KR20220016480A - 탈핵 적혈구를 생성하는 방법 - Google Patents

탈핵 적혈구를 생성하는 방법 Download PDF

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조나단 립시츠
브라이언 조셉 페리라
브라이안 왕
앨런 길버트
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루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

탈핵 적혈구를 생성하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/852,930에 대한 우선권을 주장한다. 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 탈핵 적혈구를 생성하는 방법에 관한 것이다.
적혈구는 실혈을 경험한 환자에게 수혈된다. 또한, 적혈구를 포함하는 조작된 탈핵 적혈구는 이를 필요로 하는 환자에게 외인성 단백질(들)을 운반하거나 제공하는 치료제로서 개발 중에 있다.
본 발명은 분화 및/또는 성숙 동안 적혈구 전구 세포의 관류 배양이 증가된 세포 증식, 증가된 탈핵 속도에 기반하고, 따라서 탈핵된 적혈구(예: 적혈구 전구 세포의 분화 또는 성숙 동안 관류 배양의 사용을 포함하지 않는 방법과 비교)의 수를 증가시키고/시키거나 적혈구 전구 세포가 계속 성장 및/또는 탈핵할 수 있는 시간의 길이를 증가시킨다.
이러한 발견의 관점에서, 탈핵 적혈구 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다. 또한 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식(batch) 또는 유가식(fed batch); (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다. 또한 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하고, 여기서 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다.
다음을 포함하는 탈핵 적혈구 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 단계 (a) 전에:
(i) 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 제공하기 위해 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하는 단계; 및
(ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하는 단계.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 플라스크(shake flask)이다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 튜브(shake tube)이다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다.
일부 실시예에서, 진탕 튜브는 원뿔형 용기(conical container)이다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 배양 백(culture bag)이다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가식 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 유가식 배양은 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF, stem cell factor), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 각각 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-6을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 8μg/mL 내지 약 12μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg /mL 내지 약 400 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 150μg/mL 내지 약 250μg/mL 트랜스페린을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg /mL 내지 약 240 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg /mL 내지 약 220 μg /mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)에서의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)에서 관류 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3에서 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3에서 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 추가 부피의 제2 배양 배지를 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1μg/mL 트랜스페린 내지 약 500μg/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 100 μg /mL 트랜스페린 내지 약 300 μg /mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 25 nM 덱사메타손을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예태에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 μg /mL 내지 약 50 μg /mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L 의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 100 L 의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3에서 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3에서 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 다음을 포함한다: (i) 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및 (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1 μg /mL 트랜스페린 내지 약 500 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 100μg/mL 트랜스페린 내지 약 300μg/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO를 각각 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg /mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b) 및 (d)에서의 관류 배양은 접선 여과의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과(tangential filtration)는 교대 접선 여과(ATF, alternating tangential filtration)이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다.
다음을 포함하는 탈핵 적혈구 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함하는 단계.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 단계 (a) 전에:
(i) 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 제공하기 위해 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포를 배치하는 단계; 및 (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 100mL 내지 약 500mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 진탕관은 원추형 용기이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 진탕관을 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 배양 백이다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 유가식 배양은 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 각각 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1 μg /mL 내지 약 20 μg /mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 8 μg/mL 내지 약 12μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50 μg /mL 내지 약 400 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 150 μg /mL 내지 약 250 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 160 μg /mL 내지 약 240 μg /mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 180 μg /mL 내지 약 220 μg /mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)에서의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기술된 방법 중 어떤 것의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 여기에 설명된 방법 중 일부의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 진탕관은 원추형 용기이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 진탕관을 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 배양 백이다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 생물반응기이다. 일부 실시예에서, 생물반응기는 1L 내지 약 15,000L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)에서 생물반응기는 약 5L 내지 약 100L의 부피를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 유가식으로 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 유가식 배양은 추가 부피의 제2 배양 배지를 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제2 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 주기적으로 제2 세포 배양물에 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 25 nM 덱사메타손을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 500mL 내지 약 15,000L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1g/mL 내지 약 50㎍/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1 μg /mL 내지 약 20 ㎍ /mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1 μg /mL 내지 약 50 μg /mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1 μg /mL 내지 약 20 μg /mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 접선 여과의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과는 교대 접선 여과(ATF)이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성한다.
또한 다음을 포함하는 탈핵 적혈구 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (a) 일정 부피의 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물을 관류 생물반응기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 초기의 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 세포 밀도; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구세포의 집단을 포함하는 단계.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 단계 (a) 이전에: (i) 복수의 적혈구 전구 세포를 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 배치하여 초기 세포 배양물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 세포 밀도; 및 (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 100mL 내지 약 500mL 의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 진탕관은 원추형 용기이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 진탕관을 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)의 용기는 배양 백이다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50mL 내지 약 500mL 의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 진동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 유가식 배양은 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 각각 Flt-3 리간드, SCF, IL-3, 및 IL-6을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-6을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 8 ㎍/mL 내지 약 12 ㎍/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 5 mM 내지 약 7 mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 50 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 150㎍/mL 내지 약 250㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 160㎍/mL 내지 약 240㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 180㎍/mL 내지 약 220㎍/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 12일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)에서의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)에서 관류 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 관류 생물반응기는 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 추가 부피의 제2 배양 배지를 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-3을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL IL-3을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 25 nM 덱사메타손을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 대략 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 4일 내지 약 10일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도는 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기술된 방법 중 어느 것의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 용기는 진탕 플라스크이다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 15 mL 내지 약 3 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 50 mL 내지 약 1.5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 용기는 진탕 튜브이다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 2 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 10 mL 내지 약 250 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 50 mL 내지 약 200 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 진탕관은 원추형 용기이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 진탕관을 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 튜브를 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 용기는 배양 백이다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 5 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 배양 백은 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 용기는 생물반응기이다. 일부 실시예에서, 생물반응기는 1L 내지 약 15,000L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 생물반응기는 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 생물반응기는 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 생물반응기는 약 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물을 유가식으로 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 유가식 배양은 추가 부피의 제3 배양 배지를 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제3 세포 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)에서의 회분식 및 유가식 배양은 다음을 포함한다: (i) 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및 (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 1일 내지 약 7일이다. 일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 3일 내지 약 5일이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 1일 내지 약 10일이다. 일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 3일 내지 약 7일이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 병세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 둘 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린, 인슐린 및 EPO를 각각 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L- 글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 8일 내지 약 15일 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 단계 (d)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL이다. 일부 실시예에서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도는 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)의 관류 배양은 접선 여과의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과는 교대 접선 여과(ATF)이다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 접선 여과는 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구 /mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 1 x 107 탈핵 적혈구 /mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구 /mL의 세포 밀도를 생성한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 107 탈핵 적혈구 /mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구 /mL의 세포 밀도를 생성한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 인간 적혈구 전구 세포이다. 일부 실시예에서, 적혈구계 전구 세포는 O 음성 인간 공여자로부터 수득된다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성 및 Kell 음성 인간 공여자로부터 수득된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 집단은 탈핵 인간 적혈구의 집단이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (e) 단계 (d)에서 제3 세포 배양물로부터 탈핵 적혈구의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (f) 단계 (e)에서 단리된 탈핵 적혈구의 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (g) 단계 (f)에서 탈핵 적혈구의 제제화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 단계 (a) 전에, 제1 세포 배양에서 적혈구 전구 세포 내로 핵산을 도입하는 단계, 방법은 조작된 탈핵 적혈구 집단의 생산을 초래한다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 집단은 조작된 탈핵 인간 적혈구이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 핵산은 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 코딩한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 하나 이상의 외인성 단백질을 세포에 클릭-접합하는 것을 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 세포를 저장성 로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 물리적 조작을 통해 세포를 로딩하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 단백질이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 페닐알라닌 암모니아 분해효소이고, 여기서 페닐알라닌 암모니아 분해효소는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)은 면역조절 분자를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)은 항원 제시 분자를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (e) 단계 (d)에서 제3 세포 배양물로부터 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (f) 단계 (e)에서 단리된 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 방법은 (g) 단계 (f)에서 조작된 탈핵 적혈구의 제제화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 탈핵 적혈구의 집단이 본 명세서에 제공된다.
또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 제제가 본 명세서에 제공된다.
용어 "집단(population)"은 주어진 물품(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 탈핵 적혈구 중 임의의 것) 중 2개 이상을 의미한다.
"조작된 탈핵 적혈구"라는 용어는 하나 이상 (예: 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯)의 외인성 단백질(들) (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 외인성 단백질의 임의의 조합)을 포함하는 탈핵 적혈구 (예: 인간 탈핵 적혈구)를 의미한다. 예를 들어, 조작된 탈핵 적혈구포는 세포질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 그의 원형질막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 적혈구는 (i) 그의 세포질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들) 및 (ii) 그의 원형질막에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 가질 수 있다. 조작된 탈핵 적혈구의 비제한적인 예는 클릭-접합(click-conjugated) 탈핵 적혈구포, 저장성(hypotonically) 로딩된 탈핵 적혈구, 및 물리적 조작 (예를 들어, 여기에 설명되거나 당업계에 알려진 임의의 예시적인 유형의 물리적 조작)에 의해 로딩된 탈핵 적혈구를 포함한다. 조작된 탈핵 적혈구의 추가의 비제한적인 측면이 본 명세서에 기재되어 있다.
"클릭-접합 탈핵 적혈구(click-conjugated enucleated erythroid cell)"라는 용어는 화학 반응을 통해 조작된 탈핵 적혈구의 원형질막 상에 존재하는 다른 단백질 (예: 탈핵 적혈구의 내인성 단백질 또는 다른 외인성 단백질)에 접합된 하나 이상의 외인성 단백질을 갖는 조작된 탈핵 적혈구를 의미한다.
용어 "저장성 로딩된 탈핵 적혈구(hypotonically-loaded enucleated erythroid cell)"는 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포를 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는 낮은 이온 강도 완충제에 노출시킴으로써 적어도 부분적으로 생성된 조작된 탈핵 적혈구를 의미한다. 저장성-로딩된 탈핵 적혈구를 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 저장성-로딩된 탈핵 적혈구를 생성하기 위한 추가 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"물리적 조작에 의해 로딩된 탈핵 적혈구(enucleated erythroid cell loaded by physical manipulation)"라는 용어는 적혈구 전구 세포 내로 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질) 및/또는 하나 이상의 외인성 단백질(들) (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 코딩하는 핵산의 도입을 초래하는 방식으로 적혈구 전구 세포를 물리적으로 조작하여 적어도 부분적으로 생성된 탈핵 적혈구를 의미한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 물리적 조작의 비제한적 예는 전기천공 및 입자-매개 형질감염을 포함한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 물리적 조작의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
"외인성 단백질"이라는 용어는 세포 내로 또는 세포 상에 도입되거나, 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 세포 내로 또는 세포의 전구체 내로 도입함으로써 세포에 의해 발현되게 하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 세포 내로 도입된 외인성 핵산 또는 세포의 전구체에 의해 코딩되는 단백질이며, 이 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 화학적 또는 효소적 수단에 의해 세포의 표면에 접합된 단백질이다. 외인성 단백질의 비제한적 부류에는 효소, 인터류킨, 사이토카인 수용체, Fc-결합 분자, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC-결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화 작용제, 수용체 리간드(예를 들어, 수용체 작용제 또는 수용체 길항제), 및 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 조작된 탈핵 적혈구에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 예는 본 명세서에 기재되어 있다(예를 들어, 표 A-D 참조). 조작된 탈핵 적혈구에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
"막에 존재하는 단백질"이라는 용어는 (1) 탈핵 적혈구의 막에 물리적으로 부착되거나 적어도 부분적으로 내장된 단백질 (예를 들어, 막횡단 단백질, 말초막 단백질, 지질 고정 단백질(예를 들어, GPI-앵커, N-미리스톨화 단백질, 또는 S-팔미토일화 단백질)) 또는 (2) 동족 수용체에 안정적으로 결합된 단백질로, 동족 수용체는 탈핵 적혈구(예를 들어, 동족 수용체에 결합된 리간드, 여기서 동족 수용체는 탈핵 적혈구의 막에 물리적으로 부착됨)의 막에 물리적으로 부착된다. 포유동물 세포의 막 상의 단백질의 존재를 결정하기 위한 비제한적 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS), 면역조직화학, 세포 분획 분석 및 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
"적혈구 전구 세포"라는 용어는 궁극적으로 탈핵 적혈구로 분화/발달할 수 있는 포유동물 세포를 의미한다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC, HSPC, hematopoietic stem/progenitor cell), 비장 집락 형성(CFU-S, spleen colony forming) 세포, 총골수 전구체(CMP, common myeloid progenitor) 세포, 배반구 집락 형성 세포(blastocyte colony-forming cell), 버스트 형성 단위 적혈구/적혈구(BFU-E, burst forming unit-erythroid/erythrocyte), 거핵구-적혈구 전구 세포(MEP, megakaryocyte-erythroid progenitor), 적혈구 집락 형성 단위 또는 집락 형성 단위 적혈구(CFU-E, colony-forming unit erythrocyte), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 인간 적혈구 전구 세포이다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성 인간 공여자로부터 수득될 수 있다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 O 음성 및 Kell 음성 인간 공여자로부터 수득될 수 있다.
"대상체"라는 용어는 모든 포유동물을 의미한다. 일부 실시예에서, 대상체 또는 "치료가 필요한 대상체"는 영장류 (예: 인간, 유인원(simian)(예: 원숭이(예: 마모셋 또는 비비) 또는 유인원(ape)(예: 고릴라, 침팬지, 오랑우탄 또는 긴팔원숭이)), 설치류 (예: 마우스, 기니피그, 햄스터 또는 쥐), 토끼, 개, 고양이, 말, 양, 소, 돼지, 또는 염소일 수 있다. 일부 실시예에서, 대상체 또는 "치료에 적합한 대상체"는 인간이 아닌 포유동물, 특히 인간에서 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 통상적으로 사용되는 포유동물(예를 들어, 마우스, 돼지, 랫트 또는 -인간 영장류)가 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 피험자는 의료 전문가(예: 의사, 검사실 기술자, 의사의 조수, 간호사 또는 임상 검사실 기술자)에 의해 치료가 필요한 것으로 사전에 진단되거나 식별될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료하는"은 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 대상체 중 임의의 것)에서 의학적 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 수, 중증도, 빈도 및/또는 지속기간의 감소를 의미한다.
"진동 플라스크"라는 용어는 하나 이상의 기체 투과성 표면 (예: 기체 투과성 요소가 있는 말단, 예를 들어 멸균 장벽 역할도 할 수 있는 멤브레인) 및/또는 하나 이상의 배출 캡이 있는 일정량의 액체 배양 배지를 담을 수 있는 용기(예: 멸균 용기)를 의미하고 그 모양의 적어도 일부는 대략 절두원추형이다. 예를 들어, 진탕 플라스크는 T-플라스크, 삼각 플라스크, 또는 이들의 당업계에서 인정하는 변형된 버전과 같은 세포 배양 플라스크일 수 있다.
"진동 튜브"라는 용어는 하나 이상의 기체 투과성 표면 (예: 기체 투과성 요소가 있는 말단, 예를 들어 멸균 장벽 역할도 할 수 있는 멤브레인) 및/또는 하나 이상의 배출 캡이 있는 액체 배양 배지를 보유할 수 있는 용기(예: 멸균 용기)를 의미하고 교반시 (예: 회전 교반) 용기 내에 액체 배양 배지를 보유할 수 있으며, 그 형상의 적어도 일부는 대략 원통형이다. 예를 들어, 진동 튜브는 EppendorfTM 튜브(예: 50mL 또는 15mL EppendorfTM 튜브) 또는 해당 분야에서 인정하는 등가물 또는 변형된 버전일 수 있다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 다중 웰 플레이트의 웰(예: 둥근 바닥 웰 또는 평평한 바닥 웰)일 수 있다.
"유가식 배양(feed-batch culture)"이라는 용어는 세포 배양물로부터 제1 액체 배양 배지를 실질적으로 또는 현저하게 제거하지 않고 초기 세포 배양물에 제2 액체 배양 배지를 증분 또는 연속 첨가하는 것을 포함하는 배양 방법을 의미한다. 일부 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 실질적으로 동일한 농도로 동일한 성분을 포함한다. 다른 경우에, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지의 농축된 형태이고/이거나 건조 분말로서 첨가된다.
"관류 배양"이라는 용어는 세포 배양물에 액체 배양 배지의 첨가(증분 또는 연속) 및 세포 배양물로부터 액체 배양 배지의 제거를 모두 포함하는 배양 방법을 의미한다. 제거 및 추가는 동시에 또는 순차적으로 수행하거나 둘을 조합하여 수행할 수 있다. 또한, 제거 및 추가를 연속적으로 수행할 수 있다.
제거된 액체 배양 배지의 부피 및 첨가된 액체 배양 배지의 부피는 일부 경우에 배양 기간의 전체 또는 일부에 걸쳐 각각의 24시간 (또는 대안적으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시간 기간 또는 24시간 초과의 증분 시간 기간) 기간 동안 대략 동일하게 유지될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 액체 배양 배지의 부피가 제거되는 속도 (볼륨/시간 단위) 및 액체 배양 배지의 부피가 첨가되는 속도 (볼륨/시간 단위)는 다양할 수 있다. 액체 배양 배지의 부피가 제거되는 속도 (볼륨/시간 단위) 및 액체 배양 배지의 부피가 첨가되는 속도 (볼륨/시간 단위)는 대략 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적으로, 제거 및 추가된 부피는 배양 기간 동안 24시간 (또는 대안적으로, 1시간 내지 약 24시간의 증분 시간 기간 또는 24시간 초과의 증분 시간 기간)마다 변경될 수 있다(예: 점진적으로 증가). 예를 들어, 배양 기간에 걸쳐 각각의 24시간 기간 (또는 대안적으로, 약 1시간 내지 24시간 초과의 증분 시간 기간 또는 24시간 초과의 증분 기간) 내에 제거된 액체 배양 배지의 부피 및 추가되는 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간 동안 증가 (예: 점진적으로 또는 시차를 두고 증가)될 수 있다.
액체 배양 배지의 부피는 예를 들어 피펫팅을 사용하여 세포를 침전시키고 액체 배양 배지의 부피를 제거하거나, 또는 원심력의 사용을 적어도 부분적으로 포함할 수 있는 방법에 의해 용기(예: 생물반응기)로부터 액체 배양 배지의 부피를 제거할 수 있는 기계적 시스템에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 액체 배양 배지의 부피는 적혈구 전구 세포 및 탈핵 적혈구를 배제하는 분자량 컷오프를 갖는 멸균 막을 통해 액체 배양 배지 부피의 스며들거나 중력 흐름에 의해 제거될 수 있다.
액체 배양 배지의 부피는 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프에 의해 자동화된 방식으로 용기(예를 들어, 생물반응기)에 추가될 수 있다.
"동물성 성분이 없는 액체 배양 배지"라는 용어는 포유동물 유래 성분(예: 단백질 또는 혈청)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"무혈청 액체배지"라 함은 포유동물의 혈청을 포함하지 않는 액체배지를 말한다.
"화학적으로 정의된 액체 배양 배지"라는 용어는 모든 화학 성분이 알려진 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지는 일반적으로 알부민과 지질의 복합 혼합물을 포함하기 때문에 태아 혈청, 혈청 알부민 또는 혈청 알부민을 포함하지 않는다.
용어 "교반(agitation)"은 용기 내에서 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 세포 중 임의의 것을 포함하는 세포 배양물)의 이동을 의미한다. 교반은 임의의 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 회전식 진탕기와 같은 원형 또는 타원형 운동으로 세포 배양물을 함유하는 용기를 이동시키는 기구를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용기를 기울이거나 세포 배양물을 함유하는 용기를 굴려서 교반을 수행할 수 있다. 일부 실시예에서, 세포 배양물의 교반은 세포 배양물을 함유하는 생물반응기에서 임펠러의 사용을 통해 발생할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 세포 배양은 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 적어도 일부에 대한 세포 배양물의 교반을 포함하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에 사용하기 위해 여기에 설명되어 있다. 당업계에 공지된 다른 적절한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 시퀀스, 데이터베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 충돌하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 관류 배양된 M-기 적혈구 세포 및 대조군 조건에서 배양된 M-기 적혈구의 탈핵 비율을 나타낸다. M상은 여기에 설명된 방법의 단계 (d)에 해당한다.
도 2는 관류 배양된 M기 적혈구 세포 및 대조군 조건에서 배양된 적혈구의 생존 세포 밀도를 나타낸다.
도 3은 관류 배양된 D-기 적혈구의 생존 세포 밀도 및 생존율을 나타낸다. D-상은 여기에 설명된 방법의 단계 (b)에 해당한다.
탈핵 적혈구 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다. 또한 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식(batch) 또는 유가식(fed batch); (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계로서, 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다. 또한 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL; (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계; (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하고, 여기서 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 종료 시 탈핵 속도 또는 탈핵 세포의 백분율의 증가((예를 들어, 적어도 1% 내지 약 300% 증가(예를 들어, 약 1% 내지 약 280% 증가, 약 1% 내지 약 260% 증가, 약 1% 내지 약 240% 증가, 약 1% 내지 약 220% 증가, 약 1% 내지 약 200% 증가, 약 1% 내지 약 180% 증가, 약 1% 내지 약 160% 증가, 약 1% 증가에서 140% 증가, 약 1% 증가에서 약 120% 증가, 약 1% 증가에서 약 100% 증가, 약 1% 증가에서 약 80% 증가, 약 1% 증가에서 약 60% 증가 , 약 1% 증가에서 약 40% 증가, 약 1% 증가에서 약 20% 증가, 약 1% 증가에서 약 10% 증가, 약 1% 증가에서 약 5% 증가, 약 5% 증가에서 약 300% 증가, 약 5%에서 약 280% 증가, 약 5%에서 약 260% 증가, 약 5%에서 약 240% 증가, 약 5%에서 약 220 % 증가, 약 5%에서 약 200% 증가, 약 5%에서 약 180% 증가, 약 5%에서 약 160% 증가 약 5% 증가에서 약 140% 증가, 약 5%에서 약 120% 증가, 약 5% 증가에서 약 100% 증가, 약 5% 증가에서 약 80% 증가, 약5% 증가에서 약 60% 증가, 5% 증가에서 약 40% 증가, 약 5% 증가에서 약 20% 증가, 약 5% 증가에서 약 10% 증가, 약 10%에서 300% 증가, 약 10% 에서 약 280% 증가, 약 10% 에서 약 260% 증가, 약 10% 에서 약 240% 증가, 약 10% 에서 약 220% 증가, 약 10% 에서 약 200% 증가, 약 10% 에서 약 180% 증가, 약 10% 에서 약 160% 증가, 약 10% 에서 약 140% 증가, 약 10% 에서 약 120% 증가로, 약 10% 증가에서 약 100% 증가, 약 10% 증가에서 약 80% 증가, 약 10% 증가에서 약 60% 증가, 약 10% 증가에서 약 40% 증가, 약 10% 증가에서 약 20% 증가, 약 20% 증가에서 약 300% 증가, 약 20% 내지 약 280% 증가, 약 20% 내지 약 260% 증가, 약 20% 내지 약 240% 증가, 약 20% 내지 약 220% 증가, 약 20% 내지 약 200% 증가, 약 20% 내지 약 180% 증가, 약 20% 내지 약 160% 증가, 약 20% 내지 약 140% 증가, 약 20% 내지 약 120% 증가, 약 20% 증가에서 약 100% 증가, 약 20% 증가에서 약 80% 증가, 약 20% 증가에서 약 60% 증가, 약 20% 증가에서 약 40% 증가, 약 40% 증가에서 약 300% 증가, 약 40%에서 약 280% 증가, 약 40%에서 약 260% 증가, 약 40%에서 약 240% 증가, 약 40 %에서 약 220% 증가, 약 40%에서 약 200% 증가, 약 40%에서 약 180% 증가, 약 40%에서 약 160% 증가, 약 40%에서 약 140 % 증가, 약 40%에서 약 120% 증가, 약 40%에서 약 100% 증가, 약 40% 증가에서 약 80% 증가, 약 40% 증가에서 약 60% 증가, 약 60% 증가에서 약 300% 증가, 약 60%에서 약 280% 증가, 약 60% 내지 약 260% 증가, 약 60% 내지 약 240% 증가, 약 60% 내지 약 220% 증가, 약 60% 내지 약 200% 증가, 약 60% 내지 약 180% 증가 약 60% 내지 약 160% 증가, 약 60% 내지 약 140% 증가, 약 60% 내지 약 120% 증가, 약 60% 내지 약 100% 증가, 약 60% 증가에서 약 80% 증가, 약 80% 증가에서 약 300% 증가, 약 80%에서 약 280% 증가, 약 80%에서 약 260% 증가, 약 80%에서 약 240 % 증가, 약 80% 내지 약 220% 증가, 약 80% 내지 약 200% 증가, 약 80% 내지 약 180% 증가, 약 80% 내지 약 160% 증가, 약 80% 증가에서 약 140% 증가, 약 80%에서 약 120% 증가, 약 80% 증가 약 100% 증가, 약 100% 증가 내지 약 300% 증가, 약 100% 내지 약 280% 증가, 약 100% 내지 약 260% 증가, 약 100% 내지 약 240% 증가, 약 100% 내지 약 220% 증가, 약 100% 내지 약 200% 증가, 약 100% 내지 약 180% 증가, 약 100% 내지 약 160% 증가, 약 100% 증가 약 140% 증가, 약 100% 내지 약 120% 증가, 약 120% 증가 내지 약 300% 증가, 약 120% 내지 약 280% 증가, 약 120% 내지 약 260% 증가, 약 120% 내지 약 240% 증가, 약 120% 내지 약 220% 증가, 약 120% 내지 약 200% 증가, 약 120% 내지 약 180% 증가, 약 120% 내지 약 160% 증가, 약 120% 증가에서 약 140% 증가, 약 140% 증가에서 약 300% 증가, 약 140%에서 약 280% 증가, 약 140%에서 약 260% 증가, 약 140% 내지 약 240% 증가, 약 140% 내지 약 220% 증가, 약140% 내지 약 200% 증가, 약 140% 내지 약 180% 증가, 약 140% 내지 약 160% 증가, 약 160% 증가 내지 약 300% 증가, 약 160% 내지 약a 280% 증가, 약 160%에서 약 260% 증가, 약 160%에서 약 240% 증가, 약 160%에서 약 220% 증가, 약 160%에서 약 200% 증가, 약 160 % 내지 약 180% 증가, 약 180% 증가 내지 약 300% 증가, 약 180% 내지 약 280% 증가, 약 180% 내지 약 260% 증가, 약 180% 내지 약 240% 증가 , 약 180% 내지 약 220% 증가, 약 180% 내지 약 200% 증가, 약 200% 내지 약 300% 증가, 약 200% 내지 약 280% 증가, 약 200% 내지 약 260% 증가, 약 200% 내지 약 240% 증가, 약 200% 내지 약 220% 증가, 약 220% 증가 내지 약 300% 증가, 약 220% 내지 약 280% 증가, 약 약 220%에서 약 260% 증가, 약 220%에서 약 240% 증가, 약 240 % 증가에서 약 300% 증가, 약 240%에서 약 280% 증가, 약 240%에서 약 260% 증가, 약 260%에서 약 300% 증가, 약 260%에서 약 280% 증가 , 또는 약 280% 증가에서 약 300% 증가))를 제공하며, 예를 들어, 분화 또는 성숙 동안 관류 배양의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 분화 또는 성숙 동안 관류 배양의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교하여 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 종료 시에 탈핵 적혈구 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 탈핵 적혈구 중 임의의 것)의 농도, 수 또는 수율의 약 1% 증가 내지 약 300% 증가 (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)를 제공한다.
일부 예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 예를 들어 분화 또는 성숙 동안 관류 배양의 사용을 포함하지 않는 유사한 방법과 비교하여 본 명세서에 기재된 임의의 방법 동안 전구 적혈구 세포당 평균 세포 분열 수의 약 1% 증가 내지 약 300% 증가 (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)를 제공한다.
이러한 방법의 비제한적인 측면은 아래에 설명되어 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 아래에 열거된 예시적인 실시예는 임의의 조합으로 사용될 수 있고, 당해 분야에 공지된 다른 실시예와 조합될 수 있다.
