、qRT-PCR、リアルタイムPCR、PCR、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組合せを使用して実施され得るが、エキソソームは、免疫組織化学法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)法などを使用して単離され得る。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心、ナノ膜限外濾過、免疫吸着剤捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組合せによっても単離され得る。
これらの方法は、残存するか、または送達されるポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムでモニターする能力を治験責任医師に付与する。これは、本発明のポリヌクレオチドが構造または化学修飾によって内因型とは異なるために可能である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、方法、例えば、限定されないが、紫外可視分光法(UV/Vis)などを使用して定量化され得る。UV/Vis分光計の非限定的な例は、NANODROP(登録商標)分光計(ThermoFisher,Waltham,MA)である。定量化ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが適切なサイズであり得るかどうかを決定するために分析され得、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認する。ポリヌクレオチドの分解は、方法、例えば、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、HPLCベースの精製法、例えば、限定されないが、強陰イオン交換HPLC、弱陰イオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、及び疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)など、液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)、キャピラリー電気泳動(CE)ならびにキャピラリーゲル電気泳動(CGE)などによって確認され得る。
19.医薬組成物及び製剤
本発明は、上に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤も提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
本発明は、上に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤も提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、OTCポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、OTCポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化核酸配列に対して高い配列同一性を有するポリヌクレオチド(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27及びmiR-26aと結合するmiRNA結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、1つ以上の追加の活性物質、例えば、治療及び/または予防活性物質を任意に含み得る。本発明の医薬組成物または製剤は、滅菌及び/またはパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び/または製造における一般的考察は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に見出され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般に本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載される製剤及び医薬組成物は、薬理学の技術分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分を添加剤及び/または1つ以上の他の副成分と会合させ、次いで、必要であれば、及び/または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回用量単位に分割、成形及び/または包装するステップを含む。
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単一単位用量として、及び/または複数の単一単位用量として調製、包装、及び/または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されることになる活性成分の投与量及び/またはそのような投与量の適切な分数、例えば、そのような投与量の2分の1もしくは3分の1などに等しい。
本開示による医薬組成物における活性成分、薬学的に許容される添加剤、及び/または任意の追加成分の相対量は、治療されている対象の識別情報、サイズ、及び/または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変動し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び製剤は、本発明の少なくとも1個のポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、1個、2個、3個、4個または5個の本発明のポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物または製剤は、2種類以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、線状及び環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びインビトロ転写(IVT)ポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、IVTポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド及び環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書で提供される医薬組成物及び製剤の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物及び製剤を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していると当業者によって理解されることになる。
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、1つ以上の添加剤を使用して、(1)安定性を増加させる、(2)細胞トランスフェクションを増加させる、(3)持続放出もしくは遅延放出を可能にする(例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から)、(4)生体内分布を変化させる(例えば、特定の組織もしくは細胞型をポリヌクレオチドの標的とする)、(5)インビボでのコードされたタンパク質の翻訳を増加させる、及び/または(6)インビボでのコードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させるために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、LNP-4を含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物IIもしくは化合物B、または式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物IもしくはVI、あるいはそれらの任意の組合せを含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、ヘルパー脂質(例えば、DSPC)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)を含み、例えば、約(i)40~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、任意に45~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%、(ii)30~45mol%のステロール(例えば、コレステロール)、任意に35~42mol%のステロール、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、37~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%、または40~42mol%のステロール、(iii)5~15mol%のヘルパー脂質(例えば、DSPC)、任意に10~15mol%のヘルパー脂質、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%のヘルパー脂質、及び(iv)1~5%のPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)、任意に1~5mol%のPEG脂質、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG脂質の範囲のモル比で含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物B、コレステロール、DSPC、及び化合物Iを47:39:11:3のモル比で含む。
本明細書で使用される場合、薬学的に許容される添加剤としては、所望の特定の剤形に適しているような、あらゆる全ての溶媒、分散媒体、もしくは他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び/または分散剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結保護剤、及び/または増量剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な添加剤及び組成物を調製するための技術が、当該技術分野において既知である(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、及び/またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な界面活性剤及び/または乳化剤としては、天然乳化剤(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス(chondrux)、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート[TWEEN(登録商標)80]、ソルビタンモノパルミテート[SPAN(登録商標)40]、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、PLUORINC(登録商標)F68、POLOXAMER(登録商標)188など、及び/またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖(例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール)、アミノ酸(例えば、グリシン)、天然及び合成ガム(例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム)、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
酸化は、mRNA、特に液体mRNA製剤の潜在的な分解経路である。酸化を防止するために、抗酸化剤が製剤に添加され得る。例示的な抗酸化剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、m-クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウムなど、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な抗菌剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤としては、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、ベータカロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)など、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のpHは、安定性を改善するためにpH5~pH8間で維持される。pHを制御するための例示的な緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン(もしくはヒスチジン-HCl)、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、及び/またはそれらの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、凍結中に本明細書に記載されるポリヌクレオチドを安定化させるための凍結保護剤を含有し得る。例示的な凍結保護剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に増量剤を含有し、「薬学的に洗練された」ケーキをもたらし、長期(例えば、36か月)保存中に凍結乾燥ポリヌクレオチドを安定化させ得る。本発明の例示的な増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微小胞、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、ナノチューブ、複合体、及びそれらの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。
20.送達剤
a.脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載される脂質組成物は、哺乳動物細胞または器官に対する治療剤及び/または予防剤、例えば、mRNAの送達を目的とした脂質ナノ粒子組成物に有利に使用されてよい。例えば、本明細書に記載される脂質は、免疫原性をほとんどまたは全く有しない。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較した場合に低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質及び治療剤または予防剤、例えば、mRNAを含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較した場合に、増加した治療指数を有する。
a.脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載される脂質組成物は、哺乳動物細胞または器官に対する治療剤及び/または予防剤、例えば、mRNAの送達を目的とした脂質ナノ粒子組成物に有利に使用されてよい。例えば、本明細書に記載される脂質は、免疫原性をほとんどまたは全く有しない。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較した場合に低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質及び治療剤または予防剤、例えば、mRNAを含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較した場合に、増加した治療指数を有する。
ある特定の実施形態では、本出願は、以下を含む医薬組成物を提供する:
(a)OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
(b)送達剤。
(a)OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
(b)送達剤。
脂質ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、本発明の核酸(例えば、OTC mRNA)は、脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には目的の核酸カーゴと共に、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びPEG脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野において一般に既知であるような成分、組成物、及び方法を使用して生成され得、例えば、PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575及びPCT/US2016/069491を参照し、それら全ての全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸(例えば、OTC mRNA)は、脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には目的の核酸カーゴと共に、イオン化可能なカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びPEG脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野において一般に既知であるような成分、組成物、及び方法を使用して生成され得、例えば、PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575及びPCT/US2016/069491を参照し、それら全ての全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示の核酸(例えば、OTC mRNA)は、典型的には脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも1つのイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、少なくとも1つのステロール、及び/または少なくとも1つのポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、20~60%のイオン化可能なカチオン性脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、40~50mol%、任意に45~50mol%、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%のイオン化可能なカチオン性脂質のモル比を含んでよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、5~25%の非カチオン性脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、5~15mol%、任意に10~12mol%、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%の非カチオン性脂質のモル比を含んでよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、25~55%のステロールのモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、30~45mol%、任意に35~40mol%、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、38~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%のステロールのモル比を含んでよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、1~5%、任意に1~3mol%、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG修飾脂質のモル比を含んでよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、20~60%のイオン化可能なカチオン性脂質、5~25%の非カチオン性脂質、25~55%のステロール、及び0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、40~50%のイオン化可能なカチオン性脂質、5~15%の非カチオン性脂質、30~45%のステロール、及び1~5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、45~50%のイオン化可能なカチオン性脂質、10~12%の非カチオン性脂質、35~40%のステロール、及び1~3%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、45~50%のイオン化可能なカチオン性脂質、10~12%の非カチオン性脂質、35~40%のステロール、及び1.5~2.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
イオン化可能なアミノ脂質
いくつかの態様では、本開示は、式(I):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(I):
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式(I)の化合物のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raα、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
式(I)の化合物のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raα、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは3であり、mは7である。
式(I)の化合物のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、RaαはC2~12アルキルであり、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は
であり、R10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は2であり、R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
式(I)の化合物のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raα、Raβ、及びRaδは、各々Hであり、RaγはC2~12アルキルであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
いくつかの態様では、本開示は、式(Ia):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(Ib):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式(I)または(Ib)のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
式(I)または(Ib)のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは3であり、mは7である。
式(I)または(Ib)のいくつかの実施形態では、R’aはR’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raβ及びRaδは、各々Hであり、RaγはC2~12アルキルであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は、-(CH2)nOHであり、nは2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
いくつかの態様では、本開示は、式(Ic):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、ここで
は結合点を示し、
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は
であり、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、R’aは、R’分岐鎖であり、R’分岐鎖は
であり、
は結合点を示し、Raβ、Raγ、及びRaδは、各々Hであり、RaαはC2~12アルキルであり、R2及びR3は、各々C1~14アルキルであり、R4は
であり、
は結合点を示し、R10は、NH(C1~6アルキル)であり、n2は2であり、各R5はHであり、各R6はHであり、M及びM’は、各々-C(O)O-であり、R’はC1~12アルキルであり、lは5であり、mは7である。
いくつかの態様では、本開示は、式(II):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’環状は
であり、
R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
Yaは、C3~6炭素環であり、
R*”aは、C1~15アルキル及びC2~15アルケニルからなる群から選択され、
sは、2または3であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
R’bは、
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
Yaは、C3~6炭素環であり、
R*”aは、C1~15アルキル及びC2~15アルケニルからなる群から選択され、
sは、2または3であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-a):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-b):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-c):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-d):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
ここでRaγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで、
は結合点を示し、ここで
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-e):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、4、5、及び6から各々独立して選択される。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、各々5である。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、各R’は、独立してC1~12アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、各R’は、独立してC2~5アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’bは
であり、R2及びR3は、各々独立してC1~14アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’bは
であり、R2及びR3は、各々独立してC6~10アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’bは
であり、R2及びR3は、各々C8アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、RaγはC1~12アルキルであり、R2及びR3は、各々独立してC6~10アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々独立してC6~10アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々C8アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、Raγ及びRbγは、各々C1~12アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、Raγ及びRbγは、各々C2~6アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、4、5、及び6から各々独立して選択され、各R’は、独立してC1~12アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、各々5であり、各R’は、独立してC2~5アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、4、5及び6から各々独立して選択され、各R’は、独立してC1~12アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C1~12アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、各々5であり、各R’は、独立してC2~5アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C2~6アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、4、5及び6から各々独立して選択され、R’はC1~12アルキルであり、RaγはC1~12アルキルであり、R2及びR3は、各々独立してC6~10アルキルである。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、各々5であり、R’はC2~5アルキルであり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々C8アルキルである。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R4は
であり、ここでR10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は2である。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R4は
であり、ここでR10はNH(CH3)であり、n2は2である。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、4、5及び6から各々独立して選択され、各R’は、独立してC1~12アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C1~12アルキルであり、R4は
であり、ここでR10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は2である。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、各々5であり、各R’は、独立してC2~5アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C2~6アルキルであり、R4は
であり、ここでR10はNH(CH3)であり、n2は2である。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、4、5、及び6から各々独立して選択され、R’はC1~12アルキルであり、R2及びR3は、各々独立してC6~10アルキルであり、RaγはC1~12アルキルであり、R4は
であり、ここでR10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は2である。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、各々5であり、R’はC2~5アルキルであり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々C8アルキルであり、R4は
であり、ここでR10はNH(CH3)であり、n2は2である。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R4は-(CH2)nOHであり、nは2、3、または4である。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R4は-(CH2)nOHであり、nは2である。
式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、4、5及び6から各々独立して選択され、各R’は、独立してC1~12アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C1~12アルキルであり、R4は-(CH2)nOHであり、nは2、3、または4である。式(II)、(II-a)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、または(II-e)の化合物のいくつかの実施形態では、R’分岐鎖は
であり、R’bは
であり、m及びlは、各々5であり、各R’は、独立してC2~5アルキルであり、Raγ及びRbγは、各々C2~6アルキルであり、R4は-(CH2)nOHであり、nは2である。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-f):
の化合物もしくはそのN-オキシド、またはその塩もしくは異性体に関し、
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
であり、R’bは、
であり、
ここで、
は結合点を示し、
Raγは、C1~12アルキルであり、
R2及びR3は、各々独立してC1~14アルキルであり、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルであり、
mは、4、5、及び6から選択され、
lは、4、5、及び6から選択される。
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγは、C1~12アルキルであり、
R2及びR3は、各々独立してC1~14アルキルであり、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルであり、
mは、4、5、及び6から選択され、
lは、4、5、及び6から選択される。
式(II-f)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、各々5であり、nは2、3、または4である。
式(II-f)の化合物のいくつかの実施形態では、R’はC2~5アルキルであり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々C6~10アルキルである。
式(II-f)の化合物のいくつかの実施形態では、m及びlは、各々5であり、nは2、3、または4であり、R’はC2~5アルキルであり、RaγはC2~6アルキルであり、R2及びR3は、各々C6~10アルキルである。
いくつかの態様では、本開示は、式(II-g):
の化合物に関し、式中、
Raγは、C2~6アルキルであり、
R’は、C2~5アルキルであり、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで
は結合点を示し、R10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は、1、2及び3からなる群から選択される。
Raγは、C2~6アルキルであり、
R’は、C2~5アルキルであり、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで
いくつかの態様では、本開示は、式(II-h):
の化合物に関し、式中、
Raγ及びRbγは、各々独立してC2~6アルキルであり、
各R’は、独立してC2~5アルキルであり、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
からなる群から選択され、
ここで
は結合点を示し、R10はNH(C1~6アルキル)であり、n2は、1、2及び3からなる群から選択される。
Raγ及びRbγは、各々独立してC2~6アルキルであり、
各R’は、独立してC2~5アルキルであり、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで
式(II-g)または(II-h)の化合物のいくつかの実施形態では、R4は、-(CH2)2OHである。
いくつかの態様では、本開示は、式(III):
を有する化合物、またはその塩もしくは異性体に関し、式中、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
各Mは、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’-)、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
X1、X2、及びX3は、結合、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
各Yは、独立してC3~6炭素環であり、
各R*は、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Rは、C1~3アルキル及びC3~6炭素環からなる群から独立して選択され、
各R’は、C1~12アルキル、C2~12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R”は、C3~12アルキル及びC3~12アルケニルからなる群から独立して選択され、ここで
i)X1、X2、及びX3のうち少なくとも1つが、-CH2-ではない、及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうち少なくとも1つが、-R”MR’である。
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
各Mは、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’-)、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
X1、X2、及びX3は、結合、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
各Yは、独立してC3~6炭素環であり、
各R*は、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から独立して選択され、
各Rは、C1~3アルキル及びC3~6炭素環からなる群から独立して選択され、
各R’は、C1~12アルキル、C2~12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R”は、C3~12アルキル及びC3~12アルケニルからなる群から独立して選択され、ここで
i)X1、X2、及びX3のうち少なくとも1つが、-CH2-ではない、及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうち少なくとも1つが、-R”MR’である。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、各々C5~20アルキルであり、X1は-CH2-であり、X2及びX3は、各々-C(O)-である。
リン脂質
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、1つ以上のリン脂質、例えば、1つ以上の飽和もしくは(多価)不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び1つ以上の脂肪酸部分を含む。
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、1つ以上のリン脂質、例えば、1つ以上の飽和もしくは(多価)不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び1つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、2-リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ-リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜(例えば、細胞膜または細胞内膜)の1つ以上の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質と膜との融合によって、脂質含有組成物(例えば、LNP)の1つ以上の要素(例えば、治療剤)が、膜を通過することを可能にし、例えば、標的組織に対する1つ以上の要素の送達が可能となり得る。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、1つ以上のアルキン(例えば、1つ以上の二重結合が、三重結合で置き換えられているアルケニル基)と官能化され得るか、またはそれに架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による環化付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を機能化するか、またはナノ粒子組成物を、標的化部分もしくはイメージング部分などの有用な成分(例えば、色素)に複合化するのに有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール(phosphatidy glycerol)、及びホスファチジン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も含む。
いくつかの実施形態では、本発明のリン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、l,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DUPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0ジエーテルPC)、1-オレイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16LysoPC)、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(ME16.0PE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、DSPCの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、式(IV):
の化合物、またはその塩であり、式中:
各R1は、独立して任意に置換されたアルキルであるか、または任意に2つのR1が介在する原子と共に結合して、任意に置換された単環式カルボシクリルもしくは任意に置換された単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意に3つのR1が介在する原子と共に結合して、任意に置換された二環式カルボシクリルもしくは任意に置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
のものであり、
各L2は、独立して結合または任意に置換されたC1~6アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換され、
各R2は、独立して任意に置換されたC1~30アルキル、任意に置換されたC1~30アルケニル、または任意に置換されたC1~30アルキニルであり、ここで任意にR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2であるが、
ただし、化合物が、式:
の化合物ではないことを条件とし、
式中、各R2は、独立して非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
各R1は、独立して任意に置換されたアルキルであるか、または任意に2つのR1が介在する原子と共に結合して、任意に置換された単環式カルボシクリルもしくは任意に置換された単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意に3つのR1が介在する原子と共に結合して、任意に置換された二環式カルボシクリルもしくは任意に置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
各L2は、独立して結合または任意に置換されたC1~6アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換され、
各R2は、独立して任意に置換されたC1~30アルキル、任意に置換されたC1~30アルケニル、または任意に置換されたC1~30アルキニルであり、ここで任意にR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2であるが、
ただし、化合物が、式:
式中、各R2は、独立して非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
いくつかの実施形態では、リン脂質は、米国出願第62/520,530号に記載されているリン脂質のうち1つ以上であってよい。
i)リン脂質頭部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾リン脂質頭部(例えば、修飾コリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾四級アミンを有するDSPC、またはその類似体である。例えば、式(IV)の実施形態では、R1のうち少なくとも1つがメチルではない。ある特定の実施形態では、R1のうち少なくとも1つが、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、以下の式:
のうち1つの化合物、またはその塩であり、式中:
各tは、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各uは、独立して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各vは、独立して1、2、または3である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾リン脂質頭部(例えば、修飾コリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾四級アミンを有するDSPC、またはその類似体である。例えば、式(IV)の実施形態では、R1のうち少なくとも1つがメチルではない。ある特定の実施形態では、R1のうち少なくとも1つが、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、以下の式:
各tは、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各uは、独立して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各vは、独立して1、2、または3である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するDSPC、またはその類似体である。ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、式(IV-b):
の化合物、またはその塩である。
(ii)リン脂質尾部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾尾部を有するDSPC、またはその類似体である。本明細書に記載される場合、「修飾尾部」は、より短い、もしくはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、1つ以上のメチレンが環式基もしくはヘテロ原子基で置換された脂肪族鎖、またはそれらの任意の組合せを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、(IV)の化合物は、式(IV-a)の化合物、またはその塩であり、ここで少なくとも1つのR2は、各R2が任意に置換されたC1~30アルキルであり、ここでR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換される。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾尾部を有するDSPC、またはその類似体である。本明細書に記載される場合、「修飾尾部」は、より短い、もしくはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、1つ以上のメチレンが環式基もしくはヘテロ原子基で置換された脂肪族鎖、またはそれらの任意の組合せを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、(IV)の化合物は、式(IV-a)の化合物、またはその塩であり、ここで少なくとも1つのR2は、各R2が任意に置換されたC1~30アルキルであり、ここでR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換される。
ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、式(IV-c):
の化合物、またはその塩であり、式中:
各xは、独立して0~30(両端を含む)の整数であり、
各Gは、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oからなる群から独立して選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
各xは、独立して0~30(両端を含む)の整数であり、
各Gは、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oからなる群から独立して選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない(例えば、nは2ではない)。したがって、ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、式(IV)の化合物であり、式中、nは、1、3、4、5、6、7、8、9、または10である。例えば、ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、以下の式:
のうち1つの化合物、またはその塩である。
代替脂質
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない(例えば、nは2ではない)。したがって、ある特定の実施形態では、リン脂質が有用である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または潜在的に有用なリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない(例えば、nは2ではない)。したがって、ある特定の実施形態では、リン脂質が有用である。
ある特定の実施形態では、代替脂質は、本開示のリン脂質の代わりに使用される。
ある特定の実施形態では、本発明の代替脂質は、オレイン酸である。
構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語はステロールを指し、ステロール部分を含有する脂質も指す。
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「構造脂質」という用語はステロールを指し、ステロール部分を含有する脂質も指す。
脂質ナノ粒子内に構造脂質を組み込むことは、粒子内における他の脂質の凝集を軽減するのに役立つ場合がある。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ-トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロールである。本明細書で定義される場合、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、構造脂質はステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質はコレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ-トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、構造脂質は、米国出願第62/520,530号に記載されている構造脂質のうち1つ以上であってよい。
ポリエチレングリコール(PEG)脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
