KR20220005028A - 탈핵 적혈구를 포함하는 조성물 - Google Patents

탈핵 적혈구를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220005028A
KR20220005028A KR1020217037876A KR20217037876A KR20220005028A KR 20220005028 A KR20220005028 A KR 20220005028A KR 1020217037876 A KR1020217037876 A KR 1020217037876A KR 20217037876 A KR20217037876 A KR 20217037876A KR 20220005028 A KR20220005028 A KR 20220005028A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
days
pharmaceutically acceptable
composition
acceptable aqueous
buffered solution
Prior art date
Application number
KR1020217037876A
Other languages
English (en)
Inventor
호 키 키스 웡
지에 리
Original Assignee
루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. filed Critical 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Publication of KR20220005028A publication Critical patent/KR20220005028A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate

Abstract

탈핵 적혈구를 포함하는 조성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.

Description

탈핵 적혈구를 포함하는 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/839,506에 대한 우선권을 주장한다. 전체 내용이 여기에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 탈핵 적혈구(enucleated erythroid cell)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
적혈구는 혈액 손실을 경험한 환자에게 수혈된다. 또한, 적혈구를 포함하는 조작된 탈핵 적혈구는 이를 필요로 하는 환자에게 외인성 단백질(들)을 운반하거나 제공하는 치료제로서 개발 중에 있다.
요약
본 발명은 (a) 탈핵 적혈구의 집단(population) 및 (b) 약 6.5 내지 약 8.5의 pH 및 약 150 mOsm/L 내지 약 150 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 약학적으로 허용가능한 완충 수용액을 포함하는 조성물의 발견에 기초한다. 약 5mM 내지 약 80mM의 완충액, 약 5mM 내지 약 35mM 인산 이온, 약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온, 약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온, 약 0.01mM을 포함하는 400mOsm/L 약 10mM 내지 약 10mM 칼슘 이온, 약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온, 및 약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함하고, 0.1mM 미만의 글루코스를 포함하고, 임의로, 하나 이상을 포함하지 않는 수크로스, 콜로이드, 및 항산화제의 조합은 탈핵 적혈구를 포함하는 다른 조성물과 비교하여 개선된 안정성(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 온도에서 인큐베이션 후 용혈 감소 및/또는 증가된 세포 수)을 갖는다. 이러한 발견의 관점에서, (a) 탈핵 적혈구의 집단; 및 (b) 약 6.5 내지 약 8.5의 pH 및 약 150 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 약학적으로 허용가능한 완충 수용액: 약 5 mM 내지 약 80 mM의 완충액; 약 5mM 내지 약 35mM 인산 이온; 약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온; 약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온; 및 약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함하며, 여기서: 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.1mM 미만의 글루코스를 포함하고; 선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 또한, 이들 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트, 이들 조성물 중 임의의 것을 제조하는 방법, 및 임의의 이들 조성물을 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, (a) 탈핵 적혈구의 집단; 및 (b) 약 5mM 내지 약 80mM의 완충액; 약 5mM 내지 약 35mM 인산 이온; 약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온; 약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온; 및 약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함하며, 여기서: 약학적으로 허용 가능한 완충 수용액은 5mM 미만의 글루코스를 포함하고; 선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 완충액을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20 mM 내지 약 30 mM의 완충액을 포함한다. 일부 실시예에서, 완충액은 Good's 버퍼이다. 일부 실시예에서, Good's 버퍼는 HEPES, MOPS, TES, MES, ADA, ACES, BES, Bicine, CAPS, CAPSO, CHES, PIPES, TAPS 및 Tris로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서 Good's 버퍼는 HEPES이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 25 mM 인산 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 인산 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 인산 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 인산일나트륨 및/또는 인산이나트륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 50mM 내지 약 140mM의 나트륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 70mM 내지 약 120mM의 나트륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 나트륨 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화나트륨, 인산일나트륨 및/또는 인산이나트륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 칼륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 30mM 내지 약 50mM의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 칼륨 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화칼륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 칼슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM 칼슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 칼슘 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화칼슘으로 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 마그네슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3mM 내지 약 7mM의 마그네슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 마그네슘 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화마그네슘으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20mM 내지 약 120mM의 음이온성 세포 불침투제를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 75mM 내지 약 120mM의 음이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 90mM 내지 약 110mM의 음이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 음이온성 세포 불침투제는 락토비오네이트, 시트레이트 및 글루코네이트의 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 음이온성 세포 불침투제는 락토비오네이트이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 30mM 내지 약 50mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 비이온성 세포 불침투제는 만니톨, 라피노스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 비이온성 세포 불침투제는 만니톨이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 1 mM 내지 약 20 mM 클로라이드 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 핵염기, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 뉴클레오시드, 및 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데닌, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신 모노포스페이트, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신 디포스페이트, 및 약 0.01mM 내지 약 5mM 아데노신 트리포스페이트 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3 mM 내지 약 10 mM 중탄산염 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3 mM 내지 약 7 mM 중탄산염 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 바이오카르보네이트 이온은 중탄산나트륨으로서 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 피루베이트를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 폴록사머를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 폴록사머는 폴록사머-188이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 1.0% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 인간 혈청 알부민을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 7.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 pH가 약 7.2 내지 약 7.6이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 250 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 300 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.01 mM 미만의 글루코스를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.001 mM 미만의 글루코스를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 글루코스를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 1.0 x 109 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 2.0 x 109내지 약 4.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 4.0 x 109내지 약 6.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 공여자 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 조작된 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 클릭-접합 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 저장성 로딩되었다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 물리적 조작에 의해 로딩되었다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 단백질이다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 페닐알라닌 암모니아 리아제이고, 여기서 페닐알라닌 암모니아 리아제(phenylalanine ammonia lyase, PAL)는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다. 일부 실시예에서, 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물의 저장은 10% 미만의 용혈을 초래한다. 일부 실시예에서, 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물의 저장은 8% 미만의 용혈을 초래한다. 일부 실시예에서, 조성물을 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 저장하면 세포 밀도가 10% 미만으로 감소한다. 일부 실시예에서, 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물의 저장은 8% 미만의 용혈을 초래한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 항산화제를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 콜로이드를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 콜로이드는 덱스트란이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 항산화제를 포함하지 않고 콜로이드를 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음을 포함한다:
(i) 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관된 임의의 상기 실시예의 조성물을 제공하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계.
일부 실시예에서, 페닐케톤뇨증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 그 다음 방법은 (i) 하나 이상의 외인성 단백질(들)이 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)이고, 여기서 페닐알라닌 암모니아 분해효소는 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 일정 기간 동안 저장된 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하며; 그리고 (ii) 단계 (i)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 방법은 단계 (i)와 단계 (ii) 사이에 단계 (i)의 조성물을 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 4℃ 내지 약 6℃의 온도에서 저장되었다. 일부 실시예에서, 기간은 약 30일 내지 약 100일이다. 일부 실시예에서, 기간은 약 35일 내지 약 60일이다. 일부 실시예에서, 기간은 약 45일 내지 약 60일이다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온된다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 23℃ 내지 약 27℃의 온도로 가온된다. 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 10% 미만의 용혈이 발생한다. 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 8% 미만의 용혈이 발생한다. 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 세포 밀도의 10% 미만 감소가 발생한다. 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 세포 밀도의 8% 미만 감소가 발생한다. 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 대상체에 대한 정맥내 투여를 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 상기 실시예 중 임의의 것의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 미리 저장되었다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 4℃ 내지 약 6℃의 온도에서 미리 저장되었다. 일부 실시예에서, 기간은 약 30일 내지 약 100일이다. 일부 실시예에서, 기간은 약 35일 내지 약 60일이다. 일부 실시예에서, 기간은 약 45일 내지 약 60일이다. 일부 실시예에서, 방법은 투여 단계 전에 조성물을 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온된다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 23℃ 내지 약 27℃의 온도로 가온된다. 일부 실시예에서, 투여 전에 조성물을 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관하였고, 일정 기간 동안 약 2°C 내지 약 10°C의 온도에서 저장 전 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관 후 10% 미만의 용혈이 일어난다. 일부 실시예에서, 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관하기 전의 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관 후 8% 미만의 용혈이 발생한다. 일부 실시예에서, 투여 전에 조성물을 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관하였고, 여기서 세포 밀도의 10% 미만 감소는 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장한 후 발생한다. 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 저장한 후 세포 밀도의 8% 미만 감소가 발생한다. 일부 실시예에서, 투여 단계는 대상체에 대한 정맥내 투여를 포함한다.
또 다른 측면에서, 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 탈핵 적혈구의 집단을 제공하는 단계; 및 (ii) 약 5mM 내지 약 80mM의 완충기; 약 5mM 내지 약 35mM 인산 이온; 약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온; 약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온; 및 약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함하고, 여기서: 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 5mM 미만의 글루코스를 포함하고; 선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 10 mM 내지 약 40 mM의 완충액을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20 mM 내지 약 30 mM의 완충액을 포함한다. 일부 실시예에서, 버퍼는 Good's 버퍼이다. 일부 실시예에서, Good's 버퍼는 HEPES, MOPS, TES, MES, ADA, ACES, BES, Bicine, CAPS, CAPSO, CHES, PIPES, TAPS 및 Tris로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서 Good's 버퍼는 HEPES이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 25 mM 인산 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 인산 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 인산 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 인산일나트륨 및/또는 인산이나트륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 50mM 내지 약 140mM의 나트륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 70mM 내지 약 120mM의 *?*나트륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 나트륨 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화나트륨, 인산일나트륨 및/또는 인산이나트륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 10 mM 내지 약 50 mM 칼륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 30mM 내지 약 50mM의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 칼륨 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화칼륨으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 칼슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM 칼슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 칼슘 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화칼슘으로 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 1 mM 내지 약 10 mM 마그네슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3mM 내지 약 7mM의 마그네슘 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 마그네슘 이온은 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 염화마그네슘으로서 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20mM 내지 약 120mM의 음이온성 세포 불침투제를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 75mM 내지 약 120mM의 음이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 90mM 내지 약 110mM의 음이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 음이온성 세포 불침투제는 락토비오네이트, 시트레이트 및 글루코네이트의 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 음이온성 세포 불침투제는 락토비오네이트이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 20mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 30mM 내지 약 50mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함한다. 일부 실시예에서, 비이온성 세포 불침투제는 만니톨, 라피노스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 비이온성 세포 불침투제는 만니톨이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 1 mM 내지 약 20 mM 클로라이드 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 5 mM 내지 약 15 mM 클로라이드 이온을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 핵염기, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 뉴클레오시드, 및 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데닌, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신 모노포스페이트, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 아데노신 디포스페이트, 및 약 0.01mM 내지 약 5mM 아데노신 트리포스페이트 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3 mM 내지 약 10 mM 중탄산염 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 3 mM 내지 약 7 mM 중탄산염 이온을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 바이오카르보네이트 이온은 중탄산나트륨으로서 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 존재한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM 피루베이트를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 폴록사머를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 폴록사머는 폴록사머-188이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 1.0% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 인간 혈청 알부민을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 7.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 pH가 약 7.2 내지 약 7.6이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 250 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 300 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.01 mM 미만의 글루코스를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.001 mM 미만의 글루코스를 포함한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 글루코스를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 1.0 x 109 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 2.0 x 109 내지 약 4.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약 4.0 x 109 내지 약 6.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함한다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 공여자 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 조작된 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 클릭-접합 인간 탈핵 적혈구다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 저장성 로딩되었다. 일부 실시예에서, 조작된 인간 탈핵 적혈구는 물리적 조작에 의해 로딩되었다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 단백질이다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나는 페닐알라닌 암모니아 분해효소이고, 여기서 페닐알라닌 암모니아 분해효소는 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재한다. 일부 실시예에서, 약 2℃내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물의 저장은 10% 미만의 용혈을 초래한다. 일부 실시예에서, 약 2℃내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물의 저장은 8% 미만의 용혈을 초래한다. 일부 실시예에서, 조성물을 약 2℃내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 저장하면 세포 밀도가 8% 미만 감소한다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 항산화제를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 콜로이드를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 콜로이드는 덱스트란이다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 항산화제를 포함하지 않고 콜로이드를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 방법은 탈핵 적혈구의 집단을 제공하기 위해 적혈구계 전구 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 실시예 중 임의의 것에 기재된 방법에 의해 제공되는 조성물이 제공된다.
"비이온성 세포 불침투제"라는 용어는 (i) 생리학적 pH(예: pH 약 7.4)에서 양이온이 없고 음이온이 없고, (ii) 손상되지 않은 물리적 및 화학적으로 변경되지 않은 포유동물 세포의 원형질막, (iii) 수동적 생물물리학적 삼투 효과에 의해 손상되지 않은 물리적 및 화학적으로 변경되지 않은 포유동물 세포로의 물 이동을 방지한다. 비이온성 세포 불침투제의 비제한적 예는 만니톨, 라피노스, 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 글루코네이트, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 1kDa 초과, 5kDa 초과, 10kDa 초과, 15kDa 초과의 분자량을 갖는 예를 들어, PEG 20kDa의 PEG)을 포함한다. 비이온성 세포 불침투제의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
"음이온성 세포 불침투제"라는 용어는 (i) 생리학적 pH(예: pH 약 7.4)에서 하나 이상의 음이온(들)을 갖고, (ii) 손상되지 않은 물리적 및 화학적으로 변경되지 않은 포유동물 세포의 원형질막을 실질적으로 통과하지 않으며, (iii) 수동적 생물물리학적 삼투 효과에 의해 손상되지 않은 물리적 및 화학적으로 변경되지 않은 포유동물 세포로의 물 이동을 방지한다. 음이온성 세포 불침투제의 비제한적인 예는 락토비오네이트, 시트레이트 및 글루코네이트를 포함한다. 음이온성 세포 불침투제의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
용어 "집단(population)"은 주어진 물품(예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 탈핵 적혈구 중 임의의 것) 중 2개 이상을 의미한다.
용어 "조작된 탈핵 적혈구"는 하나 이상(예: 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 외인성 단백질(들)(예: 임의의 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 외인성 단백질의 조합). 예를 들어, 조작된 탈핵 적혈구는 그의 세포질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 그의 원형질막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 (i) 그의 세포질에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(들) 및 (ii) 그의 원형질막에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 가질 수 있다. 조작된 탈핵 적혈구의 비제한적인 예는 클릭-접합 탈핵 적혈구, 저장성 로딩된 탈핵 적혈구, 및 물리적 조작(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 유형의 물리적 조작)에 의해 로딩된 탈핵 적혈구를 포함한다. 조작된 탈핵 적혈구의 추가의 비제한적인 측면이 본 명세서에 기재되어 있다.
"클릭-접합 탈핵 적혈구(click-conjugated enucleated erythroid cell)"라는 용어는 효소(들) 및/또는 펩티드 서열(들)의 촉매 활성 및/또는 화학 반응을 통해 조작된 탈핵 적혈구 원형질막에 존재하는 다른 단백질 (예를 들어 탈 적혈구의 내인성 단백질 또는 다른 외인성 단백질) 에 접합된 하나 이상의 외인성 단백질을 갖는 조작된 탈핵 적혈구를 의미한다.
"저장성 로딩된 탈핵 적혈구(hypotonically-loaded enucleated erythroid cell)"라는 용어는 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포를 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는 낮은 이온 강도 완충액 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 예시적인 낮은 이온 강도 완충액 중 임의의 것)에 노출시켜 적어도 부분적으로 생성된 조작된 탈핵 적혈구를 의미한다. 저장성-로딩된 탈핵 적혈구를 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 저장성-로딩된 탈핵 적혈구를 생성하기 위한 추가 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"물리적 조작에 의해 로딩된 탈핵 적혈구(enucleated erythroid cell loaded by physical manipulation)"라는 용어는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 적혈구 전구 세포 내로 코딩하는 핵산의 도입을 초래하는 방식으로 적혈구 전구 세포를 물리적으로 조작함으로써 적어도 부분적으로 생성된 탈핵 적혈구를 의미한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 물리적 조작의 비제한적 예는 전기천공 및 입자 매개 형질감염을 포함한다. 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 물리적 조작의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
용어 "외인성 단백질(exogenous protein)"은 세포 내로 또는 세포 상에 도입되거나, 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 세포 내로 또는 세포의 전구체 내로 도입함으로써 세포에 의해 발현되게 하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 세포 내로 도입된 외인성 핵산 또는 세포의 전구체에 의해 코딩되는 단백질이며, 이 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 화학적 또는 효소적 수단에 의해 세포의 표면에 접합된 단백질이다. 외인성 단백질의 비제한적 부류에는 효소, 인터류킨, 사이토카인 수용체, Fc-결합 분자, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC-결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화 작용제, 수용체 리간드(예를 들어, 수용체 작용제 또는 수용체 길항제), 및 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 조작된 탈핵 적혈구에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 예는 본 명세서에 기재되어 있다(예를 들어, 표 A-D 참조). 조작된 탈핵 적혈구에 존재할 수 있는 외인성 단백질의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
"막에 존재하는 단백질(protein present on the membrane)"이라는 용어는 (1) 탈핵 적혈구의 막에 물리적으로 부착되거나 적어도 부분적으로 내장된 단백질(예: 막횡단 단백질, 말초막 단백질, 지질 고정 단백질(예를 들어 GPI-앵커, N-미리스토화 단백질, 또는 S-팔미토일화 단백질)) 또는 (2) 동족 수용체에 물리적으로 부착된 동족 수용체에 안정적으로 결합된 단백질 탈핵 적혈구(예를 들어 동족 수용체에 결합된 리간드, 여기서 동족 수용체는 탈핵 적혈구의 막에 물리적으로 부착됨)를 의미한다. 포유동물 세포의 막 상의 단백질의 존재를 결정하기 위한 비제한적 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS), 면역조직화학, 세포 분획 분석 및 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
"적혈구 전구 세포(erythroid progenitor cells)"라는 용어는 궁극적으로 탈핵 적혈구로 분화/발달할 수 있는 포유동물 세포를 의미한다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC, HSPC), 비장 집락 형성(CFU-S) 세포, 공통 골수 전구(CMP) 세포, 배반구 군체 형성 세포, 버스트 형성 단위-적혈구/적혈구(BFU-E), 거핵구-적혈구 전구 세포(MEP) 세포, 적혈구 군체 형성 단위 또는 집락 형성 단위 적혈구(CFU-E), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 이들의 조합이다.
"항산화제(antioxidant agent)"라는 용어는 산소 및/또는 라디칼 산소 종에 대한 노출에 의해 야기되는 화학적 변화를 방지하는 제제를 의미하며, 효소 및 비효소 제제를 모두 포함한다. 효소적 항산화제의 비제한적인 예는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 글루타티온 퍼옥시다제 및 카탈라제를 포함한다. 비효소적 항산화제의 비제한적 예는 아스코르브산(비타민 C), α-토코페롤(비타민 E), 글루타티온, N-아세틸 시스테인, 및 β-카로틴(카로티노이드)을 포함한다. 항산화제의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
"대상체(subject)"이라는 용어는 모든 포유동물을 의미한다. 일부 실시예에서, 대상체 또는 "치료가 필요한 대상체"는 영장류(예: 인간, 유인원(예: 원숭이(예: 마모셋(marmoset) 또는 비비(baboon))), 또는 유인원(예: 고릴라, 침팬지, 오랑우탄 또는 긴팔 원숭이), 설치류(예: 마우스, 기니피그, 햄스터 또는 쥐), 토끼, 개, 고양이, 말, 양, 소, 돼지 또는 염소이다. 일부 실시예에서, 대상체 또는 "치료에 적합한 대상체"는 인간이 아닌 포유동물, 특히 인간에서 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 통상적으로 사용되는 포유동물(예를 들어, 마우스, 돼지, 래트 또는 비인간 영장류)가 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 피험자는 의료 전문가(예: 의사, 검사실 기술자, 의사의 조수, 간호사 또는 임상 검사실 기술자)에 의해 치료가 필요한 것으로 사전에 진단되거나 식별될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료하는(treating)"은 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 대상체 중 임의의 것)에서 의학적 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 수, 중증도, 빈도 및/또는 지속기간의 감소를 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에 사용하기 위해 여기에 설명되어 있다. 당업계에 공지된 다른 적절한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 시퀀스, 데이터베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 충돌하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1A 및 1B는 HypoThermosol®(HTS; Sigma-Aldrich 카탈로그 번호 H4416)에 저장된 탈핵 적혈구와 비교하여 T1 시리즈 제형에 저장된 탈핵 적혈구에 대한 용혈 백분율 및 세포 수의 백분율 변화를 보여준다다. 도 1A는 각각 34일, 40일 및 68일 후 HTS에 저장된 것과 비교하여 T1 시리즈 제형에 저장된 탈핵 적혈구에 대한 용혈률을 나타낸다. 도 1B는 68일 동안 HTS에 저장된 것과 비교하여 68일 동안 T1 시리즈 제제에 저장된 탈핵 적혈구에 대한 세포 수의 변화 백분율을 나타낸다.
도 2는 HTS 또는 T1-1에서 각각 32일 또는 45일 동안 보관한 후 탈핵 적혈구 농도를 나타낸다.
도 3A 및 3B는 HTS에 저장된 것과 비교하여 T1-1 제형에 저장된 탈핵 적혈구의 오스모스캔 곡선(osmoscan curve)을 나타낸다. 도 3A는 각각 34일, 40일 및 68일 후 T1-1 제제 또는 HTS에 보관된 탈핵 적혈구의 오스모스캔 곡선을 나타낸다. 도 3B는 각각 32일 또는 45일 후 T1-1 제제 또는 HTS에 보관된 탈핵 적혈구의 오스모스캔 곡선을 나타낸다.
도 4A는 T1-1(6개 배치) 또는 0.2% w/v 인간 혈청 알부민이 추가로 보충된 T1-1(2개 배치)에서 2-8ºC에서 보관할 때, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 및 세포 표면 상의 IL-15 수용체 알파(IL-15Rα)의 세포외 부분에 연결된 IL-15를 포함하는 제2 외인성 단백질을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구의 시간 경과에 따른 세포 농도를 나타낸다.
도 4B는 T1-1(6개 배치) 또는 0.2% w/v 인간 혈청 알부민이 추가로 보충된 T1-1(2개 배치)에서 2-8ºC에서 보관할 때, 표면 상의 IL-15Rα의 세포외 부분에 연결된 IL-15를 포함하는 제2 외인성 단백질 및 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구의 시간 경과에 따른 용혈의 백분율을 나타낸다.
(a) 탈핵 적혈구 집단; 및 (b) 약 6.5 내지 약 8.5의 pH(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위 범위) 및 약 150 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L(예를 들어, 약 5mM 내지 약 80mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 부분 범위)의 완충액(예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 완충액)을 포함하는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위 ); 약 5mM 내지 약 35mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위범위) 인산 이온; 약 50mM 내지 약 160mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 나트륨 이온; 약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 20mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 마그네슘 이온; 및 약 5mM 내지 약 60mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)의 비이온성 세포 불침투성 제제(예를 들면, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 비이온성 세포 불침투성 제제) 여기서: 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.1mM 미만의 글루코스를 포함하고(예를 들어, 검출가능한 글루코스를 함유하지 않음); 선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 이들 조성물의 일부 실시예는 0.005mM 미만의 글루코스, 0.001mM 미만의 글루코스, 글루코스 없음 또는 검출가능한 글루코스를 포함하지 않는다. 이러한 조성물의 일부 실시예는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 수크로스, 콜로이드(예를 들어, 덱스트란) 및 항산화제를 포함하지 않는다.