진탕 플라스크(Shake Flask)
여기에 설명된 방법의 일부 측면에는 진탕 플라스크의 사용이 포함된다. 일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 2mL 내지 약 5L, 약 2mL 내지 약 4.5L, 약 2mL 내지 약 4L, 약 2mL 내지 약 3.5L, 약 2mL 내지 약 3L, 약 2 mL 내지 약 2.5 L, 약 2 mL 내지 약 2 L, 약 2 mL 내지 약 1.5 L, 약 2 mL 내지 약 1.0 L, 약 2 mL 내지 약 950 mL, 약 2 mL 내지 약 900 mL, 약 2 mL 내지 약 850 mL, 약 2 mL 내지 약 800 mL, 약 2 mL 내지 약 750 mL, 약 2 mL 내지 약 700 mL, 약 2 mL 내지 약 650 mL, 약 2 mL 내지 약 600 mL, 약 2 mL 내지 약 550 mL, 약 2 mL 내지 약 500 mL, 약 2 mL 내지 약 450 mL, 약 2 mL 내지 약 400 mL, 약 2 mL 내지 약 350 mL, 약 2 mL 내지 약 300 mL, 약 2 mL 내지 약 250 mL, 약 2 mL 내지 약 200 mL, 약 2 mL 내지 약 180 mL, 약 2 mL 내지 약 160 mL, 약 2 mL 내지 약 140 mL, 약 2 mL 내지 약 120 mL, 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 10mL, 약 2mL 내지 약 5mL, 약 5mL 내지 약 5L, 약 5mL 내지 약 4.5L, 약 5mL 내지 약 4L, 약 5mL 내지 약 3.5L, 약 5mL 내지 약 3L, 약 5 mL 내지 약 2.5 L, 약 5 mL 내지 약 2 L, 약 5 mL 내지 약 1.5 L, 약 5 mL 내지 약 1.0 L, 약 5 mL 내지 약 950 mL, 약 5 mL 내지 약 900 mL, 약 5 mL 내지 약 850 mL, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 750 mL, 약 5 mL 내지 약 700 mL, 약 5 mL 내지 약 650 mL, 약 5 mL 내지 약 600 mL, 약 5 mL 내지 약 550 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 5 L, 약 10 mL 내지 약 4.5 L, 약 10 mL 내지 약 4 L, 약 10 mL 내지 약 3.5 L, 약 10 mL 내지 약 3 L, 약 10 mL 내지 약 2.5 L, 약 10 mL 약 2 L, 약 10 mL 내지 약 1.5 L, 약 10 mL 내지 약 1.0 L, 약 10 mL 내지 약 950 mL, 약 10 mL 내지 약 900 mL, 약 10 mL 내지 약 850 mL, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 750 mL, 약 10 mL 내지 약 700 mL, 약 10 mL 내지 약 650 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 550 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 180 mL, 약 10 mL 내지 약 160 mL, 약 10 mL 내지 약 140 mL, 약 10 mL 내지 약 120 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 5 L, 약 20 mL 내지 약 4.5 L, 약 20 mL 내지 약 4 L, 약 20 mL 내지 약 3.5 L, 약 20 mL 내지 약 3 L, 약 20 mL 내지 약 2.5 L, 약 20 mL 내지 약 2 L, 약 20 mL 내지 약 1.5 L, 약 20mL 내지 약 1.0L, 약 20mL 내지 약 950mL, 약 20mL 내지 약 900mL, 약 20mL 내지 약 850mL, 약 20mL 내지 약 800mL, 약 20mL 내지 약 750mL, 약 20 mL 내지 약 700 mL, 약 20 mL 내지 약 650 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 550 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 5 L, 약 40 mL 내지 약 4.5 L, 약 40 mL 내지 약 4 L, 약 40 mL 내지 약 3.5 L, 약 40 mL 내지 약 3 L, 약 40 mL 내지 약 2.5 L, 약 40 mL 내지 약 2 L, 약 40 mL 내지 약 1.5 L, 약 40 mL 내지 약 1.0 L, 약 40 mL 내지 약 950 mL, 약 40 mL 내지 약 900 mL, 약 40 mL 내지 약 850 mL, 약 40 mL 내지 약 800 mL, 약 40 mL 내지 약 750 mL, 약 40 mL 내지 약 700 mL, 약 40 mL 내지 약 650 mL, 약 40 mL 내지 약 600 mL, 약 40 mL 내지 약 550 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400 mL, 약 40 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 40 mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80 mL, 약 40 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 5 L, 약 60 mL 내지 약 4.5 L, 약 60 mL 내지 약 4 L, 약 60mL 내지 약 3.5 L, 약 60 mL 내지 약 3 L, 약 60 mL 내지 약 2.5 L, 약 60 mL 내지 약 2 L, 약 60 mL 내지 약 1.5 L, 약 60 mL 내지 약 1.0 L, 약 60 mL 내지 약 950 mL, 약 60 mL 내지 약 900 mL, 약 60 mL 내지 약 850 mL, 약 60 mL 내지 약 800 mL, 약 60 mL 내지 약 750 mL, 약 60 mL 내지 약 700 mL, 약 60 mL 내지 약 650 mL, 약 60 mL 내지 약 600 mL, 약 60 mL 내지 약 550 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140 mL, 약 60 mL 내지 약 120 mL, 약 60 mL 내지 약 100 mL, 약 60 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 5 L, 약 80 mL 내지 약 4.5 L, 약 80 mL 내지 약 4 L, 약 80 mL 내지 약 3.5 L, 약 80mL 내지 약 3L, 약 80mL 내지 약 2.5L, 약 80mL 내지 약 2L, 약 80mL 내지 약 1.5L, 약 80 mL 내지 약 1.0 L, 약 80 mL 내지 약 950 mL, 약 80 mL 내지 약 900 mL, 약 80 mL 내지 약 850 mL, 약 80 mL 내지 약 800 mL, 약 80 mL 내지 약 750 mL, 약 80 mL 내지 약 700mL, 약 80mL 내지 약 650mL, 약 80mL 내지 약 600mL, 약 80mL 내지 약 550mL, 약 80mL 내지 약 500mL, 약 80mL 내지 약 450mL, 약 80mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL , 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 5 L, 약 100 mL 내지 약 4.5 L, 약 100 mL 내지 약 4 L, 약 100 mL 내지 약 3.5 L, 약 100 mL 내지 약 3 L, 약 100 mL 내지 약 2.5 L, 약 100 mL 내지 약 2 L, 약 100 mL 내지 약 1.5 L, 약 100 mL 내지 약 1.0 L, 약 100 mL 내지 약 950mL, 약 100mL 내지 약 900mL, 약 100mL 내지 약 850mL, 약 100mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 750 mL, 약 100 mL 내지 약 700 mL, 약 100 mL 내지 약 650 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 550 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 5 L, 약 120 mL 내지 약 4.5 L, 약 120 mL 내지 약 4 L, 약 120 mL 내지 약 3.5 L, 약 120 mL 내지 약 3 L, 약 120 mL 내지 약 2.5 L, 약 120 mL 내지 약 2 L, 약 120 mL 내지 약 1.5 L, 약 120 mL 내지 약 1.0 L, 약 120 mL 내지 약 950 mL, 약 120 mL 내지 약 900 mL, 약 120 mL 내지 약 850 mL, 약 120 mL 내지 약 800 mL, 약 120 mL 내지 약 750 mL, 약 120 mL 내지 약 700 mL, 약 120 mL 내지 약 650 mL, 약 120 mL 내지 약 600 mL, 약 120 mL 내지 약 550 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 내지 약 450 mL, 약 120 mL 내지 약 400 mL, 약 120 mL 내지 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL , 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 5 L, 약 140 mL 내지 약 4.5 L, 약 140 mL 내지 약 4 L, 약 140 mL 내지 약 3.5 L, 약 140 mL 내지 약 3 L, 약 140 mL 내지 약 2.5 L, 약 140 mL 내지 약 2 L, 약 140 mL 내지 약 1.5 L, 약 140 mL 약 1.0 L, 약 140 mL 내지 약 950 mL, 약 140 mL 내지 약 900 mL, 약 140 mL 내지 약 850 mL, 약 140 mL 내지 약 800 mL, 약 140 mL 내지 약 750 mL, 약 140 mL 내지 약 700 mL, 약 140 mL 내지 약 650 mL, 약 140 mL 내지 약 600 mL, 약 140 mL 내지 약 550 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350 mL, 약 140 mL 내지 약 300 mL, 약 140 mL내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 5 L, 약 160 mL 내지 약 4.5 L, 약 160 mL 내지 약 4 L, 약 160mL 내지 약 3.5L, 약 160mL 내지 약 3L, 약 160mL 내지 약 2.5L, 약 160mL 내지 약 2L, 약 160mL 내지 약 1.5L, 약 160mL 내지 약 1.0L, 약 160 mL 내지 약 950 mL, 약 160 mL 내지 약 900 mL, 약 160 mL 내지 약 850 mL, 약 160 mL 내지 약 800 mL, 약 160 mL 내지 약 750 mL, 약 160 mL 내지 약 700 mL, 약 160 mL 내지 약 650 mL, 약 160 mL 내지 약 600 mL, 약 160 mL 내지 약 550 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 5 L, 약 180 mL 내지 약 4.5 L, 약 180mL 내지 약 4L, 약 180mL 내지 약 3.5L, 약 180mL 내지 약 3 L, 약 180 mL 내지 약 2.5 L, 약 180 mL 내지 약 2 L, 약 180 mL 내지 약 1.5 L, 약 180 mL 내지 약 1.0 L, 약 180 mL 내지 약 950 mL, 약 180 mL 내지 약 900 mL, 약 180 mL 내지 약 850 mL, 약 180 mL 내지 약 800 mL, 약 180 mL 내지 약 750 mL, 약 180 mL 내지 약 700 mL, 약 180 mL 내지 약 650 mL, 약 180 mL 내지 약 600 mL, 약 180 mL 내지 약 550 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 5 L, 약 200 mL 내지 약 4.5 L, 약 200 mL 내지 약 4 L, 약 200 mL 내지 약 3.5 L, 약 200 mL 내지 약 3 L, 약 200mL 내지 약 2.5L, 약 200mL 내지 약 2L, 약 200mL 내지 약 1.5L, 약 200mL 내지 약 1.0L, 약 200mL 내지 약 950mL, 약 200mL 내지 약 900mL, 약 200mL 내지 약 850mL, 약 200mL 내지 약 800mL, 약 200mL 내지 약 750mL, 약 200 mL 내지 약 700 mL, 약 200 mL 내지 약 650 mL, 약 200 mL 내지 약 600 mL, 약 200 mL 내지 약 550 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 5 L, 약 250 mL 내지 약 4.5 L, 약 250 mL 내지 약 4 L, 약 250 mL 내지 약 3.5 L, 약 250 mL 내지 약 3 L, 약 250 mL 내지 약 2.5 L, 약 250 mL 내지 약 2 L, 약 250 mL 내지 약 1.5 L, 약 250 mL 내지 약 1.0 L, 약 250 mL 내지 약 950 mL, 약 250 mL 내지 약 900 mL, 약 250 mL 내지 약 850 mL, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 750 mL, 약 250 mL 내지 약 700 mL, 약 250 mL 내지 약 650 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250 mL 내지 약 550 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350mL, 약 250mL 내지 약 300mL, 약 300mL 내지 약 5L, 약 300 mL 내지 약 4.5 L, 약 300 mL 내지 약 4 L, 약 300 mL 내지 약 3.5 L, 약 300 mL 내지 약 3 L, 약 300 mL 내지 약 2.5 L, 약 300 mL 내지 약 2 L, 약 300 mL 내지 약 1.5 L, 약 300 mL 내지 약 1.0 L, 약 300 mL 내지 약 950 mL, 약 300 mL 내지 약 900 mL, 약 300 mL 내지 약 850 mL, 약 300 mL 내지 약 800 mL, 약 300 mL 내지 약 750 mL, 약 300 mL 내지 약 700 mL, 약 300 mL 내지 약 650 mL, 약 300 mL 내지 약 600 mL, 약 300 mL 내지 약 550 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 3 L, 약 350 mL 내지 약 2.5 L, 약 350 mL 내지 약 2 L, 약 350 mL 내지 약 1.5 L, 약 350 mL 내지 약 1.0 L, 약 350 mL 내지 약 950 mL, 약 350 mL 내지 약 900 mL, 약 350 mL 내지 약 850 mL, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350 mL 내지 약 750 mL, 약 350 mL 내지 약 700mL, 약 350mL 내지 약 650mL, 약 350mL 내지 약 600mL, 약350mL 내지 약 550mL, 약 350mL 내지 약 500mL, 약 350mL 내지 약 450mL, 약 350mL 내지 약 400mL, 약 400mL 내지 약 5L, 약 400mL 내지 약 4.5L, 약 400 mL 내지 약 4 L, 약 400 mL 내지 약 3.5 L, 약 400 mL 내지 약 3 L, 약 400 mL 내지 약 2.5 L, 약 400 mL 내지 약 2 L, 약 400 mL 내지 약 1.5 L, 약 400 mL 내지 약 1.0 L, 약 400 mL 내지 약 950 mL, 약 400 mL 내지 약 900 mL, 약 400 mL 내지 약 850 mL, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 750 mL, 약 400 mL 내지 약 700 mL, 약 400 mL 내지 약 650 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 550 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 3 L, 약 450 mL 내지 약 2.5 L, 약 450 mL 내지 약 2 L, 약 450 mL 내지 약 1.5 L, 약 450 mL 내지 약 1.0 L, 약 450 mL 내지 약 950 mL, 약 450 mL 내지 약 900 mL, 약 450 mL 내지 약 850 mL, 약 450 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 750 mL, 약 450 mL 내지 약 700 mL, 약 450 mL 내지 약 650 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 550 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 5 L, 약 500 mL 내지 약 4.5 L, 약 500 mL 내지 약 4 L, 약 500 mL 내지 약 3.5 L, 약 500 mL 내지 약 3 L, 약 500 mL 내지 약 2.5 L, 약 500 mL 내지 약 2 L, 약 500 mL 내지 약 1.5 L, 약 500mL 내지 약 1.0L, 약 500mL 내지 약 950mL, 약 500mL 내지 약 900mL, 약 500mL 내지 약 850mL, 약 500mL 내지 약 800mL, 약 500mL 내지 약 750mL, 약 500 mL 내지 약 700 mL, 약 500 mL 내지 약 650 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 500 mL 내지 약 550 mL, 약 550 mL 내지 약 5 L, 약 550 mL 내지 약 4.5 L, 약 550 mL 내지 약 4 L, 약 550 mL 내지 약 3.5 L, 약 550 mL 내지 약 3 L, 약 550 mL 내지 약 2.5 L, 약 550 mL 내지 약 2 L, 약 550 mL 내지 약 1.5 L, 약 550 mL 내지 약 1.0 L, 약 550 mL 내지 약 950 mL, 약 550 mL 내지 약 900 mL, 약 550 mL 내지 약 8 50 mL, 약 550 mL 내지 약 800 mL, 약 550 mL 내지 약 750 mL, 약 550 mL 내지 약 700 mL, 약 550 mL 내지 약 650 mL, 약 550 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 5 L , 약 600 mL 내지 약 4.5 L, 약 600 mL 내지 약 4 L, 약 600 mL 내지 약 3.5 L, 약 600 mL 내지 약 3 L, 약 600 mL 내지 약 2.5 L, 약 600 mL 내지 약 2 L, 약 600 mL 내지 약 1.5 L, 약 600 mL 내지 약 1.0 L, 약 600 mL 내지 약 950 mL, 약 600 mL 내지 약 900 mL, 약 600 mL 내지 약 850 mL, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 600 mL 약 750 mL 내지 약 750 mL, 약 600 mL 내지 약 700 mL, 약 600 mL 내지 약 650 mL, 약 650 mL 내지 약 5 L, 약 650 mL 내지 약 4.5 L, 약 650 mL 내지 약 4 L, 약 650 mL 내지 약 3.5 L, 약 650 mL 내지 약 3 L, 약 650 mL 내지 약 2.5 L, 약 650 mL 내지 약 2 L, 약 650 mL 내지 약 1.5 L, 약 650 mL 내지 약 1.0 L, 약 650 mL 내지 약 950 mL , 약 650 mL 내지 약 900 mL, 약 650 mL 내지 약 850 mL, 약 650 mL 내지 약 800 mL, 약 650 mL 내지 약 750 mL, 약 650 mL 내지 약 700 mL, 약 700 mL 내지 약 5 L, 약 700 mL 내지 약 4.5 L, 약 700 mL 내지 약 4 L, 약 700 mL 내지 약 3.5 L, 약 700 mL 약 3 L, 약 700 mL 내지 약 2.5 L, 약 700 mL 내지 약 2 L, 약 700 mL 내지 약 1.5 L, 약 700 mL 내지 약 1.0 L, 약 700 mL 내지 약 950 mL, 약 700 mL 내지 약 900 mL, 약 700 mL 내지 약 850 mL, 약 700 mL 내지 약 800 mL, 약 700 mL 내지 약 750 mL, 약 750 mL 내지 약 5 L, 약 750 mL 내지 약 4.5 L, 약 750 mL 내지 약 4 L , 약 750 mL 내지 약 3.5 L, 약 750 mL 내지 약 3 L, 약 750 mL 내지 약 2.5 L, 약 750 mL 내지 약 2 L, 약 750 mL 내지 약 1.5 L, 약 750 mL 내지 약 1.0 L, 약 750 mL 내지 약 950 mL, 약 750 mL 내지 약 900 mL, 약 750 mL 내지 약 850 mL, 약 750 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 5 L, 약 800 mL 내지 약 4.5 L, 약 800 mL 약 4L, 약 800mL 내지 약 3.5L, 약 800mL 내지 약 3L, 약 800mL 내지 약 2.5L, 약 800mL 내지 약 2L, 약 800mL 내지 약 1.5L, 약 800mL 내지 약 1.0L, 약 800mL 내지 약 950mL, 약 800mL 내지 약 900mL, 약 800mL 내지 약 850mL, 약 850 mL 내지 약 5 L, 약 850 mL 내지 약 4.5 L, 약 850 mL 내지 약 4 L, 약 850 mL 내지 약 3.5 L, 약 850 mL 내지 약 3 L, 약 850 mL 내지 약 2.5 L, 약 850 mL 내지 약 2 L, 약 850 mL 내지 약 1.5 L, 약 850 mL 내지 약 1.0 L, 약 850 mL 내지 약 950 mL, 약 850 mL 내지 약 900 mL, 약 900 mL 내지 약 5 L, 약 900 mL 내지 약 4.5 L, 약 900mL 내지 약 4L, 약 900mL 내지 약 3.5L, 약 900mL 내지 약 3L, 약 900mL 내지 약 2.5L, 약 900mL 내지 약 2L, 약 900mL 내지 약 1.5L, 약 900 mL 내지 약 1.0 L, 약 900 mL 내지 약 950 mL, 약 950 mL 내지 약 5 L, 약 950 mL 내지 약 4.5 L, 약 950 mL 내지 약 4 L, 약 950 mL 내지 약 3.5 L, 약 950 mL 내지 약 3L, 약 950mL 내지 약 2.5L, 약 950mL 내지 약 2L, 약 950mL 내지 약 1.5L, 약 95 0 mL 내지 약 1.0 L, 약 1.0 L 내지 약 5 L, 약 1.0 L 내지 약 4.5 L, 약 1.0 L 내지 약 4 L, 약 1.0 L 내지 약 3.5 L, 약 1.0 L 내지 약 3 L, 1.0 L 내지 약 2.5 L, 1.0 L 내지 약 2 L, 1.0 L 내지 약 1.5 L, 약 1.5 L 내지 약 5 L, 약 1.5 L 내지 약 4.5 L, 약 1.5 L 내지 약 4 L, 약 1.5 L 내지 약 3.5 L, 약 1.5 L 내지 약 3 L, 약 1.5 L 내지 약 2.5 L, 약 1.5 L 내지 약 2 L, 약 2 L 내지 약 5 L, 약 2 L 내지 약 4.5 L, 약 2 L 내지 약 4 L, 약 2 L 내지 약 3.5L, 약 2L 내지 약 3L, 약 2L 내지 약 2.5L, 약 2.5L 내지 약 5L, 약 2.5L 내지 약 4.5L, 약 2.5L 내지 약 4L, 약 2.5L 내지 약 4L, 약 2.5L 내지 약 3.5 L, 약 2.5 L 내지 약 3 L, 약 3 L 내지 약 5 L, 약 3 L 내지 약 4.5 L, 약 3 L 내지 약 4 L, 약 3 L 내지 약 3.5 L, 약 3.5 L 내지 약 5 L, 약 3.5L 내지 약 4.5L, 약 3.5L 내지 약 4L, 약 4L 내지 약 5L, 약 4L 내지 약 4.5L, 또는 약 4.5L 내지 약 5L의 부피를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 진탕 플라스크는 약 0.1 x g 내지 약 50 x g((예를 들어, 약 0.1 xg 내지 약 40 xg, 약 0.1 xg 내지 약 30 xg, 약 0.1 xg 내지 약 20 xg, 약 0.1 xg 내지 약 15 xg, 약 0.1 xg 내지 약 10 xg, 약 0.1 xg 내지 약 9.5 xg , 약 0.1 xg 내지 약 9.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 8.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 8.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 7.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 7.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 6.5 xg 0.1 xg 내지 약 6.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 5.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 5.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 4.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 4.1 xg, 약 0.1 xg 내지 약 4.0 xg, 약0.1 xg 내지 약 3.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 3.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 2.5 xg, 약 0.1 xg 내지 약 2.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 1.78 xg, 약 0.1 xg 내지 약 1.6 xg, 약 0.1 xg 1.4 xg, 약 0.1 xg 내지 약 1.2 xg, 약 0.1 xg 내지 약 1.0 xg, 약 0.1 xg 내지 약 0.8 xg, 약 0.1 xg 내지 약 0.6 xg, 약 0.1 xg 내지 약 0.4 xg, 약 0.1 xg 내지 약 0.23 xg , 약 0.23 xg 내지 약 50 xg, 약 0.23 xg 내지 약 40 xg, 약 0.23 xg 내지 약 30 xg, 약 0.23 xg 내지 약 20 xg, 약 0.23 xg 내지 약 15 xg, 약 0.23 xg 내지 약 10 xg, 약 0.23xg 내지 약 9.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 9.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 8.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 8.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 7.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 7.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 6.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 6.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 5.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 5.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 4.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 4.1 xg, 약 0.23 xg 내지 약 4.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 3.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 3.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 2.5 xg, 약 0.23 xg 내지 약 2.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 1.78 xg, 약 0.23 xg 내지 약 1.6 xg, 약 0.23 xg 내지 약 1.4 xg, 약 0.23 xg 내지 약 1.2 xg, 약 0.23 xg 내지 약 1.0 xg, 약 0.23 xg 내지 약 0.8 xg, 약 0.23 xg 내지 약 0.6 xg, 약 0.23 xg 내지 약 0.4 xg, 약 0.4 xg 내지 약 50 xg, 약 0.4 xg 내지 약 40 xg, 약 0.4 xg 내지 약 30 xg, 약 0.4 xg 내지 약 20 xg, 약 0.4 xg 내지 약 15 xg, 약 0.4 xg 내지 약 10 xg, 약 0.4 xg 내지 약 9.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 9.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 8.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 8.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 7.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 7.0 xg 약 0.4 xg 내지 약 6.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 6.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 5.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 5.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 4.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 4.1 xg, 약 0.4xg 내지 약 4.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 3.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 3.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 2.5 xg, 약 0.4 xg 내지 약 2.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 1.78 xg, 약 0.4 내지 약 1.6 xg, 약 0.4 xg 내지 약 1.4 xg, 약 0.4 xg 내지 약 1.2 xg, 약 0.4 xg 내지 약 1.0 xg, 약 0.4 xg 내지 약 0.8 xg, 약 0.4 xg 내지 약 0.6 xg, 약 0.6 xg 내지 약 0.6 xg, 약 0.6 xg 내지 약 40 xg, 약 0.6 xg 내지 약 30 xg, 약 0.6 xg 내지 약 20 xg, 약 0.6 xg 내지 약 15 xg, 약 0.6 xg 내지 약 10 xg, 약 0.6 xg 내지 약 9.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 9.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 8.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 8.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 7.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 7.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 6.5 xg, 약 0.6 xg 약 6.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 5.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 5.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 4.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 4.1 xg, 약 0.6 xg 내지 약 4.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 3.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 3.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 2.5 xg, 약 0.6 xg 내지 약 2.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 1.78 xg, 약 0.6 xg 내지 약 1.6 xg, 약 0.6 xg 내지 약 1.4 약 0.6 xg 내지 약 1.2 xg, 약 0.6 xg 내지 약 1.0 xg, 약 0.6 xg 내지 약 0.8 xg, 약 0.8 xg 내지 약 50 xg, 약 0.8 xg 내지 약 40 xg, 약 0.8 xg 내지 약 30 xg, 약 0.8 xg 내지 약 20 xg, 약 0.8 xg 내지 약 15 xg, 약 0.8 xg 내지 약 10 xg, 약 0.8 xg 내지 약 9.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 9.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 8.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 8.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 7.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 7.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 6.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 6.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 5.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약5.0 xg , 약 0.8 xg 내지 약 4.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 4.1 xg, 약 0.8 xg 내지 약 4.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 3.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 3.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 2.5 xg, 약 0.8 xg 내지 약 2.0 xg, 약 0.8 xg 내지 약 1.78 xg, 약 0.8 xg 내지 약 1.6 xg, 약 0.8 xg 내지 약 1.4 xg, 약 0.8 xg 내지 약 1.2 xg, 약 0.8 xg 내지 약 1.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 50 xg, 약 1.0 xg 내지 약 40 xg, 약 1.0 xg 내지 약 30 xg, 약 1.0 xg 내지 약 20 xg, 약 1.0 xg 내지 약 15 xg, 약 1.0 xg 내지 약 10 xg, 약 1.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 6.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 6.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 5.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 5.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 4.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 4.1 xg, 약 1.0 xg 내지 약 4.0 xg, 약 1.0 xg 약 3.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 3.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 2.5 xg, 약 1.0 xg 내지 약 2.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 1.78 xg, 약 1.0 xg 내지 약 1.6 xg, 약 1.0 xg 내지 약 1.0 xg, 약 1.0 xg 내지 약 1.2 xg, 약 1.2 xg 내지 약 50 xg, 약 1.2 xg 내지 약 40 xg, 약 1.2 xg 내지 약 30 xg, 약 1.2 xg 내지 약 20 xg, 약 1.2 xg 내지 약 15 xg, 약 1.2 xg 내지 약 10 xg, 약 1.2 xg 내지 약 9.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 9.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 8.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 8.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 7.5 xg, 약1.2 xg 내지 약 7.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 6.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 6.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 5.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 5.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 4.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 4.1 xg, 약 1.2 xg 내지 약 4.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 3.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 3.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 2.5 xg, 약 1.2 xg 내지 약 2.0 xg, 약 1.2 xg 내지 약 1.78 xg , 약 1.2 xg 내지 약 1.6 xg, 약 1.2 xg 내지 약 1.4 xg, 약 1.4 xg 내지 약 50 xg, 약 1.4 xg 내지 약 40 xg, 약 1.4 xg 내지 약 30 xg, 약 1.4 xg 내지 약 20 xg, 약 1.4 xg 내지 약 15 xg, 약 1.4 xg 내지 약 10 xg, 약 1.4 xg 내지 약 9.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 9.0 xg, 약 1.4 xg 내지 약 8.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 8.0 xg, 약 1.4 xg 약 7.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 7.0 xg, 약 1.4 xg 내지 약 6.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 6.0 xg, 약 1.4 xg 내지 약 5.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 5.0 xg, 약 1.4 xg 내지 4.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 4.1 xg, 약 1.4 xg 내지 약 4.0 xg, 약 1.4 xg 내지 약 3.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 3.0 xg, 약 1.4 xg 내지 약 2.5 xg, 약 1.4 xg 내지 약 2.0 xg 약 1.4 xg 내지 약 1.78 xg, 약 1.4 xg 내지 약 1.6 xg, 약 1.6 xg 내지 약 50 xg, 약 1.6 xg 내지 약 40 xg, 약 1.6 xg 내지 약 30 xg, 약 1.6 xg 내지 약 20 xg, 약 1.6 xg 내지 약 15 xg, 약 1.6 xg 내지 약 10 xg, 약 1.6 xg 내지 약 9.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 9.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 8.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 8.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 7.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 7.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 6.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 6.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 5.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 5.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 14.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 4.1 xg, 약 1.6 xg 내지 약 4.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 3.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 3.0 xg, 약 1.6 xg 내지 약 2.5 xg, 약 1.6 xg 내지 약 2.0 xg 약 1 .6 xg 내지 약 1.78 xg, 약 1.78 xg 내지 약 50 xg, 약 1.78 xg 내지 약 40 xg, 약 1.78 xg 내지 약 30 xg, 약 1.78 xg 내지 약 20 xg, 약 1.78 xg 내지 약 15 xg, 약 1.78 xg 내지 약 10 xg, 약 1.78 xg 내지 약 9.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 9.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 8.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 8.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 7.5 xg, 약1.78 xg 내지 약 7.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 6.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 6.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 5.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 5.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 4.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 4.1 xg, 약 1.78 xg 내지 약 4.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 3.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 3.0 xg, 약 1.78 xg 내지 약 2.5 xg, 약 1.78 xg 내지 약 2.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약50 xg, 약 2.0 xg 내지 약 40 xg, 약 2.0 xg 내지 약 30 xg, 약 2.0 xg 내지 약 20 xg, 약 2.0 xg 내지 약 15 xg, 약 2.0 xg 내지 약 10 xg, 약 2.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 6.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 6.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 5.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 5.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 4.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 4.1 xg, 약 2.0 xg 내지 약 4.0 xg, 약 2.0 xg 약 3.5 xg, 약 2.0 xg 내지 약 3.0 xg, 약 2.0 xg 내지 약 2.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 50 xg, 약 2.5 xg 내지 약 40 xg, 약 2.5 xg 내지 약 30 xg, 약 2.5 xg 내지 약 20 xg, 약 2.5 xg 내지 약 15 xg, 약 2.5 xg 내지 약 10 xg, 약 2.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 7.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 7.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 6.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 6.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 5.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 5.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 4.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 4.1 xg, 약 2.5 xg 내지 약 4.0 xg, 약 2.5 xg 내지 약 3.5 xg, 약 2.5 xg 내지 약 3.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 50 xg, 약 3.0 xg 내지 약 xg, 약 3.0 xg 내지 약 30 xg, 약 3.0 xg 내지 약 20 xg, 약 3.0 xg 내지 약 15 xg, 약 3.0 xg 내지 약 10 xg, 약 3.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 6.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 6.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 5.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 5.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 4.5 xg, 약 3.0 xg 내지 약 4.1 xg, 약 3.0 xg 내지 약 4.0 xg, 약 3.0 xg 내지 약 3.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 50 xg, 약 3.5 xg 내지 약 40 xg, 약 3.5 xg 내지 약 30 xg, 약 3.5 xg 내지 약 20 xg, 약 3.5 xg 내지 약 15 xg, 약 3.5 xg 내지 약 10 xg, 약 3.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 3.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 3.5 xg 내지 약 7.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 7.0 xg, 약 3.5 xg 내지 약 6.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 6.0 xg, 약 3.5 xg 내지 약 5.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 5.0 xg, 약 3.5 xg 내지 약 4.5 xg, 약 3.5 xg 내지 약 4.1 xg, 약 3.5 xg 내지 약 4.0 xg, 약 4.0 xg 50 xg, 약 4.0 xg 내지 약 40 xg, 약 4.0 xg 내지 약 30 xg, 약 4.0 xg 내지 약 20 xg, 약 4.0 xg 내지 약 15 xg, 약 4.0 xg 내지 약 10 xg, 약 4.0 xg 내지 약 9.5 xg , 약 4.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 4.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 4.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 4.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 4.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 4.0 xg 내지 약 6.5 xg, 약 4.0 xg 내지 약 6.0 xg, 약 4.0 xg 내지 약 5.5 xg, 약 4.0 xg 내지 약 5.0 xg, 약 4.0 xg 내지 약 4.5 xg, 약 4.0 xg 내지 약 4.1 xg, 약 4.1 xg 내지 약 50 xg, 약 4.1 xg 내지 약40 xg, 약 4.1 xg 내지 약 30 xg, 약 4.1 xg 내지 약 20 xg, 약 4.1 xg 내지 약 15 xg, 약 4.1 xg 내지 약 10 xg, 약 4.1 xg 내지 약 9.5 xg, 약 4.1 xg 내지 약 9.0 xg, 약 4.1 xg 내지 약 8.5 xg, 약 4.1 xg 내지 약 8.0 xg, 약 4.1 xg 내지 약 7.5 xg, 약 4.1 xg 내지 약 7.0 xg, 약 4.1 xg 내지 약 6.5 xg, 약 4.1 xg 내지 약 6.0 xg 약 4.1 xg 내지 약 5.5 xg, 약 4.1 xg 내지 약 5.0 xg, 약 4.1 xg 내지 약 4.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 50 xg, 약 4.5 xg 내지 약 40 xg, 약 4.5 xg 내지 약 30 xg, 약 4.5 xg 내지 약 20 xg, 약 4.5 xg 내지 약 15 xg, 약 4.5 xg 내지 약 10 xg, 약 4.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 4.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 4.5 xg 내지 약 7.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 7.0 xg, 약 4.5 xg 내지 약 6.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 6.0 xg, 약 4.5 xg 내지 약 5.5 xg, 약 4.5 xg 내지 약 5.0 xg, 약 5 .0 xg 내지 약 50 xg, 약 5.0 xg 내지 약 40 xg, 약 5.0 xg 내지 약 30 xg, 약 5.0 xg 내지 약 20 xg, 약 5.0 xg 내지 약 15 xg, 약 5.0 xg 내지 약 10 xg, 약 5.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 5.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 5.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 5.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 5.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 5.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 5.0 xg 약 6.5 xg, 약 5.0 xg 내지 약 6.0 xg, 약 5.0 xg 내지 약 5.5 xg, 약 5.5 xg 내지 약 50 xg, 약 5.5 xg 내지 약 40 xg, 약 5.5 xg 내지 약 30 xg, 약 5.5 xg 내지 약 20 xg, 약 5.5 xg 내지 약 15 xg, 약 5.5 xg 내지 약 10 xg, 약 5.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 5.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 5.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 5.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 5.5 xg 내지 약 7.5 xg, 약 5.5 xg 내지 약 7.0 xg, 약 5.5 xg 내지 약 6.5 xg, 약 5.5 xg 내지 약 6.0 xg, 약 6.0 xg 내지 약 50 xg, 약 6.0 xg 내지 약 40 xg, 약 6 xg 내지 약 30 xg, 약 6.0 xg 내지 약 20 xg, 약 6.0 xg 내지 약 15 xg, 약 6.0 xg 내지 약 10 xg, 약 6.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 6.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 6.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 6.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 6.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 6.0 xg 내지 약 7.0 xg, 약 6.0 xg 내지 약 6.5 xg, 약 6.5 xg 내지 약 50 xg, 약 6.5 xg 내지 약 40 xg, 약 6.5 xg 내지 약 30 xg, 약 6.5 xg 내지 약 20 xg, 약 6.5 xg 내지 약 15 xg, 약 6.5 xg 내지 약 10 xg, 약 6.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 6.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 6.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 6.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 6.5 xg 내지 약 7.5 xg, 약 6.5 xg 내지 약 7.0 xg, 약 7.0 xg 내지 약 50 xg, 약 7.0 xg 내지 약 40 xg, 약 7.0 xg 내지 약 30 , 약 7.0 xg 내지 약 20 xg, 약 7.0 xg 내지 약 15 xg, 약 7.0 xg 내지 약 10 xg, 약 7.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 7.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 7.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 7.0 xg 내지 약 8.0 xg, 약 7.0 xg 내지 약 7.5 xg, 약 7.5 xg 내지 약 50 xg, 약 7.5 xg 내지 약 40 xg, 약 7.5 xg 내지 약 30 xg, 약 7.5 xg 내지 약 20 xg, 약 7.5 xg 내지 약 15 xg, 약 7.5 xg 내지 약 10 xg, 약 7.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 7.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 7.5 xg 내지 약 8.5 xg, 약 7.5 xg 내지 약 8.0 xg, 약 8.0 xg 내지 약 50 xg, 약 8.0 xg 내지 약 40 xg, 약 8.0 xg 내지 약 30 xg, 약 8.0 xg 내지 약 20 xg, 약 8.0 xg 내지 약 15 xg, 약 8.0 xg 내지 약 10 xg, 약 8.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 8.0 xg 내지 약 9.0 xg, 약 8.0 xg 내지 약 8.5 xg, 약 8.5 xg 내지 약 50 xg, 약 8.5 xg 내지 약 40 xg, 약 8.5 xg 내지 약 30 xg, 약 8.5 xg 내지 약 20 xg, 약 8.5 xg 내지 약 15 xg, 약 8.5 xg 내지 약 10 xg, 약 8.5 xg 내지 약 9.5 xg, 약 8.5 xg 내지 약 9.0 xg, 약 9.0 xg 내지 약 50 xg, 약 9.0 xg 내지 약 40 xg, 약 9.0 xg 내지 약 30 xg, 약 9.0 xg 내지 약 20 xg, 약 9.0 xg 내지 약 15 xg, 약 9.0 xg 내지 약 10 xg, 약 9.0 xg 내지 약 9.5 xg, 약 9.5 xg 내지 약 50 xg, 약 9.5 xg 내지 약 40 xg, 약 9.5 xg 내지 약 30 xg, 약 9.5 xg 내지 약 20 xg, 약 9.5 xg 내지 약 15 xg, 약 9.5 xg 내지 약 10 xg, 약 10 xg 내지 약 50 xg, 약 10 xg 내지 약 40 xg, 약 10 xg 내지 약 30 xg, 약 10 xg 내지 약 20 xg, 약 10 xg 내지 약 15 xg, 약 15 xg 내지 약 50 xg, 약 15 xg 내지 약 40 xg, 약 15 xg 내지 약 30 xg, 약 15 xg 내지 약 20 xg, 약 20 xg 내지 약 50 xg, 약 20 xg 내지 약 40 xg, 약 20 xg 내지 약 30 xg, 약 30 xg 내지 약 50 xg, 약 30 xg 내지 약 40 xg, 또는 약 40 xg 내지 약 50 xg)의 교반과 함께 배양될 수 있다.
다양한 진탕 플라스크가 시판되고 있다. 진탕 플라스크의 추가의 비제한적인 측면은 당업계에 공지되어 있다.
진탕 튜브
여기에 설명된 방법의 일부 측면에는 진탕 튜브의 사용이 포함된다. 일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 1 mL 내지 약 500 mL, 약 1 mL 내지 약 450 mL, 약 1 mL 내지 약 400 mL, 약 1 mL 내지 약 350 mL, 약 1 mL 내지 약 300 mL, 약 1 mL 내지 약 250 mL, 약 1 mL 내지 약 200 mL, 약 1 mL 내지 약 180 mL, 약 1 mL 내지 약 160 mL, 약 1 mL 내지 약 140 mL, 약 1 mL 내지 약 120 mL, 약 1 mL 내지 약 100 mL, 약 1 mL 내지 약 80 mL, 약 1 mL 내지 약 60 mL, 약 1 mL 내지 약 40 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 1 mL 내지 약 2 mL, 약 2 mL 내지 약 500 mL, 약 2 mL 내지 약 450 mL, 약 2 mL 내지 약 400 mL, 약 2 mL 내지 약 350 mL, 약 2 mL 내지 약 300 mL, 약 2 mL 내지 약 250 mL, 약 2 mL 내지 약 200 mL, 약 2 mL 내지 약 180 mL, 약 2 mL 내지 약 160 mL, 약 2 mL 내지 약 140 mL, 약 2 mL 내지 약 120 mL, 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 10 mL, 약 2 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 180 mL, 약 10 mL 내지 약 160 mL, 약 10 mL 내지 약 140 mL, 약 10 mL 내지 약 120 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400 mL, 약 40 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 40 mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80 mL, 약 40 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140 mL, 약 60 mL 내지 약 120 mL, 약 60 mL 내지 약 100 mL, 약 60 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 500 mL, 약 80 mL 내지 약 450 mL, 약 80 mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL, 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 내지 약 450 mL, 약 120 mL 내지 약 400 mL, 약 120 mL 내지 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL, 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350 mL, 약 140 mL 내지 약 300 mL, 약 140 mL 내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 500mL, 약 400mL 내지 약 450mL, 또는 약 450mL 내지 약 500mL의 부피를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 진탕 튜브는 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)의 교반과 함께 배양될 수 있다.
다양한 진탕 튜브가 시판되고 있다. 진탕 튜브의 추가적인 비제한적인 측면은 당업계에 공지되어 있다.