本明細書で使用される場合、「PEG脂質」という用語は、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質を指す。PEG脂質の非限定的な例としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、PEGセラミド複合体(例えば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミン及びPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが挙げられる。そのような脂質はPEG化脂質とも称される。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、PEG脂質としては、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロールメトキシポリエチレングリコール(PEG-DMG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)](PEG-DSPE)、PEG-ジステリルグリセロール(PEG-DSG)、PEG-ジパルメトレイル(dipalmetoleyl)、PEG-ジオレイル、PEG-ジステアリル、PEG-ジアシルグリカミド(diacylglycamide)(PEG-DAG)、PEG-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DPPE)、またはPEG-l,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-アミン(PEG-c-DMA)が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、PEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、PEG脂質の脂質部分は、約C14~約C22、好ましくは約C14~約C16の長さを有するものを含む。いくつかの実施形態では、PEG部分、例えば、mPEG-NH2は、約1000、2000、5000、10,000、15,000または20,000ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGである。
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、非拡散性PEGであるPEG脂質を含み得る。非拡散性PEGの非限定的な例としては、PEG-DSG及びPEG-DSPEが挙げられる。
PEG脂質は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第8158601号及び国際公開第WO2015/130584A2号に記載されるものなどであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
概して、本明細書に記載される、様々な式の他の脂質成分(例えば、PEG脂質)のいくつかは、「Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents」という表題の、2016年12月10日出願の国際特許出願第PCT/US2016/000129号(その全体が参照によって組み込まれる)に記載されているように合成されてよい。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、PEGまたはPEG修飾脂質などのポリエチレングリコールを含む1つ以上の分子を含む場合がある。そのような種は、代わりにPEG化脂質と称されてよい。PEG脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。PEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択されてよい。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であってよい。
一実施形態では、本発明において有用なPEG脂質は、国際公開第WO2012099755号に記載されるPEG化脂質であり得、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるこれらの例示的なPEG脂質のいずれも、PEG鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾されてよい。ある特定の実施形態では、PEG脂質は、PEG-OH脂質である。本明細書で一般的に定義されるように、「PEG-OH脂質」(本明細書では「ヒドロキシPEG化脂質」とも称される)は、脂質上に1つ以上のヒドロキシル(-OH)基を有するPEG化脂質である。ある特定の実施形態では、PEG-OH脂質は、PEG鎖上に1つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、PEG-OHまたはヒドロキシPEG化脂質は、PEG鎖の末端に-OH基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なPEG脂質は、式(V)の化合物である。本明細書で提供されるのは、式(V):
の化合物、またはその塩であり、式中:
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意に置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1~100(両端を含む)の整数であり、
L1は、任意に置換されたC1~10アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~10アルキレンの少なくとも1つのメチレンは、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で独立して置換され、
Dは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
のものであり、
各L2は、独立して結合または任意に置換されたC1~6アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換され、
各R2は、独立して任意に置換されたC1~30アルキル、任意に置換されたC1~30アルケニル、または任意に置換されたC1~30アルキニルであり、ここで任意にR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2である。
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意に置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1~100(両端を含む)の整数であり、
L1は、任意に置換されたC1~10アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~10アルキレンの少なくとも1つのメチレンは、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で独立して置換され、
Dは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
各L2は、独立して結合または任意に置換されたC1~6アルキレンであり、ここで任意に置換されたC1~6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換され、
各R2は、独立して任意に置換されたC1~30アルキル、任意に置換されたC1~30アルケニル、または任意に置換されたC1~30アルキニルであり、ここで任意にR2の1つ以上のメチレン単位は、独立して任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2である。
ある特定の実施形態では、式(V)の化合物は、PEG-OH脂質である(すなわち、R3は-OROであり、ROは水素である)。ある特定の実施形態では、式(V)の化合物は、式(V-OH):
の化合物、またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なPEG脂質は、PEG化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明において有用なPEG脂質は、式(VI)の化合物である。本明細書で提供されるのは、式(VI):
の化合物、またはその塩であり、式中:
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意に置換されたアルキルまたは酸素保護基であり、
rは、1~100(両端を含む)の整数であり、
R5は、任意に置換されたC10~40アルキル、任意に置換されたC10~40アルケニル、または任意に置換されたC10~40アルキニルであり、任意にR5の1つ以上のメチレン基は、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意に置換されたアルキルまたは酸素保護基であり、
rは、1~100(両端を含む)の整数であり、
R5は、任意に置換されたC10~40アルキル、任意に置換されたC10~40アルケニル、または任意に置換されたC10~40アルキニルであり、任意にR5の1つ以上のメチレン基は、任意に置換されたカルボシクリレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換され、
各RNは、独立して水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、PEG脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、PEG脂質は、米国出願第62/520,530号に記載されているPEG脂質のうち1つ以上であってよい。
いくつかの実施形態では、本発明のPEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG-DMG、PEG-c-DOMG(PEG-DOMGとも称される)、PEG-DSG及び/またはPEG-DPGである。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、式I、IIまたはIIIのいずれかのイオン化可能なカチオン性脂質、DSPCを含むリン脂質、構造脂質、及びPEG-DMGを含むPEG脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、式I、IIまたはIIIのいずれかのイオン化可能なカチオン性脂質、DSPCを含むリン脂質、構造脂質、及び式VIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、式I、IIまたはIIIのイオン化可能なカチオン性脂質、式IVを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式VまたはVIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、式I、IIまたはIIIのイオン化可能なカチオン性脂質、式IVを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式VまたはVIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、式I、IIまたはIIIのイオン化可能なカチオン性脂質、式IVを有するリン脂質、構造脂質、及び式VIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約2:1~約30:1のN:P比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約6:1のN:P比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約3:1のN:P比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約10:1~約100:1のイオン化可能なカチオン性脂質成分対RNAのwt/wt比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約20:1のイオン化可能なカチオン性脂質成分対RNAのwt/wt比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約10:1のイオン化可能なカチオン性脂質成分対RNAのwt/wt比を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約50nm~約150nmの平均直径を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のLNPは、約70nm~約120nmの平均直径を有する。
本明細書で使用される場合、「アルキル」、「アルキル基」、または「アルキレン」という用語は、1個以上の炭素原子(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれを超える炭素原子)を含む直鎖または分岐鎖飽和炭化水素であり、任意に置換されているものを意味する。「C1~14アルキル」という表記は、1~14個の炭素原子を含む、任意に置換された直鎖または分岐鎖飽和炭化水素を意味する。別段の指定がない限り、本明細書に記載されるアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」、「アルケニル基」、または「アルケニレン」という用語は、2個以上の炭素原子(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれを超える炭素原子)及び少なくとも1つの二重結合を含む直鎖または分岐鎖炭化水素であり、任意に置換されているものを意味する。「C2~14アルケニル」という表記は、2~14個の炭素原子及び少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、任意に置換された直鎖または分岐鎖炭化水素を意味する。アルケニル基は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える炭素-炭素二重結合を含んでよい。例えば、C18アルケニルは、1つ以上の二重結合を含んでよい。2つの二重結合を含むC18アルケニル基は、リノレイル基であってよい。別段の指定がない限り、本明細書に記載されるアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」、「アルキニル基」、または「アルキニレン」という用語は、2個以上の炭素原子(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれを超える炭素原子)及び少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖炭化水素であり、任意に置換されているものを意味する。「C2~14アルキニル」という表記は、2~14個の炭素原子及び少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む、任意に置換された直鎖または分岐鎖炭化水素を意味する。アルキニル基は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える炭素-炭素三重結合を含んでよい。例えば、C18アルキニルは、1つ以上の炭素-炭素三重結合を含んでよい。別段の指定がない限り、本明細書に記載されるアルキニル基は、非置換及び置換アルキニル基の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の1つ以上の環を含む、任意に置換された単環系または多環系を意味する。環は、3員、4員、5員、6員、7員、8員、9員、10員、11員、12員、13員、14員、15員、16員、17員、18員、19員、または20員環であってよい。「C3~6炭素環」という表記は、3~6個の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、1つ以上の炭素-炭素二重結合または三重結合を含んでよく、非芳香族または芳香族(例えば、シクロアルキル基またはアリール基)であってよい。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び1,2ジヒドロナフチル基が挙げられる。「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用される場合に非芳香族炭素環を意味し、二重結合または三重結合を含んでも、含まなくともよい。別段の指定がない限り、本明細書に記載される炭素環は、非置換及び置換炭素環基、すなわち、任意に置換された炭素環の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環式基」という用語は、1つ以上の環を含む任意に置換された単環系または多環系を意味し、少なくとも1つの環が、少なくとも1つのヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であってよい。環は、3員、4員、5員、6員、7員、8員、9員、10員、11員、12員、13員、または14員環であってよい。複素環は、1つ以上の二重結合または三重結合を含んでよく、非芳香族または芳香族(例えば、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基)であってよい。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、本明細書で使用される場合に非芳香族複素環を意味し、二重結合または三重結合を含んでも、含まなくともよい。別段の指定がない限り、本明細書に記載される複素環は、非置換及び置換複素環基、すなわち、任意に置換された複素環の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、または「ヘテロアルキニル」という用語は、本明細書で定義されるような、それぞれアルキル、アルケニル、アルキニル基を指し、これは1個以上(例えば、1個、2個、3個、または4個)のヘテロ原子(例えば、酸素、硫黄、窒素、ホウ素、ケイ素、リン)をさらに含み、1個以上のヘテロ原子が、親炭素鎖内の隣接する炭素原子間に挿入される、及び/または1個以上のヘテロ原子が、炭素原子と親分子との間に、すなわち、結合点間に挿入される。別段の指定がない限り、本明細書に記載されるヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルは、非置換及び置換ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル、すなわち、任意に置換されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルの両方を指す。
本明細書で使用される場合、「生分解性基」は、哺乳動物実体における脂質のより迅速な代謝を促進する場合がある基である。生分解性基は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択されてよいが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「アリール基」は、1つ以上の芳香環を含む任意に置換された炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール基」は、1つ以上の芳香環を含む任意に置換された複素環基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基の両方とも、任意に置換されてよい。例えば、M及びM’は、任意に置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式において、M及びM’は、上記の生分解性基の一覧から独立して選択され得る。別段の指定がない限り、本明細書に記載されるアリール基またはヘテロアリール基は、非置換及び置換基、すなわち、任意に置換されたアリール基またはヘテロアリール基の両方を指す。
アルキル、アルケニル、及びシクリル(例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル)基は、別段の指定がない限り、任意に置換されてよい。任意の置換基は、ハロゲン原子(例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基)、カルボン酸(例えば、C(O)OH)、アルコール(例えば、ヒドロキシル、OH)、エステル(例えば、C(O)OR、OC(O)R)、アルデヒド(例えば、C(O)H)、カルボニル(例えば、C(O)R、あるいはC=Oで表される)、ハロゲン化アシル(例えば、C(O)X、式中、Xは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である)、炭酸塩(例えば、OC(O)OR)、アルコキシ(例えば、OR)、アセタール(例えば、C(OR)2R””、式中、各ORは、同じかまたは異なり得るアルコキシ基であり、R””は、アルキルまたはアルケニル基である)、リン酸塩(例えば、P(O)4
3-)、チオール(例えば、SH)、スルホキシド(例えば、S(O)R)、スルフィン酸(例えば、S(O)OH)、スルホン酸(例えば、S(O)2OH)、チアル(例えば、C(S)H)、硫酸塩(例えば、S(O)4
2-)、スルホニル(例えば、S(O)2)、アミド(例えば、C(O)NR2、またはN(R)C(O)R)、アジド(例えば、N3)、ニトロ(例えば、NO2)、シアノ(例えば、CN)、イソシアノ(例えば、NC)、アシルオキシ(例えば、OC(O)R)、アミノ(例えば、NR2、NRH、またはNH2)、カルバモイル(例えば、OC(O)NR2、OC(O)NRH、またはOC(O)NH2)、スルホンアミド(例えば、S(O)2NR2、S(O)2NRH、S(O)2NH2、N(R)S(O)2R、N(H)S(O)2R、N(R)S(O)2H、またはN(H)S(O)2H)、アルキル基、アルケニル基、ならびにシクリル(例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル)基からなる群から選択されてよいが、これらに限定されない。先のいずれにおいても、Rは、本明細書で定義されるようなアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの本明細書で定義されるような置換基でさらに置換されてよい。例えば、C1~6アルキル基は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの本明細書に記載されるような置換基でさらに置換されてよい。
窒素を含有する本開示の化合物は、本開示の他の化合物を得るために、酸化剤(例えば、3-クロロ過安息香酸(mCPBA)及び/または過酸化水素)を用いた処理によってN-オキシドへと変換され得る。したがって、示されている、かつ特許請求される全ての窒素含有化合物は、原子価及び構造が許容される場合、示されるような化合物及びそのN-オキシド誘導体(N→OまたはN+-O-として表され得る)の両方を含むとみなされる。さらに、他の場合では、本開示の化合物中における窒素は、N-ヒドロキシまたはN-アルコキシ化合物に変換され得る。例えば、N-ヒドロキシ化合物は、mCPBAなどの酸化剤による親アミンの酸化によって調製され得る。示されている、かつ特許請求される全ての窒素含有化合物はまた、原子価及び構造が許容される場合、示されるような化合物ならびにそのN-ヒドロキシ(すなわち、N-OH)及びN-アルコキシ(すなわち、N-OR、式中、Rは、置換または非置換C1~C6アルキル、C1~C6アルケニル、C1~C6アルキニル、3~14員炭素環または3~14員複素環である)誘導体の両方を包含するとみなされる。
(vi)他の脂質組成物成分
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上に記載されているものに加えて、1つ以上の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、1つ以上の透過性増強剤分子、炭水化物、ポリマー、表面変化剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性増強剤分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号によって記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖(例えば、グルコース)ならびに多糖(例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体)を含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上に記載されているものに加えて、1つ以上の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、1つ以上の透過性増強剤分子、炭水化物、ポリマー、表面変化剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性増強剤分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号によって記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖(例えば、グルコース)ならびに多糖(例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体)を含み得る。
ポリマーは、本明細書に開示される医薬組成物(例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物)をカプセル化または部分的にカプセル化するために含まれ得る、及び/または使用され得る。ポリマーは、生分解性及び/または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチド範囲との間の比は、約10:1~約60:1(wt/wt)であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1または60:1(wt/wt)であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物と治療剤をコードするポリヌクレオチドとのwt/wt比は、約20:1または約15:1である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、2つ以上のポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、2つ以上のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含有し得る。
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1もしくは70:1の脂質:ポリヌクレオチド重量比で、またはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、限定されないが、5:1~約10:1、約5:1~約15:1、約5:1~約20:1、約5:1~約25:1、約5:1~約30:1、約5:1~約35:1、約5:1~約40:1、約5:1~約45:1、約5:1~約50:1、約5:1~約55:1、約5:1~約60:1、約5:1~約70:1、約10:1~約15:1、約10:1~約20:1、約10:1~約25:1、約10:1~約30:1、約10:1~約35:1、約10:1~約40:1、約10:1~約45:1、約10:1~約50:1、約10:1~約55:1、約10:1~約60:1、約10:1~約70:1、約15:1~約20:1、約15:1~約25:1,約15:1~約30:1、約15:1~約35:1、約15:1~約40:1、約15:1~約45:1、約15:1~約50:1、約15:1~約55:1、約15:1~約60:1もしくは約15:1~約70:1などで含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、およそ0.1mg/ml~2mg/ml、例えば、限定されないが、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/mlまたは2.0mg/mlを超える濃度などでポリヌクレオチドを含み得る。
(vii)ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される。したがって、本開示はまた、(i)本明細書に記載されるような化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び(ii)OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをカプセル化し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される。したがって、本開示はまた、(i)本明細書に記載されるような化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び(ii)OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをカプセル化し得る。
ナノ粒子組成物は通常、およそマイクロメートル以下のサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質小胞)、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、500nm以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、1つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された2つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、互いに機能化及び/または架橋され得る。脂質二重層は、1つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能なアミノ脂質、構造脂質、リン脂質、及びmRNAを含む。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能なアミノ脂質、PEG修飾脂質、ステロール及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約40~50%のイオン化可能なアミノ脂質、約5~15%の構造脂質、約30~45%のステロール、及び約1~5%のPEG修飾脂質のモル比を有する。
いくつかの実施形態では、LNPは、0.4未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、中性pHにおいて正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、50~150nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、80~100nmの平均直径を有する。
本明細書で一般的に定義されるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子を指す。脂質は天然に存在するか、または合成の場合がある。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及びポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、いくつかの脂質の両親媒性特性によって、水性媒体中でリポソーム、小胞、または膜が形成される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子(LNP)は、イオン化可能なアミノ脂質を含んでよい。本明細書で使用される場合、「イオン化可能なアミノ脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、1つ以上の荷電部分を含む脂質を指してよい。いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、正に荷電しているか、または負に荷電していてよい。イオン化可能なアミノ脂質は、正に荷電していてよく、その場合にそれは「カチオン性脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質分子は、アミン基を含んでよく、イオン化可能なアミノ脂質と称され得る。本明細書で使用される場合、「荷電部分」は、形式的な電子電荷、例えば、一価(+1、または-1)、二価(+2、または-2)、三価(+3、または-3)などを持つ化学部分である。荷電部分は、アニオン性(すなわち、負に荷電している)またはカチオン性(すなわち、正に荷電している)であってよい。正に荷電した部分の例としては、アミン基(例えば、第一級、第二級、及び/または第三級アミン)、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、ならびにイミジゾリウム(imidizolium)基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分はアミン基を含む。負に荷電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、サルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電部分の電荷は、いくつかの場合では、環境条件によって変動する場合があり、例えば、pHの変化によって、部分の電荷が変化する場合がある、及び/または部分が荷電するようになるか、もしくは非荷電になる場合がある。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択されてよい。
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分負電荷」または「部分正電荷」を指さないと理解されるべきである。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味が付与されている。「部分負電荷」は、電子密度が結合の1個の原子に引き寄せられ、原子上に部分負電荷が生じるように極性化される結合を官能基が含む場合をもたらし得る。当業者は一般に、そのように極性化され得る結合を認識することになる。
イオン化可能なアミノ脂質は、当該技術分野では「イオン化可能なカチオン性脂質」と称されることもある。一実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、リンカー構造を介して接続されている正荷電親水性頭部及び疎水性尾部を有してよい。
これらに加えて、イオン化可能なアミノ脂質はまた、環状アミン基を含む脂質であってよい。
一実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、国際公開第WO2013086354号及び同第WO2013116126号(その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるイオン化可能なアミノ脂質から選択されてよいが、これらに限定されない。
さらに別の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、米国特許第7,404,969号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)の式CLI-CLXXXXIIから選択されてよいが、これらに限定されない。
一実施形態では、脂質は、国際公開第WO2012170889号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されているものなどの切断可能な脂質であってよい。一実施形態では、脂質は、当該技術分野において既知の方法によって、及び/または国際公開第WO2013086354号(その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような方法によって合成されてよい。
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けられ得る。例えば、顕微鏡法(例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法)が、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べるために使用され得る。動的光散乱法または電位差測定法(例えば、電位差滴定法)が、ゼータ電位を測定するために使用され得る。動的光散乱法はまた、粒径を決定するためにも利用され得る。機器、例えば、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)などもまた、ナノ粒子組成物の複数の特性、例えば、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などを測定するためにも使用され得る。
ナノ粒子のサイズは、限定されないが、炎症などの生体反応に対抗するのに役立ち得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的作用を増加させ得る。
本明細書で使用される場合、ナノ粒子組成物との関連において「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約10~約100nm、例えば、限定されないが、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm、約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nm及び/または約90~約100nmなどの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化される。
一実施形態では、ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、100nm超、150nm超、200nm超、250nm超、300nm超、350nm超、400nm超、450nm超、500nm超、550nm超、600nm超、650nm超、700nm超、750nm超、800nm超、850nm超、900nm超、950nmまたは1000nm超の直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、1μm以下(例えば、1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、またはそれ未満)である。
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散指数は、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒度分布を示すために使用され得る。小さい(例えば、0.3未満の)多分散指数は一般に、狭い粒度分布を示す。ナノ粒子組成物は、約0~約0.25、例えば、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、または0.25などの多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物の多分散指数は、約0.10~約0.20であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すために使用され得る。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷について記載し得る。より高い荷電種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用をし得るため、正または負の比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物のゼータ電位は、約-10mV~約+20mV、約-10mV~約+15mV、約10mV~約+10mV、約-10mV~約+5mV、約-10mV~約0mV、約-10mV~約-5mV、約-5mV~約+20mV、約-5mV~約+15mV、約-5mV~約+10mV、約-5mV~約+5mV、約-5mV~約0mV、約0mV~約+20mV、約0mV~約+15mV、約0mV~約+10mV、約0mV~約+5mV、約+5mV~約+20mV、約+5mV~約+15mV、または約+5mV~約+10mVであり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約0mV~約100mV、約0mV~約90mV、約0mV~約80mV、約0mV~約70mV、約0mV~約60mV、約0mV~約50mV、約0mV~約40mV、約0mV~約30mV、約0mV~約20mV、約0mV~約10mV、約10mV~約100mV、約10mV~約90mV、約10mV~約80mV、約10mV~約70mV、約10mV~約60mV、約10mV~約50mV、約10mV~約40mV、約10mV~約30mV、約10mV~約20mV、約20mV~約100mV、約20mV~約90mV、約20mV~約80mV、約20mV~約70mV、約20mV~約60mV、約20mV~約50mV、約20mV~約40mV、約20mV~約30mV、約30mV~約100mV、約30mV~約90mV、約30mV~約80mV、約30mV~約70mV、約30mV~約60mV、約30mV~約50mV、約30mV~約40mV、約40mV~約100mV、約40mV~約90mV、約40mV~約80mV、約40mV~約70mV、約40mV~約60mV、及び約40mV~約50mVであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV~約50mV、約15mV~約45mV、約20mV~約40mV、及び約25mV~約35mVであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV、約20mV、約30mV、約40mV、約50mV、約60mV、約70mV、約80mV、約90mV、及び約100mVであり得る。
ポリヌクレオチドの「カプセル化効率」という用語は、提供された最初の量と比較した、調製後にナノ粒子組成物によってカプセル化されるか、または別の方法でそれと会合するポリヌクレオチドの量を記載する。本明細書で使用される場合、「カプセル化」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉込め、包囲、または内包を指し得る。
カプセル化効率は、望ましくは高い(例えば、100%に近い)。カプセル化効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を、ナノ粒子組成物を1つ以上の有機溶媒または界面活性剤で分解する前と後で比較することによって測定され得る。
蛍光が、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定するために使用され得る。本明細書に記載されるナノ粒子組成物の場合、ポリヌクレオチドのカプセル化効率は、少なくとも50%、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%であり得る。いくつかの実施形態では、カプセル化効率は、少なくとも80%であり得る。ある特定の実施形態では、カプセル化効率は、少なくとも90%であり得る。
本明細書に開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、ポリヌクレオチドの特性に加えて、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び/または用途、あるいはナノ粒子組成物の他の特性などに依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物中で有用なmRNAの量は、mRNAのサイズ(長さ、または分子量として表される)、配列、及び他の特性に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量も、変動し得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物及びポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考慮によって最適化され得る。ポリヌクレオチドとしてmRNAを含む組成物については、N:P比が有用な測定基準として機能し得る。
ナノ粒子組成物のN:P比は発現及び忍容性の両方を制御するため、N:P比が低く発現が強いナノ粒子組成物が望ましい。N:P比は、ナノ粒子組成物中の脂質対RNAの比によって変動する。
一般に、N:P比は低い方が好ましい。1つ以上のRNA、脂質、及びそれらの量は、約2:1~約30:1、例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1、または30:1などのN:P比を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、N:P比は、約2:1~約8:1であり得る。他の実施形態では、N:P比は、約5:1~約8:1である。ある特定の実施形態では、N:P比は、5:1~6:1である。特定の一態様では、N:P比は、約5.67:1である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドのカプセル化を含む脂質ナノ粒子の作製方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示される医薬組成物のいずれかを使用し、当該技術分野において既知の脂質ナノ粒子の作製方法に従って脂質ナノ粒子を作製することを含む。例えば、Wang et al.(2015)“Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles”Adv.Drug Deliv.Rev.87:68-80、Silva et al.(2015)“Delivery Systems for Biopharmaceuticals.Part I:Nanoparticles and Microparticles”Curr.Pharm.Technol.16:940-954、Naseri et al.(2015)“Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers:Structure,Preparation and Application”Adv.Pharm.Bull.5:305-13、Silva et al.(2015)“Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals”Curr.Pharm.Biotechnol.16:291-302、及び当該文献で引用された参考文献を参照のこと。
21.他の送達剤
a.リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させ得る、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させ得るため、ポリヌクレオチドによるタンパク質産生の有効性を改善するために使用され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるためにも使用され得る。
a.リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させ得る、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させ得るため、ポリヌクレオチドによるタンパク質産生の有効性を改善するために使用され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるためにも使用され得る。
リポソームは、主に脂質二重層で構成され得、医薬製剤の投与を目的とした送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多層小胞(MLV)は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性区画で区切られた一連の同心二重層を含有し得る。小型単層小胞(SUV)は、直径50nmよりも小さい場合があり得、大型単層小胞(LUV)は、直径50~500nmであり得る。リポソームの設計は、不健康な組織に対するリポソームの結合を改善するために、または限定されないが、エンドサイトーシスなどの事象を活性化するためにオプソニンまたはリガンドを含み得るが、これらに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いpH値または高いpH値を含有し得る。
リポソームの形成は、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用及び/または送達中に含まれる任意の追加プロセス、目的の用途に最適な小胞サイズ、多分散性及び有効期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間再現性及びスケールアップ生産などに依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国公開第US20130177638号、同第US20130177637号、同第US20130177636号、同第US20130177635号、同第US20130177634号、同第US20130177633号、同第US20130183375号、同第US20130183373号、及び同第US20130183372号に記載される方法、装置及びデバイスによって調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、リポソームによってカプセル化され得る、及び/またはそれは、例えば、国際公開第WO2012031046号、同第WO2012031043号、同第WO2012030901号、同第WO2012006378号、及び同第WO2013086526号、ならびに米国公開第US20130189351号、同第US20130195969号及び同第US20130202684号に記載されるようなリポソームによって、その後にカプセル化され得る水性コア内に含有され得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、カチオン性水中油型エマルジョンに製剤化され得、エマルジョン粒子は、油コア及び分子をエマルジョン粒子に固定するポリヌクレオチドと相互作用し得るカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、内部で親水性相が分散している連続した疎水性相を含む油中水型エマルジョンに製剤化され得る。例示的なエマルジョンは、国際公開第WO2012006380号及び同第WO201087791号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載される方法によって作製され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、脂質-ポリカチオン複合体に製剤化され得る。脂質-ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第US20120178702号に記載されるような方法によって達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチド、あるいはポリペプチド、例えば、限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び/またはポリアルギニンならびに国際公開第WO2012013326号または米国公開第US20130142818号に記載されるカチオン性ペプチドなどが挙げられ得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第WO2013123523号、同第WO2012170930号、同第WO2011127255号及び同第WO2008103276号、ならびに米国公開第US20130171646号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるものなどの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化され得る。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的には1つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質はイオン化可能なアミノ脂質であり、当該技術分野において「イオン化可能なカチオン性脂質」と称されることもある。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、及び粒子凝集を減少できる分子、例えば、PEGまたはPEG修飾脂質を含む他の成分をさらに含む。