일부 실시예에서, 약 2℃ 내지 약 10℃ (예를 들어, 약 2 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 4 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 4℃ ~ 10℃, 약 4℃ ~ 약 9℃, 약 4℃ ~ 약 8℃, 약 4℃ ~ 약 7℃, 약 4℃ ~약 6℃, 약 5℃ ~ 10℃, 약 5℃ ~ 약 9 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 7 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 7℃ ~ 약 9℃ 또는 약 8℃ ~ 약 10℃)에서 본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 30일 내지 약 100일 동안 (예를 들어, 약 30일 내지 약 95일, 약 30일 내지 약 90일, 약 30일 내지 약 85일, 약 30일 내지 약 80일, 약 30일 내지 약 75일, 약 30일 내지 약 70일 , 약 30일 내지 약 65일, 약 30일 내지 약 60일, 약 30일 내지 약 55일, 약 30일 내지 약 50일, 약 30일 내지 약 45일, 약 30일 내지 약 40일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 100일, 약 35일 내지 약 95일, 약 35일 내지 약 90일, 약 35일 내지 약 85일, 약 35일 내지 약 80일, 약 35일 약 75일 내지 약 75일, 약 35일 내지 약 70일, 약 35일 내지 약 65일, 약 35일 내지 약 60일, 약 35일 내지 약 55일, 약 35일 내지 약 50일, 약 35일 내지 약 45일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 100일, 약 40일 내지 약 95일, 약 40일 내지 약 90일, 약 40일 내지 약 85일, 약 40일 내지 약 80일 , 약 40일 내지 약 75일, 약 40일 내지 약 70일, 약 40일 내지 약 65일, 약 40일 내지 약 60일, 약 40일 내지 약 55일, 약 40일 내지 약 50일, 약 40일 일 내지 약 45일, 약 45일 내지 약 100일, 약 45일 내지 약 95일, 약 45일 내지 약 90일, 약 45일 내지 약 85일, 약 45일 내지 약 80일, 약 45일 내지 약 75일, 약 45일 내지 약 70일, 약 45일 내지 약 65일, 약 45일 내지 약 60일, 약 45일 내지 약 55일, 약 45일 내지 약 50일, 약 50일 내지 약 100일 일, 약 50일 내지 약 95일, 약 50일 내지 약 90일, 약 50일 내지 약 85일, 약 50일 내지 약 80일, 약 50일 내지 약 75일, 약 50일 내지 약 70일, 약 50일 내지 약 65일, 약 50일 내지 약 60일, 약 50일 내지 약 55일, 약 55일 내지 약 100일, 약 55일 내지 약 95일, 약 55일 내지 약 90일, t 55일 내지 약 85일, 약 55일 내지 약 80일, 약 55일 내지 약 75일, 약 55일 내지 약 70일, 약 55일 내지 약 65일, 약 55일 내지 약 60일, 약 60일 일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 95일, 약 60일 내지 약 90일, 약 60일 내지 약 85일, 약 60일 내지 약 80일, 약 60일 내지 약 75일, 약 60일 내지 약 70일, 약 60일 내지 약 65일, 약 65일 내지 약 100일, 약 65일 내지 약 95일, 약 65일 내지 약 90일, 약 65일 내지 약 85일, 약 65일 내지 약 80일 일, 약 65일 내지 약 75일, 약 65일 내지 약 70일, 약 70일 내지 약 100일, 약 70일 내지 약 95일, 약 70일 내지 약 90일, 약 70일 내지 약 85일, 약 70일 내지 약 80일, 약 70일 내지 약 75일, 약 75일 내지 약 100일, 약 75일 내지 약 95일, 약 75일 내지 약 90일, 약 75일 내지 약 85일, 약 75일 일 내지 약 80일, 약 80일 내지 약 100일, 약 80일 내지 약 95일, 약 80일 내지 약 90일, 약 80일 내지 약 85일, 약 85일 내지 약 100일, 약 85일 내지 약 95일, 약 85일 내지 약 90일, 약 90일 내지 약 100일, 약 90일 내지 약 95일, 약 95일 내지 약 100일) 저장은 12% 미만 용혈, 10.0% 미만 용혈, 9.5% 미만 용혈, 9.0% 미만 용혈, 8.5% 미만 용혈, 8.0% 미만 용혈, 7.5% 미만 용혈, 7.0% 미만 용혈, 6.5% 미만 용혈, 6.0% 미만 용혈, 5.5% 미만 용혈, 5.0% 미만 용혈, 4.5% 미만 용혈, 4.0% 미만 용혈, 3.5% 미만 용혈, 3.0% 미만 용혈, 미만 2.5% 용혈, 2.0% 미만 용혈, 1.5% 미만 용혈, 1.0% 미만 용혈, 0.5% 미만 용혈, 또는 0.1% 미만 용혈 (예를 들어, 보관 전과 비교하여)이다.
또한 다음을 포함하는 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 대상체 중 임의의 것)를 치료하는 방법은 일정 기간 동안 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 기간, 예를 들어, 약 30일 내지 약 100일, 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나)에서 보관된 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 제공하는 단계; 그리고 (ii) 단계 (i)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 기간, 예를 들어, 약 30일 내지 약 100일, 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 약 2 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 4 ℃ , 약 3 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 4℃ ~ 약 10℃, 약 4℃ ~ 약 9℃, 약 4℃ ~ 8℃, 약 4℃ ~ 약 7℃, 약 4℃ ~ 약 6℃, 약 5℃ ~ 약 10℃, 약 5℃ ~ 약 9 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 7 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 7℃ ~ 약 9℃ 또는 약 8℃ ~ 약 10℃)에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 12% 미만의 용혈이 발생한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 일정 기간 동안 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 기간, 예를 들어, 약 30일 내지 약 100일, 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 약 2 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 4 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 4℃ ~ 약 10℃, 약 4℃ ~ 약 9℃, 약 4℃ ~ 약 8℃, 약 4℃ ~ 약 7℃, 약 4℃ ~ 약 6℃, 약 5℃ ~ 약 10℃, 약 5℃ ~ 약 9 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 7 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 7℃ ~ 약 9℃ 또는 약 8℃ ~ 약 10℃)에서 저장하기 전의 조성물과 비교하여 단계 (i) 후에 세포 밀도의 12% 미만 감소 (예를 들어, 10% 미만 감소, 9.5% 미만 감소, 9.0% 미만 감소, 8.5% 미만 감소, 8.0% 미만 감소, 7.5% 미만 감소, 7.0 미만 % 감소, 6.5% 미만 감소, 6.0% 미만 감소, 5.5% 미만 감소, 5.0% 미만 감소, 4.5% 미만 감소, 4.0% 미만 감소, 3.5% 미만 감소, 3.0% 미만 감소, 2.5% 미만 감소, 2.0% 미만 감소, 1.5% 미만 감소, 1.0% 미만 감소, 0.5% 미만 감소 또는 0.1% 미만 감소)가 발생한다.
또한, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 대상체)를 치료하는 방법이 제공된다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 투여 전에 조성물을 일정 기간 동안 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 기간, 예를 들어, 약 30일 내지 약 100일, 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 약 2 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 2 ℃ ~ 약 4 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 6 ℃, 약 3 ℃ ~ 약 5 ℃, 약 4℃ ~ 약 10℃, 약 4℃ ~ 9℃, 약 4℃ ~ 약 8℃, 약 4℃ ~ 약 7℃, 약 4℃ ~ 약 6℃, 약 5℃ ~ 약 10℃, 약 5℃ ~ 약 9 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 5 ℃ ~ 약 7 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 9 ℃, 약 6 ℃ ~ 약 8 ℃, 약 7 ℃ ~ 약 10 ℃, 약 7℃ ~ 약 9℃ 또는 약 8℃ ~ 약 10℃)에서 저장하고, 12% 미만의 용혈 (예를 들어, 약 10% 미만 용혈, 약 9.5% 미만 용혈, 9.0% 미만 용혈, 8.5% 미만 용혈, 8.0% 미만 용혈, 7.5% 미만 용혈, 7.0% 미만 용혈, 6.5 미만 % 용혈, 6.0% 미만 용혈, 5.5% 미만 용혈, 5.0% 미만 용혈, 4.5% 미만 용혈, 4.0% 미만 용혈, 3.5% 미만 용혈, 3.0% 미만 용혈, 2.5% 미만 용혈, 용혈 2.0% 미만, 용혈 1.5% 미만, 용혈 1.0% 미만, 용혈 0.5% 미만 또는 용혈 0.1% 미만)은 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관하기 전의 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관 후 발생한다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 투여 전에 조성물을 일정 기간 동안 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 기간, 예를 들어, 약 30일 내지 약 100일, 또는 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4ºC~약 10ºC, 약 4ºC~약 9ºC, 약 4ºC~약 8ºC, 약 4ºC~약 7ºC, 약 4º~약 6ºC, 약 5ºC~약 10ºC, 약 5ºC~ 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10 ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 저장하고, 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관하기 전의 조성물과 비교하여 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관한 후 세포 밀도의 12% 미만 감소 (예를 들어, 10% 미만 감소, 9.5% 미만 감소, 9.0% 미만 감소, 8.5% 미만 감소, 8.0% 미만 감소, 7.5% 미만 감소, 7.0 미만 % 감소, 6.5% 미만 감소, 6.0% 미만 감소, 5.5% 미만 감소, 5.0% 미만 감소, 4.5% 미만 감소, 4.0% 미만 감소, 3.5% 미만 감소, 3.0% 미만 감소, 2.5% 미만 감소, 2.0% 미만 감소, 1.5% 미만 감소, 1.0% 미만 감소, 0.5% 미만 감소 또는 0.1% 미만 감소)가 발생한다.
또한, 조성물의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 탈핵 적혈구 집단을 제공하는 단계; 및 (ii) 탈핵 적혈구 집단을 약 6.5 내지 약 8.5의 pH(예를 들어, 본원에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위 범위) 및 약 150 mOsm/L 내지 약 150 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 재현탁시키는 단계를 포함한다. 다음을 포함하는 약 400 mOsm/L(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 예시적인 완충액); 약 5mM 내지 약 35mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위범위) 인산 이온; 약 50mM 내지 약 160mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 나트륨 이온; 약 5mM 내지 약 60mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이러한 범위의 임의의 하위 범위) 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 10mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것) 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 20mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위) 마그네슘 이온; 및 약 5mM 내지 약 60mM(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)의 비이온성 세포 불침투성 제제(예를 들면, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 비이온성 세포 불침투성 제제) 여기서: 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.1mM 미만의 글루코스를 포함하고(예를 들어, 검출가능한 글루코스 없음); 선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 약제학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.005mM 미만의 글루코스, 0.001mM 미만의 글루코스를 포함하거나, 글루코스를 포함하지 않거나, 또는 검출가능한 글루코스를 포함하지 않는다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 1종 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 수크로스, 콜로이드(예를 들어, 덱스트란) 및 항산화제를 포함하지 않는다. 이들 방법의 일부 실시예에서, 약 30일 내지 약 100일 동안 (예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 약 2℃ 내지 약 10℃ (예를 들어, 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4ºC~약 10ºC, 약 4ºC~약 9ºC, 약 4ºC~약 8ºC, 약 4ºC~약 7ºC, 약 4º~약 6ºC, 약 5ºC~약 10ºC, 약 5ºC~ 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10 ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 조성물을 보관하면, 예를 들어 약 30일에서 약 100일 동안 약 2ºC에서 약 10ºC에서 조성물을 보관하기 전과 비교하여 12% 미만의 용혈 (예를 들어, 약 10% 미만 용혈, 약 9.5% 미만 용혈, 약 9.0% 미만 용혈, 약 8.5% 미만 용혈, 약 8.0% 미만 용혈, 약 7.5% 미만 용혈, 약 7.0% 미만 용혈, 약 6.5% 미만 용혈, 약 5.0% 미만 용혈, 약 4.5% 미만 용혈, 약 4.0% 미만 용혈, 약 3.5% 미만 용혈, 약 3.0% 미만 용혈, 약 2.5% 미만 용혈 , 약 2.0% 미만 용혈, 약 1.5% 미만 용혈, 약 1.0% 미만 용혈, 0.5% 미만 용혈, 또는 0.1% 미만 용혈)이 일어난다. 이러한 방법의 일부 실시예에서, 조성물을 약 2℃ 내지 약 10℃ (예를 들어, 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4ºC~약 10ºC, 약 4ºC~약 9ºC, 약 4ºC~약 8ºC, 약 4ºC~약 7ºC, 약 4º~약 6ºC, 약 5ºC~약 10ºC, 약 5ºC~ 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10 ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 약 30일 내지 약 100일 동안 (예를 들어, 여기에 설명된 이 범위의 하위 범위 중 하나) 보관하면 세포 밀도에서 세포 밀도가 12% 미만 (예를 들어, 10% 미만 감소, 9.5% 미만 감소, 9.0% 미만 용혈, 8.5% 미만 용혈, 8.0% 미만 용혈, 7.5% 미만 용혈, 7.0% 미만 용혈, 6.5 미만 % 용혈, 6.0% 미만 용혈, 5.5% 미만 용혈, 5.0% 미만 용혈, 4.5% 미만 용혈, 4.0% 미만 용혈, 3.5% 미만 용혈, 3.0% 미만 용혈, 2.5% 미만 용혈 , 용혈 2.0% 미만, 용혈 1.5% 미만, 용혈 1.0% 미만, 용혈 0.5% 미만 또는 용혈 0.1% 미만)이 된다. 이들 방법의 일부 실시예는 탈핵 적혈구의 집단을 제공하기 위해 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 적혈구 전구 세포)를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 용혈을 측정하기 위한 예시적인 분석이 여기에 설명되어 있다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 조성물이 제공된다.
이들 조성물 및 방법의 비제한적인 측면은 하기에 기재되어 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 아래에 열거된 예시적인 실시예는 임의의 조합으로 사용될 수 있고, 당해 분야에 공지된 다른 실시예와 조합될 수 있다.
탈핵 적혈구
본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 일부 실시예에서, 조성물은 약 0.5 x 108 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL를 포함하고 예를 들어, 약 0.5 x 108 내지 약 6.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 5.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 4.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 3.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 2.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 1.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 0.5 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 1.0 x 108, 약 1.0 x 108 내지 약 7.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 6.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 5.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 4.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 3.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 2.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 0.5 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 2.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 2.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 4.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 4.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 4.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 5.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 5.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 또는 약 6.0 x 109 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL이다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구(예: 인간 탈핵 적혈구)는 하나 이상의 마이너 혈액형 항원(minor blood group antigens), Le(a-b-)(루이스 항원 시스템의 경우), Fy(ab-)(더피 시스템의 경우), Jk(ab-)(키드 시스템의 경우), MN-(MNS 시스템의 경우), Kk-( Kell 시스템), Lu(ab-)(루터교 시스템의 경우) 및 H-항원 음성(봄베이 표현형) 또는 이들의 조합에 대해 음성이다(즉, 포함하지 않는다). 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 또한 O형 및/또는 Rh-형이다. 마이너 혈액형은 예를 들어 Agarwal et al., "Blood group phenotype frequency in a tertiary care hospital in north India," Blood Res. 48(1):51-54, 2013, Mitra et al., "Blood groups systems", Indian J. Anaesth. 58(5):524-528, 2014에 설명되어 있으며, 이에 대한 설명은 참조로 여기에 포함된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)는 외인성 단백질 (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 외인성 단백질)을 포함하지 않는 단리된 미배양 탈핵 적혈구와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 일부 실시예에서, WO 2015/073587의 실시예 59에 기재된 방법을 사용하여 삼투 취약성을 측정한다 (이의 설명은 본 명세서에 참고로 포함됨).
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)는 야생형, 미처리 탈핵 적혈구와 대략 동일한 직경 또는 부피를 갖는다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구(예를 들어, 인간 탈핵 적혈구)의 집단은 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 마이크론, 또는 약 4.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 10 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.0 내지 약 5.0 마이크론, 약 4.0 내지 약 4.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 4.5 내지 11.5 마이크론, 약 , 약 4.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.5 마이크론, 약 4.5 내지 약 5.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.0 내지 약 6.0 마이크론, 약 5.0 내지 약 5.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 10.5, 약 5.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 7.0 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.5 마이크론, 약 5.5 내지 약 6.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 11 .5 마이크론, 약 6.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 8.5, 약 6.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.0 내지 약 7.0 마이크론, 약 6.0 내지 약 6.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.5 마이크론, 약 6.5 내지 약 7.0 마이크론, 7.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.0 내지 약 8.0 마이크론, 약 7.0 내지 ab 7.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 7.55 내지 약 .5 마이크론 9.0 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.5 마이크론, 약 7.5 내지 약 8.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.0 내지 약 9.0 마이크론, 약 8.0 내지 약 8.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 11.0 마이크론, 약8.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.5 마이크론, 약 8.5 내지 약 9.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.0 내지 약 10.0 마이크론, 약 9.0 내지 약 9.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.5 마이크론, 약 9.5 내지 약 10.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.0 내지 약 11.0 마이크론, 약 10.0 내지 약 10.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 12.0 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.5 마이크론, 약 10.5 내지 약 11.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 12.0 마이크론, 약 11.0 내지 약 11.5 마이크론. 11.5 내지 약 12.0 마이크론의 평균 직경을가지이고 선택적으로 모집단의 표준 편차는 1, 2 또는 3 마이크론 미만이다. 탈핵 적혈구 직경은 예를 들어 Advia 120 혈액학 시스템 또는 Moxi Z 세포 계수기(Orflo)를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 평균 미립자 부피의 부피는 약 10fL 내지 약 175fL, 약 10fL 내지 약 160fL, 약 10fL 내지 약 140fL, 약 10fL 내지 약 120fL, 약 10fL 내지 약 100fL, 약 10fL 내지 약 95fL, 약 10fL 내지 약 90fL, 약 10fL 내지 약 85fL, 약 10fL 내지 약 80fL, 약 10fL 내지 약 75fL, 약 10fL 내지 약 70fL, 약 10fL 내지 약 65fL, 약 10fL 내지 약 60fL, 약 10fL 내지 약 55fL, 약 10fL 내지 약 50fL, 약 10fL 내지 약 45fL, 약 10fL 내지 약 40 fL, 약 10fL 내지 약 35fL, 약 10fL 내지 약 30fL, 약 10fL 내지 약 25fL, 약 10fL 내지 약 20fL, 약 10fL 내지 약 15fL, 약 15fL 내지 약 175fL, 약 15fL 내지 약 160fL, 약 15fL 내지 약 140fL, 약 15fL 내지 약 120fL, 약 15fL 내지 약 100fL, 약 15fL 내지 약 95fL, 약 15fL 내지 약 90fL, 약 15 fL 내지 약 85fL, 약 15fL 내지 약 80fL, 약 15fL 내지 약 75f L, 약 15fL 내지 약 70fL, 약 15fL 내지 약 65fL, 약 15fL 내지 약 60fL, 약 15fL 내지 약 55fL, 약 15fL 내지 약 50fL, 약 15fL 내지 약 45fL, 약 15fL 내지 약 40fL, 약 15fL 내지 약 35fL, 약 15fL 내지 약 30fL, 약 15fL 내지 약 25fL, 약 15fL 내지 약 20fL, 약 20fL 내지 약 175fL, 약 20 fL 내지 약 160fL, 약 20fL 내지 약 140fL, 약 20fL 내지 약 120fL, 약 20fL 내지 약 100fL, 약 20fL 내지 약 95fL, 약 20fL 내지 약 90fL, 약 20fL 내지 약 85fL, 약 20fL 내지 약 80fL, 약 20fL 내지 약 75fL, 약 20fL 내지 약 70fL, 약 20fL 내지 약 65fL, 약 20fL 내지 약 60fL, 약 20fL 내지 약 55 fL, 약 20fL 내지 약 50fL, 약 20fL 내지 약 45fL, 약 20fL 내지 약 40fL, 약 20fL 내지 약 35fL, 약 20fL 내지 약 30fL, 약 20fL 내지 약 25fL, 약 25fL 내지 약 175fL, 약 25fL 내지 약 160fL, 약 25fL 내지 약 140fL, 약 25fL 내지 약 120fL, 약 25 fL 내지 약 100 fL, 약 25 fL 내지 약 95 fL, 약 25 fL 내지 약 90 fL, 약 25 fL 내지 약 85 fL, 약 25 fL 내지 약 80 fL, 약 25 fL 내지 약 75 fL, 약 25 fL 내지 약 70fL, 약 25fL 내지 약 65fL, 약 25fL 내지 약 60fL, 약 25fL 내지 약 55fL, 약 25fL 내지 약 50fL, 약 25fL 내지 약 45fL, 약 25fL 내지 약 40 fL, 약 25fL 내지 약 35fL, 약 25fL 내지 약 30fL, 약 30fL 내지 약 175fL, 약 30fL 내지 약 160fL, 약 30fL 내지 약 140fL, 약 30fL 내지 약 120fL, 약 30fL 내지 약 100fL, 약 30fL 내지 약 95fL, 약 30fL 내지 약 90fL, 약 30fL 내지 약 85fL, 약 30fL 내지 약 80fL, 약 30fL 내지 약 75fL, 약 30 fL 내지 약 70fL, 약 30fL 내지 약 65fL, 약 30fL 내지 약 60fL, 약 30fL 내지 약 55fL, 약 30fL 내지 약 50fL, 약 30fL 내지 약 45fL, 약 30fL 내지 약 40fL, 약 30fL 내지 약 35fL, 약 35fL 내지 약 175fL, 약 35fL 내지 약 160fL, 약 35fL 내지 약 140 fL, 약 35 fL 내지 약 120 fL, 약 35 fL 내지 약 100 fL, 약 35 fL 내지 약 95 fL, 약 35 fL 내지 약 90 fL, 약 35 fL 내지 약 85 fL, 약 35 fL 내지 약 80 fL , 약 35fL 내지 약 75fL, 약 35fL 내지 약 70fL, 약 35fL 내지 약 65fL, 약 35fL 내지 약 60fL, 약 35fL 내지 약 55fL, 약 35fL 내지 약 50fL, 약 35fL 내지 약 45fL, 약 35fL 내지 약 40fL, 약 40fL 내지 약 175fL, 약 40fL 내지 약 160fL, 약 40fL 내지 약 140fL, 약 40fL 내지 약 120fL, 약 40fL 약 100fL 내지 약 40fL 내지 약 95fL, 약 40fL 내지 약 90fL, 약 40fL 내지 약 85fL, 약 40fL 내지 약 80fL, 약 40fL 내지 약 75fL, 약 40fL 내지 약 70fL, 약 40fL 내지 약 65fL, 약 40fL 내지 약 60fL, 약 40fL 내지 약 55fL, 약 40fL 내지 약 50fL, 약 40fL 내지 약 45fL, 약 45fL 내지 약 175fL , 약 45fL 내지 약 160fL, 약 45fL 내지 약 140fL, 약 45fL 내지 약 120fL, 약 45fL 내지 약 100fL, 약 45fL 내지 약 95fL, 약 45fL 내지 약 90fL, 약 45fL 내지 약 85fL, 약 45fL 내지 약 80fL, 약 45fL 내지 약 75fL, 약 45fL 내지 약 70fL, 약 45 fL 내지 약 65fL, 약 45fL 내지 약 60fL, 약 45fL 내지 약 55fL, 약 45fL 내지 약 50fL, 약 50fL 내지 약 175fL, 약 50fL 내지 약 160fL, 약 50fL 내지 약 140fL, 약 50fL 내지 약 120fL, 약 50fL 내지 약 100fL, 약 50fL 내지 약 95fL, 약 50fL 내지 약 90fL, 약 50fL 내지 약 85fL, 약 50fL 내지 약 80 fL, 약 50fL 내지 약 75fL, 약 50fL 내지 약 70fL, 약 50fL 내지 약 65fL, 약 50fL 내지 약 60fL, 약 50fL 내지 약 55fL, 약 60fL 내지 약 175fL, 약 60fL 내지 약 160fL, 약 60fL 내지 약 140fL, 약 60fL 내지 약 120fL, 약 60fL 내지 약 100fL, 약 60fL 내지 약 95fL, 약 60fL 내지 약 90fL, 약 60 fL 내지 약 85fL, 약 60fL 내지 약 80fL, 약 60fL 내지 약 75fL, 약 60fL 내지 약 70fL, 약 60 fL 내지 약 65fL, 약 70fL 내지 약 175fL, 약 70fL 내지 약 160fL, 약 70fL 내지 약 140fL, 약 70fL 내지 약 120fL, 약 70fL 내지 약 100fL, 약 70fL 내지 약 95fL, 약 70fL 내지 약 90fL, 약 70fL 내지 약 85fL, 약 70fL 내지 약 80fL, 약 70fL 내지 약 75fL, 약 80fL 내지 약 175fL, 약 80fL 내지 약 160 fL, 약 80fL 내지 약 140fL, 약 80fL 내지 약 120fL, 약 80fL 내지 약 100fL, 약 80fL 내지 약 95fL, 약 80fL 내지 약 90fL, 약 80fL 내지 약 85fL, 약 100fL 내지 약 175fL, 약 100fL 내지 약 160fL, 약 100fL 내지 약 140fL, 약 100fL 내지 약 120fL, 약 120fL 내지 약 175fL, 약 120fL 내지 약 160fL, fL 내지 약 140fL, 약 140fL 내지 약 175fL, 약 140fL 내지 약 160fL, 또는 약 160fL 내지 약 175fL이고, 선택적으로 모집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 2fL 미만이다. 평균 미립자 부피는 예를 들어 혈액 분석 기기, 예를 들어 Coulter 계수기, Moxi Z 세포 계수기(Orflo) 또는 Sysmex 혈액학 분석기를 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 인간 (예를 들어, 인간 공여자 적혈구 전구 세포로부터 유래됨) 탈핵 적혈구이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 일부 실시예태에서, 탈핵 적혈구는 조작된 인간 탈핵 적혈구다. 일부 예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 단일 외인성 단백질(예를 들어, 세포질에 존재하거나 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질)(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 포함한다.
다른 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 2개 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 포함한다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 탈핵 적혈구(예를 들어, 효소, 예를 들어, 페닐알라닌 암모니아 분해효소)의 세포질에 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 외인성 단백질 중 적어도 하나는 조작된 탈핵 적혈구의 막(예를 들어, Fc-결합 분자, 사이토카인 수용체, T-세포 활성화 리간드, T-세포 수용체, 면역 억제 분자, MHC 분자, APC-결합 분자, 자가항원, 알레르겐, 독소, 표적화제, 수용체 리간드(예를 들어, 수용체 작용제 또는 수용체 길항제), 또는 항체 또는 항체 단편)에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 조작된 적혈구를 포함할 수 있는 하나 이상의 외인성 단백질의 비제한적 예는 외인성 단백질을 포함하는 조작된 적혈구가 치료에 사용될 수 있는 상응하는 질병 또는 상태에 추가로 하기 표 A-D에 열거되어 있다.