배양 백
여기에 설명된 방법의 일부 측면에는 배양 백의 사용이 포함된다. 일부 예에서, 배양 백은 약 50mL 내지 약 500L, 약 50mL 내지 약 400L, 약 50mL 내지 약 300L, 약 50mL 내지 약 200L, 약 50mL 내지 약 100L, 약 50mL 내지 약 50L, 50mL 내지 약 25L, 약 50mL 내지 약 20L, 약 50mL 내지 약 15L, 약 50mL 내지 약 10L, 약 50mL 내지 약 8L, 약 50 mL 내지 약 6 L, 약 50 mL 내지 약 5 L, 약 50 mL 내지 약 4 L, 약 50 mL 내지 약 3 L, 약 50 mL 내지 약 2.5 L, 약 50 mL 내지 약 2.0 L, 약 50 mL 약 1.8 L, 약 50 mL 내지 약 1.6 L, 약 50 mL 내지 약 1.4 L, 약 50 mL 내지 약 1.2 L, 약 50 mL 내지 약 1.0 L, 약 50 mL 내지 약 900 mL, 약 50 mL 내지 약 800 mL, 약 50 mL 내지 약 700 mL, 약 50 mL 내지 약 600 mL, 약 50 mL 내지 약 500 mL, 약 50 mL 내지 약 450 mL, 약 50 mL 내지 약 400 mL, 약 50 mL 내지 약 350 mL, 약 50 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 250 mL, 약 50 mL 내지 약 200 mL, 약 50 mL 내지 약 150 mL, 약 50 mL 내지 약 100 mL, 약 50 mL 내지 약 75 mL, 약 75 mL 내지 약 500 L, 약 75 mL 내지 약 400 L, 약 75 mL 내지 약 300 L, 약 75 mL 내지 약 200 L, 약 75 mL 내지 약 100L, 약 75mL 내지 약 50L, 75mL 내지 약 25L, 약 75mL 내지 약 20L, 약 75mL 내지 약 15L, 약 75mL 내지 약 10L, 약 75mL 내지 약 8 L, 약 75 mL 내지 약 6 L, 약 75 mL 내지 약 5 L, 약 75 mL 내지 약 4 L, 약 75 mL 내지 약 3 L, 약 75 mL 내지 약 2.5 L, 약 75 mL 내지 약 2.0 L, 약 75 mL 내지 약 1.8 L, 약 75 mL 내지 약 1.6 L, 약 75 mL 내지 약 1.4 L, 약 75 mL 내지 약 1.2 L, 약 75 mL 내지 약 1.0 L, 약 75 mL 내지 약 900 mL, 약 75 mL 내지 약 800 mL, 약 75 mL 내지 약 700 mL, 약 75 mL 내지 약 600 mL, 약 75 mL 내지 약 500 mL, 약 75 mL 내지 약 450 mL, 약 75 mL 내지 약 400 mL, 약 75 mL 내지 약 350mL, 약 75mL 내지 약 300mL, 약 75mL 내지 약 250mL, 약 75mL 내지 약 200mL, 약 75mL 내지 약 150mL, 약 75 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 500 L, 약 100 mL 내지 약 400 L, 약 100 mL 내지 약 300 L, 약 100 mL 내지 약 200 L, 약 100 mL 내지 약 100 L, 약 100 mL 내지 약 50L, 100mL 내지 약 25L, 약 100mL 내지 약 20L, 약 100mL 내지 약 15L, 약 100mL 내지 약 10L, 약 100mL 내지 약 8L, 약 100mL 내지 약 6 L, 약 100 mL 내지 약 5 L, 약 100 mL 내지 약 4 L, 약 100 mL 내지 약 3 L, 약 100 mL 내지 약 2.5 L, 약 100 mL 내지 약 2.0 L, 약 100 mL 내지 약 1.8 L, 약 100 mL 내지 약 1.6 L, 약 100 mL 내지 약 1.4 L, 약 100 mL 내지 약 1.2 L, 약 100 mL 내지 약 1.0 L, 약 100 mL 내지 약 900 mL, 약 100 mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 700 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300mL, 약 100mL 내지 약 250mL, 약 100mL 내지 약 200mL, 약 100mL 내지 약 150 mL, 약 150 mL 내지 약 500 L, 약 150 mL 내지 약 400 L, 약 150 mL 내지 약 300 L, 약 150 mL 내지 약 200 L, 약 150 mL 내지 약 100 L, 약 150 mL 내지 약 50 L, 150 mL 내지 약 25 L, 약 150 mL 내지 약 20 L, 약 150 mL 내지 약 15 L, 약 150 mL 내지 약 10 L, 약 150 mL 내지 약 8 L, 약 150 mL 내지 약 6 L, 약 150 mL 내지 약 5 L, 약 150 mL 내지 약 4 L, 약 150 mL 내지 약 3 L, 약 150 mL 내지 약 2.5 L, 약 150 mL 내지 약 2.0 L, 약 150 mL 내지 약 1.8 L, 약 150 mL 내지 약 1.6 L, 약 150 mL 내지 약 1.4 L, 약 150 mL 내지 약 1.2 L, 약 150 mL 내지 약 1.0 L, 약 150 mL 내지 약 900 mL, 약 150 mL 내지 약 800 mL, 약 150 mL 내지 약 700 mL, 약 150 mL 내지 약 600 mL, 약 150 mL 내지 약 500 mL, 약 150 mL 내지 약 450 mL, 약 150 mL 내지 약 400 mL, 약 150 mL 내지 약 350 mL, 약 150 mL 내지 약 300 mL, 약 150mL 내지 약 250mL, 약 150mL 내지 약 200mL, 약 200mL 내지 약 500L, 약 200mL 내지 약 400 L, 약 200 mL 내지 약 300 L, 약 200 mL 내지 약 200 L, 약 200 mL 내지 약 100 L, 약 200 mL 내지 약 50 L, 200 mL 내지 약 25 L, 약 200 mL 내지 약 20 L, 약 200mL 내지 약 15L, 약 200mL 내지 약 10L, 약 200mL 내지 약 8L, 약 200mL 내지 약 6L, 약 200mL 내지 약 5L, 약 200mL 내지 약 4L, 약 200 mL 내지 약 3 L, 약 200 mL 내지 약 2.5 L, 약 200 mL 내지 약 2.0 L, 약 200 mL 내지 약 1.8 L, 약 200 mL 내지 약 1.6 L, 약 200 mL 내지 약 1.4 L, 약 200 mL 내지 약 1.2 L, 약 200 mL 내지 약 1.0 L, 약 200 mL 내지 약 900 mL, 약 200 mL 내지 약 800 mL, 약 200 mL 내지 약 700 mL, 약 200 mL 내지 약 600 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 500 L, 약 250mL 내지 약 400L, 약 250mL 내지 약 300L, 약 250mL 내지 약 200L, 약 250mL 내지 약 100L, 약 250mL 내지 약 50L, 250mL 내지 약 25L, 약 250mL 내지 약 20 L, 약 250 mL 내지 약 15 L, 약 250 mL 내지 약 10 L, 약 250 mL 내지 약 8 L, 약 250 mL 내지 약 6 L, 약 250 mL 내지 약 5 L, 약 250 mL 내지 약 4 L, 약 250 mL 내지 약 3 L, 약 250 mL 내지 약 2.5 L, 약 250 mL 내지 약 2.0 L, 약 250 mL 내지 약 1.8 L, 약 250 mL 내지 약 1.6 L, 약 250 mL 내지 약 1.4 L, 약 250 mL 내지 약 1.2 L, 약 250 mL 내지 약 1.0 L, 약 250 mL 내지 약 900 mL, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 700 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 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2.0 L, 약 350 mL 내지 약 1.8 L, 약 350 mL 내지 약 1.6 L, 약 350 mL 내지 약 1.4 L, 약 350 mL 내지 약 1.2 L, 약 350 mL 내지 약 1.0 L, 약 350 mL 내지 약 900 mL, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350 mL 내지 약 700 mL, 약 350 mL 내지 약 600 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 500 L, 약 400 mL 내지 약 400 L, 약 400 mL 내지 약 300 L, 약 400 mL 내지 약 200 L, 약 400 mL 내지 약 100 L, 약 400 mL 내지 약 50 L, 400 mL 내지 약 25 L, 약 400 mL 내지 약 20 L, 약 400 mL 내지 약 15 L, 약 400 mL 내지 약 10 L, 약 400 mL 내지 약 8 L, 약 400 mL 내지 약 6 L, 약 400 mL 약 5 L, 약 400 mL 내지 약 4 L, 약 400 mL 내지 약 3 L, 약 400 mL 내지 약 2.5 L, 약 400 mL 내지 약 2.0 L, 약 400 mL 내지 약 1.8 L, 약 400 mL 내지 약 1.6 L, 약 400 mL 내지 약 1.4 L, 약 400 mL 내지 약 1.2 L, 약 400 mL 내지 약 1.0 L, 약 400 mL 내지 약 900 mL, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 700 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 500 L, 약 450mL 내지 약 400L, 약 450mL 내지 약 300L, 약 450mL 내지 약 200L, 약 450mL 내지 약 100L, 약 450mL 내지 약 50L, 450mL 내지 약 25L, 약 450 mL 내지 약 20 L, 약 450 mL 내지 약 15 L, 약 450 mL 내지 약 10 L, 약 450 mL 내지 약 8 L, 약 450 mL 내지 약 6 L, 약 450 mL 내지 약 5 L, 약 450 mL 약 4 L, 약 450 mL 내지 약 3 L, 약 450 mL 내지 약 2.5 L, 약 450 mL 내지 약 2.0 L, 약 450 mL 내지 약 1.8 L, 약 450 mL 내지 약 1.6 L, 약 450 mL 내지 약 1.4 L, 약 450 mL 내지 약 1.2 L, 약 450 mL 내지 약 1.0 L, 약 450 mL 내지 약 900 mL, 약 4 50 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 700 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 500 L, 약 500 mL 내지 약 400 L, 약 500 mL 약 300L, 약 500mL 내지 약 200L, 약 500mL 내지 약 100L, 약 500mL 내지 약 50L, 500mL 내지 약 25L, 약 500mL 내지 약 20L, 약 500mL 내지 약 15 L, 약 500mL 내지 약 10L, 약 500mL 내지 약 8L, 약 500mL 내지 약 6L, 약 500mL 내지 약 5L, 약 500mL 내지 약 4L, 약 500mL 내지 약 3L, 약 500 mL 내지 약 2.5 L, 약 500 mL 내지 약 2.0 L, 약 500 mL 내지 약 1.8 L, 약 500 mL 내지 약 1.6 L, 약 500 mL 내지 약 1.4 L, 약 500 mL 내지 약 1.2 L, 약 500 mL 내지 약 1.0 L, 약 500 mL 내지 약 900 mL, 약 500 mL 내지 약 800 mL, 약 500 mL 내지 약 700 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 500 L, 약 600 mL 내지 약 400L, 약 600mL 내지 약 300L, 약 600mL 내지 약 200L, 약 600mL 내지 약 100L, 약 600mL 내지 약 50L, 600mL 내지 약 25L, 약 600mL 내지 약 20L, 약 600mL 내지 약 15L, 약 600mL 내지 약 10L, 약 600mL 내지 약 8L, 약 600mL 약 6 L, 약 600 mL 내지 약 5 L, 약 600 mL 내지 약 4 L, 약 600 mL 내지 약 3 L, 약 600 mL 내지 약 2.5 L, 약 600 mL 내지 약 2.0 L, 약 600 mL 내지 약 1.8 L, 약 600 mL 내지 약 1.6 L, 약 600 mL 내지 약 1.4 L, 약 600 mL 내지 약 1.2 L, 약 600 mL 내지 약 1.0 L, 약 600 mL 내지 약 900 mL, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 600 mL 내지 약 700 mL, 약 700 mL 내지 약 500 L, 약 700 mL 내지 약 400 L, 약 700 mL 내지 약 300 L, 약 700 mL 내지 약 200 L, 약 700 mL 내지 약 100 L, 약 700 mL 내지 약 50 L, 700 mL 내지 약 25 L, 약 700 mL 내지 약 20 L, 약 700 mL 내지 약 15 L, 약 700 mL 내지 약 10 L, 약 700 mL 내지 약 8 L, 약 700 mL 내지 약 6 L, 약 700 mL 내지 약 5 L, 약 700 mL 내지 약 4 L, 약 700 mL 내지 약 3 L, 약 700 mL 내지 약 2 .5 L, 약 700 mL 내지 약 2.0 L, 약 700 mL 내지 약 1.8 L, 약 700 mL 내지 약 1.6 L, 약 700 mL 내지 약 1.4 L, 약 700 mL 내지 약 1.2 L, 약 700 mL 내지 약 1.0 L, 약 700mL 내지 약 900mL, 약 700mL 내지 약 800mL, 약 800mL 내지 약 500L, 약 800mL 내지 약 400L, 약 800mL 내지 약 300L, 약 800mL 내지 약 200L, 약 800 mL 내지 약 100 L, 약 800 mL 내지 약 50 L, 800 mL 내지 약 25 L, 약 800 mL 내지 약 20 L, 약 800 mL 내지 약 15 L, 약 800 mL 내지 약 10 L, 약 800 mL 약 8 L, 약 800 mL 내지 약 6 L, 약 800 mL 내지 약 5 L, 약 800 mL 내지 약 4 L, 약 800 mL 내지 약 3 L, 약 800 mL 내지 약 2.5 L, 약 800 mL 내지 약 2.0 L, 약 800 mL 내지 약 1.8 L, 약 800 mL 내지 약 1.6 L, 약 800 mL 내지 약 1.4 L, 약 800 mL 내지 약 1.2 L, 약 800 mL 내지 약 1.0 L, 약 800 mL 내지 약 900 mL , 약 900mL 내지 약 500L, 약 900mL 내지 약 400L, 약 900mL 내지 약 300L, 약 900mL 내지 약 20 0 L, 약 900 mL 내지 약 100 L, 약 900 mL 내지 약 50 L, 900 mL 내지 약 25 L, 약 900 mL 내지 약 20 L, 약 900 mL 내지 약 15 L, 약 900 mL 내지 약 10 L, 약 900 mL 내지 약 8 L, 약 900 mL 내지 약 6 L, 약 900 mL 내지 약 5 L, 약 900 mL 내지 약 4 L, 약 900 mL 내지 약 3 L, 약 900 mL 내지 약 2.5 L, 약 900 mL 내지 약 2.0 L, 약 900 mL 내지 약 1.8 L, 약 900 mL 내지 약 1.6 L, 약 900 mL 내지 약 1.4 L, 약 900 mL 내지 약 1.2 L, 약 900 mL 내지 약 1.0 L, 약 1.0 L 내지 약 500L, 약 1.0L 내지 약 400L, 약 1.0L 내지 약 300L, 약 1.0L 내지 약 200L, 약 1.0L 내지 약 100L, 약 1.0L 내지 약 50L, 1.0L 내지 약 25L , 약 1.0 L 내지 약 20 L, 약 1.0 L 내지 약 15 L, 약 1.0 L 내지 약 10 L, 약 1.0 L 내지 약 8 L, 약 1.0 L 내지 약 6 L, 약 1.0 L 내지 약 5 L, 약 1.0 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1.6 L 내지 약 50 L, 1.6 L 내지 약 25 L, 약 1.6 L 내지 약 20L, 약 1.6L 내지 약 15L, 약 1.6L 내지 약 10L, 약 1.6L 내지 약 8L, 약 1.6L 내지 약 6L, 약 1.6L 내지 약 5L, 약 1.6L 내지 약 4L , 약 1.6 L 내지 약 3 L, 약 1.6 L 내지 약 2.5 L, 약 1.6 L 내지 약 2.0 L, 약 1.6 L 내지 약 1.8 L, 약 1.8 L 내지 약 500 L, 약 1.8 L 내지 약 400 L, 약 1.8 L 내지 약 300 L, 약 1.8 L 내지 약 200 L, 약 1.8 L 내지 약 100 L, 약 1.8 L 내지 약 50 L, 1.8 L 내지 약 25 L, 약 1.8 L 내지 약 20 L, 약 1.8 L 내지 약 15 L, 약 1.8 L 내지 약 10 L, 약 1.8 L 내지 약 8 L, 약 1.8 L 내지 약 6 L, 약 1.8 L 내지 약 5 L, 약 1.8 L 내지 약 4 L, 약 1.8 L 내지 약 3 L, 약 1.8 L 내지 약 2.5 L, 약 1.8 L 내지 약 2.0 L, 약 2.0 L 내지 약 500 L, 약 2.0 L 내지 약 400 L, 약 2.0 L 내지 약 300 L, 약 2.0 L 내지 약 200L, 약 2.0L 내지 약 100L, 약 2.0L 내지 약 50L, 2.0L 내지 약 25L, 약 2.0L 내지 약 20L, 약 2.0L 내지 약 15L, 약 2.0L 내지 약 10L , 약 2.0 L 내지 약 8 L, 약 2.0 L 내지 약 6 L, 약 2.0 L 내지 약 5 L, 약 2.0 L 내지 약 4 L, 약 2.0 L 내지 약 3 L, 약 2.0 L 내지 약 2.5 L, 약 2.5 L 내지 약 500 L, 약 2.5 L 내지 약 400 L, 약 2.5 L 내지 약 300 L, 약 2.5 L 내지 약 200 L, 약 2.5 L 내지 약 100 L, 약 2.5 L 내지 약 50 L, 2.5 L 내지 약 25 L, 약 2.5 L 내지 약 20 L, 약 2.5 L 내지 약 15 L, 약 2.5 L 내지 약 10 L, 약 2.5 L 내지 약 8 L, 약 2.5 L 내지 약 6 L, 약 2.5 L 내지 약 5 L, 약 2.5L 내지 약 4L, 약 2.5L 내지 약 3L, 약 3L 내지 약 500L, 약 3L 내지 약 400L, 약 3L 내지 약 300L, 약 3L 내지 약 2 00L, 약 3L 내지 약 100L, 약 3L 내지 약 50L, 3L 내지 약 25L, 약 3L 내지 약 20L, 약 3L 내지 약 15L, 약 3L 내지 약 10L, 약 3 L 내지 약 8 L, 약 3 L 내지 약 6 L, 약 3 L 내지 약 5 L, 약 3 L 내지 약 4 L, 약 4 L 내지 약 500 L, 약 4 L 내지 약 400 L, 약 4 L 내지 약 300L, 약 4L 내지 약 200L, 약 4L 내지 약 100L, 약 4L 내지 약 50L, 4L 내지 약 25L, 약 4L 내지 약 20L, 약 4L 내지 약 15L, 약 4L 내지 약 10L, 약 4L 내지 약 8L, 약 4L 내지 약 6L, 약 4L 내지 약 5L, 약 5L 내지 약 500L, 약 5L 내지 약 400L , 약 5 L 내지 약 300 L, 약 5 L 내지 약 200 L, 약 5 L 내지 약 100 L, 약 5 L 내지 약 50 L, 5 L 내지 약 25 L, 약 5 L 내지 약 20 L, 약 5 L 내지 약 15 L, 약 5 L 내지 약 10 L, 약 5 L 내지 약 8 L, 약 5 L 내지 약 6 L, 약 6 L 내지 약 500 L, 약 6 L 내지 약 400 L, 약 6 L 내지 약 300L, 약 6L 내지 약 200L, 약 6L 내지 약 100L , 약 6L 내지 약 50L, 6L 내지 약 25L, 약 6L 내지 약 20L, 약 6L 내지 약 15L, 약 6L 내지 약 10L, 약 6L 내지 약 8L, 약 8 L 내지 약 500L, 약 8L 내지 약 400L, 약 8L 내지 약 300L, 약 8L 내지 약 200L, 약 8L 내지 약 100L, 약 8L 내지 약 50L, 8L 내지 약 25L, 약 8L 내지 약 20L, 약 8L 내지 약 15L, 약 8L 내지 약 10L, 약 10L 내지 약 500L, 약 10L 내지 약 400L, 약 10L 내지 약 300L, 약 10L 내지 약 200L, 약 10L 내지 약 100L, 약 10L 내지 약 50L, 10L 내지 약 25L, 약 10L 내지 약 20L, 약 10L 내지 약 15L, 약 15 L 내지 약 500L, 약 15L 내지 약 400L, 약 15L 내지 약 300L, 약 15L 내지 약 200L, 약 15L 내지 약 100L, 약 15L 내지 약 50L, 15L 내지 약 25L, 약 15L 내지 약 20L, 약 20L 내지 약 500L, 약 20L 내지 약 400L, 약 20L 내지 약 300L, 약 20L 내지 약 200L, 약 20L 내지 약 100L , 약 20L 내지 약 50 L, 20L 내지 약 25L, 약 25L 내지 약 500L, 약 25L 내지 약 400L, 약 25L 내지 약 300L, 약 25L 내지 약 200L, 약 25L 내지 약 100L, 약 25 L 내지 약 50 L, 약 50 L 내지 약 500 L, 약 50 L 내지 약 400 L, 약 50 L 내지 약 300 L, 약 50 L 내지 약 200 L, 약 50 L 내지 약 100 L, 약 100 L 약 500L, 약 100L 내지 약 400L, 약 100L 내지 약 300L, 약 100L 내지 약 200L, 약 200L 내지 약 500L, 약 200L 내지 약 400L, 약 200L 내지 약 300L, 약 300L 내지 약 500L, 약 300L 내지 약 400L, 또는 약 400L 내지 약 500L의 부피를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 배양 백은 분당 약 5개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기, 분당 약 5개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 분당 약 5개의 진동 주기 내지분당 약 30개의 진동 주기, 분당 약 5개의 진동 주기 내지 분당 약 25개의 진동 주기, 분당 약 5개의 진동 주기 내지 분당 약 20개의 진동 주기, 분당 약 5개의 진동 주기 내지 분당 약 15개의 진동 주기, 약 분당 5개의 진동 주기 내지 분당 약 10개의 진동 주기, 분당 약 10개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기, 분당 약 10개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 분당 약 10개의 진동 주기 내지 약 30 분당 진동 주기, 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기, 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 20 진동 주기, 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 15 진동 주기, 분당 약 15 진동 주기 내지 분당 약 40 진동 주기, 분당 약 15개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 분당 약 15개의 진동 주기 내지 분당 약 30개의 진동 주기, 분당 약 15개의 진동 주기 내지 분당 약 25개의 진동 주기, 약 15개의 진동 주기 분당 약 20개의 진동 주기, 분당 약 20개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기, 분당 약 20개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 분당 약 20개의 진동 주기 내지 약 30개의 진동 주기, 분당 약 20개의 진동 주기 내지 분당 약 25개의 진동 주기, 분당 약 25개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기, 분당 약 25개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 분당 약 25개의 진동 주기 분당 약 30개의 진동 주기, 분당 약 30개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기, 분당 약 30개의 진동 주기 내지 분당 약 35개의 진동 주기, 또는 분당 약 35개의 진동 주기 내지 분당 약 40개의 진동 주기의 진동 속도로 배양될 수 있다.
다양한 배양 백이 상업적으로 이용 가능하다. 배양 백의 추가의 비제한적인 측면은 당업계에 공지되어 있다.
생물 반응기(Bioreactor)
본 명세서에 기재된 방법의 일부 측면은 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)는 약 500mL 내지 약 15,000L, 약 500mL 내지 약 12,500L, 약 500mL 내지 약 10,000L, 약 500mL 내지 약 8,000L, 약 500 mL 내지 약 6,000 L, 약 500 mL 내지 약 4,000 L, 약 500 mL 내지 약 2,000 L, 약 500 mL 내지 약 1,000 L, 약 500 mL 내지 약 800 L, 약 500 mL 내지 약 600 L, 약 500 mL 내지 약 400 L, 약 500 mL 내지 약 200 L, 약 500 mL 내지 약 100 L, 약 500 mL 내지 약 50 L, 약 500 mL 내지 약 20 L, 약 500 mL 내지 약 10 L, 약 500 mL 내지 약 5 L, 약 500 mL에서 약 1 L, 약 500 mL에서 약 750 mL, 약 750 mL에서 약 15,000 L, 약 750 mL에서 약 12,500 L, 약 750 mL에서 약 10,000 L, 약 750 mL에서 약 8,000 L, 약 750mL 내지 약 6,000L, 약 750mL 내지 약 4,000L, 약 750mL 내지 약 2,000L, 약 750mL 내지 약 1,000L, 약 750mL 내지 약 800L, 약 750mL 내지 약 600L, 약 750 mL 내지 약 400 L, 약 750 mL 내지 약 200 L, 약 750 mL 내지 약 100 L, 약 750 mL 내지 약 50 L, 약 750 mL 내지 약 20 L, 약 750 mL 내지 약 10 L, 약 750 mL 내지 약 5 L, 약 750 mL 내지 약 1 L, 약 1L 내지 약 15,000L, 약 1L 내지 약 12,500L, 약 1L 내지 약 10,000L, 약 1L 내지 약 8,000L, 약 1L 내지 약 6,000L, 약 1L 내지 약 4,000L, 약 1 L 내지 약 2,000 L, 약 1 L 내지 약 1,000 L, 약 1 L 내지 약 800 L, 약 1 L 내지 약 600 L, 약 1 L 내지 약 400 L, 약 1 L 내지 약 200 L, 약 1 L 내지 약 100L, 약 1L 내지 약 50L, 약 1L 내지 약 20L, 약 1L 내지 약 10L, 약 1L 내지 약 5L, 약 5L 내지 약 15,000L, 약 5L 내지 약 12,500L, 약 5L 내지 약 10,000L, 약 5L 내지 약 8,000L, 약 5L 내지 약 6,000L, 약 5L 내지 약 4,000L, 약 5L 내지 약 2,000L, 약 5L 내지 약 1,000 L, 약 5L 내지 약 800L, 약 5L 내지 약 600L, 약 5L 내지 약 400L, 약 5L 내지 약 200L, 약 5L 내지 약 100L, 약 5 L 내지 약 50 L, 약 5 L 내지 약 20 L, 약 5 L 내지 약 10 L, 약 10 L 내지 약 15,000 L, 약 10 L 내지 약 12,500 L, 약 10 L 내지 약 10,000 L, 약 10 L 약 8,000L, 약 10L 내지 약 6,000L, 약 10L 내지 약 4,000L, 약 10L 내지 약 2,000L, 약 10L 내지 약 1,000L, 약 10L 내지 약 800L, 약 10L 내지 약 600L, 약 10L 내지 약 400L, 약 10L 내지 약 200L, 약 10L 내지 약 100L, 약 10L 내지 약 50L, 약 10L 내지 약 20L, 약 20L 내지 약 15,000L , 약 20L 내지 약 12,500L, 약 20L 내지 약 10,000L, 약 20L 내지 약 8,000L, 약 20L 내지 약 6,000L, 약 20L 내지 약 4,000L, 약 20L 내지 약 2,000L, 약 20 L 내지 약 1,000 L, 약 20 L 내지 약 800 L, 약 20 L 내지 약 600 L, 약 20 L 내지 약 400 L, 약 20 L 내지 약 200 L, 약 20 L 내지 약 100 L, 약 20 L 약 50L 내지 약 50L, 약 50L 내지 약 15,000L, 약 50L 내지 약 12,500L, 약 50L 내지 약 10,000L, 약 50L 내지 약 8,000L, 약 50L 내지 약 6,000L, 약 50L 내지 약 4,000L, 약 50L 내지 약 2,000L, 약 50L 내지 약 1,000L, 약 50L 내지 약 800L, 약 50L 내지 약 600L , 약 50L 내지 약 400L, 약 50L 내지 약 200L, 약 50L 내지 약 100L, 약 100L 내지 약 15,000L, 약 100L 내지 약 12,500L, 약 100L 내지 약 10,000L, 약 100 L 내지 약 8,000 L, 약 100 L 내지 약 6,000 L, 약 100 L 내지 약 4,000 L, 약 100 L 내지 약 2,000 L, 약 100 L 내지 약 1,000 L, 약 100 L 내지 약 800 L, 약 10 약 600L, 약 100L 내지 약 400L, 약 100L 내지 약 200L, 약 200L 내지 약 15,000L, 약 200L 내지 약 12,500L, 약 200L 내지 약 10,000L, 약 200L 내지 약 8,000L, 약 200L 내지 약 6,000L, 약 200L 내지 약 4,000L, 약 200L 내지 약 2,000L, 약 200L 내지 약 1,000L, 약 200L 내지 약 800L, 약 200L 내지 약 60 , 약 200L 내지 약 400L, 약 400L 내지 약 15,000L, 약 400L 내지 약 12,500L, 약 400L 내지 약 10,000L, 약 400L 내지 약 8,000L, 약 400L 내지 약 6,000L, 약 400L 내지 약 4,000L, 약 400L 내지 약 2,000L, 약 400L 내지 약 1,000L, 약 400L 내지 약 800L, 약 400L 내지 약 600L, 약 600L 내지 약 15,000L, 약 600L 내지 약 12,500L, 약 600L 내지 약 10,000L, 약 600L 내지 약 8,000L, 약 600L 내지 약 6,000L, 약 600L 내지 약 4,000L, 약 600L 내지 약 2,000L, 약 600L 내지 약 1,000L, 약 600L 내지 약 800L, 약 800L 내지 약 15,000L, 약 800L 내지 약 12,500 L, 약 800L 내지 약 10,000L, 약 800L 내지 약 8,000L, 약 800L 내지 약 6,000L, 약 800L 내지 약 4,000L, 약 800L 내지 약 2,000L, 약 800L 내지 약 1,000 약 1,000 L 내지 약 15,000 L, 약 1,000 L 내지 약 12,500 L, 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 약 1,000 L 내지 약 8,000 L, 약 1,000 L 내지 약 6,000 L, 약 1,000 L 내지 약 4,000 L, 약 1,000 L 내지 약 2,000 L, 약 2,000 L 내지 약 15,000 L, 약 2,000 L 내지 약 12,500 L, 약 2,000 L 내지 약 10,000 L, 약 2,000L 내지 약 8,000L, 약 2,000L 내지 약 6,000L, 약 2,000L 내지 약 4,000L, 약 4,000L 내지 약 15,000L, 약 4,000L 내지 약 12,500L, 4,000L 내지 약 10,000L, 약 4,000L 내지 약 8,000L, 약 2,000L 내지 약 6,000L, 약 6,000L 내지 약 15,000L, 약 6,000L 내지 약 12,500L, 약 6,000L 내지 약 10,000, 약 6,000L 내지 약 8,000, 약 8,000 내지 약 15,000L, 약 8,000L 내지 약 12,500L, 약 8,000L 내지 약 10,000L, 약 10,000L 내지 약 15,000L, 약 10,000L 내지 약 12,500L, 또는 약 12,500L 내지 약 15,000 L의 부피를 가질 수 있다.
다양한 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)가 상업적으로 이용 가능하다. 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)의 추가의 비제한적인 측면은 당업계에 공지되어 있다.
두 번째 세포 배양 제공(단계 A)
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 단계 (a)는 일정 부피의 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적 적혈구 전구 세포) 의 제1 세포 배양물을 용기 (예를 들어, 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기), 진탕 플라스크, 진탕 튜브 또는 배양 백) 내에 함유된 제2 배양 배지 (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 제2 배양 배지)에 배치하여 약 0.1 x 104개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 0.1 x 104개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 0.1 x 104개 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포 ls/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 104 세포/mL, 약 0.1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 104 세포/mL, 0.5 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL , 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 1 x 106개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 4 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 1 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 0.5 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 104개 세포/mL 내지 약 1 x 104개 세포/mL, 1 x 104개 세포/ mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 104 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 1 x 104개 세포/mL 내지 약 4 x 105개 세포/mL, 약 1 x 104개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL, 약 1 x 104개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 1 x 104 세포s/mL 내지 약 1 x 105개 세포/mL, 약 1 x 104개 세포/mL 내지 약 0.5 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/ mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 106개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 4 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 105개 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 4 x 105개 세포/mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/ mL, 약 1 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL, 약 1.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 1.5 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포s/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL, 약 2 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 2 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 2 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 2 x 105개 세포/mL 내지 약 4 x 105개 세포/mL, 약 4 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/ mL, 약 4 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 4 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 106개 세포/mL, 약 4 x 105개 세포/mL 내지 약 0.5 x 106개 세포/mL, 약 0.5 x 106개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 0.5 x 106개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 0.5 x 106개 세포/mL 내지 약 1 x 106개 세포/mL, 약 1 x 106개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL, 약 1 x 106개 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 또는 약 0.5 x 107개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제2세포배양물을 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (a)는 약 0.1 mL 내지 약 5,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 4,500 L, 약 0.1 mL 내지 약 4,000 L, 약 0.1 mL 내지 약 3,500 L, 약 0.1 mL 내지 약 0.1 mL 내지 약 3,000L, 약 0.1mL 내지 약 2,500L, 약 0.1mL 내지 약 2,000L, 약 0.1mL 내지 약 1,500L, 약 1mL 내지 약 1,000L, 약 0.1mL 내지 약 800mL, 약 0.1mL 내지 약 600mL, 약 0.1 mL 내지 약 500 mL, 약 0.1 mL 내지 약 450 mL, 약 0.1 mL 내지 약 400 mL, 약 0.1 mL 내지 약 350 mL, 약 0.1 mL 내지 약 300 mL, 약 0.1 mL 내지 약 250 mL, 약 0.1 mL 내지 약 200 mL, 약 0.1 mL 내지 약 150 mL, 약 0.1 mL 내지 약 100 mL, 약 0.1 mL 내지 약 50 mL, 약 0.1 mL 내지 약 20 mL, 약 0.1 mL 내지 약 10 mL, 약 0.1 mL 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 5,000 L, 약 5 mL 내지 약 4,500 L, 약 5 mL 내지 약 4,000 L, 약 5 mL 내지 약 3,500 L, 약 5 mL 내지 약 3,000 L, 약 5 mL 내지 약 2,500L, 약 5mL 내지 약 2,000L, 약 5mL 내지 약 1,500L, 약 5mL 내지 약 1,000L, 약 5mL 내지 약 800mL, 약 5mL 내지 약 600mL, 약 5mL 내지 약 500mL, 약 5mL 내지 약 450mL, 약 5mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 150 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 50 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 5,000 L, 약 10 mL 내지 약 4,500 L, 약 10 mL 내지 약 4,000 L, 약 10 mL 내지 약 3,500 L, 약 10 mL 내지 약 3,000 L, 약 10 mL 내지 약 2,500 L, 약 10 mL 내지 약 2,000 L, 약 10 mL 내지 약 1,500 L, 약 10 mL 내지 약 1,000 L, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 150 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 50 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 5,000 L, 약 20 mL 내지 약 4,500 L, 약 20 mL 내지 약 4,000 L, 약 20 mL 약 3,500L, 약 20mL 내지 약 3,000L, 약 20mL 내지 약 2,500L, 약 20mL 내지 약 2,000L, 약 20mL 내지 약 1,500L, 약 20mL 내지 약 1,000L, 약 20mL 내지 약 800 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 150 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 50 mL, 약 50 mL 내지 약 5,000 L, 약 50mL 내지 약 4,500L, 약 50mL 내지 약 4,000L, 약 50mL 내지 약 3,500L, 약 50mL 내지 약 3,000L, 약 50mL 내지 약 2,500L, 약 50mL 내지 약 2,000L, 약 50mL 약 1,500L 내지 약 50mL 내지 약 1,000L, 약 50mL 내지 약 800mL, 약 50 mL 내지 약 600 mL, 약 50 mL 내지 약 500 mL, 약 50 mL 내지 약 450 mL, 약 50 mL 내지 약 400 mL, 약 50 mL 내지 약 350 mL, 약 50 mL 내지 약 300 mL, 약 50 mL 내지 약 250mL, 약 50mL 내지 약 200mL, 약 50mL 내지 약 150mL, 약 50mL 내지 약 100mL, 약 100mL 내지 약 5,000L, 약 100mL 내지 약 4,500L, 약 100mL 내지 약 4,000L, 약 100mL 내지 약 3,500L, 약 100mL 내지 약 3,000L, 약 100mL 내지 약 2,500L, 약 100mL 내지 약 2,000L, 약 100mL 내지 약 1,500L, 약 100mL 내지 약 1,000L , 약 100 mL 내지 약 800 mL, 약 100 mL 내지 약 600 mL, 약 100 mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL, 약 100 mL 내지 약 150 mL, 약 150 mL 내지 약 5,000 L, 약 150 mL 내지 약 4,500 L, 약 150 mL 내지 약 4,000 L, 약 150 mL 내지 약 3,500 L, 약 150 mL 내지 약 3,000L, 약 150mL 내지 약 2,500L, 약 150mL 내지 약 2,000L, 약 150mL 내지 약 1,500L, 약 150mL 내지 약 1,000L, 약 150mL 내지 약 800mL, 약 150mL 내지 약 600 mL, 약 150 mL 내지 약 500 mL, 약 150 mL 내지 약 450 mL, 약 150 mL 내지 약 400 mL, 약 150 mL 내지 약 350 mL, 약 150 mL 내지 약 300 mL, 약 150 mL 내지 약 250 mL, 약 150 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 5,000 L, 약 200 mL 내지 약 4,500 L, 약 200 mL 내지 약 4,000 L, 약 200 mL 내지 약 3,500 L, 약 200 mL 내지 약 3,000 L, 200mL 내지 약 2,500L, 약 200mL 내지 약 2,000L, 약 200mL 내지 약 1,500L, 약 200mL 내지 약 1,000L, 약 200mL 내지 약 800mL, 약 200mL 내지 약 600mL, 약 200mL 약 500mL 내지 약 200mL 내지 약 450mL, 약 200mL 내지 약 400mL, 약 200mL 내지 약 350mL, 약 200mL 내지 약 300mL, 약 200mL 내지 약 250mL, 약 250mL 내지 약 5,000L, 약 250mL 내지 약 4,500L, 약 250mL 내지 약 4,000L, 약 250mL 내지 약 3,500L, 약 250mL 내지 약 3,000L, 약 250mL 내지 약 2,500L, 약 250mL 내지 약 2,000L, 약 250mL 내지 약 1,500mL, 약 2 약 1,000L 내지 약 1,000L, 약 250mL 내지 약 800mL, 약 250mL 내지 약 600mL, 약 250mL 내지 약 500mL, 약 250mL 내지 약 450mL, 약 250mL 내지 약 400mL, 약 250mL 내지 약 350mL, 약 250mL 내지 약 300mL, 약 300mL 내지 약 5,000L, 약 300mL 내지 약 4,500L, 약 300mL 내지 약 4,000L, 약 300mL 내지 약 3,500L, 약 300mL 내지 약 3,000mL, 약 300mL 내지 약 2,500L, 약 300mL 내지 약 2,000L, 약 300mL 내지 약 1,500L, 약 300mL 내지 약 1,000L, 약 300mL 내지 약 800mL, 약 300mL 내지 약 600mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 5,000 L, 약 350 mL 내지 약 4,500 L, 약 350 mL 내지 약 4,000 L, 약 350 mL에서 약 3,500 L, 약 350 mL 내지 약 3,000 L, 약 350 mL 내지 약 2,500 L, 약 350 mL 내지 약 2,000 L, 약 350 mL 내지 약 1,500 L, 약 350 mL 내지 약 1,000 L, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350mL 내지 약 600mL, 약 350mL 내지 약 500mL, 약 350mL 내지 약 450mL, 약 350mL 내지 약 400mL, 약 400mL 내지 약 5,000L, 약 400mL 내지 약 4,500L, 약 400 mL 내지 약 4,000L, 약 400mL 내지 약 3,500L, 약 400mL 내지 약 3,000L, 약 400mL 내지 약 2,500L, 약 400mL 내지 약 2,000L, 약 400mL 내지 약 1,500mL, 약 400mL 내지 약 1,000 L, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 5,000 L, 약 450 mL 내지 약 4,500 L, 약 450mL 내지 약 4,000L, 약 450mL 내지 약 3,500L, 약 450mL 내지 약 3,000L, 약 450mL 내지 약 2,500L, 약 450mL 내지 약 2,000L, 약 450mL 내지 약 1,500L 약 450mL 내지 약 1,000L, 약 450mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 5,000 L, 약 500 mL 내지 약 4,500 L, 약 500 mL 내지 약 4,000 L, 약 500 mL 내지 약 3,500L, 약 500mL 내지 약 3,000L, 약 500mL 내지 약 2,500L, 약 500mL 내지 약 2,000L, 약 500mL 내지 약 1,500L, 약 500mL 내지 약 1,000L, 약 500mL 내지 약 800mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 5,000 L, 약 600 mL 내지 약 4,500 L, 약 600 mL 내지 약 4,000 L, 약 600 mL 내지 약 3,500 L, 약 600 mL 내지 약 3,000 L, 600 mL 내지 약 2,500 L, 약 600 mL 내지 약 2,000 L, 약 600 mL 내지 약 1,500 L, 약 600 mL 내지 약 1,000 L, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 5,000 mL, 약 80 약 4,500L, 약 800mL 내지 약 4,000L, 약 800mL 내지 약 3,500L, 약 800mL 내지 약 3,000L, 약 800mL 내지 약 2,500L, 약 800mL 내지 약 2,000L, 약 800mL 내지 약 1,500L, 약 800mL 내지 약 1,000L L, 약 1,000L 내지 약 5,000L, 약 1,000L 내지 약 4,500L, 약 1,000L 내지 약 4,000L, 약 1,000L 내지 약 3,500L, 약 1,000L 내지 약 3,000L, 1,000L 내지 약 2,500L,약 1,000L 내지 약 2,000L, 약 1,000L 내지 약 1,500L, 약 1,500L 내지 약 5,000L, 약 1,500L 내지 약 4,500L, 약 1,500L 내지 약 4,000L, 약 1,500L 내지 약 3,500L, 약 1,500L 내지 약 2,500L, 약 1,500L 내지 약 2,000L, 약 2,000L 내지 약 5,000L, 약 2,000L 내지 약 4,500L, 약 2,000L 내지 약 4,000, 약 2,000L 내지 약 3,500L, 약 2,000L 내지 약 3,000L, 약 2,000L 내지 약 2,500L, 약 2,500L 내지 약 5,000L, 약 2,500L 내지 약 4,500L, 약 2,500L 내지 약 4,000 L, 약 2,500L 내지 약 3,500 L, 약 2,500L 내지 약 3,000L, 약 3,000L 내지 약 5,000L, 약 3,000L 내지 약 4,500L, 약 3,000L 내지 약 4,000L, 약 3,000L 내지 약 3,500L, 약 3,500L 내지 약 5,000L, 3,500L 내지 약 4,500L, 약 3,500L 내지 약 4,000L, 약 4,000L 내지 약 5,000L, 약 4,000L 내지 약 4,500L, 약 4,500L 내지 약 5,000L의 부피를 배치하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (a)는 약 10μL 내지 약 0.1mL, 약 10 μL 내지 약 μL, 약 10 μL 내지 약 60 μL, 약 10μL 내지 약 40 μL, 약 10 μL 내지 약 20 μL, 약 20 μL 내지 약 0.1mL, 약 20 μL 내지 약 80 μL, 약 20 μL 내지 약 60 μL, 약 20 μL 내지 약 40 μL, 약 40 μL 내지 약 0.1mL, 약 40 μL 내지 약 80 μL, 약 40 μL 내지 약 60 μL, 약 60 μL 내지 약 0.1mL, 약 60 μL 내지 약 80 μL, 또는 약 60 μL 내지 약 0.1mL 의 부피를 배치하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 생물반응기)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 생물반응기의 추가 예 및 측면은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 진탕 플라스크(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 임의의 것)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 진탕 플라스크의 추가 예 및 측면은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 진탕 튜브(예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 예시적인 진탕 튜브 중 임의의 것)이다. 단계 (a)에서 사용될 수 있는 진탕 튜브의 추가 예 및 측면은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시예에서, 단계 (a)의 용기는 배양 백(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 배양 백 중 임의의 것)이다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린(예를 들어, 약 1μg/mL 내지 약 500μg/mL 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), IL-3(예를 들어, 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 줄기 세포 인자(SCF) (예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 덱사메타손(예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방 펩티드(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO 또는 EPO-모방 펩티드 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 및 인슐린(예: 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL 인슐린 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 중 하나 이상(예: 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위범위)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 0.1% w/v 내지 약 4% w/v(예를 들어, 약 0.1% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w /v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 4% w/v, 약 0.2% w/ v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.2% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 4 % w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 4% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 2.0 % w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 4% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 3.5% w/v, 약 2.5% w/v 내지 약 3.0% w/v, 약 3.0% w/v 내지 약 4% w/v, 약 3.0% w/v 내지 약 3.5% w/v, 또는 약 3.5% w/v 내지 약 4.0% w/v) 인간 혈청 알부민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w /v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/ v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v) 폴록사머-188(P188)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 320μμ/mL, 약 1μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 100μg /mL, 약 1μg/mL내지 약 80μg/mL, 약 1μg/mL내지 약 60μg/mL, 약 1μg/mL내지 약 40μg/mL, 약 1μg/ mL 내지 약 20μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 10μg/mL내지 약 360μg/mL, 약 10μg/mL내지 약 340μg/mL, 약 10μg/mL내지 약 320μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 240μg/ mL, 약 10μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 10μg/mL 약 160μg/mL 내지 약 10μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 60μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 20μg/mL내지 약 80μg/mL, 약 20μg/mL내지 약 60μg/mL, 약 20μg/mL내지 약 40μg/mL, 약 40μg/mL내지 약 500μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 40μg /mL 내지 약 420μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 40μg/mL내지 약 280μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 40μg/mL내지 약 80μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 60μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 60μg/ mL 내지 약 380μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 320μg/mL , 약 60μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 80μg/ mL 내지 약 320μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 260μg/mL , 약 80μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 100μg/mL에서 약 300μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 100μg /mL 내지 약 240μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 140μ g/mL 내지 약 460μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 400μg /mL, 약 140μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 140μg/ mL 내지 약 320μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 420μ g/mL, 약 160μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 160μg /mL 내지 약 340μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 200μg /mL 내지 약 300μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 240μg/ mL, 약 200μg/mL 내지 약 220μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 220μg/mL내지 약 320μg/mL, 약 220μg/mL내지 약 300μg/mL, 약 220μg/mL내지 약 280μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 220μg/mL 내지 약 240μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 240μg/ mL 내지 약 400μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 240μg/mL 내지 약 260μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 260μg/mL내지 약 360μg/mL, 약 260μg/mL내지 약 340μg/mL, 약 260μg/mL내지 약 320μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 260μg/mL 내지 약 280μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 280μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 300μg/ mL 내지 약 420μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 360μg/mL , 약 300μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 320μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 320μg/ mL 내지 약 420μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 320μg/mL 내지 약 360μg/mL , 약 320μg/mL 내지 약 340μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 340μg/mL 내지 약 360μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 360μg/mL 내지 약 380μg/mL, 약 380μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 380μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 380μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 380μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 380μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 380μg/ mL 내지 약 400μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 420μg/mL, 약 420μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 420μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 420μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 420μg/mL 내지 약 440μg/mL, 약 440μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 440μg/mL 내지 약 480μg/mL, 약 440μg/mL 내지 약 460μg/mL, 약 460μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 460μg/mL 내지 약 480μg/mL, 또는 약 480μg/mL 내지 약 500μg/mL의 트랜스페린(예를 들어, 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 5ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60 ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180ng/mL, 또는 약 180ng/mL 내지 약 200ng/mL의 IL-3(예를 들어, 인간 IL-3)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 450 ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 10ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 20ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 750ng /mL, 약 20ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 t 550ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 350 ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 40ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 40ng /mL 내지 약 600ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 60ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 650ng /mL, 약 60ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 80ng /mL 내지 약 1μg/mL, 약 80ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 t 80ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 100ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 550ng/mL , 약 100ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 150ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 650ng /mL, 약 150ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 200ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 200 ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 250ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 700ng /mL, 약 250ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 300ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 300ng /mL 내지 약 650ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 350ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 750 ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 400ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 400 ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 450ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 500ng/mL 내지 약 950 ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 1g/mL, 약 550ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 600ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 600 ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 650ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 700ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 750ng/mL 내지 약 1μg/mL , 약 750ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 750ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 750ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 750ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 800ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 800ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 800ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 800ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 850 ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 850ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 850ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 900ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 900 ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 950ng/mL 내지 약 1μg/mL의 SCF(예를 들어, 인간 줄기 세포 인자)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 nM 내지 약 200 nM, 약 0.1 nM 내지 약 180 nM, 약 0.1 nM 내지 약 160 nM, 약 0.1 nM 내지 약 140 nM, 약 0.1 nM 내지 약 120 nM, 0.1 nM 내지 약 100 nM, 약 0.1 nM 내지 약 80 nM, 약 0.1 nM 내지 약 60 nM, 약 0.1 nM 내지 약 50 nM, 약 0.1 nM 내지 약 40 nM, 약 0.1 nM 내지 약 30 nM, 약 0.1 nM 내지 약 25nM, 약 0.1nM 내지 약 20nM, 약 0.1nM 내지 약 15nM, 약 0.1nM 내지 약 10nM, 약 0.1nM 내지 약 5nM, 약 0.1nM 내지 약 2nM, 약 0.1nM 내지 1 nM, 약 1 nM 내지 약 200 nM, 약 1 nM 내지 약 180 nM, 약 1 nM 내지 약 160 nM, 약 1 nM 내지 약 140 nM, 약 1 nM 내지 약 120 nM, 약 1 nM 내지 약 100 nM, 약 1 nM 내지 약 80 nM, 약 1 nM 내지 약 60 nM, 약 1 nM 내지 약 50 nM, 약 1 nM 내지 약 40 nM, 약 1 nM 내지 약 30 nM, 약 1 nM 내지 약 25 nM, 약 1nM 내지 약 20nM, 약 1nM 내지 약 15nM, 약 1nM 내지 약 10nM, 약 1 nM 내지 약 5 nM, 약 1 nM 내지 약 2 nM, 약 2 nM 내지 약 200 nM, 약 2 nM 내지 약 180 nM, 약 2 nM 내지 약 160 nM, 약 2 nM 내지 약 140 nM, 약 2 nM 내지 약 120 nM, 약 2 nM 내지 약 100 nM, 약 2 nM 내지 약 80 nM, 약 2 nM 내지 약 60 nM, 약 2 nM 내지 약 50 nM, 약 2 nM 내지 약 40 nM, 약 2 nM 내지 약 30 nM, 약 2 nM 내지 약 25 nM, 약 2 nM 내지 약 20 nM, 약 2 nM 내지 약 15 nM, 약 2 nM 내지 약 10 nM, 약 2 nM 내지 약 5 nM, 약 5 nM 내지 약 200 nM, 약 5 nM 내지 약 180 nM, 약 5 nM 내지 약 160 nM, 약 5 nM 내지 약 140 nM, 약 5 nM 내지 약 120 nM, 약 5 nM 내지 약 100 nM, 약 5 nM 내지 약 80 nM, 약 5nM 내지 약 60nM, 약 5nM 내지 약 50nM, 약 5nM 내지 약 40nM, 약 5nM 내지 약 30nM, 약 5nM 내지 약 25nM, 약 5nM 내지 약 20nM, 약 5nM 내지 약 15 nM, 약 5 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 200 nM, 약 10 nM 내지 약 180 nM, 약 10 nM 내지 약 160 nM, 약 10 nM 내지 약 140 nM, 약 10 nM 내지 약 120 nM, 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 10 nM 내지 약 80 nM, 약 10 nM 내지 약 60 nM, 약 10 nM 내지 약 50 nM, 약 10 nM 내지 약 40 nM, 약 10 nM 내지 약 30 nM, 약 10 nM 내지 약 25 nM, 약 10 nM 내지 약 20 nM, 약 10 nM 내지 약 15 nM, 약 15 nM 내지 약 200 nM, 약 15 nM 내지 약 180, 15nM 내지 약 160nM, 약 15nM 내지 약 140nM, 약 15nM 내지 약 120nM, 약 15nM 내지 약 100nM, 약 15nM 내지 약 80nM, 약 15nM 내지 약 60nM, 약 15nM 내지 약 50 nM, 약 15 nM 내지 약 40 nM, 약 15 nM 내지 약 30 nM, 약 15 nM 내지 약 25 nM, 약 15 nM 내지 약 20 nM, 약 20 nM 내지 약 200 nM, 약 20 nM 180 nM, 약 20 nM 내지 약 160 nM, 약 20 nM 내지 약 140 nM, 약 20 nM 내지 약 120 nM, 약 20 nM 내지 약 100 nM, 약 20 nM 내지 약 80 nM, 약 20 nM 내지 약 60 nM, 약 20nM 내지 약 50nM, 약 20nM 내지 약 40nM, 약 20nM 내지 약 30nM, 약 20nM 내지 약 25nM, 약 25 nM 내지 약 200 nM, 약 25 nM 내지 약 180 nM, 약 25 nM 내지 약 160 nM, 약 25 nM 내지 약 140 nM, 약 25 nM 내지 약 120 nM, 약 25 nM 내지 약 100 nM, 약 25 nM 내지 약 80 nM, 약 25 nM 내지 약 60 nM, 약 25 nM 내지 약 50 nM, 약 25 nM 내지 약 40 nM, 약 25 nM 내지 약 30 nM, 약 30 nM 내지 약 200 nM, 30 nM 내지 약 180nM, 약 30nM 내지 약 160nM, 약 30nM 내지 약 140nM, 약 30nM 내지 약 120nM, 약 30nM 내지 약 100nM, 약 30nM 내지 약 80nM, 약 30nM 내지 약 60nM, 약 30nM 내지 약 50nM, 약 30nM 내지 약 40nM, 약 40nM 내지 약 200nM, 약 40nM 내지 약 180nM, 약 40nM 내지 약 160nM, 약 40nM 내지 약 140nM, 약 40 nM 내지 약 120 nM, 약 40 nM 내지 약 100 nM, 약 40 nM 내지 약 80 nM, 약 40 nM 내지 약 60 nM, 약 40 nM 내지 약 50 nM, 약 50 nM 내지 약 200nM, 약 50nM 내지 약 180nM, 약 50nM 내지 약 160nM, 약 50nM 내지 약 140nM, 약 50nM 내지 약 120 nM, 약 50 nM 내지 약 100 nM, 약 50 nM 내지 약 80 nM, 약 50 nM 내지 약 60 nM, 약 60 nM 내지 약 200 nM, 약 60 nM 내지 약 180 nM, 약 60 nM 내지 약 160 nM , 약 60 nM 내지 약 140 nM, 약 60 nM 내지 약 120 nM, 약 60 nM 내지 약 100 nM, 약 60 nM 내지 약 80 nM, 약 80 nM 내지 약 200 nM, 약 80 nM 내지 약 180 nM, 약 80 nM 내지 약 160 nM, 약 80 nM 내지 약 140 nM, 약 80 nM 내지 약 120 nM, 약 80 nM 내지 약 100 nM, 약 100 nM 내지 약 200 nM, 약 100 nM 내지 약 180 nM, 약 100nM 내지 약 160nM, 약 100nM 내지 약 140nM, 약 100nM 내지 약 120nM, 약 120nM 내지 약 200nM, 약 120nM 내지 약 180nM, 약 120nM 내지 약 160nM, 약 120nM 내지 140 nM, 약 140 nM 내지 약 200 nM, 약 140 nM 내지 약 180 nM, 약 140 nM 내지 약 160 nM, 약 160 nM 내지 약 200 nM, 약 160 nM 내지 약 180 nM, 또는 약 180 nM 내지 200 nM 덱사메타손을 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 280ng /mL, 약 1ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 1ng /mL 내지 약 30ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL , 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 5ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 220 ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 15n g/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 10ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 10ng /mL 내지 약 280ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng /mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 15n g/mL, 15ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 15ng /mL 내지 약 260ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 30ng /mL, 약 15ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL, 20ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 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260ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 220ng/mL, 220ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 22 0ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 240ng/mL, 240ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 300 ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 260ng/mL, 260ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 260ng /mL 내지 약 300ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 280ng/mL, 280ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 300ng/mL, 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 300ng /mL 내지 약 360ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 320ng/mL, 320ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 340ng/mL, 340ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 440ng /mL, 약 340ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 360ng/mL, 360ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 360 ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 380ng/mL, 380ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 400ng/mL, 400ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 420ng/mL, 420ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 440ng/mL, 440ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 440ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 440ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 480ng/mL, 또는 약 480ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방 펩티드를 포함한다. EPO 모방 펩티드의 비제한적인 예는 예를 들어 정의된 화학적 링커 또는 더 큰 중합체 PEG 링커 (예를 들어, Johnson and Jolliffe, Nephrology Dialysis Transplantation 15(9):1274-1277, 2000에 기재되어 있는 것들)를 사용하는 EPO 모방 펩티드((EMP1; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 서열번호: 1)) 또는 이의 펩티드 이량체, ERB1-7 (예를 들어 McConnell et al., Biol. Chem. 379(10):1279-86, 1998에 기재되어 있는 것들), EPO-R 유래 펩티드(ERP), Johnson et al., Biochemistry 37(11):3699-3710, 1998에 기재되어 있는 EMP20(YSCHFGPLTWVCK(SEQ) ID NO: 2)), AGEM400(히드록시에틸 전분), 및 페골시헤마티드(pegolsihematide) (예를 들어, Gupta and Wish, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27(5):345-350, 2018에 기재되어 있는 것들)를 포함한다. EPO-모방 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 2μg/mL 약 15μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 25μg/ mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 25 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 20μg/ mL, 약 20μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 30μg /mL, 약 20μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 25μg/ mL 내지 약 40μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 35μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 35μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 35μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 40μg/mL내지 약 50μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것) 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(또는 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위범위)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 0.1% w/v 내지 약 4% w/v(또는 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위범위) 인간 혈청 알부민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제2 배양 배지의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(또는 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 하위 범위 중 임의의 것) 폴록사머-188(P188)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 및/또는 무혈청 액체 배양 배지일 수 있다.