例示的なイオン化可能なアミノ脂質としては、本明細書に開示される任意の化合物II、VI、A、及びB、DLin-MC3-DMA(MC3)、DLin-DMA、DLenDMA、DLin-D-DMA、DLin-K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-KC3-DMA、DLin-KC4-DMA、DLin-C2K-DMA、DLin-MP-DMA、DODMA、98N12-5、C12-200、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLinDAP、DLinAP、DLin-EG-DMA、DLin-2-DMAP、KL10、KL22、KL25、オクチル-CLinDMA、オクチル-CLinDMA(2R)、オクチル-CLinDMA(2S)、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なイオン化可能なアミノ脂質としては、(13Z,16Z)-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン(L608)、(20Z,23Z)-N,N-ジメチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン、(17Z,20Z)-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-9-アミン、(16Z,19Z)-N5N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-8-アミン、(13Z,16Z)-N,N-ジメチルドコサ-13,16-ジエン-5-アミン、(12Z,15Z)-N,N-ジメチルヘンイコサ-12,15-ジエン-4-アミン、(14Z,17Z)-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-6-アミン、(15Z,18Z)-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-7-アミン、(18Z,21Z)-N,N-ジメチルへプタコサ-18,21-ジエン-10-アミン、(15Z,18Z)-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-5-アミン、(14Z,17Z)-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-4-アミン、(19Z,22Z)-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-9-アミン、(18Z,21Z)-N,N-ジメチルへプタコサ-18,21-ジエン-8-アミン、(17Z,20Z)-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-7-アミン、(16Z,19Z)-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-6-アミン、(22Z,25Z)-N,N-ジメチルヘントリアコンタ-22,25-ジエン-10-アミン、(21Z,24Z)-N,N-ジメチルトリアコンタ-21,24-ジエン-9-アミン、(18Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-18-エン-10-アミン、(17Z)-N,N-ジメチルヘキサコサ-17-エン-9-アミン、(19Z,22Z)-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-7-アミン、N,N-ジメチルへプタコサン-10-アミン、(20Z,23Z)-N-エチル-N-メチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン、1-[(11Z,14Z)-1-ノニルイコサ-11,14-ジエン-1-イル]ピロリジン、(20Z)-N,N-ジメチルヘプタコス-20-エン-10-アミン、(15Z)-N,N-ジメチルエプタコス-15-エン-10-アミン、(14Z)-N,N-ジメチルノナコス-14-エン-10-アミン、(17Z)-N,N-ジメチルノナコス-17-エン-10-アミン、(24Z)-N,N-ジメチルトリトリアコント-24-エン-10-アミン、(20Z)-N,N-ジメチルノナコス-20-エン-10-アミン、(22Z)-N,N-ジメチルヘントリアコント-22-エン-10-アミン、(16Z)-N,N-ジメチルペンタコス-16-エン-8-アミン、(12Z,15Z)-N,N-ジメチル-2-ノニルヘンイコサ-12,15-ジエン-1-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]エプタデカン-8-アミン、1-[(1S,2R)-2-ヘキシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-21-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘンイコサン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン-8-アミン、N,N-ジメチル-[(1R,2S)-2-ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン-5-アミン、N,N-ジメチル-3-{7-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]へプチル}ドデカン-1-アミン、1-[(1R,2S)-2-へプチルシクロプロピル]-N,N-ジメチルオクタデカン-9-アミン、1-[(1S,2R)-2-デシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルペンタデカン-6-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ペンタデカン-8-アミン、R-N,N-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、S-N,N-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-{2-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-1-[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)-N,N-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-[(5Z)-オクト-5-エン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、1-{2-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-1-[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)-1-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、(2S)-1-(へプチルオキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、N,N-ジメチル-1-(ノニルオキシ)-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、N,N-ジメチル-1-[(9Z)-オクタデク-9-エン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-N,N-ジメチル-1-[(6Z,9Z,12Z)-オクタデカ-6,9,12-トリエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(ペンチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-(ヘキシルオキシ)-3-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、1-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-[(13Z,16Z)-ドコサ-13,16-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-[(13Z,16Z)-ドコサ-13,16-ジエン-1-イルオキシ]-3-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、(2S)-1-[(13Z)-ドコス-13-エン-1-イルオキシ]-3-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、1-[(13Z)-ドコス-13-エン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-[(9Z)-ヘキサデク-9-エン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2R)-N,N-ジメチル-H(1-メトイルオクチル(metoyloctyl))オキシ]-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、(2R)-1-[(3,7-ジメチルオクチル)オキシ]-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、N,N-ジメチル-1-(オクチルオキシ)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン-2-アミン、N,N-ジメチル-1-{[8-(2-オクリルシクロプロピル(oclylcyclopropyl))オクチル]オキシ}-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、及び(11E,20Z,23Z)-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,2-トリエン-10-アミン、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール(phosphatidy glycerol)、及びホスファチジン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0ジエーテルPC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME16:0PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG、及びそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、MPPC、MSPC、PMPC、PSPC、SMPC、SPPC、DHAPE、DOPG、及びそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のリン脂質(例えば、DSPC)の量は、約1mol%~約20mol%の範囲である。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のリン脂質(例えば、DSPC)の量は、約5~15mol%、任意に10~12mol%、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%の範囲である。
構造脂質は、ステロール及びステロール部分を含有する脂質を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ-トコフェロール、及びそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロール)の量は、約20mol%~約60mol%の範囲である。いくつかの実施形態では、脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロール)の量は、約30~45mol%、任意に35~40mol%、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、38~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%の範囲である。
PEG修飾脂質としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、PEGセラミド複合体(例えば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミンならびにPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが挙げられる。そのような脂質はPEG化脂質とも称される。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であり得る。いくつかの実施形態では、PEG脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロールメトキシポリエチレングリコール(PEG-DMG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)](PEG-DSPE)、PEG-ジステリルグリセロール(PEG-DSG)、PEG-ジパルメトレイル(dipalmetoleyl)、PEG-ジオレイル、PEG-ジステアリル、PEG-ジアシルグリカミド(diacylglycamide)(PEG-DAG)、PEG-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DPPE)、またはPEG-l,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-アミン(PEG-c-DMA)である。いくつかの実施形態では、PEG部分は、約1000、2000、5000、10,000、15,000または20,000ダルトンのサイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のPEG脂質の量は、約0mol%~約5mol%の範囲である。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のPEG脂質の量は、約1~5%、任意に1~3mol%、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%の範囲である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるLNP製剤は、透過性増強剤分子をさらに含み得る。非限定的な透過性増強剤分子は、米国公開第US20050222064号に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
LNP製剤は、リン酸複合体をさらに含有し得る。リン酸複合体は、インビボ循環時間を増加させ得る、及び/またはナノ粒子の標的送達を増加させ得る。リン酸複合体は、例えば、国際公開第WO2013033438号または米国公開第US20130196948号に記載される方法によって作製され得る。LNP製剤はまた、例えば、米国公開第US20130059360号、同第US20130196948号、及び同第US20130072709号に記載されているようなポリマー複合体(例えば、水溶性複合体)も含有し得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
LNP製剤は、対象において本発明のナノ粒子の送達を増強するための複合体を含み得る。さらに、複合体は、対象におけるナノ粒子の貪食クリアランスを阻害し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、ヒト膜タンパク質CD47から設計された「自己」ペプチド(例えば、Rodriguez et al,Science 2013 339,971-975(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)によって記載される「自己」粒子)であり得る。Rodriguez et al.によって示される通り、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介クリアランスを遅延させてナノ粒子の送達を増強した。
LNP製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体としては、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸塩、フィトグリコーゲンベータ-デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ-デキストリン(例えば、国際公開第WO2012109121号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる))が挙げられ得るが、これらに限定されない。
LNP製剤は、粒子の送達を改善するために界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。いくつかの実施形態では、LNPは、親水性コーティング、例えば、限定されないが、PEGコーティング及び/または米国公開第US20130183244号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような中性表面電荷を有するコーティングなどでコーティングされ得る。
LNP製剤は、米国特許第8,241,670号または国際公開第WO2013110028号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるように、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを貫通し得るように、粒子の表面特性を変化させるために設計され得る。
粘液に浸透するように設計されたLNPは、ポリマー材料(すなわち、ポリマーコア)及び/またはポリマー-ビタミン複合体及び/またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ(スチレン)、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチエンイミン(polyethyeneimine)、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが挙げられ得るが、これらに限定されない。
粘液に浸透するように設計されたLNPとしては、表面変化剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)、界面活性剤(例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなど)、糖または糖誘導体(例えば、シクロデキストリン)、核酸、ポリマー(例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー)、粘液溶解剤(例えば、N-アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、clerodendrum、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ4ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン)ならびにrhDNaseを含む様々なDNaseなども挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、粘液浸透性LNPは、粘膜浸透促進コーティングを含む低張製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して低張であり得る。低張製剤の非限定的な例は、例えば、国際公開第WO2013110028号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に見られ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、リポプレックス、例えば、限定されないが、Silence Therapeutics(London,United Kingdom)のATUPLEX(商標)システム、DACCシステム、DBTCシステム及び他のsiRNA-リポプレックス技術、STEMGENT(登録商標)(Cambridge,MA)のSTEMFECT(商標)、ならびに核酸のポリエチレンイミン(PEI)またはプロタミンベースの標的及び非標的送達などとして製剤化される(Aleku et al.Cancer Res.2008 68:9788-9798、Strumberg et al.Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222-1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360-1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334-344、Kaufmann et al.Microvasc Res 2010 80:286-293、Weide et al.J Immunother.2009 32:498-507、Weide et al.J Immunother.2008 31:180-188、Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294、Fotin-Mleczek et al.,2011 J.Immunother.34:1-15、Song et al.,Nature Biotechnol.2005,23:709-717、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 6;104:4095-4100、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる))。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、平均直径が10~1000nmの球状であり得る固体脂質ナノ粒子(SLN)として製剤化される。SLNは、親油性分子を可溶化し得る固体脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤及び/または乳化剤で安定化され得る。例示的なSLNは、国際公開第WO2013105101号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるようなものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、制御放出及び/または標的送達のために製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「制御放出」は、治療結果をもたらすために特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、制御放出及び/または標的送達のために、本明細書に記載される、及び/または当該技術分野において既知の送達剤にカプセル化され得る。本明細書で使用される場合、「カプセル化する」という用語は、封入する、包囲する、または内包することを意味する。本発明の化合物の製剤化に関連する場合、カプセル化は、実質的、完全または部分的であり得る。「実質的にカプセル化される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99%超、または99%超が、送達剤内に封入、包囲または内包され得ることを意味する。「部分的にカプセル化される」は、本発明の医薬組成物または化合物の10未満、10、20、30、40、50またはそれ未満が、送達剤内に封入、包囲または内包され得ることを意味する。
有利には、カプセル化は、蛍光及び/または電子顕微鏡写真を使用して本発明の医薬組成物または化合物のエスケープまたは活性を測定することによって決定され得る。例えば、少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9%、または99%超の本発明の医薬組成物または化合物が、送達剤中にカプセル化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子中にカプセル化され得、これは本明細書では「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称される。治療用ナノ粒子は、例えば、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、同第WO2010005721号、同第WO2010005723号、及び同第WO2012054923号、ならびに米国公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、同第US20100068285号、同第US20110274759号、同第US20100068286号、同第US20120288541号、同第US20120140790号、同第US20130123351号及び同第US20130230567号、ならびに米国特許第8,206,747号、同第8,293,276号、同第8,318,208号及び同第8,318,211号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載される方法によって製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出のために製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。期間は、数時間、数日、数週間、数か月及び数年を含み得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際 公開第WO2010075072号ならびに米国公開第US20100216804号、同第US20110217377号、同第US20120201859号及び同第US20130150295号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に開示されるように製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、標的特異的であるように製剤化され得、例えば、国際公開第WO2008121949号、同第WO2010005726号、同第WO2010005725号、同第WO2011084521号及び同第WO2011084518号、ならびに米国公開第US20100069426号、同第US20120004293号及び同第US20100104655号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるものなどである。
LNPは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して調製され得る。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、Microinnova(Allerheiligen bei Wildon,Austria)によって製造されているものを含むが、これらに限定されないスリットインターデジタルマイクロミキサー及び/またはスタガードヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)が挙げられ得るが、これらに限定されない(Zhigaltsevet al.,“Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing,”Langmuir 28:3633-40(2012)、Belliveau et al.,“Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA,”Molecular Therapy-Nucleic Acids.1:e37(2012)、Chen et al.,“Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic Formulation,”J.Am.Chem.Soc.134(16):6948-51(2012)(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。例示的なマイクロミキサーとしては、Slit Interdigital Microstructured Mixer(SIMM-V2)またはStandard Slit Interdigital Micro Mixer(SSIMM)またはCaterpillar(CPMM)またはInstitut fur Mikrotechnik Mainz GmbH(Mainz Germany)のImpinging-jet(IJMM)を含む。いくつかの実施形態では、SHMを使用するLNPの作製方法は、少なくとも2つの投入流を混合することをさらに含み、混合は、微細構造が誘導するカオス的移流(MICA)によって生じる。本方法によれば、流体流は、ヘリンボーンパターン中に存在するチャネルを介して流れ、これによって回転流が生じ、流体を互いの周りに巻き付ける。本方法はまた、流体混合用の表面を含み得、表面は流体循環中にその向きを変える。SHMを使用するLNPの生成方法は、米国公開第US20040262223号及び同第US20120276209号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に開示されるものを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して脂質ナノ粒子に製剤化され得る(Whitesides,George M.,“The Origins and the Future of Microfluidics,”Nature 442:368-373(2006)、及びAbraham et al.,“Chaotic Mixer for Microchannels,”Science 295:647-651(2002)(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロミキサーチップ、例えば、限定されないが、Harvard Apparatus(Holliston,MA)またはDolomite Microfluidics(Royston,UK)のものなどを使用して脂質ナノ粒子に製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構で2つ以上の流体流を迅速に混合するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、約1nm~約100nm、例えば、限定されないが、約1nm~約20nm、約1nm~約30nm、約1nm~約40nm、約1nm~約50nm、約1nm~約60nm、約1nm~約70nm、約1nm~約80nm、約1nm~約90nm、約5nm~約100nm、約5nm~約10nm、約5nm~約20nm、約5nm~約30nm、約5nm~約40nm、約5nm~約50nm、約5nm~約60nm、約5nm~約70nm、約5nm~約80nm、約5nm~約90nm、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm、約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nm及び/または約90~約100nmなどの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、100nm超、150nm超、200nm超、250nm超、300nm超、350nm超、400nm超、450nm超、500nm超、550nm超、600nm超、650nm超、700nm超、750nm超、800nm超、850nm超、900nm超、950nm超または1000nm超の直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さいLNPを使用して送達され得る。そのような粒子は、0.1μm未満~最大100nm、例えば、限定されないが、0.1μm未満、1.0μm未満、5μm未満、10μm未満、15um未満、20um未満、25um未満、30um未満、35um未満、40um未満、50um未満、55um未満、60um未満、65um未満、70um未満、75um未満、80um未満、85um未満、90um未満、95um未満、100um未満、125um未満、150um未満、175um未満、200um未満、225um未満、250um未満、275um未満、300um未満、325um未満、350um未満、375um未満、400um未満、425um未満、450um未満、475um未満、500um未満、525um未満、550um未満、575um未満、600um未満、625um未満、650um未満、675um未満、700um未満、725um未満、750um未満、775um未満、800um未満、825um未満、850um未満、875um未満、900um未満、925um未満、950um未満、または975um未満などの直径を含み得る。
本明細書に記載されるナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び/または免疫応答を調節するように幾何学的に操作され得る。幾何学的に操作された粒子は、標的送達、例えば、限定されないが、肺送達などを目的として本明細書に記載されるポリヌクレオチドを組み込むために、多様な形状、サイズ及び/または表面電荷を有し得る(例えば、国際公開第WO2013082111号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。幾何学的に操作された粒子の他の物理的特徴としては、細胞及び組織との相互作用を変化させ得る開窓、角度のついたアーム、非対称性及び表面粗さ、電荷が挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子は、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子、例えば、限定されないが、米国公開第US20130172406号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるものなどである。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得、これは2つ以上のポリマー、例えば、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート(polypropylfumerate)、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはそれらの組合せなどを含み得る。
b.リピドイド
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、リピドイドを用いて製剤化され得る。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子が調製され得、したがって、局所的及び/または全身的な投与経路を介したリピドイド製剤の注射後、コードされたタンパク質の産生によって判断されるように、ポリヌクレオチドの効果的な送達を達成する。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない様々な手段によって投与され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、リピドイドを用いて製剤化され得る。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子が調製され得、したがって、局所的及び/または全身的な投与経路を介したリピドイド製剤の注射後、コードされたタンパク質の産生によって判断されるように、ポリヌクレオチドの効果的な送達を達成する。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない様々な手段によって投与され得る。
リピドイドの合成は、文献に記載されている(Mahon et al.,Bioconjug.Chem.2010 21:1448-1454、Schroeder et al.,J Intern Med.2010 267:9-21、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561-569、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864-1869、Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:12996-3001(その全て全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
ペンタ[3-(1-ラウリルアミノプロピオニル)]-トリエチレンテトラミン塩酸塩(TETA-5LAP、98N12-5としても知られ、Murugaiah et al.,Analytical Biochemistry,401:61(2010)を参照のこと)、C12-200(誘導体及びバリアントを含む)、ならびにMD1を含むが、これらに限定されない異なるリピドイドを用いた製剤が、インビボ活性について試験され得る。リピドイド「98N12-5」は、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872-879によって開示されている。リピドイド「C12-200」は、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864-1869及びLiu and Huang,Molecular Therapy.2010 669-670によって開示されている。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドに製剤化され得る。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第8,450,298号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載される方法によって調製され得る。
リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、3つもしくは4つまたはそれを超えるいずれかの成分を含む粒子を含み得る。リピドイド及びリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第WO2015051214号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
c.ヒアルロニダーゼ
いくつかの実施形態では、注射(例えば、筋肉内または皮下注射)のための本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を下げることによって、組織透過性を増加させる(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427-440)。あるいは、ヒアルロニダーゼは、筋肉内、または皮下に投与されるポリヌクレオチドに曝露される細胞数を増加させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、注射(例えば、筋肉内または皮下注射)のための本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を下げることによって、組織透過性を増加させる(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427-440)。あるいは、ヒアルロニダーゼは、筋肉内、または皮下に投与されるポリヌクレオチドに曝露される細胞数を増加させるために使用され得る。
d.ナノ粒子模倣物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ナノ粒子模倣物内にカプセル化される、及び/またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生物または粒子、例えば、限定されないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン及び細胞などを模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン(viron)粒子内にカプセル化され得る(例えば、国際公開第WO2012006376号ならびに米国公開第US20130171241号及び同第US20130195968号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ナノ粒子模倣物内にカプセル化される、及び/またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生物または粒子、例えば、限定されないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン及び細胞などを模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン(viron)粒子内にカプセル化され得る(例えば、国際公開第WO2012006376号ならびに米国公開第US20130171241号及び同第US20130195968号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
e.自己組織化ナノ粒子、または自己組織化高分子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を、送達のために自己組織化ナノ粒子、または両親媒性高分子(AM)内に含む。AMは、ポリ(エチレングリコール)に共有結合したアルキル化糖骨格を有する生体適合性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中では、AMは自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載されていて、AM及びAMの形成方法は、米国公開第US20130217753号に記載されている(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を、送達のために自己組織化ナノ粒子、または両親媒性高分子(AM)内に含む。AMは、ポリ(エチレングリコール)に共有結合したアルキル化糖骨格を有する生体適合性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中では、AMは自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載されていて、AM及びAMの形成方法は、米国公開第US20130217753号に記載されている(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
f.カチオン及びアニオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びそれらの組合せなどを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第6,265,389号及び同第6,555,525号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるようなポリマー及び金属カチオンと複合化したポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオン性ナノ粒子内、またはカチオン性ナノ粒子を含む1つ以上のデポー剤内のポリヌクレオチドの送達は、長時間作用性デポー剤として作用し、及び/またはヌクレアーゼによる分解速度を減少させることによってポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びそれらの組合せなどを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第6,265,389号及び同第6,555,525号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるようなポリマー及び金属カチオンと複合化したポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオン性ナノ粒子内、またはカチオン性ナノ粒子を含む1つ以上のデポー剤内のポリヌクレオチドの送達は、長時間作用性デポー剤として作用し、及び/またはヌクレアーゼによる分解速度を減少させることによってポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善し得る。
g.アミノ酸脂質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と製剤化された本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び1つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の作製方法の非限定的な例は、米国特許第8,501,824号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドと結合し、それを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第7,098,032号、同第6,897,196号、同第6,426,086号、同第7,138,382号、同第5,563,250号、及び同第5,505,931号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような酸不安定性リンカーによって提供され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と製剤化された本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び1つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の作製方法の非限定的な例は、米国特許第8,501,824号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドと結合し、それを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第7,098,032号、同第6,897,196号、同第6,426,086号、同第7,138,382号、同第5,563,250号、及び同第5,505,931号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような酸不安定性リンカーによって提供され得る。
h.高分子電解質間複合体
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を高分子電解質間複合体内に含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが1つ以上のアニオン性分子と複合化される場合に形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間複合体ならびに高分子電解質間複合体の作製方法の非限定的な例は、米国特許第8,524,368号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を高分子電解質間複合体内に含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが1つ以上のアニオン性分子と複合化される場合に形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間複合体ならびに高分子電解質間複合体の作製方法の非限定的な例は、米国特許第8,524,368号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
i.結晶性ポリマー系
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を結晶性ポリマー系内に含む。結晶性ポリマー系は、結晶部分及び/または結晶部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第8,524,259号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を結晶性ポリマー系内に含む。結晶性ポリマー系は、結晶部分及び/または結晶部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第8,524,259号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
j.ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコアシェル型ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)ならびに天然及び/または合成ポリマーを含む。ポリマーとしては、ポリエテン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l-リジン)(PLL)、PLLにグラフト化したPEG、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分岐ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、マルチブロックコポリマー、ポリ[α-(4-アミノブチル)-L-グリコール酸)(PAGA)、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)ならびに天然及び/または合成ポリマーを含む。ポリマーとしては、ポリエテン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l-リジン)(PLL)、PLLにグラフト化したPEG、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分岐ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、マルチブロックコポリマー、ポリ[α-(4-アミノブチル)-L-グリコール酸)(PAGA)、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なポリマーとしては、MIRUS(登録商標)Bio(Madison,WI)及びRoche Madison(Madison,WI)のDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,CA)製剤、限定されないが、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PHASERX(登録商標)、Seattle,WA)などのPHASERX(商標)ポリマー製剤、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego,CA)のVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)のシクロデキストリン、デンドリマー及びポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)ポリマーが挙げられる。RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)及びPHASERX(登録商標)(Seattle,WA)などのpH応答性コブロックポリマー。
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの(例えば、筋肉内または皮下注射後の)持続放出または遅延放出を可能にする。ポリヌクレオチドの放出プロファイルを変化させると、例えば、コードされたタンパク質の翻訳が長期間にわたって行われ得る。ポリマー製剤はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるためにも使用され得る。持続放出製剤としては、PLGAミクロスフェア、エチレンビニルアセテート(EVAc)、ポロキサマー、GELSITE(登録商標)(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、HYLENEX(登録商標)(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、フィブリノゲンポリマーなどの外科用シーラント(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、TISSELL(登録商標)(Baxter International,Inc.Deerfield,IL)、PEGベースのシーラント、及びCOSEAL(登録商標)(Baxter International,Inc.Deerfield,IL)が挙げられ得るが、これらに限定されない。
非限定的な例として、修飾mRNAは、PLGAミクロスフェアを調節可能な放出速度(例えば、数日間及び数週間)で調製し、カプセル化プロセス中に修飾mRNAの完全性を維持しながら、PLGAミクロスフェア内に修飾mRNAをカプセル化することによってPLGAミクロスフェアに製剤化され得る。EVAcは、前臨床持続放出インプラント用途に広く使用されている非生分解性生体適合性ポリマーである(例えば、徐放性製品のOcusert(緑内障用ピロカルピン経眼挿入物)またはprogestasert(持続放出プロゲステロン子宮内避妊器具)、経皮送達系のTestoderm、Duragesic及びセレギリン、カテーテル)。ポロキサマーF-407NFは、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンの親水性非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーであり、5℃未満の温度では低粘度を有し、15℃超の温度では固体ゲルを形成する。