[표A]
Figure pct00001
[표B]
Figure pct00002
[표C]
Figure pct00003
[표D]
Figure pct00004
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 클릭 화학 반응의 생성물일 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 외인성 단백질은 세포의 막 상에 존재하는 단백질에 접합될 수 있다(예를 들어, 제2 (외인성 단백질 또는 내인성 단백질)). 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 소르타제 효소(sortase enzyme)를 사용한 접합 반응의 생성물일 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 외인성 단백질은 세포의 막 상에 존재하는 단백질에 접합될 수 있다(예를 들어, 제2 외인성 단백질 또는 내인성 단백질)). 소르타제 효소를 사용한 접합 반응의 비제한적인 예는 U.S. Pat. No. 10,260,038 and U.S. Pat. Pub. No. 2016/0082046 A1이다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 지질-고정된 단백질, 예를 들어, GPI-앵커, N-미리스톨화된 단백질, 또는 S-팔미토일화된 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막횡단 단백질(예를 들어, 단일-통과 또는 다중-통과 막횡단 단백질) 또는 말초 막 단백질일 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 막횡단 도메인을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 작은 통합 막 단백질 1(SMIM1) 또는 글리코포린 A(GPA)의 막횡단 도메인을 포함하는 융합 단백질)일 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 세포외 공간으로 돌출된 임의의 아미노산을 갖지 않는다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 조작된 탈핵 적혈구의 세포질 내로 돌출된 임의의 아미노산을 갖지 않는다. 일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 외인성 단백질은 세포외 공간으로 돌출된 아미노산 및 조작된 탈핵 적혈구의 세포질 내로 돌출된 아미노산을 갖는다.
조작된 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 외인성 단백질)을 코딩하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, DNA 발현 벡터 또는 mRNA)을 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 적혈구 전구 세포)에 도입함으로써 생성될 수 있다. DNA 발현 벡터를 갑상샘 선조 세포에 도입하기 위한 예시적인 방법은 리포솜-매개 전달, 형질전환, 유전자 총, 형질감염 및 형질도입, 예를 들어 바이러스-매개 유전자 전달 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 레트로바이러스 기반 벡터를 포함한 바이러스 벡터를 사용하여 수행)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. DNA 발현 벡터를 적혈구 전구 세포에 도입하기 위한 추가의 예시적인 방법은 예를 들어, 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션 및 세포 미세주입의 사용을 포함한다.
적혈구 전구 세포는 예를 들어 조작된 탈핵 적혈구로의 분화를 허용하는 적합한 조건 하에 하나 이상의 외인성 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 도입 전 및/또는 후에 임의로 배양될 수 있다. 일부 실시예에서, 생성된 조작된 탈핵 적혈구는 성숙한 적혈구와 관련된 단백질, 예를 들어 헤모글로빈(예를 들어, 성인 헤모글로빈 및/또는 태아 헤모글로빈), 글리코포린 A, 및 표준 방법 (예를 들어, 웨스턴 블로팅 또는 FACS 분석)에 의해 검증 및 정량화될 수 있는 외인성 단백질을 포함한다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포는 외인성 단백질을 코딩하는 mRNA로 형질감염되어 조작된 탈핵 적혈구를 생성할 수 있다. 메신저 RNA는 외인성 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA 플라스미드 구성물의 시험관내 전사로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 특정 RNA 중합효소와 양립할 수 있는 프로모터 서열을 함유하는 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터 ZAP Express® pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA, USA)는 각각 T3 및 T7 RNA 중합효소와 호환되는 T3 및 T7 프로모터 서열을 포함한다. 센스 mRNA의 시험관내 전사를 위해, 플라스미드는 외인성 단백질을 코딩하는 서열의 말단에 상응하는 정지 코돈(들)의 하류 제한 부위에서 선형화된다. mRNA는 예를 들어 RNAMaxx® High Yield Transcription Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 같은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 선형 DNA 주형으로부터 전사된다. 일부 경우에, 5'-m7GpppG 캡핑된 mRNA를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이 선형화된 cDNA 주형의 전사는 예를 들어 Ambion(Austin, Tex., USA)의 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit를 사용하여 수행할 수 있다. 전사는 30분에서 4시간 동안 37°C에서 20-100μl의 반응 부피로 수행할 수 있다. 전사된 mRNA는 선형화된 DNA 주형을 제거하기 위해 DNase I로 간단히 처리한 다음 염화리튬, 아세트산나트륨 또는 아세트산암모늄이 있는 상태에서 70% 에탄올에 침전시켜 반응 혼합물에서 정제한다. 전사된 mRNA의 무결성은 아가로스-포름알데히드 겔 또는 상업적으로 이용 가능한 Novex 사전 주조 TBE 겔(Novex, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용한 전기영동을 사용하여 평가할 수 있다.
외인성 단백질을 코딩하는 메신저 RNA는 예를 들어, 리포펙션 및 전기천공을 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다(van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001). 리포펙션의 경우, 예를 들어 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 5μg의 시험관 내 전사된 mRNA를 양이온성 지질 DMRIE-C(Invitrogen)와 1:4 비율로 5-15분 동안 인큐베이션한다.
대안적으로, 다양한 다른 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체를 사용하여 예를 들어 DOTAP, 다양한 형태의 폴리에틸렌이민, 및 폴리L-리신 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), 및 수퍼팩트(Superfect)(Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA; 예를 들어, Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001 참조)를 포함하는 mRNA로 적혈구계 전구 세포를 형질감염시킬 수 있다. 생성된 mRNA/지질 복합체를 37°C에서 2시간 동안 세포(1 - 2 x 106 cells/mL)와 함께 배양하고 세척한 다음 다시 배양한다. 전기천공의 경우, 예를 들어 500μL의 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 약 5 내지 20 x 106 세포를 약 20μg의 시험관 내 전사된 mRNA와 혼합하고 예를 들어 Easyject Plus 장치(EquiBio, Kent, United Kingdom)을 사용하여 0.4cm 큐벳에서 전기천공한다. 일부 경우에는 특정 mRNA를 적혈구 전구 세포로 형질감염시키기 위한 유용한 조건을 결정하기 위해 다양한 전압, 정전용량 및 전기천공 부피를 테스트해야 할 수 있다. 일반적으로 mRNA로 세포를 효율적으로 형질감염시키는 데 필요한 전기천공 매개변수는 DNA의 전기천공에 필요한 것보다 세포에 덜 해로운 것으로 보인다(van Tandeloo et al., Blood 98:49-56, 2001).
대안적으로, mRNA는 펩티드-매개 RNA 전달 전략을 사용하여 탈핵 적혈구 또는 적혈구계 전구 세포로 형질감염될 수 있다(예를 들어, Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891, 2001 참조). 예를 들어, 양이온성 지질 폴리에틸렌이민 2 kDA(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)는 특히 유사분열 후 1차 세포에서 mRNA 형질감염의 효율을 증가시키기 위해 멜리틴 펩타이드(Alta Biosciences, Birmingham, UK)와 조합될 수 있다. 멜리틴 펩티드는 예를 들어 헤테로-이작용성 가교제 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트와 같은 이황화 가교제를 사용하여 PEI에 접합될 수 있다. 시험관 내 전사된 mRNA는 멜리틴-PEI와 함께 5-15분 동안 사전 배양되어 RNA/펩티드/지질 복합체를 형성한다. 그런 다음 이 복합체를 5% CO2 가습 환경에서 37°C에서 2~4시간 동안 무혈청 배양 배지의 세포에 첨가한 다음 제거하고 형질감염된 세포를 추가로 배양한다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 하나 이상의 외인성 단백질(들) (예를 들어, 임의의 외인성 단백질 또는 본 명세에 기재된 외인성 단백질의 임의의 조합)을 코딩하는 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 핵산)을 적혈구계 전구 세포 내로 도입함으로써 생성된다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 적혈구 전구 세포 내로 도입되는 DNA에 의해 코딩된다. 일부 실시예에서, 외인성 단백질은 적혈구 전구 세포 내로 도입되는 RNA에 의해 코딩된다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 예를 들어 일시적 또는 안정한 형질감염 및 유전자 요법 접근법을 비롯한 다양한 DNA 기술을 사용하여 탈핵 적혈구로의 말단 분화 전에 적혈구계 전구 세포에 도입될 수 있다.
바이러스 유전자 전달은 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MMLV), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(adenovirus, adeno-associated virus, AAV), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV1)와 같은 렌티바이러스 및 예를 들어, 거품성 바이러스(foamy virus)와 같은 스푸마바이러스(spumavirus)와 를 비롯한 많은 바이러스가 유전자 전달 매개체로 사용될 수 있다(예를 들어, Osten et al., HEP 178:177-202, 2007 참조). 예를 들어, 레트로바이러스는 인간 세포를 포함한 포유동물 세포를 효율적으로 형질도입하고 염색체에 통합하여 안정적인 유전자 전달을 제공한다.
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 적혈구 전구 세포 내로 형질감염될 수 있다. 적합한 벡터는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 벡터이다(Malik et al., Blood 91:2664-2671, 1998). 발암성 레트로바이러스인 MMLV를 기반으로 하는 벡터는 현재 유전자 치료 임상 시험에서 사용된다(Hassle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92, 2002). 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 DNA 구축물은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 MMLV 벡터 골격에서 생성될 수 있다. 구축물은 예를 들어 PA317 세포와 같은 패키징 세포주 내로 형질감염되고 바이러스 상청액은 예를 들어 PG13 세포와 같은 생산자 세포를 형질감염시키기 위해 사용된다. PG13 바이러스 상층액은 적혈구 전구 세포와 함께 배양된다. 외인성 단백질의 발현은 FACS 분석(형광 활성화 세포 분류)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질에 대해 지시된 형광 표지된 항체가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막에 존재하는 경우에 사용한다. 외인성 단백질이 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하도록 유사한 방법이 사용될 수 있다.
선택적으로, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 추적 분자를 암호화하는 핵산은 바이러스 기반 접근법을 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 형질감염될 수 있다(Tao et al., Stem Cells 25:670-678 , 2007). 강화 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP) 또는 적색 형광 단백질 (예를 들어, DsRed-Express)을 코딩하는 DNA를 함유하는 에코토프 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, Phoenix-Eco 세포주 (배급: Orbigen, San Diego, CA)와 같은 패키징 세포를 사용하여 패키징된다. 패키징 세포주는 예를 들어 gag, pol 및 env를 포함하여 적절한 바이러스 포장에 필요한 바이러스 단백질을 안정적으로 발현한다. 바이러스 입자가 흘러 들어간 Phoenix-Eco 세포의 상등액은 적혈구 전구 세포를 형질도입하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 형질도입은 레트로바이러스 매개 유전자 전달의 효율성을 개선하기 위해 재조합 피브로넥틴의 단편과 같은 특수 코팅된 표면에서 수행될 수 있다(예를 들어, RetroNectin, Takara Bio USA, Madison, WI). 세포는 레트로바이러스 Phoenix-Eco 상청액과 적절한 보조 인자가 있는 RetroNectin 코팅 플레이트에서 배양된다. 형질도입은 다음날 반복될 수 있다. 이 경우, EGFP 또는 DsRed-Express를 발현하는 적혈구 전구 세포의 백분율은 FACS에 의해 평가될 수 있다. 형질도입 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있는 다른 리포터 유전자에는 예를 들어 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 및 루시페라제, 뿐만 아니라 저친화성 신경 성장 인자 수용체(low-affinity nerve growth factor receptor, LNGFR) 및 인간 세포 표면 CD24 항원 (Bierhuizen et al., Leukemia 13:605-613, 1999)이 포함된다.
비바이러스 벡터는 조작된 탈핵 적혈구를 생성하기 위해 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 인코딩하는 핵산을 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 화학적 및 물리적 방법을 포함하여 많은 전달 방법을 사용하여 비바이러스 벡터를 적혈구 전구 세포에 도입할 수 있다.
외인성 단백질을 코딩하는 비바이러스 벡터는 양이온성 지질 및 중합체와 같은 합성 거대분자를 사용하여 적혈구 전구 세포 내로 도입될 수 있다(Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005). 예를 들어 양이온성 리포솜은 전하 상호작용을 통해 DNA와 복합체를 형성한다. 양전하를 띤 DNA/지질 복합체는 음의 세포 표면에 결합하고 세포내이입에 의해 세포에 흡수된다. 이 접근법은 예를 들어 조혈 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Keller et al., Gene Therapy 6:931-938, 1999 참조). 적혈구 전구 세포의 경우, 플라스미드 DNA (예를 들어, OptiMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 같은 무혈청 배지에서)는 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약 Lipofectamine™(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 같은 양이온성 리포솜(혈청이 없는 배지에서)과 혼합되고, 복합체를 형성하기 위해 적어도 20분 동안 인큐베이션되도록 허용된다. DNA/리포솜 복합체를 적혈구 전구 세포에 첨가하고 5-24시간 동안 배양한 후 외인성 단백질(들)의 이식유전자 발현을 분석할 수 있다. 대안적으로, 다른 상업적으로 이용가능한 리포솜 형질감염제가 사용될 수 있다(예를 들어, In vivo GeneSHUTTLE™, Qbiogene, Carlsbad, CA).
선택적으로, 예를 들어 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)과 같은 양이온성 중합체를 사용하여 적혈구 전구 세포, 예를 들어 조혈 및 제대혈 유래 CD34+ 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다(예를 들어, Shin et al., Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384, 2005). 인간 CD34+ 세포를 인간 제대혈에서 분리하고 200ng/ml 줄기 세포 인자 및 20% 열 불활성화 혈청이 보충된 Iscove의 변형 Dulbecco 배지에서 배양한다. 외인성 단백질(들)을 인코딩하는 플라스미드 DNA는 0.8K에서 750K까지 다양한 크기의 분지형 또는 선형 PEI와 함께 배양된다(Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA; Fermetas, Hanover, Md., USA). PEI는 4.2 mg/mL 증류수에서 스톡 용액으로 제조되고 HCl을 사용하여 pH 5.0으로 약간 산성화된다. DNA 1μg이 3nmol 인산염을 포함하고 1μL의 PEI 스톡 용액이 10nmol 아민 질소를 포함한다는 계산에 기초하여 다양한 질소/인산염 비율로 실온에서 30분 동안 DNA를 PEI와 결합할 수 있다. 단리된 CD34+ 세포에 DNA/양이온성 복합체를 시딩하고, 280 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 외인성 단백질(들)의 발현이 평가될 때까지 배양 배지에서 4시간 이상 동안 인큐베이션한다.
플라스미드 벡터는 입자 매개 형질감염, "유전자 총(gene gun)", 생물학적 제제 또는 입자 충격 기술과 같은 물리적 방법을 사용하여 적합한 적혈구 전구 세포에 도입될 수 있다(Papapetrou, et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005). . 이때 외인성 단백질을 코딩하는 DNA는 금 입자에 흡수되어 입자총에 의해 세포에 투여된다. 이 접근법은 예를 들어 적혈구 전구 세포, 예를 들어 제대혈로부터 유래된 조혈 줄기 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Verma et al., Gene Therapy 5:692-699, 1998 참조). 이와 같이 제대혈을 분리하여 인산완충식염수에 3배 희석한다. CD34+ 세포는 2차 항체로 코팅된 자기 마이크로비드 및 자기 분리 시스템(예: Miltenyi MiniMac System, Auburn, CA, USA)과 함께 항-CD34 단일클론 항체를 사용하여 정제된다. CD34+ 농축 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다. 형질감염을 위해, 외인성 단백질(들)을 코딩하는 플라스미드 DNA는 염화칼슘 및 스페르미딘으로 처리하여 입자, 예를 들어 금 비드 상에 침전된다. DNA 코팅된 비드를 에탄올로 세척한 후, 비드를 예를 들어 Biolistic PDS-1000/He System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 배양된 세포로 전달할 수 있다. 예를 들어, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 루시퍼라제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 사용하여 형질감염의 효율을 평가할 수 있다.
선택적으로, 전기천공법을 사용하여 플라스미드 벡터를 적혈구 전구 세포에 도입할 수 있다. 전기천공법은 세포막에 일시적인 기공을 생성하여 예를 들어 DNA 및 RNA를 비롯한 다양한 분자를 세포에 도입할 수 있도록 한다. 이와 같이, CD34+ 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 단리되고 배양된다. 전기천공 직전에, 세포를 실온에서 250xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 분리하고 1.0% 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충된 X-VIVO 10과 같은 전기천공 완충액에서 0.2-10x106개 생존 세포/ml로 재현탁시켰다. 플라스미드 DNA(1-50μg)를 500μL의 세포 현탁액과 함께 적절한 전기천공 큐벳에 첨가한다.
전기천공은 예를 들어 200 V 내지 280 V 범위의 전압 및 25 내지 70 밀리초 범위의 펄스 길이를 갖는 ECM 600 전기천공기(Genetronics, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행될 수 있다. 다수의 대안적 전기천공 기구가 상업적으로 입수가능하고 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Gene Pulser Xcell™, BioRad, Hercules, CA; Cellject Duo, Thermo Science, Milford, MA). 대안적으로, 분리된 CD34+ 세포의 효율적인 전기천공은 다음 매개변수를 사용하여 수행할 수 있다: 4 mm 큐벳, 1600 μL, 550 V/cm, 및 1x105 세포/mL에서 세포 500 μL당 10 μg DNA(Oldak et al., Acta Biochim.Polonica 49:625-632, 2002).
전기천공의 한 형태인 뉴클레오펙션은 또한 적혈구 전구 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 이 경우, 형질감염은 DNA(또는 다른 시약)가 핵으로 직접 수송될 수 있도록 하는 세포 유형 특정 용액의 전기적 매개변수를 사용하여 수행되어 세포질에서 가능한 분해의 위험을 줄인다. 예를 들어, Human CD34 Cell Nucleofector™ Kit(Amaxa Inc.)를 사용하여 적혈구 전구 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이 경우, Human CD34 Cell Nucleofector™ 솔루션의 1-5x106 세포를 1-5 μg의 DNA와 혼합하고 제조업체가 결정한 사전 프로그래밍된 설정을 사용하여 Nucleofector™ 기기에서 형질감염시킨다.
적혈구 전구 세포는 게놈에 통합되지 않는 한 포유동물 세포에서 자가 복제할 수 없는 통상적인 발현 벡터로 비-바이러스 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 적혈구 전구 세포는 염색체로의 통합 없이 자율적으로 복제되는 유전자 단위로서 숙주 핵에서 지속될 수 있는 에피솜 벡터로 형질감염될 수 있다(Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130, 2005). 이러한 벡터는 예를 들어 EBV, 인간 폴리오마바이러스 BK, 소 유두종 바이러스-1(bovine papilloma virus-1, BPV-1), 단순 포진 바이러스-1(HSV), 및 유인원 바이러스 40(Simian virus 40, SV40). 포유동물 인공 염색체는 또한 비바이러스 유전자 전달을 위해 사용될 수 있다(Vanderbyl et al., Exp. Hematol. 33:1470-1476, 2005).
하나 이상의 외인성 단백질(들)을 코딩하는 외인성 핵산은 당업계에 공지된 표준 분자 생물학 방법, 예를 들어 제한 분해(restriction digestion), 중첩-신장 PCR(overlap-extension PCR) 및 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)에 의해 발현 벡터로 조립될 수 있다.
외인성 핵산은 예를 들어, 외인성 단백질이 세포 표면에서 발현되도록 내인성 또는 천연 막 단백질을 코딩하는 유전자에 융합된 탈핵 적혈구의 세포 표면에 정상적으로 존재하지 않는 외인성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 단백질을 암호화하는 외인성 유전자는 1형 막 단백질의 리더 서열 뒤의 N 말단, 2형 막 단백질의 C 말단, 또는 GPI 연결 막 단백질의 GPI 부착 부위의 상류에 복제될 수 있다.
표준 클로닝 방법을 사용하여 융합된 두 유전자 사이에 유연한 아미노산 링커(flexible amino acid linker)를 도입할 수 있다. 예를 들어, 가요성 링커는 전장 항체로부터 단일쇄 항체 단편을 생성하는 데 일반적으로 사용되는 [Gly4Ser]3(서열 번호 1) 또는 단일 사슬 Arc 억제인자를 생성하는 데 사용되는 것과 같은 Ala-Gly-Ser-Thr 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 가요성 링커는 가요성 링커가 없는 등가 구축물(equivalent construct)보다 더 많은 유연성 및 입체적 자유도를 갖는 외인성 단백질을 제공한다. 이러한 추가된 유연성은 표적, 예를 들어 항체 또는 단백질에 대한 결합 또는 활성 부위가 기질(예를 들어, 표적)에 접근할 수 있어야 하는 단백질의 효소 반응에 대한 결합을 필요로 하는 응용 분야에서 유용하다.
일부 실시예에서, 제공된 방법은 적혈구 전구 세포를 핵산과 접촉시키고 본 명세서에 기재된 것과 같은 핵산의 전달에 효과적인 조건 하에 전기천공에 의해 핵산을 도입함으로써 적혈구 전구 세포 내로 큰 핵산(특히 mRNA와 같은 RNA)의 전달을 포함한다. 적합한 전기천공기는 Bio-Rad GENE PULSER and GENE PULSER II; the Life Technologies NEON; BTX GEMINI system; and MAXCYTE 전기천공기를 포함하나 이제 한정되지는 않는다. 이러한 방법은 바이러스 전달이나 바이러스 벡터의 사용이 필요하지 않는다. 적합한 핵산은 mRNA와 같은 RNA를 포함한다. 적합한 핵산은 또한 전위 요소, 안정한 에피솜, 플라스미드 DNA 또는 선형 DNA를 포함하는 DNA를 포함한다.
세포주의 전기천공을 위한 조건은 문헌, 예를 들어 문헌 Van Tendeloo et al., Blood 98(l):49-56, 2001에 설명되어 있다. 본 명세서에 기술된 방법에 적합한 전기천공 조건은 Life Technologies Neon Transfection System에 대해 다음을 포함한다: 약 500 내지 약 2000V 범위의 펄스 전압, 800 내지 약 1800V, 또는 약 850 내지 약 1700V; 약 5 내지 약 50msec, 또는 약 10 내지 약 40msec 범위의 펄스 폭; 및 1 내지 2 펄스, 1 내지 3 펄스, 1 내지 4 펄스, 또는 1 내지 5 펄스 범위의 펄스 수.
예를 들어 4일 동안 적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건: a) 펄스 전압 1300-1400, 펄스 폭: 10-20 msec, 펄스 수: 1-3; b) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3; c) 펄스 전압 1400, 펄스 폭: 20 msec, 펄스 수: 1; 및 d) 펄스 전압 1300, 펄스 폭: 10 msec, 펄스 수: 3.
예를 들어 8-9일 동안 적혈구 전구 세포의 전기천공에 특히 적합한 조건: a) 펄스 전압: 1400-1600, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1 ; b) 펄스 전압: 1100-1300, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 1; c) 펄스 전압: 1000-1200, 펄스 폭: 40, 펄스 수: 1 ; d) 펄스 전압: 1100-1400, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 2; e) 펄스 전압: 950-1150, 펄스 폭: 30, 펄스 수: 2; f) 펄스 전압: 1300-1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이러한 조건은 일반적으로 약 60% 이상 (예를 들어, 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 형질감염 효율 및 약 70% 이상 (예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 세포 생존율을 초래한다.
분화 조건 하에 배양물에서 12-13일 동안 적혈구 전구 세포의 전기천공을 위한 특히 적합한 조건은 예를 들어 다음을 포함한다: a) 펄스 전압: 1500-1700, 펄스 폭: 20, 펄스 수: 1; 및 b) 펄스 전압: 1500-1600, 펄스 폭: 10, 펄스 수: 3. 이러한 조건은 일반적으로 약 50% 이상 (예를 들어, 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 형질감염 효율 및 약 70% 이상 (예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 약 97%, 또는 그 이상)의 세포 생존율을 초래한다.