단계 A 전 선택적 배양 단계
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는 단계 (a) 이전에, (i) 제1 세포 배양물 (예를 들어, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL (예를 들어, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/ mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 0.1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/ mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106개 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/ mL, 1 x 105 세포/mL 내지 약 1.5 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포 /mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 1.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포 /mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포 /mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 3 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/ mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 105 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/ mL, 약 6 x 105 세포 /mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 8 x 105 세포/ mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 106 세포/mL, 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 106 세포/mL, 약 3 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/ mL, 약 3 x 106세포/mL 내지 약 4 x 106세포/mL, 또는 약 4 x 106세포/mL 내지 약 5 x 106세포/mL)을 제공하기 위해 용기(예를 들어, 생물반응기, 진탕 튜브, 또는 진탕 플라스크, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 생물반응기, 진탕 튜브 또는 진탕 플라스크 중 임의의 것) 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 적혈구 전구 세포 중 임의의 것)를 배치하고; (ii) 약 1일 내지 약 15일 동안(예를 들어, 약 1일 내지 약 14일, 약 1일 내지 약 13일, 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일 , 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 15일, 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일 , 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일 , 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 제1 세포 배양물을 배양(예를 들어, 회분식, 유가식 또는 관류식 배양)한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)는 진탕 플라스크 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 임의의 것) 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 적혈구 전구 세포 중 임의의 것)를 배치하는 것을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (ii)는 진탕 플라스크에서 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)에서 제1 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)는 진탕 튜브 (예를 들어, 여기에 설명된 임의의 예시적인 부피를 갖는 여기에 설명된 임의의 예시적인 진탕 튜브) 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구 전구 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 적혈구 전구 세포 중 임의의 것)를 배치하는 것을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (ii)는 진탕 튜브에서 제1 세포 배양물을 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)에서 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (i)는 복수의 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 배양 백에 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적 적혈구 전구 세포)를 배치하는 것을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (ii)는 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)의 진동 속도로 배양 백에서 제1 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다.
유가식 배양(Fed Batch Culturing)
일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 유가식 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)에서 유가식 배양은 추가 부피의 제1 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제1 배양 배지 중 임의의 것)를 시간 경과에 따라 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제1 배양 배지의 추가 부피는 시간이 지남에 따라 제 1 배양 배지에 주기적으로 (예를 들어, 3일에 1회, 2일에 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 1일 6회, 1일 7회, 1일 8회, 1일 9회, 1일 10회, 1일 11회 또는 1일 12회) 추가된다. 일부 실시예에서, 단계 (i) 직후에 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어, 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x, 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0 x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x, 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 약 3.5x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5 x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0 x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x , 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5 x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5 x, 약 1.5x에서 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x , 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0 x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0 x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x, 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0 x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x, 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x , 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0x 내지 약 7.0x , 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x, 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5 x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0x 내지 약 7.0x , 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0x, 약 6.5 x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)의 제1 세포 배양물의 부피가 각각의 24시간 증분으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제1 세포 배양물에 대한 추가 부피의 제1 배양 배지의 첨가는 일단 제1 세포 배양물이 표적 특이적 세포 밀도, 예를 들어, 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/m에 도달하면 시작된다.
관류 배양
일부 실시예에서, 단계 (ii)는 제1 세포 배양물을 관류 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3(예를 들어, 약 10 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 20 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 15 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 15 W/ m3 내지 약 140 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 20 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 100 W/ m3, 약 20 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 25 W/ m3 내지 약 80 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 30 W/ m3 내지 약 35 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 160 W/ m3, 약 40 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 80 W/ m3 내지 약 200W/m3, 약 80W/m3 내지 약 180W /m3, 약 80 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 100 W/m3 , 약 100W/m3내지 약 200W/m3, 약 100W/m3내지 약 180W/m3, 약 100W/m3내지 약 160W/m3, 약 100W/m3내지 약 140W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 120 W /m3 내지 약 140 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 160 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 160 W/m3 내지 약 180 W/m3, 및 약 180 W/m3 내지 약 200 W/m3)의 P/V 값으로 제1 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 생물반응기에서)을 교반하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (ii)에서 관류 배양은 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.04 nL/세포/일 내지 약 0.1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.1 nL/ 세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.5 nL/ 세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/ 세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 2 nL/ 세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 40nL/세포/일, 약 2nL/세포/일 내지 약 35nL/세포/일, 약 2nL/세포/일 내지 약 30nL/세포/일, 약 2nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 5 nL/ 세포/일, 약 2nL/세포 /일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 50nL/세포/일, 약 4nL/세포/일 내지 약 45nL/세포/일, 약 4nL/세포/일 내지 약 40nL/세포/일, 약 4nL/세포/일 내지 35 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 20 nL /세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포 /일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일 , 약 5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/이 내지 약 25 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 10 nL /세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포 /일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일 , 약 6 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 6 nL /세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 40nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 10 nL/ 세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/ 일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 또는 약 55 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 속도는 시간이 지남에 따라 증가된다.
일부 실시예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 약 0.1 VVD 내지 약 3 VVD(예를 들어, 약 0.1 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.1VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.1VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 2.2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 1.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 1.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.8 VVD 내지 2.4 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 3 VVD, 2.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 또는 약 2.8 VVD 내지 약 3 VVD) 의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 적어도 부분적으로 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제1 배양 배지 중 임의의 것))를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 배지의 추가 부피 (예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제1 배양 배지 중 임의의 것))는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 배양 배지(예를 들어, 제1 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제1 배양 배지 중 임의의 것))의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적 (예: 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번)으로 첨가된다. 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제1 배양 배지 중 임의의 것)의 첨가는 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프를 사용하여 기계적으로, 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 예에서, 단계 (ii)에서의 관류 배양은 적어도 부분적으로 일정 부피의 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)를 시간에 따라 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)는 시간이 지남에 따라 연속적으로 제거된다. 일부 실시예에서, 배양 배지는 시간이 지남에 따라 주기적으로((예: 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번)) 제거된다. 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)의 제거는 예를 들어 접선 흐름 여과(TFF, tangential flow filtration) 또는 교대 흐름 여과(ATF, alternating flow filtration)를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 흐름 여과의 추가의 비제한적인 측면이 여기에 설명되어 있다. 일부 실시예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF) 또는 교대 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과(예를 들어, 접선 유동 여과 또는 교대 접선 여과)는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm, 약 10 nm 내지 약 5.5 μm, 약 10 nm 내지 약 5.0 μm, 약 10 nm 내지 약 4.5 μm, 약 10 nm 내지 약 4.0 μm, 약 10 nm 내지 약 3.5 μm, 약 10 nm 내지 약 3.0 μm, 약 10 nm 내지 약 2.5 μm, 약 10 nm 내지 약 2.0 μm, 약 10 nm 내지 약 1.5 μm, 약 10 nm 내지 약 1.0 μm, 약 10 nm 내지 약 0.5 μm, 약 10 nm 내지 약 0.2 μm, 10 nm 내지 약 0.1 μm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 6.0 μm, 약 50 nm 내지 약 5.5 μm, 약 50 nm 내지 약 5.0 μm, 약 50 nm 내지 약 4.5 μm, 약 50 nm 내지 약 4.0 μm, 약 50 nm 내지 약 3.5 μm, 약 50 nm 내지 약 3.0 μm, 약 50 nm 내지 약 2.5 μm, 약 50 nm 내지 약 2.0 μm, 약 50 nm 내지 약 1.5 μm, 약 50 nm 내지 약 1.0 μm, 약 50 nm 내지 약 0.5 μm, 약 50 nm 내지 약 0.2 μm, 약 50 nm 내지 약 0.1 μm, 약 0.1 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.1 μm.5m 내지 약 4.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.0μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.2 μm, 약 0.2 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 3.5μm, 약 0.2 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 6.0μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 1.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 6.0μm, 약 1.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 2.5μm, 약 2.5μm 내지 약 6.0μm, 약 2.5μm 내지 약 5.5μm, 약 2.5μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.0μm, 약 3.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.5 μm. 약 4.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 4.5μm, 약 4.5μm 약 6.0 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 5.5 μm, 또는 약 5.5 μm 내지 약 6.0 μm 의 평균 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터의 사용을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 세포 배양물의 관류는 일단 제1 세포 배양물이 특정 표적 세포 밀도, 예를 들어, 약 1.0 x 106개 세포/mL, 약 1.5 x 106개 세포/mL, 약 2.0 x 106개 세포/mL, 약 2.5 x 106개 세포/mL, 약 3.0 x 106개 세포/mL, 약 3.5 x 106개 세포/mL, 약 4.0 x 106개 세포/mL, 약 4.5 x 106개 세포/mL, 약 5.0 x 106개 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106개 세포/mL, 약 9.5 x 106개 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107개 세포/mL에 도달하면 시작된다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 Flt-3 리간드 (예를 들어, 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), SCF (예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), IL-3 (예를 들어, 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것) 및 IL-6 (예를 들어, 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 중 하나 이상(예: 하나, 둘, 셋 또는 넷)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제1 배양 배지의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 CellGenix SCGM 배지를 포함한다. 임의의 제1 배양 배지의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 0.1mM 내지 약 9.5mM, 약 0.1mM 내지 약 9.0mM, 약 0.1mM 내지 약 8.5mM, 약 0.1mM 내지 약 8.0mM, 약 0.1mM 내지 약 7.5mM, 약 0.1mM 내지 약 7.0mM, 약 0.1mM 내지 약 6.5mM, 약 0.1mM 내지 약 6.0mM, 약 0.1mM 내지 약 5.5mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4.5mM, 약 0.1mM 내지 약 4.0mM, 약 0.1mM 내지 약 3.5mM, 약 0.1mM 내지 약 3.0mM, 약 0.1mM 내지 약 2.5mM, 약 0.1mM 내지 약 2.0mM, 약 0.1mM 내지 약 1.5mM, 약 0.1mM 내지 약 1.0mM, 약 0.1mM 내지 약 0.5mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 9.5mM, 약 0.5mM 내지 약 9.0 mM, 약 0.5mM 내지 약 8.5mM, 약 0.5mM 내지 약 8.0mM, 약 0.5mM 내지 약 7.5mM, 약 0.5mM 내지 약 7.0mM, 약 0.5mM 내지 약 6.5mM, 약 0.5mM 내지 약 6.0mM, 약 0.5mM 내지 약 5.5mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 4.5mM, 약 0.5mM 내지 약 4.0mM, 약 0.5mM 내지 약 3.5mM, 약 0.5mM 내지 약 3.0mM, 약 0.5mM 내지 약 2.5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.0mM, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 약 0.5mM 내지 약 1.0mM, 약 1.0mM 내지 약 10mM, 약 1.0mM 내지 약 9.5mM, 약 1.0mM 내지 약 9.0mM, 약 1.0mM 내지 약 8.5 mM, 약 1.0mM 내지 약 8.0mM, 약 1.0mM 내지 약 7.5mM, 약 1.0mM 내지 약 7.0mM, 약 1.0mM 내지 약 6.5mM, 약 1.0mM 내지 약 6.0mM, 약 1.0mM 내지 약 5.5mM, 약 1.0mM 내지 약 5mM, 약 1.0mM 내지 약 4.5mM, 약 1.0mM 내지 약 4.0mM, 약 1.0mM 내지 약 3.5mM, 약 1.0mM 내지 약 3.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.5mM, 약 1.0 mM 내지 약 2.0mM, 약 1.0mM 내지 약 1.5mM, 약 1.5mM 내지 약 10mM, 약 1.5mM 내지 약 9.5mM, 약 1.5mM 내지 약 9.0mM, 약 1.5mM 내지 약 8.5mM, 약 1.5mM 내지 약 8.0mM, 약 1.5mM 내지 약 7.5mM, 약 1.5mM 내지 약 7.0 mM, 약 1.5mM 내지 약 6.5mM, 약 1.5mM 내지 약 6.0mM, 약 1.5mM 내지 약 5.5mM, 약 1.5mM 내지 약 5mM, 약 1.5mM 내지 약 4.5mM, 약 1.5mM 내지 약 4.0mM, 약 1.5mM 내지 약 3.5mM, 약 1.5mM 내지 약 3.0mM, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 약 1.5mM 내지 약 2.0mM, 약 2.0mM 내지 약 10mM, 약 2.0mM 내지 약 9.5mM, 약 2.0 mM 내지 약 9.0mM, 약 2.0mM 내지 약 8.5mM, 약 2.0mM 내지 약 8.0mM, 약 2.0mM 내지 약 7.5mM, 약 2.0mM 내지 약 7.0mM, 약 2.0mM 내지 약 6.5mM, 약 2.0mM 내지 약 6.0mM, 약 2.0mM 내지 약 5.5mM, 약 2.0mM 내지 약 5mM, 약 2.0mM 내지 약 4.5mM, 약 2.0mM 내지 약 4.0mM, 약 2.0mM 내지 약 3.5mM, 약 2.0mM 내지 약 3.0 mM, 약 2.0mM 내지 약 2.5mM, 약 2.5mM 내지 약 10mM, 약 2.5mM 내지 약 9.5mM, 약 2.5mM 내지 약 9.0mM, 약 2.5mM 내지 약 8.5mM, 약 2.5mM 내지 약 8.0mM, 약 2.5mM 내지 약 7.5mM, 약 2.5mM 내지 약 7.0mM, 약 2.5m M 내지 약 6.5mM, 약 2.5mM 내지 약 6.0mM, 약 2.5mM 내지 약 5.5mM, 약 2.5mM 내지 약 5mM, 약 2.5mM 내지 약 4.5mM, 약 2.5mM 내지 약 4.0mM, 약 2.5mM 내지 약 3.5mM, 약 2.5mM 내지 약 3.0mM, 약 3.0mM 내지 약 10mM, 약 3.0mM 내지 약 9.5mM, 약 3.0mM 내지 약 9.0mM, 약 3.0mM 내지 약 8.5mM, 약 3.0mM 내지 약 8.0 mM, 약 3.0mM 내지 약 7.5mM, 약 3.0mM 내지 약 7.0mM, 약 3.0mM 내지 약 6.5mM, 약 3.0mM 내지 약 6.0mM, 약 3.0mM 내지 약 5.5mM, 약 3.0mM 내지 약 5mM, 약 3.0mM 내지 약 4.5mM, 약 3.0mM 내지 약 4.0mM, 약 3.0mM 내지 약 3.5mM, 약 3.5mM 내지 약 10mM, 약 3.5mM 내지 약 9.5mM, 약 3.5mM 내지 약 9.0mM, 약 3.5 mM 내지 약 8.5mM, 약 3.5mM 내지 약 8.0mM, 약 3.5mM 내지 약 7.5mM, 약 3.5mM 내지 약 7.0mM, 약 3.5mM 내지 약 6.5mM, 약 3.5mM 내지 약 6.0mM, 약 3.5mM 내지 약 5.5mM, 약 3.5mM 내지 약 5mM, 약 3.5mM 내지 약 4.5mM, 약 3.5mM 내지 약 4.0mM, 약 4.0mM 내지 약 10mM, 약 4.0mM 내지 약 9.5mM, 약 4.0mM 내지 약 9.0mM, 약 4.0mM 내지 약 8.5mM, 약 4.0mM 내지 약 8.0mM, 약 4.0mM 내지 약 7.5mM, 약 4.0mM 내지 약 7.0mM, 약 4.0mM 내지 약 6.5mM, 약 4.0mM 내지 약 6.0mM, 약 4.0mM 내지 약 5mM, 약 4.0mM 내지 약 4.5mM, 약 4.5mM 내지 약 10mM, 약 4.5mM 내지 약 9.5mM, 약 4.5mM 내지 약 9.0mM, 약 4.5mM 내지 약 8.5 mM, 약 4.5mM 내지 약 8.0mM, 약 4.5mM 내지 약 7.5mM, 약 4.5mM 내지 약 7.0mM, 약 4.5mM 내지 약 6.5mM, 약 4.5mM 내지 약 6.0mM, 약 4.5mM 내지 약 5.5mM, 약 4.5mM 내지 약 5.0mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM, 약 5.0mM 내지 약 9.5mM, 약 5.0mM 내지 약 9.0mM, 약 5.0mM 내지 약 8.5mM, 약 5.0mM 내지 약 8.0mM, 약 5.0 mM 내지 약 7.5mM, 약 5.0mM 내지 약 7.0mM, 약 5.0mM 내지 약 6.5mM, 약 5.0mM 내지 약 6.0mM, 약 5.0mM 내지 약 5.5mM, 약 5.5mM 내지 약 10mM, 약 5.5mM 내지 약 9.5mM, 약 5.5mM 내지 약 9.0mM, 약 5.5mM 내지 약 8.5mM, 약 5.5mM 내지 약 8.0mM, 약 5.5mM 내지 약 7.5mM, 약 5.5mM 내지 약 7.0mM, 약 5.5mM 내지 약 6.5mM mM, 약 5.5mM 내지 약 6.0mM, 약 6.0mM 내지 약 10mM, 약 6.0 mM 내지 약 9.5mM, 약 6.0mM 내지 약 9.0mM, 약 6.0mM 내지 약 8.5mM, 약 6.0mM 내지 약 8.0mM, 약 6.0mM 내지 약 7.5mM, 약 6.0mM 내지 약 7.0mM, 약 6.0mM 내지 약 6.5mM, 약 6.5mM 내지 약 10mM, 약 6.5mM 내지 약 9.5mM, 약 6.5mM 내지 약 9.0mM, 약 6.5mM 내지 약 8.5mM, 약 6.5mM 내지 약 8.0mM, 약 6.5mM 내지 약 7.5m mM, 약 6.5mM 내지 약 7.0mM, 약 7.0mM 내지 약 10mM, 약 7.0mM 내지 약 9.5mM, 약 7.0mM 내지 약 9.0mM, 약 7.0mM 내지 약 8.5mM, 약 7.0mM 내지 약 8.0mM, 약 7.0mM 내지 약 7.5mM, 약 7.5mM 내지 약 10mM, 약 7.5mM 내지 약 9.5mM, 약 7.5mM 내지 약 9.0mM, 약 7.5mM 내지 약 8.5mM, 약 7.5mM 내지 약 8.0mM, 약 8.0mM 내지 약 10mM, 약 8.0mM 내지 약 9.5mM, 약 8.0mM 내지 약 9.0mM, 약 8.0mM 내지 약 8.5mM, 약 8.5mM 내지 약 10mM, 약 8.5mM 내지 약 9.5mM, 약 8.5mM 내지 약 9.0mM, 약 9.0mM 내지 약 10mM, 약 9.0mM 내지 약 9.5 mM, 또는 약 9.5mM 내지 약 10mM)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 제1 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1 g/mL 내지 약 20 g/mL(예를 들어, 약 1 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 15 μ g/mL, 약 1μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 1μg /mL 내지 약 11μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 9μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 8μg/ mL, 약 1μg/mL 내지 약 7μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 6μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 4μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 3μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 8μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 7μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 6μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 4μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 3μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 20μg /mL, 약 3μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 13μg/mL , 약 3μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 9μg/mL, 약 3μg/mL내지 약 8μg/mL, 약 3μg/mL내지 약 7μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 6μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 3μg/mL 내지 약 4μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 17μg /mL, 약 4μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 4μg/ mL 내지 약 13μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 9μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 8μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 7μg/mL, 약 4μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 4 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 5 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 5 μ g/mL 내지 약 11μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 9μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 8μg /mL, 약 5μg/mL 내지 약 7μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 6μg/mL, 약 6μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 6μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 6μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 6μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 6μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 6 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 7 μg/mL내지 약 20μg/mL, 약 7μg/mL내지 약 19μg/mL, 약 7μg/mL내지 약 18μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 17μ g/mL, 약 7μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 7μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 7 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 8 μg/mL 내지 약 14 μg/ mL, 약 8μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 12μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 8μg/mL 내지 약 9μg/mL, 약 9μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 9μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 15 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 14 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 13 μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 12 *?*μg/mL, 약 9 μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 9μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 19μ g/mL, 약 10μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 10μg /mL 내지 약 15μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 12μg/ mL, 약 10μg/mL 내지 약 11μg/mL, 약 11μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 11μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 11μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 11 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 약 11μg/mL내지 약 16μg/mL, 약 11μg/mL내지 약 15μg/mL, 약 11μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 11μ g/mL 내지 약 13μg/mL, 약 11μg/mL 내지 약 12μg/mL, 12μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 19μg/ mL, 약 12μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 16μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 14μg/mL, 약 12μg/mL 내지 약 13μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 16 μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 13μg/mL 내지 약 14μg/mL, 14μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 14μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 14μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 14μg/mL 내지 약 17μg/mL, 약 14μg/mL 내지 약 16μg/ mL, 약 14μg/mL 내지 약 15μg/mL, 15μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 17μg/m L, 약 15μg/mL 내지 약 16μg/mL, 16μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 16μg/mL 내지 약 19μg/mL, 약 16μg/mL 내지 약 18 μg/mL, 약 16 μg/mL 내지 약 17 μg/mL, 17 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 17 μg/mL 내지 약 19 μg/mL, 약 17 μg/mL 내지 약 18μg/mL, 약 18μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 18μg/mL 내지 약 19μg/mL, 또는 약 19μg/mL 내지 약 20 μg/mL) 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 제1 배양 배지의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제1 배양 배지의 일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) (예를 들어, 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 50 μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 50μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 50μg/mL 내지 약 150μg/mL, 약 50μg/mL 내지 약 100μg/mL , 약 100μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 150 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 150 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 200μ g/mL 내지 약 250μg/mL, 약 250μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 250μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 250μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 또는 약 350μg /mL 내지 약 400 μg /mL의 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합))을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 90ng /mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng /mL 내지 약 170ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 150ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng /mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng /mL, 약 10ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL , 약 1 0ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 20ng /mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 20ng/mL 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 30ng/mL mL 내지 약 50ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL내지 약 190ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 18 0ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 140ng /mL, 약 70ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 80ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 80ng/mL 약 100ng/mL 내지 약 80ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 170ng /mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 110ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 120n g/mL 내지 약 160ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 190 ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 190ng/mL, 또는 약 190ng/mL 내지 약 200ng/mL, Flt-3 리간드(예를 들어, 재조합 인간 Flt-3 리간드)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 450 ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 250ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 5ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 150ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 50 ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 25ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 15ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 10ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 300ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 250ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL내지 약 15ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 15ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 15n g/mL 내지 약 300ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 20ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 650ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 600ng /mL, 약 20ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 20ng/mL내지 약 400ng/mL , 약 20ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 25ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 650ng/mL, 약 25ng /mL 내지 약 600ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 300ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 250ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 200ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 150ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 100ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 50ng/mL, 약 50ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 50ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 600 ng/mL, 약 50ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 50ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 50ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 50ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 100ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 100ng /mL 내지 약 700ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 100ng/mL 약 500ng/mL내지 약 100ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 100ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 100ng/mL내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 150ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 150ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 150ng /mL 내지 약 400ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 150ng/mL 약 200ng/mL 내지 약 200ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 200ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 650 ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 300ng/mL mL, 약 200ng/mL내지 약 250ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 250ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 650ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 250ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 250ng /mL 내지 약 450ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 300ng/mL 약 1μg/mL 내지 약 300ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 300ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 300ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 300ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL내지 약 450ng /mL, 약 300ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL내지 약 350ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 350ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 650ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 350 ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 350ng/mL내지 약 400ng/mL, 약 400ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 400ng /mL 내지 약 950ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 400ng/mL 약 750ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 400ng/mL내지 약 550ng/mL, 약 400ng/mL내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL내지 약 450ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 1 μg/mL, 약 450ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 800ng /mL, 약 450ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 650ng/mL, 약 450ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 500ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 500 ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 550ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 550ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 550ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 550ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 550ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 550ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 550ng/mL내지 약 650 ng/mL, 약 550ng/mL내지 약 600ng/mL, 약 600ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 600ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 600ng/mL내지 약 900ng /mL, 약 600ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 600ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 600ng/mL내지 약 750ng/mL, 약 600ng/mL내지 약 700ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 650ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 650ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 650ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 700ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 850ng/mL, 약 700ng /mL 내지 약 800ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 750ng/mL, 약 750ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 750ng/mL 내지 약 950ng/mL, 약 750ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 750ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 750ng/mL내지 약 800ng/mL, 약 800ng/mL내지 약 1 μg/mL, 약 800ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 800ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 800ng/mL내지 약 850ng/mL, 약 850ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 850ng/mL내지 약 950ng/mL, 약 850ng/mL내지 약 900ng/mL, 약 900ng/mL내지 약 1μg/mL, 약 900ng/mL내지 약 950ng /mL, 또는 약 950ng/mL 내지 약 1μg/mL의 SCF(예: 재조합 인간 줄기 세포 인자)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 90ng /mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 2ng/mL, 2ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 70ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 10ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng /mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 60ng /mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 60ng /mL 내지 약 80ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 70ng/mL 약 180ng/mL 내지 약 70ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 150ng /mL, 약 80ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 90ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 190ng/mL, 또는 약 190ng/mL 내지 약 200ng/mL의 IL-3(예를 들어, 재조합 인간 IL-3)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 0.1ng/mL 내지 약 2ng/mL, 2ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 2ng/mL mL 내지 약 180ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 2 ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 2ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 70ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 10ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng /mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 40 ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 60ng /mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 70ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 70ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 90ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 90ng /mL 내지 약 140ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 90ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 110ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 110ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 130ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 170 ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 130ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 150 ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 170ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 190ng/mL, 약 170ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 190ng/mL, 또는 약 190ng/mL 내지 약 200ng/mL의 IL-6(예를 들어, 재조합 인간 IL-6)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 배양 배지는, 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 및/또는 무혈청 액체 배양 배지일 수 있다.