非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国特許第6,177,274号に記載されるように、PLLでグラフト化したPEGのポリマー化合物と共に製剤化され得る。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ブロックコポリマー、例えば、PLGA-PEGブロックコポリマー(例えば、米国公開第US20120004293号ならびに米国特許第8,236,330号及び同第8,246,968号を参照のこと)、またはPLGA-PEG-PLGAブロックコポリマー(例えば、米国特許第6,004,573号を参照のこと)などと共に製剤化され得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、少なくとも1つのアミン含有ポリマー、例えば、限定されないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、ポリ(アミン-co-エステル)またはそれらの組合せなどと共に製剤化され得る。例示的なポリアミンポリマー及び送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第8,460,696号、同第8,236,280号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第6,696,038号、同第6,517,869号、同第6,267,987号、同第6,217,912号、同第6,652,886号、同第8,057,821号、及び同第8,444,992号、米国公開第US20030073619号、同第US20040142474号、同第US20100004315号、同第US2012009145号及び同第US20130195920号、ならびに国際公開第WO2006063249号及び同第WO2013086322号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、線状生分解性コポリマー、PAGA、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーまたはそれらの組合せに製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第US20130184453号に記載されるような少なくとも1つのシクロデキストリンポリマーに、またはそれと共に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第WO2013106072号、同第WO2013106073号及び同第WO2013106086号に記載されるような少なくとも1つの架橋カチオン結合ポリマーに、またはそれと共に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第US20130231287号に記載されるような少なくともPEG化されているアルブミンポリマーに、またはそれと共に製剤化され得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、及び/または他の生分解性剤、例えば、限定されないが、リン酸カルシウムなどの組合せを使用してナノ粒子として製剤化され得る。成分は、送達を目的としたナノ粒子の微調整を可能にするために、コアシェル型、ハイブリッド、及び/または交互積層構造で組み合わされ得る(Wang et al.,Nat Mater.2006 5:791-796、Fuller et al.,Biomaterials.2008 29:1526-1532、DeKoker et al.,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748-761、Endres et al.,Biomaterials.2011 32:7721-7731、Su et al.,Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774-87(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる))。非限定的な例として、ナノ粒子は、複数のポリマー、例えば、限定されないが、親水性-疎水性ポリマー(例えば、PEG-PLGA)、疎水性ポリマー(例えば、PEG)及び/または親水性ポリマー(国際公開第WO20120225129号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる))などを含み得る。
コアシェル型ナノ粒子の使用は、さらにカチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するハイスループットアプローチにも焦点を当てている(Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:12996-13001(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる))。ポリマーナノ粒子の複合体化、送達、及び内在化は、ナノ粒子のコア及びシェル成分の両方における化学組成を変化させることによって正確に制御され得る。例えば、コアシェル型ナノ粒子は、ナノ粒子にコレステロールを共有結合させた後、マウス肝細胞にsiRNAを効率的に送達し得る。
いくつかの実施形態では、中間のPLGA層及びPEGを含有する外側の中性脂質層を含む中空の脂質コアが、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドの送達に使用され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコア及びコア中のポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、当該技術分野において既知であるポリマーのいずれかであり得る。ポリマーシェルは、コア中のポリヌクレオチドを保護するために使用され得る。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドと共に使用するためのコアシェル型ナノ粒子は、米国特許第8,313,777号または国際公開第WO2013124867号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
k.ペプチド及びタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含み、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させるために、及び/またはポリヌクレオチドの生体内分布を変化させるために(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることによって)、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるために(例えば、国際公開第WO2012110636号及び同第WO2013123298号)ペプチド及び/またはタンパク質と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、米国公開第US20130129726号、同第US20130137644号及び同第US20130164219号に記載されているものであり得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含み、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させるために、及び/またはポリヌクレオチドの生体内分布を変化させるために(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることによって)、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるために(例えば、国際公開第WO2012110636号及び同第WO2013123298号)ペプチド及び/またはタンパク質と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、米国公開第US20130129726号、同第US20130137644号及び同第US20130164219号に記載されているものであり得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
l.複合体
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または複合体として融合タンパク質(例えば、標的化基及び治療用タンパク質もしくはペプチドを有する)を共に産生する2つのコード領域を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。複合体は、ナノ粒子を組織もしくは生物のニューロンに選択的に誘導するか、または血液脳関門の通過を助けるペプチドであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または複合体として融合タンパク質(例えば、標的化基及び治療用タンパク質もしくはペプチドを有する)を共に産生する2つのコード領域を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。複合体は、ナノ粒子を組織もしくは生物のニューロンに選択的に誘導するか、または血液脳関門の通過を助けるペプチドであり得る。
複合体としては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、もしくはグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸)、または脂質などが挙げられる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)などであり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリ(L-ラクチド-co-グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸)、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、複合体は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの担体として機能し得る。複合体は、カチオン性ポリマー、例えば、限定されないが、ポリ(エチレングリコール)でグラフト化され得るポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンなどを含み得る。例示的な複合体及びそれらの調製物は、米国特許第6,586,524号及び米国公開第US20130211249号(その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
複合体はまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣物またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、内皮細胞もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基としては、ホルモン及びホルモン受容体も挙げられ得る。それらとしては、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価マンノース、多価フルコース(frucose)、またはアプタマーなども挙げられ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはp38MAPキナーゼの活性化因子である。
標的化基は、特異的受容体を標的とすることができる任意のリガンドであり得る。例としては、葉酸、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース-6P、アパタマー(apatamer)、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDL、及びHDLリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標的化基はアプタマーである。アプタマーは未修飾であり得るか、または本明細書に開示される修飾の任意の組合せを有し得る。非限定的な例として、標的化基は、例えば、米国公開第US2013021661012号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるような、血液中枢神経系関門を通過する標的送達のためのグルタチオン受容体(GR)結合複合体であり得る。
いくつかの実施形態では、複合体は、相乗的な生体分子-ポリマー複合体であり得、これは、より高い治療有効性を提供するための長時間作用性連続放出システムを含む。相乗的な生体分子-ポリマー複合体は、米国公開第US20130195799号に記載されているものであり得る。いくつかの実施形態では、複合体は、国際特許公開第WO2012040524号に記載されるようなアプタマー複合体であり得る。いくつかの実施形態では、複合体は、米国特許第8,507,653号に記載されるようなアミン含有ポリマー複合体であり得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(登録商標)(PHASERX(登録商標),Inc.Seattle,WA)に複合化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合され、これはシグナル配列または標的化配列も含み得る。複合体は、安定性の増加、及び/または細胞トランスフェクションの増加、及び/または生体内分布の変化(例えば、特定の組織もしくは細胞型に標的化される)を有するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、送達を増強するために薬剤に複合化され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、国際公開第WO2011062965号に記載されるような、モノマーまたはポリマー、例えば、標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーなどであり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第6,835.393号及び同第7,374,778号に記載されるようなポリヌクレオチドに共有結合した輸送剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、米国特許第7,737,108号及び同第8,003,129号に記載されるものなどの膜バリア輸送増強剤であり得る。参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
22.使用方法
上に記載されるポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、OTC関連疾患、障害または状態を治療及び/または予防するための調製、製造及び治療的使用に使用される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、OTCDを治療及び/または予防するために使用される。
上に記載されるポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、OTC関連疾患、障害または状態を治療及び/または予防するための調製、製造及び治療的使用に使用される。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、OTCDを治療及び/または予防するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、それを必要とする対象、例えば、高アンモニア血症を有する対象のアンモニアレベルを減少させる方法に使用される。例えば、本開示の一態様は、対象におけるOTCDの徴候及び症状を軽減する方法を提供し、OTCをコードするポリヌクレオチド(例えば、OTCポリペプチドをコードするmRNA)を含む組成物または製剤をその対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、OTCDのバイオマーカー、例えば、アンモニア、オロチン酸、及び/またはそれらの任意の組合せのレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後、短時間以内(例えば、約6時間以内、約8時間以内、約12時間以内、約16時間以内、約20時間以内、または約24時間以内)に、OTCDの1つ以上のバイオマーカー、例えば、アンモニア、及び/またはオロチン酸のレベル減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、ヒト対象の体重を増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後、短時間以内(例えば、約12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、5日、7日、14日、24日、48日、または60日以内)に体重の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、ヒト対象の体重を維持する。
補充療法は、OTCDの潜在的な治療法である。したがって、本開示のある特定の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、mRNAは、OTCDに対する遺伝子補充療法での使用に適したOTCポリペプチドをコードする1つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、OTCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAを対象に提供することによって、対象におけるOTCもしくはOTC活性の欠如、またはOTC活性の低下もしくは異常を治療する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列最適化されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OTCポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、ORF)を含み、核酸は、例えば、そのG/C、ウリジン、またはチミジン含有量を改変することによって配列最適化される、及び/またはポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miRNA-142と結合するmiRNA結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを含む組成物もしくは製剤、医薬組成物または製剤の対象への投与は、組成物または製剤の投与前に観察されるレベルよりも、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%低いレベルまで細胞内のアンモニアの低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、対象の細胞においてOTCの発現をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤を投与すると、対象におけるOTC酵素活性の増加がもたらされる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、OTCポリペプチドをコードするmRNAを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用され、本方法は、対象の少なくとも一部の細胞におけるOTC酵素活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするmRNAを含む組成物または製剤の対象への投与は、正常な対象、例えば、OTCDに罹患していないヒトで予想される活性レベルの少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%またはそれを超えるレベルまで、対象となる細胞におけるOTC酵素活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、著しいクロライドチャネル活性が生じるのに十分な期間で持続する、対象の細胞の少なくとも一部におけるOTCタンパク質の発現をもたらす。
別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤は、本明細書に記載されるような有益な生物学的効果を有するのに十分な期間、OTCタンパク質が治療レベルで発現されるように反復投与され得る。
いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞中に導入される場合、それらの細胞内のOTC発現レベルを、例えば、ポリペプチドが細胞に導入される前の細胞におけるOTC発現レベルに対して少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%まで増加させる。
いくつかの実施形態では、本方法または使用は、配列番号:3のポリヌクレオチドに対して配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAを投与することを含み、ポリヌクレオチドはOTCポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本方法または使用は、配列番号:4のポリヌクレオチドに対して配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAを投与することを含み、ポリヌクレオチドはOTCポリペプチドをコードする。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の哺乳動物対象への移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与は当業者に既知であり、これとしては、局所移植(例えば、局所または皮下投与)、臓器送達または全身注射(例えば、静脈内注射または吸入)、及び薬学的に許容される担体内における細胞の製剤化が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示はまた、OTC活性の増加を必要とする対象、例えば、OTCDを有する対象においてOTC活性を増加させる方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるOTCポリペプチド、例えば、ヒトOTCポリペプチド、その変異体、またはヒトOTCを含む融合タンパク質をコードするmRNAを含む、治療有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、OTC活性を必要とする対象、例えば、OTCDを有する対象への投与後に測定されるOTC活性は、少なくとも健康なヒト対象で観察される正常なOTC活性レベルである。いくつかの態様では、投与後に測定されるOTC活性は、OTCD患者、例えば、未治療のOTCD患者で観察されるOTC活性レベルよりも高い。いくつかの態様では、OTC活性の増加を必要とする対象、例えば、OTCDを有する対象における、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードするmRNAを含む、治療有効量の組成物または製剤を対象に投与した後のOTC活性の増加は、健康なヒト対象で観察される正常なOTC活性レベルの少なくとも約5パーセント、少なくとも約10パーセント、少なくとも約15パーセント、少なくとも約20パーセント、少なくとも約25パーセント、少なくとも約30パーセント、少なくとも約35パーセント、少なくとも約40パーセント、少なくとも約45パーセント、少なくとも約50パーセント、少なくとも約55パーセント、少なくとも約60パーセント、少なくとも約65パーセント、少なくとも約70パーセント、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約100パーセント、または100パーセント超である。いくつかの態様では、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードするmRNAを含む組成物または製剤を対象に投与した後(例えば、単回用量の投与後)の、OTCD患者で観察されるOTC活性レベルを上回るOTC活性の増加は、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも12日間、少なくとも14日間、少なくとも21日間、または少なくとも28日間維持される。
本開示はまた、OTCD患者におけるOTCDの症状(例えば、高レベルの血中アンモニア、高アンモニア血症、高レベルのオロチン酸、拒食、嘔吐、嗜眠、易刺激性、発作、筋緊張低下、肝腫大、呼吸異常、及び脳内浮腫)を治療、予防、または改善する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードするmRNAを含む、治療有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、OTCDの治療を必要とする対象に対する、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードするmRNAを含む、治療有効量の組成物または製剤の投与は、OTCDの症状の減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)、医薬組成物及び製剤は、本明細書に開示されるOTCポリペプチドをコードするウラシル修飾配列ならびに本明細書に開示されるmiRNA結合部位、例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位及び/またはmiR-126に結合するmiRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のOTCポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基の一種(例えば、ウラシル)の少なくとも95%が、修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも95%が、1-N-メチルシュードウリジンまたは5-メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、例えば、LNP-4を含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物IIもしくは化合物B、または式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物Iもしくは化合物VI、あるいはそれらの任意の組合せを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、ヘルパー脂質(例えば、DSPC)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)を含み、例えば、約(i)40~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、任意に45~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%、(ii)30~45mol%のステロール(例えば、コレステロール)、任意に35~42mol%のステロール、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、37~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%、または40~42mol%のステロール、(iii)5~15mol%のヘルパー脂質(例えば、DSPC)、任意に10~15mol%のヘルパー脂質、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%のヘルパー脂質、及び(iv)1~5%のPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)、任意に1~5mol%のPEG脂質、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG脂質の範囲のモル比で含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物B、コレステロール、DSPC、及び化合物Iを47:39:11:3のモル比で含む。
当業者は、本発明の薬物または治療の治療有効性が、試料中、または対象から(例えば、前臨床試験対象(げっ歯類、霊長類など)から、もしくは臨床対象(ヒト)から)採取した試料中におけるコードされたタンパク質(例えば、酵素)の発現レベルを測定することによって特徴付けられ得るか、または決定され得ると理解することになる。同様に、本発明の薬物または治療の治療有効性は、試料中、または対象から(例えば、前臨床試験対象(げっ歯類、霊長類など)から、もしくは臨床対象(ヒト)から)採取した試料中におけるコードされたタンパク質(例えば、酵素)の活性レベルを測定することによって特徴付けられ得るか、または決定され得る。さらに、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から採取した試料(複数可)中の適切なバイオマーカーレベルを測定することによって特徴付けられ得るか、または決定され得る。タンパク質及び/またはバイオマーカーのレベルは、本発明のmRNA治療薬の単回用量による投与後に決定され得るか、あるいは単回用量による投与後のいくつかの時点で決定及び/またはモニターされ得るか、あるいは治療経過、例えば、複数回用量治療の全体を通して決定及び/またはモニターされ得る。
OTCタンパク質発現レベル
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類など)またはヒト対象におけるOTCタンパク質の発現レベル(複数可)の測定、決定及び/またはモニタリングを特徴とする。動物は、正常で健康な動物または野生型動物に加えて、OTCDの理解及びその治療に使用するため動物モデルを含む。例示的な動物モデルとしては、げっ歯類モデル、例えば、OTC欠損マウス(OTCマウスとも称される)が挙げられる。
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類など)またはヒト対象におけるOTCタンパク質の発現レベル(複数可)の測定、決定及び/またはモニタリングを特徴とする。動物は、正常で健康な動物または野生型動物に加えて、OTCDの理解及びその治療に使用するため動物モデルを含む。例示的な動物モデルとしては、げっ歯類モデル、例えば、OTC欠損マウス(OTCマウスとも称される)が挙げられる。
OTCタンパク質発現レベルは、例えば、血液試料または針生検からの生体試料内におけるタンパク質レベルを決定する、当該技術分野で認識されている任意の方法によって測定または決定され得る。「レベル」または「タンパク質のレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは試料または対象内のタンパク質の重量、質量または濃度を意味する。ある特定の実施形態では、試料は、例えば、以下:精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び/またはHPLCのいずれかに供され、その後、例えば、質量分析及び/または分光分析を使用して、タンパク質レベルの決定に供される場合があると当業者には理解されることになる。例示的な実施形態では、酵素結合免疫吸着法(ELISA)が、タンパク質発現レベルを決定するために使用され得る。他の例示的な実施形態では、タンパク質精製、分離及びLC-MSは、本発明によるタンパク質のレベルを決定するための手段として使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明のmRNA療法(例えば、単回静脈内用量)は、mRNA療法の単回用量の投与後、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも84時間、少なくとも96時間、少なくとも108時間、少なくとも122時間で、対象の組織(例えば、心臓、肝臓、脳、または骨格筋)においてOTCタンパク質発現レベルの増加(例えば、正常レベルの2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍の増加及び/または少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%に増加)をもたらす。
OTCタンパク質活性
OTCD患者では、OTC酵素活性は、正常な生理学的活性レベルと比較して減少する。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類など)またはヒト対象におけるOTCタンパク質の活性レベル(複数可)(すなわち、酵素活性レベル(複数可))の測定、決定及び/またはモニタリングを特徴とする。活性レベルは、生体試料中の酵素活性レベルを決定する、当該技術分野で認識されている任意の方法によって測定または決定され得る。「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは試料または試料内の総タンパク質の体積、質量または重量あたりの酵素活性を意味する。例示的な実施形態では、「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、流体(例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿など)1ミリリットルあたりの単位で記載されるか、または試料内の組織重量あたり、もしくはタンパク質(例えば、総タンパク質)重量あたりの単位で記載される。酵素活性の単位(「U」)は、単位時間あたりの加水分解される基質の重量または質量で記載され得る。本発明のある特定の実施形態では、U/ml血漿またはU/mgタンパク質(組織)で記載されるOTC活性を特徴とし、単位(「U」)は、1時間あたりの加水分解されるnmol基質(またはnmol/時間)で記載される。
OTCD患者では、OTC酵素活性は、正常な生理学的活性レベルと比較して減少する。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類など)またはヒト対象におけるOTCタンパク質の活性レベル(複数可)(すなわち、酵素活性レベル(複数可))の測定、決定及び/またはモニタリングを特徴とする。活性レベルは、生体試料中の酵素活性レベルを決定する、当該技術分野で認識されている任意の方法によって測定または決定され得る。「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは試料または試料内の総タンパク質の体積、質量または重量あたりの酵素活性を意味する。例示的な実施形態では、「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、流体(例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿など)1ミリリットルあたりの単位で記載されるか、または試料内の組織重量あたり、もしくはタンパク質(例えば、総タンパク質)重量あたりの単位で記載される。酵素活性の単位(「U」)は、単位時間あたりの加水分解される基質の重量または質量で記載され得る。本発明のある特定の実施形態では、U/ml血漿またはU/mgタンパク質(組織)で記載されるOTC活性を特徴とし、単位(「U」)は、1時間あたりの加水分解されるnmol基質(またはnmol/時間)で記載される。
ある特定の実施形態では、本発明のmRNA療法は、投与後6時間~12時間、または12時間~24時間、24時間~48時間、または48時間~72時間(例えば、投与後48時間または72時間)で、組織(例えば、肝臓)中において少なくとも5U/mg、少なくとも10U/mg、少なくとも20U/mg、少なくとも30U/mg、少なくとも40U/mg、少なくとも50U/mg、少なくとも60U/mg、少なくとも70U/mg、少なくとも80U/mg、少なくとも90U/mg、少なくとも100U/mg、または少なくとも150U/mgのOTC活性をもたらすのに効果的なmRNAの用量を含む医薬組成物を特徴とする。
いくつかの実施形態では、本発明のmRNA療法(例えば、単回静脈内用量)は、mRNA療法の単回用量の投与後、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、あるいは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30日またはそれを超えて、対象の肝臓組織においてOTC活性レベルの増加(例えば、正常レベルの2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍の増加及び/または少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%に増加)をもたらす。
例示的な実施形態では、本発明のmRNA療法は、上記の活性レベルをもたらすmRNAの単回静脈内用量を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態では、本発明のmRNA療法は、上記の活性レベルを維持するmRNAの複数回の単一単位静脈内用量で投与され得る医薬組成物を特徴とする。
OTCバイオマーカー
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、OTCのバイオマーカーのレベル、例えば、アンモニアまたはオロチン酸のレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後、短時間以内にOTCの1つ以上のバイオマーカーレベル、例えば、アンモニアまたはオロチン酸レベルの減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、OTCのバイオマーカーのレベル、例えば、アンモニアまたはオロチン酸のレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後、短時間以内にOTCの1つ以上のバイオマーカーレベル、例えば、アンモニアまたはオロチン酸レベルの減少をもたらす。
本発明のさらなる態様は、例えば、同じ患者から、別の患者から、対照から、及び/または同じ時点もしくは異なる時点からの別の試料内における同じもしくは別のバイオマーカーのレベル(例えば、参照レベル)、及び/または生理学的レベル、及び/または上昇レベル、及び/または超生理学的レベル、及び/または対照のレベルと比較した場合に、試料内で決定されるバイオマーカーのレベル(複数可)を決定することを特徴とする。当業者は、バイオマーカーの生理学的レベル、例えば、正常または野生型動物、正常または健康な対象などにおけるレベル、特に健康な、及び/または正常な機能を有する対象に特徴的なレベル(複数可)に精通していることになる。本明細書で使用される場合、「上昇レベル」という語句は、正常もしくは野生型前臨床動物に、または正常もしくは健康な対象、例えば、ヒト対象に通常見られる量よりも多い量を意味する。本明細書で使用される場合、「超生理学的」という用語は、正常もしくは野生型前臨床動物に、または正常もしくは健康な対象、例えば、ヒト対象に通常見られる量よりも多い量を意味し、任意に著しく増強された生理学的応答をもたらす。本明細書で使用される場合、「比較する」または「と比較して」という用語は、好ましくは2つ以上の値、例えば、バイオマーカー(複数可)のレベルの数学的比較を意味する。したがって、そのような値のうち少なくとも2つが互いに比較される場合、値の1つが別の値または値の群よりも高い、低い、または同一であるかどうかは、当業者には容易に明らかとなる。「比較する」または「との比較」は、例えば、投与前の対象(例えば、OTCDに罹患している人)または正常もしくは健康な対象における対照値との比較、例えば、参照血液、血清、血漿、及び/または組織(例えば、肝臓)のアンモニア及び/またはオロチン酸レベルと比較した場合という文脈であり得る。「比較する」または「との比較」はまた、例えば、投与前の対象(例えば、OTCDに罹患している人)または正常もしくは健康な対象における対照値との比較、例えば、参照血液、血清、血漿及び/または組織(例えば、肝臓)のアンモニア及び/またはオロチン酸レベルと比較した場合という文脈であり得る。
本明細書で使用される場合、「対照」は、好ましくは対象のOTCD状態が既知である対象からの試料である。一実施形態では、対照は健康な患者の試料である。別の実施形態では、対照は、既知のOTCD状態、例えば、重度、軽度、または健康なOTCD状態を有する少なくとも1人の対象、例えば、対照患者からの試料である。別の実施形態では、対照は、OTCDの治療を受けていない対象からの試料である。よりさらなる実施形態では、対照は、単一対象からの試料もしくは異なる対象からの試料のプール及び/または異なる時点で対象(複数可)から採取した試料である。
「レベル」または「バイオマーカーのレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは試料または対象内における本発明のバイオマーカーの質量、重量または濃度を意味する。ある特定の実施形態では、試料は、例えば、以下:物質精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び/またはHPLCのうち1つ以上に供され、その後、例えば、質量分光分析を使用して、バイオマーカーレベルの決定に供される場合があると当業者には理解されることになる。ある特定の実施形態では、LC-MSは、本発明によるバイオマーカーのレベルを決定するための手段として使用され得る。
バイオマーカーの「レベルを決定する」という用語は、本明細書で使用される場合、対象からの試料、例えば、対象からの体液(例えば、血清、血漿、尿、リンパ液など)または対象の組織(例えば、肝臓など)中における少なくとも1つの物質の量を定量化することを含む方法を意味し得る。
「参照レベル」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のmRNA療法を投与する前の対象(例えば、OTCDに罹患している人)または正常もしくは健康な対象におけるレベル(例えば、バイオマーカーのレベル)を指し得る。
本明細書で使用される場合、「正常な対象」または「健康な対象」という用語は、OTCDと関連する症状に罹患していない対象を指す。さらに、対象は、対象がOTC遺伝子の機能部分もしくはドメインの変異を有しない、及び/またはOTCDと関連する症状をもたらす、酵素OTCもしくはその活性の減少もしくは欠損をもたらすOTC遺伝子の変異を有しない場合、正常(または健康)とみなされることになる。変異は、対象からの試料が、そのようなOTC変異についての遺伝子検査に供される場合に検出されることになる。本発明のある特定の実施形態では、健康な対象からの試料が対照試料として使用されるか、または健康もしくは正常な対象の試料からのバイオマーカーレベルに対する既知値もしくは標準値が、対照として使用される。
いくつかの実施形態では、OTCDの治療を必要とする対象からの試料またはOTCDの治療を受けている対象におけるバイオマーカーレベルを、バイオマーカーの対照レベルと比較することは、対象(OTCDの治療を必要とする、またはOTCDの治療を受けている)からの試料におけるバイオマーカーレベルをベースラインまたは参照レベルと比較することを含み、対象(OTCDの治療を必要とする、もしくはOTCDの治療を受けている)からの試料におけるバイオマーカーレベルが、ベースラインもしくは参照レベルと比較して上昇している、増加しているか、もしくは高い場合、これは対象がOTCDに罹患している、及び/または治療を必要としていることを示し、及び/または対象(OTCDの治療を必要とする、もしくはOTCDの治療を受けている)からの試料におけるバイオマーカーレベルが、ベースラインレベルと比較して低下しているか、もしくは低い場合、これは対象がOTCDに罹患していないか、OTCDの治療に成功しているか、もしくはOTCDの治療を必要としていないことを示す。ある特定の時間内、例えば、6時間以内、12時間以内、24時間、36時間、48時間、60時間、もしくは72時間以内、及び/またはある特定の期間内、例えば、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、1週間、2週間、3週間、4週間、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、18か月、24か月などで、バイオマーカーレベルの減少(例えば、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍の減少及び/または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%の減少)が強くなるほど、療法、例えば、本発明のmRNA療法(例えば、単回用量または複数回レジメン)などの成功率が上がる。
投与後1日、2日、3日、4日、5日、6日以内またはそれを超える日数で、特に体液(例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣)または対象内の組織(複数可)(例えば、肝臓)内のバイオマーカーレベルが、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも100%またはそれを超えて減少することは、OTCD治療の成功に適した用量であることを示していて、本明細書で使用される場合の減少は、好ましくは指定の期間の終了時(例えば、単回静脈内用量の、例えば、投与後)に決定されるバイオマーカーのレベルが、その期間の開始時(例えば、その用量の投与前)に決定された同じバイオマーカーのレベルと比較されることを意味する。例示的な期間としては、投与後12、24、48、72、96、120または144時間、特に投与後24、48、72または96時間が挙げられる。
基質レベル(例えば、バイオマーカー)の持続的減少は、特にmRNA治療薬の投薬及び/または投与レジメンがOTCDの治療に成功していることを示している。そのような持続的減少は、本明細書では効果の「持続期間」と称され得る。例示的な実施形態では、投与後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日以内またはそれを超える日数で、特に体液(例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣)または対象内の組織(複数可)(例えば、肝臓)内のバイオマーカーレベルが、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約100%またはそれを超えて減少することは、治療アプローチの成功を示している。例示的な実施形態では、1つ以上の試料(例えば、体液及び/または組織)中の基質(例えば、バイオマーカー)レベルの持続的減少が好ましい。例えば、バイオマーカーの持続的減少をもたらすmRNA療法は、任意に少なくとも1つの組織、好ましくは2つ、3つ、4つ、5つまたはそれを超える組織内でのバイオマーカーの持続的減少と組み合わせて、治療の成功を示している。
いくつかの実施形態では、本発明のmRNA療法の単回用量は、約0.2~約0.8mg/kg(mpk)、約0.3~約0.7mpk、約0.4~約0.8mpk、または約0.5mpkである。別の実施形態では、本発明のmRNA療法の単回用量は、1.5mpk未満、1.25mpk未満、1mpk未満、または0.75mpk未満である。
23.使用を目的とした組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、上に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤を対象とする。
本発明のある特定の態様は、上に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤を対象とする。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、以下を含む:
(i)OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルを含み(例えば、ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである)、ポリヌクレオチドが、miRNA結合部位、例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-142-3pもしくはmiR-142-5p結合部位)及び/またはmiR-126に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-126-3pもしくはmiR-126-5p結合部位)をさらに含む、前記ポリヌクレオチド、ならびに
(ii)例えば、LNP-4、式(I)を有する化合物、例えば、化合物IIもしくは化合物B、式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物Iもしくは化合物VI、またはそれらの任意の組合せを含む送達剤。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物II、化合物VI、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組合せを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、ヘルパー脂質(例えば、DSPC)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)を含み、例えば、約(i)40~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、任意に45~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%、(ii)30~45mol%のステロール(例えば、コレステロール)、任意に35~42mol%のステロール、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、37~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%、または40~42mol%のステロール、(iii)5~15mol%のヘルパー脂質(例えば、DSPC)、任意に10~15mol%のヘルパー脂質、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%のヘルパー脂質、及び(iv)1~5%のPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)、任意に1~5mol%のPEG脂質、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG脂質の範囲のモル比で含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物B、コレステロール、DSPC、及び化合物Iを47:39:11:3のモル比で含む。
(i)OTCポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルを含み(例えば、ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、N1-メチルシュードウラシルまたは5-メトキシウラシルである)、ポリヌクレオチドが、miRNA結合部位、例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-142-3pもしくはmiR-142-5p結合部位)及び/またはmiR-126に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-126-3pもしくはmiR-126-5p結合部位)をさらに含む、前記ポリヌクレオチド、ならびに