Life Technologies Neon 시스템과 관련하여 여기에 개시된 조건은 일상적인 실험과 여기에 설명된 특정 전기천공기는 개시된 방법을 제한하지 않으며 다른 전기천공기 및/또는 다른 전기천공 설정에 맞게 당업자에 의해 쉽게 조정될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 전기천공 조건을 사용하여 배양된 적혈구 전구 세포를 처음으로 전기천공하고, 이어서 원하는 기간 동안 (임의로 분화 조건 하에) 배양한 다음, 두 번째로 재전기천공한다. 일부 실시예에서, 배양된 적혈구 전구 세포를 처음으로 전기천공한 다음, 원하는 기간 동안 (임의로 분화 조건 하에) 배양한 다음, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째로 재전기천공한다. 선택적으로, 첫 번째와 두 번째, 두 번째와 세 번째 등의 전기천공 사이의 배양 기간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 전기천공 사이의 기간은 원하는 대로 예를들면 30분, 1시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 12일, 13일 14일 또는 21일 조정할 수 있다. 예를 들어, 적혈구 전구 세포는 1일 및 2일, 1일 및 3일, 1일 및 4일, 1일 및 5일, 1일 및 6일, 1일 및 7일, 1일 및 8일, 1일 및 9일, 1일 및 10일, 1일 및 11일, 1일 및 12일, 1일 및 13일, 1일 및 14일, 1일 및 15일, 또는 1일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 다른 실시예에서, 세포는 2일 및 3일, 2일 및 4일, 2일 및 5일, 2일 및 6일, 2일 및 7일, 2일 및 8일, 2일 및 9일, 2일 및 10일, 2일 및 11일, 2일 및 12일, 2일 및 13일, 2일 및 14일, 2일 및 15일, 또는 2일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 3일 및 4일, 3일 및 5일, 3일 및 6일, 3일 및 7일, 3일 및 8일, 3일 및 9일, 3일 및 10일, 3일 및 11일, 3일 및 12일, 3일 및 13일, 3일 및 14일, 3일 및 15일, 또는 3일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 세포는 4일 및 5일, 4일 및 6일, 4일 및 7일, 4일 및 8일, 4일 및 9일, 4일 및 10일, 4일 및 11일, 4일 및 12일, 4일 및 13일, 4일 및 14일, 4일 및 15일, 또는 4일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 세포는 5일 및 6일, 5일 및 7일, 5일 및 8일, 5일 및 9일, 5일 및 10일, 5일 및 11일, 5일 및 12일, 5일 및 13일, 5일 및 14일, 5일 및 15일 또는 5일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 6일 및 7일, 6일 및 8일, 6일 및 9일, 6일 및 10일, 6일 및 11일, 6일 및 12일, 6일 및 13일, 6일 및 14일, 6일 및 15일 또는 6일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 7일 및 8일, 7일 및 9일, 7일 및 10일, 7일 및 11일, 7일 및 12일, 7일 및 13일, 7일 및 14일, 7일 및 15일, 또는 7일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 8일 및 9일, 8일 및 10일, 8일 및 11일, 8일 및 12일, 8일 및 13일, 8일 및 14일, 8일 및 15일, 또는 8일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 9일, 10일, 9일 및 11일, 9일 및 12일, 9일 및 13일, 9일 및 14일, 9일 및 15일, 또는 9일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 10일 및 11일, 10일 및 12일, 10일 및 13일, 10일 및 14일, 10일 및 15일, 또는 10일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 11일 및 12일, 11일 및 13일, 11일 및 14일, 11일 및 15일, 또는 11일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 12일 및 13일, 12일 및 14일, 12일 및 15일, 또는 12일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 13일 및 14일, 13일 및 15일, 또는 13일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 14일 및 15일, 또는 14일 및 16일에 전기천공될 수 있다. 선택적으로, 적혈구 전구 세포는 2회 이상, 예를 들어, 3회, 4회, 5회 또는 6회 전기천공될 수 있고 간격은 세포의 분화 과정의 임의의 지점에서 원하는 대로 선택될 수 있다.
일부 실시예에서는, 여기에 기재된 전기 천공 조건을 사용하여 배양된 적혈구 전구 세포가 분화의 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16일에 전기 천공된다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 클릭-접합된 조작된 탈핵 적혈구일 수 있다. 촉매적 결합-형성 폴리펩타이드 도메인은 세포질에 존재하거나 막 상에 존재하는, 예를 들어 적혈구 전구 세포 상에서 또는 내에서 발현될 수 있다. Streptococcus pyogenes에서 분리된 단백질인 Spy0128에서 파생된 것을 포함하여 트랜스펩티다제, 소르타제 및 이소펩티다제를 비롯한 많은 촉매 결합 형성 폴리펩티드가 존재한다. Spy0128의 자가촉매 이소펩티드 결합-형성 서브유닛(CnaB2 도메인)을 분할하면 서로에 대해 특이성을 갖는 촉매 활성을 유지하는 두 개의 별개의 폴리펩티드가 생성된다는 것이 입증되었다. 이 시스템의 폴리펩타이드를 SpyTag 및 SpyCatcher라고 한다. 혼합 시 SpyTag와 SpyCatcher는 SpyTag의 Aspl 17과 SpyCatcher의 Lys31 사이에 이소펩티드 결합이 형성된다(Zakeri and Howarth, JACS 132:4526, 2010). 반응은 세포 환경과 양립가능하고 단백질/펩티드 접합에 대해 매우 특이적이다(Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:E690-E697, 2012). SpyTag 및 SpyCatcher는 엘라스틴 유사 단백질에서 번역 후 토폴로지 변형을 지시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, N-말단에 SpyTag를 배치하고 C-말단에 SpyCatcher를 배치하면 원형 엘라스틴 유사 단백질이 형성된다(Zhang et al, J. Am. Chem. Soc. 2013).
구성 요소 SpyTag 및 SpyCatcher는 상호 교환되어 분자 A가 SpyTag에 융합되고 분자 B가 SpyCatcher에 융합되는 시스템이 분자 A가 SpyCatcher에 융합되고 분자 B가 SpyTag에 융합되는 시스템과 기능적으로 동일하다. 이 설명의 목적을 위해 SpyTag 및 SpyCatcher가 사용될 때 상보적인 분자가 그 자리에서 대체될 수 있음을 이해해야 한다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합 형성 폴리펩타이드를 사용하여 외인성 단백질을 예를 들어 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 세포의 표면에 부착할 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 세포의 세포외 표면에서 발현될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드는 예를 들어 유형-1 또는 유형-3 막횡단 단백질의 N 말단, 예를 들어, 유형-2 막횡단 단백질, 예를 들어 Kell의 C 말단에 융합된 글리코포린 A, 에 융합된 다중-통과 막횡단 단백질, 예를 들어 밴드 3의 세포외 말단 또는 세포외 루프에서 인-프레임 삽입 GPI-수용체 폴리펩티드, 예를 들어, 지질-사슬-고정된 폴리펩티드에 융합되거나 말초 막 단백질에 융합된 CD55 또는 CD59에 융합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 인코딩하는 핵산은 SpyTag 융합을 발현하는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 제핵 적혈구 세포로부터 발현 및 분비될 수 있다. 대안적으로, SpyCatcher 융합을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 박테리아, 진균, 곤충, 포유동물 또는 무세포 생산 시스템에서 외인성으로 생산될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 세포의 표면에 부착시키는 공유 결합이 형성될 것이다.
한 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 동일한 적혈구에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩타이드의 발현 시, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩타이드 사이에 이소펩타이드 결합이 형성되어 적혈구 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
또 다른 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구에서 Gatal 프로모터의 제어 하에 글리코포린 A의 N 말단에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 외인성 단백질은 적절한 포유동물 세포 발현 시스템, 예를 들어 HEK293 세포에서 발현될 수 있다. 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 상의 SpyTag 융합 폴리펩티드의 발현 시, SpyCatcher 융합 폴리펩티드는 세포와 접촉될 수 있다. 적절한 반응 조건에서 이소펩티드 결합은 SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 형성되어 적혈구 전구 세포 표면 또는 탈핵 적혈구 표면과 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
SpyTag/SpyCatcher 시스템과 같은 촉매 결합 형성 폴리펩타이드를 사용하여 외인성 단백질을 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에 고정할 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 트랜스진(transgene)의 직접 발현, 예를 들어, 헤모글로빈과 같은 내인성 세포내 단백질에 대한 융합, 세포내 융합을 비롯한 다수의 방법에 의해 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에서 발현될 수 있다. 내인성 세포 표면 단백질의 도메인, 예를 들어 밴드 3, 글리코포린 A, Kell, 또는 세포골격의 구조적 구성요소에 대한 융합. SpyTag 서열은 폴리펩타이드 말단에 제한되지 않으며 폴리펩타이드 번역 및 국재화가 교란되지 않도록 내인성 폴리펩타이드의 내부 서열 내에 통합될 수 있다. 외인성 단백질은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합을 인코딩하는 핵산 서열은 동일한 적혈구 전구 세포 또는 SpyTag 융합을 발현하는 탈핵 적혈구 내에서 발현될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응 시, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구의 세포내 공간에서 외인성 단백질을 고정시키는 역할을 하는 공유 결합이 형성될 것이다.
한 실시예에서, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 세포내에서 헤모글로빈 베타에 융합된 SpyTag를 발현할 수 있다. 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 해독시 세포내 베타 글로빈이 C 말단에서 SpyTag에 융합되도록 헤모글로빈 프로모터, 베타 글로빈 유전자, 및 SpyTag 서열을 포함하는 유전자 서열로 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 번역 시 세포내 단백질(예를 들어, PAH)이 N 말단에서 SpyCatcher에 융합되도록 SpyCatcher 구동 단백질 발현 (예를 들어, 페닐알라닌 수산화효소(phenylalanine hydroxylase, PAH) 발현)을 코딩하는 Gatal 프로모터 주도 유전자를 발현한다. 두 융합 단백질의 발현 시 SpyTag 결합 베타 글로빈은 세포 내 공간에서 이소펩티드 결합을 통해 SpyCatcher 결합 단백질(예를 들어, PAH)에 연결되어 단백질(예를 들어, PAH)이 베타 글로빈에 고정되고 성숙 동안 유지되도록 한다.
또 다른 실시예에서, SpyTag 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내의 외인성 단백질에 대한 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드는 동일한 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구 내에서 글리코포린 A의 C 말단(세포내)에 대한 융합으로 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드의 발현 시, 이소펩티드 결합이 SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 형성되어 막 고정된 내인성 적혈구계 폴리펩티드와 외인성 단백질 사이에 공유 결합을 형성한다.
다른 분자 융합은 폴리펩티드 사이에 형성될 수 있으며 직접 또는 간접 접합을 포함한다. 폴리펩타이드는 서로 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 링커는 펩타이드, 폴리머, 앱타머 또는 핵산일 수 있다. 중합체는 예를 들어 천연, 합성, 선형 또는 분지형일 수 있다. 외인성 단백질은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이종 융합 단백질을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 서로 직접 연결된 또는 개재 링커 서열 및/또는 한쪽 또는 양쪽 말단에 추가 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 링커에 대한 접합은 공유 결합 또는 이온 결합을 통해 이루어질 수 있다.
일부 실시예에서, 조작된 탈핵 적혈구는 저장성 로딩된 인간 탈핵 적혈구다. 저장성 로딩/용해의 경우 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구가 낮은 이온 강도 완충액에 노출되어 파열된다. 외인성 단백질은 세포 내에 분포한다. 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포는 분리된 탈핵 적혈구의 펠릿에 30-50배 부피 과량의 5mM 인산염 완충액(pH 8)을 첨가하여 저장성 용해될 수 있다. 생성된 용해된 세포막은 원심분리에 의해 분리된다. 용해된 세포막의 펠릿을 재현탁하고 외인성 단백질의 존재하에 낮은 이온 강도 완충액에서 예를 들어 30분 동안 인큐베이션한다. 대안적으로, 용해된 세포막은 탈핵 적혈구 또는 적혈구 전구 세포를 효율적으로 로딩하기 위해 결정된 최상의 조건에 따라 1분만큼 적게 또는 길게는 며칠 동안 외인성 단백질과 함께 인큐베이션될 수 있다. 하나 이상의 외인성 단백질(들) (예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 예시적인 외인성 단백질)을 코딩하는 핵산의 저장성 로딩을 위해, 핵산은 저장성 Tris-HCl 용액(pH 7.0)에 현탁되어 적혈구 전구 세포에 주입될 수 있다. Tris-HCl의 농도는 탈핵 적혈구를 효율적으로 로딩하기 위해 결정된 최상의 조건에 따라 약 20mmol/l 내지 약 150mmol/l일 수 있다.
대안적으로, 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구는 세포를 팽창시키고 세포막에 기공을 생성하기 위해 저장성 용액에 대한 조절된 투석을 사용하여 외인성 단백질로 로딩될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,327,710; 5,753,221; 6,495,351 및 10,046,009참조). 예를 들어, 세포 펠렛을 10mM HEPES, 140mM NaCl, 5mM 포도당 pH 7.4에 재현탁하고 10mM NaH2PO4, 10mM NaHCO3, 20mM 포도당 및 4mM MgCl2, pH7.4 를 함유하는 낮은 이온 강도 완충액에 대해 투석한다. 30-60분 후, 세포는 추가 30-60분 동안 외인성 단백질을 함유하는 16mM NaH2PO4, pH 7.4 용액에 대해 추가로 투석된다. 이러한 모든 절차는 4 °C의 온도에서 유리하게 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 투석 접근법에 의해 다량의 적혈구 전구 세포 또는 탈핵 적혈구를 로딩하는 것이 유리할 수 있고 이러한 목적을 위해 설계된 특정 장치가 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 4,327,710, 6,139,836 및 6,495,351).
완충액(Buffer)
본 명세서에 기재된 제제는 완충액(예를 들어, 하나 이상의 완충액)(예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 예시적 완충액 중 임의의 것)를 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 제형에 존재할 수 있는 완충액(예를 들어, 하나 이상의 완충액)의 비제한적 예는 Good's 완충액일 수 있다. Good's 버퍼의 비제한적 예는 다음과 같다: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) (HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)(MOPS), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일] 아미노] 에탄설폰산(2-[[1,3-dihydoxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]ethanesulfonic acid)(TES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)(MES), 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카르복시메틸)아미노] 아세트산(2-[(2-amino-2-oxoethyl)-(carboxymethyl)amino]acetic acid)(ADA), N-(2- 아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산(N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid)(ACES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(N,N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid)(BES), 2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산(2-(bis(2-hydroxyethyl)amino)acetic acid)(Bicine), N-사이클로헥실 -3-아미노프로판술폰산(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)(CAPS), N-시클로헥실-2-히드록실-3-아미노프로판술폰산 (N-cyclohexyl-2-hydroxyl- 3-aminopropanesulfonic acid) (CAPSO), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid)(CHES), 피페라진-N, N-비스(2-에탄술폰산) (piperazine-N,N´-bis(2-ethanesulfonic acid)) (PIPES), [트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판술폰산 ([tris(hydroxymethyl) methylamino]propanesulfonic acid)(TAPS), 및 2-아미노-2-(히드록시메틸) 프로판-1,3-디올(2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol)(Tris). 본 명세서에 기재된 임의의 제제에 존재할 수 있는 완충액의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 완충액의 최종 농도(또는 하나 이상의 완충액의 최종 총 농도)는, 예를 들어, 약 0.1mM 내지 약 100mM, 약 0.1mM 내지 약 95mM, 약 0.1mM 내지 약 90mM, 약 0.1mM 내지 약 85mM, 약 0.1mM 내지 약 80mM, 약 0.1mM 내지 약 75mM, 약 0.1mM 내지 약 70mM, 약 0.1mM 내지 약 65mM, 약 0.1mM 내지 약 60mM, 0.1mM 내지 약 55mM, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 45mM, 약 0.1mM 약 40mM, 약 0.1mM 내지 약 35mM, 약 0.1mM 내지 약 30mM, 약 0.1mM 내지 약 25mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 0.1mM 내지 약 15mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 5.0mM, 약 0.1mM 내지 약 2.0mM, 약 0.1mM 내지 약 1.0mM, 약 1.0mM 내지 약 100mM, 약 1.0mM 내지 약 95mM, 약 1.0mM 내지 약 90mM , 약 1.0mM 내지 약 85mM, 약 1.0mM 내지 약 80mM, 약 1.0mM 내지 약 75mM, 약 1.0mM 내지 약 70mM, 약 1.0mM 내지 약 65mM, 약 1.0mM 내지 약 60mM, 1.0 mM 내지 약 55mM, 약 1.0mM 내지 약 50mM, 약 1.0mM 내지 약 45mM, 약 1.0mM 내지 약 40mM, 약 1.0mM 내지 약 35mM, 약 1.0mM 내지 약 30mM, 약 1.0mM 내지 약 25mM, 약 1.0mM 내지 약 20mM, 약 1.0mM 내지 약 15mM, 약 1.0mM 내지 약 10mM, 약 1.0mM 내지 약 5.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.0mM, 약 5.0mM 내지 약 100mM, 약 5.0mM 내지 약 95mM, 약 5.0mM 내지 약 90mM, 약 5.0mM 내지 약 85mM , 약 5.0mM 내지 약 80mM, 약 5.0mM 내지 약 75mM, 약 5.0mM 내지 약 70mM, 약 5.0mM 내지 약 65mM, 약 5.0mM 내지 약 60mM, 약 5.0mM 내지 약 55mM, 약 5.0mM 내지 약 50mM, 약 5.0mM 내지 약 45mM, 약 5.0mM 내지 약 40mM, 약 5.0mM 내지 약 35mM, 약 5.0mM 내지 약 30mM, 약 5.0mM 내지 약 25mM, 약 5.0mM 약 20mM 내지 약 5.0mM 내지 약 15mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 95mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 85mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 70mM, 약 10mM 내지 약 65mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 55mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 45mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10 mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 100mM, 약 15mM 내지 약 95mM, 약 15mM 내지 약 90mM, 약 15mM 내지 약 85mM, 약 15mM 내지 약 80mM, 약 15mM 내지 약 75mM, 약 15mM 내지 약 70mM, 약 15mM 내지 약 65 mM, 약 15mM 내지 약 60mM, 약 15mM 내지 약 55mM, 약 15mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 45mM, 약 15mM 내지 약 40mM, 약 15mM 내지 약 35mM, 약 15mM 내지 약 30mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 95mM, 약 20mM 내지 약 90mM, 약 20 mM 내지 약 85mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 70mM, 약 20mM 내지 약 65mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 55mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 45mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 35mM mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 20mM 내지 약 25mM일 수 있다.
포스페이트 이온(Phosphate Ion)
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 포스페이트 이온의 최종 농도는 예를 들어, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 45mM, 약 0.1mM 내지 약 40mM, 약 0.1mM 내지 약 35mM, 약 0.1mM 내지 약 30mM, 약 0.1mM 내지 약 25mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 0.1mM 내지 약 15mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 5.0mM, 약 0.1mM 내지 약 2.0mM, 약 0.1mM 내지 약 1.0mM, 약 1.0mM 내지 약 50mM, 약 1.0mM 내지 약 45mM, 약 1.0mM 내지 약 40mM, 약 1.0mM 내지 약 35mM , 약 1.0mM 내지 약 30mM, 약 1.0mM 내지 약 25mM, 약 1.0mM 내지 약 20mM, 약 1.0mM 내지 약 15mM, 약 1.0mM 내지 약 10mM, 약 1.0mM 내지 약 5.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.0mM, 약 5.0mM 내지 약 50mM, 약 5.0mM 내지 약 45mM, 약 5.0mM 내지 약 40mM, 약 5.0mM 내지 약 35mM, 약 5.0mM 내지 약 30mM, 약 5.0mM 내지 약 25mM, 약 5.0m M 내지 약 20mM, 약 5.0mM 내지 약 15mM, 약 5.0mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 45mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 45mM mM, 약 15mM 내지 약 40mM, 약 15mM 내지 약 35mM, 약 15mM 내지 약 30mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 45mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 35mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 20mM 내지 약 25mM, 약 25mM 내지 약 50mM, 약 25 mM 내지 약 45mM, 약 25mM 내지 약 40mM, 약 25mM 내지 약 35mM, 약 25mM 내지 약 30mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 45mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 35mM, 약 35mM 내지 약 50mM, 약 35mM 내지 약 45mM, 약 35mM 내지 약 40mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 45mM, 또는 약 45mM 내지 약 50mM일 수 있다.
일부 실시예에서, 인산 이온은 인산일나트륨(monosodium phosphate), 인산이나트륨(disodium phosphate), 인산일칼슘(monocalcium phosphate), 인산이칼슘(dicalcium phosphate), 삼인산오칼륨(pentapotassium triphosphate), 삼인산오나트륨(pentasodium triphosphate), 인산마그네슘(magnesium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 또는 인산암모늄(ammonium phosphate)으로서 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 존재한다. 추가의 약학적으로 허용되는 인산 이온 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
칼륨 이온(Potassium Ion)
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 칼륨 이온의 최종 농도는 예를 들어, 약 0.1mM 내지 약 100mM, 약 0.1mM 내지 약 95mM, 약 0.1mM 내지 약 90mM, 약 0.1mM 내지 약 85mM, 약 0.1mM 내지 약 80mM, 약 0.1mM 내지 약 75mM, 약 0.1mM 내지 약 70mM, 약 0.1mM 내지 약 65mM, 약 0.1mM 내지 약 60mM, 약 0.1mM 내지 약 55mM, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 45mM, 약 0.1mM 내지 약 40mM, 약 0.1mM 내지 약 35mM, 약 0.1mM 내지 약 30mM, 약 0.1mM 내지 약 25mM , 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 0.1mM 내지 약 15mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 100mM, 약 5mM 내지 약 95mM, 약 5mM 내지 약 90mM, 약 5mM 내지 약 85mM, 약 5mM 내지 약 80mM, 약 5mM 내지 약 75mM, 약 5mM 내지 약 70mM, 약 5mM 내지 약 65mM, 약 5mM 내지 약 60mM, 약 5mM 내지 약 55mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 45mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 35mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 5mM 내지 약 25mM, 약 5mM 약 20mM, 약 5mM 내지 약 15mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 95mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 85mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 75mM, 약 10mM 내지 약 70mM, 약 10mM 내지 약 65mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 55mM , 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 45mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 100mM, 약 15mM 내지 약 95mM, 약 15mM 내지 약 90mM, 약 15mM 내지 약 85mM, 약 15mM 내지 약 80mM, 약 15mM 내지 약 75mM, 약 15mM 내지 약 70mM, 약 15mM 내지 약 65mM, 약 15mM 내지 약 60mM, 약 15mM 내지 약 55mM, 약 15mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 45mM, 약 15mM 내지 약 40mM, 약 15mM 내지 약 35mM, 약 15mM 내지 약 30mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 95mM, 약 20mM 내지 약 90mM, 약 20mM 내지 약 85mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 75mM, 약 20mM 내지 약 70mM, 약 20mM 내지 약 65mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 55mM, 약 20mM 내지 약 50mM , 약 20mM 내지 약 45mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 35mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 20mM 내지 약 25mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 95mM, 약 30mM 내지 약 90mM, 약 30mM 내지 약 85mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 30mM 내지 약 75mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 65mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 55mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 45mM mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 35mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 95mM, 약 40mM 내지 약 90mM, 약 40mM 내지 약 85mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 75mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 65mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 55mM, 약 40 mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 45mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 95mM, 약 50mM 내지 약 90mM, 약 50mM 내지 약 85mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 50mM 내지 약 55mM, 약 60mM 내지 약 100 mM, 약 60mM 내지 약 95mM, 약 60mM 내지 약 90mM, 약 60mM 내지 약 85mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 75mM, 약 60mM 내지 약 70mM, 약 60mM 내지 약 65mM, 약 70mM 내지 약 100mM, 약 70mM 내지 약 95mM, 약 70mM 내지 약 90mM, 약 70mM 내지 약 85mM, 약 70mM 내지 약 80mM, 약 70mM 내지 약 75mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 95mM, 약 80mM 내지 약 90mM, 약 80mM 내지 약 85mM, 약 90mM 내지 약 100mM, 또는 약 90mM 내지 약 95mM일 수 있다.