배양 단계 B
관류 배양
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 2일 내지 약 15일 동안 (예를 들어, 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3 일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일 , 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 제2 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 부피를 갖는 예시적인 생물반응기 중 임의의 것에서의 임의의 제2 세포 배양물)을 관류 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3 (예를 들어, 약 10 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 120 W/ m3, 약 10 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 20 W/m3, 약 10 W/m3 내지 약 15 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 15 W/ m3 내지 약 140 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 15 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 15 W/m3 내지 20 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 20 W/m3 내지 약 25 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 25 W/ m3 내지 약 80 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 25 W/m3 내지 약 30 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 180 W /m3, 약 30 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 40 W/m3, 약 30 W/m3 내지 약 35 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 35 W/m3 내지 180 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 35 W /m3 내지 약 120 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 35 W/m3 내지 약 60 W/m3, 약 35 W/m3 약 내지 40W/m3, 약 40W/m3 내지 약 200W/m3, 약 40W/m3 내지 약 180W/m3, 약 40W/m3 내지 약 160W/m3, 약 40W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 40 W/m3 내지 약 60 W /m3, 약 60 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 60 W/m3 내지 약 80 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 120 W/m3, 약 80 W/m3 내지 약 100 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 200 W /m3, 약 100 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 100 W/m3 내지 약 120 W/m3 , 약 120 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 120 W/m3 내지 약 140 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 180 W/m3, 약 140 W/m3 내지 약 160 W/m3, 약 160 W/m3 내지 약 200 W/m3, 약 160 W /m3 내지 약 180 W/m3, 및 약 180 W/m3 내지 약 200 W/m3)의 P/V 값으로 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 생물반응기에서) 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약10 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포 /일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일 , 약 1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 8 nL/ 세포/일, 약 2nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 15 nL/ 세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 20 nL /세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일 , 약 6 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 6 nL /세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 50nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 또는 약 55 nL /세포/일 내지 약 60 nL/세포/일 일의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 속도는 시간이 지남에 따라 증가된다.
일부 실시예에서, 단계 (b)에서의 관류 배양은 약 0.1 VVD(vessel volume per day) 내지 약 3 VVD(예를 들어, 약 0.1 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.4 VVD, 0.1 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.1 VVD 내지 약 0.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.2 VVD 내지 약 0.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.4 VVD 내지 약 0.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.6 V VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 0.6 VVD 내지 약 0.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2 .2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 0.8 VVD 내지 약 1.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 1.0 VVD 내지 약 1.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.2 VVD 내지 약 1.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.4 VVD 내지 약 1.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 1.6 VVD 내지 약 1.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 3 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 1.8 VVD 내지 2.4 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 1.8 VVD 내지 약 2.0 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.0 VVD 내지 약 2.2 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.2 VVD 내지 약 2.4 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 3 VVD, 2.4 VVD 내지 약 2.8 VVD, 약 2.4 VVD 내지 약 2.6 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 3 VVD, 약 2.6 VVD 내지 약 2.8 VVD, 또는 약 2.8 VVD 내지 약 3 VVD)의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 적어도 부분적으로 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지))를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지))는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제2 배양 배지 중 임의의 것))는 시간 경과에 따라 주기적으로 (예를 들오, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 제2 세포 배양물에 첨가된다. 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지)의 첨가는 예를 들어 연동 펌프 또는 관류 펌프를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 단계 (b)에서 관류 배양은 시간이 지남에 따라 일정 부피의 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)를 제거하는 것을 적어도 부분적으로 포함한다. 일부 실시예에서, 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)는 시간이 지남에 따라 연속적으로 제거된다. 일부 실시예에서, 배양 배지는 시간이 지남에 따라 주기적으로 (예를 들오, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 제거된다. 배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)의 제거는 예를 들어 접선 흐름 여과(TFF) 또는 교대 흐름 여과(ATF)를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 흐름 여과의 추가의 비제한적인 측면이 여기에 설명되어 있다.
이러한 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린(예를 들어, 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린(예를 들어, 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), IL-3(예를 들어, 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3(예를 들어, 재조합 인간 IL-3) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), SCF(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF(예를 들어, 재조합 인간 SCF) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 덱사메타손(예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO- 모방 펩티드(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방 펩티드 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것) 및 인슐린(예: 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 중 하나 이상(예: 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)을 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 약 0.1mM 내지 약 10mM(또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF) 또는 교대 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과(예를 들어, 접선 유동 여과 또는 교대 접선 여과)는 약 10 nm 내지 약 6.0 μm, 약 10 nm 내지 약 5.5 μm, 약 10 nm 내지 약 5.0 μm, 약 10 nm 내지 약 4.5 μm, 약 10 nm 내지 약 4.0 μm, 약 10 nm 내지 약 3.5 μm, 약 10 nm 내지 약 3.0 μm, 약 10 nm 내지 약 2.5 μm, 약 10 nm 내지 약 2.0 μm, 약 10 nm 내지 약 1.5 μm, 약 10 nm 내지 약 1.0 μm, 약 10 nm 내지 약 0.5 μm, 약 10 nm 내지 약 0.2 μm, 10 nm 내지 약 0.1 μm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 6.0 μm, 약 50 nm 내지 약 5.5 μm, 약 50 nm 내지 약 5.0 μm, 약 50 nm 내지 약 4.5 μm, 약 50 nm 내지 약 4.0 μm, 약 50 nm 내지 약 3.5 μm, 약 50 nm 내지 약 3.0 μm, 약 50 nm 내지 약 2.5 μm, 약 50 nm 내지 약 2.0 μm, 약 50 nm 내지 약 1.5 μm, 약 50 nm 내지 약 1.0 μm, 약 50 nm 내지 약 0.5 μm, 약 50 nm 내지 약 0.2 μm, 약 50 nm 내지 약 0.1 μm, 약 0.1 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 4.5 μm, 0.1 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 1.0 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.1 μm 내지 약 0.2 μm, 약 0.2 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 3.5 μm 약 0.2 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1.0 μm 약 0.2 μm 내지 약 0.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.5 μm, 약 0.5 μm 내지 약 1.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.0 μm 내지 약 2.0 μm, 약 1.0 μm 내지 약 1.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 6.0 μm, 1.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.5 μm, 약 1.5 μm 내지 약 2.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.0 μm 내지 약 3.0 μm, 약 2.0 μm 내지 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.0 μm 내지 약 4.0 μm, 약 3.0 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 4.0 μm 내지 약 4.5 μm, 약 4.5 μm 내지 약 6.0 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.5 μm, 약 4.5 μm 내지 약 5.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 6.0 μm, 약 5.0 μm 내지 약 5.5 μm, 또는 약 5.5 μm 약 6.0 μm 의 평균 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터의 사용을 포함한다.
일부 실시예에서, 제2 세포 배양물의 관류는 일단 제1 세포 배양물이 특정 표적 세포 밀도, 예를 들어, 약 1.0 x 106개 세포/mL, 약 1.5 x 106개 세포/mL, 약 2.0 x 106개 세포/mL, 약 2.5 x 106개 세포/mL, 약 3.0 x 106개 세포/mL, 약 3.5 x 106개 세포/mL, 약 4.0 x 106개 세포/mL, 약 4.5 x 106개 세포/mL, 약 5.0 x 106개 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106개 세포/mL, 약 9.5 x 106개 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107개 세포/mL에 도달하면 시작된다.
배치 또는 유가 배양
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물(예를 들어, 예시적인 진탕 플라스크, 진탕 튜브, 배양 백 또는 생물반응기 중 임의의 것에서 제2 세포 배양물 중 임의의 것)을 약 2일 내지 약 15일 동안(예를 들어, 약 2일 내지 약 14일, 약 2일 내지 약 13일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 12일 동안, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 15일, 약 3일 내지 약 14일, 약 3일 내지 약 13일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 15일, 약 4일 내지 약 14일, 약 4일 내지 약 13일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일) 배치식 또는 유가식으로 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)는 생물반응기(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 생물반응기)에 배치된 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식 배양을 포함한다. 이러한 실시예태에서, 단계 (b)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)의 P/V 값으로 생물반응기에서 제2 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 임의의 것)에 배치된 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (b)는 진탕 플라스크에서 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 하위 범위 중 임의의 것)에서 제2 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브(예를 들어, 여기에 설명된 임의의 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 설명된 임의의 예시적인 진탕 튜브(예를 들어, 원뿔형 용기))에 배치된 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식 회분식 배양을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (b)는 진탕 튜브에서 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)에서 제2 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)는 배양 백(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 배양 백)에 배치된 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (b)는 분당 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)의 요동 속도로 배양 백에서 제2 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)는 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (b)에서 유가식 배양은 추가 부피의 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지)를 시간 경과에 따라 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지))는 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제2 배양 배지 중 임의의 것))는 시간 경과에 따라 주기적으로(예: 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 제2 세포 배양물에 첨가된다. 일부 실시예에서, 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어, 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x, 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2 x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x, 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5 x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0 x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x , 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5 x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5x, 약 1.5x 내지 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x, 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0 x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x, 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x, 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5 x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x, 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0x 내지 약 7.0x, 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x , 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5 x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0x 내지 약 7.0x, 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5 x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0x, 약 6.5x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)의 단계 (a) 직후의 두 번째 세포 배양의 부피가 각 24시간 증분으로 추가된다. 일부 실시예에서, 제2 세포 배양물에 대한 추가 부피의 배양 배지(예를 들어, 제2 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제2 배양 배지 중 임의의 것))의 첨가는 일단 제1 세포 배양물이 특정 표적 세포, 예를 들어, 약 1.0 x 106개 세포/mL, 약 1.5 x 106개 세포/mL, 약 2.0 x 106개 세포/mL, 약 2.5 x 106개 세포/mL, 약 3.0 x 106개 세포/mL, 약 3.5 x 106개 세포/mL, 약 4.0 x 106개 세포/mL, 약 4.5 x 106개 세포/mL, 약 5.0 x 106개 세포/mL, 약 5.5 x 106개 세포/mL, 약 6.0 x 106개 세포/mL, 약 6.5 x 106개 세포/mL, 약 7.0 x 106개 세포/mL, 약 7.5 x 106개 세포/mL, 약 8.0 x 106개 세포/mL, 약 8.5 x 106개 세포/mL, 약 9.0 x 106개 세포/mL, 약 9.5 x 106개 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL 밀도에 도달하면 시작된다.
배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 배양 배지)의 첨가는 예를 들어 연동 펌프를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
이러한 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 트랜스페린(예를 들어, 약 1μg/mL 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린(예를 들어, (예를 들어, 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), IL-3(예를 들어, 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3(예를 들어, 재조합 인간 IL-3) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), SCF(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF(예를 들어, 재조합 인간 SCF) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 덱사메타손(예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO- 모방 펩티드(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방 펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 EPO-모방 펩티드) 또는 이 범위의 임의의 하위 범위 여기에 설명됨) 및 인슐린(예를 들어, 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 중 하나 이상(예: 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)을 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 지질(예를 들어, 지질 혼합물)을 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 제2 배양 배지는 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합 의 약 0.1mM 내지 약 10mM(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)을 포함한다.
세 번째 세포 배양 제공(단계 C)
본 명세서에 기술된 방법은 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 배양 배지)는 용기(예를 들어, 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기), 진탕 튜브, 진탕 플라스크, 또는 배양 백) 내에 포함되는 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105개 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 0.5 x 105 세포/ mL 내지 약 1 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/ mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 105 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107개 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 105 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 0.1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/ mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 0.1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 약 0.5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 106 세포/ mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 0.5 x 107 세포/mL, 또는 약 0.5 x 107 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 가지는 제3 세포 배양물을 제공한다.
일부 실시예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 임의의 것)의 부피를 생물반응기(예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의의 예시적인 부피를 갖는 임의의 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기))에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 0.5 x 105개 세포/mL내지 약 1 x 107 세포/mL (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (c)는 진탕 플라스크 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 임의의 것) 내에 포함된 제3 배양 배지에 단계 (b)의 제2 세포 배양물 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 임의의 것)의 부피를 배치하여 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제2 세포 배양물)의 부피를 진탕 튜브 (예를 들어, 여기에 설명된 임의의 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 설명된 임의의 예시적인 진탕 튜브(예를 들어, 원뿔형 용기)) 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL(또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 제2 세포 배양물 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제2 세포 배양물 중 임의의 것)의 부피를 배양 백 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 배양 백 중 임의의 것) 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 0.5 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)의 트랜스페린(예를 들어, 약 1 μg/mL 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 인슐린(예를 들어, 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린(예를 들어, 재조합 인간 인슐린) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), SCF(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF(예를 들어, 재조합 인간 SCF) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 및 EPO 또는 EPO 모방 펩티드(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO 모방 펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 EPO 모방 펩티드), 또는 임의의 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 제3 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM, Iscove's modified Dulbecco's medium)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 제3 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어, 약 0.1% v/v 내지 약 9.5% v/v, 0.1% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.5 % v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/ v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5.5 % v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.0% v/ v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.0% v/v , 약 1.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5 % v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.5 % v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.5% v /v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.000% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.0 % v/v 내지 약 5% v/v, 약 2. 0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0 % v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.5% v /v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.5% v/ v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.0 %v/v, 약 3.0%v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0 % v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.5% v/v에서 약 8.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.5% v /v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5.5% v/ v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0 % v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 5.0 % v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.0% v /v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 10% v/ v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.000% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.5 % v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 7.5% v /v 내지 약 10% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.0% v/v 약 9.0% v/v, 약 8.000% v /v 내지 약 8.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.0% v/ v, 약 9.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 또는 약 9.5% v/v 내지 약 10% v/v) 혈청(예를 들어, 인간 AB 혈청)를 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 0.1% v/v 내지 약 5% v/v(예를 들어, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5 % v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v /v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/ v, 약1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0 % v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v /v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/ v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 또는 약 4.5% v/v 내지 약 5% v/v) 인간 혈장을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1 U/mL 내지 약 5 U/mL(예를 들어, 약 1 U/mL 내지 약 4 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 3 U/mL, 약 1 U/mL 내지 약 2U/mL, 약 2U/mL 내지 약 5U/mL, 약 2U/mL 내지 약 4U/mL, 약 2U/mL 내지 약 3U/mL, 약 3U/mL 내지 약 5U/mL, 약 3U/mL 내지 약 4U/mL, 또는 약 4U/mL 내지 약 5U/mL) 헤파린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/ v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v) 폴록사머-188(P188)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 제3 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM (예를 들어, 약 1 mM 내지 약 7 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 또는 약 7mM 내지 약 8mM)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 5μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 60μg /mL, 약 5μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 5 μ g/mL 내지 약 20μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 10μg/mL, 10μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 60μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 20μg/mL, 20μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 20 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 40μg/mL, 40μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 80μg/mL, 약 40μg/mL 내지 약 60μg/mL, 60μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 60μg/mL내지 약 350μg/mL, 약 60μg/mL내지 약 300μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 60 μg/mL 내지 약 120μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 100μg/mL, 약 60μg/mL 내지 약 80μg/mL, 80μg/mL 내지 약 500μg /mL, 약 80μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 80μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 약 80 μg/mL 내지 약 120 μg/mL, 약 80 μg/mL 약 100 μg/mL, 100 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 160μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 140μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 120μg/mL, 120μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 120μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 160 μg/mL, 약 120 μg/mL 내지 약 140 μg/mL, 140 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 140 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 180μg/mL, 약 140μg/mL 내지 약 160μg/mL, 160μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 160μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 200 μg/mL, 약 160 μg/mL 내지 약 180 μg/mL, 180 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 180 μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 250μg/mL, 약 180μg/mL 내지 약 200μg/mL, 200μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 350μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 250 μg/mL, 250 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 350 μg/mL, 약 250 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 300 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 350μg/mL, 350μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 350μg/mL 내지 약 450μg/mL, 약 350μg/mL 내지 약 400μg/mL, 400μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 450 μg/mL, 또는 450 μg/mL 내지 약 500 μg/mL의 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 5ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 800ng/mL , 약 5ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 20ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 50ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 50ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 50 ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 100ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 100ng /mL 내지 약 700ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 150ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 150ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 800 ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 250ng/mL, 약 150ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 200ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 200ng /mL 내지 약 450ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 200ng/mL 약 250ng/mL 내지 약 250ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 250ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 300ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 350 ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 350ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 350ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 1μg/m, 약 400ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 450ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 450ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 500ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 500ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 600ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 600ng/mL 내지 약 700ng/mL, 약 700ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 700ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 700 ng/mL 내지 약 800ng/mL, 약 800ng/mL 내지 약 1μg/mL, 약 800ng/mL 내지 약 900ng/mL, 약 900ng/mL 내지 약 1g/mL의 SCF (예를 들어, 재조합 인간 SCF)를 포함한다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 340ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 320ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 280 ng/mL, 약 1ng/mL내지 약 260ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15 ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 5ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 5ng /mL 내지 약 300ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 10ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 10ng/mL mL 내지 약 200ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 15ng/mL, 15ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 340ng/mL, 약 15ng/mL내지 약 320ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL, 20ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 25ng/mL, 25ng/mL 내지 약 500ng /mL, 약 25ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 160ng/mL, 약 25ng/mL내지 약 140ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 25ng /mL 내지 약 80ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 30ng/mL, 30ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 420 ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 260 ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 40ng/mL, 40ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 400ng/mL,약 40ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 40ng/mL내지 약 140ng/mL, 약 40ng/mL내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80 ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 60ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 60ng /mL 내지 약 280ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 80ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 100ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 100ng /mL 내지 약 480ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 100 ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 120ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 480ng /mL, 약 120ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 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160ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180ng/mL, 180ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 440ng /mL, 약 180ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 200ng/mL, 200ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 200ng /mL 내지 약 440ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 200ng/mL내지 약 260ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 220ng/mL, 220ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 240ng/mL, 240ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 260ng/mL, 260ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 280ng/mL, 280ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 280ng/mL mL 내지 약 480ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 320 ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 300ng/mL, 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 460ng/mL , 약 300ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 320ng/mL, 320ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 340ng/mL, 340ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 440 ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 360ng/mL, 360ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 380ng/mL, 380ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 400ng/mL, 400ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 440ng /mL, 약 400ng/mL 내지 약 420ng/mL, 420ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 440ng/mL, 440ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 440ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 440ng /mL 내지 약 460ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 480ng/mL, 또는 약 480ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO 모방 펩티드를 포함한다. EPO-모방 펩티드의 비제한적인 예가 본 명세서에 기재되어 있다. EPO-모방 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 2 μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 15μg/ mL 내지 약 35μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 20μg /mL 내지 약 45μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 35μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지는 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 및/또는 무혈청 액체 배양 배지일 수 있다.
배양 단계 D
관류 배양
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5일 내지 약 20일(예를 들어, 약 5일 내지 약 19일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 16일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 20일, 약 6일 내지 약 19일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 17일, 약 6일 내지 약 16일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6 일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 19일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 17일, 약 7일 내지 약 16일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 19일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 17일, 약 8일 내지 약 16일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 19일, 약 9일 내지 약 18일, 약 9일 내지 약 17일, 약 9일 내지 약 16일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 19일 , 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 17일, 약 10일 내지 약 16일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 20일, 약 11일 내지 약 19일, 약 11일 내지 약 18일, 약 11일 내지 약 17일, 약 11일 내지 약 16일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 19일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 17일, 약 12일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 약 20일, 약 13일 내지 약 19일, 약 13일 내지 약 18일, 약 13일 내지 약 17일, 약 13일 내지 약 16일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 20일, 약 14일 내지 약 19일, 약 14일 내지 약 18일, 약 14일 내지 약 17일, 약 14일 내지 약 16일, 약 14일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 19일, 약 15일 내지 약 18일, 약 15일 내지 약 17일, 약 15일 내지 약 16일, 약 16일 내지 약 20일, 약 16일 내지 약 19일, 약 16일 내지 약 18일, 약 16일 내지 약 17일, 약 17일 내지 약 20일, 약 17일 내지 약 19일, 약 17일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 20일, 약 18일 내지 약 19일, 또는 약 19일 내지 약 20일) 동안 제3 세포 배양물 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)에서 본 명세서에 기재된 임의의 제3 세포 배양물)을 관류 배양하는 것을 포함하고 여기서 단계 (d) 후 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구(예를 들어, 여기에 기술된 예시적인 탈핵 적혈구 중 임의의 것)의 집단을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 범위의 임의의 하위 범위)의 P/V 값으로 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기재된 임의의 생물반응기에서)을 교반하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.1 nL/ 세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 0.1 nL/세포/일 내지 약 0.5 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 0.5 nL /세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포 /일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 5 nL /세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 1 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 1 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 1 nL/ 세포/일 내지 약 2 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 8 nL/ 세포/일, 약 2nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 2 nL/세포/일 내지 약 4 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 15 nL/ 세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 4 nL/세포/일 내지 약 5 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 20 nL /세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 8 nL/세포 /일, 약 5 nL/세포/일 내지 약 6 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 6 nL /세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 6 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 6 nL/세포 /일 내지 약 8 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 50nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 8 nL/세포/일 내지 약 10 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 10 nL/세포/일 내지 약 15 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/ 일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 15 nL/세포/일 내지 약 20 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 20 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 20 nL/ 세포/일 내지 약 25 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 25 nL/세포/일 내지 약 30 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 30 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 35 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 40 nL/세포/일 내지 약 45 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 약 45 nL/세포/일 내지 약 50 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 60 nL/세포/일, 약 50 nL/세포/일 내지 약 55 nL/세포/일, 또는 약 55 nL /세포/일 내지 약 60 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 관류 속도는 시간이 지남에 따라 증가된다.
일부 실시예에서, 단계 (d)에서의 관류 배양은 약 0.1 VVD 내지 약 3 VVD(또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)의 관류 속도를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 단계 (d)에서 관류 배양은 다음을 포함한다: (i) 추가 부피의 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)를 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 제1 기간 동안 첨가하는 단계; (ii) 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 첨가하는 단계.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)에 연속적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)에 연속적으로 첨가된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 주기적으로 (예를 들어, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 첨가되고; 및/또는 (ii) (ii)에서 추가 부피의 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)가 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)에 주기적(예를 들어, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번)으로 첨가된다.
배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 또는 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 첨가는 예를 들어 연동 펌프를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
배양 배지(예를 들어, 실질적으로 무세포 배양 배지)의 제거는 예를 들어 접선 흐름 여과(TFF, tangential flow filtration) 또는 교대 흐름 여과(ATF, alternating flow filtration)를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다. 접선 흐름 여과의 추가의 비제한적인 측면이 여기에 설명되어 있다.
일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2 일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6 일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8 일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 10일 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
일부 실시예에서, (ii)의 제2 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2 일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
이들 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 트랜스페린 (예를 들어, 약 100 ㎍/mL 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린(예를 들어, 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방 펩티드 (예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방 펩티드 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 및 인슐린 (예를 들어, 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 중 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 제4 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 제4 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어, 약 0.1% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.5 % v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/ v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5 % v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.0% v /v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 8.0% v/ v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.5 % v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/ v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 9.0% v/v , 약 2.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 8.000% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0 % v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 2.5% v/ v 내지 약 5.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.0% v/v , 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 6.0 % v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0 % v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 3.5% v/v에서 약 8.5% v/v, 약 3.5% v/v에서 약 8.0% v/v, 약 3.5% v/v에서 약 7.5% v/v, 약 3.5% v /v 내지 약 7.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5.5% v/ v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.5 % v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5.5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 9.0% v /v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 4.5% v/ v 내지 약 7.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 4.5% v/v 내지 약 5.5% v/v , 약 4.5% v/v 내지 약 5.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 5.0% v/v 내지 약 5.5 % v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 5.5% v/v 내지 약 6.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 7.5% v/v , 약 6.0% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 6.0% v/v 내지 약 6.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 6.5% v/v 내지 약 7.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.5 % v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 7.0% v/v 내지 약 7.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 7.5% v/v 내지 약 8.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 8.0% v/v 내지 약 8.5% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 10% v/v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.5% v/ v, 약 8.5% v/v 내지 약 9.0% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 10% v/v, 약 9.0% v/v 내지 약 9.5% v/v, 또는 약 9.5% v/ v 내지 약 10% v/v) 혈청(예를 들어, 인간 AB 혈청)을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 0.1% v/v 내지 약 5% v/v(예를 들어, 약 0.1% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 0.5 % v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 0.5% v/v 내지 약 1.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.0% v /v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 1.0% v/v 내지 약 1.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 5% v/ V, 약 1.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 1.5% v/v 내지 약 2.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.0 % v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 2.0% v/v 내지 약 2.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 2.5% v /v 내지 약 4.0% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 2.5% v/v 내지 약 3.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 3.0% v/v 내지 약 3.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.5% v/v, 약 3.5% v/v 내지 약 4.0% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 5% v/v, 약 4.0% v/v 내지 약 4.5% v/v, 또는 약 4.5% v/v 내지 약 5% v/v) 인간 혈장을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1U/mL 내지 약 5U/mL(예를 들어, 약 1U/mL 내지 약 4U/mL, 약 1U/mL 내지 약 3U/mL, 약 1U/mL 내지 약 2U/mL, 약 2U/mL 내지 약 5U/mL, 약 2U/mL 내지 약 4U/mL, 약 2U/mL 내지 약 3U/mL, 약 3U/mL 약 5U/mL 내지 약 5U/mL, 약 3U/mL 내지 약 4U/mL, 또는 약 4U/mL 내지 약 5U/mL) 헤파린을 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v(예를 들어, 약 0.1% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.1% w/v 내지 약 0.5% w/v, 약 0.5% w/ v 내지 약 3% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.5% w/v 내지 약 1.5% w/v , 약 0.5% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 3% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 3% w/v, 약 2.0% w/v 내지 약 2.5% w/v, 또는 약 2.5% w/v 내지 약 3% w/v) 폴록사머-188(P188)를 포함한다. 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합의 약 1mM 내지 약 8mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위 범위)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 100 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.5mg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 1.4mg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 1.3mg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 1.2mg/mL, 100 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 100 μg/mL 내지 약 800 μg /mL, 약 100μg/mL 내지 약 700μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 600μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 100μg/ mL 내지 약 400μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 300μg/mL, 약 100μg/mL 내지 약 200μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 2mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 1.4 mg/ mL, 약 200μg/mL 내지 약 1.3mg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 1.2mg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 1.1mg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 900μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 800μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 700μg/mL, 약 200μg/mL 내지 약 600μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 400 μg/mL, 약 200 μg/mL 내지 약 300 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 300 μg /mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 300 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 600μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 500μg/mL, 약 300μg/mL 내지 약 400μg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 400 μg/ mL 내지 약 1.4mg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 1.3mg/mL, 약 400μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 800 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 400 μg/mL 내지 약 500 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 500 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 500 μg /mL 내지 약 1.1mg/mL, 약 500μg/mL 내지 약 1.0mg/mL, 약 500μg/mL 내지 약 900μg/mL, 약 500μg/mL 내지 약 800μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 500 μg/mL 내지 약 600 μg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 1.6mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 1.5mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 1.4mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 600 μg /mL 내지 약 1.1mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 1.0mg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 900μg/mL, 약 600μg/mL 내지 약 800μg/mL, 약 600 μg/mL 내지 약 700 μg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.6 mg /mL, 약 700μg/mL 내지 약 1.5mg/mL, 약 700μg/mL 내지 약 1.4mg/mL, 약 700μg/mL 내지 약 1.3mg/mL, 약 700μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 700 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 700 μg/ mL 내지 약 800μg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 2mg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 1.8mg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 1.6mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.5mg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 1.4mg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 1.3mg/mL, 약 800μg/mL 내지 약 1.2mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 800 μg/mL 내지 약 900 μg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 2 mg /mL, 약 900μg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 900 μg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 1.0 mg/mL 내지 약 1.1 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.1 mg /mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1.1 mg/mL 내지 약 1.2 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.2 mg/mL 내지 약 1.3 mg/mL, 약 1. 3 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.3 mg/mL 내지 약 1.4 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.4 mg/mL 내지 약 1.5 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 약 1.6 mg/mL, 약 1.6 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1.6 mg/mL 내지 약 1.8 mg/mL, 또는 약 1.8 mg/mL 내지 약 2 mg/mL의 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합)을 포함한다.
일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 280ng /mL, 약 1ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 1ng /mL 내지 약 30ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 5ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 5ng /mL 내지 약 460ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 220ng /mL, 약 5ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 5ng /mL 내지 약 15ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 10ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 200 ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 15ng/mL, 15ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL, 20ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 20 ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 140 ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 20ng/mL 내지 약 25ng/mL, 25ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 25 ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 40ng/mL, 약 25ng/mL 내지 약 30ng/mL, 30ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 340 ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 30 ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 60ng/mL, 약 30ng/mL 내지 약 40ng/mL, 40ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 480ng/mL,약 40ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 320ng /mL, 약 40ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 40ng/mL 내지 240ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 160 ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 80ng/mL, 약 40ng/mL 내지 약 60ng/mL, 60ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 60ng /mL 내지 약 360ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 100ng/mL, 약 60ng/mL 내지 약 80ng/mL, 80ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 480 ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 80 ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 120ng/mL, 약 80ng/mL 내지 약 100ng/mL, 100ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 100ng /mL 내지 약 320ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 160ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 140ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 120ng/mL, 120ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 120 ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 120ng /mL 내지 약 160ng/mL, 약 120ng/mL 내지 약 140ng/mL, 140ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 380 ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 180ng/mL, 약 140ng/mL 내지 약 160ng/mL, 160ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 160ng /mL 내지 약 480ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 160 ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 200ng/mL, 약 160ng/mL 내지 약 180 ng/mL, 180ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 180ng /mL 내지 약 260ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 180ng/mL 내지 약 220ng/mL, 약 180 ng/mL 내지 약 200ng/mL, 200ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 280ng /mL, 약 200ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 240ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 220ng/mL, 220ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 220 ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 260ng/mL, 약 220ng/mL 내지 약 240ng/mL, 240ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 280ng/mL, 약 240ng/mL 내지 약 260ng/mL, 260ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 260 ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 260ng/mL 내지 약 280ng/mL, 280ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 320ng/mL, 약 280ng/mL 내지 약 300ng/mL, 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 300ng /mL 내지 약 360ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 340ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 320ng/mL, 320ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 360ng/mL, 약 320ng/mL 내지 약 3 40ng/mL, 340ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 380ng/mL, 약 340ng/mL 내지 약 360ng/mL, 360ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 360ng /mL 내지 약 420ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 360ng/mL 내지 약 380ng/mL, 380ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 420ng/mL, 약 380ng/mL 내지 약 400 ng/mL, 400ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 460ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 440ng/mL, 약 400ng/mL 내지 약 420ng/mL, 420ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 420ng /mL 내지 약 460ng/mL, 약 420ng/mL 내지 약 440ng/mL, 440ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 440ng/mL 내지 약 480ng/mL, 약 440ng/mL 내지 약 440ng/mL 약 460ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 460ng/mL 내지 약 480ng/mL, 또는 약 480ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO ) 또는 EPO-모방 펩티드를 포함한다. EPO-모방 펩티드의 비제한적 예가 본 명세서에 기재되어 있다. EPO-모방 펩티드의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 30g/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 0.1 μg/mL 약 20μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 0.1μg/mL 내지 약 1μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 1μg /mL 내지 약 25μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 1μg/mL 약 15μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 2μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 2 μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 2μg/mL 내지 약 5μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 5μg/mL 내지 약 10μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 35 μg/mL, 약 10 μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 10μg/mL 내지 약 15μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 15μg/mL 내지 약 20μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 20μg/mL 내지 약 25μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 25μg/mL 내지 약 30μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 45μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 40μg/mL, 약 30μg/mL 내지 약 35μg/mL, 약 35μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 약 35 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 40 μg/mL 내지 약 45 μg/mL, 또는 약 45 μg/mL 내지 약 50 μg/mL의 인슐린(예: 인간 인슐린)을 포함한다.
일부 실시예에서, 관류 배양은 접선 여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF) 또는 교대 접선 여과(ATF))의 사용을 포함한다. 일부 실시예에서, 접선 여과(예를 들어, TFF 또는 ATF)는 평균 기공 크기가 약 10 nm 내지 약 6.0 μm 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것)인 하나 이상의 필터의 사용을 포함한다.
일부 실시예에서, 제4 배양 배지는, 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 또는 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 액체 배양 배지, 및/또는 무혈청 액체 배양 배지일 수 있다.
일부 실시예에서, 제3 세포 배양물의 관류는 일단 제1 세포 배양물이 특정 표적 세포 밀도, 예를 들어, 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL에 도달하면 시작된다.
일부 실시예에서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107개의 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 107 탈핵 적혈구 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구의 세포 밀도를 초래한다.