(ii)例えば、LNP-4、式(I)を有する化合物、例えば、化合物IIもしくは化合物B、式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物Iもしくは化合物VI、またはそれらの任意の組合せを含む送達剤。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物II、化合物VI、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組合せを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、送達剤は、イオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、ヘルパー脂質(例えば、DSPC)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)を含み、例えば、約(i)40~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質(例えば、化合物II、VI、またはB)、任意に45~50mol%のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、45~46mol%、46~47mol%、47~48mol%、48~49mol%、または49~50mol%、例えば、約45mol%、45.5mol%、46mol%、46.5mol%、47mol%、47.5mol%、48mol%、48.5mol%、49mol%、または49.5mol%、(ii)30~45mol%のステロール(例えば、コレステロール)、任意に35~42mol%のステロール、例えば、30~31mol%、31~32mol%、32~33mol%、33~34mol%、35~35mol%、35~36mol%、36~37mol%、37~38mol%、38~39mol%、または39~40mol%、または40~42mol%のステロール、(iii)5~15mol%のヘルパー脂質(例えば、DSPC)、任意に10~15mol%のヘルパー脂質、例えば、5~6mol%、6~7mol%、7~8mol%、8~9mol%、9~10mol%、10~11mol%、11~12mol%、12~13mol%、13~14mol%、または14~15mol%のヘルパー脂質、及び(iv)1~5%のPEG脂質(例えば、化合物IまたはPEG-DMG)、任意に1~5mol%のPEG脂質、例えば、1.5~2.5mol%、1~2mol%、2~3mol%、3~4mol%、または4~5mol%のPEG脂質の範囲のモル比で含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物B、コレステロール、DSPC、及び化合物Iを47:39:11:3のモル比で含む。
いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論的最小ウラシルまたはチミン含有量(%UTMまたは%TTM)と比較したORFのウラシルまたはチミン含有量は、約100%~約150%である。
いくつかの実施形態では、上記のポリヌクレオチド、組成物または製剤は、OTC関連疾患、障害または状態、例えば、OTCDを治療及び/または予防するために使用される。
24.投与の形態
上に記載される本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、静脈内(静脈への)投与などの、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与され得る。それらとしてはまた、経腸(腸内に)、胃腸、硬膜外(epidural)(硬膜に)、経口(口から)、経皮、硬膜外(peridural)、脳内(大脳に)、脳室内(脳室内に)、皮膚上(皮膚上に塗布)、皮内(皮膚自体に)、皮下(皮膚の下に)、経鼻投与(鼻から)、静脈内ボーラス、点滴静脈注射、動脈内(動脈に)、筋肉内(筋肉に)、心臓内(心臓に)、骨内注入(骨髄に)、髄腔内(脊柱管に)、腹腔内(腹膜に注入または注射)、膀胱内注入、硝子体内(目から)、空洞内注射(病的腔に)、海綿体内(陰茎の基部に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身分布のために無傷の皮膚から拡散)、経粘膜(粘膜から拡散)、経膣、吹送(鼻から吸入)、舌下、唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、点耳で、耳介(耳内または耳から)、頬側(頬に向けて)、結膜、皮膚、歯(歯(複数可)に)、電気浸透、頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内(軟骨内に)、仙骨内(馬尾内に)、大槽内(大槽(cisterna magna cerebellomedularis)内に)、角膜内(角膜内に)、歯冠内(dental intracornal)、冠動脈内(冠動脈内に)、海綿体内(陰茎の海綿体の膨張空間内に)、脊髄内(椎間板内に)、管内(腺の管内に)、十二指腸内(十二指腸内に)、硬膜内(硬膜内または硬膜の下に)、表皮内(表皮に)、食道内(食道に)、胃内(胃に)、歯肉内(歯肉に)、回腸内(小腸の遠位部内に)、病巣内(限局性病変内または限局性病変に直接導入)、管腔内(管の内腔内に)、リンパ管内(リンパ内に)、髄内(骨の髄腔内に)、髄膜内(髄膜内に)、眼内(眼球内に)、卵巣内(卵巣内に)、心膜内(心膜内に)、胸膜内(胸膜内に)、前立腺内(前立腺内に)、肺内(肺またはその気管支内に)、洞内(鼻腔または眼窩周囲腔内に)、脊髄内(脊柱内に)、滑液嚢内(関節の滑膜腔内に)、腱内(腱内に)、精巣内(精巣内に)、髄腔内(脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に)、胸内(胸郭内に)、管内(臓器の細管内に)、鼓室内(中耳内に)、血管内(血管(複数可)内に)、室内(室内に)、イオン導入(可溶性塩のイオンが体内組織に移行する電流によって)、灌注(開放創または体腔を浸すか、または洗い流す)、喉頭(喉頭上に直接)、経鼻胃(鼻から胃に)、閉鎖包帯法(局所経路投与後、その領域を塞ぐ包帯で覆う)、経眼(外眼部に)、口腔咽頭(口及び咽頭に直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周部、直腸、呼吸器(局所または全身作用のために経口または経鼻吸入によって気道内に)、球後(脳橋後ろまたは眼球後ろ)、心筋内(心筋内に進入)、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤(胎盤を通過して、または胎盤を越えて)、経気管(気管壁を通過して)、経鼓膜(鼓室を越えて、または鼓室を通過して)、尿管(尿管に)、尿道(尿道に)、膣内、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスあるいは脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。
上に記載される本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、静脈内(静脈への)投与などの、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与され得る。それらとしてはまた、経腸(腸内に)、胃腸、硬膜外(epidural)(硬膜に)、経口(口から)、経皮、硬膜外(peridural)、脳内(大脳に)、脳室内(脳室内に)、皮膚上(皮膚上に塗布)、皮内(皮膚自体に)、皮下(皮膚の下に)、経鼻投与(鼻から)、静脈内ボーラス、点滴静脈注射、動脈内(動脈に)、筋肉内(筋肉に)、心臓内(心臓に)、骨内注入(骨髄に)、髄腔内(脊柱管に)、腹腔内(腹膜に注入または注射)、膀胱内注入、硝子体内(目から)、空洞内注射(病的腔に)、海綿体内(陰茎の基部に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身分布のために無傷の皮膚から拡散)、経粘膜(粘膜から拡散)、経膣、吹送(鼻から吸入)、舌下、唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、点耳で、耳介(耳内または耳から)、頬側(頬に向けて)、結膜、皮膚、歯(歯(複数可)に)、電気浸透、頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内(軟骨内に)、仙骨内(馬尾内に)、大槽内(大槽(cisterna magna cerebellomedularis)内に)、角膜内(角膜内に)、歯冠内(dental intracornal)、冠動脈内(冠動脈内に)、海綿体内(陰茎の海綿体の膨張空間内に)、脊髄内(椎間板内に)、管内(腺の管内に)、十二指腸内(十二指腸内に)、硬膜内(硬膜内または硬膜の下に)、表皮内(表皮に)、食道内(食道に)、胃内(胃に)、歯肉内(歯肉に)、回腸内(小腸の遠位部内に)、病巣内(限局性病変内または限局性病変に直接導入)、管腔内(管の内腔内に)、リンパ管内(リンパ内に)、髄内(骨の髄腔内に)、髄膜内(髄膜内に)、眼内(眼球内に)、卵巣内(卵巣内に)、心膜内(心膜内に)、胸膜内(胸膜内に)、前立腺内(前立腺内に)、肺内(肺またはその気管支内に)、洞内(鼻腔または眼窩周囲腔内に)、脊髄内(脊柱内に)、滑液嚢内(関節の滑膜腔内に)、腱内(腱内に)、精巣内(精巣内に)、髄腔内(脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に)、胸内(胸郭内に)、管内(臓器の細管内に)、鼓室内(中耳内に)、血管内(血管(複数可)内に)、室内(室内に)、イオン導入(可溶性塩のイオンが体内組織に移行する電流によって)、灌注(開放創または体腔を浸すか、または洗い流す)、喉頭(喉頭上に直接)、経鼻胃(鼻から胃に)、閉鎖包帯法(局所経路投与後、その領域を塞ぐ包帯で覆う)、経眼(外眼部に)、口腔咽頭(口及び咽頭に直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周部、直腸、呼吸器(局所または全身作用のために経口または経鼻吸入によって気道内に)、球後(脳橋後ろまたは眼球後ろ)、心筋内(心筋内に進入)、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤(胎盤を通過して、または胎盤を越えて)、経気管(気管壁を通過して)、経鼓膜(鼓室を越えて、または鼓室を通過して)、尿管(尿管に)、尿道(尿道に)、膣内、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスあるいは脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。
25.定義
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書に別途明示的に提供されない限り、以下の用語の各々は、以下に記載される意味を有するものとする。追加の定義が、本出願全体を通して記載される。
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書に別途明示的に提供されない限り、以下の用語の各々は、以下に記載される意味を有するものとする。追加の定義が、本出願全体を通して記載される。
本発明は、群のうちの正確に1つのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、それに用いられる、またはさもなければそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーのうち2つ以上、または全てが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、それに用いられる、またはさもなければそれに関連する実施形態を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。「a」(または「an」)という用語に加えて「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。ある特定の態様では、「a」または「an」という用語は、「単一」を意味する。他の態様では、「a」または「an」という用語は、「2つ以上」または「複数」を含む。
さらに、「及び/または」は、本明細書で使用される場合、2つの指定された特徴または構成要素の各々の、他方を伴うか、または伴わない特定の開示とみなされるべきである。したがって、「及び/または」という用語は、本明細書で「A及び/またはB」などの語句で使用される場合、「A及びB」、「AまたはB」、「A」(単独)、ならびに「B」(単独)を含むことを意図する。同様に、「及び/または」という用語は、「A、B、及び/またはC」などの語句で使用される場合、以下の態様の各々を包含することを意図する:A、B、及びC、A、B、またはC、AまたはC、AまたはB、BまたはC、A及びC、A及びB、B及びC、A(単独)、B(単独)、ならびにC(単独)。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press、及びOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Pressは、本開示で使用される用語の多くに関する一般的な辞書を当業者に提供する。
態様が「含む」という言葉を用いて本明細書に記載される場合は常に、「からなる」及び/または「から本質的になる」に関して記載される他の類似の態様も提供される。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系(SI)で承認された形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。数値の範囲が列挙されている場合、その範囲の列挙された上限と下限との間に介在する各整数値、及びその各分数も、そのような値間の各部分範囲と共に具体的に開示されていると理解されるべきである。任意の範囲の上限及び下限は、独立してその範囲内に含まれ得るか、またはその範囲から除外され得、いずれか一方、いずれでもない、または両方の限界値が含まれる各範囲も、本発明内に包含される。値が明示的に列挙される場合、列挙された値とほぼ同じ数量または量の値も本発明の範囲内であると理解されるべきである。組合せが開示される場合、その組合せの要素の各部分的組合せも具体的に開示されていて、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、その組合せも開示されている。ある発明のいずれかの要素が複数の選択肢を有するものとして開示される場合、各選択肢が単独で、または他の選択肢との任意の組合せで除外されるその発明の例も本明細書に開示され、ある発明の2つ以上の要素がそのような除外を有し得、そのような除外を有する要素の全ての組合せが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、一般に認められているそれらの1文字コードで表される。別段の指示がない限り、核酸は、5’から3’の方向で左から右に記載される。核酸塩基は、本明細書ではIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される、それらの一般に既知の1文字記号によって表される。したがって、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、Gはグアニンを表し、Tはチミンを表し、Uはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書ではIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される、それらの一般に既知の3文字記号によって、または1文字記号のいずれかによって表される。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に記載される。
約:「約」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して数値に関連して使用される場合、当業者に周知かつ許容される精度の間隔を示し、そのような精度の間隔は±10%である。
範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、別段の指示がない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態に記載されている範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、その範囲における下限の単位の10分の1までと想定し得る。
併用投与:本明細書で使用される場合、「併用投与(administered in combination)」または「併用投与(combined administration)」という用語は、2つ以上の薬剤が、患者に対する各薬剤の効果の重複が存在し得るように、同時に、または間隔をあけて対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは互いに約60分、30分、15分、10分、5分、または1分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、組合せ(例えば、相乗)効果が達成されるように、十分に互いに近接して間隔があけられる。
アミノ酸置換:「アミノ酸置換」という用語は、親配列または参照配列(例えば、野生型OTC配列)中に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列(例えば、野生型OTCポリペプチド配列)中で、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野において既知の組換え方法によって置換され得る。したがって、「X位の置換」への言及は、X位に存在するアミノ酸を代替アミノ酸残基で置換することを指す。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマAnYに従って記載され得、式中、Aは、n位に天然に、または元々存在するアミノ酸に対応する1文字コードであり、Yは置換アミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、スキーマAn(YZ)に従って記載され得、式中、Aは、X位に天然に、または元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する1文字コードであり、Y及びZは代替置換アミノ酸残基である。
本開示の文脈では、置換は(それらがアミノ酸置換と称される場合であっても)、核酸レベルで行われる、すなわち、アミノ酸残基を代替アミノ酸残基で置換することは、第1アミノ酸をコードするコドンを、第2アミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
動物:本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ)である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
およそ:本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、1つ以上の目的の値に適用される場合に規定の参照値に類似した値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り(そのような数が可能な値の100%を超えことになる場合を除く)、規定の参照値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満の値内にいずれの方向にも(上回るか、または下回る)含まれる値の範囲を指す。
と関連する:疾患に関して本明細書で使用される場合、「と関連する」という用語は、問題となっている症状、測定値、特性、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行に関連していることを意味する。関連性は疾患と因果関係があり得るが、必ずしもその必要はない。例えば、OTCDの患者の症状、後遺症、または生活の質の低下を引き起こすいずれの影響も、OTCDと関連すると考えられ、本発明のいくつかの実施形態では、治療、改善、または予防を必要とする対象に本発明のポリヌクレオチドを投与することによって治療、改善、または予防され得る。
2つ以上の部分に関して使用される場合、「と関連する」、「複合化される」、「連結される」、「付加される」、及び「つながれる」という用語は、2つ以上の部分に関して使用される場合、部分が、直接または連結剤として機能する1つ以上の追加の部分を介するいずれかで、互いに物理的に関連または結合され、構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で部分が物理的に関連したままであるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「関連性」は、厳密には直接の共有化学結合による必要はない。それはまた、「関連する」実体が物理的に関連したままとなるように十分に安定したイオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性を示唆し得る。
生体適合性:本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、損傷、毒性または免疫系による拒絶のリスクがほとんどまたは全くない生細胞、組織、臓器または系との適合性を意味する。
生分解性:本明細書で使用される場合、「生分解性」という用語は、生物の作用によって無害な生成物に分解できることを意味する。
生物学的に活性な:本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という語句は、生物系及び/または生物において活性を有する任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与される場合、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部であっても生物学的に活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると考えられ得る。
キメラ:本明細書で使用される場合、「キメラ」は、2つ以上の不一致または異種部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、OTCポリペプチドを含む第1部分、及び第2治療用タンパク質(例えば、別個の酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはOTCの血漿中半減期を延長できる部分、例えば、抗体のFc領域)を含む第2部分(例えば、第1部分に遺伝的に融合した部分)を含み得る。
配列最適化:「配列最適化」という用語は、参照核酸配列中の核酸塩基が代替核酸塩基で置き換えられて、改善された特性、例えば、改善されたタンパク質発現または免疫原性の低下を伴う核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
概して、配列最適化の目標は、参照ヌクレオチド配列によってコードされる同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を作製することである。したがって、参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド内にはアミノ酸置換(コドン最適化の結果として)は存在しない。
コドン置換:配列最適化との関連において「コドン置換(substitution)」または「コドン置換(replacement)」という用語は、参照核酸配列中に存在するコドンを別のコドンで置き換えることを指す。コドンは参照核酸配列中で、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野において既知の組換え方法によって置換され得る。したがって、核酸配列(例えば、mRNA)のある特定の位置または核酸配列(例えば、mRNA)のある特定の領域もしくは部分配列内の「置換(substitution)」または「置換(replacement)」への言及は、そのような位置または領域のコドンを代替コドンで置換することを指す。
本明細書で使用される場合、「コード領域」及び「をコードする領域」という用語ならびにその文法上の変化形は、発現時にポリペプチドまたはタンパク質を産生するポリヌクレオチド内のオープンリーディングフレーム(ORF)を指す。
化合物:本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、図示される構造の全ての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体(例えば、シス及びトランス異性体)、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性的に純粋な形態(例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋な)ならびにエナンチオマー及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を含む、本明細書に記載される化合物のあらゆる全ての立体異性体を包含する。化合物のエナンチオマー及び立体異性体混合物ならびにそれらを、それらの構成要素であるエナンチオマーまたは立体異性体に分解する手段が周知である。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、原子核内の中性子数が異なるために異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体は、トリチウム及び重水素を含む。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、溶媒または水分子と組み合わせて調製され、日常的な方法によって溶媒和物及び水和物を形成し得る。
接触:本明細書で使用される場合、「接触」という用語は、2つ以上の実体間に物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳動物細胞及びナノ粒子が、物理的接続を共有するように作製されることを意味する。インビボ及びエクスビボの両方で細胞を外部の実体と接触させる方法は、生物学技術分野において周知である。例えば、哺乳動物内に配置されたナノ粒子組成物及び哺乳動物細胞を接触させることは、様々な投与経路(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下)によって行われ得、様々な量のナノ粒子組成物を含み得る。さらに、2つ以上の哺乳動物細胞がナノ粒子組成物と接触し得る。
保存的アミノ酸置換:「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されていて、これらとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン)が挙げられる。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられる場合、アミノ酸置換は保存的であるとみなされる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置き換えられ得る。
非保存的アミノ酸置換:非保存的アミノ酸置換としては、(i)電気陽性側鎖を有する残基(例えば、Arg、HisまたはLys)が、電気陰性残基(例えば、GluまたはAsp)と置換されるか、またはそれによって置換されるか、(ii)親水性残基(例えば、SerまたはThr)が、疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、PheまたはVal)と置換されるか、またはそれによって置換されるか、(iii)システインまたはプロリンが、任意の他の残基と置換されるか、またはそれによって置換されるか、あるいは(iv)嵩高い疎水性または芳香族側鎖を有する残基(例えば、Val、His、IleまたはTrp)が、より小さい側鎖を有するもの(例えば、AlaもしくはSer)または側鎖を有しないもの(例えば、Gly)と置換されるか、またはそれによって置換されるようなものが挙げられる。
他のアミノ酸置換が、当業者によって容易に特定され得る。例えば、アミノ酸アラニンについては、D-アラニン、グリシン、ベータ-アラニン、L-システイン及びD-システインのいずれか1つから置換が行われ得る。リジンについては、置換は、D-リジン、アルギニン、D-アルギニン、ホモ-アルギニン、メチオニン、D-メチオニン、オルニチン、またはD-オルニチンのいずれか1つであり得る。概して、単離ポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想され得る機能的に重要な領域における置換は、(i)極性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンと(もしくはそれによって)置換されるか、(ii)システイン残基が、任意の他の残基と(もしくはそれによって)置換されるか、(iii)電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸と(もしくはそれによって)置換されるか、または(iv)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有しないもの、例えばグリシンと(もしくはそれによって)置換されるようなものである。前述した非保存的置換の1つがタンパク質の機能特性を変化させ得る可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも相関し、したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性に対してほとんどまたは全く影響を及ぼし得ない。
保存的:本明細書で使用される場合、「保存的」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指し、それらは比較される2つ以上の配列の同じ位置に変化を生じないものである。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、より関連性の高い配列間で保存されているものである。
いくつかの実施形態では、2つ以上の配列は、それらが互いに100%同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、2つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、2つ以上の配列は、それらが互いに約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%、約98%、または約99%同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、2つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも30%同一、少なくとも40%同一、少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、2つ以上の配列は、それらが互いに約30%同一、約40%同一、約50%同一、約60%同一、約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%同一、約98%同一、または約99%同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用され得るか、またはその一部、領域もしくは特徴に適用され得る。
制御放出:本明細書で使用される場合、「制御放出」という用語は、治療結果をもたらすために特定の放出パターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルを指す。
環状または環化:本明細書で使用される場合、「環状」という用語は、連続したループの存在を指す。環状分子は環状である必要はなく、サブユニットの切れ目のない鎖を形成するように結合していればよい。本発明の操作RNAまたはmRNAなどの環状分子は、単一単位もしくは多量体であり得るか、または複合体もしくは高次構造の1つ以上の構成要素を含み得る。
送達:本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、目的地に実体を提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路によって)対象に投与することを含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのナノ粒子組成物の投与は、1つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含み得る。
送達剤:本明細書で使用される場合、「送達剤」は、標的細胞へのポリヌクレオチドのインビボ、インビトロ、またはエクスビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
ドメイン:本明細書で使用される場合、ポリペプチドに言及する場合に、「ドメイン」という用語は、1つ以上の特定可能な構造的または機能的特性または性質(例えば、結合能、タンパク質間相互作用の部位として機能する)を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投薬レジメン:本明細書で使用される場合、「投薬レジメン(dosing regimen)」または「投薬レジメン(dosing regimen)」は、投与スケジュールまたは医師が決定した治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
有効量:本明細書で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、そのため、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、タンパク質欠乏症(例えば、OTC欠損症)を治療する薬剤を投与することと関連して、薬剤の有効量は、例えば、薬剤を投与しない場合に観察される症状の重症度と比較した場合に、OTC欠損症と関連する症状を改善、減少、排除、または予防するのに十分なOTCを発現するmRNAの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」と交換可能に使用され得る。
カプセル化する:本明細書で使用される場合、「カプセル化する」という用語は、封入する、包囲する、または内包することを意味する。
カプセル化効率:本明細書で使用される場合、「カプセル化効率」は、ナノ粒子組成物の調製に使用されるポリヌクレオチドの初期総量と比較した、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供されるポリヌクレオチドの総量100mgのうち、97mgのポリヌクレオチドがナノ粒子組成物中にカプセル化される場合、カプセル化効率は97%とされ得る。本明細書で使用される場合、「カプセル化」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉込め、包囲、または内包を指し得る。
送達の増強:本明細書で使用される場合、「送達の増強」という用語は、目的の標的組織への対照ナノ粒子(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)によるポリヌクレオチドの送達レベルと比較して、目的の標的組織(例えば、哺乳動物の肝臓)へのナノ粒子によるポリヌクレオチドの、より多い(例えば、少なくとも1.5倍多い、少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、少なくとも5倍多い、少なくとも6倍多い、少なくとも7倍多い、少なくとも8倍多い、少なくとも9倍多い、少なくとも10倍多い)送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織中で産生されるタンパク質の量を、その組織の重量と比較するか、組織内のポリヌクレオチドの量を、その組織の重量と比較するか、組織中で産生されるタンパク質の量を、その組織内の総タンパク質の量と比較するか、または組織内のポリヌクレオチドの量を、その組織内の総ポリヌクレオチドと比較することによって測定され得る。標的組織に対するナノ粒子の送達の増強は、治療されている対象で決定される必要はなく、それが動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代理において決定され得ると理解されることになる。
発現:本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうち1つ以上を指す:(1)DNA配列からのmRNA鋳型の生成(例えば、転写によって)、(2)mRNA転写物のプロセシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、及び/または3’末端プロセシングによって)、(3)ポリペプチドまたはタンパク質へのmRNAの翻訳、ならびに(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
製剤:本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドならびに担体、添加剤、及び送達剤のうち1つ以上を含む。
断片:「断片」は、本明細書で使用される場合、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、全長タンパク質(例えば、OTC)の部分配列であり、N末端、及び/またはC末端、及び/または内部部分配列が欠失している。本発明のいくつかの好ましい態様では、本発明のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的:本明細書で使用される場合、「機能的」生体分子は、それによって特徴付けられる特性及び/または活性を呈する形態の生体分子である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的OTC断片を発現できるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、OTCの機能的断片は、野生型OTCの断片(すなわち、その天然に存在するアイソフォームのいずれかの断片)、またはその変異体もしくはバリアントを指し、断片は、対応する全長タンパク質の生物活性の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%を保持する。
OTC関連疾患:本明細書で使用される場合、「OTC関連疾患」または「OTC関連障害」という用語は、それぞれOTC活性の異常(例えば、活性低下または活性増加)に起因する疾患または障害を指す。非限定的な例として、OTCDは、OTC関連疾患である。OTCDの多数の臨床型が、当該技術分野において既知である。例えば、www.omim.org/entry/300461を参照のこと。
「OTC酵素活性」及び「OTC活性」という用語は、本開示において交換可能に使用され、細胞膜を介して塩化物イオンを輸送するOTCの能力を指す。したがって、OTC酵素活性またはOTC活性を保持または有する断片またはバリアントは、カルバミルリン酸とオルニチンとの反応を触媒してシトルリン及びリン酸を形成する際に測定可能な酵素活性を有する断片またはバリアントを指す。したがって、OTC酵素活性またはOTC活性を保持または有する断片またはバリアントは、アンモニアを尿素に変換する際に測定可能な酵素活性を有する断片またはバリアントを指す。
ヘルパー脂質:本明細書で使用される場合、「ヘルパー脂質」という用語は、脂質部分(脂質層、例えば、脂質二重層に挿入するため)及び極性部分(脂質層の表面で生理的溶液と相互作用するため)を含む化合物または分子を指す。通常、ヘルパー脂質はリン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を「補完」し、二重層の融合性を増加させること、及び/または例えば、細胞に送達される核酸のエンドソーム脱出の促進を助けることである。ヘルパー脂質はまた、LNP表面の重要な構造成分であると考えられている。
相同性:本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)間及び/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。概して、「相同性」という用語は、2つの分子間の進化的関係性を示唆する。したがって、相同である2つの分子は、進化的に共通の祖先を有することになる。本発明との関連において、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%が同一(全く同じモノマー)であるか、または類似している(保存的置換)場合、互いに「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列)間の比較を必然的に指す。
同一性:本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)間及び/またはポリペプチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出は、例えば、最適な比較を目的として2つの配列をアラインメントすることによって実施され得る(例えば、最適なアラインメントのために第1及び第2核酸配列の一方または両方にギャップが導入され得、比較目的のために非同一配列が無視され得る)。ある特定の実施形態では、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第1配列中のある位置が、第2配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合には、分子はその位置で同一である。2つの配列間での同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、その配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較及び2つの配列間における同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。DNAとRNAとを比較する場合、チミン(T)及びウラシル(U)は同等とみなされ得る。
好適なソフトウェアプログラムが、様々な供給源から入手可能であり、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントに利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための好適な1つのプログラムはbl2seqであり、これは米国政府の米国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)BLASTウェブサイト(blast.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能な一連のBLASTプログラムの一部である。Bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して2つの配列間の比較を行う。BLASTNは核酸配列の比較に使用されるが、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Needle、Stretcher、Water、またはMatcherであり、これらはバイオインフォマティクスプログラムの一連のEMBOSSの一部であり、欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute(EBI))(www.ebi.ac.uk/Tools/psa)からも入手可能である。
配列アラインメントは、MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal XまたはClustal Omega)、MUSCLEなどの当該技術分野において既知の方法を使用して実施され得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインメントする単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、各々独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、小数点以下で四捨五入されることに留意する。例えば、80.11、80.12、80.13、及び80.14は80.1に切り捨てられる一方で、80.15、80.16、80.17、80.18、及び80.19は、80.2に切り上げられる。また、長さの値は常に整数となることに留意する。
ある特定の態様では、第1アミノ酸配列(または核酸配列)の第2アミノ酸配列(または核酸配列)に対する同一性パーセンテージ「%ID」は、%ID=100×(Y/Z)として算出され、式中、Yは、第1及び第2配列のアラインメント(目視または特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントされるような)において完全な一致としてスコアされたアミノ酸残基(または核酸塩基)の数であり、Zは、第2配列中の残基の総数である。第1配列の長さが第2配列よりも長い場合、第1配列の第2配列に対する同一性パーセントは、第2配列の第1配列に対する同一性パーセントよりも高くなる。
当業者であれば、配列同一性パーセントを算出するための配列アラインメントの生成は、一次配列データによってのみ誘導されるバイナリー配列間比較に限定されないと理解することになる。また、配列アラインメントは、配列データを異種ソースからのデータ、例えば、構造データ(例えば、結晶学的タンパク質構造)、機能データ(例えば、変異の位置)、または系統発生的データなどと統合することによって生成され得るとも理解されることになる。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する好適なプログラムは、www.tcoffee.orgで入手可能な、あるいは、例えば、EBIから入手可能なT-Coffeeである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終アラインメントは、自動または手動のいずれかで精選され得るとも理解されることになる。
挿入及び欠失バリアント:「挿入バリアント」は、ポリペプチドに言及する場合、天然または開始配列中における特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入される1つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「すぐ隣接する」は、アミノ酸のアルファ-カルボキシまたはアルファ-アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。「欠失バリアント」は、ポリペプチドに言及する場合、天然または開始アミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で1つ以上のアミノ酸が欠失していることになる。
インタクト:本明細書で使用される場合、ポリペプチドとの関連において、「インタクト」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させない、または置換しないことを意味する。逆に、核酸との関連においては「インタクト」という用語は、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持すること、例えば、野生型核酸塩基を変異させない、または置換しないことを意味する。
イオン化可能なアミノ脂質:「イオン化可能なアミノ脂質」という用語は、1つ、2つ、3つ、またはそれを超える脂肪酸または脂肪アルキル鎖及びpH滴定可能なアミノ頭部基(例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基)を有するような脂質を含む。イオン化可能なアミノ脂質は、典型的にはアミノ頭部基のpKa未満のpHでプロトン化(すなわち、正に荷電)し、pKaを超えるpHでは実質的に荷電していない。そのようなイオン化可能なアミノ脂質としては、DLin-MC3-DMA(MC3)、(13Z,165Z)-N,N-ジメチル-3-ノニドコサ-13-16-ジエン-1-アミン(L608)、ならびに本明細書に記載される式I、II、及びIIのいずれか1つの化合物(例えば、化合物II、化合物VI、及び化合物Bのいずれか1つ)が挙げられるが、これらに限定されない。
リンカー:本明細書で使用される場合、「リンカー」は、原子、例えば、10~1,000個の原子の群を指し、原子または基、例えば、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどで構成され得る。リンカーは、第1端で核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、第2端でペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に結合され得る。リンカーは、核酸配列中への組込みに干渉しないような十分な長さのものであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のために、例えば、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチド多量体(例えば、2つ以上のキメラポリヌクレオチド分子もしくはIVTポリヌクレオチドの連結による)またはポリヌクレオチド複合体を形成するために、加えてペイロードを投与するなどのために使用され得る。リンカー中に組み込まれ得る化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、本明細書に記載されるように、その各々が任意に置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール)、ならびにデキストランポリマー及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、例えば、ジスルフィド結合(-S-S-)またはアゾ結合(-N=N-)などのリンカー内の切断可能な部分が挙げられるが、これらに限定されず、還元剤または光分解を使用して切断され得る。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、もしくは他の還元剤、及び/または光分解の使用によって切断され得るアミド結合に加えて、例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得るエステル結合を含む。
投与方法:本明細書で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法を含み得る。投与方法は、身体の特定の領域または系に標的送達する(例えば、特異的に送達する)ように選択され得る。
修飾:本明細書で使用される場合、「修飾」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的方法を含む多くの方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、本発明のmRNA分子は、非天然ヌクレオシド及び/またはヌクレオチドの導入によって、例えば、それが天然リボヌクレオチドA、U、G、及びCに関連するように修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、A、C、G、Uリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾」されているとはみなされない。
ナノ粒子組成物:本明細書で使用される場合、「ナノ粒子組成物」は、1つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は通常、およそマイクロメートル以下のサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質小胞)、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、500nm以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
天然に存在する:本明細書で使用される場合、「天然に存在する」は、人工的に補助することなく自然界に存在することを意味する。
核酸配列:「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は交換可能に使用され、連続した核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖のいずれかのDNAまたはRNA、例えば、mRNAであり得る。
「核酸」という用語は、その最も広義には、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合にポリヌクレオチドと称される。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、例えば、β-D-リボ配置を有するLNA、α-L-リボ配置を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)、2’-アミノ官能化を有する2’-アミノ-LNA、及び2’-アミノ官能化を有する2’-アミノ-α-LNAを含む)、エチレン核酸(ENA)、シクロヘキセニル核酸(CeNA)またはそれらのハイブリッドもしくは組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
「をコードするヌクレオチド配列」という語句は、ポリペプチドをコードする核酸(例えば、mRNAまたはDNA分子)コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内における発現を誘導できるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能的に連結される開始シグナル及び終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
機能的に連結される:本明細書で使用される場合、「機能的に連結される」という語句は、2つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的連結を指す。
任意に置換される:本明細書で「任意に置換されたX」(例えば、任意に置換されたアルキル)という形の語句は、「X、ここでXは任意に置換されている」(例えば、「アルキル、ここでアルキルは任意に置換されている」)に相当することを意図する。これは、特徴「X」(例えば、アルキル)それ自体が任意であることを意味することを意図しない。
部分:本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