일부 실시예에서, 칼륨 이온은 염화칼륨, 중황산칼륨, 탄산칼륨, 불화칼륨, 요오드화칼륨, 질산칼륨, 포스페이트칼륨 또는 황산칼륨으로서 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 용액에 존재한다. 칼륨 이온의 추가적인 약학적으로 허용되는 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
칼슘 이온
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 칼슘 이온의 최종 농도는 예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 20mM, 약 0.01mM 내지 약 19mM, 약 0.01mM 내지 약 18mM, 약 0.01mM 내지 약 17mM 내지 약 0.01mM 내지 약 16mM, 약 0.01mM 내지 약 15mM, 약 0.01mM 내지 약 14mM, 약 0.01mM 내지 약 13mM, 약 0.01mM 내지 약 12mM, 약 0.01mM 내지 약 11mM, 약 0.01mM 내지 약 10mM, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 약 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM , 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.05mM, 약 0.05mM 내지 약 20mM, 약 0.05mM 내지 약 19mM, 약 0.05mM 내지 약 18mM, 약 0.05mM 내지 약 17mM, 약 0.05mM 내지 약 16mM, 약 0.05mM 내지 약 15mM, 약 0.05mM 약 14 mM, 약 0.05mM 내지 약 13mM, 약 0.05mM 내지 약 12mM, 약 0.05mM 내지 약 11mM, 약 0.05mM 내지 약 10mM, 약 0.05mM 내지 약 9mM, 약 0.05mM 내지 약 8mM, 약 0.05mM 내지 약 7mM, 약 0.05mM 내지 약 6mM, 약 0.05mM 내지 약 5mM, 약 0.05mM 내지 약 4mM, 약 0.05mM 내지 약 3mM, 약 0.05mM 내지 약 2mM, 약 0.05 mM 내지 약 1mM, 약 0.05mM 내지 약 0.5mM, 약 0.05mM 내지 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 0.1mM 내지 약 19mM, 약 0.1mM 내지 약 18mM, 약 0.1mM 내지 약 0.1mM 약 17mM, 약 0.1mM 내지 약 16mM, 약 0.1mM 내지 약 15mM, 약 0.1mM 내지 약 14mM, 약 0.1mM 내지 약 13mM, 약 0.1mM 내지 약 12mM, 약 0.1mM 내지 약 11mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1 mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 0.5mM, 약 0.5mM 내지 약 20mM, 약 0.5mM 내지 약 19mM, 약 0.5mM 내지 약 18mM, 약 0.5mM 내지 약 17mM, 약 0.5mM 내지 약 16mM, 약 0.5mM 내지 약 15mM, 약 0.5mM 내지 약 14mM, 약 0.5mM 내지 약 13mM, 약 0.5mM 내지 약 12mM, 약 0.5mM 내지 약 11mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 9mM, 약 0.5mM 내지 약 8mM, 약 0.5mM 내지 약 7mM, 약 0.5mM 내지 약 6mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 4mM, 약 0.5mM 내지 약 3mM, 약 0.5mM 내지 약 2mM, 약 0.5mM 내지 약 1.0mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 19mM, 약 1mM 내지 약 18mM, 약 1 mM 내지 약 17mM, 약 1mM 내지 약 16mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 1mM 내지 약 14mM, 약 1mM 내지 약 13mM, 약 1mM 내지 약 12mM, 약 1mM 내지 약 11mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM, 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 20mM, 약 2mM 내지 약 19mM, 약 2mM 내지 약 18mM, 약 2mM 내지 약 17mM, 약 2mM 내지 약 16mM, 약 2mM 내지 약 15mM, 약 2mM 내지 약 14mM, 약 2mM 내지 약 13mM, 약 2mM 내지 약 12mM, 약 2mM 내지 약 11mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7 mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 20mM, 약 3mM 내지 약 19mM, 약 3mM 내지 약 18mM, 약 3mM 내지 약 17mM, 약 3mM 내지 약 16mM, 약 3mM 내지 약 15mM, 약 3mM 내지 약 14mM, 약 3mM 내지 약 13mM, 약 3mM 내지 약 12mM, 약 3mM 내지 약 11mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약6mM, 약 3mM 내지 약 5mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 20mM, 약 4mM 내지 약 19mM, 약 4mM 내지 약 18mM, 약 4mM 내지 약 17mM , 약 4mM 내지 약 16mM, 약 4mM 내지 약 15mM, 약 4mM 내지 약 14mM, 약 4mM 내지 약 13mM, 약 4mM 내지 약 12mM, 약 4mM 내지 약 11mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 19mM, 약 5mM 내지 약 18mM, 약 5mM 내지 약 17mM, 약 5mM 내지 약 16mM, 약 5mM 내지 약 15mM, 약 5mM 내지 약 14mM, 약 5mM 내지 약 13mM, 약 5mM 내지 약 12mM, 약 5mM 내지 약 11mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM , 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 20mM, 약 6mM 내지 약 19mM, 약 6mM 내지 약 18mM, 약 6mM 내지 약 17mM, 약 6mM 내지 약 16mM, 약 6mM 내지 약 15mM, 약 6mM 내지 약 14mM, 약 6mM 내지 약 13mM, 약 6mM 내지 약 12mM, 약 6mM 내지 약 11mM , 약 6mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 20mM, 약 7mM 내지 약 19mM, 약 7mM 내지 약 18mM, 약 7mM 내지 약 17mM, 약 7mM 내지 약 16mM, 약 7mM 내지 약 15mM, 약 7mM 내지 약 14mM, 약 7mM 내지 약 13mM, 약 7mM 약 12mM 내지 약 7mM 내지 약 11mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 20mM, 약 8mM 내지 약 19mM, 약 8mM 내지 약 18mM, 약 8mM 내지 약 17mM, 약 8mM 내지 약 16mM, 약 8mM 내지 약 15mM, 약 8mM 내지 약 14mM, 약 8mM 내지 약 13mM, 약 8mM 내지 약 12mM, 약 8mM 내지 약 11mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 약 9mM 내지 약 20mM, 약 9mM 내지 약 19mM, 약 9mM 내지 약 18mM, 약 9mM 내지 약 17mM, 약 9mM 내지 약 16mM, 약 9mM 내지 약 15mM, 약 9mM 내지 약 14mM, 약 9mM 내지 약 13mM, 약 9mM 내지 약 12mM, 약 9mM 내지 약 11mM, 약 9mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 19mM, 약 10mM 내지 약 18mM, 약 10mM 내지 약 17mM, 약 10mM 내지 약 16mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 10mM 내지 약 14mM, 약 10mM 내지 약 13mM, 약 10mM 내지 약 12mM, 약 10mM 내지 약 11 mM, 약 11mM 내지 약 20mM, 약 11mM 내지 약 19mM, 약 11mM 내지 약 18mM, 약 11mM 내지 약 17mM, 약 11mM 내지 약 16mM, 약 11mM 내지 약 15mM, 약 11mM 내지 약 14mM, 약 11mM 내지 약 13mM, 약 11mM 내지 약 12mM, 약 12mM 내지 약 20mM, 약 12mM 내지 약 19mM, 약 12mM 내지 약 18mM, 약 12mM 내지 약 17mM, 약 12mM 내지 약 16mM, 약 12mM 내지 약 15mM, 약 12mM 내지 약 14mM, 약 12mM 내지 약 13mM, 약 13mM 내지 약 20mM, 약 13mM 내지 약 19mM, 약 13mM 내지 약 18mM, 약 13mM 내지 약 17mM, 약 13mM 내지 약 16mM, 약 13mM 내지 약 15mM, 약 13mM 내지 약 14mM, 약 14mM 내지 약 20mM, 약 14mM 내지 약 19mM, 약 14mM 내지 약 18mM, 약 14mM 내지 약 17mM, 약 14mM 내지 약 16mM, 약 14mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 19mM, 약 15mM 내지 약 18mM, 약 15mM 내지 약 17mM, 약 15mM 내지 약 16mM, 약 16mM 내지 약 20mM, 약 16mM 내지 약 19mM, 약 16mM 내지 약 18mM, 약 16mM 내지 약 17mM, 약 17mM 내지 약 20mM, 약 17mM 내지 약 19mM, 약 17mM 내지 약 18mM, 약 18mM 내지 약 20mM, 약 18mM 내지 약 19mM, 또는 약 19mM 내지 약 20mM일 수 있다.
일부 실시예에서, 칼슘 이온은 염화칼슘, 탄산칼슘, 요오드화칼슘, 황산칼슘, 포스페이트칼슘 또는 아질산칼슘으로서 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용가능한 용액에 존재한다. 칼슘 이온의 추가적인 약학적으로 허용가능한 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
마그네슘 이온
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 마그네슘 이온의 최종 농도는 예를 들어, 약 0.1mM 내지 약 50mM, 약 0.1mM 내지 약 45mM, 약 0.1mM 내지 약 40mM, 약 0.1mM 내지 약 35mM, 약 0.1mM 내지 약 30mM, 약 0.1mM 내지 약 25mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 0.1mM 내지 약 15mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 0.5mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 45mM, 약 0.5mM 내지 약 40mM, 약 0.5mM 내지 약 35mM , 약 0.5mM 내지 약 30mM, 약 0.5mM 내지 약 25mM, 약 0.5mM 내지 약 20mM, 약 0.5mM 내지 약 15mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 45mM, 약 1mM 내지 약 40mM, 약 1mM 내지 약 35mM, 약 1mM 내지 약 30mM, 약 1mM 약 25mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약1mM 내지 약 15mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 45mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 35mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 5mM 내지 약 25mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 15mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 45mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 45mM, 약 15mM 내지 약 40mM, 약 15mM 내지 약 35mM, 약 15mM 내지 약 30mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 45mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 35mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 20mM 내지 약 25mM, 약 25mM 내지 약 50mM, 약 25mM 내지 약 45mM, 약 25mM 내지 약 40mM, 약 25mM 내지 약 35mM, 약 25mM 내지 약 30mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 45mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 35mM, 약 35mM 내지 약 50mM, 약 35mM 내지 약 45mM, 약 35mM 내지 약 40mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 45mM, 또는 약 45mM 내지 약 50mM일 수 있다.
일부 실시예에서, 마그네슘 이온은 염화마그네슘, 브롬화마그네슘, 불화마그네슘, 요오드화마그네슘 또는 황산마그네슘으로서 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 용액에 존재한다. 마그네슘 이온의 약학적으로 허용되는 공급원의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
비이온성 세포 불침투제
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 비이온성 세포 불침투제의 최종 농도는 예를 들어, 약 5mM 내지 약 100mM, 약 5mM 내지 약 90mM, 약 5mM 내지 약 80mM, 약 5mM 내지 약 70mM, 약 5mM 내지 약 60mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 100mM, 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 70mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 90mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 70mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 30mM 내지 약 100mM , 약 30mM 내지 약 90mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 90mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 90mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 60mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 90mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 70mM , 약 70mM 내지 약 100mM, 약 70mM 내지 약 90mM, 약 70mM 내지 약 80mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 90mM, 또는 약 90mM 내지 약 100mM일 수 있다.
비이온성 세포 불침투제의 비제한적인 예는 만니톨, 라피노스, 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 글루코네이트, 및 PEG(예를 들어, 분자량이 1kDa 초과, 5kDa 초과, 또는 15kDa, 예를 들어, PEG 20kDa)를 포함한다. 비이온성 세포 불침투제의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
글루코스
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 0.1mM 미만의 글루코스, 예를 들어, 0.09mM 미만, 0.08mM 미만, 0.07mM 미만, 0.06mM 미만, 0.05mM 미만, 0.04mM 미만, 0.03mM 미만, 0.02mM 미만, 0.01mM 미만, 0.009mM 미만, 0.008mM 미만, 0.007mM 미만, 0.006mM 미만, 0.005mM 미만, 0.004mM 미만, 0.003mM 미만, 0.002mM 미만, 또는 0.001mM 미만의 글루코스를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 글루코스를 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 검출가능한 글루코스를 포함하지 않는다.
음이온성 세포 불침투제
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 음이온성 세포 불침투제를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 음이온성 세포 불침투제의 최종 농도는 예를 들어 약 1mM 내지 약 150mM, 약 1mM 내지 약 140mM, 약 1mM 내지 약 130mM, 약 1mM 내지 약 130mM, 약1mM 내지 약 120mM, 약 1mM 내지 약 110mM, 약 1mM 내지 약 100mM, 약 1mM 내지 약 90mM, 약 1mM 내지 약 80mM, 약 1mM 내지 약 70mM, 약 1mM 약 60mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 40mM, 약 1mM 내지 약 30mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 150mM, 약 5mM 내지 약 140mM, 약 5mM 내지 약 130mM, 약 5mM 내지 약 120mM, 약 5mM 내지 약 110mM, 약 5mM 내지 약 100mM , 약 5mM 내지 약 90mM, 약 5mM 내지 약 80mM, 약 5mM 내지 약 70mM, 약 5mM 내지 약 60mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 150mM, 약 10mM 내지 약 140mM, 약 10mM 내지 약 130mM, 약 10mM 내지 약 120mM, 약 10mM 내지 약 110mM, 약 10mM 내지 약 100mM , 약 10mM 내지 약 90mM, 약 10mM 내지 약 80mM, 약 10mM 내지 약 70mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 150mM, 약 20mM 내지 약 140mM, 약 20mM 내지 약 130mM, 약 20mM 내지 약 120mM, 약 20mM 내지 약 110mM, 약 20mM 내지 약 100mM, 약 20mM 내지 약 90mM, 약 20mM 내지 약 80mM, 약 20mM 내지 약 70mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 30mM 내지 약 150mM, 약 30mM 내지 약 140mM, 약 30mM 내지 약 130mM, 약 30mM 내지 약 120mM , 약 30mM 내지 약 110mM, 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 90mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 40mM 내지 약 150mM, 약 40mM 내지 약 140mM , 약 40mM 내지 약 130mM, 약 40mM 내지 약 120mM, 약 40mM 내지 약 110mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 90mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 50mM 내지 약 150mM, 약 50mM 내지 약 140mM, 약 50mM 내지 약 130mM, 약 50mM 내지 약 120mM, 약 50mM 내지 약 110mM, 약 50mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 90mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 60mM 내지 약 150mM, 약 60mM 내지 약 140mM, 약 60mM 내지 약 130mM, 약 60mM 내지 약 120mM, 약 60mM 내지 약 110mM, 약 60mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 90mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 70mM, 약 70mM 내지 약 150 mM, 약 70mM 내지 약 140mM, 약 70mM 내지 약 130mM, 약 70mM 내지 약 120mM, 약 70mM 내지 약 110mM, 약 70mM 내지 약 100mM, 약 70mM 내지 약 90mM, 약 70mM 내지 약 80mM, 약 80mM 내지 약 150mM, 약 80mM 내지 약 140mM, 약 80mM 내지 약 130mM, 약 80mM 내지 약 120mM, 약 80mM 내지 약 110mM, 약 80mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 90mM, 약 90mM 내지 약 150mM, 약 90mM 내지 약 140mM, 약 90mM 내지 약 130mM, 약 90mM 내지 약 120mM, 약 90mM 내지 약 110mM, 약 90mM 내지 약 100mM, 약 100mM 내지 약 150mM, 약 100mM 내지 약 140mM, 약 100mM 내지 약 130mM, 약 100mM 내지 약 120mM, 약 100mM 내지 약 110 mM, 약 110mM 내지 약 150mM, 약 110mM 내지 약 140mM, 약 110mM 내지 약 130mM, 약 110mM 내지 약 120mM, 약 120mM 내지 약 150mM, 약 120mM 내지 약 140mM, 약 120mM 내지 약 130mM, 약 130mM 내지 약 150mM, 약 130mM 내지 약 140mM 또는 약 140mM 내지 약 150mM일 수 있다.
음이온성 세포 불침투제의 비제한적인 예는 락토비오네이트, 시트레이트 및 글루코네이트를 포함한다. 음이온성 세포 불침투제의 추가 예는 당업계에 공지되어 있다.
염화 이온
본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 클로라이드 이온의 최종 농도는 예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 60mM, 약 0.5mM 내지 약 55mM, 약 0.5mM 내지 약 50mM, 약 0.5mM 내지 약 45mM, 약 0.5mM 내지 약 40mM, 약 0.5mM 내지 약 35mM, 약 0.5mM 내지 약 30mM, 약 0.5mM 내지 약 25mM, 약 0.5mM 내지 약 20mM, 약 0.5mM 내지 약 15mM, 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 60mM, 약 1mM 내지 약 55mM, 약 1mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 45mM, 약 1mM 내지 약 40mM, 약 1mM 내지 약 35mM, 약 1mM 내지 약 30mM, 약 1mM 내지 약 25mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 15mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 60mM, 약 5mM 내지 약 55mM, 약 5mM 내지 약 50mM, 약 5mM 내지 약 45mM, 약 5mM 내지 약 40mM, 약 5mM 내지 약 35mM, 약 5mM 내지 약 30mM, 약 5mM 내지 약 25mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 15mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 60mM, 약 10 mM 내지 약 55mM, 약 10mM 내지 약 50mM, 약 10mM 내지 약 45mM, 약 10mM 내지 약 40mM, 약 10mM 내지 약 35mM, 약 10mM 내지 약 30mM, 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 15mM, 약 15mM 내지 약 60mM, 약 15mM 내지 약 55mM, 약 15mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 45m mM, 약 15mM 내지 약 40mM, 약 15mM 내지 약 35mM, 약 15mM 내지 약 30mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 20mM 내지 약 60mM, 약 20mM 내지 약 55mM, 약 20mM 내지 약 50mM, 약 20mM 내지 약 45mM, 약 20mM 내지 약 40mM, 약 20mM 내지 약 35mM, 약 20mM 내지 약 30mM, 약 20 mM 내지 약 25mM, 약 25mM 내지 약 60mM, 약 25mM 내지 약 55mM, 약 25mM 내지 약 50mM, 약 25mM 내지 약 45m M, 약 25mM 내지 약 40mM, 약 25mM 내지 약 35mM, 약 25mM 내지 약 30mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 55mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 45mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 35mM, 약 35mM 내지 약 60mM, 약 35mM 내지 약 55mM, 약 35mM 내지 약 50mM, 약 35 mM 내지 약 45mM, 약 35mM 내지 약 40mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 55mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 45mM, 약 45mM 내지 약 60mM, 약 45mM 내지 약 55mM, 약 45mM 내지 약 50mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 50mM 내지 약 55mM, 또는 약 55mM 내지 약 60mM일 수 있다. 염화 이온의 비제한적인 공급원은 상이한 염화 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘을 포함한다. 염화 이온의 추가적인 약학적으로 허용되는 공급원은 당업계에 공지되어 있다. 일부 예에서, 염화 이온은 조성물에 존재하는 하나 이상의 다른 음이온에 대한 반대이온으로서 조성물에 존재할 수 있다.
핵염기(Nucleobase)
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM , 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM , 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM)의 핵염기를 더 포함할 수 있다. 핵염기의 비제한적인 예는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 하이포잔틴 및 우라실을 포함한다.
뉴클레오사이드
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM , 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM , 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM)의 뉴클레오사이드를 더 포함할 수 있다. 뉴클레오사이드의 비제한적인 예는 아데노신, 이노신, 시티딘, 우리딘, 구아노신 및 티미딘을 포함한다.
뉴클레오티드
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM , 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM , 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM)의 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 아데노신 모노포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 트리포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 구아노신 디포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 시티딘 모노포스페이트, 시티딘 디포스페이트, 시티딘 트리포스페이트, 티미딘 모노포스페이트, 티미딘 디포스페이트, 티미딘 트리포스페이트, 우리딘 디포스페이트, 우리딘 삼포스페이트를 포함한다.
중탄산염 이온(Bicarbonate Ion)
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01mM 내지 약 20mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 18mM, 약 0.01mM 내지 약 16mM, 약 0.01mM 내지 약 14mM, 0.01mM 내지 약 12mM, 약 0.01mM 내지 약 10mM, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 약 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 18mM, 약 1mM 내지 약 16mM, 약 1mM 내지 약 14mM, 약 1mM 내지 약 12mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM, 약 1mM 내지 약 8mM , 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 20mM, 약 2mM 내지 약 18mM, 약 2mM 내지 약 16mM, 약 2mM 내지 약 14mM, 약 2mM 내지 약 12mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 20mM, 약 3mM 내지 약 18mM , 약 3mM 내지 약 16mM, 약 3mM 내지 약 14mM, 약 3mM 내지 약 12mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM, 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 20mM, 약 4mM 내지 약 18mM, 약 4mM 내지 약 16mM, 약 4mM 내지 약 14mM, 약 4mM 내지 약 12mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 18mM, 약 5mM 내지 약 16mM, 약 5mM 내지 약 14mM , 약 5mM 내지 약 12mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 내지 약 20mM, 약 6mM 내지 약 18mM, 약 6mM 내지 약 16mM, 약 6mM 내지 약 14mM, 약 6mM 내지 약 12mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 16mM 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 20mM, 약 7mM 내지 약 18mM, 약 7mM 내지 약 16mM, 약 7mM 내지 약 14 mM, 약 7mM 내지 약 12mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 20mM, 약 8mM 내지 약 18mM, 약 8mM 내지 약 16mM, 약 8mM 내지 약 14mM, 약 8mM 내지 약 12mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 약 9mM 내지 약 20mM, 약 9mM 내지 약 18mM, 약 9mM 내지 약 16mM, 약 9mM 내지 약 14mM, 약 9mM 내지 약 12mM, 약 9mM 내지 약 10mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 18mM, 약 10mM 내지 약 16mM, 약 10mM 내지 약 14mM, 약 10mM 내지 약 12mM, 약 12mM 내지 약 20mM, 약 12mM 내지 약 18mM, 약 12mM 내지 약 16 mM, 약 12mM 내지 약 14mM, 약 14mM 내지 약 20mM, 약 14mM 내지 약 18mM, 약 14mM 내지 약 16mM, 약 16mM 내지 약 20mM, 약 16mM 내지 약 18mM, 또는 약 18mM 내지 약 20mM) 중탄산염 이온을 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 중탄산염 이온은 중탄산나트륨으로서 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 존재할 수 있다. 중탄산염 이온의 추가적인 약학적으로 허용되는 공급원은 당업계에 공지되어 있다.
피루브산(Pyruvate)
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.01mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.01mM 내지 약 0.1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM , 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 약 1mM 내지 약 2mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 9mM, 약 2mM 내지 약 8mM, 약 2mM 내지 약 7mM, 약 2mM 내지 약 6mM, 약 2mM 내지 약 5mM, 약 2mM 내지 약 4mM, 약 2mM 내지 약 3mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 9mM, 약 3mM 내지 약 8mM, 약 3mM 내지 약 7mM, 약 3mM 내지 약 6mM, 약 3mM 내지 약 5mM , 약 3mM 내지 약 4mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 9mM, 약 4mM 내지 약 8mM, 약 4mM 내지 약 7mM, 약 4mM 내지 약 6mM, 약 4mM 내지 약 5mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 9mM, 약 5mM 내지 약 8mM, 약 5mM 내지 약 7mM, 약 5mM 내지 약 6mM, 약 6mM 약 10mM, 약 6mM 내지 약 9mM, 약 6mM 내지 약 8mM, 약 6mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 9mM, 약 7mM 내지 약 8mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 9mM, 또는 약 9mM 내지 약 10mM) 피루브산을 더 포함할 수 있다.
폴록사머(Poloxamer)
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188)를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-124, 폴록사머-182, 폴록사머-188, 폴록사머-331 및/또는 폴록사머-407)의 최종 농도는 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v (예를 들어, 약 0.01% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.7% w /v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.01% w/ v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.0% w/v , 약 0.01% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.01 % w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.10% w/v, 약 0.01% 내지 약 0.05% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 2.0% w/v , 약 0.05% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.90 % w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.50% w /v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.10% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.10 % w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.10% w /v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.10% w/v 약 0.60% w/v 내지 약 0.10% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약0.10% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.15 % w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.15% w /v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.70% w/ v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.15% w/v 약 0.50% w/v 내지 약 0.15% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.7 % w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.0% w /v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.20% w/ v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0. 25% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.25 % w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.25% w /v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.75% w/ v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.25% w/v 약 0.55% w/v 내지 약 0.25% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.30 % w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.30% w /v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 2.0% w/ v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0. 35% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.70 % w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 2.0% w /v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.40% w/ v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.3% w/v , 약 0.40% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.9% w /v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.45% w/ v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.2% w/v , 약 0.45% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 2.0 % w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.50% w/v 내지 ab 1.3% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.70 % w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.7% w /v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.55% w/ v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.0% w/v , 약 0.55% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 2.0 % w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.3% w /v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.60% w/ v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.70% w/v , 약 0.60% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.1 % w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.9 % w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.2% w /v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.70% w/ v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.9% w/v , 약 0.75% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.75% w/v 내지 a 약 0.80% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.4 % w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.9% w /v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.90% w/ v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.2% w/v , 약 0.90% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1. 0% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.2 % w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.5% w /v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 1.2% w/ v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.7% w/v , 약 1.2% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.4 % w/v, 약 1.4% w/v에서 약2.0% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.9 % w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.7% w /v, 약 1.7% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.7% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.7% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.8% w/ v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.8% w/v 내지 약 1.9% w/v, 또는 약 1.9% w/v 내지 약 2.0% w/v)일 수 있다.