배치 또는 유가 배양
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5일 내지 약 20일(예를 들어, 약 5일 내지 약 19일, 약 5일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 17일, 약 5일 내지 약 16일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 14일, 약 5일 내지 약 13일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 20일, 약 6일 내지 약 19일, 약 6일 내지 약 18일, 약 6일 내지 약 17일, 약 6일 내지 약 16일, 약 6일 내지 약 15일, 약 6일 내지 약 14일, 약 6일 내지 약 13일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 19일, 약 7일 내지 약 18일, 약 7일 내지 약 17일, 약 7일 내지 약 16일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 13일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 20일, 약 8일 내지 약 19일, 약 8일 내지 약 18일, 약 8일 내지 약 17일, 약 8일 내지 약 16일, 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 20일, 약 9일 내지 약 19일, 약 9일 내지 약 18일, 약 9일 내지 약 17일, 약 9일 내지 약 16일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 20 일, 약 10일 내지 약 19일, 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 17일, 약 10일 내지 약 16일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 20일, 약 11일 내지 약 19일, 약 11일 내지 약 18일, 약 11일 내지 약 17일, 약 11일 내지 약 16일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 19일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 17일, 약 12일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 20일, 약 13일 내지 약 19일, 약 13일 내지 약 18일, 약 13일 내지 약 17일, 약 13일 내지 약 16일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 20일, 약 14일 내지 약 19일, 약 14일 내지 약 18일, 약 14일 내지 약 17일, 약 14일 내지 약 16일 일, 약 14일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 20일, 약 15일 내지 약 19일, 약 15일 내지 약 18일, 약 15일 내지 약 17일, 약 15일 내지 약 16일, 약 16일 내지 약 20일, 약 16일 내지 약 19일, 약 16일 내지 약 18일, 약 16일 내지 약 17일, 약 17일 내지 약 20일, 약 17일 내지 약 19일, 약 17일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 20일, 약 18일 내지 약 19일, 또는 약 19일 내지 약 20일) 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기재된 예시적인 진탕 플라스크, 진탕 튜브, 배양 백, 또는 생물반응기 중 임의의 것에서 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 회분식 유가식을 포함하며 여기서 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 탈핵 적혈구의 집단(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 탈핵 적혈구 중 임의의 것)을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 생물반응기(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 생물반응기 중 임의의 것)에 배치된 제3 세포 배양물 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 회분식 또는 유가식으로 배양하는 것을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (d)는 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값에서 (또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 교반하면서 생물반응기에서 제3 세포 배양물(예를 들어, 본ㅍ명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 진탕 플라스크 중 임의의 것)에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 회분식 또는 유가식을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (d)는 진탕 플라스크 내에서 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)에서 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브 (예를 들어, 여기에 설명된 임의의 예시적인 부피를 갖는 본 명세서에 설명된 임의의 예시적인 진탕 튜브(예를 들어, 원뿔형 용기))에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 회분식 또는 유가식을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (d)는 진탕 튜브 내에서 약 0.1 x g 내지 약 50 x g(예를 드렁, 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)에서 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 배양 백 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 부피 중 임의의 것을 갖는 본 명세서에 기술된 예시적인 배양 백 중 임의의 것)에 배치된 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 회분식 또는 유가식을 포함한다. 이러한 실시예에서, 단계 (d)는 분당 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 진동 속도(또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)로 배양 백에서 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 배치 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)을 유가식으로 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 단계 (d)에서의 유가식 배양은 추가 부피의 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것) 및/또는 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)를 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것) 및/또는 제4 배양 배지 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 연속적으로 첨가된다. 일부 실시예에서, 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것) 및/또는 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 주기적으로(예를 들어, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 첨가된다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 직후의 세 번째 세포 배양액의 부피가 약 0.1x 내지 약 10x(예를 들어, 약 0.1x 내지 약 9.5x, 약 0.1x 내지 약 9.0x, 약 0.1x 내지 약 8.5x, 약 0.1x 내지 약 8.0x, 약 0.1x 내지 약 7.5x, 약 0.1x 내지 약 7.0x, 약 0.1x 내지 약 6.5x, 약 0.1x 내지 약 6.0x, 약 0.1x 내지 약 5.5x, 약 0.1x 내지 약 5.0x, 약 0.1x 내지 약 4.5x , 약 0.1x 내지 약 4.0x, 약 0.1x 내지 약 3.5x, 약 0.1x 내지 약 3.0x, 약 0.1x 내지 약 2.5x, 약 0.1x 내지 약 2.0x, 약 0.1x 내지 약 1.5x, 약 0.1x 내지 약 1.0x, 약 0.1x 내지 약 0.5x, 약 0.1x 내지 약 0.3x, 약 0.1x 내지 약 0.2x, 약 0.2x 내지 약 10x, 약 0.2x 내지 약 9.5x, 약 0.2x 내지 약 9.0x, 약 0.2x 내지 약 8.5x, 약 0.2x 내지 약 8.0x, 약 0.2x 내지 약 7.5x, 약 0.2x 내지 약 7.0x, 약 0.2x 내지 약 6.5x, 약 0.2x 내지 약 6.0 x, 약 0.2x 내지 약 5.5x, 약 0.2x 내지 약 5.0x, 약 0.2x 내지 약 4.5x, 약 0.2x 내지 약 4.0x, 약 0.2x 내지 약 3.5x, 약 0.2x 내지 약 3.0x, 약 0.2x 내지 약 2.5x, 약 0.2x 내지 약 2.0x, 약 0.2x 내지 약 1.5x, 약 0.2x 내지 약 1.0x, 약 0.2x 내지 약 0.5x, 약 0.2x 내지 약 0.3x, 약 0.3x 내지 약 10x , 약 0.3x 내지 약 9.5x, 약 0.3x 내지 약 9.0x, 약 0.3x 내지 약 8.5x, 약 0.3x 내지 약 8.0x, 약 0.3x 내지 약 7.5x, 약 0.3x 내지 약 7.0x, 약 0.3x 내지 약 6.5x, 약 0.3x 내지 약 6.0x, 약 0.3x 내지 약 5.5x, 약 0.3x 내지 약 5.0x, 약 0.3x 내지 약 4.5x, 약 0.3x 내지 약 4.0x, 약 0.3x 내지 약 3.5x, 약 0.3x 내지 약 3.0x, 약 0.3x 내지 약 2.5x, 약 0.3x 내지 약 2.0x, 약 0.3x 내지 약 1.5x, 약 0.3x 내지 약 1.0x, 약 0.3x 내지 약 0.5x, 약 0.5x 내지 약 10x, 약 0.5x 내지 약 9.5x, 약 0.5x 내지 약 9.0x, 약 0.5x 내지 약 8.5x, 약 0.5x 내지 약 8.0x, 약 0.5x 내지 약 7.5x, 약 0.5x 내지 약 7.0x, 약 0.5x 내지 약 6.5x, 약 0.5x 내지 약 6.0x, 약 0.5x 내지 약 5.5x, 약 0.5x 내지 약 5.0x, 약 0.5x 내지 약 4.5x, 약 0.5 x 내지 약 4.0x, 약 0.5x 내지 약 3.5x, 약 0.5x 내지 약 3.0x, 약 0.5x 내지 약 2.5x, 약 0.5x 내지 약 2.0x, 약 0.5x 내지 약 1.5x, 약 0.5x 내지 약 1.0x, 약 1.0 x 내지 약 10x, 약 1.0x 내지 약 9.5x, 약 1.0x 내지 약 9.0x, 약 1.0x 내지 약 8.5x, 약 1.0x 내지 약 8.0x, 약 1.0x 내지 약 7.5x, 약 1.0x 내지 약 7.0x, 약 1.0x 내지 약 6.5x, 약 1.0x 내지 약 6.0x, 약 1.0x 내지 약 5.5x, 약 1.0x 내지 약 5.0x, 약 1.0x 내지 약 4.5x, 약 1.0x 내지 약 4.0x, 약 1.0x 내지 약 3.5x, 약 1.0x 내지 약 3.0x, 약 1.0x 내지 약 2.5x, 약 1.0x 내지 약 2.0x, 약 1.0x 내지 약 1.5x, 약 1.5x 내지 약 10x, 약 1.5 x 내지 약 9.5x, 약 1.5x 내지 약 9.0x, 약 1.5x 내지 약 8.5x, 약 1.5x 내지 약 8.0x, 약 1.5x 내지 약 7.5x, 약 1.5x 내지 약 7.0x, 약 1.5x 내지 약 6.5x, 약 1.5x 내지 약 6.0x, 약 1.5x 내지 약 5.5x, 약 1.5x 내지 약 5.0x, 약 1.5x 내지 약 4.5x, 약 1.5x 내지 약 4.0x, 약 1.5x 내지 약 3.5 x, 약 1.5x 내지 약 3.0x, 약 1.5x 내지 약 2.5x, 약 1.5x 내지 약 2.0x, 약 2.0x 내지 약 10x, 약 2.0x 내지 약 9.5x, 약 2.0x 내지 약 9.0x, 약 2.0x 내지 약 8.5x , 약 2.0x 내지 약 8.0x, 약 2.0x 내지 약 7.5x, 약 2.0x 내지 약 7.0x, 약 2.0x 내지 약 6.5x, 약 2.0x 내지 약 6.0x, 약 2.0x 내지 약 5.5x, 약 2.0x 내지 약 5.0x, 약 2.0x 내지 약 4.5x, 약 2.0x 내지 약 4.0x, 약 2.0x 내지 약 3.5x, 약 2.0x 내지 약 3.0x, 약 2.0x 내지 약 2.5x, 약 2.5x 내지 약 10x, 약 2.5x 내지 약 9.5x, 약 2.5x 내지 약 9.0x, 약 2.5x 내지 약 8.5x, 약 2.5x 내지 약 8.0x, 약 2.5x 내지 약 7.5x, 약 2.5x 내지 약 7.0 x, 약 2.5x 내지 약 6.5x, 약 2.5x 내지 약 6.0x, 약 2.5x 내지 약 5.5x, 약 2.5x 내지 약 5.0x, 약 2.5x 내지 약 4.5x, 약 2.5x 내지 약 4.0x, 약 2.5x 내지 약 3.5x, 약 2.5x 내지 약 3.0x, 약 3.0x 내지 약 10x, 약 3.0x 내지 약 9.5x, 약 3.0x 내지 약 9.0x, 약 3.0x 내지 약 8.5x, 약 3.0x 내지 약 8.0x, 약 3.0x 내지 약 7.5x, 약 3.0x 내지 약 7.0x, 약 3.0x 내지 약 6.5x, 약 3.0x 내지 약 6.0x, 약 3.0x 내지 약 5.5x, 약 3.0x 내지 약 5.0x, 약 3.0 x 내지 약 4.5x, 약 3.0x 내지 약 4.0x, 약 3.0x 내지 약 3.5x, 약 3.5x 내지 약 10x, 약 3.5x 내지 약 9.5x, 약 3.5x 내지 약 9.0x, 약 3.5x 내지 약 8.5x, 약 3.5x 내지 약 8.0x, 약 3.5x 내지 약 7.5x, 약 3.5x 내지 약 7.0x, 약 3.5x 내지 약 6.5x, 약 3.5x 내지 약 6.0x, 약 3.5x 내지 약 5.5x , 약 3.5x 내지 약 5.0x, 약 3.5x 내지 약 4.5x, 약 3.5x 내지 약 4.0x, 약 4.0x 내지 약 10x, 약 4.0x 내지 약 9.5x, 약 4.0x 내지 약 9.0x, 약 4.0 x 내지 약 8.5x, 약 4.0x 내지 약 8.0x, 약 4.0x 내지 약 7.5x, 약 4.0x 내지 약 7.0x, 약 4.0x 내지 약 6.5x, 약 4.0x 내지 약 6.0x, 약 4.0x 내지 약 5.5x, 약 4.0x 내지 약 5.0x, 약 4.0x 내지 약 4.5x, 약 4.5x 내지 약 10x, 약 4.5x 내지 약 9.5x, 약 4.5x 내지 약 9.0x, 약 4.5x 내지 약 8.5x , 약 4.5x 내지 약 8.0x, 약 4.5x 내지 약 7.5x, 약 4.5x 내지 약 7.0x, 약 4.5x 내지 약 6.5x, 약 4.5x 내지 약 6.0x, 약 4.5x 내지 약 5.5x, 약 4.5x 내지 약 5.0x, 약 5.0x 내지 약 10x, 약 5.0x 내지 약 9.5x, 약 5.0x 내지 약 9.0x, 약 5.0x 내지 약 8.5x, 약 5.0x 내지 약 8.0x, 약 5.0x 내지 약 7.5x, 약 5.0 x 내지 약 7.0x, 약 5.0x 내지 약 6.5x, 약 5.0x 내지 약 6.0x, 약 5.0x 내지 약 5.5x, 약 5.5x 내지 약 10x, 약 5.5x 내지 약 9.5x, 약 5.5x 내지 약 9.0x, 약 5.5x 내지 약 8.5x, 약 5.5x 내지 약 8.0x, 약 5.5x 내지 약 7.5x, 약 5.5x 내지 약 7.0x, 약 5.5x 내지 약 6.5x, 약 5.5x 내지 약 6.0x, 약 6.0x 내지 약 10x, 약 6.0x 내지 약 9.5x, 약 6.0x 내지 약 9.0x, 약 6.0x 내지 약 8.5x, 약 6.0x 내지 약 8.0x, 약 6.0x 내지 약 7.5x, 약 6.0 x 내지 약 7.0x, 약 6.0x 내지 약 6.5x, 약 6.5x 내지 약 10x, 약 6.5x 내지 약 9.5x, 약 6.5x 내지 약 9.0x, 약 6.5x 내지 약 8.5x, 약 6.5x 내지 약 8.0 x, 약 6.5 x 내지 약 7.5x, 약 6.5x 내지 약 7.0x, 약 7.0x 내지 약 10x, 약 7.0x 내지 약 9.5x, 약 7.0x 내지 약 9.0x, 약 7.0x 내지 약 8.5x, 약 7.0x 내지 약 8.0 x, 약 7.0x 내지 약 7.5x, 약 7.5x 내지 약 10x, 약 7.5x 내지 약 9.5x, 약 7.5x 내지 약 9.0x, 약 7.5x 내지 약 8.5x, 약 7.5x 내지 약 8.0x, 약 8.0x 내지 약 10x, 약 8.0x 내지 약 9.5x, 약 8.0x 내지 약 9.0x, 약 8.0x 내지 약 8.5x, 약 8.5x 내지 약 10x, 약 8.5x 내지 약 9.5x, 약 8.5x 내지 약 9.0x, 약 9.0x 내지 약 10x, 약 9.0x 내지 약 9.5x, 또는 약 9.5x 내지 약 10x)로 각 24시간 증분으로 추가된다. 일부 실시예에서, 제3 세포 배양물에 대한 추가 부피의 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것) 및/또는 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 첨가는 일단 제3 세포 배양물이 특정 표적 세포 밀도 예를 들어, 약 1.0 x 106 세포/mL, 약 1.5 x 106 세포/mL, 약 2.0 x 106 세포/mL, 약 2.5 x 106 세포/mL, 약 3.0 x 106 세포/mL, 약 3.5 x 106 세포/mL, 약 4.0 x 106 세포/mL, 약 4.5 x 106 세포/mL, 약 5.0 x 106 세포/mL, 약 5.5 x 106 세포/mL, 약 6.0 x 106 세포/mL, 약 6.5 x 106 세포/mL, 약 7.0 x 106 세포/mL, 약 7.5 x 106 세포/mL, 약 8.0 x 106 세포/mL, 약 8.5 x 106 세포/mL, 약 9.0 x 106 세포/mL, 약 9.5 x 106 세포/mL, 또는 약 1.0 x 107 세포/mL에 도달하면 시작된다.
일부 실시예에서, 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개)의 트랜스페린(예를 들어, 약 1μg/mL 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린(예를 들어, 인간 아포트랜스페린, 인간 홀로 트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 인슐린(예를 들어, 약 0.1μg/mL 내지 약 50μg/mL 인슐린(예를 들어, 재조합 인간 인슐린) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), SCF(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF(예를 들어, 재조합 인간 SCF) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위), 및 EPO 또는 EPO 모방 펩티드(예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO 모방 펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 EPO 모방 펩티드), 또는 임의의 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위)를 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)에서의 유가식 배양은 (i) 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 첨가하는 단계; 및 (ii) 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제3 세포 배양물)에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 연속적으로 첨가되고; 및/또는 (ii)에서 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 연속적으로 첨가된다.
일부 실시예에서, (i)에서 제3 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 제3 배양 배지 중 임의의 것)의 추가 부피는 제1 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 주기적으로(예를 들어, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 첨가되고; 및/또는 (ii) (ii)에서 추가 부피의 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제3 세포 배양물 중 임의의 것)에 주기적으로(예를 들어, 3일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 다섯 번, 하루에 여섯 번, 하루에 일곱 번, 하루에 여덟 번, 하루에 아홉 번, 하루에 열 번, 하루에 열두 번, 또는 열두 번) 첨가한다.
배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제3 배양 배지 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 제4 배양 배지)의 추가는 예를 들어 연동 펌프를 사용하여 기계적으로 또는 수동으로(예를 들어, 멸균 피펫팅에 의해) 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, (i)의 제1 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2 일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4 일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6 일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8 일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
일부 실시예에서, (ii)에서 제2 기간은 약 1일 내지 약 12일, 약 1일 내지 약 11일, 약 1일 내지 약 10일, 약 1일 내지 약 9일, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2 일, 약 2일 내지 약 12일, 약 2일 내지 약 11일, 약 2일 내지 약 10일, 약 2일 내지 약 9일, 약 2일 내지 약 8일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 12일, 약 3일 내지 약 11일, 약 3 일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 8일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 12일, 약 4일 내지 약 11일, 약 4일 내지 약 10일, 약 4일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 12일, 약 5일 내지 약 11일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 8일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 또는 약 11일 내지 약 12일이다.
이들 방법의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 제4 배양 배지 중 임의의 것)는 트랜스페린(예를 들어, 약 100μg/mL 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린(예를 들어, 아포트랜스페린, 홀로트랜스페린, 또는 이들의 조합) 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것), 에리트로포이에틴(EPO) 또는 EPO-모방 펩티드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 EPO-모방 펩티드) (예를 들어, 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL의 EPO(예를 들어, 재조합 인간 EPO) 또는 EPO-모방 펩티드 또는 이것의 임의의 하위 범위 여기에 설명된 범위), 및 인슐린(예를 들어, 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린 또는 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 중 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 제4 배양 배지의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 0.1% v/v 내지 약 10% v/v(예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)혈청(예를 들어, 인간 AB 혈청)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 제4 배양 배지 중 임의의 것의 일부 실시예에서, 제4 배양 배지는 약 1 mM 내지 약 8 mM(예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합 포함한다.
일부 실시예에서, 단계 (d)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 8일 내지 약 15일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 14일, 약 9일 내지 약 13일, 약 9일 내지 약 12일, 약 9일 내지 약 11일, 약 9일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 10일 내지 약 13일, 약 10일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 11일, 약 11일 내지 약 15일, 약 11일 내지 약 14일, 약 11일 내지 약 13일, 약 11일 내지 약 12일, 약 12일 내지 약 15일, 약 12일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 13일, 약 13일 내지 약 15일, 약 13일 내지 약 14일, 또는 약 14일 내지 약 15일동안 수행된다.
일부 실시예에서, 단계 (d)는 약 5 x 106 탈핵 적혈구계 세포/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구계 세포/mL(또는 하위 범위 중 하나인 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 1 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 5 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 107 탈핵 적혈구, 약 6 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 106 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 2 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 4 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108 탈핵 적혈구/mL, 약 6 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL, 약 8 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 1 x 108탈핵 적혈구/mL)의 세포 밀도를 초래한다.
탈핵 적혈구
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)는 하나 이상의 소수 혈액형 항원(예를 들어, Le(a-b-)(루이스 항원 시스템용), Fy(ab-)(더피 시스템용), Jk(ab-)(키드 시스템용), MN-(MNS 시스템용), Kk-( Kell 시스템), Lu(ab-)(루터교 시스템의 경우) 및 H-항원 음성(봄베이 표현형), 또는 이들의 조)합에 대해 음성이다(즉, 포함하지 않음). 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 또한 O형 및/또는 Rh-형이다. 소수 혈액형은 예를 들어 Agarwal et al., "Blood group phenotype frequency in a tertiary care hospital in north India," Blood Res. 48(1):51-54, 2013, Mitra et al., "Blood groups systems", Indian J. Anaesth. 58(5):524-528, 2014에 그 설명이 참고로 여기에 포함된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)는 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 외인성 단백질)을 포함하지 않는 단리된 미배양 탈핵 적혈구와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 일부 실시예에서, WO 2015/073587의 실시예 59에 기재된 방법을 사용하여 삼투 취약성을 측정한다(이의 설명은 본 명세서에 참고로 포함됨).
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)는 야생형, 미처리 탈핵 적혈구와 대략 동일한 직경 또는 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)의 집단은 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 마이크론, 또는 약 4.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 10 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.0 마이크론, 4.0 내지 약 4.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 4. 5 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 약 12.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 6 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.0마이크론, 약 6.5 내지 8.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.5 내지 11.0 마이크론, 7.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 8.50 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 11. 0 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 11.5 마이크론, 또는 약 11.5 내지 약 12.0 마이크론, 선택적으로 모집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3 마이크론 미만의 평균 직경을 갖는다. 탈핵 적혈구 직경은 예를 들어 Advia 120 혈액학 시스템, Vi-cell™ 세포 생존도 분석기(Beckman Coulter) 또는 Moxi Z 세포 계수기(Orflo)를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 평균 미립자 부피의 부피는 약 10fL 내지 약 175fL, 약 10fL 내지 약 160fL, 약 10fL 내지 약 140fL, 약 10fL 내지 약 120fL, 10fL 내지 약 100fL, 약 10fL 내지 약 95fL, 약 10fL 내지 약 90fL, 약 10fL 내지 약 85fL, 약 10fL 내지 약 80fL, 약 10fL 내지 약 75fL, 약 10fL 내지 약 70fL, 약 10fL 내지 약 65fL, 약 10fL 내지 약 60fL, 약 10fL 내지 약 55fL, 약 10fL 내지 약 50fL, 약 10fL 내지 약 45fL, 약 10fL 내지 약 40fL, 약 10fL 내지 약 35fL, 약 10fL내지 약 30fL, 약 10fL 내지 약 25fL, 약 10fL 내지 약 20fL, 약 10fL 내지 약 15fL, 약 15fL 내지 약 175fL, 약 15fL 내지 약 160fL, 약 15fL 내지 약 140fL, 약 15fL 내지 약 120fL, 약 15fL 내지 약 100fL, 약 15fL 내지 약 95fL, 약 15fL 내지 약 90fL, 약 15fL 내지 약 85fL, 약 15fL 내지 약 80fL, 약 15fL 내지 약 75 fL, 약 15fL 내지 약 70fL, 약 15fL 내지 약 65fL, 약 15fL 내지 약 60fL, 약 15fL 내지 약 55fL, 약 15fL 내지 약 50fL, 약 15fL 내지 약 45fL, 약 15fL 내지 약 40fL, 약 15fL 내지 약 35fL, 약 15fL 내지 약 30fL, 약 15fL 내지 약 25fL, 약 15fL 내지 약 20fL, 약 20fL 내지 약 175fL, 약 20 fL 내지 약 160fL, 약 20fL 내지 약 140fL, 약 20fL 내지 약 120fL, 약 20fL 내지 약 100fL, 약 20fL 내지 약 95fL, 약 20fL 내지 약 90fL, 약 20fL 내지 약 85fL, 약 20fL 내지 약 80fL, 약 20fL 내지 약 75fL, 약 20fL 내지 약 70fL, 약 20fL 내지 약 65fL, 약 20fL 내지 약 60fL, 약 20fL 내지 약 55 fL, 약 20fL 내지 약 50fL, 약 20fL 내지 약 45fL, 약 20fL 내지 약 40fL, 약 20fL 내지 약 35fL, 약 20fL 내지 약 30fL, 약 20fL 내지 약 25fL, 약 25fL 내지 약 175fL, 약 25fL 내지 약 160fL, 약 25fL 내지 약 140fL, 약 25fL 내지 약 120fL, 약 25fL 내지 약 100fL, 약 25fL 내지 약 95fL, 약 25fL 내지 약 90fL, 약 25fL 내지 약 85fL, 약 25fL 내지 약 80fL, 약 25fL 내지 약 75fL, 약 25fL 내지 약 70f,L약 25fL내지 약 65fL, 약 25fL 내지 약 60fL, 약 25fL 내지 약 55fL, 약 25fL 내지 약 50fL, 약 25fL 내지 약 45fL, 약 25fL 내지 약 40fL, 약 25fL내지 약 35fL, 약 25fL 내지 약 30fL, 약 30fL 내지 약 175fL, 약 30fL 내지 약 160fL, 약 30fL 내지 약 140fL, 약 30fL 내지 약 120fL , 약 30fL 내지 약 100fL, 약 30fL 내지 약 95fL, 약 30fL 내지 약 90fL, 약 30fL 내지 약 85fL, 약 30fL 내지 약 80fL, 약 30fL 내지 약 75fL, 약 30fL 내지 약 70fL, 약 30fL 내지 약 65fL, 약 30fL 내지 약 60fL, 약 30fL 내지 약 55fL, 약 30fL 내지 약 50fL, 약 30fL 내지 약 45fL, 약 30fL 약 40fL 내지 약 30fL 내지 약 35fL, 약 35fL 내지 약 175fL, 약 35fL 내지 약 160fL, 약 35fL 내지 약 140 fL, 약 35 fL 내지 약 120 fL, 약 35 fL 내지 약 100 fL, 약 35 fL 내지 약 95 fL, 약 35 fL 내지 약 90 fL, 약 35 fL 내지 약 85 fL, 약 35 fL 내지 약 80 fL, 약 35fL내지 약 75fL, 약 35fL내지 약 70fL, 약 35fL내지 약 65fL, 약 35fL내지 약 60fL, 약 35fL내지 약 55fL, 약 35fL내지 약 50fL, 약 35fL내지 약 45fL, 약 35fL 내지 약 40fL, 약 40fL내지 약 175fL, 약 40fL내지 약 160fL, 약 40fL내지 약 140fL, 약 40fL내지 약 120fL, 약 40 fL 내지 약 100fL, 약 40fL 내지 약 95fL, 약 40fL 내지 약 90fL, 약 40fL 내지 약 85fL, 약 40fL 내지 약 80fL, 약 40fL 내지 약 75fL, 약 40fL 내지 약 70fL, 약 40fL내지 약 65fL, 약 40fL내지 약 60fL, 약 40fL내지 약 55fL, 약 40fL 내지 약 50fL, 약 40fL내지 약 45fL, 약 45fL내지 약 175 fL, 약 45fL 내지 약 160fL, 약 45fL 내지 약 140fL, 약 45fL 내지 약 120fL, 약 45fL 내지 약 100f L, 약 45fL 내지 약 95fL, 약 45fL 내지 약 90fL, 약 45fL 내지 약 85fL, 약 45fL 내지 약 80fL, 약 45fL 내지 약 75fL, 약 45fL 내지 약 70fL, 약 45fL내지 약 65fL, 약 45fL내지 약 60fL, 약 45fL 내지 약 55fL, 약 45fL내지 약 50fL, 약 50fL내지 약 175fL, 약 50fL내지 약 160fL, 약 50 fL 내지 약 140fL, 약 50fL 내지 약 120fL, 약 50fL 내지 약 100fL, 약 50fL 내지 약 95fL, 약 50fL 내지 약 90fL, 약 50fL 내지 약 85fL, 약 50fL 내지 약 80fL, 약 50fL내지 약 75fL, 약 50fL내지 약 70fL, 약 50fL내지 약 65fL, 약 50fL내지 약 60fL, 약 50fL내지 약 55fL, 약 60fL내지 약 175 fL, 약 60fL 내지 약 160fL, 약 60fL 내지 약 140fL, 약 60fL 내지 약 120fL, 약 60fL 내지 약 100fL, 약 60fL 내지 약 95fL, 약 60fL 내지 약 90fL, 약 60fL 내지 약 85fL, 약 60fL 내지 약 80fL, 약 60fL 내지 약 75fL, 약 60fL 내지 약 70fL, 약 60 fL 내지 약 65 fL, 약 70 fL 내지 약 175 fL, 약 70 fL 내지 약 160 fL, 약 70 fL 내지 약 140 fL, 약 70 fL 내지 약 120 fL, 약 70 fL 내지 약 100 fL, 약 70 fL 내지 약 95fL, 약 70fL내지 약 90fL, 약 70fL내지 약 85fL, 약 70fL내지 약 80fL, 약 70fL내지 약 75fL, 약 80fL내지 약 175fL, 약 80fL내지 약 160fL, 약 80fL내지 약 140fL, 약 80fL내지 약 120fL, 약 80fL 내지 약 100fL, 약 80fL내지 약 95fL, 약 80fL 내지 약 90fL, 약 80fL내지 약 85fL, 약 100fL내지 약 175fL, 약 100fL내지 약 160fL, 약 100fL내지 약 140fL, 약 100fL내지 약 120fL, 약 120fL내지 약 175fL, 약 120fL 내지 약 160fL, 120fL 내지 약 140fL, 약 140fL 내지 약 175fL, 약 140fL 내지 약 160fL, 또는 약 160fL 내지 약 175fL이고, 선택적으로 모집단의 표준 편차는 50, 40, 30 미만, 20, 10, 5 또는 2 fL이다. 평균 미립자 부피는 예를 들어 혈액 분석 기기, 예를 들어 Coulter 계수기, Moxi Z 세포 계수기(Orflo) 또는 Sysmex 혈액학 분석기를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 인간 (예를 들어, 인간 공여자 적혈구 전구 세포로부터 유래됨) 탈핵 적혈구이다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 조작된 인간 탈핵 적혈구이다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 단일 외인성 단백질(예를 들어, 세포질에 존재하거나 조작된 탈핵 적혈구 막 상에 존재하는 외인성 단백질) (예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 포함한다.
다른 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 2개 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 포함한다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 탈핵 적혈구(예를 들어, 효소, 예를 들어, 페닐알라닌 암모니아 분해효소)의 세포질에 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 탈핵 적혈구 (예를 들어, Fc-결합 분자, 사이토카인 수용체, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC-결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화제, 수용체 리간드(예를 들어, 수용체 작용제 또는 수용체 길항제), 또는 항체 또는 항체 단편)의 막 상에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 조작된 적혈구가 포함할 수 있는 하나 이상의 외인성 단백질의 비제한적 예는 하기 표 A-D에 열거되어 있으며, 추가로 외인성 단백질을 포함하는 조작된 적혈구가 치료에 사용될 수 있는 상응하는 질병 또는 상태가 열거 되어있다. 본 명세서에 기재된 임의의 적혈구에 포함될 수 있는 외인성 단백질의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 클릭 화학 반응의 생성물(예를 들어, 외인성 단백질은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 세포의 막 상에 존재하는 단백질(예를 들어, 제2 외인성 단백질 또는 내인성 단백질)에 접합될 수 있음)일 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 소르타제 효소(예를 들어, 외인성 단백질은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 세포의 막 상에 존재하는 단백질(예를 들어, 제2 외인성 단백질 또는 내인성 단백질)에 접합될 수 있음)를 사용한 접합 반응의 생성물일 수 있다. 소르타제 효소를 사용한 접합 반응의 비제한적인 예는 US. Pat. No. 10,260,038 and U.S. Pat. Pub. No. 2016/0082046 A1,에서 찾을 수 있으며, 둘 다 참고로 포함된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는 하나 이상의 외인성 단백질을 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 세포, 예를 들어 탈핵 적혈구, 조작된 탈핵 적혈구, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 전구 적혈구 세포) (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법 사용)에 클릭-접합하는 것을 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 세포, 예를 들어 탈핵 적혈구, 조작된 탈핵 적혈구, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 전구 적혈구 세포) (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법 사용)를 저장성 로딩하는 것을 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는) 물리적 조작(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 세포, 예를 들어 탈핵 적혈구, 조작된 탈핵 적혈구, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 전구 적혈구 세포)를 로딩하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 지질-고정된 단백질, 예를 들어, GPI-앵커, N-미리스톨화된 단백질, 또는 S-팔미토일화된 단백질일 수 있다. 일부 실시예에서 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막횡단 단백질(예를 들어, 단일-통과 또는 다중-통과 막횡단 단백질) 또는 말초 막 단백질일 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막횡단 도메인(예를 들어, 작은 통합 막 단백질 1(SMIM1) 또는 글리코포린 A(GPA)의 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 세포외 공간으로 돌출된 아미노산을 갖지 않는다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 조작된 탈핵 적혈구의 세포질 내로 돌출된 임의의 아미노산을 갖지 않는다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 세포외 공간으로 돌출된 아미노산 및 조작된 제핵 적혈구계 세포의 세포질 내로 돌출된 아미노산을 갖는다.
본 명세서에 기재된 방법은 단계 (a) 이전에 또는 단계 (a) 동안 (예를 들어, (a) 단계 중 언제든지 1-3일 이상, 예를 들어, (a) 단계 시작 시 1-3일 이상)에 하나 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 적혈구 전구 세포 중 임의의 것) 내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조작된 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 외인성 단백질)을 코딩하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, DNA 발현 벡터 또는 mRNA)을 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 적혈구 전구 세포)에 도입함으로써 생성될 수 있다. DNA 발현 벡터를 갑상샘 선조 세포에 도입하기 위한 예시적인 방법은 리포솜-매개 전달, 형질전환, 유전자 총, 형질감염 및 형질도입, 예를 들어 바이러스-매개 유전자 전달 (예: 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 레트로바이러스 기반 벡터를 포함한 바이러스 벡터를 사용하여 수행)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. DNA 발현 벡터를 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위한 추가의 예시적인 방법은 예를 들어, 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션 및 세포 미세주입의 사용을 포함한다.
적혈구 전구 세포는 조작된 탈핵 적혈구로의 분화를 허용하는 적합한 조건 하에 하나 이상의 외인성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 도입 전에 임의로 배양될 수 있다. 일부 실시예에서, 생성된 조작된 탈핵 적혈구는 성숙한 적혈구, 예를 들어, 헤모글로빈(예: 성인 헤모글로빈 및/또는 태아 헤모글로빈), 글리코포린 A 및 표준 방법(예: 웨스턴 블롯팅 또는 FACS 분석)으로 검증 및 정량화할 수 있는 외인성 단백질과 관련된 단백질을 포함한다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포는 외인성 단백질을 코딩하는 mRNA로 형질감염되어 조작된 탈핵 적혈구를 생성할 수 있다. 메신저 RNA는 외인성 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA 플라스미드 구성물의 시험관내 전사로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 특정 RNA 중합효소와 양립할 수 있는 프로모터 서열을 함유하는 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터 ZAP Express® pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA, USA)는 각각 T3 및 T7 RNA 중합효소와 호환되는 T3 및 T7 프로모터 서열을 포함한다. 센스 mRNA의 시험관내 전사를 위해, 플라스미드는 외인성 단백질을 코딩하는 서열의 말단에 상응하는 정지 코돈(들)의 하류 제한 부위에서 선형화된다. mRNA는 예를 들어 RNAMaxx® High Yield Transcription Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 같은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 선형 DNA 주형으로부터 전사된다. 일부 경우에, 5'-m7GpppG 캡핑된 mRNA를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이 선형화된 cDNA 주형의 전사는 예를 들어 Ambion(Austin, Tex., USA)의 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit를 사용하여 수행할 수 있다. 전사는 30분에서 4시간 동안 37°C에서 20-100μl의 반응 부피로 수행할 수 있다. 전사된 mRNA는 선형화된 DNA 주형을 제거하기 위해 DNase I로 간단히 처리한 다음 염화리튬, 아세트산나트륨 또는 아세트산암모늄이 있는 70% 에탄올에 침전시켜 반응 혼합물에서 정제한다. 전사된 mRNA의 무결성은 아가로스-포름알데히드 겔 또는 상업적으로 이용 가능한 Novex 사전 주조 TBE 겔(Novex, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용한 전기영동을 사용하여 평가할 수 있다.
외인성 단백질을 암호화하는 메신저 RNA는 예를 들어, 리포펙션 및 전기천공을 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포에 도입될 수 있다(van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001). 리포펙션의 경우, 예를 들어 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 5μg의 시험관 내 전사된 mRNA를 양이온성 지질 DMRIE-C(Invitrogen)와 1:4 비율로 5-15분 동안 배양한다.
대안적으로, 다양한 다른 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체가 예를 들어, DOTAP, 다양한 형태의 폴리에틸렌이민, 및 폴리L-리신(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), 및 Superfect (Qiagen, Inc., Valencia, Calif., USA; See, e.g., Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001)을 포함하는 mRNA로 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 생성된 mRNA/지질 복합체를 37°C에서 2시간 동안 세포(1 - 2 x 106 cells/mL)와 함께 배양하고 세척한 다음 다시 배양한다. 전기천공의 경우, 예를 들어 500μL의 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 약 5 내지 20 x 106 세포를 시험관 내 전사된 mRNA 약 20μg과 혼합하고 예를 들어 Easyject Plus 장치(EquiBio, Kent, United Kingdom)를 사용하여 0.4cm 큐벳에서 전기천공한다. 어떤 경우에는 특정 mRNA를 적혈구 전구 세포로 형질감염시키기 위한 유용한 조건을 결정하기 위해 다양한 전압, 커패시턴스 및 전기천공 부피를 테스트해야 할 수 있다. 일반적으로 mRNA로 세포를 효율적으로 형질감염시키는 데 필요한 전기천공 매개변수는 DNA의 전기천공에 필요한 것보다 세포에 덜 해로운 것으로 보인다(van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001).
대안적으로, mRNA는 펩티드-매개 RNA 전달 전략을 사용하여 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내로 형질감염될 수 있다(예를 들어, Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001 참조). 예를 들어, 양이온성 지질 폴리에틸렌이민 2kDA(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)는 특히 유사분열 후 1차 세포에서 mRNA 형질감염의 효율을 증가시키기 위해 멜리틴 펩타이드(Alta Biosciences, Birmingham, UK)와 조합될 수 있다. 멜리틴 펩티드는 예를 들어 헤테로-이작용성 가교제 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트와 같은 이황화 가교제를 사용하여 PEI에 접합될 수 있다. 시험관 내 전사된 mRNA는 멜리틴-PEI와 함께 5-15분 동안 사전 배양되어 RNA/펩티드/지질 복합체를 형성한다. 그런 다음 이 복합체를 5% CO2 가습 환경에서 37°C에서 2~4시간 동안 무혈청 배양 배지의 세포에 첨가한 다음 제거하고 형질감염된 세포를 추가로 배양한다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(들) (예를 들어, 임의의 외인성 단백질 또는 본 명세서에 기재된 외인성 단백질의 임의의 조합)을 코딩하는 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 핵산)을 적혈구 전구 세포 내로 도입함으로써 생성된다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 적혈구 전구 세포 내로 도입되는 DNA에 의해 코딩된다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 적혈구 전구 세포 내로 도입되는 RNA에 의해 코딩된다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 예를 들어 일시적 또는 안정한 형질감염 및 유전자 요법 접근법을 비롯한 다양한 DNA 기술을 사용하여 탈핵 적혈구로의 말단 분화 전에 적혈구 전구 세포에 도입될 수 있다.