患者:本明細書で使用される場合、「患者」は、治療を望むか、もしくは治療を必要とし得る、治療を必要としている、治療を受けている、治療を受ける予定の対象、または特定の疾患もしくは状態について熟練の専門家によるケアを受けている対象を指す。いくつかの実施形態では、治療は、急性疾患の発症リスクを予防または低減させるために必要とされる、要求される、または受ける、すなわち、それが予防的治療である。
薬学的に許容される:「薬学的に許容される」という語句は、適切な医学的判断の範囲内でヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適していて、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益/リスク比に見合うような化合物、物質、組成物、及び/または剤形を指すために本明細書で用いられる。
薬学的に許容される添加剤:「薬学的に許容される添加剤」という語句は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分(例えば、活性化合物を懸濁または溶解できるビヒクル)を指し、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性であるという特性を有する。添加剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料(色味)、皮膚軟化剤、乳化剤、賦形剤(希釈剤)、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味料、芳香剤、流動化剤(流動促進剤)、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。例示的な添加剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(二塩基性)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される塩:本開示はまた、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって(例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって)親化合物が修飾される。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに加えて、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これらに限定されないものが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機または有機酸から形成された親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって塩基または酸部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、そのような塩は、それらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適切な塩基または酸と水中もしくは有機溶媒中で、またはそれら2つの混合物中で反応させることによって調製され得、一般にエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が使用される。好適な塩の一覧は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008、及びBerge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)に見出され、その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
薬学的に許容される溶媒和物:「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、本明細書で使用される場合、好適な溶媒の分子が結晶格子内に組み込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理学的に忍容性のあるものである。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水(例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物)、N-メチルピロリドン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N’-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N’-ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMEU)、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2-(1H)-ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2-ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と称される。
薬物動態:本明細書で使用される場合、「薬物動態」は、生物に投与される物質の運命の決定に関連するような分子または化合物の任意の1つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝及び排出の程度及び速度を含む、いくつかの領域に分類される。これは一般にADMEと称され、(A)吸収は、物質が血液循環に入るプロセスであり、(D)分布は、体液及び体組織全体にわたる物質の分散または伝播であり、(M)代謝(または生体内変換)は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、(E)排出(または排除)は、体内からの物質の排除を指す。まれに、体組織内に不可逆的に蓄積する薬物もある。
ポリヌクレオチド:「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。本用語は、分子の一次構造を指す。したがって、本用語は、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)に加えて、三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸(「RNA」)を含む。本用語はまた、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化による、及び/またはキャッピングによる修飾型、ならびに非修飾型も含む。より具体的には「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、例えば、スプライシングされているか、またはスプライシングされていないかにかかわらず、tRNA、rRNA、hRNA、siRNA及びmRNAを含むもの、プリン塩基またはピリミジン塩基のN-またはC-グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド(normucleotidic)骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸「PNA」)及びポリモルホリノポリマー、ならびにポリマーが、DNA及びRNAに見られるものなどの、塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有することを条件とする、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドはmRNAを含む。他の態様では、mRNAは合成mRNAである。いくつかの態様では、合成mRNAは、少なくとも1つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様では、ある特定のクラスの全ての核酸塩基が、非天然核酸塩基で置換されている(例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の全てのウリジンが、非天然核酸塩基、例えば、5-メトキシウリジンで置換され得る)。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド(例えば、合成RNAまたは合成DNA)は、天然核酸塩基、すなわち、合成DNAの場合にはA(アデノシン)、G(グアノシン)、C(シチジン)、及びT(チミジン)のみ、または合成RNAの場合にはA、C、G、及びU(ウリジン)のみを含む。
当業者は、本明細書に開示されるコドンマップ中のT塩基が、DNA中に存在するのに対して、対応するRNA中ではT塩基はU塩基で置き換えられると理解することになる。例えば、DNA形態、例えば、ベクターまたはインビトロ翻訳(IVT)鋳型における本明細書に開示されるコドン-ヌクレオチド配列は、そのT塩基が、その対応する転写mRNAにおいてU塩基として転写されることになる。この点に関して、コドン最適化DNA配列(Tを含む)及びそれらの対応するmRNA配列(Uを含む)の両方が、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列とみなされる。当業者はまた、1つ以上の塩基を非天然塩基と置き換えることによって同等のコドンマップが生成され得ることも理解することになる。したがって、例えば、TTCコドン(DNAマップ)はUUCコドン(RNAマップ)に対応し、それによりΨΨCコドン(Uがシュードウリジンで置き換えられているRNAマップ)に対応することになる。
標準的なA-T及びG-C塩基対は、チミジンのN3-H及びC4-オキシとアデノシンのそれぞれN1及びC6-NH2との間、及びシチジンのC2-オキシ、N3及びC4-NH2とグアノシンのそれぞれC2-NH2、N’-H及びC6-オキシとの間で水素結合の形成を可能にする条件下で形成される。したがって、例えば、グアノシン(2-アミノ-6-オキシ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)は、イソグアノシン(2-オキシ-6-アミノ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)を形成するように修飾され得る。そのような修飾によって、ヌクレオシド塩基はシトシンと標準的な塩基対を効果的に形成しないことになる。しかしながら、シトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-オキシ-4-アミノ-ピリミジン)の修飾によるイソシトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-アミノ-4-オキシ-ピリミジン)の形成は、グアノシンとは効果的に塩基対合しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成することになる修飾ヌクレオチドをもたらす(Collins et al.の米国特許第5,681,702号)。イソシトシンは、Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)から入手可能であり、イソシチジンは、Switzer et al.(1993)Biochemistry 32:10489-10496及び当該文献で引用された参考文献によって記載される方法によって調製され得、2’-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Tor et al.,1993,J.Am.Chem.Soc.115:4461-4467及び当該文献で引用された参考文献の方法によって調製され得、イソグアニンヌクレオチドは、Switzer et al.,1993(上記)及びMantsch et al.,1993,Biochem.14:5593-5601によって記載される方法を使用して、またはCollins et al.の米国特許第5,780,610号に記載される方法によって調製され得る。他の非天然塩基対は、2,6-ジアミノピリミジン及びその相補体(1-メチルピラゾロ-[4,3]ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン)の合成について、Piccirilli et al.,1990,Nature 343:33-37に記載される方法によって合成され得る。特有の塩基対を形成する他のそのような修飾ヌクレオチド単位が既知であり、例えば、Leach et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.114:3675-3683及びSwitzer et al.(上記)に記載されるものなどである。
ポリペプチド:「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは修飾アミノ酸を含み得る。本用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識化成分との複合化などによって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、アミノ酸の1つ以上の類似体(例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、p-アセチルフェニルアラニン、D-アミノ酸、及びクレアチンなどを含む)を含有するポリペプチドに加えて、当該技術分野において既知の他の修飾も、本定義内に含まれる。
本用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドとしては、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、ならびに前述の類似体が挙げられる。ポリペプチドは単量体であり得るか、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多重鎖ポリペプチドも含み得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。いくつかの実施形態では、「ペプチド」は、50アミノ酸長以下、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長であり得る。
ポリペプチドバリアント:本明細書で使用される場合、「ポリペプチドバリアント」という用語は、天然または参照配列と分子のアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較した場合に、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び/または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約99%の同一性を有することになる。いくつかの実施形態では、それらは天然配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%同一である。
予防すること:本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害及び/または状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状、特徴、もしくは臨床所見の発症を部分的もしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状、特徴、もしくは所見の発症を部分的もしくは完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害及び/または状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること、及び/または感染、疾患、障害、及び/または状態と関連する病状を発症するリスクを低下させることを指す。
予防(prophylactic):本明細書で使用される場合、「予防」は、疾患の蔓延を予防するために使用される治療薬または活動方針を指す。
予防(prophylaxis):本明細書で使用される場合、「予防」は、健康を維持し、疾患の蔓延を予防するために取られる手段を指す。「免疫予防」は、疾患の蔓延を予防するために能動免疫または受動免疫をもたらす手段を指す。
シュードウリジン:本明細書で使用される場合、シュードウリジン(ψ)は、ヌクレオシドウリジンのC-グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の改変体、バリアント、アイソフォームまたは誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体としては、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-シュードウリジン、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)(N1-メチル-シュードウリジンとしても知られる)、1-メチル-4-チオ-シュードウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、3-メチル-シュードウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、及び2’-O-メチル-シュードウリジン(ψm)が挙げられるが、これらに限定されない。
精製した:本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製した」、「精製」は、不要な成分、物質的汚染、混入物または不完全体から実質的に純粋または清澄にすることを意味する。
参照核酸配列:「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」という用語は、配列最適化され得る開始核酸配列(例えば、RNA、例えば、mRNA配列)を指す。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、その断片またはバリアントである。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、これまでに配列最適化した核酸配列である。
塩:いくつかの態様では、本明細書に開示される送達のための医薬組成物は、それらの脂質成分の一部の塩を含む。「塩」という用語は、任意のアニオン性及びカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定的な例としては、無機及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩(例えば、ヘミオキサレート)、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、重亜硫酸塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、重クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びこれらの混合物が挙げられる。
試料:本明細書で使用される場合、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞または構成部分のサブセット(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液及び精液を含むが、これらに限定されない体液)を指す。試料はさらに、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解物または抽出物、あるいはそれらの画分または部分を含み得、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、及び尿生殖路の外側部分、涙、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器が挙げられるが、これらに限定されない。試料はさらに、栄養ブロスまたはゲルなどの培地を指し、それらはタンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有し得る。
シグナル配列:本明細書で使用される場合、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」という語句は交換可能に使用され、ある特定の細胞小器官、細胞コンパートメントへのタンパク質の輸送もしくは局在化、または細胞外輸送を誘導し得る配列を指す。本用語は、シグナル配列ポリペプチド及びシグナル配列をコードする核酸配列の両方を包含する。したがって、核酸との関連においてシグナル配列への言及は、実際にはシグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
類似性:本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)間及び/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いの類似性パーセントの算出は、類似性パーセントの算出が、当該技術分野において理解されているような保存的置換を考慮することを除いて、同一性パーセントの算出と同じ手法で実施され得る。
単一単位用量:本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、1用量/1回/単一経路/単一接触点、すなわち、単回投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
特異的送達:本明細書で使用される場合、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、オフターゲット組織(例えば、哺乳動物の脾臓)と比較して、目的の標的組織(例えば、哺乳動物の肝臓)へのナノ粒子によるポリヌクレオチドの、より多い(例えば、少なくとも1.5倍多い、少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、少なくとも5倍多い、少なくとも6倍多い、少なくとも7倍多い、少なくとも8倍多い、少なくとも9倍多い、少なくとも10倍多い)送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織中で産生されるタンパク質の量を、その組織の重量と比較するか、組織内のポリヌクレオチドの量を、その組織の重量と比較するか、組織中で産生されるタンパク質の量を、その組織内の総タンパク質の量と比較するか、または組織内のポリヌクレオチドの量を、その組織内の総ポリヌクレオチドと比較することによって測定され得る。例えば、腎血管標的化については、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、組織1gあたり1.5、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、または20倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達される場合、ポリヌクレオチドは、肝臓及び脾臓と比較した場合に哺乳動物の腎臓に特異的に提供される。標的組織に特異的に送達するナノ粒子の能力は、治療されている対象で決定される必要はなく、それが動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代理において決定され得ると理解されることになる。
安定した:本明細書で使用される場合、「安定した」は、反応混合物から有用な純度まで単離させるのに十分に堅牢であり、いくつかの場合には、有効な治療剤に製剤化できる化合物を指す。
安定化:本明細書で使用される場合、「安定化させる」、「安定化した」、「安定化領域」という用語は、安定にさせるか、または安定することを意味する。
対象:「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または療法が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、飼育動物、家畜動物、動物園の動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなど、霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーなど、イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミなど、ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラなど、ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマなど、クマ、食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、及びヒツジなど、有蹄動物、例えば、シカ及びキリンなど、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒト対象である。他の実施形態では、対象はヒト患者である。特定の実施形態では、対象は、治療を必要とするヒト患者である。
実質的に:本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体的またはほぼ全体的な程度または度合いを表す定性的状態を指す。生物学技術分野における当業者は、生物学的及び化学的特性が、あるとしてもめったに完了しない、及び/または完全には進行しない、あるいは確かな結果を達成しないか、またはそれを回避しないと理解することになる。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的特性に固有の完全性の欠如可能性を得るために本明細書で使用される。
実質的に等しい:本明細書で使用される場合、それが用量間の時間差に関連する場合に、本用語はプラス/マイナス2%を意味する。
罹患している:疾患、障害、及び/または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、及び/または状態と診断されているか、またはそれらの1つ以上の症状を呈している。
に罹患しやすい:疾患、障害、及び/または状態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、及び/または状態と診断されていない、及び/またはそれらの症状を示すことができないが、疾患またはその症状を発症する傾向を有している。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び/または状態(例えば、OTCD)に罹患しやすい個体は、以下のうち1つ以上によって特徴付けられ得る:(1)疾患、障害、及び/または状態の発症と関連する遺伝子変異、(2)疾患、障害、及び/または状態の発症と関連する遺伝子多型、(3)疾患、障害、及び/または状態と関連するタンパク質及び/または核酸の発現及び/または活性の増加及び/または低減、(4)疾患、障害、及び/または状態の発症と関連する習慣及び/または生活様式、(5)疾患、障害、及び/または状態の家族歴、ならびに(6)疾患、障害、及び/または状態の発症と関連する微生物への曝露及び/またはその感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び/または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び/または状態を発症することになる。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び/または状態に罹患しやすい個体が、疾患、障害、及び/または状態を発症しない。
持続放出:本明細書で使用される場合、「持続放出」という用語は、特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成:「合成」という用語は、人の手によって生成、調製、及び/または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的細胞:本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、任意の1つ以上の目的の細胞を指す。本細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官内に見られ得る。生物は動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象または患者であり得る。
標的組織:本明細書で使用される場合、「標的組織」は、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的及び/または薬理学的効果をもたらすことになる、任意の1つ以上の目的の組織型を指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、及びそれらの系または群が挙げられる。特定の用途において、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管(例えば、冠動脈内もしくは大腿内)の血管内皮であり得る。「オフターゲット組織」は、コードされたタンパク質の発現が、所望の生物学的及び/または薬理学的効果をもたらさない任意の1つ以上の組織型を指す。
オフターゲット問題における治療剤の存在は、以下の結果であり得る:(i)ポリヌクレオチドが投与部位から末梢組織もしくは遠位のオフターゲット組織に拡散もしくは血流を介して漏出すること(例えば、ある特定の組織でポリペプチドを発現するように意図されたポリヌクレオチドが、オフターゲット組織に到達し、ポリペプチドがオフターゲット組織中で発現されることになる)、または(ii)そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後、ポリペプチドが末梢組織もしくは遠位のオフターゲット組織に拡散もしくは血流を介して漏出すること(例えば、ポリヌクレオチドが標的組織中でポリペプチドを発現し、ポリペプチドが末梢組織に拡散することになる)。
標的化配列:本明細書で使用される場合、「標的化配列」という語句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を誘導し得る配列を指す。
治療剤:「治療剤」という用語は、対象に投与される場合、治療、診断、及び/または予防効果を有し、及び/または所望の生物学的及び/または薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。例えば、いくつかの実施形態では、OTCポリペプチドをコードするmRNAは、治療剤であり得る。
治療有効量:本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び/または状態に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与される場合、感染、疾患、障害、及び/または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、及び/またはその発症を遅延させるのに十分な、送達される薬剤(例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など)の量を意味する。
治療上有効な結果:本明細書で使用される場合、「治療上有効な結果」という用語は、感染、疾患、障害、及び/または状態に罹患しているか、または罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び/または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、及び/またはその発症を遅延させるのに十分な結果を意味する。
転写:本明細書で使用される場合、「転写」という用語は、DNA(例えば、DNA鋳型または配列)からmRNA(例えば、mRNA配列または鋳型)を産生する方法を指す。
トランスフェクション:本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチド(例えば、外来核酸)を細胞中に導入することを指し、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現される(例えば、mRNA)か、またはポリペプチドが細胞機能を調節する(例えば、siRNA、miRNA)。本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)からポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳及び/またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。トランスフェクションの方法としては、化学的方法、物理的処理及びカチオン性脂質または混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
治療すること、治療、療法:本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」または「療法」という用語は、疾患、例えば、OTCDの1つ以上の症状または特徴の部分的または完全な軽減、改善(ameliorating)、改善(improving)、緩和、発症の遅延、進行の阻害、重症度の減少、及び/または発症率の減少を指す。例えば、OTCDを「治療すること」は、疾患と関連する症状を軽減すること、患者の寿命を延長すること(生存率を増加させること)、疾患の重症度を減少させること、疾患の発症を予防または遅延させることなどを指し得る。治療は、疾患、障害、及び/または状態の徴候を示さない対象に、及び/または疾患、障害、及び/または状態の初期徴候のみを示す対象に、疾患、障害、及び/または状態と関連する病状の発症リスクを低下させる目的で投与され得る。
非修飾:本明細書で使用される場合、「非修飾」は、ある方法で変化させる前の任意の物質、化合物または分子を指す。非修飾は、生体分子の野生型または天然型を指し得るが、必ずしもそうとは限らない。分子が一連の修飾を受け得ることによって、各修飾分子は、後続の修飾のための「非修飾」出発分子として機能し得る。
ウラシル:ウラシルは、RNAの核酸中における4つの核酸塩基の1つであり、それは文字Uで表される。ウラシルは、リボース環、またはより具体的にはリボフラノースに、β-N1-グリコシド結合を介して結合し、ヌクレオシドウリジンを得ることができる。ヌクレオシドウリジンはまた、その核酸塩基の1文字コード、すなわち、Uに従って通常短縮される。したがって、本開示との関連において、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがUである場合、そのようなUは、交換可能に「ウラシル」または「ウリジン」として指定される。
ウリジン含有量:「ウリジン含有量」または「ウラシル含有量」という用語は交換可能であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含有量またはウラシル含有量は、絶対値(配列中のウリジンもしくはウラシルの総数)または相対値(核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルの割合)として表され得る。
ウリジン修飾配列:「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含有量及び/またはウリジンパターンに関して、全体的もしくは局所的に異なるウリジン含有量(より高い、もしくはより低いウリジン含有量)または異なるウリジンパターン(例えば、勾配分布もしくはクラスター形成)を有する、配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)を指す。本開示の内容において、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等かつ交換可能であるとみなされる。
「高ウリジンコドン」は、2個または3個のウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、1個のウリジンを含むコドンとして定義され、「ウリジンのないコドン」は、一切ウリジンを含まないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンへの置換、高ウリジンコドンのウリジンのないコドンへの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンへの置換、低ウリジンコドンのウリジンのないコドンへの置換、ウリジンのないコドンの低ウリジンコドンへの置換、ウリジンのないコドンの高ウリジンコドンへの置換、及びそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置換され得る。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置換され得る。いくつかの実施形態では、ウリジンのないコドンは、別のウリジンのないコドンで置換され得る。ウリジン修飾配列は、ウリジン富化配列またはウリジン希薄化配列であり得る。
ウリジン富化:本明細書で使用される場合、「ウリジン富化」という用語及び文法上の変化形は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に関して、配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)中におけるウリジン含有量の増加(絶対値またはパーセンテージ値で表される)を指す。ウリジン富化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン富化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対して)または局所的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して)であり得る。
ウリジン希薄化:本明細書で使用される場合、「ウリジン希薄化」という用語及び文法上の変化形は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に関して、配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)中におけるウリジン含有量の低下(絶対値またはパーセンテージ値で表される)を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン希薄化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対して)または局所的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して)であり得る。
バリアント:本開示で使用されるようなバリアントという用語は、天然バリアント(例えば、多型、アイソフォームなど)及び天然配列または開始配列(例えば、野生型配列)中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去されていて、その代わりに同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されている人工バリアントの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」と記載され得る。置換は、分子中の1つのアミノ酸だけが置換されている場合に単一型であり得るか、またはそれらは、同じ分子中で2つ以上のアミノ酸が置換されている場合に多重型であり得る。アミノ酸が挿入または欠失される場合、得られたバリアントは、それぞれ「挿入バリアント」または「欠失バリアント」となる。
開始コドン:本明細書で使用される場合、「開始(initiation)コドン」という用語は、「開始(start)コドン」という用語と交換可能に使用され、リボソームによって翻訳されるオープンリーディングフレームの最初のコドンを指し、アデニン-ウラシル-グアニン核酸塩基の連結したトリプレットで構成される。開始コドンは、アデニン(A)、ウラシル(U)、及びグアニン(G)の最初の文字コードで表され、単に「AUG」と記載されることが多い。天然mRNAは開始コドンとしてAUG以外のコドンを使用する場合があり、それらは本明細書では「代替開始コドン」と称されるが、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの開始コドンはAUGコドンを使用する。翻訳開始のプロセス中に、開始コドンを含む配列は、リボソームが結合した開始tRNA(Met-tRNAi
Met)のアンチコドンとの相補的塩基対合を介して認識される。オープンリーディングフレームは、2つ以上のAUG開始コドンを含有する場合があり、それらは本明細書では「代替開始コドン」と称される。
開始コドンは、翻訳開始において重要な役割を果たす。開始コドンは、リボソームによって翻訳されるオープンリーディングフレームの最初のコドンである。典型的には、開始コドンはヌクレオチドトリプレットAUGを含むが、いくつかの場合では、異なるヌクレオチドで構成される他のコドンで翻訳が開始され得る。真核生物における翻訳の開始は、メッセンジャーRNA分子(mRNA)、40Sリボソームサブユニット、翻訳機構の他の構成要素(例えば、真核生物開始因子、eIF)間の多数のタンパク質-タンパク質、タンパク質-RNA、及びRNA-RNA相互作用を含む多段階生化学的プロセスである。現在のmRNA翻訳開始モデルでは、開始前複合体(あるいは「43S開始前複合体」、「PIC」と略される)は、mRNA上の動員部位(典型的には5’キャップ)から、特定の翻訳促進ヌクレオチドコンテキスト(Kozak配列)内に存在する最初のAUGコドンに遭遇するまで、5’から3’の方向にヌクレオチドをスキャンすることによって、開始コドンまで移動すると仮定している(Kozak(1989)J Cell Biol 108:229-241)。PICによるスキャンは、開始Met-tRNAi
Met転移RNAのアンチコドンを含むヌクレオチドと、mRNAの開始コドンを含むヌクレオチドとの間の相補的塩基対合時に終了する。AUGコドンとMet-tRNAi
Metアンチコドンとの間の生産的塩基対合は、結果的に大きな60SリボソームサブユニットをPICに結合させ、翻訳伸長能力がある活性リボソームを形成する、一連の構造的及び生化学的事象を引き起こす。
Kozak配列:「Kozak配列」(「Kozakコンセンサス配列」とも称される)という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を増強するための翻訳開始エンハンサーエレメントを指し、真核生物では5’UTR内に位置する。Kozakコンセンサス配列は、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する開始コドン(AUG)を取り囲む単一変異の効果分析後に配列GCCRCC(配列番号:79)(式中、R=プリン)として最初に定義された(Kozak(1986)Cell 44:283-292)。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、Kozakコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは改変体を含む。(翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例としては、Andrews et al.の米国特許第5,807,707号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、Chernajovskyの米国特許第5,723,332号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)、Wilsonの米国特許第5,891,665号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
修飾される:本明細書で使用される場合、「修飾される」または「修飾」は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)の状態変化または組成もしくは構造の変化を指す。ポリヌクレオチドは、化学的、構造的、及び/または機能的方法を含む様々な方法で修飾される場合がある。例えば、ポリヌクレオチドは、1つ以上のRNAエレメントを組み込むことによって構造的に修飾されてよく、RNAエレメントは、1つ以上の機能(例えば、翻訳調節活性)を提供する配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、1つ以上の修飾(例えば、1つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾を含んでよく、それらの任意の組合せを含む)で構成されてよい。
核酸塩基:本明細書で使用される場合、「核酸塩基」(あるいは「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」)という用語は、核酸中に見られるプリンまたはピリミジン複素環化合物を指し、核酸またはその一部もしくはセグメントに改善された特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性)を付与する天然に存在するプリン及びピリミジンの任意の誘導体または類似体を含む。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルは、天然核酸に主に見られる核酸塩基である。他の天然、非天然、及び/または合成核酸塩基は、当該技術分野において既知の通り、及び/または本明細書に記載される通り、核酸中に組み込まれ得る。別段の指定がない限り、本明細書に記載される配列番号の核酸塩基配列は、天然核酸塩基及び化学修飾核酸塩基の両方を包含する(例えば、配列番号の「U」表記は、ウラシル及び化学修飾ウラシルの両方を包含する)。
ヌクレオシド/ヌクレオチド:本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)、またはその誘導体もしくは類似体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)に共有結合しているが、ヌクレオシド間連結基(例えば、リン酸基)を欠いている、糖分子(例えば、RNA中のリボースもしくはDNA中のデオキシリボース)、またはその誘導体もしくは類似体を含有する化合物を指す。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基(例えば、リン酸基)に共有結合したヌクレオシド、あるいは核酸またはその一部もしくはセグメントに改善された化学的及び/または機能的特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性)を付与する、その任意の誘導体、類似体、または改変体を指す。
核酸:本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広義に使用され、ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体のポリマーを含む任意の化合物及び/または物質を包含する。これらのポリマーは、多くの場合に「ポリヌクレオチド」と称される。したがって、本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は同等であり、交換可能に使用される。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、DNA-RNAハイブリッド、RNAi誘導剤、RNAi剤、siRNA、shRNA、mRNA、修飾mRNA、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、三重らせん形成を誘導するRNA、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、例えば、β-D-リボ配置を有するLNA、α-L-リボ配置を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)、2’-アミノ官能化を有する2’-アミノ-LNA、及び2’-アミノ官能化を有する2’-アミノ-α-LNAを含む)またはそれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸構造:本明細書で使用される場合、「核酸構造」(「ポリヌクレオチド構造」と交換可能に使用される)という用語は、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び/または核酸(例えば、mRNA)を含む連結ヌクレオチドの配列、あるいはその誘導体または類似体の配置または組織を指す。本用語はまた、核酸の二次元または三次元状態も指す。したがって、「RNA構造」という用語は、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び/またはRNA分子(例えば、mRNA)を含む、連結ヌクレオチドの配列、あるいはその誘導体または類似体の配置または組織を指し、及び/またはRNA分子の二次元及び/または三次元状態を指す。核酸構造は、組織複雑性の増加に基づいて、本明細書において「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称される4つの組織カテゴリーにさらに区分され得る。
オープンリーディングフレーム:本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」という用語は、「ORF」と略され、ポリペプチドをコードするmRNA分子のセグメントまたは領域を指す。ORFは、開始コドンから始まり終止コドンで終わる、重複しないインフレームコドンの連続ストレッチを含み、リボソームによって翻訳される。
開始前複合体(PIC):本明細書で使用される場合、「開始前複合体」(あるいは「43S開始前複合体」、「PIC」と略される)という用語は、40Sリボソームサブユニット、真核生物開始因子(eIF1、eIF1A、eIF3、eIF5)、及びeIF2-GTP-Met-tRNAi
Met三元複合体を含むリボ核タンパク質複合体を指し、mRNA分子の5’キャップに結合して、結合後に5’UTRのリボソームスキャニングを行うことが本質的に可能である。
RNAエレメント:本明細書で使用される場合、「RNAエレメント」という用語は、生物学的機能を提供する、及び/または生物活性(例えば、翻訳調節活性)を有するRNA分子の部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載されるものなどの、1つ以上のRNAエレメントの組込みによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾ポリヌクレオチドに1つ以上の望ましい機能特性を提供する。本明細書に記載されるようなRNAエレメントは、天然に存在する、天然には存在しない、合成、操作したもの、またはそれらの任意の組合せであり得る。例えば、調節活性を提供する天然に存在するRNAエレメントは、ウイルス、原核生物及び真核生物(例えば、ヒト)のトランスクリプトーム全体にわたって見られるエレメントを含む。RNAエレメント、特に真核生物mRNA及び翻訳されたウイルスRNAは、細胞内における多くの機能の仲介に関与していることが示されている。例示的な天然RNAエレメントとしては、翻訳開始エレメント(例えば、内部リボソーム進入部位(IRES)、Kieft et al.,(2001)RNA 7(2):194-206を参照のこと)、翻訳エンハンサーエレメント(例えば、APP mRNA翻訳エンハンサーエレメント、Rogers et al.,(1999)J Biol Chem 274(10):6421-6431を参照のこと)、mRNA安定性エレメント(例えば、AUリッチエレメント(ARE)、Garneau et al.,(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8(2):113-126を参照のこと)、翻訳抑制エレメント(例えば、Blumer et al.,(2002)Mech Dev 110(1-2):97-112を参照のこと)、タンパク質結合RNAエレメント(例えば、鉄応答性エレメント、Selezneva et al.,(2013)J Mol Biol 425(18):3301-3310を参照のこと)、細胞質ポリアデニル化エレメント(Villalba et al.,(2011)Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457)、及び触媒RNAエレメント(例えば、リボザイム、Scott et al.,(2009)Biochim Biophys Acta 1789(9-10):634-641を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。
滞留時間:本明細書で使用される場合、「滞留時間」という用語は、開始前複合体(PIC)またはリボソームがmRNA分子に沿って個別の位置(position)または位置(location)で占有する時間を指す。
翻訳調節活性:本明細書で使用される場合、「翻訳調節活性」(「翻訳調節機能」と交換可能に使用される)という用語は、PIC及び/またはリボソームの活性を含む、翻訳機構の活性を調節する(modulate)(例えば、調節する(regulate)、影響する、制御する、変化させる)生物学的機能、機構、またはプロセスを指す。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、mRNA翻訳の翻訳忠実度を促進及び/または増強する。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、リーキースキャニングを減少させる、及び/または阻害する。