혈청 알부민
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HSA)을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 약학적으로 허용되는 완충 수용액 중 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 HSA)의 최종 농도는 약 0.01% w/v 내지 약 2.0% w/v(예를 들어, 약 0.01% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.6% w/v , 약 0.01% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.65 % w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.30% w /v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.01% w/v 내지 약 0.10 % w/v, 약 0.01% 내지 약 0.05% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.05% w/v 약 1.8% w/v 내지 약 0.05% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.05 % w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.05% w /v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.05% w /v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 0.10% w/ v, 약 0.10% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.10% w/v 약 1.7% w/v 내지 약 0.10% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.10 % w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.10% w /v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.10% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.10% w/v 약 0.20% w/v 내지 약 0.10% w/v 내지 약 0.15% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.15 % w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.15% w /v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.45% w/ v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.15% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.15% w/v 약 0.25% w/v 내지 약 0.15% w/v 내지 약 0.20% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.2 % w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.65% w /v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.20% w/ v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.20% w/v 내지 약 0.30% w/v , 약 0.20% w/v 내지 약 0.25% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.3 % w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.70% w /v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.25% w/ v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.25% w/v 내지 약 0.35% w/v , 약 0.25% w/v 내지 약 0.30% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.5 % w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.80% w /v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.30% w/ v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.45% w/v , 약 0.30% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.30% w/v 내지 약 0.35% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.2 % w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.35 % w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.35% w/v 내지 약 0.40% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.40% w /v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.2% w/ v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.40% w/v 약 0.80% w/v 내지 약 0.40% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.40% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약0.40% w/v 내지 약 0.45% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.45 % w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.45% w /v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.45% w/v 내지 약 0.50% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.50% w/v 약 1.9% w/v 내지 약 0.50% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.50% w/v 약 1.2% w/v 내지 약 0.50% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.65% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.50% w/v 내지 약 0.55% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.55 % w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.55% w /v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.55% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.55% w/v 약 0.65% w/v 내지 약 0.55% w/v 내지 약 0.60% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.2 % w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.60% w/v 내지 약 0.65% w /v, 약 0.65% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.65% w/ v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.4% w/v , 약 0.65% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.65% w/v 내지 약 0.70% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.70 % w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.70% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.70% w /v 내지 약 0.75% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.8% w/ v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.75% w/v 약 1.4% w/v 내지 약 0.75% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.75% w/v 내지 약 0.80% w/v, 약 0.80% w /v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.7% w/ v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.80% w/v 약 1.3% w/v 내지 약 0.80% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 0.80% w/v 내지 약 0.90% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 0.90 % w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 0.90% w/v 내지 약 1.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.0% w /v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.5% w/ v, 약1.0% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 1.0% w/v 내지 약 1.1% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.1 % w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.1% w/v 내지 약 1.2% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.2% w /v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.6% w/ v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.2% w/v 내지 약 1.3% w/v, 약 1.3% w/v 약 2.0% w/v 내지 약 1.3% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.3% w/v 내지 약 1.4% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.4% w/v 내지 약 1.5% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.8 % w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.5% w/v 내지 약 1.6% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.6% w/v 내지 약 1.7% w/v, 약 1.7% w/v 내지 약 2.0% w /v, 약 1.7% w/v 내지 약 1.9% w/v, 약 1.7% w/v 내지 약 1.8% w/v, 약 1.8% w/v 내지 약 2.0% w/v, 약 1.8% w/ v 내지 약 1.9% w/v, 또는 약 1.9% w/v 내지 약 2.0% w/v)일 수 있다.
pH
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 pH가 예를 들어, 약 6.0 내지 약 9.0, 약 6.0 내지 약 8.8, 약 6.0 내지 약 8.6, 약 6.0 내지 약 8.4, 약 6.0 내지 약 8.2, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 7.8, 약 6.0 내지 약 7.6, 약 6.0 내지 약 7.4, 약 6.0 내지 약 7.2, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 6.8, 약 6.0 내지 약 6.6, 약 6.0 내지 약 6.4, 약 6.0 내지 약 6.2, 약 6.2 내지 약 9.0, 약 6.2 내지 약 8.8, 약 6.2 내지 약 8.6, 약 6.2 내지 약 8.4, 약 6.2 내지 약 8.2, 약 6.2 내지 약 8.0, 약 6.2 내지 약 7.8, 약 6.2 내지 약 7.6, 약 6.2 내지 약 7.4, 약 6.2 내지 약 7.2, 약 6.2 내지 약 7.0, 약 6.2 내지 약 6.8, 약 6.2 내지 약 6.6, 약 6.2 내지 약 6.4, 약 6.4 내지 약 9.0, 약 6.4 내지 약 8.8, 약6.4 내지 약 8.6, 약 6.4 내지 약 8.4, 약 6.4 내지 약 8.2, 약 6.4 내지 약 8.0, 약 6.4 내지 약 7.8, 약 6.4 내지 약 7.6, 약 6.4 내지 약 7.4, 약 6.4 내지 약7.2, 약 6.4 내지 약 7.0, 약 6.4 내지 약 6.8, 약 6.4 내지 약 6.6, 약 6.6 내지 약 9.0, 약 6.6 내지 약 8.8, 약 6.6 내지 약 8.6, 약 6.6 내지 약 8.4, 약 6.6 내지 약 8.2 , 약 6.6 내지 약 8.0, 약 6.6 내지 약 7.8, 약 6.6 내지 약 7.6, 약 6.6 내지 약 7.4, 약 6.6 내지 약 7.2, 약 6.6 내지 약 7.0, 약 6.6 내지 약 6.8 6.8 내지 약 9.0, 약 6.8 내지 약 8.8, 약 6.8 내지 약 8.6, 약 6.8 내지 약 8.4, 약 6.8 내지 약 8.2, 약 6.8 내지 약 8.0, 약 6.8 내지 약 7.8, 약 6.8 내지 약 7.6, 약 6.8 내지 약 7.4, 약 6.8 내지 약 7.2, 약 6.8 내지 약 7.0, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.8, 약 7.0 내지 약 8.6, 약 7.0 내지 약 8.4, 약7.0 내지 약 8.2, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.8, 약 7.0 내지 약 7.6, 약 7.0 내지 약 7.4, 약 7.0 내지 약 7.2, 약 7.2 내지 약 9.0, 약 7.2 내지 약 8.8, 약7. 2 내지 약 8.6, 약 7.2 내지 약 8.4, 약 7.2 내지 약 8.2, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.8, 약 7.2 내지 약 7.6, 약 7.2 내지 약 7.4, 약 7.4 내지 약 9.0, 약 7.4 내지 약 8.8, 약 7.4 내지 약 8.6, 약 7.4 내지 약 8.4, 약 7.4 내지 약 8.2, 약 7.4 내지 약 8.0, 약 7.4 내지 약 7.8, 약 7.4 내지 약 7.6, 약 7.6 내지 약 9.0, 약 7.8 내지 약 8.8, 약 7.6 내지 약 8.6, 약 7.6 내지 약 8.4, 약 7.6 내지 약 8.2, 약 7.6 내지 약 8.0, 약 7.6 내지 약 7.8, 약 7.8 내지 약 9.0, 약 7.8 내지 약 8.8, 약 7.8 내지 약 8.6, 약7.8 내지 약 8.4, 약 7.8 내지 약 8.2, 약 7.8 내지 약 8.0, 약 8.0 내지 약 9.0, 약 8.0 내지 약 8.8, 약 8.0 내지 약 8.6, 약 8.0 내지 약 8.4, 약 8.0 내지 약 8.2, 약8.2 내지 약 9.0, 약 8.2 내지 약 8.8, 약 8.2 내지 약 8.6, 약 8.2 내지 약 8.4, 약 8.4 내지 약 9.0, 약 8.4 내지 약 8.8, 약 8.4 내지 약 8.6, 약 8.6 내지 약 9.0, 약 8.6 내지 약8.8, 또는 약 8.8 내지 약 9.0이다.
삼투압(Osmolarity)
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 100 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L(예를 들어, 약 100 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 100 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 100mOsm/L 내지 약 340mOsm/L, 약 100mOsm/L 내지 약 320mOsm/L, 약 100mOsm/L 내지 약 300mOsm/L, 약 100mOsm/L 내지 280 mOsm/L, 약 100 mOsm/L 내지 약 260 mOsm/L, 약 100 mOsm/L 내지 약 250 mOsm/L, 약 100 mOsm/L 내지 약 200 mOsm/L, 약 100 mOsm/0 내지 약150 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 340 mOsm/L 내지 약 320 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 300 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 280 mOsm/L, 약 150 mOsm/L 내지 약 260 mOsm/L, 약 150mOsm/L 내지 약 250mOsm/L, 약 150mOsm/L 내지 약 200mOsm/L, 약 200mOsm/L 내지 약 400mOsm/L, 약 200mOsm/L 내지 약 380mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 340 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 320 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 300 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 280 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 260 mOsm/L, 약 200 mOsm/L 내지 약 250 mOsm/L, 약 250 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 250 mOsm/L 내지 약 380mOsm/L, 약 250mOsm/L 내지 약 360mOsm/L, 약 250mOsm/L 내지 약 340mOsm/L, 약 250mOsm/L 내지 약 320mOsm/L, 약 250mOsm/L 내지 약 300 mOsm/L, 약 250 mOsm/L 내지 약 280 mOsm/L, 약 250 mOsm/L 내지 약 260 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 340 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 320 mOsm/L, 약 260 mOsm/L 내지 약 300 mOsm/L, 약 260mOsm/L 내지 약 280mOsm/L, 약 280mOsm/L 내지 약 400mOsm/L, 약 280mOsm/L 내지 약 380mOsm/L, 약 280mOsm/ L 내지 약 360mOsm/L, 약 280mOsm/L 내지 약 340mOsm/L, 약 280mOsm/L 내지 약 320 mOsm/L, 약 280 mOsm/L 내지 약 300 mOsm/L, 약 300 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 300 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 300 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 300 mOsm/L 내지 약 340 mOsm/L, 약 300 mOsm/L 내지 약 320 mOsm/L, 약 320 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 320 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 320 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 320 mOsm/L 내지 약 340 mOsm/L, 약 340 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 340 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 약 340 mOsm/L 내지 약 360 mOsm/L, 약 360 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 약 360 mOsm/L 내지 약 380 mOsm/L, 또는 약 380/L 내지 400 mOsm/L)의 삼투압 농도를 갖는다.
예시적인 실시예
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 약 70mM 내지 약 90mM (예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM (예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM (예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM (예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM (예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM (예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM (예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM (예를 들어, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액 (예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM (예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM (예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM (예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 및 약 0.1mM 내지 약 2mM (예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 7.4 내지 약 7.8 (예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단), 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 IL-15 수용체 알파(IL-15Rα)의 세포외 부분에 연결된 IL-15 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, IL-15Rα 스시-결합 도메인), 예를 들어 여기에서 참조로 포함된 통합된 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769에 기술된 바와 같은 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 및 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) , 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 막횡단에 연결된 IL-12 p40 또는 이의 단편 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769에 기술된 바와 같은 단백질(예를 들어, GPA, 또는 그의 막횡단 단편, 또는 SMIM1, 또는 그의 막횡단 단편) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 및 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 항원성 펩티드를 포함하는 제1 외인성 단백질(예를 들어, HPV)의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA*02: 01) 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 이의 단편 또는 변이체, 막횡단 단백질(예를 들어, GPA, 또는 이의 막횡단 단편) 및 IL-12 p40을 포함하는 제2 외인성 단백질, 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편, 또는 이의 단편, 막횡단 단백질(예: GPA 또는 이의 막횡단 단편), 또는 SMIM1, 또는 막횡단 파편 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0290686(본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 및 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188), 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) , 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 IL-15 수용체 알파(IL-15Rα)의 세포외 부분에 연결된 IL-15 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, IL-15Rα 스시 결합 도메인), 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM) 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188), 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) , 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 막횡단에 연결된 IL-12 p40 또는 이의 단편 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769에 기술된 바와 같은 단백질(예를 들어, GPA, 또는 그의 막횡단 단편, 또는 SMIM1, 또는 그의 막횡단 단편) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188), 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 그의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 항원성 펩티드를 포함하는 제1 외인성 단백질(예를 들어, HPV)의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) B2M에 연결된 HPV16 E711-19와 같은 항원, 또는 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA*02:01)의 알파1, 알파2 및 알파 3 도메인 중 하나 이상에 연결된 이의 단편, 또는 단편 또는 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 이의 변이체, 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 4-1BBL 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질 및 IL-12 p40을 포함하는 제2 외인성 단백질 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편 또는 막횡단 단백질(예: GPA 또는 이의 막횡단 단편, 또는 SMIM1), 또는 이의 막횡단 단편), 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0290686(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술됨) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 80mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 42mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.1mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 10mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 25mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 100mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 40mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188), 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 79.4mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 41.7mM) 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.0mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 9.9mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 24.8mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 99.2mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 39.7mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v(예를 들어, 약 0.15% w/v 내지 약 0.25% w/v, 또는 약 0.20% w/v)의 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예: 폴록사머-188)를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) , 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 IL-15Rα의 세포외 부분에 연결된 IL-15 또는 이의 단편 또는 이의 단편(예를 들어, 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 IL-15Rα 스시-결합 도메인(IL-15Rα 스시 결합 도메인), 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 79.4mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 41.7mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.0mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 9.9mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 24.8mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 99.2mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 39.7mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v(예를 들어, 약 0.15% w/v 내지 약 0.25% w/v, 또는 약 0.20% w/v)의 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188)를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질(예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구(또는 그의 집단) , 막횡단 단백질(예를 들어, GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 제2 외인성 단백질, 및 막횡단에 연결된 IL-12 p40 또는 이의 단편 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769에 기술된 바와 같은 단백질(예를 들어, GPA, 또는 그의 막횡단 단편, 또는 SMIM1, 또는 그의 막횡단 단편) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 79.4mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 41.7mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.0mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 9.9mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 24.8mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 99.2mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 39.7mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v(예를 들어, 약 0.15% w/v 내지 약 0.25% w/v, 또는 약 0.20% w/v)의 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188)를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이들의 막 상에 존재하는 외인성 단백질을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구세포(예를 들어, MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA*02:01)의 알파1, 알파2 및 알파 3 도메인 중 하나 이상에 연결된 B2M 또는 이의 단편, 또는 막횡단 단백질에 연결된 이의 단편 또는 변이체 (예를 들어, GPA 또는 그의 막횡단 단편); 막횡단 단백질 (예를 들어, GPA 또는 그의 막횡단 단편)에 연결된 4-1BBL 또는 그의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질, 및 IL을 포함하는 제2 외인성 단백질 -12 p40, 또는 이의 단편, IL-12 p35에 연결된, 또는 이의 단편, 막횡단 단백질(예를 들어, GPA, 또는 이의 막횡단 단편, 또는 SMIM1, 또는 이의 막횡단 단편), 예를 들어, 미국 특허 출원에 기술된 공개 번호 2019/0290686(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은) 및 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 약 70mM 내지 약 90mM(예를 들어, 약 75mM 내지 약 85mM, 또는 약 79.4mM)의 나트륨 이온, 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 37mM 내지 약 47mM, 또는 약 41.7mM)의 칼륨 이온; 약 0.01mM 내지 약 0.15mM(예를 들어, 약 0.01mM 내지 약 0.10mM, 또는 약 0.05mM)의 칼슘 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 4mM 내지 약 6mM, 또는 약 5mM)의 마그네슘 이온; 약 5mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 10.0mM)의 클로라이드 이온; 약 5mM 내지 약 15mM(예를 들어, 약 8mM 내지 약 12mM, 또는 약 9.9mM)의 포스페이트 이온; 약 1mM 내지 약 10mM(예를 들어, 약 3mM 내지 약 7mM, 또는 약 5mM)의 중탄산염 이온; 약 15mM 내지 약 35mM(예를 들면, 약 20mM 내지 약 30mM, 또는 약 24.8mM)의 완충액(예를 들면, HEPES); 약 80mM 내지 약 120mM(예를 들어, 약 90mM 내지 약 110mM, 또는 약 99.2mM)의 락토비오네이트; 약 30mM 내지 약 50mM(예를 들어, 약 35mM 내지 약 45mM, 또는 약 39.7mM)의 만니톨; 약 0.1mM 내지 약 3mM(예를 들어, 약 1.5mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 2.0mM)의 아데노신; 약 0.1mM 내지 약 2mM(예를 들어, 약 0.5mM 내지 약 1.5mM, 또는 약 1.0mM)의 아데닌; 및 약 0.1% w/v 내지 약 0.3% w/v(예를 들어, 약 0.15% w/v 내지 약 0.25% w/v, 또는 약 0.20% w/v)의 혈청 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민) 및 약 7.4 내지 약 7.8(예를 들어, 약 7.5 내지 약 7.6, 또는 약 7.57)의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 약 0.1% w/v 내지 약 0.9% w/v(예를 들어, 약 0.3% w/v 내지 약 0.7% w/v, 또는 약 0.5% w/v)의 폴록사머(예를 들어, 폴록사머-188)를 추가로 포함한다.
키트
또한, 본 명세서에서 제공된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것을 함유하는 하나 이상의 멸균 용기(예를 들어, 멸균 원뿔형 튜브, 멸균 페트리 접시, 멸균 바이알(예를 들어, 붕규산 유리 바이알(borosilicate glass vial) 및 멸균 플라스틱 백(디-2-에틸헥실 프탈레이트(DEHP, di-2-ethylhexyl phthalate)-가소화 폴리비닐 클로라이드(PVC, plasticized polyvinyl chloride) 백, 또는 n-부티릴-트리(n-헥실)-시트레이트(BTHC, n-butyryl-tri(n-hexyl)-citrate)-가소화 PVC 백(plasticized PVC bag))를 포함하는 키트가 여기에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 키트 필요로 하는 대상체에게 임의의 조성물을 투여하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 키트의 일부 실시예는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 적합한 단일 투여 형태를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물의 단일 투여 형태는, 예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 2 L, 약 0.5 mL 내지 약 1800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1000 mL, 약 0.5 mL 내지 약 800 mL, 약 0.5 mL 내지 약 600 mL, 약 0.5 mL 내지 약 500 mL, 약 0.5 mL 내지 약 450 mL, 약 0.5 mL 내지 약 400 mL, 약 0.5 mL 내지 약 350 mL, 약 0.5 mL 내지 약 300 mL, 약 0.5 mL 내지 약 250 mL, 약 0.5 mL 내지 약 200 mL, 약 0.5 mL 내지 약 180 mL, 약 0.5 mL 내지 약 160 mL, 약 0.5 mL 내지 약 140 mL, 약 0.5 mL 내지 약 120 mL, 약 0.5 mL 내지 약 100 mL, 약 0.5 mL 내지 약 80 mL, 약 0.5 mL 내지 약 60 mL, 약 0.5 mL 내지 약 40 mL, 약 0.5 mL 내지 약 20mL, 약 0.5mL 내지 약 10mL, 약 0.5mL 내지 약 5mL, 약 0.5mL 내지 약 1.0mL, 약 1.0mL 내지 약 2L, 약 1.0mL 내지 약 1800mL, 약 1.0mL 내지 약 1.0mL 약 1500mL, 약 1.0mL 내지 약 1200mL, 약 1.0 mL 내지 약 1000 mL, 약 1.0 mL 내지 약 800 mL, 약 1.0 mL 내지 약 600 mL, 약 1.0 mL 내지 약 500 mL, 약 1.0 mL 내지 약 450 mL, 약 1.0 mL 내지 약 400 mL, 약 1.0 mL 내지 약 350 mL, 약 1.0 mL 내지 약 300 mL, 약 1.0 mL 내지 약 250 mL, 약 1.0 mL 내지 약 200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 180 mL, 약 1.0 mL 내지 약 160 mL, 약 1.0 mL 내지 약 140 mL, 약 1.0 mL 내지 약 120 mL, 약 1.0 mL 내지 약 100 mL, 약 1.0 mL 내지 약 80 mL, 약 1.0 mL 내지 약 60 mL, 약 1.0 mL 내지 약 40 mL, 약 1.0 mL 내지 약 20 mL, 약 1.0 mL 내지 약 10 mL, 약 1.0 mL 내지 약 5 mL, 약 5 mL 내지 약 2 L, 약 5 mL 내지 약 1800 mL, 약 5 mL 내지 약 1500 mL, 약 5 mL 내지 약 1200 mL, 약 5 mL 내지 약 1000 mL, 약 5 mL 내지 약 800 mL, 약 5 mL 내지 약 600 mL, 약 5 mL 내지 약 500 mL, 약 5 mL 내지 약 450 mL, 약 5 mL 내지 약 400mL, 약 5mL 내지 약 350mL, 약 5mL 내지 약 300mL, 약 5mL 내지 약 250mL, 약 5mL 내지 약 200mL, 약 5mL 내지 약 180mL, 약 5mL 내지 약 160mL, 약 5mL 내지 약 140mL, 약 5mL 내지 약 120mL, 약 5mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 20 mL, 약 5 mL 내지 약 10 mL, 약 10 mL 내지 약 2 L, 약 10 mL 내지 약 1800 mL, 약 10 mL 내지 약 1500 mL, 약 10 mL 내지 약 1200 mL, 약 10 mL 내지 약 1000 mL, 약 10 mL 내지 약 800 mL, 약 10 mL 내지 약 600 mL, 약 10 mL 내지 약 500 mL, 약 10 mL 내지 약 450 mL, 약 10 mL 내지 약 400 mL, 약 10 mL 내지 약 350 mL, 약 10 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200mL, 약 10mL 내지 약 180mL, 약 10mL 내지 약 160mL, 약 10mL 내지 약 140mL, 약 10mL 내지 약 120mL, 약 10mL 내지 약 100mL, 약 10mL 내지 약 80 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 40 mL, 약 10 mL 내지 약 20 mL, 약 20 mL 내지 약 2 L, 약 20 mL 내지 약 1800 mL, 약 20 mL 내지 약 1500 mL, 약 20 mL 내지 약 1200 mL, 약 20 mL 내지 약 1000 mL, 약 20 mL 내지 약 800 mL, 약 20 mL 내지 약 600 mL, 약 20 mL 내지 약 500 mL, 약 20 mL 내지 약 450 mL, 약 20 mL 내지 약 400 mL, 약 20 mL 내지 약 350 mL, 약 20 mL 내지 약 300 mL, 약 20 mL 내지 약 250 mL, 약 20 mL 내지 약 200 mL, 약 20 mL 내지 약 180 mL, 약 20 mL 내지 약 160 mL, 약 20 mL 내지 약 140 mL, 약 20 mL 내지 약 120 mL, 약 20 mL 내지 약 100 mL, 약 20 mL 내지 약 80 mL, 약 20 mL 내지 약 60 mL, 약 20 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 2 L, 약 40 mL 내지 약 1800 mL, 약 40 mL 내지 약 1500 mL, 약 40 mL 내지 약 1200 mL, 약 40 mL 내지 약 1000 mL, 약 40 mL 내지 약 800 mL, 약 40 mL 내지 약 600 mL, 약 40 mL 내지 약 500 mL, 약 40 mL 내지 약 450 mL, 약 40 mL 내지 약 400 mL, 약 40 mL 내지 약 350 mL, 약 40 mL 내지 약 300 mL, 약 40 mL 내지 약 250 mL, 약 40 mL 내지 약 200 mL, 약 40 mL 내지 약 180 mL, 약 40 mL 내지 약 160 mL, 약 40 mL 내지 약 140 mL, 약 40 mL 내지 약 120 mL, 약 40 mL 내지 약 100 mL, 약 40 mL 내지 약 80mL, 약 40mL 내지 60 mL, 약 60 mL 내지 약 2 L, 약 60 mL 내지 약 1800 mL, 약 60 mL 내지 약 1500 mL, 약 60 mL 내지 약 1200 mL, 약 60 mL 내지 약 1000 mL, 약 60 mL 내지 약 800 mL, 약 60 mL 내지 약 600 mL, 약 60 mL 내지 약 500 mL, 약 60 mL 내지 약 450 mL, 약 60 mL 내지 약 400 mL, 약 60 mL 내지 약 350 mL, 약 60 mL 내지 약 300 mL, 약 60 mL 내지 약 250 mL, 약 60 mL 내지 약 200 mL, 약 60 mL 내지 약 180 mL, 약 60 mL 내지 약 160 mL, 약 60 mL 내지 약 140 mL, 약 60 mL 내지 약 120 mL, 약 60 mL 내지 약 100 mL, 약 60 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 2 L, 약 80 mL 내지 약 1800 mL, 약 80 mL 내지 약 1500 mL, 약 80 mL 내지 약 1200 mL, 약 80 mL 내지 약 1000 mL, 약 80 mL 내지 약 800 mL, 약 80 mL 내지 약 600 mL, 약 80 mL 내지 약 500 mL, 약 80 mL 내지 약 450 mL, 약 80 mL 내지 약 400 mL, 약 80 mL 내지 약 350 mL, 약 80 mL 내지 약 300 mL, 약 80 mL 내지 약 250 mL, 약 80 mL 내지 약 200 mL, 약 80 mL 내지 약 180 mL, 약 80 mL 내지 약 160 mL, 약 80 mL 내지 약 140 mL, 약 80 mL 내지 약 120 mL, 약 80 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 2 L, 약 100 mL 내지 약 1800mL, 약 100mL 내지 약 1500mL, 약 100mL 내지 약 1200mL, 약 100mL 내지 약 1000mL, 약 100mL 내지 약 800mL, 약 100mL 내지 약 600mL, 약 100mL 내지 약 500 mL, 약 100 mL 내지 약 450 mL, 약 100 mL 내지 약 400 mL, 약 100 mL 내지 약 350 mL, 약 100 mL 내지 약 300 mL, 약 100 mL 내지 약 250 mL, 약 100 mL 내지 약 200 mL , 약 100 mL 내지 약 180 mL, 약 100 mL 내지 약 160 mL, 약 100 mL 내지 약 140 mL, 약 100 mL 내지 약 120 mL, 약 120 mL 내지 약 2 L, 약 120 mL 내지 약 1800 mL, 약 120 mL 내지 약 1500 mL, 약 120 mL 내지 약 1200 mL, 약 120 mL 내지 약 1000 mL, 약 120 mL 내지 약 800 mL, 약 120 mL 내지 약 600 mL, 약 120 mL 내지 약 500 mL, 약 120 mL 약 450 mL로, 약 120 mL에서 약 400 mL, 약 120 mL에서 약 350 mL, 약 120 mL 내지 약 300 mL, 약 120 mL 내지 약 250 mL, 약 120 mL 내지 약 200 mL, 약 120 mL 내지 약 180 mL, 약 120 mL 내지 약 160 mL, 약 120 mL 내지 약 140 mL, 약 140 mL 내지 약 2 L, 약 140 mL 내지 약 1800 mL, 약 140 mL 내지 약 1500 mL, 약 140 mL 내지 약 1200 mL, 약 140 mL 내지 약 1000 mL, 약 140 mL 내지 약 800 mL, 약 140 mL 내지 약 600 mL, 약 140 mL 내지 약 500 mL, 약 140 mL 내지 약 450 mL, 약 140 mL 내지 약 400 mL, 약 140 mL 내지 약 350 mL, 약 140 mL 내지 약 300 mL, 약 140 mL 내지 약 250 mL, 약 140 mL 내지 약 200 mL, 약 140 mL 내지 약 180 mL, 약 140 mL 내지 약 160 mL, 약 160 mL 내지 약 500 mL, 약 160 mL 내지 약 450 mL, 약 160 mL 내지 약 400 mL, 약 160 mL 내지 약 350 mL, 약 160 mL 내지 약 300 mL, 약 160 mL 내지 약 250 mL, 약 160 mL 내지 약 200 mL, 약 160 mL 내지 약 180 mL, 약 180 mL 내지 약 2 L, 약 180mL 내지 약 1800mL, 약 180mL 내지 약 1500mL, 약 180 mL 내지 약 1200 mL, 약 180 mL 내지 약 1000 mL, 약 180 mL 내지 약 800 mL, 약 180 mL 내지 약 600 mL, 약 180 mL 내지 약 500 mL, 약 180 mL 내지 약 450 mL, 약 180 mL 내지 약 400 mL, 약 180 mL 내지 약 350 mL, 약 180 mL 내지 약 300 mL, 약 180 mL 내지 약 250 mL, 약 180 mL 내지 약 200 mL, 약 200 mL 내지 약 2 L, 약 200 mL 내지 약 1800mL, 약 200mL 내지 약 1500mL, 약 200mL 내지 약 1200mL, 약 200mL 내지 약 1000mL, 약 200mL 내지 약 800mL, 약 200mL 내지 약 600mL, 약 200mL 내지 약 500mL, 약 200 mL 내지 약 450mL, 약 200 mL 내지 약 400 mL, 약 200 mL 내지 약 350 mL, 약 200 mL 내지 약 300 mL, 약 200 mL 내지 약 250 mL, 약 250 mL 내지 약 2 L , 약 250 mL 내지 약 1800 mL, 약 250 mL 내지 약 1500 mL, 약 250 mL 내지 약 1200 mL, 약 250 mL 내지 약 1000 mL, 약 250 mL 내지 약 800 mL, 약 250 mL 내지 약 600 mL, 약 250mL 내지 약 500mL, 약 250mL 내지 약 450mL, 약 250mL 내지 약 400mL, 약 250mL 내지 약 350mL, 약 250mL 내지 약 300mL, 약 300mL 내지 약 2L, 약 300mL 내지 약 1800mL, 약 300mL 내지 약 1500mL, 약 300 mL 내지 약 1200 mL, 약 300 mL 내지 약 1000 mL, 약 300 mL 내지 약 800 mL, 약 300 mL 내지 약 600 mL, 약 300 mL 내지 약 500 mL, 약 300 mL 내지 약 450 mL, 약 300 mL 내지 약 400 mL, 약 300 mL 내지 약 350 mL, 약 350 mL 내지 약 2 L, 약 350 mL 내지 약 1800 mL, 약 350 mL 내지 약 1500 mL, 약 350 mL 내지 약 1200 mL, 약 350 mL 내지 약 1000 mL, 약 350 mL 내지 약 800 mL, 약 350 mL 내지 약 600 mL, 약 350 mL 내지 약 500 mL, 약 350 mL 내지 약 450 mL, 약 350 mL 내지 약 400 mL, 약 400 mL 내지 약 2 L, 약 400 mL 내지 약 1800 mL, 약 400 mL 내지 약 1500 mL, 약 400 mL 내지 약 1200 mL, 약 400 mL 내지 약 1000 mL, 약 400 mL 내지 약 800 mL, 약 400 mL 내지 약 600 mL, 약 400 mL 내지 약 500mL, 약 400mL 내지 약 450mL, 약 450 mL 내지 약 2 L, 약 450 mL 내지 약 1800 mL, 약 450 mL 내지 약 1500 mL, 약 450 mL 내지 약 1200 mL, 약 450 mL 내지 약 1000 mL, 약 450 mL 내지 약 800 mL, 약 450 mL 내지 약 600 mL, 약 450 mL 내지 약 500 mL, 약 500 mL 내지 약 2 L, 약 500 mL 내지 약 1800 mL, 약 500 mL 내지 약 1500 mL, 약 500 mL 내지 약 1200 mL, 약 500 mL 내지 약 1000 mL, 약 500 mL 내지 약 800 mL, 약 500 mL 내지 약 600 mL, 약 600 mL 내지 약 2 L, 약 600 mL 내지 약 1800 mL, 약 600 mL 내지 약 1500 mL, 약 600 mL 내지 약 1200 mL, 약 600 mL 내지 약 1000 mL, 약 600 mL 내지 약 800 mL, 약 800 mL 내지 약 2 L, 약 800 mL 내지 약 1800 mL, 약 800 mL 내지 약 1500 mL, 약 800 mL 내지 약 1200 mL, 약 800 mL 내지 약 1000 mL, 약 1000 mL 내지 약 2 L, 약 1000 mL 내지 약 1800 mL, 약 1000 mL 내지 약 1500 mL, 약 1000 mL 내지 약 1200 mL, 약 1200 mL 내지 약 2 L, 약 1200 mL 내지 약 1800mL, 약 1200mL 내지 약 1500mL, 약 1500 mL 내지 약 2L, 약 1500mL 내지 약 1800mL, 또는 약 1800mL 내지 약 2L의 부피를 가질 수 있다.