바이러스 유전자 전달은 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV1)과 같은 렌티바이러스 및 거품형 바이러스(foamy virus)와 같은 스푸마바이러스(예: Osten et al 참조., HEP 178:177-202, 2007)를 포함한 많은 바이러스가 유전자 전달 매개체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스는 인간 세포를 포함한 포유동물 세포를 효율적으로 형질도입하고 염색체에 통합하여 안정적인 유전자 전달을 제공한다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 적혈구 전구 세포 내로 형질감염될 수 있다. 적합한 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 벡터(Malik et al., Blood 91:2664-2671, 1998)이다. 발암성 레트로바이러스인 MMLV를 기반으로 하는 벡터는 현재 유전자 치료 임상 시험(Hassle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92, 2002)에서 사용된다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 DNA 구성물은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 MMLV 벡터 골격에서 생성될 수 있다. 구축물은 예를 들어 PA317 세포와 같은 패키징 세포주 내로 형질감염되고 바이러스 상청액은 예를 들어 PG13 세포와 같은 생산자 세포를 형질감염시키기 위해 사용된다. PG13 바이러스 상청액은 적혈구 전구 세포와 함께 배양된다. 외인성 단백질의 발현은 그것이 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막에 존재하는 경우, 예를 들어 외인성 단백질에 대해 지시된 형광 표지된 항체를 사용하여 FACS 분석(형광 활성화 세포 분류)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 외인성 단백질이 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하도록 유사한 방법이 사용될 수 있다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 적혈구 전구 세포 내로 형질감염될 수 있다. 적합한 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 벡터(Malik et al., Blood 91:2664-2671, 1998)이다. 발암성 레트로바이러스인 MMLV를 기반으로 하는 벡터는 현재 유전자 치료 임상 시험(Hassle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92, 2002)에서 사용된다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 DNA 구성물은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 MMLV 벡터 골격에서 생성될 수 있다. 구축물은 예를 들어 PA317 세포와 같은 패키징 세포주 내로 형질감염되고 바이러스 상청액은 예를 들어 PG13 세포와 같은 생산자 세포를 형질감염시키기 위해 사용된다. PG13 바이러스 상청액은 적혈구 전구 세포와 함께 배양된다. 외인성 단백질의 발현은 그것이 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막에 존재하는 경우, 예를 들어 외인성 단백질에 대해 지시된 형광 표지된 항체를 사용하여 FACS 분석(형광 활성화 세포 분류)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 외인성 단백질이 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하도록 유사한 방법이 사용될 수 있다.
비바이러스 벡터는 조작된 탈핵 적혈구를 생성하기 위해 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 화학적 및 물리적 방법을 포함하여 많은 전달 방법을 사용하여 비바이러스 벡터를 적혈구 전구 세포에 도입할 수 있다.
외인성 단백질을 코딩하는 비바이러스 벡터는 양이온성 지질 및 중합체(Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005)와 같은 합성 거대분자를 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 양이온성 리포솜은 전하 상호작용을 통해 DNA와 복합체를 형성한다. 양전하를 띤 DNA/지질 복합체는 음의 세포 표면에 결합하고 세포내이입에 의해 세포에 흡수된다. 이 접근법은 예를 들어 조혈 세포(예를 들어, Keller et al., Gene Therapy 6:931-938, 1999 참조)를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적혈구 전구 세포의 경우, 플라스미드 DNA (예를 들어 OptiMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 같은 무혈청 배지에서)는 시판되는 형질감염 시약 Lipofectamine™(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 같은 양이온성 리포솜(무혈청 배지 중)과 혼합되고 복합체를 형성하기 위해 적어도 20분 동안 배양되도록 하였다. DNA/리포솜 복합체를 적혈구 전구 세포에 첨가하고 5-24시간 동안 배양한 후 외인성 단백질(들)의 이식유전자 발현을 분석할 수 있다. 대안적으로, 다른 상업적으로 입수가능한 리포솜 형질감염제가 사용될 수 있다(예를 들어, In vivo GeneSHUTTLE™, Qbiogene, Carlsbad, CA).
선택적으로, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 중합체를 사용하여 적혈구 전구 세포, 예를 들어 조혈 및 제대혈 유래 CD34+ 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다(예를 들어, Shin et al., Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384, 2005). 인간 CD34+ 세포를 인간 제대혈에서 분리하고 200ng/ml 줄기 세포 인자 및 20% 열 불활성화 혈청이 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco 배지에서 배양한다. 외인성 단백질(들)을 코딩하는 플라스미드 DNA는 0.8K에서 750K까지 다양한 크기의 분지형 또는 선형 PEI와 함께 배양된다(Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA; Fermetas, Hanover, Md., USA). PEI는 4.2 mg/mL 증류수에서 스톡 용액으로 제조되고 HCl을 사용하여 pH 5.0으로 약간 산성화된다. DNA 1μg이 3nmol 인산염을 포함하고 1μL의 PEI 스톡 용액이 10nmol 아민 질소를 포함한다는 계산에 기초하여 다양한 질소/인산염 비율에서 실온에서 30분 동안 DNA를 PEI와 결합할 수 있다. 단리된 CD34+ 세포는 DNA/양이온성 복합체로 시딩되고, 5분 동안 280 xg에서 원심분리되고, 외인성 단백질(들)의 발현이 평가될 때까지 배양 배지에서 4시간 이상 동안 배양된다.
플라스미드 벡터는 입자 매개 형질감염, "유전자 총(gene gun)", 생물학적 제제 또는 입자 충격 기술과 같은 물리적 방법을 사용하여 적합한 적혈구 전구 세포에 도입될 수 있다(Papapetrou, et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005). 이때 외인성 단백질을 코딩하는 DNA는 금 입자에 흡수되어 입자총에 의해 세포에 투여된다. 이 접근법은 예를 들어 적혈구 전구 세포, 예를 들어 제대혈로부터 유래된 조혈 줄기 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Verma et al., Gene Therapy 5:692-699, 1998 참조). 이와 같이 제대혈을 분리하여 인산완충식염수에 3배 희석한다. CD34+ 세포는 이차 항체로 코팅된 자기 마이크로비드 및 자기 분리 시스템(예: Miltenyi MiniMac System, Auburn, CA, USA)과 함께 항-CD34 단일클론 항체를 사용하여 정제된다. CD34+ 농축 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다. 형질감염을 위해, 외인성 단백질(들)을 코딩하는 플라스미드 DNA는 염화칼슘 및 스페르미딘으로 처리하여 입자, 예를 들어 금 비드 상에 침전된다. DNA 코팅된 비드를 에탄올로 세척한 후, 비드를 예를 들어 Biolistic PDS-1000/He System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 배양된 세포로 전달할 수 있다. 예를 들어, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 루시퍼라제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 사용하여 형질감염의 효율을 평가할 수 있다.
선택적으로, 전기천공법을 사용하여 플라스미드 벡터를 적혈구 전구 세포에 도입할 수 있다. 전기천공법은 세포막에 일시적인 기공을 생성하여 예를 들어 DNA 및 RNA를 비롯한 다양한 분자를 세포에 도입할 수 있다. 이와 같이, CD34+ 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 단리되고 배양된다. 전기천공 직전에, 세포를 실온에서 250xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 분리하고 1.0% 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충된 X-VIVO 10과 같은 전기천공 완충액에서 0.2-10x106개 생존 세포/ml로 재현탁시켰다. 플라스미드 DNA(1-50μg)를 500μL의 세포 현탁액과 함께 적절한 전기천공 큐벳에 첨가한다.
전기천공은 예를 들어 200 V 내지 280 V 범위의 전압 및 25 내지 70 밀리초 범위의 펄스 길이를 갖는 ECM 600 전기천공기(Genetronics, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행될 수 있다. 다수의 대안적 전기천공 기구가 상업적으로 입수가능하고 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Gene Pulser Xcell™, BioRad, Hercules, CA; Cellject Duo, Thermo Science, Milford, MA). 대안적으로, 다음 매개변수를 사용하여 분리된 CD34+ 세포의 효율적인 전기천공을 수행할 수 있다: 4 mm 큐벳, 1600 μL, 550 V/cm 및 1x105 세포/mL에서 500 μL의 세포당 10 μg의 DNA(Oldak et al., Acta Biochim. Polonica 49:625-632, 2002).
전기천공의 한 형태인 뉴클레오펙션은 또한 적혈구 전구 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 이 경우, 형질감염은 DNA(또는 다른 시약)가 핵으로 직접 수송될 수 있도록 하는 세포 유형 특정 용액의 전기적 매개변수를 사용하여 수행되어 세포질에서 가능한 분해의 위험을 줄인다. 예를 들어, Human CD34 Cell Nucleofector™ Kit(Amaxa Inc.)를 사용하여 적혈구 전구 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이 경우, Human CD34 Cell Nucleofector™ 솔루션의 1-5x106 세포를 1-5 μg의 DNA와 혼합하고 제조업체가 결정한 사전 프로그래밍된 설정을 사용하여 Nucleofector™ 기기에서 형질감염시킨다.
적혈구 전구 세포는 게놈에 통합되지 않는 한 포유동물 세포에서 자가 복제할 수 없는 통상적인 발현 벡터로 비-바이러스 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 적혈구 전구 세포는 염색체로의 통합 없이 자율적으로 복제되는 유전자 단위로서 숙주 핵에서 지속될 수 있는 에피솜 벡터로 형질감염될 수 있다(Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005). 이러한 벡터는 예를 들어, EBV, 인간 폴리오마바이러스 BK, 소 유두종 바이러스-1(BPV-1), 단순 포진 바이러스-1(HSV) 및 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 잠복 감염 시 세포에서 정상적으로 염색체외 복제하는 바이러스에서 파생된 유전 요소를 이용한다. 포유동물 인공 염색체는 또한 비바이러스 유전자 전달을 위해 사용될 수 있다(Vanderbyl et al., Exp. Hematol. 33:1470-1476, 2005).
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 암호화하는 외인성 핵산은 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 방법, 예를 들어 제한 분해, 중첩-신장 PCR 및 깁슨 어셈블리에 의해 발현 벡터로 조립될 수 있다.
외인성 핵산은 외인성 단백질이 세포 표면 예를 들어, 제핵 적혈구 세포에서 발현되도록 내인성 또는 천연 막 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된, 세포 표면에 정상적으로 존재하지 않는 외인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 외인성 유전자는 유형 2 막 단백질의 C 말단, 또는 GPI 연결 막 단백질의 GPI 부착 부위의 상류에서 유형 1 막 단백질의 리더 서열에 따라 N 말단에서 클로닝될 수 있다.
표준 클로닝 방법을 사용하여 융합된 두 유전자 사이에 유연한 아미노산 링커를 도입할 수 있다. 예를 들어, 유연한 링커는 일반적으로 전장 항체, 또는 (서열 번호 4) 폴리펩티드, 예를 들어 단일 사슬 Arc 억제인자를 생성하는 데 사용되는 폴리펩티드로부터 단일 사슬 항체 단편을 생성되는데 사용되는 [Gly4Ser]3(서열번호 3)과 같은 폴리-글리신 폴리-세린 링커이다. 일부 실시예에서, 가요성 링커는 가요성 링커가 없는 등가 구축물보다 더 많은 유연성 및 입체적 자유도를 갖는 외인성 단백질을 제공한다. 이러한 추가된 유연성은 표적, 예를 들어 항체 또는 단백질에 대한 결합 또는 활성 부위가 기질(예를 들어, 표적)에 접근할 수 있어야 하는 단백질의 효소 반응에 대한 결합을 필요로 하는 응용 분야에서 유용한다.
일부 실시예에서, 제공된 방법은 적혈구 전구 세포를 핵산과 접촉시키고 여기에 설명된 것과 같이, 세포에 핵산의 전달에 효과적인 조건 하에 전기천공에 의해 핵산을 도입함으로써 적혈구 전구 세포 내로 큰 핵산(특히 mRNA와 같은 RNA)의 전달을 포함한다. 적합한 전기천공기는 Bio-Rad GENE PULSER 및 GENE PULSER II; 라이프 테크놀로지스 NEON; BTX 제미니 시스템; 및 MAXCYTE 전기천공기를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 이러한 방법은 바이러스 전달이나 바이러스 벡터의 사용이 필요하지 않는다. 적합한 핵산은 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 적합한 핵산은 또한 전위 요소, 안정한 에피솜, 플라스미드 DNA 또는 선형 DNA를 포함하는 DNA를 포함한다.
세포주의 전기천공을 위한 조건은 문헌, 예를 들어 문헌 Van Tendeloo et al., Blood 98(l):49-56, 2001에 설명되어 있다. 여기에 설명된 방법에 적합한 전기천공 조건은 Life Technologies Neon Transfection System에 대해 다음을 포함한다: 약 500 내지 약 2000V, 약 800 내지 약 1800V, 또는 약 850 내지 약 1700V 범위의 펄스 전압; 약 5 내지 약 50msec, 또는 약 10 내지 약 40msec 범위의 펄스 폭; 및 1 내지 2 펄스, 1 내지 3 펄스, 1 내지 4 펄스, 또는 1 내지 5 펄스 범위의 펄스 수.
적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건은 예를 들어 4일 동안 포함한다: a) 펄스 전압 1300-1400, 펄스 폭: 10-20 msec, 펄스 수: 1-3; b) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3; c) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 20 msec, 펄스 수: 1 ; 및 d) 펄스 전압 1300, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3.
적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건은 예를 들어, 8-9일 동안 포함한다: a) 펄스 전압: 1400-1600, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1; b) 펄스 전압: 1100-1300, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 1; c) 펄스 전압: 1000-1200, 펄스 폭: 40, 펄스 수: 1; d) 펄스 전압: 1100-1400, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 2; e) 펄스 전압: 950-1150, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 2; f) 펄스 전압: 1300-1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이러한 조건은 일반적으로 약 60% 이상 (예를 들어, 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 형질감염 효율 및 약 70% 이상 (예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 세포 생존율을 초래한다.
분화 조건 하에 배양물에서 적혈구 전구 세포의 전기천공을 위한 특히 적합한 조건은 예를 들어 12-13일 동안 다음을 포함한다: a) 펄스 전압: 1500-1700, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1; 및 b) 펄스 전압: 1500-1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이러한 조건은 일반적으로 약 50% 이상(예: 약 55%, 60%, 65% 이상, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97% 이상), 및 적어도 약 70% 이상(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 세포 생존율.
Life Technologies Neon 시스템과 관련하여 여기에 개시된 조건은 일상적인 실험만으로 다른 전기천공기 및/또는 다른 전기천공 설정에 맞도록 당업자에 의해 쉽게 조정될 수 있으며 본 명세서에 기술된 특정 전기천공기는 개시된 방법을 제한하지 않는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 전기천공 조건을 사용하여 배양된 적혈구 전구 세포를 처음으로 전기천공하고, 이어서 원하는 기간 동안 (선택적으로 분화 조건 하에) 배양한 다음, 두 번째로 재전기천공한다. 일부 실시예에서, 배양된 적혈구 전구 세포를 처음으로 전기천공한 다음, 원하는 기간 동안 (임의로 분화 조건 하에) 배양한 다음, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째로 재전기천공한다. 선택적으로, 첫 번째와 두 번째, 두 번째와 세 번째 등의 전기천공 사이의 배양 기간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 전기천공 사이의 기간은 원하는 대로, 예를 들어 기간은 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 12일, 13일 14일 또는 21일로 조정할 수 있다. 예를 들어, 적혈구 전구 세포는 1일 및 2일, 1일 및 3일, 1일 및 4일, 1일 및 5일, 1일 및 6일, 1일 및 7일, 1일 및 8일, 1일 및 9일, 1일 및 10일, 1일 및 11일, 1일 및 12일, 1일 및 13일, 1일 및 14일, 1일 및 15일, 또는 1일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 다른 실시예에서, 세포는 2일과 3일, 2일과 4일, 2일과 5일, 2일과 6일, 2일과 7일, 2일과 8일, 2일과 9일, 2일과 10일, 2일과 11일, 2일과 12일, 2일과 13일, 2일과 14일, 2일과 15일, 또는 2일과 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 3일과 4일, 3일과 5일, 3일과 6일, 3일과 7일, 3일과 8일, 3일과 9일, 3일과 10일, 3일과 11일, 3일과 12일, 3일과 13일, 3일과 14일, 3일과 15일, 또는 3일과 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 세포는 4일과 5일, 4일과 6일, 4일과 7일, 4일과 8일, 4일과 9일, 4일과 10일, 4일과 11일, 4일과 12일, 4일과 13일, 4일과 14일, 4일과 15일, 또는 4일과 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 세포는 5일과 6일, 5일과 7일, 5일과 8일, 5일과 9일, 5일과 10일, 5일과 11일, 5일과 12일, 5일과 13일, 5일과 14일, 5일과 15일, 또는 5일과 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 6일과 7일, 6일과 8일, 6일과 9일, 6일과 10일, 6일과 11일, 6일과 12일, 6일과 13일, 6일과 14일, 6일과 15일, 또는 6일과 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 7일 및 8일, 7일 및 9일, 7일 및 10일, 7일 및 11일, 7일 및 12일, 7일 및 13일, 7일 및 14일, 7일 및 15일, 또는 7일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 8일 및 9일, 8일 및 10일, 8일 및 11일, 8일 및 12일, 8일 및 13일, 8일 및 14일, 8일 및 15일, 또는 8일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 9일, 10일, 9일 및 11일, 9일 및 12일, 9일 및 13일, 9일 및 14일, 9일 및 15일, 또는 9일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 10일 및 11일, 10일 및 12일, 10일 및 13일, 10일 및 14일, 10일 및 15일, 또는 10일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 11일 및 12일, 11일 및 13일, 11일 및 14일, 11일 및 15일, 또는 11일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 12일 및 13일, 12일 및 14일, 12일 및 15일, 또는 12일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 13일 및 14일, 13일 및 15일, 또는 13일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 14일 및 15일, 또는 14일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 선택적으로, 적혈구 전구 세포는 2회 이상, 예를 들어 3회, 4회, 5회, 또는 6회 전기천공될 수 있고 간격은 세포의 분화 과정의 임의의 지점에서 원하는 대로 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 전기천공 조건을 사용하여, 배양된 적혈구 전구 세포를 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 또는 16 일 분화에서 전기천공할 수 있다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 클릭-접합된 조작된 탈핵 적혈구일 수 있다. 촉매적 결합-형성 폴리펩타이드 도메인은 세포질에 존재하거나 막 상에 존재하는, 예를 들어 적혈구 전구 세포 상에서 또는 내에서 발현될 수 있다. Streptococcus pyogenes에서 분리된 단백질인 Spy0128에서 파생된 것을 포함하여 트랜스펩티다제, 소르타제 및 이소펩티다제를 비롯한 많은 촉매 결합 형성 폴리펩티드가 존재한다. Spy0128의 자가촉매 이소펩티드 결합-형성 소단위(CnaB2 도메인)를 분할하면 서로에 대해 특이성을 갖는 촉매 활성을 유지하는 두 개의 별개의 폴리펩티드가 생성된다는 것이 입증되었다. 이 시스템의 폴리펩타이드를 SpyTag 및 SpyCatcher라고 한다. 혼합 시, SpyTag와 SpyCatcher는 SpyTag의 Aspl 17과 SpyCatcher의 Lys31 사이에 이소펩티드 결합 형성을 겪는다(Zakeri and Howarth, JACS 132:4526, 2010). 반응은 세포 환경과 호환되며 단백질/펩티드 접합에 매우 특이적이다(Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:E690-E697, 2012). SpyTag 및 SpyCatcher는 엘라스틴 유사 단백질에서 번역 후 토폴로지 변형을 지시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, N-말단에 SpyTag를 배치하고 C-말단에 SpyCatcher를 배치하면 원형 엘라스틴 유사 단백질이 형성된다(Zhang et al, J. Am. Chem. Soc. 2013).
구성 요소 SpyTag 및 SpyCatcher는 상호 교환되어 분자 A가 SpyTag에 융합되고 분자 B가 SpyCatcher에 융합되는 시스템이 분자 A가 SpyCatcher에 융합되고 분자 B가 SpyTag에 융합되는 시스템과 기능적으로 동일하다. 이 설명의 목적을 위해 SpyTag 및 SpyCatcher가 사용될 때 상보적인 분자가 그 자리에서 대체될 수 있음을 이해해야 한다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합 형성 폴리펩타이드를 사용하여 외인성 단백질을 예를 들어 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 표면에 부착할 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포외 표면에서 발현될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드는 예를 들어 유형-1 또는 유형-3 막횡단 단백질의 N 말단, 예를 들어, 유형-2 막횡단 단백질, 예를 들어 Kell의 C 말단에 융합된 글리코포린 A에 융합된 다중-통과 막횡단 단백질, 예를 들어 밴드 3의 세포외 말단 또는 세포외 루프에서 인-프레임 삽입 GPI-수용체 폴리펩티드, 예를 들어 CD55 또는 CD59는 지질 사슬-고정된 폴리펩티드에 융합되거나 말초 막 단백질에 융합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 코딩하는 핵산은 SpyTag 융합을 발현하는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구로부터 발현 및 분비될 수 있다. 대안적으로, SpyCatcher 융합을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 박테리아, 진균, 곤충, 포유동물 또는 무세포 생산 시스템에서 외인성으로 생산될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 표면에 부착시키는 공유 결합이 형성될 것이다.
한 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 세포에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 동일한 적혈구 세포에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩타이드의 발현 시, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩타이드 사이에 이소펩타이드 결합이 형성되어 적혈구 세포 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
또 다른 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 적합한 포유동물 세포 발현 시스템, 예를 들어 HEK293 세포에서 발현될 수 있다. 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 상의 SpyTag 융합 폴리펩티드의 발현 시, SpyCatcher 융합 폴리펩티드는 세포와 접촉될 수 있다. 적절한 반응 조건에서 이소펩티드 결합은 SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 형성되어 적혈구 전구 세포 표면 또는 탈핵 적혈구 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합 형성 폴리펩타이드를 사용하여 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에 고정할 수 있다. SpyTag 폴리펩타이드 서열은 트랜스진의 직접 발현, 내인성 세포내 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈, 내인성 세포 표면 단백질의 세포내 도메인에 대한 융합, 예를 들어, 밴드 3, 글리코포린 A, Kell, 또는 세포골격의 구조적 구성요소에 대한 융합을 비롯한 다수의 방법에 의해 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에서 발현될 수 있다. SpyTag 서열은 폴리펩타이드 말단에 제한되지 않으며 폴리펩타이드 번역 및 국한이 교란되지 않도록 내인성 폴리펩타이드의 내부 서열 내에 통합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 코딩하는 핵산 서열은 SpyTag 융합을 발현하는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내에서 발현될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에서 외인성 단백질을 고정시키는 역할을 하는 공유 결합이 형성될 것이다.
한 실시예에서, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 세포내에서 헤모글로빈 베타에 융합된 SpyTag를 포함한다. 적혈구 전구 세포는 해독시 세포내 베타 글로빈이 C 말단에서 SpyTag에 융합되도록 헤모글로빈 프로모터, 베타 글로빈 유전자, 및 SpyTag 서열을 포함하는 유전자 서열로 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 번역시 외인성 폴리펩티드가 N 말단에서 SpyCatcher에 융합되도록 외인성 폴리펩티드의 발현을 유도하는 SpyCatcher를 코딩하는 Gatal 프로모터-유도 유전자를 발현한다. 두 융합 단백질의 발현 시 SpyTag 결합 베타 글로빈은 이소펩티드 결합을 통해 세포내 공간에서 SpyCatcher 결합 외인성 폴리펩티드에 연결되어 외인성 폴리펩티드가 베타 글로빈에 고정되고 성숙 동안 유지되도록 한다.
또 다른 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내의 외인성 단백질에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내에서 글리코포린 A의 C 말단(세포내)에 대한 융합으로 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드의 발현 시, 이소펩티드 결합이 SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 형성되어 막 고정된 내인성 적혈구계 폴리펩티드와 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
다른 분자 융합은 폴리펩티드 사이에 형성될 수 있으며 직접 또는 간접 접합을 포함한다. 폴리펩타이드는 서로 직접 접합되거나 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 링커는 펩타이드, 폴리머, 앱타머 또는 핵산일 수 있다. 중합체는 예를 들어 천연, 합성, 선형 또는 분지형일 수 있다. 외인성 단백질은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 서로 직접 연결된 또는 개재 링커 서열 및/또는 한쪽 또는 양쪽 말단에 추가 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 링커에 대한 접합은 공유 결합 또는 이온 결합을 통해 이루어질 수 있다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 저장성 로딩된 인간 탈핵 적혈구이다. 저장성 로딩/용해의 경우 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 이온 강도가 낮은 완충액에 노출되어 파열된다. 외인성 단백질은 세포 내에 분포한다. 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포는 분리된 탈핵 적혈구의 펠릿에 30-50배 부피 과량의 5mM 인산염 완충액(pH 8)을 첨가하여 저장성 용해될 수 있다. 생성된 용해된 세포막은 원심분리에 의해 분리된다. 용해된 세포막의 펠릿을 재현탁하고 외인성 단백질의 존재 하에 낮은 이온 강도 완충액에서, 예를 들어 30분 동안 배양한다. 대안적으로, 용해된 세포막은 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포를 효율적으로 로딩하기 위해 결정된 최상의 조건에 따라 1분만큼 적게 또는 길게는 며칠 동안 외인성 단백질과 함께 배양될 수 있다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 코딩하는 핵산의 저장성 로딩을 위해, 핵산은 저장성 Tris-HCl 용액(pH 7.0)에 현탁되고 적혈구 전구 세포에 주입될 수 있다. Tris-HCl의 농도는 탈핵 적혈구를 효율적으로 로딩하기 위해 결정된 최상의 조건에 따라 약 20mmol/l 내지 약 150mmol/l일 수 있다.
대안적으로, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 세포를 팽창시키고 세포막에 기공을 생성하기 위해 저장성 용액에 대한 조절된 투석을 사용하여 외인성 단백질로 로딩될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,327,710; 5,753,221; 6,495,351 및 10,046,009 참조). 예를 들어, 세포 펠렛을 10mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM 포도당 pH 7.4에 재현탁하고 10mM NaH2PO4, 10mM NaHCO3, 20mM 포도당 및 4mM MgCl2, pH7.4를 함유하는 낮은 이온 강도 완충액에 대해 투석한다. 30-60분 후, 세포는 추가 30-60분 동안 외인성 단백질을 함유하는 16mM NaH2PO4, pH 7.4 용액에 대해 추가로 투석된다. 이들 절차는 모두 4℃의 온도에서 유리하게 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 투석 접근법에 의해 다량의 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구를 로딩하는 것이 유리할 수 있고 이러한 목적을 위해 설계된 특정 장치가 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,327,710, 6,139,836 및 6,495,351).
탈핵 적혈구의 분리 및 공식화
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 (e) 단계 (d)의 제3 세포 배양물로부터 조작된 제핵 적혈구계 세포의 집단을 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 조작된 탈핵 적혈구는 원심분리(예: 밀도-구배 원심분리), FACS 및 MACS와 같은(이에 국한되지 않음) 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 (f) 단계 (e)에서 단리된 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 제형화하는 것은 조작된 탈핵 적혈구의 단리된 집단을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 완충제 또는 부형제(예를 들어, 인산염 완충 식염수)와 혼합하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 집단은 대상체에 대한 세포의 저장, 수송 및/또는 투여에 적합한 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)로 제제화된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 단계 (f)에서 조작된 탈핵 적혈구의 제제화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체(예르 들어, 조작된 탈핵 적혈구에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질이 필요한 것으로 이전에 확인되거나 진단된 대상, 또는 수혈 및/또는 적혈구 증가가 필요한 것으로 확인된 대상)에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 대상체는 투여된 조작된 탈핵 적혈구에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 필요로 하는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 제제화된 집단은 대상체에게 정맥내 투여를 통해 투여된다.
구성
또한, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 탈핵 적혈구의 집단이 본원에 제공된다. 또한, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 탈핵 적혈구의 임의의 집단을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 제제(예를 들어, 약학적 조성물)가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시예에서, 제제는 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 대상체 중 임의의 것)에 대한 정맥내 투여에 적합하다. 본명세서에 기재된 임의의 조성물 또는 제제의 일부 실시예에서, 조성물 또는 제제는 본 명세서에 기재된 임의의 탈핵 적혈구의 투여 형태이다.
키트
또한 본 명세서에서 제공되는 탈핵 적혈구의 임의의 조성물, 제제 또는 집단을 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 또한 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 (예를 들어, 멸균 원추형 튜브, 멸균 페트리 접시, 멸균 바이알(예: 붕규산 유리 바이알) 및 멸균 플라스틱 백(디-2-에틸헥실 프탈레이트(DEHP)-가소화 폴리염화비닐(PVC) 백, 또는 n-부티릴-트리(n-헥실)-시트레이트(BTHC)-가소화된 PVC 백) 탈핵 적혈구의 임의의 조성물, 제형 또는 집단을 함유하는 하나 이상의 멸균 용기를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 임의의 키트는 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구의 임의의 조성물, 제제 또는 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 키트의 일부 실시예는 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구의 임의의 조성물, 제제, 및 집단의 적합한 단일 투여 형태를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 또는 제제의 단일 투여 형태는, 예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 2 L, 약 0.5 mL 내지 약 1800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1000 mL, 약 0.5 mL 내지 약 800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 600 mL, 약 0.5 mL 내지 약 500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 450 mL, 약 0.5 mL 내지 약 400 mL, 약 0.5 mL 내지 약 350 mL, 약 0.5 mL 내지 약 300 mL, 약 0.5 mL 내지 약 250 mL, 약 0.5 mL 내지 약 200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 180 mL, 약 0.5 mL 내지 약 160 mL, 약 0.5 mL 내지 약 140 mL, 약 0.5 mL 내지 약 120 mL, 약 0.5 mL 내지 약 100 mL, 약 0.5 mL 내지 약 80 mL, 약 0.5 mL 내지 약 60 mL, 약 0.5 mL 내지 약 40 mL, 약 0.5 mL 내지 약 20 mL, 약 0.5 mL 내지 약 10 mL, 약 0.5 mL 내지 약 5 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1.0 mL, 약 1.0 mL 내지 약 2 L, 약 1.0 mL 내지 약 1800 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1500 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 1000 mL, 약 1.0 mL 내지 약 800 mL, 약 1.0 mL 내지 약 600 mL, 약 1.0 mL 내지 약 500 mL, 약 1.0 mL 내지 약 450 mL, 약 1.0 mL 내지 약 400 mL, 약 1.0 mL 내지 약 350 mL, 약 1.0 mL 내지 약 300 mL, 약 1.0 mL 내지 약 250 mL, 약 1.0 mL 내지 약 200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 180 mL, 약 1.0 mL 내지 약 160 mL, 약 1.0 mL 내지 약 140 mL, 약 1.0 mL 내지 약 120 mL, 약 1.0 mL 내지 약 100 mL, 약 1.0 mL 내지 약 80 mL, 약 1.0 mL 내지 약 60 mL, 약 1.0 mL 내지 약 40 mL, 약 1.0 mL 내지 약 20 mL, 약 1.0 mL 내지 약 10 mL, 약 1.0 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 2 L, 약 5 mL 내지 약 1800 mL, 약 5 mL 내지 약 1500 mL, 약 5 mL 내지 약 1200 mL, 약 5 mL 내지 약 1000 mL, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 600 mL, 약 5 mL 내지 약 1800 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400 mL, 약 5 mL 내지 약 350 mL, 약 5 mL 내지 약 300 mL, 약 5 mL 내지 약 250 mL, 약 5 mL 내지 약 200 mL, 약 5 mL 내지 약 180 mL, 약 5 mL 내지 약 160 mL, 약 5 mL 내지 약 140 mL, 약 5 mL 내지 약 120 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 2 L, 약 10 mL 내지 약 1800 mL, 약 10 mL 내지 약 1500 mL, 약 10 mL 내지 약 1200 mL, 약 10 mL 내지 약 1000 mL, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 600mL, 약 10mL 내지 약 500mL, 약 10mL 내지 약 450mL, 약 10mL 내지 약 400mL, 약 10mL 내지 약 350mL, 약 10mL 내지 약 300mL, 약 10mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 180 mL, 약 10 mL 내지 약 160 mL, 약 10 mL 내지 약 140 mL, 약 10 mL 내지 약 120 mL, 약 10 mL 내지 약 100 mL, 약 10 mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 2 L, 약 20 mL 내지 약 1800 mL, 약 20 mL 내지 약 1500 mL, 약 20 mL 내지 약 1200 mL, 약 20 mL 내지 약 1000 mL, 약 20 mL 내지 약 800 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 2 L, 약 40 mL 내지 약 1800 mL, 약 40 mL 내지 약 1500 mL, 약 40 mL 내지 약 1200 mL, 약 40 mL 내지 약 1000 mL, 약 40 mL 내지 약 800 mL, 약 40 mL 내지 약 600 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400mL, 약 40mL 내지 약 350mL, 약 40mL 내지 약 300mL, 약 40mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80 mL, 약 40 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 2 L, 약 60 mL 내지 약 1800 mL, 약 60 mL 내지 약 1500 mL, 약 60 mL 내지 약 1200 mL, 약 60 mL 내지 약 1000 mL, 약 60 mL 내지 약 800 mL, 약 60 mL 내지 약 600 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140mL, 약 60mL 내지 약 120mL, 약 60mL 내지 약 100mL, 약 60mL 내지 약 80mL, 약 80mL 내지 약 2L, 약 80mL 내지 약 1800mL, 약 80mL 내지 약 1500mL, 약 80mL 내지 약 1200mL, 약 80mL 내지 약 1000mL, 약 80mL 내지 약 800 mL, 약 80 mL 내지 약 600 mL, 약 80 mL 내지 약 500 mL, 약 80 mL 내지 약 450 mL, 약 80 mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL, 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 2 L, 약 100 mL 내지 약 1800 mL, 약 100 mL 내지 약 1500 mL, 약 100 mL 내지 약 1200 mL, 약 100 mL 내지 약 1000 mL, 약 100 mL 약 800mL 내지 약 100mL 내지 약 600mL, 약 100mL 내지 약 500mL, 약 100mL 내지 약 450mL, 약 100mL 내지 약 400mL, 약 100mL 내지 약 350mL, 약 100mL 내지 약 300mL, 약 100mL 내지 약 250mL, 약 100mL 내지 약 200mL, 약 100m L 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 2 L, 약 120 mL 내지 약 1800 mL, 약 120 mL 내지 약 1500 mL, 약 120 mL 내지 약 1200 mL, 약 120 mL 내지 약 1000 mL, 약 120 mL 내지 약 800 mL, 약 120 mL 내지 약 600 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 내지 약 450 mL, 약 120 mL 내지 약 400 mL, 약 120 mL 내지 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL, 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 2 L, 약 140 mL 내지 약 1800 mL, 약 140 mL 내지 약 1500 mL, 약 140 mL 내지 약 1200 mL, 약 140 mL 내지 약 1000 mL, 약 140 mL 내지 약 800 mL, 약 140 mL 내지 약 600 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350mL, 약 140mL 내지 약 300mL, 약 140mL 내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 2 L, 약 180 mL 내지 약 1800 mL, 약 180 mL 내지 약 1500 mL, 약 180 mL 내지 약 1200 mL, 약 180 mL 내지 약 1000 mL, 약 180 mL 내지 약 800 mL, 약 180 mL 내지 약 600 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 2 L, 약 200 mL 내지 약 1800 mL, 약 200 mL 내지 약 1500 mL, 약 200 mL 내지 약 1200 mL, 약 200 mL 내지 약 1000 mL, 약 200 mL 내지 약 800 mL, 약 200 mL 내지 약 600 mL, 약 200 mL 내지 약 500 mL, 약 200 mL 내지 약 450 mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 2 L, 약 250 mL 내지 약 1800 mL, 약 250 mL 내지 약 1500 mL, 약 250 mL 내지 약 1200 mL, 약 250 mL 내지 약 1000 mL, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250 mL 내지 약 500 mL, 약 250 mL 내지 약 450 mL, 약 250 mL 내지 약 400 mL, 약 250 mL 내지 약 350 mL, 약 250 mL 내지 약 300 mL, 약 300 mL 내지 약 2 L, 약 300 mL 내지 약 1800 mL, 약 300 mL 내지 약 1500 mL, 약 300 mL 내지 약 1200 mL, 약 300 mL 내지 약 1000 mL, 약 300 mL 내지 약 800 mL, 약 300 mL 내지 약 600 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 2 L, 약 350 mL 내지 약 1800 mL, 약 350 mL 내지 약 1500 mL, 약 350mL 내지 약 1200mL, 약 350mL 내지 약 1000mL, 약 350mL 내지 약 800mL, 약 350mL 내지 약 600mL, 약 350mL 내지 약 500mL, 약 350mL 내지 약 450mL, 약 350mL 내지 약 400mL, 약 400mL 내지 약 2L, 약 400 mL 내지 약 1800 mL, 약 400 mL 내지 약 1500 mL, 약 400 mL 내지 약 1200 mL, 약 400 mL 내지 약 1000 mL, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 500 mL, 약 400 mL 내지 약 450 mL, 약 450 mL 내지 약 2 L, 약 450 mL 내지 약 1800 mL, 약 450 mL 내지 약 1500 mL, 약 450 mL 내지 약 1200 mL, 약 450 mL 내지 약 1000 mL, 약 450 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 2 L, 약 500 mL 내지 약 1800 mL, 약 500 mL 내지 약 1500 mL, 약 500 mL 내지 약 1200 mL, 약 500 mL 내지 약 1000 mL, 약 500 mL 내지 약 800 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 2 L, 약 600 mL 내지 약 1800 mL, 약 600 mL 내지 약 1500mL, 약 600mL 내지 약 1200mL, 약 600 mL 내지 약 1000 mL, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 2 L, 약 800 mL 내지 약 1800 mL, 약 800 mL 내지 약 1500 mL, 약 800 mL 내지 약 1200 mL, 약 800 mL 내지 약 1000 mL, 약 1000 mL 내지 약 2 L, 약 1000 mL 내지 약 1800 mL, 약 1000 mL 내지 약 1500 mL, 약 1000 mL 내지 약 1200 mL, 약 1200 mL 내지 약 2 L, 약 1200 mL 내지 약 1800 mL, 약 1200 mL 내지 약 1500 mL, 약 1500 mL 내지 약 2 L, 약 1500 mL 내지 약 1800 mL, 또는 약 1800 mL 내지 약 2 L의 부피를 가질 수 있다.