26.均等物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載される本発明に従って、特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験以上のことを行わずに確認することができることになる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
当業者であれば、本明細書に記載される本発明に従って、特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験以上のことを行わずに確認することができることになる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
特許請求の範囲において、「a」、「an」、及び「the」などの冠詞は、特に反対の指示がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、1つまたは2つ以上を意味し得る。群の1つ以上のメンバー間に「または」を含む請求項または説明は、特に反対の指示がない限り、またはさもなければ文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうち1つ、2つ以上、または全てが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、それに用いられる、またはさもなければそれに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に1つのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、それに用いられる、またはさもなければそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーのうち2つ以上、または全てが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、それに用いられる、またはさもなければそれに関連する実施形態を含む。
「を含む」という用語は、オープンであることを意図して、許容するが、追加の要素またはステップの包含を必要としないことにも留意する。「を含む」という用語が本明細書で使用される場合、したがって、「からなる」という用語もまた包含かつ開示される。
範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、別段の指示がない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態に記載されている範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、その範囲における下限値の単位の10分の1まで想定し得ると理解されるべきである。
さらに、先行技術の範囲内である本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか1つ以上から明示的に除外され得ると理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者には既知であるとみなされるため、除外が本明細書で明示的に記載されていなくとも、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態(例えば、それによってコードされる任意の核酸またはタンパク質、任意の作製方法、任意の使用方法など)は、先行技術の存在に関連するか否かを問わず、何らかの理由により任意の1つ以上の請求項から除外され得る。
全ての引用した出典、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、及び本明細書で引用される技術は、引用において明示的に記載されていなくとも、参照によって本出願に組み込まれる。引用した出典と本出願との記載が矛盾する場合は、本出願の記載が優先することとする。
節及び表の見出しは、限定することを意図するものではない。
構築物配列
表7
「G5」とは、mRNA中の全てのウラシル(U)がN1-メチルシュードウラシルで置き換えられていることを意味する。
「G6」とは、mRNA中の全てのウラシル(U)が5-メトキシウラシルで置換されていることを意味する。
表7
「G5」とは、mRNA中の全てのウラシル(U)がN1-メチルシュードウラシルで置き換えられていることを意味する。
「G6」とは、mRNA中の全てのウラシル(U)が5-メトキシウラシルで置換されていることを意味する。
実施例1:OTCをコードするmRNAの合成
ヒトOTCをコードするmRNAを、例えば、配列番号:1または配列番号:2に提供したORF配列(アミノ酸)を使用することによって構築し得る。
OTC
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF(配列番号:1)
OTCバリアント
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKDFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMTDAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYGSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQVATPKGYEPDPSITKLAEQYAKENGTKLSLTNDPLEAARGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF(配列番号:2)
ヒトOTCをコードするmRNAを、例えば、配列番号:1または配列番号:2に提供したORF配列(アミノ酸)を使用することによって構築し得る。
OTC
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKNFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMADAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYSSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQAATPKGYEPDASVTKLAEQYAKENGTKLLLTNDPLEAAHGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF(配列番号:1)
OTCバリアント
MLFNLRILLNNAAFRNGHNFMVRNFRCGQPLQNKVQLKGRDLLTLKDFTGEEIKYMLWLSADLKFRIKQKGEYLPLLQGKSLGMIFEKRSTRTRLSTETGFALLGGHPCFLTTQDIHLGVNESLTDTARVLSSMTDAVLARVYKQSDLDTLAKEASIPIINGLSDLYHPIQILADYLTLQEHYGSLKGLTLSWIGDGNNILHSIMMSAAKFGMHLQVATPKGYEPDPSITKLAEQYAKENGTKLSLTNDPLEAARGGNVLITDTWISMGQEEEKKKRLQAFQGYQVTMKTAKVAASDWTFLHCLPRKPEEVDDEVFYSPRSLVFPEAENRKWTIMAVMVSLLTDYSPQLQKPKF(配列番号:2)
mRNA配列は、ORF配列(ヌクレオチド)に隣接する5’及び3’UTR領域の両方を含む。例示的な構築物において、5’UTR及び3’UTR配列は、それぞれ配列番号:215及び132である。
5’UTR:
GGGAAAUCGCAAAAUUUUCUUUUCGCGUUAGAUUUCUUUUAGUUUUCUUUCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCCGCCGCC(配列番号:215)
3’UTR:
UAAAGCUCCCCGGGGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号:132)
5’UTR:
GGGAAAUCGCAAAAUUUUCUUUUCGCGUUAGAUUUCUUUUAGUUUUCUUUCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCCGCCGCC(配列番号:215)
3’UTR:
UAAAGCUCCCCGGGGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号:132)
別の例示的な構築物において、5’UTR及び3’UTR配列は、それぞれ配列番号:58及び132である。
5’UTR:
GGAAAUCGCAAAAUUUUCUUUUCGCGUUAGAUUUCUUUUAGUUUUCUUUCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCCGCCGCC(配列番号:58)
3’UTR:
UAAAGCUCCCCGGGGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号:132)
5’UTR:
GGAAAUCGCAAAAUUUUCUUUUCGCGUUAGAUUUCUUUUAGUUUUCUUUCAACUAGCAAGCUUUUUGUUCUCGCCGCCGCC(配列番号:58)
3’UTR:
UAAAGCUCCCCGGGGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号:132)
OTC mRNA配列を、修飾mRNAとして調製する。特に、インビトロ転写中、修飾mRNAを、mRNAがウリジンの代わりにN1-メチルシュードウリジンを100%含有することを確実にするために、N1-メチルシュードウリジン-5’-三リン酸を使用して生成し得る。あるいは、インビトロ転写中、修飾mRNAを、mRNAがウリジンの代わりに5-メトキシウリジンを100%含有することを確実にするために、N1-メトキシウリジン-5’-三リン酸を使用して生成し得る。さらに、OTC-mRNAを、ポリA尾部を導入するプライマーを用いて合成し得、キャップ構造を、m7Gp-ppGm-A5’キャップ1を組み込むために、m7Gp-ppGm-Aを介した共転写キャッピングを使用して両方のmRNA上に生成する。あるいは、OTC-mRNAを合成し、DNA鋳型のGibson assembly中にポリA尾部を導入し得る。
以下の実施例で試験したOTC mRNA(全て、ウリジンの代わりにN1-メチルシュードウリジンを100%含有する)の説明を、上記の表7に提供する。
実施例2:ナノ粒子組成物の作製
A.ナノ粒子組成物の作製
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば、マイクロ流体及び2つの流体流(その一方がポリヌクレオチドを含有し、他方が脂質成分を有する)のT字型混合などで作製することができる。
A.ナノ粒子組成物の作製
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば、マイクロ流体及び2つの流体流(その一方がポリヌクレオチドを含有し、他方が脂質成分を有する)のT字型混合などで作製することができる。
脂質組成物を、本明細書に開示したイオン化可能なアミノ脂質、例えば、化合物IIなどの式(I)による脂質または化合物VIなどの式(III)による脂質、リン脂質(DOPEまたはDSPCなど、Avanti Polar Lipids,Alabaster,ALから入手可能)、PEG脂質(1,2ジミリストイルsnグリセロールメトキシポリエチレングリコールなど、PEG-DMGとしても知られる、Avanti Polar Lipids,Alabaster,ALから入手可能)、ならびに構造脂質(コレステロール、Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germanyから入手可能、もしくはコルチコステロイド(プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど)、またはそれらの組合せなど)を、エタノール中約50mMの濃度で組み合わせることによって調製する。溶液を、例えば、-20℃で保存するために冷蔵しなければならない。脂質を、所望のモル比を得るように組み合わせて、約5.5mM~約25mMの最終脂質濃度まで水及びエタノールで希釈する。
ポリヌクレオチド及び脂質組成物を含むナノ粒子組成物を、脂質溶液とポリヌクレオチドを含む溶液とを、脂質組成物対ポリヌクレオチドのwt:wt比を約5:1~約50:1で組み合わせることによって調製する。脂質溶液を、NanoAssemblrマイクロ流体ベースのシステムを使用し、約10ml/分~約18ml/分の流速でポリヌクレオチド溶液に迅速に注入し、約1:1~約4:1の水対エタノール比を有する懸濁液を作製する。
RNAを含むナノ粒子組成物については、脱イオン水中0.1mg/mlの濃度のRNA溶液を、50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液中においてpH3~4で希釈し、ストック溶液を形成する。
ナノ粒子組成物を透析によって処理し、エタノールを除去して緩衝液交換を行うことができる。製剤を、10kDの分子量カットオフを用いたSlide-A-Lyzer cassettes(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rockford,IL)を使用し、一次生成物の200倍の体積のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)に対して2回透析する。最初の透析を室温で3時間実施する。次いで、製剤を4℃で一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、0.2μm滅菌フィルター(Sarstedt,Numbrecht,Germany)に通してガラスバイアル中に濾過し、クリンプクロージャーで密閉する。一般に、0.01mg/ml~0.10mg/mlのナノ粒子組成物溶液を得る。
上に記載した方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。T字型及び直接注入を含むが、これらに限定されない代替プロセスも、同じナノ沈殿を達成するために使用できる。
B.ナノ粒子組成物の特徴付け
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を使用し、ナノ粒子組成物の粒径、多分散指数(PDI)及びゼータ電位を、粒径の決定では1×PBS中において、及びゼータ電位の決定では15mM PBS中において決定できる。
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を使用し、ナノ粒子組成物の粒径、多分散指数(PDI)及びゼータ電位を、粒径の決定では1×PBS中において、及びゼータ電位の決定では15mM PBS中において決定できる。
紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチド(例えば、RNA)の濃度を決定できる。1×PBS中の100μLの希釈製剤を、900μLのメタノール及びクロロホルムの4:1(v/v)混合液に添加する。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、DU800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上で、例えば、230nm~330nmで記録する。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの濃度を、組成物中で使用したポリヌクレオチドの消衰係数に基づいて、及び例えば、260nmの波長における吸光度と、例えば、330nmの波長におけるベースライン値との差に基づいて算出できる。
RNAを含むナノ粒子組成物については、QUANT-IT(商標)RIBOGREEN(登録商標)RNAアッセイ(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)を使用して、ナノ粒子組成物によるRNAのカプセル化を評価できる。試料をTE緩衝液(10mMのTris-HCl、1mMのEDTA、pH7.5)中でおよそ5μg/mLの濃度に希釈する。50μLの希釈試料をポリスチレン96ウェルプレートに移し、50μLのTE緩衝液または50μLの2%Triton X-100溶液のいずれかをウェルに添加する。プレートを37℃の温度で15分間インキュベートする。RIBOGREEN(登録商標)試薬をTE緩衝液中で1:100に希釈し、100μLの本溶液を各ウェルに添加する。蛍光強度を、蛍光プレートリーダー(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter、Perkin Elmer,Waltham,MA)を使用して、例えば、約480nmの励起波長及び例えば、約520nmの発光波長で測定できる。試薬ブランクの蛍光値を各試料の蛍光値から差し引き、インタクトな試料(Triton X-100を添加しない)の蛍光強度を、破壊した試料(Triton X-100の添加によって生じる)の蛍光値で割ることによって遊離RNAの割合を決定する。
ナノ粒子組成物の例示的な製剤を以下の表8に提示する。「化合物」という用語は、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、MC3、化合物II、化合物VI、または化合物Bなどを指す。「リン脂質」は、DSPCまたはDOPEであり得る。「PEG脂質」は、PEG-DMGまたは化合物Iであり得る。
実施例3:OTC mRNAバリアントの設計及び合成
mRNAを、OTCをコードするコドン最適化ORFならびにバリアント5’UTR、バリアント3’UTR、及び安定化尾部を含む、最適化mRNA制御エレメントを用いて生成した。生成及び試験したmRNA配列の概要を上記表7に記載している。
mRNAを、OTCをコードするコドン最適化ORFならびにバリアント5’UTR、バリアント3’UTR、及び安定化尾部を含む、最適化mRNA制御エレメントを用いて生成した。生成及び試験したmRNA配列の概要を上記表7に記載している。
5’UTR
バリアント5’UTRを設計し、OTCタンパク質発現及びOTC活性をインビボで試験した。Spf-ashマウスに、LNP-1に製剤化した、様々な5’UTRを有する0.5mg/kgのOTC mRNA(OTC_01~OTC_05、表7を参照のこと)を投薬した。PBSを対照として投与した。投薬2日後または8日後に動物を犠牲にし、肝臓を液体窒素中で急速凍結した。タンパク質を、ミトコンドリア溶解緩衝液中のおよそ50mgの凍結肝臓組織から、ホモジナイザーを使用して抽出した。タンパク質濃度をBCAアッセイによって決定した。OTC酵素活性を、5μgの肝臓抽出物中において以前に記載された比色アッセイを使用して決定した(Ceriotti,G.Clin Chim Acta 1973,47:97-105)。
バリアント5’UTRを設計し、OTCタンパク質発現及びOTC活性をインビボで試験した。Spf-ashマウスに、LNP-1に製剤化した、様々な5’UTRを有する0.5mg/kgのOTC mRNA(OTC_01~OTC_05、表7を参照のこと)を投薬した。PBSを対照として投与した。投薬2日後または8日後に動物を犠牲にし、肝臓を液体窒素中で急速凍結した。タンパク質を、ミトコンドリア溶解緩衝液中のおよそ50mgの凍結肝臓組織から、ホモジナイザーを使用して抽出した。タンパク質濃度をBCAアッセイによって決定した。OTC酵素活性を、5μgの肝臓抽出物中において以前に記載された比色アッセイを使用して決定した(Ceriotti,G.Clin Chim Acta 1973,47:97-105)。
図1Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。2日目及び8日目のOTC発現は、親mRNAと比較して、OTC_03mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図1A、OTC_03とOTC_01との比較)。
図1Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。2日目及び8日目のOTC活性は、親mRNAと比較して、OTC_03mRNAを投与したマウスで統計的に有意に増加した(図1B、OTC_03とOTC_01との比較)。
3’UTR
バリアント3’UTRを有するmRNAを設計した(OTC_06~OTC_09、表7を参照のこと)。OTCタンパク質発現及びOTC活性を、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。
バリアント3’UTRを有するmRNAを設計した(OTC_06~OTC_09、表7を参照のこと)。OTCタンパク質発現及びOTC活性を、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。
図2Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。2日目のOTC発現は、親mRNAと比較してOTC_09mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加する傾向があり(図2A、OTC_09とOTC_01との比較)、8日目に統計的に有意な増加に到達した。同じ傾向をOTC_07mRNAでも観察した(図2A、OTC_07とOTC_01との比較)。
図2Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。2日目及び8日目のOTC活性は、親mRNAと比較して、OTC_09mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図2B、OTC_09とOTC_01との比較)。2日目のOTC活性は、親mRNAと比較してOTC_07mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加する傾向があり(図2B、OTC_07とOTC_01との比較)、8日目に統計的に有意な増加に到達した。
5’UTR及び3’UTRの組合せ
mRNAを、配列番号:58の5’UTR及び様々な3’UTRを有するように設計した(OTC_10及びOTC_11、表7を参照のこと)。OTCタンパク質発現及びOTC活性を、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。
mRNAを、配列番号:58の5’UTR及び様々な3’UTRを有するように設計した(OTC_10及びOTC_11、表7を参照のこと)。OTCタンパク質発現及びOTC活性を、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。
図3Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。各時点でのOTC発現は、PBS対照と比較して、OTC_10mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図3A、OTC_10を参照のこと)。2日目及び8日目のOTC発現は、PBS対照と比較して、OTC_11mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図3A、OTC_11を参照のこと)。
図3Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。各時点でのOTC活性は、PBS対照と比較して、OTC_10mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図3B、OTC_10を参照のこと)。2日目及び8日目のOTC活性は、PBS対照と比較して、OTC_11mRNAを投薬したマウスで統計的に有意に増加した(図3B、OTC_11を参照のこと)。
5’及び3’UTRの組合せの有効性をインビボで試験するために、OTC誘導マウスに、タモキシフェン誘導の15日後、LNP-1に製剤化したmRNA OTC_01、OTC_10、及びOTC_11を0.75mg/kg投薬した。LNP-1に製剤化した緑色蛍光タンパク質(GFP)mRNAを対照として使用した(タモキシフェン誘導の有無にかかわらず)。体重をモニターした。
図4Aは、タモキシフェン誘導後の示した日数における体重のパーセンテージを示すグラフである。OTCの投薬によって、GFP対照と比較して体重減少が縮小し、OTCの発現増加と一致した。
図4Bは、脂質ナノ粒子の投与後、示した日数での生存パーセンテージを示すグラフである。OTC_10を投与したマウスは、投薬後およそ4週間生存した。
ポリA尾部
バリアントポリA尾部を設計し、OTCタンパク質発現及び活性を、NPI-Lucを対照として用いて、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。NPI-Lucは、核局在化配列及び5回反復したMyc V5タグを含有するルシフェラーゼレポーターである。簡潔に述べると、OTC_01mRNAを、A100ポリA尾部(配列番号:195)(非保護mRNA)または逆デオキシチミジンに3’-3’結合したA100-UCUAG-A20ポリA尾部(idT保護mRNA)(配列番号:211)のいずれかを含有して調製した。mRNAをLNP-1に製剤化した。mRNAの有効性を評価するために、マウスに高タンパク質食を給餌し、体重、生存確率、及びアンモニアレベルをモニターすることによって有効性を評価した。
バリアントポリA尾部を設計し、OTCタンパク質発現及び活性を、NPI-Lucを対照として用いて、上記の5’UTRバリアントについて記載したようにインビボで試験した。NPI-Lucは、核局在化配列及び5回反復したMyc V5タグを含有するルシフェラーゼレポーターである。簡潔に述べると、OTC_01mRNAを、A100ポリA尾部(配列番号:195)(非保護mRNA)または逆デオキシチミジンに3’-3’結合したA100-UCUAG-A20ポリA尾部(idT保護mRNA)(配列番号:211)のいずれかを含有して調製した。mRNAをLNP-1に製剤化した。mRNAの有効性を評価するために、マウスに高タンパク質食を給餌し、体重、生存確率、及びアンモニアレベルをモニターすることによって有効性を評価した。
図5Aは、脂質ナノ粒子の投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。idT保護mRNAのOTC活性は、非保護尾部と比較して7日目に高い傾向を示した(図5A、下、OTC_01idTを参照のこと)。
図5Bは、脂質ナノ粒子の投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。id保護mRNAのOTC発現は、非保護尾部と比較して7日目に統計的に有意に増加する傾向があった(図5B、下、OTC_01idTを参照のこと)。
図6Aは、脂質ナノ粒子の投薬後、示した日数における体重のパーセンテージを示すグラフである。OTC mRNAをカプセル化する脂質ナノ粒子の投薬によって、ルシフェラーゼ対照と比較して体重減少が縮小した。
図6Bは、脂質ナノ粒子の投薬後、示した日数での生存パーセンテージを示すグラフである。
図7は、脂質ナノ粒子の投薬後、示した日数でのアンモニアレベルを示すグラフである。OTCをコードするidT保護mRNAを投薬したマウスは、OTCをコードする非保護mRNAを投薬したマウスのレベルと比較した場合、26日目のアンモニアレベルが低かった(図7)。
実施例4:OTC mRNAを発現するための脂質ナノ粒子製剤
OTC発現及び/または活性に対する様々な脂質ナノ粒子製剤の影響を試験した。表10は、試験した各脂質ナノ粒子製剤に使用したイオン化可能なアミノ脂質及びPEG脂質を列挙している。
OTC発現及び/または活性に対する様々な脂質ナノ粒子製剤の影響を試験した。表10は、試験した各脂質ナノ粒子製剤に使用したイオン化可能なアミノ脂質及びPEG脂質を列挙している。
肝細胞におけるOTC発現及びOTC活性を、LNP1~4を用いてSpf-ashマウスで評価した。NPI-Lucレポーターを、表10に記載したLNP1~4の投薬後に非ヒト霊長類(NHP)モデルで試験した。肝細胞における発現を決定するために、マウス及びNHPにLNP1~4(マウスには0.5mg/kg、NHPには2mg/kg)を投薬し、肝細胞発現パーセンテージを、免疫組織化学染色画像から(LNP-1について)、またはルシフェラーゼ-mRNA負荷LNPを使用することによって(LNP2~4について)推定した。野生型マウスOTC活性の増加パーセンテージを決定するために、肝細胞発現%と活性との間に直線関係があると仮定し、ほぼ全ての肝細胞がmRNAを発現している場合、LNP-1の活性の実験的に決定した20%の増加を比例とみなした。NHPについては、野生型マウスOTC活性の増加パーセンテージを、肝細胞発現パーセンテージから外挿した。表11は結果を提供する。
早期及び後期発症の両方のOTCD患者にとって、真に疾患修飾性であるためには、およそ25%の野生型OTC活性が必要であると推定する。ヒト野生型OTC活性は、マウス活性の3分の2である。
OTC発現及び活性に対する脂質ナノ粒子製剤のインビボ効果を試験するために、Spf-ashマウスにOTC_01mRNAをカプセル化しているLNP-2~LNP-7の1つを0.5mg/kg投薬した。PBSを対照として使用した。投薬の2日後に肝臓を採取し、上記実施例3に記載したようにOTC発現及び活性について分析した。
図8Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。2日目のOTC発現は、LNP-1、-4、-5、-6、及び-7を投与したマウスで有意に改善した。LNP-4のPKパラメータは組織クリアランスの観点からはるかに有利であり、OTC-mRNA療法に必要な反復投薬を支持することから、LNP-4がLNP-3と同等に十分機能したことは重要である。また、実施例6~11で証明した通り、LNP-4がLNP-2よりも有意に良好に機能したことも重要である。
図8Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。これらのデータは図7Aと同じ結論を示し、LNP-4は、LNP-2よりも大きなOTC活性、及びLNP-3と同等の活性を可能にし、OTC-mRNA療法を目的とした臨床脂質としてのLNP-4の使用を支持する。
図8Cは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬から2日後のOTC免疫組織化学Hスコアを示すグラフである。これは、IHCによって決定したような発現総量に加えて、肝細胞発現%を組み込んだ測定基準である。これらのデータは、図8A及び8Bと同じ結論を示し、LNP-4はLNP-2よりも優れ、LNP-3と同様に機能する。
実施例5:OTCタンパク質バリアントの設計及び合成
OTC変異体(OTC_12、表7を参照のこと)をコードするコドン最適化mRNAを生成し、実施例3に記載したようにOTC発現及び活性について試験した。本変異体は、比活性の増加したOTCバリアントを同定するために実施したスクリーニングの結果であった。
OTC変異体(OTC_12、表7を参照のこと)をコードするコドン最適化mRNAを生成し、実施例3に記載したようにOTC発現及び活性について試験した。本変異体は、比活性の増加したOTCバリアントを同定するために実施したスクリーニングの結果であった。
図9Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。
図9Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。OTC_12の発現はOTC_10の発現ほど高くはなかったという知見にもかかわらず、PBS対照と比較してOTC_12では持続的かつ有意なOTC活性を観察した。
OTC変異体の有効性を、実施例3に記載したようにOTC誘導マウスモデルで評価した。
図10Aは、タモキシフェン誘導後の示した日数における体重のパーセンテージを示すグラフである。OTC変異体の投薬によって、GFP対照と比較して体重減少が縮小した。これらのデータは、OTC_12がOTC_10と同様に発現しなかったという知見にもかかわらず、タモキシフェン誘導による内因性OTCタンパク質の消失後の体重維持という観点から、これら2つのmRNAが同等に十分機能することを示している。
図10Bは、脂質ナノ粒子の投与後、示した日数での生存パーセンテージを示すグラフである。OTC_10及びOTC_12を投与したマウスは、投薬後およそ4週間生存した。この結果は、OTC_12バリアントの比活性の増加と一致する。存在するタンパク質が少なかったとしても、同等の有効性を観察した。
実施例6:試料製剤の発現、クリアランス、及び忍容性
組織内に脂質が大量に蓄積すると、毒性作用を引き起こし得るため、望ましくない。一方で、組織内で迅速に代謝される脂質は、例えば、mRNAなどの治療剤を、効果が出るまで細胞に十分に送達できない。実施例7~11の試験の目的は、最適な代謝安定性を有し、強力な脂質ナノ粒子ももたらすアミノ脂質を同定することである。表12は、実施例7~11で評価したイオン化可能なアミノ脂質を示す。
組織内に脂質が大量に蓄積すると、毒性作用を引き起こし得るため、望ましくない。一方で、組織内で迅速に代謝される脂質は、例えば、mRNAなどの治療剤を、効果が出るまで細胞に十分に送達できない。実施例7~11の試験の目的は、最適な代謝安定性を有し、強力な脂質ナノ粒子ももたらすアミノ脂質を同定することである。表12は、実施例7~11で評価したイオン化可能なアミノ脂質を示す。
以下では、上記化合物のいくつかの合成を図示する。
中間体の合成
8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:3-ブチルヘプト-2-エン酸エチルの合成
トリエチルホスホノアセテート(9.07mL、45.7mmol)を、水素化ナトリウム(1.83g、45.7mmol)のTHF(14mL)懸濁液に20分かけて滴下し、ガス発生が停止するまで(およそ30分)混合物を室温で撹拌した。反応混合物を0℃まで冷却し、5-ノナノン(6.05mL、35.2mmol)を分割して添加した。反応物を徐々に室温まで加温し、還流下で24時間撹拌した。飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチする前に、反応物を室温まで冷却した。水相をジエチルエーテルで抽出して有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させて(MgSO4)濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(0~20%EtOAc:ヘキサン)によって精製し、3-ブチルヘプト-2-エン酸エチル(5.27g、24.8mmol、71%)を透明な油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.62 (s, 1H);4.14 (q, 2H, J = 6.0 Hz);2.59 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.14 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.50-1.23 (m, 11H);0.99-0.82 (m, 6H).
8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:3-ブチルヘプト-2-エン酸エチルの合成
ステップ2:3-ブチルヘプタン酸エチルの合成
撹拌棒を備えたスチール製Parr反応器に、エタノール(50mL)中の3-ブチルヘプト-2-エン酸エチル(10.5g、49.5mmol)を充填した。水酸化パラジウム炭素(1.04g、7.42mmol)を添加し、容器を密閉して排気し、H2ガス(3×)を再充填して圧力を200psiに設定した。反応物を500rpmで200psiのH2ガス下において、室温で2時間撹拌した。次いで、容器を排気し、N2ガスを再充填して開栓した。粗反応混合物をCeliteパッドに通して濾過した。CeliteパッドをEtOHで洗浄して粗物質を濃縮し、3-ブチルヘプタン酸エチル(9.69g、45.2mmol、91%)を透明な油として得た。化合物を、さらに精製することなく次のステップに進めた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.12 (q, 2H, J = 9.0 Hz);2.22 (d, 2H, J = 6.0 Hz);1.90-1.76 (m, 1H);1.38-1.19 (m, 15H);0.88 (br. t, 6H, J = 6.0 Hz).
ステップ3:3-ブチルヘプタン-1-オールの合成
乾燥エーテル(23mL)中の水素化アルミニウムリチウム(850mg、22.4mmol)の混合物に、N2下において0℃で、乾燥エーテル(15mL)中の3-ブチルヘプタン酸エチル(4.00g、18.7mmol)を滴下した。混合物を室温で2.5時間撹拌してから0℃まで冷却した。水(LiAlH4の1gあたり1mL)を溶液に滴下し、続いて15%水酸化ナトリウム(LiAlH4の1gあたり1mL)及び水(LiAlH4の1gあたり3mL)をゆっくりと添加した。溶液を室温で数分間撹拌し、Celiteパッドに通して濾過した。Celiteパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(0~40%EtOAc:ヘキサン)によって精製し、3-ブチルヘプタン-1-オール(3.19g、18.5mmol、99%)を透明な油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3.66 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.53 (q, 2H, J = 6.0 Hz);1.46-1.36 (m, 1H);1.35-1.21 (m, 12H);1.18 (br. s, 1H);0.89 (br. t, 6H, J = 6.0 Hz).
ステップ4:8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
3-ブチルヘプタン-1-オール(3.19g、18.5mmol)、8-ブロモオクタン酸(4.96g、22.2mmol)、及びDMAP(453mg、3.71mmol)の塩化メチレン(32mL)溶液に0℃で、EDCI(5.33g、27.8mmol)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を0℃まで冷却し、10%塩酸溶液(150mL)を20分かけてゆっくりと添加した。層を分離し、有機層を真空中で濃縮して粗油を得た。油をヘキサン(150mL)中に溶解し、アセトニトリル(150mL)及び5%重炭酸ナトリウム(150mL)の混合液で洗浄した。ヘキサン層を分離し、乾燥させて(MgSO4)濾過した。溶媒を真空下で除去し、8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル(6.90g、18.3mmol、99%)を透明な油として得た。化合物を、さらに精製することなく次のステップに進めた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.08 (t, 2H, J = 6.0 Hz);3.40 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.85 (五重線, 2H, J = 6.0 Hz);1.69-1.52 (m, 4H);1.49-1.20 (m, 19H);0.89 (br. t, 6H, J = 6.0 Hz).
8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イル
8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
ヘプタデカン-9-オール、8-ブロモオクタン酸、及びDMAPの塩化メチレン溶液にEDCを添加し、8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イルを得た。
8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
8-ブロモオクタン酸3-ペンチルオクチル
ステップ1:3-ペンチルオクト-2-エン酸エチルの合成
トリエチルホスホノアセテート(10.6mL、53.4mmol)を、水素化ナトリウム(2.13g、53.4mmol)のTHF(16mL)懸濁液に20分かけて滴下し、ガス発生が停止するまで(およそ30分)混合物を室温で撹拌した。反応混合物を0℃まで冷却し、6-ウンデカノン(8.42mL、41.1mmol)を分割して添加した。反応物を徐々に室温まで加温し、還流下で60時間撹拌した。飽和重炭酸ナトリウム水溶液でクエンチする前に、反応物を室温まで冷却した。水相をジエチルエーテルで抽出して有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させて(MgSO4)濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(0~20%EtOAc:ヘキサン)によって精製し、3-ペンチルオクト-2-エン酸エチル(8.76g、36.5mmol、89%)を透明な油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.61 (s, 1H);4.14 (q, 2H, J = 6.0 Hz);2.58 (ddd, 2H, J = 9.0, 9.0, 6.0 Hz);2.13 (ddd, 2H, J = 6.0, 6.0, 3.0 Hz);1.52-1.38 (m, 3H);1.38-1.23 (m, 12H);0.93-0.86 (m, 6H).
ステップ1:3-ペンチルオクト-2-エン酸エチルの合成
ステップ2:3-ペンチルオクタン酸エチルの合成
撹拌棒を備えたスチール製Parr反応器に、エタノール(37mL)中の3-ペンチルオクト-2-エン酸エチル(8.76g、36.5mmol)を充填した。水酸化パラジウム炭素(768mg、5.47mmol)を添加し、容器を密閉して排気し、H2ガス(3×)を再充填して圧力を200psiに設定した。反応物を500rpmで200psiのH2ガス下において、室温で2時間撹拌した。次いで、容器を排気し、N2ガスを再充填して開栓した。粗反応混合物をCeliteパッドに通して濾過した。CeliteパッドをEtOHで洗浄して粗物質を濃縮し、3-ペンチルオクタン酸エチル(8.45g、34.9mmol、96%)を透明な油として得た。化合物をさらに精製することなく次のステップに進めた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.12 (q, 2H, J = 6.0 Hz);2.22 (d, 2H, J = 6.0 Hz);1.92-1.77 (br. m, 1H);1.37-1.19 (m, 19H);0.88 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
ステップ3:3-ペンチルオクタン-1-オールの合成
乾燥エーテル(42mL)中の水素化アルミニウムリチウム(1.59g、41.8mmol)の混合物に、N2下において0℃で、乾燥エーテル(28mL)中の3-ペンチルオクタン酸エチル(8.45g、34.9mmol)を滴下した。混合物を室温で2.5時間撹拌してから0℃まで冷却した。水(LiAlH4の1gあたり1mL)を溶液に滴下し、続いて15%水酸化ナトリウム(LiAlH4の1gあたり1mL)及び水(LiAlH4の1gあたり3mL)をゆっくりと添加した。溶液を室温で数分間撹拌し、Celiteパッドに通して濾過した。Celiteパッドをジエチルエーテルで洗浄し、濾液を濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(0~40%EtOAc:ヘキサン)によって精製し、3-ペンチルオクタン-1-オール(6.98g、34.9mmol、100%)を透明な油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3.66 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.53 (q, 2H, J = 6.0 Hz);1.47-1.37 (br. s, 1H);1.36-1.15 (m, 17H);0.88 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
ステップ4:8-ブロモオクタン酸3-ペンチルオクチルの合成
3-ペンチルオクタン-1-オール(2.00g、9.98mmol)、8-ブロモオクタン酸(2.67g、12.0mmol)、及びDMAP(244mg、2.00mmol)の塩化メチレン(18mL)溶液に0℃で、EDCI(2.87g、15.0mmol)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を0℃まで冷却し、10%塩酸溶液(70mL)を20分かけてゆっくりと添加した。層を分離し、有機層を真空中で濃縮して粗油を得た。油をヘキサン(70mL)中に溶解し、アセトニトリル(70mL)及び5%重炭酸ナトリウム(70mL)の混合液で洗浄した。ヘキサン層を分離し、乾燥させて(MgSO4)濾過した。溶媒を真空下で除去し、8-ブロモオクタン酸3-ペンチルオクチル(3.94g、9.72mmol、97%)を透明な油として得た。化合物をさらに精製することなく次のステップに進めた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.08 (t, 2H, J = 6.0 Hz);3.40 (t, 2H, J = 6.0 Hz);3.29 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.85 (五重線, 2H, J = 6.0 Hz);1.68-1.52 (m, 4H);1.49-1.19 (m, 23H);0.88 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチル
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチルの合成
N-(3-アミノプロピル)カルバミン酸tert-ブチル(15.5g、88.8mmol)のEtOH(38mL)溶液に、EtOH(36mL)中の8-ブロモオクタン酸3-ペンチルオクチル(6.00g、14.8mmol)を20分かけて添加した。反応物を60℃まで加熱し、この温度で16時間撹拌させた。冷却時、溶媒を蒸発させて残留物を酢酸エチルで希釈し、水層で白色沈殿物を観察しなくなるまで、飽和NaHCO3水溶液及びブライン(5×)で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄して乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(ジクロロメタン中0~5~10~25~50~100%(ジクロロメタン中、1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチル(4.23g、8.49mmol、57%)を透明な油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.17 (br. s, 1H);4.07 (t, 2H, J = 6.0 Hz);3.19 (br. q, 2H, J = 6.0 Hz);2.66 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.56 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.28 (t, 2H, J = 6.0 Hz);1.70-1.52 (m, 6H);1.51-1.39 (m, 3H);1.44 (s, 9H);1.36-1.19 (m, 22H);0.88 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチルの合成
3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオン
3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオンの合成
3,4-ジメトキシ-3-シクロブテン-1,2-ジオン(1g、7mmol)の100mLのジエチルエーテル溶液に、2MメチルアミンのTHF溶液(3.8mL、7.6mmol)を添加し、ほぼすぐに沈殿物を形成した。混合物を室温で24時間撹拌し、次いで濾過して、濾過した固体をジエチルエーテルで洗浄して風乾させた。濾過した固体を熱EtOAc中に溶解し、濾過して濾液を室温まで冷却し、次いで0℃まで冷却して沈殿物を得た。これを濾過によって単離し、冷EtOAcで洗浄して風乾させ、次いで真空下で乾燥させて、3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオン(0.70g、5mmol、73%)を白色固体として得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: ppm 8.50 (br. d, 1H, J = 69 Hz);4.27 (s, 3H);3.02 (sdd, 3H, J = 42 Hz, 4.5 Hz).
3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオンの合成
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: ppm 8.50 (br. d, 1H, J = 69 Hz);4.27 (s, 3H);3.02 (sdd, 3H, J = 42 Hz, 4.5 Hz).
最終化合物の合成
化合物22:8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:8-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イル(10g、21.67mmol)及びエタノールアミン(39.70g、649.96mmol)のEtOH(5mL)溶液を、65℃まで16時間加熱した。反応物を室温まで冷却し、酢酸エチル中に溶解して水(4×)で抽出した。有機層を分離してブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させて濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を、DCM中0~100%(20%MeOH、80%DCM、1%NH4OHの溶液)によるフラッシュクロマトグラフィー(ISCO)によって精製し、8-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イル(7.85g、82%)を得た。
UPLC/ELSD: RT = 2.06 分.C27H55NO3についてMS (ES): m/z (MH+) 442.689. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.89 (p, 1H);3.66 (t, 2H);2.79 (t, 2H);2.63 (m, 2H);2.30 (t, 2H);1.77-1.20 (m, 40H);0.90 (m, 6H).
化合物22:8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:8-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
UPLC/ELSD: RT = 2.06 分.C27H55NO3についてMS (ES): m/z (MH+) 442.689. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.89 (p, 1H);3.66 (t, 2H);2.79 (t, 2H);2.63 (m, 2H);2.30 (t, 2H);1.77-1.20 (m, 40H);0.90 (m, 6H).
ステップ2:化合物22:8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル(6.15g、16.31mmol)及び8-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イル(6.86g、15.53mmol)のCPME(15mL)及びアセトニトリル(6mL)混合物溶液に、炭酸カリウム(8.59g、62.12mmol)及びヨウ化カリウム(2.84g、17.08mmol)を添加した。反応物を77℃で16時間撹拌した。反応物を冷却して濾過し、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残留物を、DCM中0~100%(20%MeOH、80%DCM、1%NH4OHの溶液)によるフラッシュクロマトグラフィー(ISCO)によって精製し、8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(2-ヒドロキシエチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(4.53g、37.8%)を得た。
UPLC/ELSD: RT = 3.04 分.C46H91NO5についてMS (ES): m/z (MH+) 739.464. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.89 (p, 1H);4.11 (m, 2H), 3.57 (bm, 2H);2.73-2.39 (m, 6H);2.30 (m, 4H);1.72-1.17 (m, 64H);0.92 (m, 12H).