제형을 만드는 방법
또한 다음을 포함하는 조성물의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 탈핵 적혈구 집단을 제공하는 단계; 및 (ii) 탈핵 적혈구의 집단을 약학적으로 허용되는 완충 수용액(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 약학적으로 허용되는 완충 수용액)에 재현탁시키는 단계를 포함한다.일부 실시예에서, 조성물은 약 0.5 x 108 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL, 예를 들어, 약 0.5 x 108 내지 약 6.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 5.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 4.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 3.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 2.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 1.0 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 0.5 x 109, 약 0.5 x 108 내지 약 1.0 x 108, 약 1.0 x 108 내지 약 7.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 6.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 5.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 4.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 3.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 2.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 108 내지 약 0.5 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 2.0 x 109, 약 0.5 x 109 내지 약 1.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 1.0 x 109 내지 약 2.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 2.0 x 109 내지 약 3.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 3.0 x 109 내지 약 4.0 x 109, 약 4.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 약 4.0 x 109 내지 약 5.0 x 109, 약 5.0 x 109 내지 약 7.0 x 109, 약 5.0 x 109 내지 약 6.0 x 109, 또는 약 6.0 x 109 내지 약 7.0 x 109 탈핵 적혈구/mL(예를 들어, 본 명세서에 기재된 예시적인 탈핵 적혈구 중 임의의 것)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 방법은 단계 (i)에서 탈핵 적혈구 집단을 재현탁시키기 전에 원심분리하는 것을 포함할 수 있다. 단계 (ii)에서 탈핵 적혈구를 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 재현탁시키는 것은 정용여과 또는 한외여과/정용여과의 조합에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 집단은 공여자(또한 공여자 탈핵 적혈구, 예를 들어 패킹된 적혈구)로부터 수득될 수 있다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구의 집단은 세척된 적혈구(RBC)일 수 있다. 세척된 적혈구는 기증자로부터 얻은 후 세척할 수 있다. 기증자로부터 얻은 적혈구 세척은 일반적으로 개방형 또는 폐쇄형 시스템에서 생리 식염수(0.9%)를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 세척 절차는 첨가제 용액 외에 혈장 단백질, 전해질, 일부 백혈구(WBC), 혈소판, 미세 입자 및 세포 파편을 포함하는 RBC 상층액의 95% - 99%를 제거한다. 개방형 시스템에서 세척된 적혈구는 생리식염수에서의 적혈구 생존 가능성뿐만 아니라 이론적으로 박테리아 오염 위험이 증가하기 때문에 세척 후 24시간 이내에 사용되는 경우가 많다. 폐쇄 시스템에서 세척된 적혈구는 14일의 만료 시간이 있다. 적혈구 세척은 심장 수술을 받는 신생아와 유아에게 자주 사용된다. 적혈구 세척은 세포외 칼륨을 감소시키지만 적혈구 막 삼투 취약성을 증가시켜 신생아 체외막 산소화(ECMO, extracorporeal membrane oxygenation)의 처음 3일 이내에 세척된 적혈구의 용혈을 증가시킨다. 적혈구 세척은 또한 적혈구 삼투압 취약성을 증가시켜 수혈 후 용혈을 증가시킬 수 있다. RBC 세척 장치의 비제한적인 예는 Cobe 2991(Terumo BCT, Lakewood, CO, USA) 및 헤모네틱스 셀 세이버 엘리트(Haemonetics, Braintree, MA, USA)를 포함한다. RBC 세척의 추가 비제한적 측면은 Schmidt et al. (Int. J. Clin. Transfusion Med. 4:79-88, 2016)에 설명되어 있다.
일부 실시예에서, 탈핵 적혈구는 조작된 탈핵 적혈구(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 조작된 탈핵 적혈구)이다.
이들 방법 중 임의의 것의 일부 실시예는 탈핵 적혈구의 집단을 제공하기 위해 적혈구 전구 세포를 배양하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 조작된 적혈구가 조작된 탈핵 적혈구인 경우, 방법은 하나 이상의 외인성 단백질 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 외인성 단백질) (예를 들어, 본 명세서에 기재된 적혈구 전구 세포 내로 핵산을 도입하는 임의의 방법 사용)을 코딩하는 하나 이상의 핵산 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 핵산)을 적혈구 전구 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이들 예에서, 방법은 핵산을 적혈구 전구 세포로 도입하기 전 및/또는 후에 적혈구 전구 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
적혈구 전구 세포는 환자 유래 적혈구 전구 세포, 불멸화 적혈구 세포주일 수 있거나 유도 만능 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 불멸화 적혈구 세포주, 예를 들어 인간 유두종 바이러스(HPV) E6 및/또는 HPV E7을 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하는 세포주이다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 cMyc 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 임의로 TP53의 발현을 억제, 감소 또는 제거하기 위한 유전적 변형을 포함한다(예를 들어 Huang et al., (2014) Mol.Ther.22(2): 451-63 참조). 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 BEL-A 세포주 세포이다(Trakarnasanga et al. (2017) Nat. Commun. 8: 14750 참조). 추가적인 불멸화 적혈구 전구 세포는 미국 특허 번호 9,951,350 및 8,975,072에 기술되어 있다. 일부 실시예에서, 적혈구 전구 세포는 Bmi-1을 코딩하는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 세포 배양 기술을 사용하여 탈핵 적혈구를 생성하는 예시적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Giarratana et al., Blood 118:5071, 2011; Kurita et al., PLOS One 8:e59890, 2013; Fibach et al., Blood 73:100, 1989; Giarratana et al., Blood 118:5071, 2011이다. 탈핵 적혈구는 예를 들어 CD34+ 조혈 전구 세포(Giarratana et al., Blood 118:5071, 2011), 유도 만능 줄기 세포(Kurita et al., 9PLOS 8: 2013), 및 배아 줄기 세포(Hirose et al., Stem Cell Reports 1:499, 2013) 를 포함하는 조혈 전구 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 적혈구 전구 세포를 탈핵 적혈구로 확장하고 분화시키는데 적합한 성장 및 분화 인자의 칵테일은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 확장 및 분화 인자의 예는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, CSF, G-CSF, 트롬보포이에틴(TPO), GM-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), Flt3, Flt2, PIXY 321 및 백혈병 억제 인자(LIF)와 같은 줄기 세포 인자(SCF), 인터루킨(IL)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
적혈구 전구 세포는 다단계 배양 과정에서 적혈구 전구 세포를 정의된 인자와 접촉시킴으로써 CD34+ 세포와 같은 적혈구 전구 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 예시적 적혈구 전구 세포)로부터 배양될 수 있다. 예를 들어, 탈핵 적혈구는 3단계 배양 과정에서 적혈구 전구 세포로부터 생성될 수 있다.
첫 번째 단계는 1-1000 ng/mL의 줄기 세포 인자(SCF), 1-100 U/mL의 에리트로포이에틴(EPO) 및 0.1-100ng/mL의 인터루킨-3(IL-3)을 포함하는 액체 배양 배지에서 적혈구 전구 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 첫 번째 단계에서, 액체 배양 배지는 핵 호르몬 수용체, 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, 또는 프레그난 X 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 수용체에 대한 리간드는 예를 들어, 코르티코스테로이드, 예를 들어 10nM-100μM의 덱사메타손 또는 10nM-100μM의 히드로코르티손; 에스트로겐, 예를 들어 10 nM 내지 100 μM의 베타-에스트라디올; 프로게스토겐, 예를 들어, 10 nM-100 μM의 프로게스테론, 10 nM-100 μM의 히드록시프로게스테론, 10 nM-100 μM의 5a-디히드로프로게스테론, 10 nM-100 μM의 11-데옥시코르티코스테론, 또는 이러한 합성 프로게스틴 예를 들어, 10 nM-100 μM의 클로르마디논 아세테이트; 안드로겐, 예를 들어 10 nM-100 μM의 테스토스테론, 10 nM-100 μM의 디히드로테스토스테론 또는 10 nM-100 μM의 안드로스테네디온; 또는 프레그난 X 수용체 리간드, 예를 들어 10 nM-100 μM의 리팜피신, 10 nM-100 μM의 하이퍼포린, 10 nM-100 μM의 St. John's Wort(하이페리신), 또는 예를 들어, 10 nM-100 μM의 토코페롤과 같은 비타민 E-유사 분자를 포함한다. 첫 번째 단계에서 액체 배양 배지는 또한 예를 들어, 인슐린 1-50㎍/mL, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1) 1-50㎍/mL, 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2) 1-50㎍/mL mL, 또는 1-50 μg/mL의 기계적 성장 인자와 같은 인슐린 유사 분자를 포함할 수 있다. 첫 번째 단계의 액체 배양 배지는 또한 트랜스페린을 0.1-5 mg/mL로 포함할 수 있다.
첫 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 선택적으로 하나 이상의 인터루킨(IL) 또는 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, 과립구 집락 자극 인자(G- CSF), 대식세포 집락자극인자(M-CSF), 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 트롬보포이에틴, 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈소판유래성장인자(PDGF), 형질전환성장인자베타(TGF- B) 종양 괴사 인자 알파(TNF-A), 거핵구 성장 및 발달 인자(MGDF), 백혈병 억제 인자(LIF), 및 Flt3 리간드와 같은 성장 인자를 포함할 수 있다. 각각의 인터루킨 또는 성장 인자는 0.1-100ng/mL의 농도로 첫 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지에 포함될 수 있다. 첫 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 또한 임의로 예를 들어, 인간 혈청(1-20%), 인간 혈장(1-20%), 플라스마네이트(1-20%), 인간 혈청(1-20%), 인간 알부민(0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린(0.1-10U/mL)과 같은 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자를 포함할 수 있다.
3단계 배양 공정의 두 번째 단계는 1-1000 ng/mL의 줄기 세포 인자(SCF) 및 1-100 U/mL의 에리트로포이에틴(EPO)을 포함하는 액체 배양 배지에서 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 두 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 또한 임의로 예를 들어, 1-50㎍/mL의 인슐린, 1-50㎍/mL의 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 1-50㎍/mL의 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2), 또는 1-50 μg/mL의 기계적 성장 인자와 같은 인슐린 유사 분자를 포함할 수 있다. 두 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 선택적으로 트랜스페린을 0.1-5 mg/mL로 추가로 포함할 수 있다. 두 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 선택적으로 예를 들어, 인간 혈장(1-20%), 플라스마네이트(1-20%), 인간 혈청(1-20%), 인간 알부민(0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린(0.1-10 U/mL)과 같은 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자를 추가로 포함할 수 있다.
3단계 배양 공정의 세 번째 단계는 에리트로포이에틴(EPO)을 포함하는 액체 배양 배지에서 적혈구 전구 세포를 1-100 U/mL로 배양하는 것을 포함한다. 세 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 선택적으로 1-1000ng/mL에서 줄기 세포 인자(SCF)를 추가로 사용할 수 있다. 세 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 선택적으로 예를 들어, 1-50㎍/mL의 인슐린, 1-50㎍/mL의 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 1-50㎍/mL의 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF-2), 또는 1-50 μg/mL의 기계적 성장 인자와 같은 인슐린 유사 분자를 추가로 포함할 수 있다. 세 번째 단계에서 사용되는 액체 배양 배지는 또한 임의로 0.1-5 mg/mL의 트랜스페린 및/또는 혈청 단백질 또는 예를 들어, 인간 혈청(1-20%), 인간 혈장(1-20%), 플라스마네이트(1-20%), 인간 혈청(1-20%), 인간 알부민(0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린 (0.1-10U/mL)과 같은 비-단백질 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 방법은 조성물을 멸균 용기에 배치하는 것을 추가로 포함한다. 멸균 용기의 비제한적인 예는 멸균 원추형 튜브, 멸균 페트리 접시, 멸균 바이알((예를 들어, 붕규산 유리 바이알)) 및 멸균 플라스틱 백 (디-2-에틸헥실프탈레이트(DEHP)-가소화된 폴리염화비닐(PVC) 백 또는 n-부티릴-트리(n-헥실)-시트레이트(BTHC)-가소화된 PVC 백)을 포함한다.
피험자를 치료하는 방법
또한 다음을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 대상체 중 임의의 것)를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예를 들어, 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 4ºC~약 10ºC, 약 4ºC~약 9ºC, 약 4ºC~약 8ºC, 약 4ºC~약 7ºC, 약 4º~약 6ºC, 약 5ºC~약 10ºC, 약 5ºC~ 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10 ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 보관된 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물)을 제공하는 단계; (ii) 단계 (ii)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계. 이들 방법의 일부 실시예에서, 대상체는 투여된 조작된 탈핵 적혈구에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질을 필요로 하는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다. 일부 실시예에서, 대상체는 수혈 및/또는 적혈구 증가가 필요한 것으로 이전에 확인되거나 진단된 바 있다.
일부 실시예에서, 다음을 포함하는 페닐케톤뇨증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 조작된 인간 탈핵 적혈구가 외인성 단백질 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 포함하는 조성물을 제공하고, 이는 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도((예: 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4 ºC ~ 약 10 ºC, 약 4 ºC ~ 약 9 ºC, 약 4 ºC ~ 약 8 ºC, 약 4 ºC ~ 약 7 ºC, 약 4 º ~ 약 6 ºC, 약 5 ºC ~ 약 10 ºC, 약 5 ºC 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC))에서 저장되는 단계; (ii) 단계 (i)의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계. 이들 방법의 일부 실시예에서, 대상체는 페닐케톤뇨증 질환을 갖는 것으로 이전에 확인되거나 진단된 바 있다.
일부 실시예에서, 다음을 포함하는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 조작된 인간 탈핵 적혈구가 알파1, 알파2 중 하나 이상에 연결된 베타 2 마이크로글로불린(B2M) 또는 이의 단편에 연결된 항원성 펩티드 (예: HPV16 E711-19와 같은 HPV 항원)를 포함하는 제1 외인성 단백질및 막횡단 단백질(예: GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 MHC 클래스 I 단백질(예: HLA*02:01), 또는 이의 단편 또는 변이체의 알파 3 도메인; 막횡단 단백질 (예: GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 4-1BBL 또는 이의 단편을 포함하는 제2 외인성 단백질; 및 IL-12 p40을 포함하는 제2 외인성 단백질, 또는 IL-12 p35에 연결된 이의 단편, 또는 일정 기간 동안 약 2°C 내지 약 10°C의 온도 (예: 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4 ºC ~ 약 10 ºC, 약 4 ºC ~ 약 9 ºC, 약 4 ºC ~ 약 8 ºC, 약 4 ºC ~ 약 7 ºC, 약 4 º ~ 약 6 ºC, 약 5 ºC ~ 약 10 ºC, 약 5 ºC 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 보관된 막횡단 단백질 (예를 들어, GPA, 또는 그의 막횡단 단편, 또는 SMIM1, 또는 그의 막횡단 단편) (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0290686에 기재된 바와 같음)에 연결된 이의 단편의 조합을 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 및(ii) 단계 (i)의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계. 이들 방법의 일부 실시예에서, 대상체는 이전에 암이 있는 것으로 확인되거나 진단된 적이 있다.
일부 실시예에서, 다음을 포함하는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 조작된 인간 탈핵 적혈구가 막횡단 단백질 (예: GPA 또는 이의 막횡단 단편)에 연결된 4-1BBL 또는 이의 단편을 포함하는 제1 외인성 단백질; 및 IL-15 수용체 알파(IL-15Rα)의 세포외 부분에 연결된 IL-15 또는 이의 단편 (예: IL-15Rα 스시 결합 도메인)을 포함하는 제2 외인성 단백질 또는 일정 기간 동안 약 2 °C 내지 약 10 °C의 온도 (예: 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4 ºC ~ 약 10 ºC, 약 4 ºC ~ 약 9 ºC, 약 4 ºC ~ 약 8 ºC, 약 4 ºC ~ 약 7 ºC, 약 4 º ~ 약 6 ºC, 약 5 ºC ~ 약 10 ºC, 약 5 ºC 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 보관된 막횡단 단백질 (예를 들어, GPA, 또는 이의 막횡단 단편) (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2019/0298769에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 참고로 포함됨)에 연결된 이의 단편을 제공하는 단계, 및(ii) 단계 (i)의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계. 이들 방법의 일부 실시얘에서, 대상체는 이전에 암이 있는 것으로 확인되거나 진단된 적이 있다.
일부 실시예에서, 다음을 포함하는 표 A 내지 D에 열거된 질환 또는 상태 중 임의의 것을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다: (i) 조작된 인간 탈핵 적혈구가 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예: 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC , 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약 4 ºC ~ 약 10 ºC, 약 4 ºC ~ 약 9 ºC, 약 4 ºC ~ 약 8 ºC, 약 4 ºC ~ 약 7 ºC, 약 4 º ~ 약 6 ºC, 약 5 ºC ~ 약 10 ºC, 약 5 ºC 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 보관된 외인성 단백질 (예를 들어, 표 A 내지 D에 나열된 상응하는 질병 또는 상태의 치료를 위해 표 A 내지 D에 나열된 예시적인 외인성 단백질 중 하나 이상)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및(ii) 단계 (i)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계. 이들 방법의 일부 실시예에서, 대상체는 표 A 내지 D에 열거된 질환 또는 상태를 갖는 것으로 이전에 확인되거나 진단되었다.
이들 방법의 일부 실시예는 단계 (i)와 단계 (ii) 사이에 단계 (i)의 조성물을 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온하는 단계를 추가로 포함한다 (예를 들어, 약 15℃ 내지 약 29℃, 약 15℃ 내지 약 28℃, 약 15℃ 내지 약 27℃, 약 15℃ 내지 약 26℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 15℃ 내지 약 24℃, 약 15℃ 내지 약 23℃, 약 15℃ 내지 약 22℃, 약 15℃ 내지 약 21℃, 약 15℃ 내지 약 20℃, 약 15℃ 내지 약 19℃, 약 15℃ 내지 약 18℃, 약 15℃ 내지 약 17℃, 약 15℃ 내지 약 16℃, 약 16℃ 내지 약 30℃, 약 16℃ 내지 약 29℃, 약 16℃ 내지 약 28℃, 약 16℃ 내지 약 27℃, 약 16℃ 내지 약 26℃, 약 16℃ 내지 약 25℃, 약 16℃ 내지 약 24℃, 약 16℃ 내지 약 23℃, 약 16℃ 내지 약 22℃, 약 16℃ 내지 약 21℃, 약 16℃ 내지 약 20℃, 약 16℃ 내지 약 19℃, 약 16℃ 내지 약 18℃, 약 16℃ 내지 약 17℃, 약 17℃ 내지 약 30℃, 약 17℃ 내지 약 29℃, 약 17℃ 내지 약 28℃, 약 17℃ 내지 약 27℃, 약 17℃ 내지 약 26℃, 약 17℃ 내지 약 25℃, 약 17℃ 내지 약 24℃, 약 17 °C 내지 약 23℃, 약 17℃ 내지 약 22℃, 약 17℃ 내지 약 21℃, 약 17℃ 내지 약 20℃, 약 17℃ 내지 약 19℃, 약 17℃ 내지 약 18℃, 약 18℃ 내지 약 30℃, 약 18℃ 내지 약 29℃, 약 18℃ 내지 약 28℃, 약 18℃ 내지 약 27℃, 약 18℃ 내지 약 26℃, 약 18℃ 내지 약 25℃, 약 18℃ 내지 약 24℃, 약 18℃ 내지 약 23℃, 약 18℃ 내지 약 22℃, 약 18℃ 내지 약 21℃, 약 18℃ 내지 약 20℃, 약 18℃ 내지 약 19℃, 약 19℃ 내지 약 30℃, 약 19℃ 내지 약 29℃, 약 19℃ 내지 약 28℃, 약 19℃ 내지 약 27℃, 약 19℃ 내지 약 26℃, 약 19℃ 내지 약 25℃, 약 19℃ 내지 약 24℃, 약 19℃ 내지 약 23℃, 약 19℃ 내지 약 22℃, 약 19℃ 내지 약 21℃, 약 19℃ 내지 약 20℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 29℃, 약 20℃ 내지 약 28℃, 약 20℃ 내지 약 27℃, 약 20℃ 내지 약 26℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 20℃ 내지 약 24 °C, 약 20℃ 내지 약 23℃, 약 20℃ 내지 약 22℃, 약 20℃ 내지 약 21℃, 약 21℃ 내지 약 30℃, 약 21℃ 내지 약 29℃, 약 21℃ 내지 약 28℃, 약 21℃ 내지 약 27℃, 약 21℃ 내지 약 26℃, 약 21℃ 내지 약 25℃, 약 21℃ 내지 약 24℃, 약 21℃ 내지 약 23℃, 약 21℃ 내지 약 22℃, 약 22℃ 내지 약 30℃, 약 22℃ 내지 약 29℃, 약 22℃ 내지 약 28℃, 약 22℃ 내지 약 27℃, 약 22℃ 내지 약 26℃, 약 22℃ 내지 약 25℃, 약 22℃ 내지 약 24℃, 약 22℃ 내지 약 23℃, 약 23℃ 내지 약 30℃, 약 23℃ 내지 약 29℃, 약 23℃ 내지 약 28℃, 약 23℃ 내지 약 27℃, 약 23℃ 내지 약 26℃, 약 23℃ 내지 약 25℃, 약 23℃ 내지 약 24℃, 약 24℃ 내지 약 30℃, 약 24℃ 내지 약 29℃, 약 24℃ 내지 약 28℃, 약 24℃ 내지 약 27℃, 약 24℃ 내지 약 26℃, 약 24℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 25℃ 내지 약 29℃, 약 25°C 내지 약 28°C , 약 25℃ 내지 약 27℃, 약 25℃ 내지 약 26℃, 약 26℃ 내지 약 30℃, 약 26℃ 내지 약 29℃, 약 26℃ 내지 약 28℃ , 약 26℃ 내지 약 27℃, 약 27℃ 내지 약 30℃, 약 27℃ 내지 약 29℃, 약 27℃ 내지 약 28℃, 약 28℃ 내지 약 30℃ , 약 28℃ 내지 약 29℃, 또는 약 29℃ 내지 약 30℃).