피험자를 치료하는 방법
또한 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구의 임의의 조성물, 제제 또는 집단의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시예에서, 투여는 정맥내 투여에 의해 수행된다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는 하나 이상의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본 명세서에 제공된 임의의 조성물과 실질적으로 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 대상체에게 투여하기 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1: 적혈구 세포의 관류 배양
교대 접선 흐름(ATF) 시스템을 적혈구 세포 분화의 후기 "M" 단계에서 생물반응기에 연결했다(본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 단계 (d)). 다른 모든 조건을 일정하게 유지하면서 상 특이적 배지를 생물반응기 시스템에 관류했다. 0.01-0.2 nL/세포/일의 세포 특이적 관류 속도(CSPR, cell-specific perfusion rate)가 사용되었다.
관류 배양(ATF) 및 대조군 적혈구계 세포(유가 배양)의 탈핵 백분율을 "M" 단계의 과정에 걸쳐 측정했다. 도 1에 도시된 바와 같이, 관류 배양된 적혈구 세포는 배양 13일째에 70%-80%의 탈핵율로 유가 배양된 대조군 세포와 비교하여 상당히 더 높은 탈핵율에 도달하였다.
관류 배양된 적혈구 세포 및 대조군 적혈구 세포의 세포 밀도는 "M" 단계의 과정에 걸쳐 NovoCyte 세포 계수기를 사용하여 측정되었다(본 명세서에 기재된 방법의 단계 (d)). 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양된 세포 관류는 대략 1.4 x 107 cells/mL의 피크 세포 밀도에 도달하였다. 대조적으로, 대조군 유가 배양 세포의 밀도는 2 x 106 cells/mL를 초과하지 않았다.
유사한 ATF 시스템 설정을 사용하여 적혈구 세포 분화의 "D" 단계 동안 관류 배양을 테스트했다(본 명세서에 기술된 방법의 단계 (b)에 해당). 관류 배양된 적혈구 세포의 세포 밀도는 "D" 단계 동안 NovoCyte 세포 계수기를 사용하여 측정되었다. 도3에 도시된 바와 같이, 관류 배양된 적혈구 세포는 높은 생존율을 유지하면서 약 1.3 - 1.7 x 107 cells/mL의 피크 밀도에 도달했다. "D" 단계의 끝에서, 관류 배양된 적혈구 세포는 1.5-3 x 106/mL의 밀도에 도달한 대조군 유가 배양 세포와 비교하여 1.0 x 107 세포/mL의 밀도에 도달했다(데이터는 표시되지 않음).
이러한 결과는 놀랍게도 "M" 기 및/또는 "D" 기 동안 적혈구 세포의 관류 배양이 분화하는 적혈구 전구 세포의 세포 밀도 및 제핵을 증가시킨다는 것을 입증하였다.
기타 실시예
본 발명이 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 설명하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 수정은 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
<110> Rubius Therapeutics, Inc. <120> METHODS OF GENERATING ENUCLEATED ERYTHROID CELLS <130> 47472-0002WO1 <140> PCT/US2020/034387 <141> 2020-05-22 <150> US 62/852,930 <151> 2019-05-24 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO mimetic peptide <400> 1 Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 15 Pro Gln Gly Gly 20 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPO mimetic peptide <400> 2 Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 4 Ala Gly Ser Thr 1

Claims (529)

  1. (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL;
    (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계;
    (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계,
    여기서 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 제핵 적혈구계 세포의 집단을 포함하는 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에:
    (i) 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 제공하기 위해 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구계 전구 세포를 배치하는 단계; 및
    (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 배치 또는 유가 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (i)의 상기 용기는 진탕 플라스크인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 진탕 플라스크의 부피는 약 15mL 내지 약 5L인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 진탕 플라스크의 부피는 약 50mL 내지 약 1.5L인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 진탕 플라스크의 부피는 약 100mL 내지 약 500mL인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)가 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 (ii)가 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 단계 (i)의 용기는 진탕 튜브인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 진탕 튜브의 부피는 약 2mL 내지 약 500mL인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 진탕 튜브의 부피는 약 10 mL 내지 약 250 mL인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 진탕 튜브의 부피는 약 50mL 내지 약 200mL인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진탕 튜브가 원추형 용기인 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 진탕 튜브를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 단계 (i)의 상기 용기는 배양 백인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 25 L인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 5 L인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 분당 약 10 진당 주기 내지 분당 약 25 진당 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유가식 배양이 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 제1 세포 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, SCF, IL-3 및 IL-6을 각각 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  34. 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  36. 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 추가로 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 8 ㎍/mL 내지 약 12 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  38. 제2항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  43. 제2항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 지질을 포함하는 것인 방법.
  44. 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 50μg/mL 내지 약 400μg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 150㎍/mL 내지 약 250㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 160 ㎍/mL 내지 약 240 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 배양 배지가 약 180 ㎍/mL 내지 약 220 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  48. 제2항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)에서 회분식 또는 유가식 배양을 약 5일 내지 약 12일 동안 수행하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양은 약 5일 내지 약 9일 동안 수행되는 것인 방법.
  50. 제2항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (i)의 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 단계 (i)의 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105세포/mL 내지 약 1.5 x 105세포/mL인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 관류 생물반응기가 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 관류 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 단계 (a)에서 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 단계 (a)의 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양이 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양이 추가 부피의 제2 배양 배지를 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 제2 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 제2 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3종 이상을 포함하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린을 각각 포함하는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함하는 것인 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 25 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  86. 제83항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  87. 제83항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 지질을 포함하는 것인 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양이 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행되는 것인 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 단계 (a)에서 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL인 방법.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 관류 생물반응기가 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 단계 (c)에서 관류 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 단계 (c)에서 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 단계 (c)의 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 단계 (d)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양이 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양이
    (i) 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  103. 제102항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가하고/하거나
    (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 방법.
  104. 제102항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가하고/하거나
    (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 방법.
  105. 제102항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, (i)에서의 제1 기간이 약 1일 내지 약 7일인 방법.
  106. 제105항에 있어서, (i)의 제1 기간이 약 3일 내지 약 5일인 방법.
  107. 제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 1일 내지 약 10일인 방법.
  108. 제107항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 3일 내지 약 7일인 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  111. 제110항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 100㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  116. 제114항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  118. 제117항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  120. 제1항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  123. 제122항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  125. 제123항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  128. 제102항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  131. 제102항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  132. 제131항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  133. 제102항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  134. 제133항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  135. 제134항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  136. 제102항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  137. 제136항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1㎍/mL 내지 약 20㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  138. 제102항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  139. 제138항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  140. 제139항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3 mM 내지 약 5 mM L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  141. 제139항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  142. 제102항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  143. 제142항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양이 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는 것인 방법.
  145. 제144항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행되는 것인 방법.
  146. 제1항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도가 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  147. 제146항에 있어서, 단계 (c)에서 초기 세포 밀도가 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  148. 제1항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (d)에서의 관류 배양은 접선 여과의 사용을 포함하는 것인 방법.
  149. 제148항에 있어서, 접선 여과가 교대 접선 여과(ATF)인 방법.
  150. 제148항 또는 제149항에 있어서, 접선 여과가 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함하는 것인 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 필터는 평균 기공 크기가 0.1 ㎛ 내지 3.0 ㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제1항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 5 x 106탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  153. 제152항에 있어서, 단계 (d)가 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 방법.
  154. 제153항에 있어서, 단계 (d)가 약 5 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  155. (a) 적혈구계 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 mL;
    (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 배양하는 회분식 또는 유가식;
    (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계;
    (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 관류 배양하는 단계,
    여기서 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 제핵 적혈구계 세포의 집단을 포함하는 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법.
  156. 제155항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에:
    (i) 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 제공하기 위해 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구계 전구 세포를 배치하는 단계; 그리고
    (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 배치 또는 유가 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  157. 제156항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 진탕 플라스크인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 15 mL 내지 약 5 L인 방법.
  159. 제158항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 50 mL 내지 약 1.5 L인 방법.
  160. 제159항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 100 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  161. 제156항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  162. 제161항에 있어서, 단계 (ii)가 진탕 플라스크를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  163. 제156항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 진탕 튜브인 방법.
  164. 제163항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 2 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  165. 제164항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 10 mL 내지 약 250 mL인 방법.
  166. 제165항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 50 mL 내지 약 200 mL인 방법.
  167. 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 진탕 튜브가 원추형 용기인 방법.
  168. 제163항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  169. 제168항에 있어서, 단계 (ii)는 진탕 튜브를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  170. 제156항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 배양 백인 방법.
  171. 제170항에 있어서, 배양 백이 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  172. 제171항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 5 L인 방법.
  173. 제172항에 있어서, 배양 백이 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는 것인 방법.
  174. 제170항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  175. 제174항에 있어서, 단계 (ii)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  176. 제156항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  177. 제156항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  178. 제177항에 있어서, 유가식 배양이 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  179. 제178항에 있어서, 제1 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  180. 제178항에 있어서, 추가 부피의 제1 세포 배양 배지가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  181. 제156항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  182. 제181항에 있어서, 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, SCF, IL-3 및 IL-6을 각각 포함하는 것인 방법.
  183. 제181항 또는 제182항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  184. 제183항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  185. 제156항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  186. 제185항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  187. 제156항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  188. 제156항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  189. 제188항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  190. 제156항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL 인슐린을 추가로 포함하는 것인 방법.
  191. 제190항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 8 ㎍/mL 내지 약 12 ㎍/mL의 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  192. 제156항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  193. 제192항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  194. 제192항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  195. 제192항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  196. 제192항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  197. 제156항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 지질을 포함하는 것인 방법.
  198. 제156항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50 μg/mL 내지 약 400 μg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  199. 제198항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 150 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  200. 제199항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 160 ㎍/mL 내지 약 240 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  201. 제200항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 180 ㎍/mL 내지 약 220 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  202. 제156항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 회분식 또는 유가식 배양을 약 5일 내지 약 12일 동안 수행하는 것인 방법.
  203. 제202항에 있어서, 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양을 약 5일 내지 약 9일 동안 수행하는 것인 방법.
  204. 제156항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  205. 제204항에 있어서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL인 방법.
  206. 제155항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 용기가 진탕 플라스크인 방법.
  207. 제206항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 15 mL 내지 약 3 L인 방법.
  208. 제207항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 50 mL 내지 약 1.5 L인 방법.
  209. 제208항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 100 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  210. 제155항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  211. 제210항에 있어서, 단계 (b)가 진탕 플라스크를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  212. 제155항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 용기가 진탕관인 방법.
  213. 제212항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 2 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  214. 제213항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 10 mL 내지 약 250 mL인 방법.
  215. 제214항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 50 mL 내지 약 200 mL인 방법.
  216. 제212항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 진탕 튜브가 원추형 용기인 방법.
  217. 제212항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  218. 제217항에 있어서, 단계 (b)는 진탕 튜브를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  219. 제155항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 용기가 배양 백인 방법.
  220. 제219항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 25 L인 방법.
  221. 제220항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 5 L인 방법.
  222. 제221항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  223. 제219항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 분당 약 10 록 사이클 내지 분당 약 50 록 사이클의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  224. 제223항에 있어서, 단계 (b)는 분당 약 10 록 사이클 내지 분당 약 25 록 사이클의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  225. 제155항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 용기가 생물반응기인 방법.
  226. 제225항에 있어서, 생물반응기가 1L 내지 약 15,000L의 부피를 갖는 것인 방법.
  227. 제226항에 있어서, 단계 (a)의 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  228. 제227항에 있어서, 단계 (a)의 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  229. 제228항에 있어서, 단계 (a)의 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  230. 제225항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  231. 제230항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  232. 제155항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 제2 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  233. 제155항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  234. 제155항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 제2 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  235. 제234항에 있어서, 제2 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  236. 제235항에 있어서, 제2 세포 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  237. 제155항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  238. 제237항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3종 이상을 포함하는 것인 방법.
  239. 제238항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린을 각각 포함하는 것인 방법.
  240. 제155항 내지 제239항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1μg/mL 트랜스페린 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  241. 제240항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  242. 제155항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  243. 제242항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  244. 제243항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  245. 제155항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  246. 제245항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  247. 제246항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함하는 것인 방법.
  248. 제155항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  249. 제248항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  250. 제248항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  251. 제155항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  252. 제251항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  253. 제252항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  254. 제155항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  255. 제254항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  256. 제155항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  257. 제256항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  258. 제256항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  259. 제256항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  260. 제256항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  261. 제155항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 지질을 포함하는 것인 방법.
  262. 제155항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 회분식 또는 유가식 배양이 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는 것인 방법.
  263. 제262항에 있어서, 단계 (b)의 회분식 또는 유가식 배양이 약 5일 내지 약 8일 동안 수행되는 것인 방법.
  264. 제155항 내지 제263항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  265. 제264항에 있어서, 단계 (a)에서 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL인 방법.
  266. 제155항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 관류 생물반응기가 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  267. 제266항에 있어서, 단계 (c)의 관류 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  268. 제267항에 있어서, 단계 (c)의 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  269. 제268항에 있어서, 단계 (c)의 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  270. 제155항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.

  271. 제270항에 있어서, 단계 (d)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제3 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  272. 제155항 내지 제271항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양이 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  273. 제272항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  274. 제273항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  275. 제155항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양이
    (i) 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  276. 제275항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가하고; 및/또는
    (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 방법.
  277. 제275항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가하고; 및/또는
    (ii)에서 제4 배양 배지의 추가 부피는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  278. 제275항 내지 제277항 중 어느 한 항에 있어서, (i)의 제1 기간이 약 1일 내지 약 7일인 방법.
  279. 제278항에 있어서, (i)의 제1 기간이 약 3일 내지 약 5일인 방법.
  280. 제275항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 1일 내지 약 10일인 방법.
  281. 제280항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 3일 내지 약 7일인 방법.
  282. 제155항 내지 제281항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  283. 제282항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  284. 제283항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  285. 제155항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 μg/mL 트랜스페린 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  286. 제285항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 100㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  287. 제155항 내지 제286항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  288. 제287항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  289. 제288항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함하는 것인 방법.
  290. 제155항 내지 제289항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  291. 제290항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  292. 제291항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  293. 제155항 내지 제292항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  294. 제293항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  295. 제155항 내지 제294항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  296. 제295항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민 또는 L-알라닐-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  297. 제296항에 있어서, 제3 배양 배지는 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  298. 제296항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  299. 제155항 내지 제298항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  300. 제299항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  301. 제275항 내지 제300항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  302. 제301항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  303. 제302항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  304. 제275항 내지 제303항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  305. 제304항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  306. 제275항 내지 제305항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  307. 제306항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  308. 제307항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1 ng/mL 내지 약 100 mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  309. 제275항 내지 제308항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  310. 제309항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  311. 제275항 내지 제310항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  312. 제311항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3 mM 내지 약 5 mM L-글루타민 또는 L-글리실-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  313. 제312항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  314. 제312항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  315. 제275항 내지 제314항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  316. 제315항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  317. 제155항 내지 제316항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양이 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는 것인 방법.
  318. 제317항에 있어서, 단계 (d)의 관류 배양은 약 9일 내지 약 13일 동안 수행되는 것인 방법.
  319. 제155항 내지 제318항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도가 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  320. 제319항에 있어서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도가 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  321. 제155항 내지 제320항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 관류 배양이 접선 여과의 사용을 포함하는 것인 방법.
  322. 제321항에 있어서, 접선 여과가 교대 접선 여과(ATF)인 방법.
  323. 제321항 또는 제322항에 있어서, 접선 여과가 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함하는 것인 방법.
  324. 제323항에 있어서, 상기 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 것인 방법.
  325. 제155항 내지 제324항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 5 x 106탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  326. 제325항에 있어서, 단계 (d)는 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  327. 제326항에 있어서, 단계 (d)는 약 5 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  328. (a) 적혈구 전구 세포의 제1 세포 배양물의 부피를 관류 생물반응기에 포함된 제2 배양 배지에 배치하여 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 1 x 107개 세포의 초기 세포 밀도를 갖는 제2 세포 배양물을 제공하는 단계 /mL;
    (b) 약 2일 내지 약 15일 동안 제2 세포 배양물을 관류 배양하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 제2 세포 배양물의 부피를 용기 내에 포함된 제3 배양 배지에 배치하여 약 1 x 105 내지 약 1 x 107 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제3 세포 배양물을 제공하는 단계;
    (d) 단계 (c)의 제3 세포 배양물을 약 5일 내지 20일 동안 회분식 또는 유가식으로 배양하는 단계,
    여기서 단계 (d) 후에 제3 배양 배지는 제핵 적혈구계 세포의 집단을 포함하는 탈핵 적혈구의 집단을 생성하는 방법.
  329. 제328항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전에:
    (i) 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 106개 세포/mL의 초기 세포 밀도를 갖는 제1 세포 배양물을 제공하기 위해 용기 내에 포함된 제1 배양 배지에 복수의 적혈구계 전구 세포를 배치하는 단계; 및
    (ii) 제1 세포 배양물을 약 1일 내지 약 15일 동안 배치 또는 유가 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  330. 제329항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 진탕 플라스크인 방법.
  331. 제330항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 15 mL 내지 약 3 L인 방법.
  332. 제331항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 50 mL 내지 약 1.5 L인 방법.
  333. 제332항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 100 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  334. 제329항 내지 제333항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  335. 제334항에 있어서, 단계 (ii)가 진탕 플라스크를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  336. 제329항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 진탕 튜브인 방법.
  337. 제336항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 2 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  338. 제337항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 10 mL 내지 약 250 mL인 방법.
  339. 제338항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 50 mL 내지 약 200 mL인 방법.
  340. 제336항 내지 제339항 중 어느 한 항에 있어서, 진탕 튜브가 원추형 용기인 방법.
  341. 제336항 내지 제340항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  342. 제341항에 있어서, 단계 (ii)가 진탕 튜브를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  343. 제329항에 있어서, 단계 (i)의 용기가 배양 백인 방법.
  344. 제343항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 25 L인 방법.
  345. 제344항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 5 L인 방법.
  346. 제345항에 있어서, 배양 백이 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는 것인 방법.
  347. 제343항 내지 제346항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  348. 제347항에 있어서, 단계 (ii)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  349. 제329항 내지 제348항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  350. 제329항 내지 제348항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 제1 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  351. 제350항에 있어서, 유가식 배양이 추가 부피의 제1 배양 배지를 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  352. 제351항에 있어서, 제1 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  353. 제351항에 있어서, 제1 세포 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제1 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  354. 제329항 내지 제353항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), IL-3, 및 IL-6 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  355. 제354항에 있어서, 제1 배양 배지가 Flt-3 리간드, SCF, IL-3 및 IL-6을 각각 포함하는 것인 방법.
  356. 제354항 또는 제355항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  357. 제356항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 150ng/mL Flt-3 리간드를 포함하는 것인 방법.
  358. 제329항 내지 제357항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  359. 제358항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  360. 제329항 내지 제359항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  361. 제329항 내지 제360항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  362. 제361항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-6을 포함하는 것인 방법.
  363. 제329항 내지 제362항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 추가로 포함하는 것인 방법.
  364. 제363항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 8 ㎍/mL 내지 약 12 ㎍/mL의 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  365. 제329항 내지 제364항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  366. 제365항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  367. 제365항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  368. 제365항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  369. 제365항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  370. 제329항 내지 제369항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 지질인 방법.
  371. 제329항 내지 제370항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 50 ㎍/mL 내지 약 400 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  372. 제371항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 150 ㎍/mL 내지 약 250 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  373. 제372항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 160 ㎍/mL 내지 약 240 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  374. 제373항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 180 ㎍/mL 내지 약 220 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  375. 제329항 내지 제374항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서의 회분식 또는 유가식 배양이 약 5일 내지 약 12일 동안 수행되는 것인 방법.
  376. 제375항에 있어서, 단계 (ii)의 회분식 또는 유가식 배양을 약 5일 내지 약 9일 동안 수행하는 것인 방법.
  377. 제329항 내지 제376항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)의 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  378. 제377항에 있어서, 단계 (i)에서의 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL인 방법.
  379. 제328항 내지 제378항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 관류 생물반응기가 약 500 mL 내지 약 15,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  380. 제379항에 있어서, 단계 (a)의 관류 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  381. 제380항에 있어서, 단계 (a)에서 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  382. 제381항에 있어서, 단계 (a)의 관류 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  383. 제328항 내지 제382항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  384. 제383항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  385. 제328항 내지 제384항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양이 약 0.5 nL/세포/일 내지 약 40 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  386. 제385항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5 nL/세포/일 내지 약 35 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  387. 제386항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양은 약 10 nL/세포/일 내지 약 25 nL/세포/일의 관류 속도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  388. 제328항 내지 제387항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양이 추가 부피의 제2 배양 배지를 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  389. 제388항에 있어서, 제2 배양 배지의 추가 부피가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  390. 제388항에 있어서, 추가 부피의 제2 배양 배지가 시간 경과에 따라 제2 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  391. 제328항 내지 제390항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, 에리트로포이에틴(EPO), 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  392. 제391항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린 중 3종 이상을 포함하는 것인 방법.
  393. 제392항에 있어서, 제2 배양 배지가 트랜스페린, IL-3, SCF, 덱사메타손, EPO 및 인슐린을 각각 포함하는 것인 방법.
  394. 제328항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1㎍/mL 트랜스페린 내지 약 500㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  395. 제394항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 100㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  396. 제328항 내지 제395항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 200ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  397. 제396항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 100ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  398. 제397항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1ng/mL 내지 약 10ng/mL IL-3을 포함하는 것인 방법.
  399. 제328항 내지 제398항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1μg/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  400. 제399항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  401. 제400항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함하는 것인 방법.
  402. 제328항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 200 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  403. 제402항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  404. 제403항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 nM 내지 약 25 nM 덱사메타손을 포함하는 것인 방법.
  405. 제328항 내지 제404항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  406. 제405항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1 ng/mL 내지 약 200 ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  407. 제406항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  408. 제328항 내지 제407항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  409. 제408항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 0.1μg/mL 내지 약 20μg/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  410. 제328항 내지 제409항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 1mM 내지 약 10mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  411. 제410항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  412. 제410항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  413. 제410항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5 mM 내지 약 7 mM L-글리실-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  414. 제410항에 있어서, 제2 배양 배지가 약 5mM 내지 약 7mM의 N-아세틸-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  415. 제328항 내지 제414항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가 지질을 포함하는 것인 방법.
  416. 제328항 내지 제415항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양이 약 4일 내지 약 10일 동안 수행되는 것인 방법.
  417. 제416항에 있어서, 단계 (b)의 관류 배양은 약 5일 내지 약 8일 동안 수행되는 것인 방법.
  418. 제328항 내지 제417항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 초기 세포 밀도가 약 0.1 x 105개 세포/mL 내지 약 2 x 105개 세포/mL인 방법.
  419. 제418항에 있어서, 단계 (a)에서 초기 세포 밀도가 약 0.5 x 105개 세포/mL 내지 약 1.5 x 105개 세포/mL인 방법.
  420. 제328항 내지 제419항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 용기가 진탕 플라스크인 방법.
  421. 제420항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 15 mL 내지 약 3 L인 방법.
  422. 제421항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 50 mL 내지 약 1.5 L인 방법.
  423. 제422항에 있어서, 진탕 플라스크의 부피가 약 100 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  424. 제328항 내지 제423항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 진탕 플라스크를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  425. 제424항에 있어서, 단계 (d)가 진탕 플라스크를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  426. 제328항 내지 제419항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 용기가 진탕 튜브인 방법.
  427. 제426항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 2 mL 내지 약 500 mL인 방법.
  428. 제427항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 10 mL 내지 약 250 mL인 방법.
  429. 제428항에 있어서, 진탕 튜브의 부피가 약 50 mL 내지 약 200 mL인 방법.
  430. 제426항 내지 제429항 중 어느 한 항에 있어서, 진탕 튜브가 원추형 용기인 방법.
  431. 제426항 내지 제430항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 진탕 튜브를 약 0.1 x g 내지 약 4.1 x g에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  432. 제431항에 있어서, 단계 (d)가 진탕 튜브를 약 0.23 x g 내지 약 1.78 x g에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
  433. 제328항 내지 제419항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 용기가 배양 백인 방법.
  434. 제433항에 있어서, 배양 백이 약 50 mL 내지 약 25 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  435. 제434항에 있어서, 배양 백의 부피가 약 50 mL 내지 약 5 L인 방법.
  436. 제435항에 있어서, 배양 백이 약 50 mL 내지 약 500 mL의 부피를 갖는 것인 방법.
  437. 제433항 내지 제436항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 50 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  438. 제437항에 있어서, 단계 (d)가 분당 약 10 진동 주기 내지 분당 약 25 진동 주기의 요동 속도로 배양 백을 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  439. 제328항 내지 제419항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 용기가 생물반응기인 방법.
  440. 제439항에 있어서, 생물반응기가 1L 내지 약 15,000L의 부피를 갖는 것인 방법.
  441. 제440항에 있어서, 생물반응기가 5 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  442. 제441항에 있어서, 생물반응기가 약 5 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  443. 제442항에 있어서, 생물반응기가 약 5 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는 것인 방법.
  444. 제439항 내지 제443항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 200 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  445. 제444항에 있어서, 단계 (b)가 약 10 W/m3내지 약 100 W/m3의 P/V 값으로 제2 세포 배양물을 교반하는 것을 포함하는 것인 방법.
  446. 제328항 내지 제445항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 제3 세포 배양물을 배치 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  447. 제328항 내지 제445항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 제3 세포 배양물을 유가 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  448. 제447항에 있어서, 유가식 배양이 추가 부피의 제3 배양 배지를 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  449. 제448항에 있어서, 추가 부피의 제3 배양 배지가 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가되는 것인 방법.
  450. 제448항에 있어서, 추가 부피의 제3 세포 배양 배지가 시간 경과에 따라 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 것인 방법.
  451. 제328항 내지 제450항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 회분식 및 유가식 배양이
    (i) 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계, 및
    (ii) 제4 배양 배지의 추가 부피를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  452. 제451항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가하고; 및/또는
    (ii)에서 추가 부피의 제4 배양 배지를 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 연속적으로 첨가하는 방법.
  453. 제451항에 있어서,
    (i)에서 추가 부피의 제3 배양 배지를 제1 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가하고; 및/또는
    (ii)에서 추가 부피의 제4 배양 배지는 제2 기간 동안 제3 세포 배양물에 주기적으로 첨가되는 방법.
  454. 제451항 내지 제453항 중 어느 한 항에 있어서, (i)에서의 제1 기간이 약 1일 내지 약 7일인 방법.
  455. 제454항에 있어서, (i)에서의 제1 기간이 약 3일 내지 약 5일인 방법.
  456. 제451항 내지 제455항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 1일 내지 약 10일인 방법.
  457. 제456항에 있어서, (ii)의 제2 기간이 약 3일 내지 약 7일인 방법.
  458. 제328항 내지 제457항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  459. 제458항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  460. 제459항에 있어서, 제3 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린, SCF 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  461. 제328항 내지 제460항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 μg/mL 트랜스페린 내지 약 500 μg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  462. 제461항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 300 ㎍/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  463. 제328항 내지 제462항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 1㎍/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  464. 제463항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL SCF를 포함하는 것인 방법.
  465. 제464항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 10ng/mL 내지 약 200ng/nL SCF를 포함하는 것인 방법.
  466. 제328항 내지 제465항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  467. 제466항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  468. 제467항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  469. 제328항 내지 제468항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1㎍/mL 내지 약 50㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  470. 제469항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  471. 제328항 내지 제470항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 1 mM 내지 약 8 mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  472. 제471항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  473. 제472항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  474. 제472항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  475. 제328항 내지 제474항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  476. 제475항에 있어서, 제3 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  477. 제451항 내지 제476항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  478. 제477항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO 중 둘 이상을 포함하는 것인 방법.
  479. 제478항에 있어서, 제4 배양 배지가 트랜스페린, 인슐린 및 EPO를 각각 포함하는 것인 방법.
  480. 제451항 내지 제479항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 2 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  481. 제480항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 100 ㎍/mL 트랜스페린 내지 약 1.5 mg/mL 트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
  482. 제451항 내지 제481항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 500ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  483. 제482항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 200ng/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  484. 제483항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1ng/mL 내지 약 100mg/mL EPO를 포함하는 것인 방법.
  485. 제451항 내지 제484항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  486. 제485항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  487. 제451항 내지 제486항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 1mM 내지 약 8mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L -글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  488. 제487항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, L-글리실-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  489. 제488항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  490. 제488항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 3mM 내지 약 5mM의 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  491. 제451항 내지 제490항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 0.5% v/v 내지 약 10% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  492. 제491항에 있어서, 제4 배양 배지가 약 4% v/v 내지 약 6% v/v 혈청을 포함하는 것인 방법.
  493. 제328항 내지 제492항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 회분식 또는 유가식 배양이 약 8일 내지 약 15일 동안 수행되는 것인 방법.
  494. 제493항에 있어서, 단계 (d)의 회분식 또는 유가식 배양을 약 9일 내지 약 13일 동안 수행하는 것인 방법.
  495. 제328항 내지 제494항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도가 약 2.0 x 105개 세포/mL 내지 약 8.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  496. 제495항에 있어서, 단계 (c)의 초기 세포 밀도가 약 4.0 x 105개 세포/mL 내지 약 6.0 x 105개 세포/mL인 방법.
  497. 제328항 내지 제496항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 관류 배양이 접선 여과의 사용을 포함하는 것인 방법.
  498. 제497항에 있어서, 접선 여과가 교대 접선 여과(ATF)인 방법.
  499. 제497항 또는 제498항에 있어서, 접선 여과가 약 10 nm 내지 약 6.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 포함하는 것인 방법.
  500. 제499항에 있어서, 상기 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3.0 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 것인 방법.
  501. 제328항 내지 제500항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 약 5 x 106탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 것인 방법.
  502. 제501항에 있어서, 단계 (d)가 약 1 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 방법.
  503. 제502항에 있어서, 단계 (d)가 약 5 x 107 탈핵 적혈구/mL 내지 약 2 x 108 탈핵 적혈구/mL의 세포 밀도를 생성하는 방법.
  504. 제1항 내지 제503항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구 전구 세포가 인간 적혈구 전구 세포인 방법.
  505. 제504항에 있어서, 적혈구 전구 세포가 O 음성 인간 공여자로부터 수득되는 것인 방법.
  506. 제505항에 있어서, 적혈구계 전구 세포가 O 음성 및 Kell 음성 인간 공여자로부터 수득되는 것인 방법.
  507. 제1항 내지 제506항 중 어느 한 항에 있어서, 탈핵 적혈구의 집단이 탈핵 인간 적혈구의 집단인 방법.
  508. 제1항 내지 제507항 중 어느 한 항에 있어서,
    (e) 단계 (d)에서 제3 세포 배양물로부터 탈핵 적혈구의 집단을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  509. (f) 단계 (e)에서 분리된 탈핵 적혈구의 집단을 공식화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  510. 제509항에 있어서, 상기 방법은:
    (g) 단계 (f)에서 제제화된 탈핵 적혈구 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  511. 제1항 내지 제506항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 단계 (a) 전에 핵산을 제1 세포 배양물에서 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 방법은 조작된 탈핵 적혈구 집단의 생산을 초래하는 것인 방법.
  512. 제511항에 있어서, 조작된 탈핵 적혈구의 집단이 조작된 탈핵 인간 적혈구인 방법.
  513. 제511항 또는 제512항에 있어서, 핵산이 하나 이상의 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  514. 제511항 내지 제513항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 인간 탈핵 적혈구가 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는 것인 방법.
  515. 제514항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질을 세포에 클릭-접합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  516. 제514항에 있어서, 세포를 저장성 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  517. 제514항에 있어서, 물리적 조작을 통해 셀을 로딩하는 단계를 더 포함하는 방법.
  518. 제514항 내지 제517항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하는 것인 방법.
  519. 제514항 내지 제518항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 단백질인 방법.
  520. 제514항 내지 제517항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나가 페닐알라닌 암모니아 리아제이고, 여기서 페닐알라닌 암모니아 리아제가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하는 것인 방법.
  521. 제514항 내지 제517항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)이 면역조절 분자를 포함하는 것인 방법.
  522. 제514항 내지 제517항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들)이 항원 제시 분자를 포함하는 것인 방법.
  523. 제511항 내지 제522항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이:
    (e) 단계 (d)에서 제3 세포 배양물로부터 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  524. 제523항에 있어서, 상기 방법은:
    (f) 단계 (e)에서 단리된 조작된 탈핵 적혈구의 집단을 공식화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  525. 제524항에 있어서, 상기 방법은:
    (g) 단계 (f)에서 조작된 탈핵 적혈구의 제형화된 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  526. 제1항 내지 제508항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 탈핵 적혈구의 집단.
  527. 제509항의 방법에 의해 생성된 제형.
  528. 제511항 내지 제523항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 탈핵 적혈구의 집단.
  529. 제524항의 방법에 의해 생성된 제형.


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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014183066A2 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
US10471099B2 (en) * 2013-05-10 2019-11-12 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs
WO2015073746A2 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Whitehead Institute For Biomedical Research 18f labeling of proteins using sortases
EP3583202A1 (en) * 2017-02-17 2019-12-25 Rubius Therapeutics, Inc. Functionalized erythroid cells
FR3114323A1 (fr) * 2020-09-23 2022-03-25 Erypharm Procédé de production de globules rouges de culture
TW202241470A (zh) 2021-01-08 2022-11-01 美商盧比亞斯治療公司 治療人類個體腫瘤之方法
TW202241471A (zh) 2021-01-08 2022-11-01 美商盧比亞斯治療公司 提高個體中NKp30陽性淋巴球的方法及其用途
TW202304482A (zh) 2021-03-14 2023-02-01 美商盧比亞斯治療公司 於個體中增加nkg2d陽性淋巴球之方法及其用途
FR3120876A1 (fr) * 2021-03-19 2022-09-23 Erypharm Procédé de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique
TW202317179A (zh) 2021-06-03 2023-05-01 美商盧比亞斯治療公司 在個體中治療ｈｐｖ１６－陽性或ｈｐｖ１６－相關的癌症之方法
FR3126713A1 (fr) * 2021-09-08 2023-03-10 Erypharm Procédé de production de cellules de culture à haute densité
FR3136483A1 (fr) * 2022-06-09 2023-12-15 Erypharm Procede de culture de cellules necessitant un apport en fer

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4327710A (en) 1980-06-18 1982-05-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Process for encapsulating additives in resealed erythrocytes for disseminating chemicals via the circulatory system
EP0517986B1 (en) 1991-06-14 1997-09-10 Communaute Economique Europeenne (Cee) Transformed erythrocytes, process for preparing the same, and their use in pharmaceutical compositions
EP0882448B1 (en) 1997-05-05 2005-01-12 DIDECO S.r.l. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus therefor
US6495351B2 (en) 2000-02-08 2002-12-17 Gendel Limited Loading system and method for using the same
US6455306B1 (en) * 2000-06-09 2002-09-24 Transcyte, Inc. Transfusable oxygenating composition
CN101045914A (zh) * 2006-03-29 2007-10-03 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 体外诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法与应用
US10471099B2 (en) 2013-05-10 2019-11-12 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs
WO2014183066A2 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
WO2015073587A2 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
FR3017299B1 (fr) 2014-02-12 2018-05-18 Erytech Pharma Composition pharmaceutique comprenant des erythrocytes encapsulant une enzyme a plp et son cofacteur
TW202246486A (zh) * 2014-06-09 2022-12-01 美商健臻公司 種子罐培養法(seed train processes)及其用途
US20180135012A1 (en) * 2015-05-13 2018-05-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
US20190160102A1 (en) * 2017-11-03 2019-05-30 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems for tumor growth inhibition

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