UPLC/ELSD: RT = 3.04 分.C46H91NO5についてMS (ES): m/z (MH+) 739.464. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.89 (p, 1H);4.11 (m, 2H), 3.57 (bm, 2H);2.73-2.39 (m, 6H);2.30 (m, 4H);1.72-1.17 (m, 64H);0.92 (m, 12H).
化合物27:8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
N-(3-アミノプロピル)カルバミン酸tert-ブチル(34.35g、197.15mmol)のEtOH(200mL)溶液を65℃まで加熱し、8-ブロモオクタン酸ヘプタデカン-9-イル(26g、56.33mmol)のEtOH(90mL)溶液を3時間かけて添加した。反応物を65℃で3時間加熱した。反応物を50℃未満まで冷却し、EtOHを真空下で蒸発させてヘプタン(4×)と共沸した。粗生成物の2-MeTHF(150mL)溶液に、5%K2CO3(150mL)を添加し、得られた混合物を10分間撹拌した。2つの層を形成した。水層を除去し、2-MeTHF層を100mLの水(×3)で洗浄した。有機層を分離してブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させて濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を、DCM中0~100%(20%MeOH、80%DCM、1%NH4OHの溶液)によるフラッシュクロマトグラフィー(ISCO)によって精製し、8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イル(20g、63.9%)を得た。UPLC/ELSD: RT = 2.34 分.C33H66N2O4についてMS (ES): m/z (MH+) 555.319. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.18 (bs, 1H);4.89 (p, 1H);3.22 (m, 2H);2.64 (t, 2H);2.59 (t, 2H);2.30 (t, 2H);1.73-1.21 (m, 50H);0.90 (m, 6H).
ステップ1:8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イルの合成
ステップ2:8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸ヘプタデカン-9-イル(11.76g、21.19mmol)及び8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル(9.2g、24.37mmol)のプロピオニトリル(52mL)溶液に、炭酸カリウム(4.39g、31.79mmol)及びヨウ化カリウム(0.53g、3.18mmol)を添加した。反応物を80℃で16時間加熱した。反応物を冷却して濾過し、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残留物を、DCM中0~100%(20%MeOH、80%DCM、1%NH4OHの溶液)によるフラッシュクロマトグラフィー(ISCO)によって精製し、8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(9.68g、53.6%)を得た。UPLC/ELSD: RT = 3.07 分.C52H102N2O6についてMS (ES): m/z (MH+) 851.216.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.68 (bs, 1H);4.90 (p, 1H);4.11 (t, 2H);3.20 (m, 2H);2.52-2.24 (m, 10H);1.76-1.20 (m, 74H);0.90 (m, 12H).
ステップ3:8-((3-アミノプロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(7g、8.22mmol)のDCM(25mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(9.4mL、123.32mmol)を添加した。反応物を室温で2時間撹拌した。反応物を真空下で蒸発させた。残留物をメチルTHF/ヘプタン(1:9)の混合物中に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム(3×)で抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄してNa2SO4で乾燥させ、濾過して真空下で蒸発させ、8-((3-アミノプロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルを得た。これをさらに精製することなく粗物質として次のステップに移した。UPLC/ELSD: RT = 2.63 分.C47H94N2O4についてMS (ES): m/z (MH+) 751.305.
ステップ4:化合物27:8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-((3-アミノプロピル)(8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(7g、9.32mmol)のメチルTHF(31mL)溶液に、3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオン(1.71g、12.11mmol)、及び10%重炭酸ナトリウム水溶液(8.6mL、10.25mmol)を添加した。反応物を50℃で2.5時間撹拌した。反応物を室温まで冷却し、ヘプタンで希釈して水で抽出した。有機層を分離してブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させて濾過し、真空下で蒸発させた。残留物を、DCM中0~100%(20%MeOH、80%DCM、1%NH4OHの溶液)によるフラッシュクロマトグラフィー(ISCO)によって精製し、8-((8-(ヘプタデカン-9-イルオキシ)-8-オキソオクチル)(3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(5.4g、63%)を得た。UPLC/ELSD: RT = 2.98 分.C52H97N3O6についてMS (ES): m/z (MH+) 861.714.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.89 (p, 1H);4.10 (t, 2H);3.75 (m, 2H);3.39-3.20 (m, 5H);3.08 (m, 4H);2.31 (m, 4H);2.12 (bm, 2H);1.81-1.20 (m, 65H);0.90 (m, 12H).
化合物30:8,8’-((3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)
ステップ1:8,8’-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)の合成
8-ブロモオクタン酸3-ペンチルオクチル(5.61g、13.8mmol)及び8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチル(6.00g、12.0mmol)のプロピオニトリル(30mL)溶液に、炭酸カリウム(2.49g、18.0mmol)及びヨードカリウム(300mg、1.80mmol)を添加した。反応物を80℃で16時間撹拌した。室温まで冷却した時、反応混合物を真空濾過によって濾過した。容器内の残留物及び漏斗上の濾過ケーキをプロピオニトリルで2回洗浄した。次いで、濾液を40℃で真空中において濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン中の0~5~10~20~25~30~35~40~50~80~100%(ジクロロメタン中の1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8,8’-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)(7.37g、8.95mmol、74%)を透明な淡黄色油として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5.66 (br. s, 1H);4.08 (t, 4H, J = 6.0 Hz);3.17 (br. q, 2H, J = 6.0 Hz);2.43 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.34 (br. t, 4H, J = 6.0 Hz);2.28 (t, 4H, J = 9.0 Hz);1.67-1.52 (m, 10H);1.48-1.37 (m, 14H);1.35-1.17 (m, 45H);0.88 (t, 12H, J = 6.0 Hz).
ステップ1:8,8’-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)の合成
ステップ2:8,8’-((3-アミノプロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)の合成
撹拌棒を備えた丸底フラスコに、8,8’-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)(3.00g、3.64mmol)を添加した。油をシクロペンチルメチルエーテル(8mL)中に溶解し、5分間撹拌した。3M HClのシクロペンチルメチルエーテル溶液(6.07mL、18.2mmol)を滴下した。添加完了後、反応物を40℃まで1時間加熱し、反応の完了をTLC/LCMS分析によってモニターした。反応物を室温まで冷却し、次いで0℃まで冷却した。次いで、10%K2CO3溶液を反応混合物に滴下した。添加完了後、水性/シクロペンチルメチルエーテルエマルジョンをEtOAcで希釈し、得られた混合物を10分間撹拌した。溶液を分離漏斗に移して層を分離した。有機層を乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮した。残留物をヘプタン中に再溶解し、MeCNで2回洗浄した。ヘプタン層を乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮し、粗8,8’-((3-アミノプロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)(2.43g、3.36mmol、92%)をオフホワイト油として得た。粗物質をさらに精製することなく次のステップに進めた。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4.08 (t, 4H, J = 6.0 Hz);2.98 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.71 (t, 2H, J = 6.0 Hz);2.54 (br. t, 4H, J = 6.0 Hz);2.28 (t, 6H, J = 6.0 Hz);1.76 (br. 五重線, 2H, J = 2.0 Hz);1.66-1.52 (m, 9H);1.52-1.43 (m, 4H);1.37-1.18 (m, 45H);0.88 (t, 12H, J = 6.0 Hz).
ステップ3:化合物30:8,8’-((3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)の合成
撹拌棒を備えた丸底フラスコに、8,8’-((3-アミノプロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)(2.43g、3.36mmol)、3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオン(616mg、4.36mmol)及び2-メチルTHF(10mL)を添加した。10%K2CO3溶液(10mL)を添加し、得られた二相混合物を45℃まで加熱し、3時間激しく撹拌した。反応完了をTLC/LCMS分析によってモニターした。完了時、混合物を室温まで冷却した。反応物を水で希釈して層を分離し、水層をヘプタンで2回抽出した。有機物を組み合わせ、水(3×)、ブラインで洗浄し、1:1アセトニトリル/水混合物で洗浄した。次いで、組み合わせた有機物を乾燥させ(Na2SO4)、濾過して濃縮した。粗残留物を共沸し、DCM及びMeOHで3回濃縮して、淡黄色の粗ワックス状油を得た。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン中0~100%(ジクロロメタン中、1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8,8’-((3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)アザンジイル)ジオクタン酸ビス(3-ペンチルオクチル)(2.11g、2.54mmol、76%)を白色ワックス状固体として得た。
UPLC/ELSD: RT = 2.79 分.C50H93N3O6についてMS (ES): m/z (MH+) 832.34. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7.83 (br. s, 1H);7.61 (br. s, 1H);4.03 (t, 4H, J = 9.0 Hz);3.64 (br. s, 2H);3.28 (br. d, 3H, J = 6.0 Hz);2.46 (t, 2H, J = 9.0 Hz);2.33 (br. t, 4H, J = 6.0 Hz);2.33 (t, 4H, J = 9.0 Hz);1.74 (br. 五重線, 2H, J = 6.0 Hz);1.62-1.47 (m, 8H);1.41-1.12 (m, 50H);0.83 (t, 12H, J = 9.0 Hz).
UPLC/ELSD: RT = 2.79 分.C50H93N3O6についてMS (ES): m/z (MH+) 832.34. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7.83 (br. s, 1H);7.61 (br. s, 1H);4.03 (t, 4H, J = 9.0 Hz);3.64 (br. s, 2H);3.28 (br. d, 3H, J = 6.0 Hz);2.46 (t, 2H, J = 9.0 Hz);2.33 (br. t, 4H, J = 6.0 Hz);2.33 (t, 4H, J = 9.0 Hz);1.74 (br. 五重線, 2H, J = 6.0 Hz);1.62-1.47 (m, 8H);1.41-1.12 (m, 50H);0.83 (t, 12H, J = 9.0 Hz).
化合物54:8-((3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル
ステップ1:8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-ブロモオクタン酸3-ブチルヘプチル(794mg、2.11mmol)及び8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)アミノ)オクタン酸3-ペンチルオクチル(1.00g、2.01mmol)のシクロペンチルメチルエーテル(9mL)及びアクトニトリル(9mL)溶液に、炭酸カリウム(1.66g、12.0mmol)及びヨードカリウム(366mg、2.21mmol)を添加した。反応物を80℃で16時間撹拌した。冷却時、揮発性物質を真空下で蒸発させた。残留物をジクロロメタンで希釈して水で洗浄した。有機層を分離し、ブラインで洗浄して乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン中0~5~10~25~50~100%(ジクロロメタン中、1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(896mg、1.13mmol、56%)を透明な油として得た。UPLC/ELSD: RT = 2.95 分.C48H94N2O6についてMS (ES): m/z (MH+) 795.59.
ステップ1:8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
ステップ2:8-((3-アミノプロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-((3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(896mg、1.13mmol)の塩化メチレン(23mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(1.72mL、22.5mmol)を添加した。反応物を室温で4時間撹拌した。反応物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を分離し、ブラインで洗浄して乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン中0~5~10~25~50~100%(ジクロロメタン中、1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8-((3-アミノプロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(632mg、0.91mmol、81%)を透明な油として得た。UPLC/ELSD: RT = 2.47 分.C43H86N2O4についてMS (ES): m/z (MH+) 695.68.
ステップ3:化合物54:8-((3-((2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチルの合成
8-((3-アミノプロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(632mg、0.91mmol)のエタノール(8mL)溶液に、3-メトキシ-4-(メチルアミノ)シクロブト-3-エン-1,2-ジオン(192mg、1.36mmol)を添加した。反応物を67℃で20時間撹拌した。20時間後、反応物を室温まで冷却し、ジエチルエーテルで希釈した。有機物をブラインで洗浄して乾燥させ(MgSO4)、濾過して濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ジクロロメタン中0~5~10~25~50~100%(ジクロロメタン中、1%NH4OH、20%MeOHの混合物))によって精製し、8-((3-(2-(メチルアミノ)-3,4-ジオキソシクロブト-1-エン-1-イル)アミノ)プロピル)(8-オキソ-8-((3-ペンチルオクチル)オキシ)オクチル)アミノ)オクタン酸3-ブチルヘプチル(240mg、0.30mmol、33%)をオフホワイトのワックス状固体として得た。UPLC/ELSD: RT = 2.67 分.C48H89N3O6についてMS (ES): m/z (MH+) 804.22. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7.38 (br. s, 1H);7.03 (br. s, 1H);4.07 (t, 4H, J = 6.0 Hz);3.65 (br. s, 2H, J = 6.0 Hz);3.27 (d, 3H, J = 6.0 Hz);2.52 (br. t, 2H, J = 6.0 Hz);2.40 (br. t, 4H, J = 6.0 Hz);2.28 (t, 4H, J = 6.0 Hz);1.75 (br. 五重線., 2H, J = 6.0 Hz);1.67-1.51 (m, 8H);1.47-1.17 (m, 46H);0.93-0.82 (m, 12H).
実施例7:マウスにおける試料製剤によって誘導したhEPOの発現及び肝臓の残留脂質レベル
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性を評価するために、本開示のナノ粒子をマウスに投与した後、肝細胞タンパク質発現(hEPO)を測定した。
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性を評価するために、本開示のナノ粒子をマウスに投与した後、肝細胞タンパク質発現(hEPO)を測定した。
リン脂質としてDSPC、構造脂質としてコレステロール、PEG脂質として化合物I、式(II)のイオン化可能なアミノ脂質、及びhEPOをコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子を、CD-1マウスに静脈内投与した。血清中のhEPOの濃度を、注入後6時間で試験した。試験した粒子のPDIは約0.1~0.4、カプセル化効率は約82~99%、粒径は約56~145nmであった。試験した脂質ナノ粒子の全てが、24時間後にマウスの肝臓内に残存した脂質の量は様々であったが、肝細胞へのmRNAの効果的な送達を示した(表13)。
実施例8:マウス及びラットにおける試料製剤によって誘導したルシフェラーゼの発現
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性をさらに評価するために、ルシフェラーゼを含有するmRNAを含む本開示のナノ粒子をげっ歯類に投与した後、ルシフェラーゼの発現を測定した。
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性をさらに評価するために、ルシフェラーゼを含有するmRNAを含む本開示のナノ粒子をげっ歯類に投与した後、ルシフェラーゼの発現を測定した。
リン脂質としてDSPC、構造脂質としてコレステロール、PEG脂質として化合物I、式(II)のイオン化可能なアミノ脂質、及びルシフェラーゼをコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子を、CD-1マウス及びSprague Dawleyラットに静脈内投与した。発現レベルは、注射の6時間後にエクスビボでの肝臓内の生物発光によって試験した。試験した粒子のPDIは約0.09~0.25、カプセル化効率は約89~98%であった。試験した脂質ナノ粒子の全てが、24時間後にラットの肝臓組織内に残存した脂質の量は様々であったが、肝臓へのmRNAの効果的な送達及び肝細胞内でのmRNA発現を示した(表14A及び表14B)。
実施例9:ラットにおける忍容性
本開示の脂質の忍容性を評価するため、試料製剤によって誘導したレポーター抗体構築物の発現をラットで評価した。
本開示の脂質の忍容性を評価するため、試料製剤によって誘導したレポーター抗体構築物の発現をラットで評価した。
リン脂質としてDSPC、構造脂質としてコレステロール、PEG脂質として化合物I、式(II)のイオン化可能なアミノ脂質、及びレポーター抗体構築物をコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子を、Sprague Dawleyラットに静脈内投与した。レポーター抗体構築物のレベルを、注射後6時間で酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって試験した。試験した製剤では、高レベルのレポーター抗体を測定したが、肝臓毒性の徴候は最小限であった(表15)。
実施例10:ラットにおける試料製剤によって誘導したhEPOの発現
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性をさらに評価するために、本開示のナノ粒子をラットに投与した後、肝細胞タンパク質発現(hEPO)を測定した。
本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性をさらに評価するために、本開示のナノ粒子をラットに投与した後、肝細胞タンパク質発現(hEPO)を測定した。
リン脂質としてDSPC、構造脂質としてコレステロール、PEG脂質として化合物I、式(II)のイオン化可能なアミノ脂質、及びhEPOをコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子を、Sprague Dawleyラットに静脈内投与した。血清中のhEPOの濃度を、注入後6時間で試験した。試験した脂質ナノ粒子の全てが、6時間後にラットの肝臓内に残存した脂質の量は様々であったが、肝細胞へのmRNAの効果的な送達を示した(表16)。
実施例11:非ヒト霊長類における試料製剤によって誘導したルシフェラーゼの発現
異なる種における本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性を評価するために、mRNAを含有する本開示のナノ粒子を非ヒト霊長類に投与した後、mRNAの発現を測定した。
異なる種における本開示の脂質の発現力価及び代謝安定性を評価するために、mRNAを含有する本開示のナノ粒子を非ヒト霊長類に投与した後、mRNAの発現を測定した。
リン脂質としてDSPC、構造脂質としてコレステロール、PEG脂質として化合物I、式(II)のイオン化可能なアミノ脂質、及びルシフェラーゼをコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子を、カニクイザルに静脈内投与した。肝臓内におけるルシフェラーゼのエクスビボレベルを、注射後6時間でELISAによって測定した。試験した脂質ナノ粒子の全てが、非ヒト霊長類の肝細胞への、mRNAの効果的な送達を示した(表17)。
実施例12:インビボ活性、発現、及び有効性
代替5’UTRと組み合わせた実施例5のOTC変異体をコードするコドン最適化mRNA(OTC_13、表7を参照のこと)を生成し、野生型OTCをコードするコドン最適化mRNA(OTC_10)と比較して、実施例3に記載したようにOTCの発現、活性、及び有効性について試験した。mRNAを、化合物A及び化合物Iを含有してLNPに製剤化した。
代替5’UTRと組み合わせた実施例5のOTC変異体をコードするコドン最適化mRNA(OTC_13、表7を参照のこと)を生成し、野生型OTCをコードするコドン最適化mRNA(OTC_10)と比較して、実施例3に記載したようにOTCの発現、活性、及び有効性について試験した。mRNAを、化合物A及び化合物Iを含有してLNPに製剤化した。
図11Aは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中の総肝細胞OTC活性を時間の関数として示すグラフである。PBS対照と比較して、持続的かつ有意なOTC活性をOTC_10及びOTC_13の両方で観察した。
図11Bは、脂質ナノ粒子またはPBSの投薬後、示した日数での肝臓試料中で検出したOTCタンパク質の量を示すグラフである。
OTC_10及びOTC_13の有効性を、実施例3に記載したようにOTC誘導マウスモデルで評価した。
図12Aは、タモキシフェン誘導後の示した日数における体重のパーセンテージを示すグラフである。OTC_10及びOTC_13変異体の投薬によって、対照と比較して体重減少が縮小した。
図12Bは、脂質ナノ粒子の投与後、示した日数での生存パーセンテージを示すグラフである。OTC_10またはOTC_13を投与したマウスは、対照と比較して生存率が増加した。
発明を実施するための形態節は、特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図し、発明の概要及び要約節はそれを意図しないと理解されるべきである。発明の概要及び要約節は、本発明者ら(複数可)によって企図されるような本発明の、全てではないが1つ以上の例示的な実施形態を記載し得、それゆえ本発明及び添付の特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本発明は、特定の機能及びそれらの関係性の実施を示す機能的構成要素を使用して上に記載されている。これらの機能的構成要素の境界は、記載の便宜上、本明細書では任意に定義されている。特定の機能及びそれらの関係性が適切に実施されている限り、別の境界が定義され得る。
特定の実施形態の前述した記載は、本発明の一般的性質を完全に明らかにすることになるため、他者が、当業者の技能範囲内の知識を適用することによって、本発明の一般概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を様々な用途に合わせて過度な実験を行うことなく、容易に修正及び/または適合され得る。したがって、そのような適合及び修正は、本明細書に提示される教示及び指針に基づいて、開示される実施形態と同等の意味及び範囲内にあることを意図する。本明細書の表現または専門用語は、制限ではなく説明を目的とし、そのため本明細書の専門用語または表現は、当業者によって教示及び指針に照らして解釈されると理解されるべきである。
本発明の幅広さ及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びその等価物に従ってのみ定義されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それら全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されることになる。
Claims (93)
- 脂質ナノ粒子であって、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含み、前記脂質ナノ粒子が、式(II):
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
R’bは、
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
Yaは、C3~6炭素環であり、
R*”aは、C1~15アルキル及びC2~15アルケニルからなる群から選択され、
sは、2または3であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される、前記脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、式(II-a):
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRaδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Raγ及びRaδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
Rbγ及びRbδは、H、C1~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、Rbγ及びRbδのうち少なくとも1つが、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される、請求項1に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、式(II-b):
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
Raγ及びRbγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R’は独立して、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される、請求項1に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、式(II-c):
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される、請求項1に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、式(II-e):
式中、R’aは、R’分岐鎖またはR’環状であり、ここで
R’分岐鎖は
ここで、
ここでRaγは、C1~12アルキル及びC2~12アルケニルからなる群から選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は-(CH2)nOHであり、式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択され、
lは、1、2、3、4、5、6、7、8、及び9から選択される、請求項1に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記PEG脂質が化合物Iである、請求項11に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、
(i)40~50mol%の前記式(II)の化合物、30~45mol%の前記構造脂質、5~15mol%の前記リン脂質、及び1~5mol%の前記PEG脂質、または
(ii)45~50mol%の前記式(II)の化合物、35~45mol%の前記構造脂質、8~12mol%の前記リン脂質、及び1.5~3.5mol%の前記PEG脂質
を含む、請求項11または12に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記mRNAが、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、前記OTCポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、請求項1~17のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ORFが、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項18または19に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドの前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む、請求項18に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項20または21に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ORFが、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項22に記載の脂質ナノ粒子。
- メッセンジャーRNA(mRNA)であって、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’非翻訳領域(UTR)と、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)とを含む、前記mRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む、請求項24に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む、請求項24または25に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む、請求項24~26のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、前記OTCポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、請求項24~27のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項24~27のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記ORFが、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項28または29に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:5~15のヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドの前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む、請求項28に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項28に記載のmRNA。
- 前記ORFが、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項32または33に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:16のヌクレオチド配列を含む、請求項32または33に記載のmRNA。
- メッセンジャーRNA(mRNA)であって、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)と、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’非翻訳領域(UTR)とを含む、前記mRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む、請求項36に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む、請求項36または37に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む、請求項36~38のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、前記OTCポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、請求項36~39のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項36~39のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記ORFが、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項40または41に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドの前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む、請求項40に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載のmRNA。
- 前記ORFが、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項43または44に記載のmRNA。
- メッセンジャーRNA(mRNA)であって、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、前記OTCポリペプチドの前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含み、前記OTCポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、前記mRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む、請求項46に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む、請求項46または47に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む、請求項46~48のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む、請求項46~49のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項46~50のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記ORFが、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項46~51のいずれか1項に記載のmRNA。
- メッセンジャーRNA(mRNA)であって、
(i)5’末端キャップと、
(ii)配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’非翻訳領域(UTR)と、
(iii)配列番号:1のオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号:3のヌクレオチド配列を含む、前記ORFと、
(iv)配列番号:132の核酸配列を含む3’UTRと、
(v)ポリA領域と
を含む、前記mRNA。 - 前記ポリA領域が、A100(配列番号:195)を含む、請求項53に記載のmRNA。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項1~54のいずれか1項に記載のmRNA。
- 前記mRNAのウラシルが全て、N1-メチルシュードウラシルである、請求項1~54のいずれか1項に記載のmRNA。
- ポリペプチドであって、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含み、前記ポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、前記ポリペプチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項57に記載のポリペプチド。
- 請求項1~56のいずれか1項に記載のmRNAと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 請求項57または58に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNAを含む、脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、式(I):
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は、-(CH2)nOH(式中、nは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択される)、ならびに
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む、請求項62に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記PEG脂質が化合物Iである、請求項63に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、
(i)40~50mol%の前記式(I)の化合物、30~45mol%の前記構造脂質、5~15mol%の前記リン脂質、及び1~5mol%の前記PEG脂質、または
(ii)45~50mol%の前記式(I)の化合物、35~45mol%の前記構造脂質、8~12mol%の前記リン脂質、及び1.5~3.5mol%の前記PEG脂質
を含む、請求項63または64に記載の脂質ナノ粒子。 - (i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、
(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物B、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、
(i)化合物B、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、
(i)化合物A、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物A、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG-DMGもしくは化合物I、
(i)化合物A、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、または
(i)化合物A、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I
を含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、化合物II及び化合物Iを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、化合物B及び化合物Iを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、化合物Aを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、化合物A及び化合物Iを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物Iを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、化合物A、DSPC、コレステロール、及び化合物Iを含む、請求項61に記載の脂質ナノ粒子。
- 脂質ナノ粒子であって、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含み、前記脂質ナノ粒子が、式(Ic):
式中、R’aは、R’分岐鎖であり、ここで
R’分岐鎖は
ここでRaα、Raβ、Raγ、及びRaδは、H、C2~12アルキル、及びC2~12アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R2及びR3は、C1~14アルキル及びC2~14アルケニルからなる群から各々独立して選択され、
R4は
ここで、
R10はN(R)2であり、各Rは、C1~6アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、n2は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10からなる群から選択され、
各R5は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
各R6は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-及び
-OC(O)-からなる群から各々独立して選択され、
R’は、C1~12アルキルまたはC2~12アルケニルであり、
lは、1、2、3、4、及び5からなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13からなる群から選択される、前記脂質ナノ粒子。 - 前記脂質ナノ粒子が、リン脂質、構造脂質、及びPEG脂質をさらに含む、請求項73~75のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記PEG脂質が化合物Iである、請求項76に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、
(i)40~50mol%の前記式(Ic)の化合物、30~45mol%の前記構造脂質、5~15mol%の前記リン脂質、及び1~5mol%の前記PEG脂質、または
(ii)45~50mol%の前記式(Ic)の化合物、35~45mol%の前記構造脂質、8~12mol%の前記リン脂質、及び1.5~3.5mol%の前記PEG脂質
を含む、請求項76または77に記載の脂質ナノ粒子。 - 前記mRNAが、配列番号:58のヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む、請求項73~78のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、配列番号:132のヌクレオチド配列を含む3’UTRを含む、請求項73~79のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、m7Gp-ppGm-Aを含む5’末端キャップを含む、請求項73~80のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記mRNAが、A100(配列番号:195)を含むポリA領域を含む、請求項73~81のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、前記OTCポリペプチドが、カルバモイルリン酸及びオルニチンと結合する、請求項73~82のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項73~83のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ORFが、配列番号:3のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項83または84に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドの前記アミノ酸配列が、(i)配列番号:1の47位に対応する位置にアスパラギン以外のアミノ酸を、(ii)配列番号:1の135位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(iii)配列番号:1の184位に対応する位置にセリン以外のアミノ酸を、(iv)配列番号:1の217位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(v)配列番号:1の227位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を、(vi)配列番号:1の229位に対応する位置にバリン以外のアミノ酸を、(vii)配列番号:1の245位に対応する位置にロイシン以外のアミノ酸を、及び/または(viii)配列番号:1の255位に対応する位置にヒスチジン以外のアミノ酸を含む、請求項83に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記OTCポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項85または86に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ORFが、配列番号:4のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である、請求項87に記載の脂質ナノ粒子。
- OTCポリペプチドの発現を必要とするヒト対象におけるOTCポリペプチドの発現方法であって、有効量の、請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNA、請求項57もしくは58に記載のポリペプチド、請求項59もしくは60に記載の医薬組成物、または請求項1~23もしくは61~88のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子を、前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
- オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(OTCD)の治療、予防、またはその発症及び/または進行の遅延を必要とするヒト対象における、OTCDの治療、予防、またはその発症及び/または進行の遅延方法であって、有効量の、請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNA、請求項57もしくは58に記載のポリペプチド、請求項59もしくは60に記載の医薬組成物、または請求項1~23もしくは61~88のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子を、前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
- アンモニア血中レベルの減少を必要とするヒト対象におけるアンモニア血中レベルの減少方法であって、有効量の、請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNA、請求項57もしくは58に記載のポリペプチド、請求項59もしくは60に記載の医薬組成物、または請求項1~23もしくは61~88のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子を、前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
- 尿中オロチン酸レベルの減少を必要とするヒト対象における尿中オロチン酸レベルの減少方法であって、有効量の、請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNA、請求項57もしくは58に記載のポリペプチド、請求項59もしくは60に記載の医薬組成物、または請求項1~23もしくは61~88のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子を、前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
- OTC活性の増加を必要とするヒト対象におけるOTC活性の増加方法であって、有効量の、請求項24~56のいずれか1項に記載のmRNA、請求項57もしくは58に記載のポリペプチド、請求項59もしくは60に記載の医薬組成物、または請求項1~23もしくは61~88のいずれか1項に記載の脂質ナノ粒子を、前記ヒト対象に投与することを含む、前記方法。
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