이들 방법의 일부 실시예에서, 기간은 약 30일 내지 약 100일 (예를 들어, 약 30일 내지 약 95일, 약 30일 내지 약 90일, 약 30일 내지 약 85일, 약 30일 내지 약 80일, 약 30일 내지 약 75일, 약 30일 내지 약 70일 , 약 30일 내지 약 65일, 약 30일 내지 약 60일, 약 30일 내지 약 55일, 약 30일 내지 약 50일, 약 30일 내지 약 45일, 약 30일 내지 약 40일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 100일, 약 35일 내지 약 95일, 약 35일 내지 약 90일, 약 35일 내지 약 85일, 약 35일 내지 약 80일, 약 35일 내지 약 75일, 약 35일 내지 약 70일, 약 35일 내지 약 65일, 약 35일 내지 약 60일, 약 35일 내지 약 55일, 약 35일 내지 약 50일, 약 35일 내지 약 45일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 100일, 약 40일 내지 약 95일, 약 40일 내지 약 90일, 약 40일 내지 약 85일, 약 40일 내지 약 80일 , 약 40일 내지 약 75일, 약 40일 내지 약 70일, 약 40일 내지 약 65일, 약 40일 내지 약 60일, 약 40일 내지 약 55일, 약 40일 내지 약 50일, 약 40일 일 내지 약 45일, 약 45일 내지 약 100일, 약 45일 내지 약 95일, 약 45일 내지 약 90일, 약 45일 내지 약 85일, 약 45일 내지 약 80일, 약 45일 내지 약 75일, 약 45일 내지 약 70일, 약 45일 내지 약 65일, 약 45일 내지 약 60일, 약 45일 내지 약 55일, 약 45일 내지 약 50일, 약 50일 내지 약 100일, 약 50일 내지 약 95일, 약 50일 내지 약 90일, 약 50일 내지 약 85일, 약 50일 내지 약 80일, 약 50일 내지 약 75일, 약 50일 내지 약 70일, 약 50일 내지 약 65일, 약 50일 내지 약 60일, 약 50일 내지 약 55일, 약 55일 내지 약 100일, 약 55일 내지 약 95일, 약 55일 내지 약 90일, 약55일 내지 약 85일, 약 55일 내지 약 80일, 약 55일 내지 약 75일, 약 55일 내지 약 70일, 약 55일 내지 약 65일, 약 55일 내지 약 60일, 약 60일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 95일, 약 60일 내지 약 90일, 약 60일 내지 약 85일, 약 60일 내지 약 80일, 약 60일 내지 약 75일, 약 60일 내지 약 70일, 약 60일 내지 약 65일, 약 65일 내지 약 100일, 약 65일 내지 약 95일, 약 65일 내지 약 90일, 약 65일 내지 약 85일, 약 65일 내지 약 80일 일, 약 65일 내지 약 75일, 약 65일 내지 약 70일, 약 70일 내지 약 100일, 약 70일 내지 약 95일, 약 70일 내지 약 90일, 약 70일 내지 약 85일, 약 70일 내지 약 80일, 약 70일 내지 약 75일, 약 75일 내지 약 100일, 약 75일 내지 약 95일, 약 75일 내지 약 90일, 약 75일 내지 약 85일, 약 75일 내지 약 80일, 약 80일 내지 약 100일, 약 80일 내지 약 95일, 약 80일 내지 약 90일, 약 80일 내지 약 85일, 약 85일 내지 약 100일, 약 85일 내지 약 95일, 약 85일 내지 약 90일, 약 90일 내지 약 100일, 약 90일 내지 약 95일, 약 95일 내지 약 100일)이다.
이들 방법의 일부 실시예에서, 단계 (ii)는 대상체에 정맥내 투여를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다 (예: 조작된 탈핵 적혈구에 존재하는 하나 이상의 외인성 단백질이 필요한 것으로 이전에 확인되거나 진단된 대상, 또는 수혈 및/또는 적혈구 증가가 필요한 것으로 확인된 대상). 이러한 방법의 일부 실시예에서, 조성물은 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도 (예: 약 2 ºC ~ 약 9 ºC, 약 2 ºC ~ 약 8 ºC, 약 2 ºC ~ 약 7 ºC, 약 2 ºC ~ 약 6 ºC, 약 2 ºC ~ 약 5 ºC, 약 2 ºC ~ 약 4 ºC, 약 3 ºC ~ 약 10 ºC, 약 3 ºC ~ 약 9 ºC, 약 3 ºC ~ 약 8 ºC, 약 3 ºC ~ 약 7 ºC, 약 3 ºC ~ 약 6 ºC, 약 3 ºC ~ 약 5 ºC, 약4ºC ~ 약 10ºC, 약 4ºC ~ 약 9ºC, 약 4ºC ~ 약 8ºC, 약 4ºC ~ 약 7ºC, 약 4º ~ 약 6ºC, 약 5ºC ~ 약 10ºC, 약 5ºC ~ 약 9 ºC, 약 5 ºC ~ 약 8 ºC, 약 5 ºC ~ 약 7 ºC, 약 6 ºC ~ 약 10 ºC, 약 6 ºC ~ 약 9 ºC, 약 6 ºC ~ 약 8 ºC, 약 7 ºC ~ 약 10 ºC, 약 7ºC ~ 약 9ºC 또는 약 8ºC ~ 약 10ºC)에서 미리 저장되었다. 일부 실시예에서, 기간은 약 30일 내지 약 100일(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 임의의 하위 범위)이다.
이러한 방법의 일부 실시예는 투여 단계 전에 조성물을 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도로 가온하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이 범위의 하위 범위 중 임의의 것). 이들 방법의 일부 실시예에서, 투여 단계는 대상체에 정맥내 투여를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법의 일부 실시예는 하나 이상의 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본 명세서에 제공된 임의의 조성물과 실질적으로 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하기 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다.
실시예
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1: 제형 개발
탈핵 적혈구에 대한 제형 개발은 실험 설계(DOE) 방법을 사용하여 수행되었다. T1 및 T2 제형 시리즈(표 1 및 2 참조)가 개발되었다. T1 제형 시리즈는 5mM 포도당을 포함하고 콜로이드를 포함하는 세포의 저체온 저장을 위해 개발된 알려진 제형인 HypoThermosol®(HTS; Sigma-Aldrich Cat. No. H4416)보다 우수한 것으로 밝혀졌다. T1-1로 명명된 제제는 저장 후 세포 수, 용혈 및 세포 변형성에 의해 결정된 바와 같이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 놀랍게도, T1-1은 포도당이 없는 제형이었고, 이는 포도당이 저장 동안 탈핵 적혈구의 안정화에 중요한 것으로 생각되기 때문에 예상치 못한 것이었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 2: 세포 저장 제제의 안정성 분석
재료 및 방법
용혈 분석
용혈률(%)을 계산하기 위해 다음 함수를 사용했다.
퍼센트 용혈(%) = 상등액 헤모글로빈 / 총 헤모글로빈
여기서 헤모글로빈은 Harboe 직접 분광광도법에 따라 측정하였다(Han et al., Vox Sang 98(2):116-23, 2010).
헤모글로빈 = 1.539 x [1.672 x (A415) - 0.836 x (A380) - 0.836 x (A450)],
여기서 A415, A380 및 A450은 각각 BioTek Gen5 플레이트 판독기를 사용하여 측정한 415 nm, 380 nm 및 450 nm에서의 흡광도이다.
결과
T1 시리즈의 제형 및 HTS를 포함하는 다양한 제형에 저장된 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 포함하는 예시적인 조작된 탈핵 적혈구 집단의 용혈 퍼센트 및 세포 수의 변화를 68일 동안 분석했다. 테스트된 T1 시리즈의 제형은 T1-1, T1-2, T1-3, T1-4, T1-5, T1-6, T1-6a5, T1-6a0, T1-6m, T1-6c, T1-7, T1-8 및 T1-9. T1-7, T1-8 및 T1-9 제형은 HTS를 포함하는 나머지 제형과 비교하여 더 높은 수준의 글루코스를 함유하였다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 다양한 T1 시리즈 제형은 34, 40 및 68일 동안 저장 후 HTS와 비교하여 감소된 탈핵 적혈구 세포 용혈을 나타내었다. 특히, T1-1에서 68일 동안 보관하면 HTS에 비해 용혈량이 더 낮았다. 다음으로, 68일 동안 보관된 탈핵 적혈구 세포에 대한 세포 수를 분석하였다. 도 1B에 도시된 바와 같이, T1-1에서의 저장은 또한 HTS 용액에서의 저장과 비교하여 세포 수의 더 낮은 감소를 초래하였다. 놀랍게도, 다른 제형에 비해 더 높은 수준의 글루코스를 함유하는 T1-7, T1-8 및 T1-9에 저장하는 것이 세포 수의 가장 높은 감소를 초래하였다.
HTS 또는 T1-1에서 32일 및 45일 보관 후 탈핵 적혈구 농도도 분석하였다. 세포 농도는 저장 전 세포 수에 대한 32일 또는 45일 저장 후 세포 수의 비율로 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, T1-1은 32일 및 45일 모두에서 HTS에 비해 세포 농도의 감소가 적었다.
다음으로, HTS 또는 T1-1에 34, 40 및 68일 동안 보관된 탈핵 적혈구 세포의 삼투압 특성을 레이저 보조 회전 적혈구 분석기(Lorrca® Maxsis)를 사용하여 엑타사이토메트리로 분석했다. 도 3A에 도시된 바와 같이, T1-1에 저장된 탈핵 적혈구는 연구된 모든 3개 시점에서 HTS에 저장된 탈핵 적혈구와 비교하여 상당히 더 높은 EImax(피크 신장 지수) 및 곡선 아래 면적(AUC)을 유지했다. 구체적으로, T1-1에 68일 동안 보관한 세포는 HTS에 40일 동안 보관한 세포와 유사한 오스모스칸(osmoscan) 특성을 나타냈다.
HTS 또는 T1-1에 32일 또는 45일 동안 보관한 탈핵 적혈구의 삼투압 특성도 분석했다. 도 3B에 도시된 바와 같이, T1-1에 저장된 탈핵 적혈구는 HTS에 저장된 탈핵 적혈구보다 훨씬 더 우수한 오스모스칸 특성을 유지하였다. 구체적으로, T1-1에 45일 동안 보관한 탈핵 적혈구는 HTS에 32일 동안 보관한 탈핵 적혈구에 비해 더 나은 오스모스칸 특성을 나타냈다.
이러한 결과는 예기치 않게 본 명세서에 제공된 조성물이 탈핵 적혈구가 장기간 저장될 때 세포 무결성을 유지하고, 용혈을 방지하고, 개선된 변형성을 제공하는 데 유리하다는 것을 입증한다.
실시예 3: 세포 보관 제제의 안정성 분석
재료 및 방법
용혈 분석
실시예 2에 기술된 것과 동일한 용혈 분석이 이들 실험에 사용되었다.
세포 농도 분석
세포 농도는 BD Trucount™ 튜브(BD BIOSCIENCES)를 사용하여 유세포 분석(BD FACSLyric™ 시스템; BD BIOSCIENCES)을 사용하여 결정하고 검출된 세포 수, BD Trucount™ 튜브에 미리 정의된 비드 및 희석 인자를 기반으로 계산했다. 방정식(mL당 세포 농도 = (세포 이벤트 수/비드 수) x (로트 특정 비드 수/샘플 부피(mL)) x 희석 계수를 사용한다.
테스트된 구성
4-1BBL을 포함하는 제1 외인성 단백질 및 0.2로 보충된 T1-1 및 T1-1에서 표면 상의 IL-15Rα의 세포외 부분에 연결된 IL-15를 포함하는 두 번째 외인성 단백질을 포함하는 예시적인 조작된 탈핵 적혈구의 6개의 상이한 배치 % w/v 인간 혈청 알부민(HSA)이 이 실험에 사용되었다. 0.2% w/v HSA가 보충된 T1-1은 다음을 포함하는 약학적으로 허용되는 완충 수용액을 포함한다: 79.4mM 나트륨 이온, 41.7mM 칼륨 이온, 0.05mM 칼슘 이온, 5.0mM 마그네슘 이온, 10.0mM 염화물 이온, 9.9mM 포스페이트 이온, 5.0mM 중탄산염 이온, 24.8mM HEPES, 99.2mM 락토비오네이트, 99.2mM 2mM 락토비오네이트, 39.7mM 락토비오네이트, 1.0mM 아데닌 및 0.20% w/v HSA, pH ~7.57.
결과
4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외인성 단백질 및 표면에 IL-15Rα의 세포외 부분에 연결된 IL-15를 포함하는 두 번째 외인성 단백질을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구가 이러한 안정성 연구에 사용되었다. 세포를 50리터 규모의 생물 반응기에서 생산하고, 여과하고, 1.5-3 × 109 cells/mL 농도의 0.2% HSA가 보충된 T1-1 또는 T1-1로 처리하고 유리 바이알 마개 시스템에 바이알을 넣었다. 바이알을 2-8 °C에서 보관하고 빛으로부터 보호했다. 표시된 보관 시점(일)에서 새로운 바이알을 실온으로 옮기고 유세포 분석에 의한 세포 농도 및 분광광도법에 의한 용혈의 안정성 테스트에 제출했다. 결과(도 4A 및 4B)는 조작된 탈핵 적혈구가 T1-1에서 안정하여 45일 이상 동안 안전한 수준 내에서 세포 양 및 용혈을 유지함을 보여준다. HSA의 추가는 안정성 결과에 영향을 미치지 않았다. 이들 데이터는 T1-1이 표면에 외인성 단백질을 포함하는 조작된 탈핵 적혈구를 안정화시키기 위한 적합한 제제임을 시사한다.
기타 실시예
본 발명이 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 설명하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 수정은 다음 청구 범위 내에 있다.

Claims (26)

  1. (a) 탈핵 적혈구 집단; 및
    (b) 6.5 내지 8.5의 pH 및 150 mOsm/L 내지 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 약학적으로 허용가능한 완충 수용액이:
    약 5mM 내지 약 80mM의 완충액;
    약 5mM 내지 약 35mM 포스페이트 이온;
    약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온;
    약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온;
    약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온;
    약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온; 및
    약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제(impermeant agent)를 포함하고, 여기서:
    약학적으로 허용되는 완충 수용액은 5mM 미만의 글루코스를 포함하고; 그리고
    선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 20mM 내지 약 30mM의 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 5mM 내지 약 15mM의 포스페이트 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 70mM 내지 약 120mM의 나트륨 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 30mM 내지 약 50mM의 칼륨 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM 칼슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 3mM 내지 약 7mM의 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 20 mM 내지 약 120 mM의 음이온성 세포 불침투제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 30mM 내지 약 50mM의 비이온성 세포 비침투제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 5 mM 내지 약 15 mM의 염화물 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액은:
    약 0.01mM 내지 약 5mM의 핵염기, 약 0.01mM 내지 약 5mM의 뉴클레오시드, 및 약 0.01mM 내지 약 5mM의 뉴클레오티드 중 하나 이상;
    약 3mM 내지 약 7mM 중탄산염 이온(bicarbonate ion);
    약 0.01mM 내지 약 5mM 피루브산(pyruvate);
    폴록사머; 및/또는
    인간 혈청 알부민을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 pH가 약 7.0 내지 약 8.0인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 약 250 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 완충 수용액이 0.01 mM 미만의 글루코스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈핵 적혈구가 조작된 인간 탈핵 적혈구인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조작된 인간 탈핵 적혈구가 하나 이상의 외인성 단백질(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 조작된 인간 탈핵 적혈구가 클릭-접합(click-conjugated) 인간 탈핵 적혈구인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 조작된 인간 탈핵 적혈구가 저장성(hypotonically) 로딩된 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 조작된 인간 탈핵 적혈구가 물리적 조작에 의해 로딩된 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질(들) 중 하나가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 막 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 단백질 중 하나가 조작된 인간 탈핵 적혈구의 세포질에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물을 저장하면 10% 미만의 용혈이 발생하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2℃ 내지 약 10℃에서 30일 내지 약 100일 동안 조성물을 저장하면 세포 밀도가 10% 미만 감소하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 대상체을 치료하는 방법으로서,
    (i) 일정 기간 동안 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 보관된 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 제공하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 대상체을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 조성물의 제조 방법으로서,
    (i) 탈핵 적혈구 집단을 제공하는 단계; 및
    (ii) 탈핵 적혈구 집단을 6.5 내지 8.5의 pH 및 150 mOsm/L 내지 400 mOsm/L의 삼투압 농도를 갖는 약학적으로 허용되는 완충 수용액에 재현탁시키는 단계가,
    약 5mM 내지 약 80mM의 완충액;
    약 5mM 내지 약 35mM 포스페이트 이온;
    약 50mM 내지 약 160mM 나트륨 이온;
    약 5mM 내지 약 60mM 칼륨 이온;
    약 0.01mM 내지 약 10mM 칼슘 이온;
    약 1mM 내지 약 20mM 마그네슘 이온; 및
    약 5mM 내지 약 60mM의 비이온성 세포 불침투제를 포함하고,
    여기서:
    약학적으로 허용되는 완충 수용액은 5mM 미만의 글루코스를 포함하고; 그리고
    선택적으로, 약학적으로 허용되는 완충 수용액은 수크로스, 콜로이드 및 항산화제 중 하나 이상을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.

KR1020217037876A 2019-04-26 2020-04-24 탈핵 적혈구를 포함하는 조성물 KR20220005028A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962839506P 2019-04-26 2019-04-26
US62/839,506 2019-04-26
PCT/US2020/029858 WO2020219909A1 (en) 2019-04-26 2020-04-24 Buffered compositions including enucleated erythroid cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220005028A true KR20220005028A (ko) 2022-01-12

Family

ID=70978546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217037876A KR20220005028A (ko) 2019-04-26 2020-04-24 탈핵 적혈구를 포함하는 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200338129A1 (ko)
EP (1) EP3958877A1 (ko)
JP (1) JP2022530130A (ko)
KR (1) KR20220005028A (ko)
CN (1) CN114007627A (ko)
AU (1) AU2020263513A1 (ko)
CA (1) CA3138137A1 (ko)
IL (1) IL287539A (ko)
SG (1) SG11202111842SA (ko)
TW (1) TW202106315A (ko)
WO (1) WO2020219909A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019016951A2 (pt) * 2017-02-17 2020-05-26 Rubius Therapeutics, Inc. Células eritroides funcionalizadas
IL297326A (en) * 2020-04-22 2022-12-01 Novartis Ag Pharmaceutical preparations and pharmaceutical products of human interleukin-15 hydrometers (ethyl-15)
TW202241470A (zh) 2021-01-08 2022-11-01 美商盧比亞斯治療公司 治療人類個體腫瘤之方法
WO2022150569A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Rubius Therapeutics, Inc. METHODS OF INCREASING NKp30-POSITIVE LYMPHOCYTES IN A SUBJECT AND USES THEREOF
TW202304482A (zh) 2021-03-14 2023-02-01 美商盧比亞斯治療公司 於個體中增加nkg2d陽性淋巴球之方法及其用途
TW202317179A (zh) 2021-06-03 2023-05-01 美商盧比亞斯治療公司 在個體中治療ｈｐｖ１６－陽性或ｈｐｖ１６－相關的癌症之方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4327710A (en) 1980-06-18 1982-05-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Process for encapsulating additives in resealed erythrocytes for disseminating chemicals via the circulatory system
DE69127615T2 (de) 1991-06-14 1998-03-19 Europ Communities Transformierte Erythrozyten, Verfahren zu deren Herstellung, und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen
EP0882448B1 (en) 1997-05-05 2005-01-12 DIDECO S.r.l. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus therefor
CA2305693A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 Laura Lee Gillespie Mammalian mesoderm induction early response (m-mier) gene family
US6495351B2 (en) 2000-02-08 2002-12-17 Gendel Limited Loading system and method for using the same
WO2009121002A1 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 Biolife Solutions, Inc. Materials and methods for hypothermic collection of whole blood
AU2009244236B2 (en) * 2008-05-06 2015-03-12 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for producing enucleated erythroid cells derived from pluripotent stem cells
GB201200458D0 (en) 2012-01-11 2012-02-22 Nhs Blood & Transplant Methods of preparing cells and compositions
US8975072B2 (en) 2012-07-20 2015-03-10 Riken Human erythroid progenitor cell line comprising HPV E6/E7 operably linked to an inducible promoter and method for producing human enucleated red blood cells
EP4119662A1 (en) 2013-05-10 2023-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
EP3546485A1 (en) 2013-05-10 2019-10-02 Whitehead Institute for Biomedical Research In vitro production of red blood cells with sortaggable proteins
AU2014348683B2 (en) 2013-11-18 2020-11-05 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
FR3017299B1 (fr) 2014-02-12 2018-05-18 Erytech Pharma Composition pharmaceutique comprenant des erythrocytes encapsulant une enzyme a plp et son cofacteur
RU2736495C2 (ru) * 2014-04-01 2020-11-17 Рубиус Терапьютикс, Инк. Способ и композиции для иммуномодуляции
US20200206269A1 (en) * 2017-08-23 2020-07-02 Whitehead Institute For Biomedical Research Production of enucleated red blood cells and uses thereof
EP3727434A1 (en) 2017-12-23 2020-10-28 Rubius Therapeutics, Inc. Artificial antigen presenting cells and methods of use
SG11202008261WA (en) 2018-03-08 2020-09-29 Rubius Therapeutics Inc Therapeutic cell systems and methods for treating cancer and infectious diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP3958877A1 (en) 2022-03-02
TW202106315A (zh) 2021-02-16
SG11202111842SA (en) 2021-11-29
CA3138137A1 (en) 2020-10-29
AU2020263513A1 (en) 2021-11-18
JP2022530130A (ja) 2022-06-27
IL287539A (en) 2021-12-01
US20200338129A1 (en) 2020-10-29
WO2020219909A1 (en) 2020-10-29
CN114007627A (zh) 2022-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220005028A (ko) 탈핵 적혈구를 포함하는 조성물
JP2022533252A (ja) 脱核赤血球細胞を生成する方法
ES2842899T3 (es) Tampones para la estabilización de preparaciones lentivirales
JP2023510916A (ja) 遺伝子発現の制御のための安全スイッチ
JP5805089B2 (ja) 細胞集団の製造方法
CN111566221B (zh) 用于nk细胞转导的方法
US20220025403A1 (en) Reduced and minimal manipulation manufacturing of genetically-modified cells
US20190201548A1 (en) Gene editing and targeted transcriptional modulation for engineering erythroid cells
US20210147802A1 (en) Methods of generating enucleated erythroid cells using taurine or hypotaurine
US20210130780A1 (en) Methods of generating enucleated erythroid cells using myo-inositol
TW202241471A (zh) 提高個體中NKp30陽性淋巴球的方法及其用途
Woods Generation of platelets with enhanced functionality by targeting transgenic proteins to alpha granules in megakaryocytes
TW202304482A (zh) 於個體中增加nkg2d陽性淋巴球之方法及其用途
Vats et al. An Overview of Gene Editing Modalities and Related Non-clinical Testing Considerations
CA3227759A1 (en) Mtor-targeted modification and uses thereof